HU228582B1 - Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity - Google Patents

Description

Trombopoietikus vegyületek

72.255/SZE

j. .&·

A jelen találmány tárgyát trombopoietikus aktivitással rendelkező vegyületek, főleg peptidek és polipeptidek képezik. A találmány szerinti vegyületek használhatók a vérlemezkék vagy vérlemezke prekurzorok (azaz például a megakariociták)

A jelen találmány tárgyát olyan vegyületek, főleg peptidek képezik, amik olyan képességgel rendelkeznek, hogy serkentik, a vérlemezkék és prekurzor sejtjeik, azaz például a megakariociták ín vitro és in vivő termelődését. Mielőtt megtárgyalnánk a találmány szerinti vegyületek természetét, háttérként az alábbiakat ismertetjük két, trombopoietíkus aktivitással rendelkező fehérjére, a trombopoíetinre, valamint a megakariocita növekedési és fejlődési faktorra (MGDF).

Az endogén trombopoietin (TPG) klónozása [Lók és mtsai:,. Natúré 369. 568-571 (1994); Bartley és mtsai: Cell 77, 11171124 (1994); Kuter és mtsai; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91, 11104-11108 (1994); de Sauvage és mtsai: Natúré 369, 533-538 (1994); Kató és mtsai: Journal of Biochemistry 119, 229-236 (1995); Chang és mtsai: Journal of Biological Chemistry 270, 511-514 (1.995)]. nagymértékben

φφφ* fokozta a meg&kariopoíézis (megakariocita termelődés) és a frombopoiézis (vérlemezke termelődés) megértését.

Az endogén humán trombopoietin egy 60-70 kDa méretű glíkozilezett fehérje, ami elsődlegesen a májban és a vesében keletkezik, 332 aminosavból áll (Bartley és mtsai; Cell 77, 11171124 (1994); Chang és mtsai: Journal of Btological Chemistry 270; 511-514 (1995)). A fehérje nagyon erősen konzerválódott a fajok között, és a humán eritropoietínnel (Gurney és mtsai; Blood 85, 981-988 (1995))az N-termlnálison (l-172~es aminosavak) 23%-os homológiát mutat (Bartley és mtsai: Cell 77, 1117-1124 (1994)1 Az endogén trombopoietinröl kimutatták, hogy a trombopoiézis biológiai kulcsszabályozőjának összes jellemzőjével rendelkezik. Zn aííro hatásai közé tartozik a megakariocita telepek indukciója mind tisztított rágcsáló hematopoietíkus őssejtekből (Ziegler és mtsai: Blood 84, 4045-4052 (1994)(, mind humán •CD'34* sejtekből (Lók és mtsai:, Natúré 369, 568-571 (1994); Rasko és mtsai: Stem Cells 15, 33-42 (1997)], a megnőtt ploidítású megakariociták generálása (Broudy és mtsai: Blood 85, 402-413 (1995)), Ezzel szemben a trombopoietin receptor (cMpl) elleni szintetikus antiszérum oligonukieotídok szignifikánsan gátolják a megakariocita őssejtek: telepképző tulajdonságait (Methia és mtsai; Blood 82, 1395-1401 (1993)(.. Továbbá a c-Mpl knoekout egerek súlyosan trombocitopéniások és megakariocita deficiensek (Alexander és mtsai: Blood 87, 21622170 (1996)).

A .rekombináns humán MGDF (rHuMGDF, Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA) egy másik, a trombopoíefcinnel rokon tromhöpöíetikus polípeptid. Előállításához olyan Eschenchín cok-t használunk, ami olyan plazmiddai van transzformálva, ami a humán trombopoíetm N-terminális receptorkötő doménjére kiterjedő csonkított fehérjét kódoló cDNS-t tartalmaz (Ulich és mtsai: Blood 86, 971-976 (1995)). A polipeptidet extraháljuk, térszerkezetet újra kialakítjuk és tisztítjuk, majd az N-termináhsához kovalens kötéssel egy polietiléngliköl (PEG) egységet csatolunk. A kapott molekula jelölése PEG-rHuMGDE, vagy röviden MGDF.

Számos különböző, átlafcmodeilt használó kísérletben (Ulich, T.R. és mtsai: Blood 86, 971-976 (1995); Hokom, M'.M. és mtsai: Blood 86, 4486-4492 (1992)] világosan kimutatták a trombopoíetín és MGDF terápiás hatékonyságát csontvelő átültetésben és tromboeítopénia kezelésébe, amely állapot gyakran beáll a kemoterápiás vagy besugárzásos terápia hatására. Az embereken kapott előzetes adatok igazolták az MGDF használhatóságát a vérlemezke-szám növelésében, különböző elrendezésben (Sasser és mtsai: Láncét 348, 1279-1.281 (1996); Kató és mtsai: Journal oiLSíochemistry 119, 229-236 (1995); Ulich és mtsai; Blood 86, 971-976 (1995)(. Az MGDF-et arra használhatjuk, hogy fokozzuk a vérlemezke-adási eljárást, mivel az MGDF beadása az egészséges vérlemezke donorokban mért eredeti értéknek körülbelül háromszorosára növeli a keringésben levő vérlemezkék. számát.

A trombopmetm és az MGDP hatását a c-Mpl receptorhoz kötődve fejti ki, ami főleg bizonyos hematopoiefcikus sejtek, azaz. például a. megakariociták, a vériemezkék, a CD34* sejtek és a primitív őssejtek felszínén expresszálódik (Debili, N. és mtsai: Biood 85, 391-481 (1995); de Sauvage, F.d, és mtsai; Natúré 369, 533-538 (1994); Bartíey és mtsai; Cell 77, 1117-1124 (1994); tok és mtsai;, Natúré 869, 568-571 (1994)]. Az interleukinok és fehérje-hormonok legtöbb receptorához hasonlóan a cMpl az L osztályú citokin receptor szupercsaládba tartozik {Vígon, 1. és mtsai; Proeeedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 5640-5644 (1992)]. Ennek a receptorosztálynak az aktiválása magában foglalja a ligandum-kőtődéssel indukált receptor homodímerizációt {Vígon, t és mtsai; Proeeedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 56405644 (1992)). Az ilyen receptor-osztálynak az aktiválása magában foglalja a receptor homodimerizációnak a llgandum-kötéssel való índukálását, ami viszont a szignál-transzdukcíős események kaszkádját indítja be.

Általánosságban, a fehérje ligandumnak a receptorával való kölcsönhatása gyakran egy viszonylag széles interface-n játszódik le. Azonban, amint azt a receptorához kötődő humán növekedési faktor esetében kimutatták, az interfa.ce-en csak nár kulcs-csoport járul hozzá a kötési energia legnagyobb részéhez [Ciackson, T. és mtsai: Science 267, 383-386 (1.995)). Ez, valamint az a tény, hogy a fehérje-hgandum többi része csak azt a célt szolgálja, hogy a kötő epitopokat a helyes topológiával mutassa he, lehetővé teszi, hogy sokkal kisebb méretű aktív ligandumot találjunk.

y erre irányuló erőfeszítésben a tág peptíd könyvtár display rendszer egy erőteljes technikának bizonyult abban, hogy nagy fehérje ligandumok kis peptid mímetikumait azonosítsák jScott, d.K. és mtsai: Science 249, 386 (1990); Devlín, d.J. és mtsai: Science 249 404 (1990)]. Ennek a technikának a használatával olyan kis pepddmolekulákaí fedeztek fel, amik a c-Mpl receptor agonistáiként hatnak jCwirla, S.E. és mtsai: Science

276

Egy ilyen vizsgálatban véletlenszerű kis peptid-szekvenciákat, amik fúziók formájában lettek bemutatva a fonalas tagok burokfehégéinek, affinítás-eluálták a c-Mpl eUenanyag-immobilizált extracehulárís doménjével szemben, és a visszamaradt tagokat egy második affinitás-tisztítási körben dúsították, A kötést szelekciós és repropagációs eljárást többször megismételték, hogy feldúsítsák az erősebben, kötők pool-ját. Ennek eredményeképpen először a c-Mpi-kötö peptideknek két családját azonosították, amiknek a szekvenciája nem áll rokonságban egymással. Ezután mutagenezis könyvtárakat hoztak létre, hogy tovább optimalizálják a legjobban, kötőket, amik végülis egy nagyon aktív peptid Izolálásához vezettek, aminek az ICsq értéke 2 nM volt, BOso értéke pedig 400 nM [Cwirla, S.E. és mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)/ Ez a 14 csoportból álló peptid, ése TMP (azaz TPO Mimetikus Peptid) látszólag nem mutat homológiát a TPO~hoz vagy az MGDF-hez. Ennek a TM.P vegyulelnek a struktúrája az alábbi:

lle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Alá Alá Arg Alá l, számú szekvencia, vagy

ÍEGPTLRQWLAARA, az egybetűs amínosav rövidítések használatával.

Korábban, EPO mimetikus peptidekkel végzett hasonló vizsgálatban egy EPO mimetikus pepiidet (EMP) fedeztek fel, ugyanezt a technikát használva (Wrighton, N.C, és mtsai: Science '273, 458-463 (1996)), amiről kiderítették, hogy dlmerként hat az EPO receptorhoz (EPÖR) való kötődésben. Az így létrejött (ligándum)y/(teeepíor)e komplex a röntgen-kríszt&üográfial adatok szerint C2 szimmetriát mutatott (Livnah, O. és mtsai: Science 273, 464-471 (1996)). Ennek a strukturális információnak az alapján az EMP -egy kovalensen kötött dimerjét tervezték meg, amiben két EMP monomer C-terminálisát egy flexibilis karral kötik össze, és erről kiderült, hogy nagymértékben megnövelik a kötődést, valamint az in vitro/in vivő biológiai aktivitását (Wrightom N.C. és mtsai: Natúré Bioteehnology 15, 1261-1265 (1997)1.

Egy hasonló G-terminális dimerizácíös stratégiát használtak ÍCwiria, S.E. és mtsai: Science a TPO mimetikus 276, 1696-1699 (1997)). Kiderült, hogy a TMP-nek egy C-terminálison kötött dimere (C~C kapcsolat) megnőtt kötési affinitással rendelkezik (0,5 nM), és jelentősen megnőtt, az in vitro aktivitása (ECso^:!sö,t nM) a sejtszaporodási vizsgálatokban [Cwírla, S.E, és mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)). Ennek a TMP C-C dimernek a struktúráját az 1. ábrán mutatjuk be, aminek a szekvenciáját a 2. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

A jelen találmány egv másik megvalósítási módja szerint a tandem dímerekefc tovább csatolhatjuk egy vagy több más egységhez, amik immunglobulin fehérjékből származnak, ezeket általánosságban az ilyen immunglobulinok Fc régiójaként említik. A kapott vegyületeket a TMP tandem dimerek Fc fúziójaként említik.

Az alábbiakban egy rövid, háttér-információkat bemutató szekció következik, ami azoknak az ellenanyagoknak az Fc régióira vonatkozik, amik jól használhatók néhány, a jelen találmány szerinti vegyülettel kapcsolatban.

Az ellenanyagok két, funkcionálisan független részből állnak, egy variábilis doménből, ami „Fab* néven ismert, ez köti meg az antigéneket, és egy konstans doménből, ami „Fc” néven ismert, ami biztosítja a kapcsolatot az effektor funkciókhoz, azaz például a komplement fixáláshoz vagy fagocifózishoz. Egy immunglobulin Fc része hosszú ideig megmarad a plazmában, míg a Fab rövid ideig marad meg [Canon es mtsai: Natúré 337, 1 (1

Az Fc dómén felhasználásával terápiás fehérjetermékeket konstruáltak, amikkel arra. tettek kísérletet, hogy hosszabb féléletidőt biztosítsanak, vagy hogy beépítsenek különböző funkciókat, azaz például az Fc receptorhoz való kötődést, a protein A kötést, a komplement fixálást és a placenta transzfert,, ami az immunglobulinok Fc régiójának összes csoportját igénybe veszi fCapon és mtsai: Natúré 337, 525-531 (1989)]. Például egy IgGl ellenanyag Fc régióját fúzionáltattuk a CD3Ö-L-hez, egy olyan molekulához, ami a Hcdgkin betegség tumorsejtekben, an ap i asz tikus limfóma sejtekben, T-sejt leukémia sejtekben és más rosszindulatú sejtekben expresszált CD3Ö receptorokhoz kötődik (5,480,931 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás}. Az lt~lö-et, egy gyulladásehenes és kilökődést gátló ágenst fúzión áltattunk rágcsáló Fcgamma2a-val, azzal a céllal, hogy fokozzuk a citokin rövid keringési fél-életidejét (Zheng, X. és mtsai: The Journal of imrnunotogy 154, 559Ö-56Ö0 (1995)). Voltak olyan vizsgálatok ís, amikben kiértékelték a humán IgG Fc fehérjéjéhez kötődő tumor nekrózís faktor receptor felhasználását szeptikus sokkban szenvedő betegek esetében (Fisher, C. és mtsai: The New England Journal of Medieíne 334, 1697-1702 (1996); Van Zee, K. és mtsai; The Journal of Immunology 158, 2221-2230 (1998)). Az Fe-t CD4 receptorhoz is fűzionáltatták, ezzel az AIDS kezelésére használható terápiás fehérjét lehetett előállítani fCapon és mtsai: Natúré 337, 525-531 (1989)}. Emellett az interleukín-2· ~t a IgGl vagy lgG3 Fc részéhez fűzionáltatták, hogy leküzdjék az interÍeukin-2 rövid fél-életidejét és szisztémás toxicitását (Harvill és mtsal: Immunotechnology X, 95-105 (1995)].

A TPO és MGDF hozzáférhetősége ellenére megmarad az igény további vegyűletek biztosítására, amik biológiai aktivitással

Ο *** «««Φ ♦ ;

rendelkeznek a. vérlemezkék termelésének serkentésében (trorabopoietí'kús aktivitás), és/vagy a vérlemezkék prekurzor sejtjeinek, főleg a megakariodták termelésének serkentésében jmegakariopoíetikus aktivitás). A jelen találmány tárgyát új vegyületek képezik, amik ilyen aktivitásokkal rendelkeznek, valamint a rokon aspektusok,

A jelen találmány tárgyát, egv vegyületcsoport képezi, ami képes kötődni, és egy transzmembrán szignált megindítani, például. a c-Mpl receptor aktiválásán keresztül, ami ugyanaz a receptor, ami befolyásolja az endogén trombopoietin (TPO) aktivitását, Tehát a jelen találmány szerinti vegyületek trombois- aktivitással rendelkeznek, azaz képesek in vivő és in váró serkenteni a vérlemezkék termelődését és/vagy megakariocitopoietikus aktivitással, azaz képesek in uwo és m tálro serkenteni a vérlemezke prekurzorok termelődését.

Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint a je találmány szerinti vegyüietek az alábbi általános struktúrát amiben TMPi~et és TMFz-t. egymástól függetlenül az alábbi központi struktúrát tartalmazó- vegyületek csoportjából választjuk ki;

Xa-X3~X4-Xs-X6-X7~X8-Xs-Xio amiben

Xa-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

Xs~at az alábbi csoportból választjuk ki: Giv és Alá:

IG **» · * χ β. ** χ' * * 9

X4 jelentése Pro;

Xs-öt az· alábbi csoportból választjuk ki: Thr és Ser;

Xe-ot az alábbi csoportból választjuk ki; Leu, Ile, Val, Alá és Phe: Χ'7-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gin, Asn és Glu;

Xs-et az alábbi csoportból választjuk ki: Trp, Tyr, Cys, Alá és Phe; Χίο-et az alábbi csoportból választjuk ki; Leu, Ile, Val, Alá, Phe, Met és Lvs;

χ/

Li egy, az alábbiakban ismertetett linker; és n értéke 0 vagy 1;

valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.

Az egyik megvalósítási mód szerint L? jelentése (Glyjn, amiben n. értéke 1-20, és ha n értéke l-nél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak maximum a fele helyettesíthető egy másik aminosavval, amit a többi természetes aminosav, vagy azok sztereoizomereí közül választjuk ki.

Az előzőkben a TMPi-re és TMPa-re megadott X2-X10 központi struktúrája mellett más rokon struktúrák is lehetnek, aholis az alábbiak közül egyet vagy többet hozzáadunk a TMPi és/vagy a TMPs központi struktúrájához; Xi kapcsolódik az Ntermmálishoz és/vagy az Xn-et, Xis-t, Xrs-at és/vagy az Xi4-et a C-termlnálishoz kapcsoljuk, aholis Xi, X12, X13 és X14 jelentése az

Xi-et az alábbi csoportból választjuk ki: Ile, Alá. Val, Leu, Ser és

»* V *

Xn-et az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, lle, Vak Let Ser, Thr, Lys, His és Glu:

Xi2~t az alábbi csoportból választjuk ki: Aia, lle, Val, Let

Gly, Ser és Gin;

Xn-at az alábbi csoportból választjuk ki: Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin és Giv: és

Xw-et az alábbi csoportból választjuk ki: Aia, lle, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu és Gly,

Egy második előnyben részesített megvalósítási mód szerint a találmány szerint vegyület általános képlete az alábbi:

(Pe)m

amiben TMPi, TMFa és n jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megadtunk, Lp Lz, és Lo jelentése linkercsoport, amiket egymástól függetlenül az Itt ismertetett linkercsoportok közül választunk ki, az Fc egy immunglobulin Fc régiója (amint az alábbiakban definiáljuk!; m, p, q és r értéke egymástól függetlenül 0 és 1, és m vagy p közül legalább az egyik 1, továbbá ha m egyenlő 0-val, akkor q értéke is 0, és ha p értéke 0, akkor r értéke 0, valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói. Az egyik megvalósítási mód szerint Li, Ls és L3 egymástól függetlenül tartalmazzák a (Gly)n-í, amiben n értéke 1-20, és ha n értéke egynél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak több mint a felét egy másik aminoesoporttal lehet helyettesíteni, amit a többi 19 természetes amínosavből, vagy azok sztereoizomerjeiból választhatjuk ki.

A fenti vegyületek (amiket az alábbiakban ismertetünk) szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak,

A jelen találmány szerinti peptídek előnyösen peptídek, amiket standard szintetikus módszerekkel, valamint bármely más peptid-előáilítási módszerrel előállíthatunk, A jelen találmány szerinti vegyületeket, amik nem-peptid részeket jelentenek, standard szerves kémiai reakciókkal .állíthatjuk elő, a standard peptidkémiai. reakciók mellett, ha ez a megközelítés alkalmazható.

A jelen, találmány -szerinti vegyületek használhatók terápiás vagy profilaktikus célokra, ha megfelelő gyógyászati hordozókkal szereljük ki őket, és hatékony mennyiséget adunk be egy alanynak, azaz például embernek (vagy más emlősnek).

A jelen találmány számos más aspektusa és előnyei nyilvánvalóak lesznek az alábbi részletes leírás alapján, az alábbi ián:

Az 1. ábrán a példaként a humán igGl megadott Fe polinukleotid és fehéríeszekvenciákat adjuk meg (a 3. számú szekvencia a kódoló szál, 5'-3'; a 4. számú szekvencia a komplementer szál, leolvasása 3'-5k és az 5. számú szekvencia a kódolt aminosav szekvencia), ami a jelen találmány szerinti vegyületek Fc fúzióiban

A 2. ábrán a pegilezett 19~es peptid (17. számú. szekvencia) előállításának szintetikus sémája látható.

A 3. ábrán a. pegilezett 20-as peptid (18. számú szekvencia) előállításának szintetikus sémája látható.

!3

A 4. ábrán különböző vegyületekkel kezelt 100 pg/kg. bólus injekcióval kezelt normális, nőstény BöF'l egerekben in rioo generált vérlemezkék számát láthatjuk, a kezelést az alábbiak szerint hajtjuk végre: a PBG-MDF jelentése 2(3 kDa átlagos molekulasúlyú PEG. a humán természetes TPO 1-I63~as aminosavai reduktív amínálásával az N-termínálís axnínocsoporthoz kötve, amely TPO .Sscheriehta coléban expresszálódik (úgy, hogy nincs glikozilezve} (lásd a Wö 95/2.6746 számú szabadalmi bejelentést, címe; „Compositions and Methods· fór Stimulating Megakaryocvte Growth and DiOérentíatiom}; a TMP jelentése az 1. számú szekvenciavázlaton bemutatott vegyület; a TMP-TMP jelentése a 21, számú szekvencíavázlaton bemutatott fehérje; a PEG-TMP-TMF kifejezés a IS, számú szekvenciavázlaton bemutatott, vegyületet jelenti, aholls a PEG csoport egy 5 kDa átlagos molekulasúlyú PEG, a 3. ábrán bemutatott módon kapcsolva; a TMP-TMP-Fc-t az alábbiakban definiáljuk, és az Fc-TMP-TMP jelentése ugyanaz mint a TMP-TMP-Fc~nek, azzal az eltéréssel, hogy az Fc csoport a TMP-TMP pepiidnek az Η-terminálisához kapcsolódik, és nem a C-termin álísához,

Az 3, ábrán normális BDF1 egerekben in vívó generált vérlemezkék száma látható, amely egereket különböző vegyületekkel kezeltünk, a. vegyületeket beültetett, ozmotikus pumpákkal adva be hétnapos periódus alatt, A vegyületeket ugyanúgy határozzuk meg. mint a 4, ábra esetében,

A 6A.., 6B. és 6C ábrán a felen találmány szerint részesített vegyüietek sematikus ábráit mutatjuk be. A óA. ábrán ♦ ·* >

egy Fe fúziós vegyület látható,, amiben az Fe egység a TMP dímer N- terminálisához van fúzionáltatva, és az Fc rész egy monomer (egvláncú) forma. A 6B. ábrán egy Fe vegyületet .mutatunk be, amiben az Fe vegyület a TMP dimer N-terminálisáh02 van fúzionáltatva, amiben az Fe rész dimer, és egy Fe monomer kapcsolódik egy TMP dimerhez. A 6C. ábrán egy Fc fúziós vegyület látható, amiben, az Fe egység a TMP dimer N-termínáhsához van fúzionáltatva, és az Fe rész dimer_s és mindegyik Fc monomer egy TMP dimerhez van kapcsolva,

Abbéli erőfeszítésünkben, hogy lead vegyületként kis struktúrákat keressünk jobb tulajdonságokkal rendelkező terápiás ágensek kifejlesztése során, a TMP dimer eltérő típusát és a rokon struktúrákat egy második TMP peptid N-terminálísához kapcsoljuk, vagy közvetlenül, vagy egy linkeren keresztül, és vizsgáljuk ennek a dimerizádos stratégiának a hatását a kapott dímer molekulák biológiai aktivitására. Néhány esetben ezeket az úgynevezett tandem dimereket (C-N kapcsolat) úgy terveztük meg, hogy a két monomer között linkerek legyenek, a línkerek előnyösen természetes anxinosavakböl állnak, ennek következtében a szintézisüket a rekombináns technológiákkal hozzáférheA jelen találmány egy olyan vegyületcsoporton alapul, ami trombopoíetikus aktivitással rendelkezik, és amiről azt gondoljuk, hogy' aktivitását az endogén TPO receptorhoz, a e-Mplhez kapcsolódva fejti ki.

Vegyületek és származékok

Az első előnyben részesített megvalósítási mód szerint a jelen találmány szerinti vegyületek az alábbi általános struktúrát amiben TMPi-et és ΤΜΡ-2-t egymástól függetlenül az alábbi központi struktúrát tartalmazó vegyületek csoportjából választjuk ki:

Xa-Xs-JU-Xs-Xö-Xy-Xs-Xs-Xw amiben

Xs-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gly és Ála;

X4 jelentése Pro;

Xs-őt az alábbi csoportból választjuk ki; Thr és Ser;

Χδ-ot az alábbi csoportból választjuk ki; Leu, He, Val, Alá és Phe; X?-et az alábbi csoportból választjuk kk Arg és Lys;

Xs-at az alábbi csoportból választjuk, ki: Gin, Asn és Glu;

Xs-et az alábbi csoportból választjuk ki: Trp, Tyr, Cys, Alá és Phe; Xio-et az alábbi csoportból választjuk kk Leu, lle, Val, Alá, Phe, es Lys;

Li egy, az alábbiakban ismertetett linket; és n érteke ö vagy 1;

valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.

Az egyik megvalósítási mód szerint Li jelentése (Gly)n, amiben n érteke 1-20, és ha n értéke 1-nél nagyobb,. akkor a Gly csoportoknak maximum a fele helyettesíthető egy másik aminoi6 savval, amit a többi természetes aminosav, vagy azok sztereo·· izomerei közül választjuk ki.

Az előzőkben a TMPi-re és TMPs-re megadott X2-X10 központi struktúrája mellett más rokon struktúrák is lehetnek, ahoiis az alábbiak közül egyet vagy többet hozzáadunk a TMPi és/vagy a TMPa központi struktúrájához: Xí kapcsolódik az N~ terminálishoz és/vagy az Xu-et, Xt2-i, Xis-at és/vagy az Xi4~et a C-termínálishoz kapcsoljuk, ahoiis Xí, Xí?, Xn és Xk jelentése az alábbi:

Xiet az alábbi csoportból választjuk ki: lle, Alá, Val, Leu, Ser és Arg;

Xu-et az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, lle, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His és Glu;

Xi2-t az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, lle, Val, Leu, Phe, Gly , Ser és Gin;

Xí3-at az alábbi csoportból választjuk ki: Arg, Lvs, Thr, Val, Asn, Gin és Gly; és

X{4-et az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, lle, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu és Gly.

A „TMP” szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy olyan egység, ami például 9 alegységet {X2-X10I tartalmaz, ahoiis Xa-Xio a központi struktúra. Az Μμ alegységek előnyösen aminosavak, amiket egymástól függetlenül választhatunk ki a 20 természetes aminosav közül, azonban a találmány olyan vegyületekre vonatkozik, amikben Xs-Xw-et egymástól függetlenül atipikus, nem-természetes,a szakterületen jól ismert aminosavak közül választjuk ki. A specifikus, előnyben részesített aminosavakat minden egyes pozícióban azonosítjuk. Az Xz lehet például Glu, Asp, Lys vagy Val, Az aminosavaknál a továbbiakban mind a hárombetűs, mind az egybetűs rövidítéseket használjuk; a rövidítések minden esetben a 20 természetes aminosavra használt standard rövidítések, vagy azok jól ismert variációi. Ezek az aminosavak lehetnek L vagy D- optikai konfigurációjúak (a Giy kivételével, ami sem L sem D konfigurációval nem rendelkezik)., és a T'MP-k tartalmazhatják az optikai konfigurációk kombinációit. Azonban a TMP láncban mindegyik amínosav esetében az L optikai konfigurációt részesítjük előnyben. A találmány tárgyát képezik továbbá a reverz TMP molekulák, amikben az aminosavaknak az N-terminálistól a C-terminálísig terjedő szekvenciája meg van fordítva. Például egy XrX-rXs normális szekvenciával rendelkező molekula reverze az Xs-Xk-Xi. A találmány tárgyát képezik továbbá a retro-reverz TMP molekulák, amikben, a reverz TMP-hez hasonló módon, az aminosavaknak az N-terminálistől a C-terminálísíg terjedő szekvenciája meg van fordítva, és a normálisan „L” enantiomerek a ,,D” sztereoizomer formájára vannak változtatva.

Emellett a találmány tárgyát képezik továbbá a TMP-k fiziológiásán elfogadható sói is, A „fiziológiásán elfogadható sók” szakkifejezés bármilyen sőt jelent, ami ismert, vagy a későbbiekben derítik ki róla, hogy gyögyászatilag elfogadható. Néhány specifikus, előnyben részesített példa a következő: aeetát,

trífiuoracetát, hidroklorid, hidrobromíd, szulfát, citrát, tartarát, glikolái, oxalát.

Azt is megfontoltuk, hogy a TMP-1 „származékai” lehetnek az előzőkben ismertetett TMP-k helyettesített formái. A TMP-k ilyen származékok közé tartoznak azok az egységek, amikben az alábbi módosítások közül egyet vagy többet végrehajtunk:

a peptidil [~€O(OjMR~] kapcsolatok (kötések) közül egyet vagy többet egy nem-peptidíl kötéssel helyettesítünk, azaz például egy -CHa-karbamát kötéssel {-€H2~OC(O)NR~j; egy foszfonát kötéssel; egy -CHa-szulfonamid [-CBrS(Qh.HR~) kötéssel; egy karbamid [-NHC(O)NH-) kötéssel; egy ~€Ha~ szekunder amin kötéssel; vagy egy alkilezett peptid kötéssel )-C(O)HR⁶, amiben R^#;> jelentése alkilcsoport);

a peptidekben az N-terminálisból egy -NRR¹ csoporttal; egy ~NR€(O)R csoporttal; egy ~NRC(O)OR csoporttal; egy' NRSfOsIR csoporttal; egy BHCRNHR csoporttal készítünk származékot, amikben R'^s jelentése hidrogénatom vagy alacsony szénatomszámú alkilcsoport, azzal a feltétellel, hogy R és RJ egyszerre nem lehet hidrogénatom; egy szukcinímíd csoport; egy benziloxikarbonil-NH~{CBZ~NH~} csoport; vagy egy benziloxikarbonil-NH-csoport, ami a fenilgyürűn 1-3 helyettesítést tartalmaz, amely helyettesítőket az alábbi csoportból választjuk ki; alacsony szénatomszám alkilcsoport, alacsony szénatomszámú alkoxi csoport, klóratom és brómatom; és azok a peptidek, amikben a szabad C-terminálisból ²-vel készítünk származékot, amiben R²-t az alábbi a cső19 portból választjuk ki; alacsony szénatomszámű aikoxi csoport és •••NR^;‘R⁴, amiben R³ és R⁴ egymástól, függetlenül lehet hidrogénatom és alacsony szénatomszámű alkiicsoport. Az „alacsony” alatt olyan csoportot értünk, ami 1-6 szénatomot tartalmaz.

Emellett a TMP molekulába az egyes amínosavak módosítását vihetjük be, oly módon, hogy a peptid megcélzott aminosav csoportjait reagáltatjuk egy szerves származékképző reagenssel, ami lepni a kiválasztott aminosav lánccal vagy temibálís csoporttal. Az alábbiakban példákat adunk meg;

A lízinil és amino terminális csoportokat re&gáltathatjuk •szukcínanhidriddel vagy más karbonsavanhidriddel. Az ezekkel a reagensekkel végzett származékképzésnek az a hatása, hogy megfordítja a lízinil-csoportok töltését. Az alfa-aminocsoportot tartalmazó csoportokból származék készítésére alkalmas reagensek közé tartoznak az imidoészterek, azaz például a metilpikoünimidát; a piridoxál foszfát; a piridoxál; a klörborohidríd; a trinítrohenzolszulfonsav; az ö-metilizokarbamid; a 2,4lízált reakció glioxaláttal pentándion; és a transzamínázzai k;

Az argíml-csoportok egy vagy több hagyományos reagenssel való reakcióval módosíthatók, azaz például fenilglioxállal, 2,3butándlonnal, 1,2-eiklöhexán.díonnal és ni.nhidrin.net Az arginínszármazék készítéséhez arra van szükség, hogy a reakciót lúgos körülmények között hajtsuk végre, mivel a guanidin funkciós csoportnak magas a pKa értéke. Emellett ezek a reagensek reagálhatnak a lízin csoportjaival,, valamint .az arginin guantdincsoportjaival Is.

A tírozii-csoportok specifikus módosítását önmagában is alaposan tanulmányozták, és különösen alaposan vizsgálták spektrális jelölések bejuttatását a tírozibcsoportokba, aromás diazónium vegyüietekkel vagy tetranitromefánnal végzett reakcióban. Az a legáltalánosabb, ha N~acetílímidazolt és tetranitrometánt használunk O-acetil brazil-csoportok és 3~nitro származékok előállítására.

Á karboxíl oldalláncokat {aszpartíl vagy glutamii csoportokat) szelektíven módosíthatjuk, karbodiimidekkel (R'-N'-C-N-R'j azaz például 1 -cíklohexil~3~(2-morfolinü-(4-etilj-karbodíim.i.ddel vagy l-etiÍ-3’(4-azonía-4,4-dimetílpen.til). karbodiimiddel reagáltatva. Emellett az aszpartíl- és gíutamií-csoportokat ammóniumionokkal aszparagin.il- és glutaminil-csoportokká alakíthatjuk át.

A glutaminil- és aszparaginil-esoportokat gyakran dozaminálják a megfelelő glutamii- és aszpartíl csoportokká. Egy másik változat szerint ezeket a csoportokat enyhén savas körülmények között dezamidálhatjuk. Ezeknek a csoportoknak akármelyik formája a jelen találmány oltalmi körébe tartozik.

A bífunkcíös ágensekkel kapott származékok jói használhatók a peptidek vagy funkcionális származékaik egy vízben oldhatatlan hordozóhoz vagy más makromolekuláris hordozóhoz keresztkőtésekkel való hozzákötéséhez. Az általánosan használt keresztkötéses ágensek közé tartozik például az .l,l-bi:sz(diazo,u észté a 4-azi.doszaiicilsav észterei.

homobiíúnkciönális imidoészterek, beleértve a díszukdmmídil észtereket, azaz például a 3,3*-ditiobisz (szukcinimidüpropionát), és a bifunkcíós maleimídek, azaz például a bisz-N-maleímidol,8~oktán. A származékképző ágensek, azaz például a metíl-3((p-a.zidoien.il) ditiojpropioímidát fénnyel aktiválható intermediereket eredményeznek, amik fény jelenlétében képesek keresztkötéseket létrehozni. Egy másik változat szerint a fehérje immobilixálására reaktív vízben oldhatatlan mátrixokat, azaz például brómeiannal aktivált szénhidrátokat használhatunk, és a reakeiöképes szubszírátokat a 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 és 4,330,440 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban írták le.

Más lehetséges módosítás lehet a prolin és a lizín hidroxilezése, a szeríl- vagy treoníl-csoportok foszforilezése, a kénatomok oxidálása a Cys amínosavban, a lizín, arginin és hiszIldin oldalláncok alfa-amino csoportjainak medlezése (Creighton, T.E.: „Proteind; Structure and Molecule Properdes”, 79-86. oldal. W.H. Freeman & Co., San Francisco (1983)], az N-terminális amin acetiíezése, és néhány esetben a C-terminális karboxíEzeknek az egységeknek a származékai előnyösen javítják a találmány szerint vegyületek egy vagy több jellemzőjét, beleértve a tromböpöíetikws aktivitást, az oldhatóságot, az abszorpciót, a biológiai fél-életidőt és a. hasonlókat. Egy másik változat szerint az egységek származékai olyan vegyületek, amik ugyanazokkal.

··}:?

vagy lényegében ugyanazokkal a jellemzőkkel és/vagy tulajdonságokkal rendelkeznek, mint azok a vegyületek, amikből nem készült származék. Az egységek egy másik változat szerint elimlnáiják vagy legyengítik a vegyületek bármelyik nemkívánatos tulajdonságát és a hasonlókat.

Az előzőkben megadott központi struktúrák, azaz az Xa-Xw mellett más struktúrákat is megfontolunk, amikben egy vagy több további X csoport kapcsolódik a központi struktúrához. így az Xh, és/vagy az Xn, X12, Xa és az Xh kapcsolható a központi struktúrához. Példaként néhány további struktúrát adunk meg:

X2-X3-X4~Xs-X6-X7~Xs~Xo-Xh3-X: 5;

Xz-X.uX^-Xs-Xs-Xr-X^Xv-XíO'-Xu-Xn:

X2-X3 -X4~Xő~X6~X7-Xs~X<)~X ω~Χ 11-Xu-X 1x

Xs-Xa-X^-Xs-Xe-Xr-Xs-Xo-’XiO-Xn-Xu-Xu-Xih

XrXr-X3“X4-Xs-X&~X?-X»~X^Xío~Xn;

Xi- Xa-Xs-X^-Xs-Xö-Xz-Xe-Xs-Xio-Xi I ’Xu;

X s - X₂-X3~X4~Xs-Xö~X7~Xs~X9~Xto-Χι 1 -Xu-Xi.x

Xr- X2-Xo~X4~Xs-Xö-X7-Xs-Xg-Xio-Xn-Xu-Xi3-X:4;

amikben Xt-Xi4 jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megadtunk. Mindegyik TMPt-nek és TMPs-nek lehet azonos vagy eltérő a szekvenciája és/vagy hossza. Néhány előnyben részesített megvalósítási mód szerint a TMPi és a TMP2 azonos.

Egy különösen előnyben részesített TMP a következő:

Ile Glu Glv Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Alá Alá Arg Aia (L számú szekvencia)

A továbbiakban a „tartalmaz'’ szakkifejezés jelentése többek között az, hogy egy' vegyület további aminosavakat tartalmazhat, egy adott szekvencia mindkét, vagy C-terminálisán., Azonban ameddig például az Xa-Xw, Xs-Xh struktúra, vagy egy másik, példaként megadott struktúra jeles van, a kémiai struktúra többi része kevésbé fontos. Természetesen a központi X2-X50 struktúrán, vagy az Xi-Xh· struktúrán kívül bármilyen struktúra nem zavarhatja jelentősen a vegyület trombopoietikus aktivitását, Például egy N-íerminális Met csoportról ís azt gondoljuk, hogy' a jelen találmány oltalmi körébe tartozik. Emellett, bár számos találmány szerinti vegyület tandem dimer, amennyiben két TMP egységet tartalmaznak, a jelen találmány szerinti más vegyüietek a TMP-k tandem multimegei, azaz az alábbi, példaként megadott struktúrával rendelkeznek:

TMP1-L-TMP2-L-TMP3;

TMPi-b-TMPz-L-TMPs-b-TMP^;

TMPi-L-TMP2:-L-TMP₃-L-TMP4aholis TMPi, ΤΜΡ2» TMPs, TMP4 és WPs jelentése lehet ugyanaz., vagy más struktúra, és amiben mindegyik TMP és b jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben definiáltunk, és mindegyik l'inker opcionális, A jelen találmány' szerinti vegyüietek előnyösen 2-5 TMP egységet tartalmaznak, különösen előnyösen 2-3 egységet, és legelőnyösebben 2 egységet. A jelen találmány ezen megvalósítási módja szerint előnyösen összesen körülbelül hatvannál kevesebb, még előnyösebben negyvennél kevesebb aminosavat tartalmaznak (azaz peptidek).

Amint azt az előzőkben megjegyeztük, a jelen találmány első megvalósítási módja szerinti vegyületek előnyösen TMP dimerek, amik vagy közvetlenül kapcsolódnak -egymáshoz, vagy egy linker csoporton keresztül, A monomer TMP egységeket a hagyományos orientáció bán mutatjuk be, balról jobbra,, az N-terminálistől a C «terminális felé olvasva. Ennek megfelelően látható-, hogy mindegyik találmány szerinti vegyületnek olyan az orientációja, hogy a 'TMP? C~terminálisa vagy közvetlenül, vagy egy linkeren keresztül a TMP2 K-terminálisához kapcsolódik. Ezt az orientációt nevezzük tandem, orientációnak, és a találmány szerinti vegyületeket általában „tandem dimerekként” említjük. Ezeket a vegyületeket dimerekként említjük, akkor is, ha a TMP? és a TMP2 szerkezete eltérő. Azaz mind homodimerekre, mind heterodimerekre gondolunk.

A «linker” csoport („Lj”). opcionális. Ha jelen van, akkor nem kritikus, hogy mi a kémiai struktúrája, mivel főleg térkitöltőként szolgál. A linkért ügy kell kiválasztani, hogy ne zavarja a végső vegyület biológiai aktivitását, és figyelembe kell venni, hogy ne növelje meg szignifikánsan a végső vegyület ímmunogenicitását. A linker előnyösen pepíidkötésekkel összekötött amínosavakból áll. Tehát az előnyben részesített megvalósítási módok szerint a linker ¥«-t tartalmaz, aholis Y jelentése egy természetes amino-sav, vagy annak sztereoizo-meije-, és „n* jelentése 1 és 20 között bármilyen szám. Tehát a linket 1-20 aminosavból állj amiket peptídkotések tartanak össze, és az aminosavakat a 20 természetes aminosav közül választhatjuk ki. Egy ennél is jobban előnyben részesített megvalósítási mód szerint az Γ-20 amino-savat az alábbi csoportból választjuk ki: Gly, Alá, Pro, Asn, Gin, Cys, Lys. Még ennél is előnyösebb, ha a tinfcerben az aminosavak többsége szférikusán nem gátolt, azaz Gly, GIy~Gly~((Gly)2j, Gly-Glv-Gly((Gly)sj... (Glyhe, Alá, Gly-Ala. Ala-Gly, Ala-Ala, stb. A linketekre más specifikus példák az alábbiak:

(GlybLys(Giy)4 (6. számú szekvencia);

(Gly)^:3AsnGly.Ser(Gly)^:2 (7. számú szekvencia);

(ez a struktúra egy glíkozilezési helyet biztosít, ha rekombináns DNS technológiával állítjuk elő olyan emlős sejtrendszerben, ami képes glikozilezm az ilyen hely< (GlyjaCysíGlyh (8, számú szekvencia); és

GlyProAsnGly (9. számú szekvencia).

A fenti nevezéktan magyarázatához annyit, hogy a (GlykLys(Gly)4 jelentése Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. A Gly és az Alá kombinációit is előnyben részesítjük.

Nem-peptides linkerek is lehetségesek. Ilyenek például az alkíl-línkerek, úgymint a -HN-fCHaJsrCO·-, ahol s értéke 2 és .20 között lehet. Ezek az alkíl linkerek tovább helyettesíthetők szférikusán nem gátolt csoporttal, azaz például alacsony szénatomszámű alkilcsoporttal (például Ci-Ca), alacsony szénatom26 * * számú acilcsoporttal, halogénnel (például Cl, Br), CN csoporttal· NPb csoporttal, fenílcsoporttal· stb.

A nem-peptíd linket egy másik típusa egy polietiléngilkol csooort, azaz

-HN-CH₂-CH₂-(O-CHz-CH₂h-CH₂-CO ahol n értéke akkora, hogy a iinker teljes molekulasúlya körülbelül löl és 5000 között legyen, előnyösen 101 és SÖÖ között.

Általánosságban felfedezték, hogy egy körülbelül 0-14 alegységet (azaz aminosavat) tartalmazó Iinker az előnyős a jelen találmány első megvalósítási módja szerinti trombopoietikus vegyü letekhez.

A peptid linkerek megváltoztathatok, ugyanolyan származékok készítésével mint amit az előzőkben a TMP-kre leírtunk.

nek

Az ebbe az ebö csoportba tartozó v< továbbá lineárisak vagy ciklikusak. A „ciklikus* szakkifejezés azt jelenti, hogy a molekulának legalább két külön, azaz nem folyamatos részét egymáshoz kötjük. Például a molekula N-termináiis és C-terminális végét kovalens kötéssel egymáshoz .kapcsolhatjuk, ciklikus molekula előállításával, Egy másik változat szerint a molekula tartalmazhat két vagy több Cys csoportot h· azaz például a línkerben), ami diszulfíd-híd képződése közben eiklizálódík. Továbbá azt ís megfontoljuk, hogy egynél több tandem peptid dimer kapcsolódhat össze, ezzel a dlmerek dimerjét képezve. így például egy Cys csoportot tartalmazó tandem dimer intermolekuláris diszulfid-hldat képezhet egy

.másik ilyen dimet Cys csoportjával. Lásd például az alábbiakban a 20. számú szekvenciát.

A jelen találmány szerinti vegyületek kovalens kötéssel vagy nem kovalens kötéssel asszociálódhatnak egy hordozó molekulához, azaz például egy lineáris polimerhez (például polietiléngUkol, polilízin, dextrán, stb.), egy elágazó láncú polimerhez [lásd például a 4,289,872 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást, benyújtó Denkemvalter és munkatársai, kibocsátva 1981. szeptember 15-én; az 5,229,490 számú Amerikai Egyesült Áöamok-beii szabadalmi leírás, benyújtó Tam. kibocsátva 1993. július 20-án; a WO 93/2X259 számú szabadalmi leírás, benyújtó Frechet és munkatársai, kibocsátva 1993. október 28-ánj; egy lipitihez; egy koleszterin csoporthoz (azaz például szteroidhoz); vagy egy szénhidráthoz vagy oligoszacharídhoz. Más lehetséges hordozó lehet egy vagy több vízoldható polimer, azaz például a políoxietilénglikol vagy a polipropiléngííkol amint azt a 4,640,835, 4,496,689, 4,301133, 4,670,417, 4,791,192 és 4,179,337 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban említik. A szakterületen ismert más használható polimerek közé tartozik például a monoraetoxi-pobetilénglikol, a dextrán, a cellulóz, vagy más szénhidrát alapú polimerek, a poii(N “Vinil-pirrolidonj-polietíéngiikol, a propilénglikol homopolíme rek, a polipropilénoxid/etllénoxid 'kopolimer, a polioxietilezett poliolok (mint például a glicerin) és a polívinil-alkohol, valamint ezeknek a. polimereknek az elegye.

ΧΛ »*

Egy előnyben, részesített ilyen hordozó a polletilénglikol (PEG), A PEG csoport molekulasúlya megfelelő értek lehet, és lehet egyenes- vagy elágazó szénláncú. A PEG átlagos molekulaa előnyösen 2 kDa és 100 kDa között lehet, még előnyősebkörülbelül 5 kDa és körülbelül 50 kDa között, legelőnyösebben körülbelül 5 kDa és körülbelül lö kDa között.

A PEG csoportok általában acüezéssél, reduktív alkilezéssel, Míchael addícióval, tioi-alkilezéssel vagy más kemoszeiektív konjugációs/ligációs módszerrel kapcsolhatók a alálmány szerinti vegyületekhez, a PEG csoporton levő reakciős csoporton (azaz például egy aldehiden, amino-, észter-, alfa-haloacetíl, maleímido- vagy hldrazín-csoporton) keresztül a megcélzott vegyület egy reakcióképes csoportjához (azaz például egy aldehid-, amino-, észter-, dől·, alfa-haloacetil·, maleímido- vagy hldrazín) csoporthoz.

A szénhidrát foligoszacharid) csoportok egyszerűen kapcsolhatók azokhoz a helyekhez, amikről ismert, hogy a fehérjékben ghkozilezési helyek. Általában az O-kapcsolt oiigoszacharídok a szerín (Ser) vagy treonin (Thr) csoporthoz kapcsolódnak, mig az N-kapcsolt oiigoszacharídok az aszparagin

Ser/Thr -szekvencia részét képezik, ahol X jelentése bármilyen aminosav lehet, a prolin kivételével. X jelentése előnyösen a 19 természetes aminosav bármelyike lehet, a prolin kivételével. Az N-kapcsolt és O-kapcsolt oügoszaoharidok struktúrái, és az egyes típusokban talált cukormaradékok eltérőek. A cukrok egyik ti29

Λ Φ

pusa, ami mindkettőn megtalálható, az N-acedlneuraminsav (másnéven sziáísav). A sziálsav általában mind az N-kapcsolt, mind az Ο-kapcsolt olígoszacharid végcsoportja, és negatív töltése miatt savas tulajdonságot ad a giíkozílezett vegyületnek. Az ilyen helyeket beépíthetjük a jelen találmány szerinti vegyületek linkerébe, és a polipeptid vegyület rekombináns módszerrel való előállítása során egy sejt (azaz például emlős sejt, mint például a CHO, a BHK, a COS) képes glikozilezní. Azonban ezek a helyek tovább glikozilezhetök a szakterületen ismert szintetikus vagy fél szintetikus eljárásokkal.

A jelen találmányban példaként megadott peptidek közül néhányat az alábbiakban sorolunk fel. Egybetüs aminosav rövidítéseket használunk, és a linkereket az egyszerűségkedvéért vonalakkal elválasztva mutatjuk be. További rövidítések: BrAe jelentése brömacetil (BrC%C(Q))_? míg a PEG jelentése polietiléngiikol.

IEGPTLRQWtAARA-GPNG-lEGPTLRQWkV\RA (10. számú szekvencia) lEGFTLRQCLAARA-GGGGGGGG-lEGPTLRQCLAARA (ciklikus) ϊ {

3_!

(11. számú szekvenciái

1EGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-1EGPTLRQCLAARA (lineáris) (12. számú szekvencia)

ÍEGPTLRQALAARA- GGGGGGGG- ÍEGPTLRQALAARA (13. számú szekvencia) lEGPTLRQWLAARA- GGGGGGGG- lEGPTLRQWLAARA (14. számú szekvencia)

3Ö

IEGPTLRQWLAARA- GGGK(BrAc)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (15. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (16. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGK(PEG)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (17, számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGC{PRG)GGGG~ IEGPTLRQWLAARA (18. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGNGSGGG- IEGPTLRQWLAARA (19. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- IEGRTLRQWLAARA (20. számú szekvencia)

IEGPTLRQWLAARA- GGGGGCGG- IEGPTLRQWLAARA (21. számú szekvencia)

Mindegyik előzőkben említett vegyületben egy M-terminális Met-et (vagy M-et, az egybetüs kőd szerint) is megfontoltunk, A fenti vegyületek multimerjeít (azaz tandem és nem-tandem, kovalens kötéssel vagy nem kovalens kötéssel összekapcsolva) is megfontoltuk,

A jelen találmány egy második megvalósítási módja szerint az előzőkben ismertetett vegyületeket egy vagy több Fc csoporttal fúzionáltathatjuk, akár közvetlenül, akár linker csoportokon keresztül. Ennek a második csoportnak a képlete általánosságban az alábbi:

|Fc^-(UkTMPí-Mn-™P2-(L3k-(Fc)p

Φ * χ fe * * χ ahohs ΤΜΡι, ΤΜΡ₂ és η jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megadtunk; fe; fe és fe jelentése linkercsopórt, amiket egymástól függetlenül választhatunk az előzőkben ismertet linker csoportokból; az Pe jelentése egy immunglobulin Fc csoportja; m, p, q és r érteke egymástól függetlenül lehet 0 és 1, azzal a feltételiéi, hogy m és p közül legalább egynek az értéke 1, emellett, ha m értéke 0 akkor q értéke is 0, és ha p értéke 0, akkor r értéke is ü; valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói,

Ennek megfelelően, az ebbe a második csoportba tartozó vegyületek struktúrája ugyanaz, mint az előzőkben meghatározott vegyületeknek» de ezeket a vegyüieteket még legalább egy Fc csoporthoz fúzionáltatjuk, közvetlenül, vagy- egy vagy több linker csoporton

A fenti vegyületek. Fc szekvenciája lehet a humán immunglobulin IgG-l nehéz lánca (Eliison, J.W, és mtsai; Nucleic Acids Research 10, 4071-4079 (1982)], vagy bármelyik másik, a szakterületen ismert Fc szekvencia (azaz például más IgG osztályok, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat az. lgG-2-t, az lgG-3-at és az IgG4-et, vagy más immunglobulínokat),

Az közismert, hogy az ellenanyagok Fc régiói monomer polipeptíd szegmensekből tevődnek össze, amik dimer vagy multímer formákká kapcsolódhatnak össze, díszulfid-hidakkal vagy nemkovalens asszociációval. A természetes Fe molekulák monomer alegységei közötti intermclekuláris díszulfid-hidak száma 1 és 4 között változik, a szóban forgó ellenanyag-osztálytól (azaz például ··* ί * β « <· ♦- « frat

»4.

♦ *·* *

IgG. IgA, IgE) vagy •alosztálytól (azaz például IgGl, ígG2, IgG3, igAl, JgGAÜ) függően. Az „Fc* szakkifejezés jelentése a továbbiakban gyűjtőnév, ami vonatkozik az Fc molekulák monomer, dimer és multimer formáira ís. Meg kell jegyeznünk, hogy az Fc monomerek spontán dimerízálnak a megfelelő Cys csoportok jelenlétében, hacsak nem olyanok a körülmények, amik megakadályozzák a diszulfid-híd képződésével lejátszódó dímerizácíót. Még akkor is, ha a Cys csoportokat, amik normális körülmények között diszulOd-hidakat képeznek az Fc dímerhen, eltávolítjuk, vagy más csoportokkal helyettesítjük, a monomer láncok tan dimenziódnak nem-kovalens kólcsönhaiásokkah Az „Fc” szakkifejezés a továbbiakban az bármelyiket jelenti: természetes monomer, természetes dimer szulfid-hiddal összekötve), módosított dímerek (diszulfiddal és/vagy nem-kovalens kötéssel összekapcsolva) és módosított monomerek (azaz származékok).

Az Fc rész variánsai, analógjai vagy származékai előállíthatok például a csoportok vagy szekvenciák különböző helyette·

A variáns (vagy analóg): polipeptidek közé tartoznak az inszerciös variánsok, amikben egy vagy több aminosav csoport helyettesít egy Fc aminosav szekvenciát. Az inszercíők: elhelyezkedhetnek a fehérje mindkét, vagy bármelyik végén, vagy elhelyezhetők az Fc aminosav szekvencia belső régióiban. Az inszerciös variánsok, amik további csoportokat tartalmaznak mindkét, vagy bármelyik végen, lehetnek például fúziós fehérjék, valamint olyan fehérjék, amik aminosav jelöléseket vagy címkéket tartalmaznak. Az Fc molekula például adott esetben tartalmaz· egy N~ terminális Met csoportot, főleg akkor, amikor a molekula rekombináns módszerekkel expresszálódik egy bakteriális sejtben, azaz Sscherichia eok-han.

Az Fc delécíós variánsok esetében egy Fc polipeptidből egy vagy több aminosav csoportot eltávolítottunk. A deléciók lehetnek az Fc polipeptid mindkét, vagy bármelyik végén, de lehet az is, hogy egy vagy több csoportot eltávolítottunk az Fc aminosav szekvencia belsejéboL A delécíós variánsok tehát egy Fc polipeptíd szekvencia összes fragmensét tartalmazzák.

Az Fc szubsztitűciós variánsokban egy Fc polipeptid egy vagy főbb aminosav csoportját eltávolítjuk, és más csoportokkal helyettesítjük. Az egyik megvalósítási mód szerint a helyettesítések konzervatív természetűek, azonban a találmány oltalmi körébe tartoznak a nem-konzervatív helyettesítések is.

A císztein csoportokat például kivághatjuk, vagy más amínosav csoportokkal helyettesíthetjük, hogy ezzel megakadályozzuk néhány, vagy' az összes díszulfid-híd kialakulását az Fc szekvenciákban. Pontosabban, az 5, számú szekvencia 7-es és 10-es pozíciójában levő aminosav císztein. Ezeket a císztein csoportokat eltávolíthatjuk, vagy egy vagy több ilyen ciszteínt más aminosavval, például alanínnal vagy szerinnel helyettesíthetünk. Ugyanúgy mint más példáknál, olyan módosítások is tehetők, amikkel (1) eltávolítjuk az Fc receptor kötőhelyet; (2) eltávolítjuk a komplement (Clq) kötőhelyet; és/vagy (3) eltávolítjuk az ellena34 nyag-dependens, sejtek által kőzve titett citofoxícitási (ADCC) helyet. Az ilyen helyek ismertek a szakirodalomban, és bármilyen ismert helyettesítés, ami az IgGl-ben levő ADCC helyekre vonatkozik, az itt használt Fc oltalmi körébe tartozik (Molecular ímmunology' 2915), 633-639 (1992)).

Hasonlóképpen, egy vagy több tírozin csoport helyettesíthető fenílalanin csoporttal is. Emellett más variáns aminosav irtszercíók, deléciók (ami lehet például 1-25 aminosavra kiterjedő), szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak. Általában a konzervatív aminosav helyettesítéseket részesítjük előnyben. Emellett, a változások lehetnek megváltoztatott aminosav formájúnk, azaz például peptidomimetíkumok vagy D~aminosavak,

A TMP vegyület Fc szekvenciáiból is készíthetők származékok, azaz olyanok, amik aminosav inszereíőtől, deléciötól vagy helyettesítéstől eltérő módosításokkal rendelkeznek. A módosítások előnyösen kovalens természetűek, és ide tartozik például a polimerekkel, tipldekkel más szerves és szervetlen anyagokkal való kémiai kötődés, A jelen találmány szerint olyan származékok készíthetők, amik megnövelik a keringési fél-életidőt, vagy úgy tervezhetők meg, hogy javítsák a polípeptidnek a kívánt sejtekre, szövetekre vagy szervekre való célzási kapacitását.

Az is lehetséges, hogy az érintetlen Fc molekula kimentő receptorkötő dóm énjét használjuk a jelen találmány szerinti vegyületek Fe részeként, ahogy azt például a WO 96/32478 számú szabadalmi leírásban közzétették, aminek címe: „Altered polypeptides with Increased Half-Lífe”. Az itt Fe néven említett nálisán vagy C-terminálisán, illetve a molekula-osztály további tagjai a WO 97/34631 számú szabadal mi leírásban említettek, amelv leírásnak a címe: „Immunoglöhuiin-Like Domains with íncreased Halí-Lives*. Az ebben a fejezetben idézett mindkét PCT publikációt a továbbiakban referenciaként kezeljük.

Az Fc fúziókat létrehozhatjuk a TMPi vagy a TMP2 N-termiP-k mindkét végén,

Meglepő módon felfedeztük, hogy azok a peptidek, amikben egy Fc egység ligálodik a TMP csoport N-terminálisához, biológiailag aktívabbak, mint a többi lehetséges fúziós molekulák, tehát előnyben részesítjük azt a fúziót, amiben a TMPt N-terminálísán egy Fe dómén van (azaz az általános képletben r és p értéke 0, valamint m és q értéke 1). Ha az Po lánc a TMP vagy a linker Hterminálisához fuzionálődik, akkor az ilyen fúzió általában az Fc lánc C-terminálisán jön létre, és fordítva.

Emellett előnyben részesítjük azokat a vegyületeket, amik az előzőkben ismertetett általános képletnek megfelelő vegyületek dimerei (ami lehet tandem és nem-tandem). Ezekben az esetekben mindegyik Fc lánc kötődhet a TMP peptidek tandem dimerjéhez. Egy ilyen vegyület sematikus példáját a 6C. ábrán mutatjuk be. Az ilyen típusú vegyület egy előnyben részesített példája a 6C. ábrán alapul, aholis az Fc az 5. számú szekvencia szerinti vegyület dímerje, mindegyik La jelentése (Gly)s, mind a TMPt, mind a TMPa az 1. számú szekvenciának megfelelő vegyület. és mindegyik ti jelentése (Glyjs. Ezt a vegyületet nevezzük még _J,Fc~TMPi-L~TMP2”-nek is. Ez reprezentálható a 34. számú ♦* szekvencia dimerjeként ís (az Fc részen keresztül}. Az. analóg vegyűletét is megfontoltuk, amelyben az Fc csoport egy Imkeren keresztül kapcsolódik a 6C, ábrán a TMP2 csoportokhoz, ezt a továbbiakban TMPs t-TMPs- Fc jelöléssel használjuk.

A második csoportba tartozó vegyüietek néhány specifikus példáját az alábbiakban adjuk meg

(23, számi

Fc-IEGFFtRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTtRQWLAARA-Fc (24. számú szekvencia) Fc-GG-lEGPTLROWtAARA-GPNG-lEGP (25, számú szekvencia)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA

26, számú szekvencia) (27. szekvencia)

Fc-ÍEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineáris) 28, számú szekvencia}

Fc-IEGPTU (29. számú (30. számú szekvencia) (31. számú szekvencia)

Fc~IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG4EGPTLRQWLÁARA (32. számú szekvencia)

Fc-IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- ÍEG.PTLRQWLAARA

Fc-IEGFFLRQWIAARA- GGGCGGGG- IEGPTLRQWLAARA (33. számú szekvencia)

Fc-GGGGGdEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG4EGPTLRQWLAARA (34. számú szekvencia)

Mindegyik előzőkben említett vegyúletben lehet egy további N-terminális metionin (Met, vagy az egybetüs kóddal Mj ís. A Met csoport az Fc csoport ^-terminálisához kapcsolódhat, azokban az esetekben, amikben az Fc csoport a TMP N-terminálísához kapcsolódik. Azokban az esetekben, amikben az Fc csoport a TMP Cterminálisához kapcsolódik, a Met csoport a TMP csoport N~fer~ mínálisához kapcsolódhat.

Mindegyik előzőkben említett esetben Fc jelentése előnyösen a humán IgGl immunglobulin nehéz lánc Fc régiója, vagy annak biológiailag aktív fragmense, származéka vagy dimere (Eliíson, J.W. és mtsai: Nucleic Acids Research 10, 4071-4079 (1982)]. Az 5. számú szekvenciavázlaton bemutatott Fc szekvencia az előzőkben említett vegyületek közül a leginkább előnyben részesített Fc. Emellett az előzőkben említett vegyületek közül előnyben részesítjük azokat, amikben az Fc az 5. számú szekvencia az S. számú szekvencia dimer formája, és mindegyik Fc lánc egy TMP tandem dimerhez kapcsolódik.

♦ * * * ♦ ♦ * » » φ * * fc «-'«· **

Emellett, bár a második, megvalósítási mód szerint előnyben részesített vegyületek közül számos tartalmaz egy vagy több tandem dímerí, amennyiben két kapcsolt TMP egységet tartalmaznak, a jelen találmány szerinti más vegyületek. közé tartoznak a TMP-k tandem multímerei, azaz az alábbi, példaként megadott struktúrák:

r c~ s Mr j -n~ ι mru-n-1 Mm

Fc-TMPrL-Th

-LS-L·

Pc~TMPi-b~TMP2-t-TMPnL-TMP4~TMFs;

TMPi-L-TMPs-L-TMP-Fc;

TMPi~b-TMP2-L-TMP3-L~TMP4~Pc;

amikben TMPp TMP2, TMPs, TMP4 és TMPs jelentése lehet azonos vagy eltérő struktúra, és amikben az Fc és mindegyik TMP és L jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben meghatároztunk, és a linkerek opcionálisak. Mindegyik előzőkben említett esetben az

Fc csoport lehet monomer vagy dimer, és azokban az esetekben, amikor az Fc jelentése dimer, egy vagy több TMP multimert kapcsolhatunk mindegyik Fc lánchoz. Megfontoltunk más példákat is, amikben a TMP dlmerek vagy multimerek kapcsolódnak egy vagy több Fc láncnak mind az N-terminálísához, mind a C-termínálisához, beleértve azt az esetet, amelyben a TMP dimerek vagy multimerek két Fc láncnak mind a négy végéhez kapcsolódnak.

A jelen találmánynak ebben a második megvalósítási módjában szereplő vegyüietek körülbelül 200-400 aminosavat

-tartalmaznak (azaz poiipeptidek).

A jelen találmány szerinti vegyüietek számos különböző módon elöállíthatók. Mivel számos vegyület lehet peptid, vagy tartalmaz pepiidet, a peptidek szintézisének módszerei különösen relevánsak ebben az esetben. Például szilárd fázisú szintézis technikák használhatók. A megfelelő technikák jól ismertek a szakterületen, és ezeket számos publikációban jelentették meg (Merrifíeld; Chem. Polypeptides, 335-361, szerkz Katsoyannís és Fanayohs (1973); Merrifíeld: J.Am, Chem. Soc. 85, 2149 (1963); Davis és mtsai; Biochem. Inti. 10, 394-414 (1985); Stewart és Young: Solid Phase Peptide Synthesis (1.969); 3,941,763 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Finn és mtsai: The Proteíns, 3. kiadás, 2. kötet, 105-253·.. oldal (1976); Erickson és mtsai: The Proteíns,. 3, kiadás, 2. kötet, 257-527, oldal (1976)|. Az egyes peptidek előállítása során a szilárd, fázisú szintézis az előnyben részesített technika, mivel a kis peptidek előállításának ez a leginkább költséghatékony előállítási módja,

A peptidek előállíthatok transzformált gazdasejtekben, rekombináns DNS technikák alkalmazásával. Ennek végrehajtásához a pepiidet kódoló rekombináns DNS molekulát állítunk elő. Az ilyen DNS és/vagy RNS molekulák előállítási módszerei jól ismertek a szakterületen. Például a peptideket kódoló szekvenciák megfelelő restrikciós enzimekkel kivághatok a DNS-bőL A releváns szekvenciákat előállíthatjuk a polimeráz láncreakció > φ

(PCR) használatával, az utána következő klónozás megkönnyítéséhez hasznos restrikciós hasítási helyeket építve a szekvenciába. Egy másik változat szerint a DNS/RNS molekula kémiai szintézis technikákkal is megszintefízálható, például a foszforamidit módszerrel. Emellett ezeknek a technikáknak a kombinációja is használható.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy vektor, ami a peptideket egy megfelelő gazdaszervezetben kódolja, A vektor tartalmazza a DNS molekulát, ami a peptideket kódolja, és működés szempontjából a megfelelő expressziős kontroll szekvenciához kapcsolódik. Ennek az operatív kapcsolásnak a végrehajtásához használható módszerek jól ismertek, akár azelőtt, hogy a peptidet kódoló DNS molekulát beépítjük a vektorba, akár azután. Az expressziós kontroll szekvenciák közé tartoznak a promoterek, aktívátorok, fokozok, operátorok, riboszőmáiis kötőhelyek, start szignálok, stop szignálok, poliadenílezési szignálok és más szignálok, amik a transzkripció vagy transzláció szabályozásában szerepet játszanak.

A kapott vektort, ami tartalmazza a pepiidet kódoló molekulát, megfelelő gazdaszervezet transzformálására használjuk. Ezt a transzformációt a szakterületen jól ismert módszerekkel hajthatjuk végre.

A nagy' számban hozzáférhető, jól ismert gazdasejtek közül számos jól ismert használható a jelen találmány gyakorlatában. Egy bizonyos gazdaszervezet kiválasztása számos, a. szakterületen jól ismert faktortól függ. Ezek közé a faktorok közé tartozik *

4 < A 4 4 * 4 4 4 Μ

X X X 4 4 4 4 > 4

4.4 X · »4 Κ* χ* »* például a kiválasztott expressziós vektorral való kvmpa DNS molekula által kódolt peptidek toxicitása a gazdasejtre, a transzformáció gyakorisága, a peptídek kinyerésének egyszerűsége, az expressziéjellemzői, a biológiai biztonság és a költségek. Ezeknek a faktoroknak az egyensúlyát felboríthatja az a felismerés, hogy nem mindegyik gazdaszervezet egyformán hatékony egy bizonyos DNS szekvencia expresszálásában.

Ezen általános irányelveken belül a jót használható mikrohiális gazdaszervezetek közé tartoznak a baktériumok (azaz például az Eschenchia cod), az élesztő (azaz például a. Snccharompces sp. és a Hc/tía pasforis), valamint más gombák, rovarok, növények, emlős (beleértve az emberi) sejtek tenyészetét, vagy más, a szakterületen ismert gazdaszervezetek.

Ezt követően a transzformált gazdaszervezetet hagyományos fermentációs körülmények között tenyésztjük, ügy, hogy a kívánt peptidek expresszálódjanak. Az ilyen fermentációs körülmények jól ismertek a szakterületen.

Végezetük a peptideket megtisztítjuk a fermentációs tenyészetből· vagy a gazdasej'tböl, amiben expresszálódnak. Ezek. a

Azokat a vegyüieteket, amik peptid-származékokat tartalmaznak, vagy nem-pepiid csoportokat tartalmaznak, jól ismert szerves kémiai módszerekkel szintetizálhatjuk meg,

Á jelen találmány szerinti vegyületeknek: megvan a képességük, hogy megkössék és aktiválják a c-Mpl receptort, és/vagy megvan a képességük, hogy serkentsék (mind in uíoo.

« * * ♦ * * * V » ♦ e κ »» * « κ ** * Ψ V.Í Φ* β* mind in váró) a vérlemezkék termelődését („trombopoíetikus aktivitás”) és a vérlemezke prekurzorok termelődését („megakatiocltopoietikus aktivitás”). Ahhoz, hogy megmérjük ezeknek a vegyületeknek az aktivitását, standard vizsgálatokat használhatunk, például azt, amit a WG95/26746 számú szabadalmi leírásban ismertettek (címe: „Compositions and Methods fér Stimulating Megakaryonyte Growth and Diíferentiation”). Az ín vám· vizsgálatokat részletesebben ismertetjük az alábbi JPél

A jelen találmány szerinti módszerekkel és készítményekkel kezelendő állapotok általában azok, amik egy létezd megakariocita/ vérlemezke deficieneíáí tartalmaznak, vagy egy, a jövőben várt vagy előre látott megakaríocíta/vérlemezke deficiencíát (például tervezett műtét vagy vérlemezke adás következtében). Az ilyen következmények aktív Mpl lígandum in vivő defieíenciájának (ideiglenes vagy állandó) lehetnek az eredményei. A vérlemezke defíciencia. generikus szakkifejezése a tromboeítopénia, és igy a jelen találmány szerinti módszerek és készítmények általánosan hozzáférhetők a tromboeítopénia íüaktíkus vagy terápiás kezelésére, ilyen kezelésre szoruló betegben.

A WHO a tromboeítopénia mértékét az egyedekben keringő vérlemezkék száma, alapján határozza meg {Miller és mtsai: Cancer 47, 210-211 (1981)], Például egy olyan egyedben, aki nem mutatja a trombocitopénia. tüneteit (ö-ás fokozat), általában 1ÖOOOÖ vérlemezke/mm³ van. Az enyhe trombocitopéníát (1-es •η « φ fokozat.) a körülbelül 79Ö00-99ÖÖ0/mm³ vérlemezke szám jelenti. A közepes trombodtopénia. (2-es fokozat) esetében a vérlemezke szám 5ÖOÜÖ-740ÖÖ között van, a súlyos tromboeitopéniát pedig 25ÖÖ0-49ÖÖ0 vérlemezke/mm³ jelenti. A életet veszélyeztető vagy legyengítő tromboeitopéniát a 250öö/mm³~néI kisebb számú keringd vérlemezke koncentráció jellemzi,

A trombodtopénia (vérlemezke defidenciaj különböző okok miatt lehet jelen, beleértve a kemoterápiát és más terápiát, amit számos különböző gyógyszerrel, besugárzásos terápiával, műtéttel, véletlen vérveszteséggel és más specifikus kóros állapottal lehet előidézni. A példaként megadott specifikus állapotok, amik magukban foglalják a írom boci iopéniát, és a jelen találmány szerint kezelhetők, az alábbiak: aplasztikus anémia, ídiopátiás vagy immun trombocitopénia (ITP), beleértve az emlőrákhoz kapcsolódó ídiopátiás tromhocítopéniás purpureát, a HlV-hez kapcsolódó ITP-t és a HlV-vel rokon trombotíkus trombocitopéniás purpureát, az áttétes tumorokat, amik tromboeitopéniát eredményeznek, a szisztémás lupus eryth.em.atosus-t, beleértve az újszülött lupus szindróma lépmegnagyobbodást; a Fanconi szindrómát; a B12 vitamin deficíendát; a főisav deíieienciát; a MayBagglin anomáliát; a Wiskott-Aldríeh szindrómát; a krónikus májbetegséget; a tromboeitopémához kapcsolódó mielodiszpiasztikus szindrómát; a rohamokban fellépő éjszakai hemoglobinuriát; a C7B3 Fab (Abcbdmab) terápiát kővető követő akut méh'· tromboeitopéniát; az alloimmun tromboeitopéniát, beleértve a.z anyai alloimmun tromboeitopéniát; az antifoszfolípid

V-4 φ* ellenanyagokhoz és a trombózishoz kapcsolódó trombocitopéniát'; az autoimmun trombocitopéniát; a gyógyszerrel indukált immun fromhodtopéniát, beleértve a carhoplatinnal indukált trombocitopéniát; a heparinnal indukált trombocitopéniát; a magzati trombocitopéniát; a terhességi trombocitopéniát; a Hughes szindrómát; a lupoid trombocitopéniát; a véletlen és/vagy tömeges vérveszteséget; a mieloproliferatív rendellenességeket; a rákban megbetegedett emberekben kialakuló trombocitopéniát; a trombotíkus trombocitopénía purpureát, beleértve a trombotikus mikroangiopátiát, ami rákos betegekben trombotikus trombocitopéniás purpurea/hemolitikus urémiás szindrómaként nyilvánul meg; az autoimmun hemolitikus anémiát; a rejtett éhbél üreg perforációt; a tiszta vörös vérsejtes aplázíát; az autoimmun trombocitopéniát; a nephropathia epídemíca-t; a rífampídnhez kapcsolódó akut vese-elégtelenséget; a París-Trosseau trombocitopéniát; az újszülött alloímmun trombocitopéniát; a rohamok ban fellépő éjszakai hemoglobmuriát; a gyomorrák esetén fellépd hematológiai változásokat; a gyerekkori hemolitikus urémiás szindrómákat; a vírusfertőzéshez, beleértve a hepatitisz A vírushoz és a citomegalovírushoz kapcsolódó trombocitopénía hematológiai manifesztádőit, Emellett bizonyos AIDS kezelések (például az AZT kezelés) is eredményeznek trombocitopéniát. Bizonyos sebgyógyulási rendellenességek is profitálhatnak a vérlemezke számok növekedéséből.

Ami a várt vérlemezke defidencíákaí, azaz például egy ♦ ♦ λ * * X » ¢- « * *

lemezke igény előtt több nappal vagy több órával, korábban beadhatjuk. Ami az akut helyzeteket illeti, azaz a véletlen és tömeges vérvesztést Illeti, a jelen találmány szerinti vegyűletet vérrel vagy tisztított vérlemezkékkel együtt adhatjuk be,

A jelen találmány szerinti vegyületek jól használhatók lehetnek emellett a megakariocítáktől eltérő néhány sejttípus serkentésében, ha ezekről a sejtekről kiderül, hogy az Mpl receptort expresszálják. Az Mpl receptort expresszáló ilyen sejtekhez kötődő állapotok, amik reagálnak az Mpl Ugandámmal való serkentésre, szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

A jelen találmány szerinti vegyületek bármilyen helyzetben használhatók, amikben a vérlemezkék vagy vérlemezke prekurzorok termelődésére van szükség, vagy amikor a c-Mpl receptor serkentésére van szükség. Tehát például a jelen találmány szerinti vegyületek emlősökben bármilyen olyan állapot kezelésére használható, amiben vérlemexkékre, megakariocitákra és hasonlókra van szükség, Ezeket a körülményeket az alábbi, példaként megadott forrásokban ismertetik: WO95/26746; WO9S/21919; WO95/1S858; W095/2192O, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk.

A jelen találmány szerinti vegyületek emellett jól használhatók lehetnek a vérlemezkék és/vagy megakariociták és rokon sejtek életképességének vagy tárolhatósági idejének fenntartásában. Ennek megfelelően hasznos lehet, ha egy vagy több ilyen vegyület hatásos mennyiségét beletesszük ilyen sejteket tartalmazó készítményekbe.

Az „emlős’* szakkifejezés alatt bármilyen emlőst értünk, beleértve az embereket, a háziállatokat., beleértve a kutyákat és macskákat; az exoíikus és/vagy állatkerti állatokat, beleértve a majmokat; a laboratóriumi állatokat, beleértve az egereket, patkányokat és tengerimalacokat; a mezőgazdasági jelentőségű állatokat, beleértve a lovakat, szarvasmarhákat, birkákat, kecskéket és sertéseket; valamint a hasonlókat. Az előnyben részesített emlős az ember.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti vegyületeket tartalmazó .gyógyászati készítmények használatának módszerei. Egy ilyen gyógyászati készítmény elkészíthető Injekciós úton, vagy orálisan, nazálisán, transzdermábsan vagy más módon való beadásra; beleértve például az intravénás, intradermábs, intramuszkuláris, intramammáris, íntraperitoneális, intratekális, intraokuláris, retrobulbárís, intrapulmonáris (azaz például aeroszohzált gyógyszerek) vagy szubkután injekciós (beleértve a depó beadást a hosszú idejű félszabaduláshoz) beadást; vagy szublingválís, anális, vaglnális vagy sebészeti úton végzett beültetéssel végzett (azaz például a lépkapszula alá, az agyba vagy a szaruhártyá.ba. való beültetést) beadást. A kezelés állhat egyetlen dózisból, vagy egy adott Időtartam alatt több dózisból. .Általában a találmány tárgyát képezik azok. a gyógyászati készítmények, amik egy, a jelen találmány szerinti vegyűletböl hatásos mennyiseget tartalmaznak, gyógy szerekkel, konzerválószerekkel, szolubilizálökkal ijuvánsokkal és/vagy hordozókkal Az ilyen em higítozkal, ;é tartoznak a különböző p-uffertartalom (azaz például TRIS-HCI, acetát, foszfát), pH és íonerősség higitószerei; az olyan adalékanyagok, mint például a detergensek és szolubüizáló ágensek (azaz például a Tween 80, Polysorbate 80), az antioxidánsok. (azaz például az aszkorbinsav, a nátrium-metabíszulfit), a konzerválószerek (azaz például a Thimersol, a benzílalkohol), és a térkitöltő anyagok (azaz például, a iaktőz, mannit); az anyag bejuttatása polimer vegyűletek részecske készítményeibe, azaz például politejsavba, políglikolsavba, stb., vagy liposzőmákha, Hialuronsav is használható, és ennek meglehet az a hatása, hogy elősegíti a keringésben hosszabb ideig való fennmaradást A gyógyaszati ex adott esetben tartalmazhatnak más elfogadható folyadékot, félig szilárd vagy szilárd higitószereket, amik gyógyászati hordozókként, töltőanyagokként vagy közegként működnek, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a polioxietilén szorbitán monolaurátot, a magnézíum-sztearátot, a metil- és propilhldroxihenzoátot, a keményítőket, a szacharózt, a dextrózt, a gumiárábikumot, a kalcium-foszfátot, az ásványolajat, a kakaóvajat és a kakaőcserjeoiajat. Az ilyen készítmények befolyásolhatják a jelen találmány szerinti fehérjék és származékok fizikai állapotát, stabilitását, az in vivő felszabadulás sebességét, valamint az in vívó kiürülés sebességét [Remíngton’s Phai'maceutícal Sciences, 18, kiadás, 1435-1712. oldal, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042 (1990)]. A készítményeket előállíthatjuk folyékony formában, vagy lehetnek szárított por formájúak, azaz például líofilezett

φ φ Φ Φ X ******* *φβχ * >φ*φ φφ porok. A beültethető, hosszú felszabadulási idejű készítményeket is megfontoltuk, ugyanúgy, mint a transzdermális készítmenye

Az alábbiakban való felhasználáshoz megfontoltuk az orális szilárd dózisformákat, amiket általánosságban ismertetnek a szakirodalomban ÍReminaton’s Pharmaeeutiea! Sciences, IS.

kiadás 89, fejezet, Mack Pubiishing Co. Easton PA 18042 (1990)1, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A szilárd dózisformák közé tartoznak a tabletták, kapszulák, pirulák, pasztillák, szögletes tabletták, ostyák vagy labdacsok. Emellett liposzómális vagy protenoid kapszulázást is használhatunk a jelen találmány szerinti készítmények kiszerelésére (lásd például a 4,925,673 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírásban ismertetett protenoid mikrogomböket), A liposzómális kapszulázás is használható és a liposzómákhál különböze polimerekkel származékok készíthetők (lásd például az 5,013,556- számú Amerikai Egyesült Allamok-belí szabadalmi leírást). A lehetséges szilárd dózisformák leírását Marshall publikálta (Marshall, K. és mtsai: Modern Pharmaceutics, szerk.: G.S. Banker és C.T. Rhodes, 10. fejezet (1979)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A készítmény általában tartalmazza a találmány szerinti vegyületet, valamint tartalmaz inért adalékanyagokat, amik lehetővé teszik a gyomor környezetével szembeni védelmet, és a biológiailag aktív anyag felszabadulását a bélben.

* ♦♦ *

Emellett megfontoltuk az előzőkben említett találmány szerinti vegyületek dózisformáit, Ha szükséges, akkor a vegyületek kémiailag módosíthatók, oly módon, hogy az orális bejuttatás hatékony legyen, A megfontolt kémiai módosítás általában az, hogy legalább· egy egy séget csatolunk a vegyület molekulájához, ahol az említett egység lehetővé teszí (aj a proteolízis gátlását; és (b) a gyomorból vagy a bélből a véráramba való jutást. Kívánatos emellett a vegyület össz~stabilitásának a növelése, és a testben való keringési idejének meghosszabbítása. Ilyen egységek lehetnek például: políetilénglíkoi, az etilénglikoí és a propílénglikol kopolimerjei, a karboximefiicellulóz, a d extrán, a polívinii-alkohol a políviníi-pírroiídon és a poliptolin (Abuchowski és Davis: Soluble Folymer-Enzyme Adducfs, Enzymes as Drugs, 367-383. oldal, szerk,; Hocenberg és Roberts, Wlley-lnterscience, New York, NY (1981); Newmark és mtsai: 3. Appl. Biochem. 4, 185189 (1982,1). Használható polimer még a poli-l,3-dioxolán és a poH-I,3,6~tioxoteán> A gyógyászati felhasználáshoz előnyben részesítjük a polietilénglikoi egységeket.

Az orális beadási formákhoz az is lehetséges, hogy egy módosított alifás aminosav sóját használjuk, azaz például a nátrium N-(8-(2-hídroxíbenzöiHamíno) kaprilátot (SNACj, ami egy olyan hordozó, ami fokozza a jelen találmány szerinti terápiás vegyületek felszívódását. Egy heparin készítmény klinikai hatékonyságát SNAC felhasználásával az Emisphere Technologies által szervezett Fázis Π vizsgálatban demonstrálták (5,792,451 számú

Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás·, címe: „Órai drug delivery' eomposition and methods”).

A hatóanyagot a készítménybe finom részecskék formájában juttathatjuk he, körülbelül Imm részeeskeméretü granulátumok vagy labdacsok formájában. A kapszulában való beadáshoz a készítmény kiszerelési formája lehet por, gyengén vagy terápiás vágót préseléssel állíthatjuk elő.

Színező és ízesítő anyagokat ís beadhatunk. Például a fehérjét (vagy származékát) formulázhatjuk, (azaz például Προszöma vagy mikrogömb kapszulázással), majd tovább vihetjük egy fogyasztható termékbe, azaz például, hütött üdítőitalba, ami színezőanyagokat és ízesítő anyagokat tartalmaz.

A hatóanyagot hígíthatjuk, vagy térfogatát egy ínért anyaggal megnövelhetjük. Ilyen hígítőanyagok lehetnek a szénhidrátok, főleg a mannít, az alfa-laktóz, a vízmentes laktőz, a cellulóz, a szacharóz, a módosított dextránok és a keményítő. Bizonyos szervetlen sók is használhatók töltőanyagként, beleértve a kalcium-triföszfátöt, a magnézium-karbonátot és a nátriumkloridot, Néhány kereskedelmi forgalomban levő higítószer a Fast-Flo, az Emdex, a STA-Rx 1500, az Emcompress és az Avicell.

A hatóanyag szilárd dőzísformájába dezintegrálő szereket Is tehetünk, A dezintegrálő szerként használható anyagok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a keményítő, beleértve a kereskedelmi forgalomban levő, keményítő alapú ' φ » S Λ χ >Λ φ « «ϊ .;· ~ χ Φ ν χ * ν » χ 4 ·> ♦ » Λ »χ. .* V «♦ «ί·' * ·^ν Λ dezintegráció- szert, az Explotab-ot. A nátrium-keményitő glikolát, az Amberlit, a nátrium••karboxímetkcelluióz, az ultramielopektin, a nátrium-algínát, a zselatin, a narancshéj, a savas karboximet.ilcellulóz, a természetes szivacs és a bentonit is mind használható. A dezintegrálő szerek egy másik formája az oldhatatlan kationos ioncserélő gyanták. Porított gumik is használhatók dezintegrálő szerként és kötőanyagként, ide tartozhatnak például a porított gumik, azaz például az agar, a Karaya vagy a tragantmézga. Az alginsav és nátriumsója szintén jól használható dezintegrálő szer.

A kötőanyagok arra használhatok, hogy a terápiás ágenst együtt tartsuk, ezzel egy kemény tablettát alakítva ki, ami tartalmaz természetes termékeket, azaz például gumiarábikumot, tragantmézgát, keményítőt és zselatint. Más ilyen anyag például a metilcellulóz, az etilcetlulőz és a karboxímetilcellulóz, Mind a polívinil-pirrolidon (PVP), mind a hídroxipropilmetil-cellulöz (HPMC) használható alkoholos oldatokban, a terápiás ágens

Súrlódást csökkentő anyagot is tehetünk a terápiás ágens készítményébe., hogy' ezzel megakadályozzuk a letapadást a kiszerelési eljárás során. Sikositö anyagok, használhatók egy olyan rétegként, ami a terápiás ágens és a présszerszám fala között van, ezek az alábbiak lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: sztearinsav, beleértve a magnézium- és kalciumsoit, a polítetrailuoretilén (FTFEJ, a folyékony paraffin, a növényi olajok és viaszok. Oldható sikositö anyagok is használhatók, azaz például a nátrinm-dodeeíl-szulfát, a magnézium52

4* « Λ

Λ** «

ít dodecil-s a különböző molekulasúlyú ponetiléngkkolo

Carbowax 4000 és 6000.

Csúsztatóanyagok is hozzáadhatok, amik javíthatják a gyógyszer áramlási tulajdonságait a gyógyszer kiszerelése közben, és segítik az átrendeződést a préselés során. A csúsztatóanyagok közé tartozik a keményítő, a taikum, a pirogén szílíkát és a hidratált szilikoaluminát.

Ahhoz, hogy’ elősegítsük a terápiás ágens feloldódását vizes környezetben, felületaktív anyagot is adhatunk hozzá nedvesítő szerként. A felületaktív anyagok közé tartoznak az anionos detergensek, azaz például a nátríum-dodecil-szulfái, a dioktü-nátrinm-szulfoszukcínát és a dioktíl-nátrium-szulfonái, Kationos de~ tergensek használhatók, ilyen lehet például a benzaikónium·’ klorid vagy a benzetónium-klorid. A potenciális nem-ionos dotergensek listája, amiket felületaktív anyagként betehetünk a készítménybe, tartalmazza a lauromakrogol 400-at, a pohoséi 400 sztearátot, a polioxiehlén hidrogénezett kasztorolaj lö-et, ~5ö~eí és 60-at, a glícerin-monosztearáfot, a poliszorbát 40-et, 60-at, 65-öt és 8ö-at, a szacharóz zsírsavésztert, a metücellulózt és a karboxímetilceliulózt. Ezek a felületaktív anyagok lehetnek jelen a fehérje vagy származéka készítményében, vagy önmagukban, vagy különböző arányú keverékekben.

A vegyület felvételét potenciálisan fokozó adalékanyag például az olaj sav, a linolsav és a linolénsav,

A szabályozott felszabadulásé termékek lehetnek kívánatosak. A gyógyszert bevihetjük egy inért mátrixba, amí lehetővé te« φ * szi a fel szabadulását,, akár diffúzióval, akár kimosődásí mechanizmusokkal, lásd például a gumikat. A lassan degenerálódó mátrixokat, azaz például alginátokat, poiiszacbaridokat is beépíthetünk a készítménybe. Ezen terápiás ágens szabályozott felszabadulásának egy másik formája az Oros terápiás rendszeren alapuló eljárás (Alza Corp.). azaz a gyógyszer egy félig áteresztő membránba van zárva, ami lehetővé teszi, hogy a víz belépjen, és ozmotikus hatások következtében egyetlen kis nyíláson át kinyomja a gyógyszert. Néhány bélben oldódó bevonatnak ia van felszabadulást késleltető hatása.

A készítményekben más bevonatok is alkalmazhatók. Ezek lehetnek különböző cukrok, amiket a bevonatot készítő edénybe teszünk. A terápiás ágens lehet egy filmbevonatú tablettában, és az ebben az esetben használt anyagokat 2 csoportra osztjuk. Az első csoportba tartoznak a bélben nem oldódó anyagok, ilyen például a metileellulóz, az etilcellulőz, a hídroxietil-cellulóz, a metilhidroxietil cellulóz, a hídroxipropil-mefil cellulóz, a nátrium karboxírnelílcellulóz, a povidone és a polietilénglikolok, A második csoportba a bélben oldódó anyagok tartoznak, amik általában ftálsav-észíerek.

Az optimális filmbevonathoz az anyagok keverékét használhatjuk. A film bevonást végezhetjük egy filmbevonó edényben, d ágyban, vagy préseléses bevonással.

A jelen találmányban a jelen találmány szerinti fehége (vagy -annak származékai) pulmonáris bejuttatását is megfontoltuk. A fehérjét (vagy származékát) egv emlős tüdejébe juttatjuk

X » be, inhalálás közben, és a tüdő epíteliális bevonatán keesztüi jut el a véráramba (Adjei és mtsai: Pharmaceutical Research 7, 565569 (1990); Adjei és mtsai: International Journal of

Pharmaceutícs 63, 135-144 (1990) (leuprolíd-acetát); Braquet és mtsai: Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (Sunpl.h

s. 143-146 (1959) (endotelin-1); Hubbard és mtsai; Annals of Internál Medicíne 3, 206-212 (1989) (alfal-antítripszin); Smifch és mtsai: J. Clinic, Invest. 84, 1145-1146 (alfal-proteínáz); Oswein és mtsai: „Áerosolízatíon of Proteíns”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Deiívery II, Keystone, (1990) (rekombináns humán növekedési hormon); Debs és mtsai: The Journal of Immology 140, 3482-3488 (1988) (gamma-interferon és tumor nekrózis faktor alfa); valamint Píatz és mtsai: 5,284,655 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás (granulocita telepserkentő faktor),

A jelen találmány gyakorlatában számos különböző mechanikai berendezést megfontoltunk, amiket arra terveztek, hogy a terápiás terméket puimonárísan lehessen bejuttatni, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a nebulizátorokat, a mért dőzisú ínhalálókat és a por-inhalálökat, amik mind

A jelen találmány gyakorlatában jól használható berendezésekre néhány specifikus példa az alábbi: Vltravent nebukzálő, gyártja a Mallmckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; az Acorn Π nebulizálő, gyártja a Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; a Ventolin mért dozisű ínhaláló, gyártja a Glaxo Inc.,

XV « ♦

Research Triangle Park, Nort Carolina; és a Spinhaler Powder ínhaler, gyártja a Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Minden ilyen berendezéshez olyan készítményeket kell használni, amik alkalmasak a találmány szerint ve_; szétosztására, Tipikus esetben mindegyik készítmény specifikus a használt berendezésre, és magában foglalhatja egy megfelelő hajtóanyag használatát, a terápiában hasznos higitószerek, adjuvánsok és/vagy hordozók használatát,

A találmány szerinti vegyüietet legelőnyösebben részecske formában lehet előállítani, aholis a részecskék átlagos mérete kisebb mint 10 pm (vagy mikron), legelőnyösebben 0,5-5 pm, hogy a lehető leghatékonyabban eljuttassuk a tüdő távolabbi részébe.

A hordozók közé tartoznak a szénhidrátok, azaz például a trehalóz, a mannit, a xílit, a szacharóz, a laktőz és a szerbit. A készítményekben használt más adalékanyag lehet például a DPPCj a DOPE, a DSPC és a DOPC. Természetes vagy szintetikus felületaktív anyagok is használhatók. Használható polietílénglíkol is (eltekintve attól, hogy a fehérje, vagy annak analógja származékának elkészítésében is használható), Dextránok, mint például cíklodextrán is használható. Epesavak és más rokon fokozószerek ís használhatok. Cellulóz és cellulóz-származékok is használhatók. Hasmálhatók aminosavak is, például a puffer elk a « -jO « a l

Emellett a bposzómák, mikrokapszulák vagy mikrogömbök, zárványkomplexek vagy más típusú hordozók használatát is megfontoltuk.

rahangos

A nebulízálóban - függetlenül attól, hogy sugaras vagy ultráié használathoz alkalmas készítmény tipikus· esetben tartalmazza a találmány szerinti vegyűletet, vízben oldva, körülbelül 0,1-25 mg biológiailag aktív fehérje per ml oldat koncentrációban. A készítmény mellett tartalmazhat egy puffért és egy egyszerű cukrot (például a fehérje stabilizálásához és az ozmotikus nyomás stabilizálásához). A nebuüzáló készítmény tartalmazhat egy felületaktív anyagot, hogy csökkentse vagy megakadályozza a fehérje aggregáciőját, amit az oldat atomizáciöja okoz az aeroszol képződése közben.

A mért dozisú ínbaláló berendezésben való használathoz készített készítmények általában tartalmaznak egy finoman eloszlatott port, ami tartalmazza a találmány szerinti vegyűletet, egy hajtóanyagban egy lelnietakttv anyag segítségevei szuszpendálva.. A hajtóanyag lehet bármilyen hagyományos, erre a célra használt anyag, azaz például klór-fluor-karbon, hídroklőrOuor-karbon, hídrofluor-karbon, hidrofíuor-karbon vagy hidrokarbon, beleértve a triklőrfíuormetánt, a diklór-diflnormetánt, a díklor-tetrafluoretanolt és az 1,1,1,2-tetrafluoretánt, vagy ezek kombinációját, A megfelelő felületaktív anyagok közé tartozik, a szorbitán-trioleát és a szójalecitin. Az oiajsav is hasznos felületaktív anyag lehet.

Egy por-inhaíáló berendezésből való szétosztáshoz való készítmény tartalmaz egy finoman eloszlatott száraz port, ami tartalmazza a találmány szerinti vegyületet, és emellett tartalmazhat egy térkitöltő ágenst, azaz például laktőzt, szorbítot, szacharózt, mannitot, trehalózt vagy xllítet, olyan mennyiségben, ami megkönnyíti a pornak a berendezésből való szétosztását, azaz például 50-90 tömegszázalékban, a készítmény tömegére számítva.

A találmány szerinti vegyületek nazális bejuttatását is megfontoltuk. A nazális bejuttatás lehetővé teszi a fehérjének a véráramba jutását, a terápiás terméknek közvetlenül az orrba való juttatása után, anélkül hogy szükség lenne a terméknek a tüdőben való lerakódására. A nazális bejuttatáshoz használt készítmények közé tartoznak a dextránnal vagy' cíklodextránnal előállított készítmények. Más, nyálkahártyákon keresztül való átjuttassál való bejuttatást is megfontoltuk.

Áz előzőkben említett állapotok kezelésére használt eljárásokban alkalmazott dözistartománvt: a kezelőorvosnak: kell megw <Σ>

határozni, figyelembe véve különböző faktorokat, amik módosítják a gyógyszerek hatását, azaz például a beteg életkorát, állapotát, testsúlyát, nemét és étrendjét, bármilyen fertőzés súlyosságát, a beadás idejét és más klinikai faktorokat. A dózis nagysága. általában 0,1 ug - 100 mg találmány szerinti vegyület per testsűlykg per nap, előnyösen 0,1-1000 pg/kg; még előnyösebben 0,1-150 pg/kg; napi dózisokban beadva, vagy ekvivalens dózisokban, rövídehb-hosszabb időtartam alatt beadva, azaz pél** * * > * * « ♦ » > * · ♦ <.

*+ « naponta, hetente kétszer, hetente vagy naponta kétszer-három szór.

A találmány szerinti vegyűletet beadhatjuk egy induló bolus-ban, ezt követi egy folyamatos infúzió, hogy fenntartsuk a gyógyszertermék állandó szintjét a keringésben. Egy másik példa szerint a találmány szerinti vegyűletet egyszeri dózis formájában adhatjuk be. A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember könnyen optimalizálja a hatékony dózisokat és beadási tartományokat, amit a helyes gyógyítási gyakorlat és az egyes beteg klinikai állapota határoz meg. A dózis gyakorisága.

az oaramétereá es a riszati kiszereléseket a szakterületen jártas szakember határozza meg, és ez függ a beadás módjától és a kívánt dózistól [Remingtons Fharmaceutical Sciences, 18. kiadás, 1435-1.712, oldal, Msek Publishing Co,., Easton, PA 18042 (1990)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Az ilyen készítmények befolyásolhatják a beadott ágensek fizikai állapotát, stabilitását, az in vivő felszabadulás sebességét és in rivo kiürülését, A beadás módjától függően a megfelelő dózis kiszámítható a testsúly, a testfelszín vagy a szerv mérete alapján, A kezeléshez szükséges megfelelő dózis meghatározásához szükséges számítások további finomítását, ami az összes előzőkben említett készítményre vonatkozik, a szakterületen jártas szakember rutinszerűen el tudja végezni, fölösleges kísérletezés nélkül, főleg az itt Ismertetett dózis-infbrmáciő és vizsgálatok alapján., valamint az előzőkben említett humán klinikai ***♦ 6 4

vizsgalaton: során ye.lt íarmakokínetikaí adatok alapján.. Á megfelelő dózisokat igazolhatjuk azokkal a bejáratott vizsgálatokkal, amikkel a vérszinteket lehet meghatározni,, a megfelelő dózis-válasz adatokkal kapcsolatban, A végső dózistartományt a kezelőorvos határozza, meg, figyelembe véve azokat a különböző faktorokat, amik befolyásolják a gyógyszerek hatását, azaz például a gyógyszer specifikus aktivitását, a károsítás súlyossága, valamint. a beteg reagálóképessége, életkora, állapota, testsúlya, neme és étrendje alapján, bármilyen fertőzés súlyossága, a beadás ideje és más .klinikai faktorok alapján. Ahogy a vizsgálatok folynak, további információk derülnek ki a különböző betegségek és állapotokra vonatkozó megfelelő dózisszintekrői és kezelési időtartamokról.

A jelen találmány szerinti terápiás eljárások, készítmények és vegyületek használhatók önmagukban, vagy más citokinekkel, oldható Mpl receptorral, hematopoietikus faktorokkal, interleukinokkal, növekedési faktorokkal vagy ellenanyagokkal kombinálva, olyan betegségek kezelésében, amiket más tünetek jellemeznek, valamint vérlemezke deficiencíák.

Az volt várható, hogy a találmány szerinti vegyület hasznosnak bizonyul a trombocitopénía bizonyos formáinak kezelésében, a hematopoiézis általános serkentőivel, például az interleukín-3mal, vagy a OM-CSF-fel kombinálva. Más megakariocíta serkentő faktorok, azaz például a meg-CSF, az őssejt faktor (SCF), a leukémia gátló faktor (ΠΡ), az onkoszratín M (OSM) vagy más megakariocíta serkentő aktivitással rendelkező molekulák is « «

6ö használhatók az Mpl lígandummal, Az ilyen együtt-beadáshoz használható további citoldn vagy hematopoietikus faktor lehet például az interleukin-1 alfa, az Interleukin-1 béta, az interleukin-2, az interleukin-3, az ínterIeukin-4, az ínterleukín-5, az interleukin-6, az interleukin-Il, a telepserkentő faktor-1 (CSF-lj, az M-CSE, az SCF, a GM-CSF, a granulocíta telepserkentő faktor (G-CSF), az EPO, az Interferon-alfa (ÍFN-álfa), a konszenzus interferon, az interferon-béta, az interferon-gamma, az interleukín7, ínterieukin-8, az interleukin-9, az interleukin-10, az interleukin-12, az interieukin-13, az interleukin-14, az interleukin-15, az interleukin-16, az interleukin-17, az interleukin-18, a trombopoietin (TPOj , az angiopoietmek, például az Ang-i, az Ang2, az Ang-4, az Ang-Y, a humán angiopoietinszerü polipeptid, a vaszkuláris endotelíálís növekedési faktor (VEGF), az angíogenin, a csont morfogenikus protein-I, a csont morfogenikus protein-2, a csont morfogenikus protei.n-3, a csont morfogenikus protein-4, a csont morfogenikus protein~S, a csont morfogenikus proteín-6, a csont morfogenikus protein-?, a csont morfogenikus protein-8, a csont morfogenikus protein-9, a csont morfogenikus protein10, a csont morfogenikus protein-11, a. csont morfogenikus protein-1.2, a csont morfogenikus protein-13, a csont morfogenikus protein-14, a csont morfogenikus protein-15, a csont morfogenikus protein receptor IA, a csont morfogenikus protein receptor IB, az agyi neurotrőf faktor, a ciiiáris neurotróf faktor, a ciiiáris neurotróf faktor receptor alfa, a eitokinnei indukált .neutrofil kemotaktlkus faktor 1, a eitokinnei indukált ól *-► 4* neutrofil kemotaktikus faktor 2alfa, a eitokinnel indukált neutrofil kemotaktikus faktor 2 béta. az endoíeliális sejtnövekedést faktor, az endotelin 1, az epidermálís növekedési faktor, az epitélium eredetű neutrofil attraktáns, a fibroblaszt növekedési faktor 4, a fibroblaszt növekedési faktor 5, a fibroblaszt növekedési faktor 6, a fibroblaszt növekedési faktor 7, a fibroblaszt növekedési faktor 8, a fibroblaszt növekedési faktor 8b, a fibrobtaszt növekedési faktor 8c, a fibroblaszt növekedési faktor 9, a fibroblaszt növekedési faktor lö, a savas fibroblaszt növekedési faktor, a bázikus fibroblaszt növekedést laktor, a glia sejtvonal eredetű neurotróf faktor receptor alfa 1, a glia sejtvonal eredetű neurotróf faktor receptor alfa 2, a növekedéssel rokon fehérje, a növekedéssel rokon fehérje alfa, a növekedéssel rokon fehérje béta, a növekedéssel rokon fehérje gamma, a heparínkötő epiderraális növekedési faktor, a hepatocita növekedési faktor, a hepatocíta növekedési faktor receptor, az inzulin-szerű növekedési faktor I, az inzulin-szerű növekedési faktor receptor, az inzulinszerű növekedési faktor Π, az inzulin-szerű növekedési faktort kőtö fehérje, a keratinodra növekedési faktor, a leukémiát gátló laktor, a leukémiát gátló faktor receptor alfa, az ídegnövekedési faktor receptor, a neurotrofin-3., a neurotroíin-4, a méhlepény növekedési faktor, a méhlepény növekedési faktor 2, a vérlemezke eredetű endoíeliális sejtnövekedés! faktor, a vérlemezke eredetű növekedési faktor, a vérlemezke eredetű növekedési faktor A lánc, a vérlemezke eredetű növekedési faktor AA, a vérlemezke eredetű növekedési faktor AB, a vérlemezke eredetű nőve(λ

si faktor B lánc, a vérlemezke eredetű növekedési faktor 88, a vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor alfa. a vérlemezke eredetű növekedési faktor béta, a pre-B sejtnövekedést serkentő faktor, az őssejt faktor receptor, a tumor nekrózás· faktor, beleértve a TNFO-t, a TNFl-et, a TNF2-t, a transzformáló növekedési faktor alfát, a transzformáló növekedési faktor bétát, a transzformáló növekedési faktor bétal-et, a transzformáló növekedési faktor 1.2-t, a transzformáló növekedési faktor bétád-t, a transzformáló növekedési faktor béta3~at, a transzformáló növekedési faktor béta-5-Öt, a látens transzformáló növekedési faktor béta-l-et, a transzformáló növekedési faktor béta kötő fehérje Ιοί, a transzformáló növekedési faktor béta kötő fehérje Il-t, a transzformáló növekedési faktor béta kötő fehérje ΙΠ-at, az I-es típusú tumor nekrózís faktor receptort, a Π-es típusú tumor nekrözis faktor receptort, az urokínáz típusú plazminogén aktlvátor receptort, a vaszkuláris endotebális növekedési faktort, és a kiméra fehérjéket, valamint azok biológiailag és immunológiailag aktív fragmenseit. Emellett hasznos lehet ha egyszerre vagy egymás után hatásos mennyiséget adunk be egy oldható emlős Mpl receptorból, ami úgy tűnik, hogy hatással van arra, hogy a megakariociták vérlemezkékké fragmentálódjanak, ha a megakariociták elérték érett formájukat. Tehát egy találmány szerinti vegyüiet beadása (azzal a céllal, hogy növeltük az érett megakariociták számát) az oldható Mpl receptor beadása után (amivel ínaktiváljuk a lígandumot, és lehetővé tesszük, hogy az érett megakariociták vérlemezkéket termeljenek) várhatóan külő* * * * φ φ « ♦ ** χ · » Φ * ♦ * * φ * φ »»*♦ Φ» φφ «φ nősen hatásos eszköz a vérlemezke termelődés serkentésére. Az idézett dózist ügy állítjuk be, hogy kompenzáljuk az ilyen addicionális· komponenseket a terápiás készítményben. A kezelt paciens változásait hagyományos módszerekkel követjük.

Azokban az esetekben, amikor a találmány szerinti vegyületeket adjuk vérlemezkék és/vagy megakariocita és rokon sejtek készítményeihez, a hozzáadandó mennyiséget általában kísérletileg határozzuk meg, a szakterületen ismert technikákkal és vizsgálati módszerekkel. A mennyiségek példája a 0,1 pg - 1 mg találmány szerinti vegyület per 1Ö⁶ sejt.

Az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány kitanitásainak alkalmazása egy specifikus problémára vagy helyzetre bőven a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember képességein beiül van, az itt megadott kitanítások alapján, A jelen találmány szerinti termékek példáit, izolálásainak reprezentatív eljárásait, használatát és gyártását az alábbiakban adjuk meg.

*·φ **

Példák

I. Az alábbiakban kísérleti módszerek példáit adjuk meg az ismertetett első csoport szerinti vegyületek előállítására

A- Anyagok és módszerek

A peptid-szintézis során használt összes aminosav-származékot (mindegyik L-konfigurációjú) és gyantát a Novabiochem-től vásároljuk. A peptid~szintézis reagenseket (DCC, HOBt,. stb.) oldat formában, vásároljuk az Applied Bíosystems, Ine.-től. A két PEG származékot a Shearwater Polymers, Inc.-tői vásároljuk. Mindegyik oldószert (diklórmetán N-metíl-pirroIídinon, metanol, acetonltril) az EM Sciences-tál vásároljuk. Az analitikai HPLC-t egy Beckman rendszeren futtatjuk Vydac oszlopon (0,46 cm χ 25 cm, 08 fordított fázis, 5 mm), 1 ml/perc áramlási sebességgel, kettős UV detektálással, 220 és 280 nm-en. Lineáris gradienst használunk mmdegyik HPLC művelethez, két mobil fázissal: A puffér - HsO (0,1% TPA) és B puffer - acetonitríl (0,1% TEA). Az itt említett számozott peptideket, azaz például a 17b, 18, 19 és 20 számú peptideket az 1. táblázat alapján számozzuk, és közülük néhányat tovább illusztrálunk a 2. és 3. ábrán,

Peptid-szintézis

Mindegyik pepiidet a jól ismert, lépésenkénti szilárd fázis szintézismódszerrel állitjuk elő. Az Fm.cc kémiát használó szilárd fázisú szintézist egy ABI Feptíde Synthesizer-rel hajtjuk végre. Tipikus esetben a peptid-szintézis egy előre töltött Wa.ng gyantán ♦ * φ

« »>»» χ„ »·♦ φ φ 0 φ * ♦ » 4 kezdődik, 0,1 mmol méretben. Az Fmoe védo< mentesitését standard píperidin protokoll alapján hajtjuk végre. A kapcsolást DCC/HÖBt használatával hajtjuk végre.. Az oldallánc védőcsoportok a következők: Glu(O-t-Bu), Thr(t-Bu), Arg(Fbf), Gln(Trt), Trp(t-Boc) és Cys(Trt). A pegüezéshez az első peptid prekurzort, a Dde-t használjuk az oldaliam: megvédésére a Hnkerben Lys-en és az utolsó kapcsoláshoz a Boc-íle-OH-t használjuk. A Dde-t vízmentes hidrazinnal (2% NMP-ben, 3><2 perc) távolítjuk el, ezt követi a br0mecetsavanhidrid.de! való kapcsolás, amit DCC-vel hajtunk végre, A 18-as peptid esetében a Hnkerben levő císztein oldalláncot egy trítílcsoporttal védjük meg. A végső védöcsoport-mentesítést és az összes peptidil gyanta lehasítását szobahőmérsékleten hajtjuk végre 4 óra hosszat, 2,5% vizet, 5% fenolt, 2,5% tríizopropílszilánt és 2,5% tioanízolt tartalmazó trífíuorecetsavat (TFA) használva. A. TFA eltávolítása után a lehasitott peptídet hideg vízmentes éterrel csapjuk ki. A ciklikus peptid diszulfíd-híd képzését közvetlenül a nyers anyagon hajtjuk végre, 15% vizes DMSO-t használva (pH=7,5). Az összes nyers peptídet preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk, majd struktúrájukat ESl-MSI-vel és aminosav-elemzéssel igazoljuk.

Egy másik változat szerint az összes, előzőkben említett peptídet t-Boc kémiával is előállíthatjuk. Ebben az esetben a kiindulási gyanta a klasszikus Merrifíeld vagy Pam gyanta, és az oldallánc védőcsoportok az alábbiak lehetnek: Glu(öbzl),

í.,

ThríBzl), ArgfTos), TrpfCHO), Cysfp-MeBzí), A hidrogénüuoridot használjuk a peptid-gyanta végső hasításához.

PEGilezés

A szintetikus peptidek. pegilezésére egy új, konvergens stratégiát fejlesztettünk ki, ami abból áll, hogy egy oldatban létrehozott konjugátumon keresztül kombinálunk egy pepiidet és egy PEG egységet, amelyek mind hordoznak egy' speciális funkcionalitást, amik kölcsönösen reakció-képesek. a másikkal. A prekurzor peptidek könnyen előállíthatok a hagyományos szilárd fázisú, szintézissel, az előzőkben említett módon. Amint azt az alábbiakban ismertetjük, ezek a peptidek „elöaktíválva” vannak egy megfelelő funkcionális csoporttal, egy specifikus ponton. A prekurzorokat tisztítjuk, majd teljesen jellemezzük a PEG egységgel való reagáltatás előtt A pepiidnek PEG-gei való ügálása általában vizes fázisban játszódik le, és könnyen követhető fordított fázisú analitikai HPLC-vel, A pegílezett peptideket könnyen tisztíthatjuk preparativ HPLC-vel és analitikai HPLC-vel, majd aminosav elemzéssel és lézer deszorpcíős tőmegspektrometríával jellemezzük.

A 19-es peptid előállítása

A I7b pepiidet (12 mg) és 30 mg (2 ekvivalens) MeO-PEGSH 5ÖÜÖ-et oldunk 1 ml vizes pufferben (p.HS). Az eiegyet szobahőmérsékleten ínkubáljuk körülbelül 30 percig, majd a .reakciót analitikai HPLC-vel elemezzük, ami a reakció körülbelül >8ö%~os lejátszódását mutatja. A pegilezett anyagot preparatív HPLC-vei izoláljuk.

mg 18-as pepiidet és 25 mg MeO-PEG-maieimídet oldunk körülbelül 1/5 ml vizes pufferben (pH~8). Az eiegyet szobahőmérsékleten mkubáljuk körülbelül 30 percig, akkor körülbelül 70%-os transzformációt érünk el, amit analitikai HPLC-vel ellenőrzünk, és analitikai HPLC-vel követünk, egy alíkvot rész mintát víve a HPLC oszlopra,. A pegilezett anyagot preparatív HPLC-vei tisztítíuk.

A biológiai aktivitás vb /ο Fetal Clone 11.-t és 1 ng/ml mIL-3-at tartalmazó

A TPO in. iáim biológiai esszé egy mitogén esszé, amiben a rágcsáló 32D sejtek egy IL-3 dependens kiónját használjuk, amit humán mpl receptorral transzíektáltunk. Ezt az esszét részletesebben a WO 95/26746 számú szabadalmi leírásban közük, A sejteket

MÉM táptalajban tartjuk fenn. A minta hozzáadása előtt a sejteket kétszer öblítjük mIL-3-at nem tartalmazó növesztő táptalajjal. Egy kiterjesztett tizenkét pontos TPO standard görbét készítünk, ami 3333 pg/ml-töl 39 pg/ml-íg terjed. Minden egyes mintából négy hígítást készítünk, amik a becslések szerint a standard görbe lineáris részére esnek (1000-125 pg/nü), majd 3 párhuzamosban futtatjuk. A. minta vagy standard egyes hígításaiból 100 μΐ-t adunk egy 96 lukas mikrotiter lemez megfelelő ·6§

Φ* «««.Φ * ·» » Φ φ φ

X * Λτ φ φ * * ♦ * » * »0 » Φ ΦΦ -^φ lukashoz., amik Inkánként 1ÖÖOO sejtet tartalmaznak. Negyvennégy óra hosszat tartjuk 37 *€-on, majd 10% COa-t, MTS-t (egy teírazolium vegyület, amit a sejtek biológiailag formatanná redukálnak). Körülbelül hat órával később egy lemezleolvasóval 490 nm-én leolvassuk az optikai sűrűséget. Egy dózis-válasz görbét (fog TPO koncentráció vs. OD-háttér) állítunk elő, és a standard görbe lineáris részére eső pontok lineáris regressziós elemzését hajtjuk végre. Az ismeretlen teszt-minták koncentrációját a kapott lineáris egyenlet és a higítási faktor felhasználásával határozzuk meg.

Rövidítések

HPLC: nagynyomású íoiyadékkromatográfía; ESI-MSÍ: eiektronpermet ionizációs tőmegspektrometria; MALDl-MS: Mátrix-asszisztált lézer deszorpciős ionizációs tömegspektrometria; PEG: polietilénglikol. Az összes aminosavat a standard hárombetűs vagy egybetus kódokkal jelöljük. t-Boc: tercButoxikarboníl; tSu: fcero-Butil; Bzl: Benzil; DCC: diciklohexilkarbodiimid; HOBt: 1 -Hidroxibenztriazol; NMP: N-metil-2-pirroiidinon; Pbf: 2,2,4,6,7-pentameÖldíhídro-benzofurán-5-szulfonil; Trí: íritil; Dde: l-(4_}4-dímetiÍ-2,6-díoxo-eíklohexilidén)etÍl.

A szekvenciálisán kapcsolt TMP dímerek tervezése azon a éltételezésen ormájára van szükség a *** * _ν.. * «Κ * «·*· c-Mpl~lei (a TPO receptor) való hatékony kölcsönhatáshoz, és ez attól függ, hogy miképpen tekerednek egymáshoz a receptor kontextusában, és a két TMP molekula egymáshoz van kötve a C-termínális - N-termmális konfigurációban, oly módon, hogy ne zavarják a globális dimer konformációt. Világos, hogy a tandem, kapcsolt dimerek aktivitása függhet a linker hosszának és összetételének helyes kiválasztásától, amely linker a két szekvenciálisán illesztett TMP monomer C-terminálisát és N-termmálisáí kapcsolja össze. Mivel a e-Mpl-hez kötött TMP-ról nincs strukturális információ, egy sorozat olyan dimer peptidet szintetizáltunk, amiknek a linkerei 0-10 illetve 14 glicin csoportot tartalmaztak (L táblázat). A glicint azért választottuk, mert egyszerű és flexibilis. Ésszerű feltételezésnek tűnt, hogy egy flexibilis pohglicin peptidlánc lehetővé teszi a két egymáshoz láncolt TMP ismétlődésnek a kívánt konformációba való szabad átalakulását, míg a szférikusán gátoltabb aminosav szekvenciák nemkívánt szekunder struktúrákat vehetnek fel, amiknek a merevsége elrontja a receptor kontextusban levő dimer peptid korrekt pakolódását.

A kapott peptidek könnyen előállíthatok a hagyományos szilárd fázisú peptid·szintézis módszerekkel [Merrífield, R.B.: Journal of the American Chemical Society 85, 2149 (1963)], Fmoc vagy t-Boc kémiát használva. A C-termínálisan kapcsolt párhuzamos dimer (2. számú szekvencia) szintézisétől eltérően, amihez egy ortogonálisán védett llzíncsoportra van szükség a kiindulási elágazási ponthoz, amivel a két peptidláncot pszeudoszimmetrikus módon fel lehet építeni [Cwirla, S.E. és * ♦ * « $ Φ φ Λ φ * ·»* * :»· « « λ ,* * * * * * Φ Φ Σ **** «« «Φ « *$.* mtsai: Science 276, 1696-1699 (19971), a mi tandem dímerjeink szintézise egyszerű, lépésenként! összeállítása a pepbdláncoknak, a C-terminálisról az X-terminálisig. Mivel a TMP dimerizációjának sokkal dr&matikusahb hatása van a proliferatív aktivitásra, mint a kötési aktivitásnak, amint azt a C-terminális dimer esetében kimutatták (Cvvirla, S.E. és mtsai: Science 276, 1696-1699 (199711, a szintetikus peptídeknek közvetlenül vizsgáljuk a biológiai aktivitását egy TPO dependens sejtszaporodási vizsgálatban, a teljes hosszúságú c-Mpl~lel transzfektált rágcsáló 32ö sejteknek egy interleukin-3 dependens kiónját használva [Palacios, R. és mtsai: Cell 41, 727 (1985)). Amint azt a vizsgálati eredmények mutatják (lásd az 1. táblázatot az alábbiakban), az összes, polígücínnel kapcsolt tandem dimer potenciája >1000« szerese a monomerének, és ebben a sejtszaporodási vizsgálatban még hatékonyabbak mint a C-terminális dimer. A mi vizsgálatunkban a C-termínális dimer abszolút aktivitása kisebb mint a természetes TPO fehérjéé, ami eltér az előzőkben említett eredményektől, amik szerint a C-terminális dimert ugyanolyan aktívnak találták mint a természetes ligandumot (Cwirla, S.E. és mtsai; Science 276, 1696-1699 (1997)]. Ez valószínűleg a két vizsgálat eltérő körülményeinek köszönhető. Mindazonáltal az aktivitásbeli különbség a tandem dimerek (az első monomer Cterminálisa a második monomer ^-terminálisához kötve) és a párhuzamos dimerek (az első monomer C-terminálísa. a második monomer C-terminálisához kötve) között ugyanabban a vizsgálatban világosan demonstrálja a tandem dim.erizált termékek * *

«.

felsőbbrendűségét a párhuzamosan dímerizált termékekkel szemben. Érdekes megjegyezni, hogy a línker hosszának széles tartományban való változása is tolerálva van. A kiválasztott monomerekhez (.1. számú szekvencia) az optimális linker mérete 8 glicin.

Más tandem dimerek

A TMP tandem dimerek ezen első sorozata után számos más molekulát terveztünk, vagy különböző linkerekkel, vagy a monomerekben végzett módosításokkal. Ezek közül a molekulák közül az első, a 13-as peptid, GPNG iinkerrel rendelkezik, amely szekvenciáról ismert, hogy erősen hajlamos béta-kanyar típusú szekunder struktúrák létrehozására. Bár még mindig körülbelül löC-szor hatékonyabb mint a monomer, erről a pepiidről kiderült, hogy körülbelül >10-szer kevésbé aktív, mint a GGGG-vel kapcsolt analóg. Tehát egy viszonylag merev béta-kanyar bevitele a linker régióba az optimális agonista konformációhoz viszonyítva láthatóan egv enyhe torzulást okoz a rövid linker formában.

A TMP szekvenciában a Trp9 szekvencia egy erősen konzerválódott csoport a random peptid-könyvtárakböl izolált aktív peptidek között. Van egy erősen konzerválódott Trp az EPO mirnetíkus peptidek konszenzus szekvenciájában, és erről a Trp szekvenciáról kiderült, hogy szerepe van a két EPO .mímetíkus peptid (EMP) közötti hídrofób mag kialakulásában, és hozzájárul az EPO receptorral való hídrofób kölcsönhatásokhoz (Livnah, O. és mtsai: Science 273, 464-471 (1996)]. Az analógia alapján azt gondoltuk,

(Tpy ty M 3 p'l : &R w i<>. 0 f · h.

<?V **

A A *

y a TMP-ben a Trp9 csoportnak hasonló funkciója lehet a peptid ligandum dímerizádojában, és egy olyan erőfeszítés során, amikor megpróbáltuk modulálni és megbecsülni a két indolgyürú. által kifejtett nem-kovalens hídroföb erők hatását, számos analógot állítottunk elő, amik a Trp mutációjából származtak. így a 14-es pepiidben a Trp csoportot mindkét TMP-ben Cys csoporttal helyettesítettük, és oxidációval egy intramolekuláris diszulfid-hid keletkezett a két eisztein között, amitől azt vártuk, hogy a peptid dimerizáeiója során utánozza a két Trp közötti, hídrofób kölcsönhatást. A 15-ős peptid a 14-es peptid redukált formája. A 16-os pepiidben két. Trp csoportot helyettesítünk Ala-val. Amint a vizsgálat adatai mutatják, mindhárom analóg inaktív. Ezek az adatok tovább demonstrálják, hogy a Trp fontos a TPO mimetikus peptid aktivitásához, nemcsak a dimer képződéséhez.

Mindkét kővetkező pepiid (a 17a és a 18-as peptid) tartalmaz a 8 aminosavbbl álló Unkerében Lys vagy Cys csoportot. Ez a két vegyület prekurzora a két pegilezett pepiidnek (19-es és 20as peptid), amikben a Lys vagy a Cys oldalláncait egy polietilénglikol (PEG) egységgel módosítottuk. Elhatároztuk, hogy egy PEG egységet juttatunk be egy viszonylag hosszú linker közepébe, oly módon, hogy a nagy PEG komponens (5 kDa) elég messze van a peptid-molekulában levő fontos kötési helyektől.. A PEG-ről ismert, hogy egy biológiailag kompatíbilis polimer, amit egyre inkább használnak kovalens módosítóként, hogy ezzel javítsák a pepiid- és fehérje-alapú terápiás szerek farmakokinetíkai írói at * *

Egy moduláris, oldat-alapú módszert terveztünk a szintetikus vagy rekombináns· peptidek egyszerű pegüezésére. A módszer azon a ma már jól kidolgozott kemoszelektiv lígálásí stratégián alapul, amely a kölcsönösen reakcioképes funkcionalitások párjai közötti specifikus reakciókat használja. Tehát a pegiíezett 19-es peptíd esetében a lizin oldalláncof egy brómaceti! csoporttal előaktiváljuk, így kapjuk a 17b pepiidet, ami már alkalmas a polietílénglíkol tiolszármazékával való reakcióra. Ennek végrehajtásához egy ortogonális védőcsoportot, a Dde-t használjuk a lizin epszilon-alkilcsoportjának megvédésére. Amikor a teljes peptidláncot már összeraktuk, akkor az N-terminális amimről t~8oc-cal eltávolítjuk a védöesoport. Azután eltávolítjuk a Dde-h hogy lehetővé tegyük a brömaeetilezést. Ezzel a stratégiával jő minőségű nyers pepiidet kapunk, amit könnyén lehet tisztítani a hagyományos fordított fázisú HPLC-vet. A pepiidnek a holla! módosított PEG-gél való liását vizes pufferben hajtjuk végre {pHASh és a reakció 30 perc teljesen lejátszódik. A tisztított, pegiíezett anyag MALDl-MS elemzéséből egy jellegzetes, harang alakét spektrumot kapunk, aminek a szomszédos csúcsai kozott 44 kDa-os növekedés van. A PEG-20-as pepiid esetében egy eiszteincsoportöt helyezünk el a linker régióban, és öldailáncának tíolcsoportja. szolgál kapcsolódási pontként a maleimidet tartalmazó poüetüénglikolhoz. Hasonló körülményeket használunk ennek a pepiidnek a pegüezéséhez. Amint, az a vizsgálati adatokból kiderült, ennek a két pe74

-Χ'φ λ £ < « gilezett pepiidnek a nem-pegilezett megfelelőikkel összehasonlítva még magasabb is az in uiire biológiai aktivitása.

A 21-es peptid a 8 aminosavból álló linkerében egy potenciális glikozüezési motívumot tartalmaz, az XGS-et. Mivel a példaként megadott tandem dimerek peptidkötésekkel összekötött természetes aminosavakböl állnak, egy ilyen molekulának megfelelő eukaríőta sejtrendszerben való expressziója egy olyan giikopepiidet eredményez, amiben egy szénhidrát egység kapcsolódik az Asn oldallánc k&rboxamidjához. A glikozilezös egy általános poszt-transzlációs módosítási eljárás, aminek számos pozitív hatása lehet egy adott fehérje biológiai aktivitására, megnövelve a vízoldhatőságát és in wo stabilitását. Amint azt az esszé adatai mutatják, ennek a gükozilezési motívumnak a iinkerbe való beépítése magas biológiai aktivitást tart fenn. A potenciális glíkopeptid szintetikus prekurzorának az aktivitása összehasonlítható a -(Glyjs-kapcsolt analógéval. Ha egyszer giikozileztük, akkor ezektől a peptidektöl azt várjuk, hogy ugyanazzal az aktivitási sorrenddel rendelkeznek, mint a pegílezett peptidek, egy PEG és a szénhidrát egység által mutatott hasonló kemofizikaí tulajdonságok miatt.

Az utolsó peptid egy dimer dímere. Ezt úgy állítjuk elő, hogy a 18-as pepiidet oxidáljuk., ami mtermólekuláris diszulfid-hidat képez a Bakerben található két cisztemcsoport között. Ezt a pepiidet ügy terveztük meg, hogy megcélozza azt a lehetőséget, hogy a TMP fcetramerként aktív. A. vizsgálati adatok azt mutatják, hogy ez a peptid illesztett moláris alapon nem aktívabb, mint egy *♦ átlagos tandem dimer, ami indirekt módon alátámasztja, azt az elképzelést, hogy a TMP aktív formája valójában egy dimer, másképpen egy tandem dimer dimerizácíojánák további hatásai lehetnének a biológiai aktivitásra.

Az alábbi 1. táblázatban összefoglaljuk az előzőkben ismertetett vegyületek relatív aktivitásait, (relatív potencia) amiket az előzőkben ismertetett in vitro esszék alapján alapján adunk meg.

S.yz^ 4 emtív konysag

	TPO	4,0
	TMP monomer (1, számú szekvencia)	1,0
	TMP C-C dimer (2, számú szekvencia.)	3,5
	TMP~(Gíy)nTMP:
1	n-0	4,5
2	n:::: 1	4,0
3	n~2	4,0
A	Í.-S — O	J. A
4-		TjU
5	n ::í:4	4,0
6	n~S	4,0
7	n~ö	4,0
8	n~7	4,0
9	n=8	4,5

«« X» φ

X ♦ φ· φφ « φφ

10	η~9	4,0
11	η-10	4,0
12	η~11	4,0

1. táblázat (folyt.)

Vegv ♦ » —· J» Λ ' ♦*** »««« • · ·♦ ♦♦♦;,, „« ·» ./ ,„· · ♦ konvság «

TMP-GPNG-TMP (lö. számú szekvencia)

ÍEGFTLRQCLAARA-GGGGGGGG-1E.GPTLRQCLAARA (11, számú lEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-lEGPTLRQCLAARA (12. számú szekvencia) •*LAARA

3.0

0,5

f.O

0,5

(13. számú szekvencia)
17a TMP-GGGKGGGG-TMP	4,0
(15, számú szekvencia) 17b TMP-GGGK{BrAc)GGGG-TMP	NA
15, számú szekvencia
18 TMP-GGGCGGGG-TMP	5,0
(17. számú szekvencia) 19 TMP~GGGK(PEG)GGGG~TMP	3,0
(17. számú szekvencia) 20 TMP~GGGC(PEG)GGGG~TMP	5,0
(13. számú szekvencia.)

	<»»« « » VJ í .·» ♦· »»♦ «t X/_,
1. táblázat (folyt,)
Vegyület	Relatív haté- konyság
21 TMP-GGGNGSGG-TMP (19 , számú szekvencia)	4,0
22 TMP- GGGCGGGG-TMP	4,0

20. számú szekvencia)

MEGJEGYZÉS: Az 1. táblázatban a számok az aktivitásnak körülbelül 1 át jelentik., t az „r” és »4 tti különbség körülbelül 1000-szeres. A 0,5-ös növekedés egy intermedier pont, így tehát az ..Γ’ és „3,5” aktivitások közötti különbség körülbelül 500-szoros, „NA” jelentése; nincs meghatározva

II. Az alábbiakban példaként olyan módszereket adunk meg, amikkel az előzőkben ismertetett második csoportba tartozó vegyületeket lehet előállítani

A, A 6C> ábrán bemutatott típusú Fc fúziós vegyület előállítása.

Egy DNS szekvenciát, ami a humán IgGl Fc régióját kódolja, leolvasási fázisban. íúzíonáltatva a TPO-mímetikus peptid dimerjéhez (34. számú szekvencia), az alábbiak szerint a luxR promoter vezérlése alá helyezzük, a pÁMG2 plazmid vektorban.

φ φ

A fúziós gént standard poiimcráz láncreakciós technikával állítjuk elő. A polímeráz láncreakció templátjaí az Fc szekvenciát kódoló Fc szekvencia és egy szintetikus gén, ami a 34. számú szekvencia szerinti vegyület további részét kódolja. A szintetikus gént 4 átlapoló nukleotídból állítjuk elő, az alábbiak szerint:

1830-52 AAA GGT GGA GGT GGT GGT ATC GAA GGT CCG ACT CTG GGT CAG TGG CTG GGT GCT CGT GCT (35. számú szekvencia)

1830-53 AGG TCC AGG AGG AGG AGG AGG AGG GAG

GCA CTG AGG CAG AG'T GGG ACC (36. számú szekvencia)

1830-54 GGT GGT GGA GGT GGC GGC GGA GGT ATT GAG GGC GCA ACC CTT CGC CAA TGG CTT GCA GCA GGC GGA (37. számú szekvencia)

1830-54 AAA AAA AGG ATC CTG GAG ATT ATG CGC GTG

CTG CAA GCC ATT GGC GAA GGG TTG GGC GCT

CAA TAG CTG GGC CGC C (38. számú szekvencia)

A 4 oligonukleotidot egymáshoz illesztve kapjuk az alábbi

SG

AAAGGTGGASOrGOrGGTATCQAAGGTCCGACTCTOCGTCASTGGCTSGCTSCTCOTGCT j-----------+------------------+-------------t-----------,-------------·-------------i. gQ <..e.V.:^:<:GT<jAGA<.-CC>V;tCC;'\^:x.G\.'A\A.-\>AA..Í;íAí;Í^>Cí'VOOA

K G G G G< L G G i? T Íj R Q W b A A R A

GGTGGiGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAAGGGC'f'TGCAGCA

-------------,----------------,----------+-----------------------------4. ^20

CCACCAGC'rCCACCGCCGCCTCCATAAC'rCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCG?

G G G G: G Gt G G X G G t* T í, R G G Á A

GitttCíttCA

------------------------------GCGCGTATTAGAGCTCTAGGAAAAAAA A A ^y

39. számú szekvencia: [A 1830-52 és a nukleotidok]

40. számú szekvencia: (A 1830-53 és a 1830-55 ko-líneárís olígonukleotidok] és a 41. számú szekvencia: [ a kódolt aminosav szekvencia].

Ezt a duplexet egy polimeráz láncreakcióban a 1830-52-es és a 183ö~55~ós otigonukleotidot használva mes és antiszensz primőrként..

A molekula Fc részét egy elő, primerként az Fc DNS-t használva.

1216-52 AAC ATA AGT ACC TGT AGG ATC G (42. számú szekvencia]

1830-51 TTCGATACCACC/ aví (43. számú szekvencia)

8!

* A «

A 1830-Sl-es és a 1830-52-es olígonukleotidok 24 nukleotidből álló átfedést tartalmaznak, ami. lehetővé teszi, hogy a két gén helyes leolvasási fázisban fuzionáljon, a fenti poiímeráz láncreakciós termékeket egy harmadik reakcióban kombinálva, külső primereket, azaz a 1216-51-et és 1830-55-őt használva.

A végső poiímeráz láncreakció génterméket (a teljes hosszúságú fúziós gén) Xbal és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a pAMG21 vektorba ligáljuk (lásd alább), majd szintén Xbal és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. A ligáit DNS-t Escherichia coli 2596 (CM221, lásd az alábbiakban) kompetens gazdasejtekbe transzformáljuk, A kiónoknak vizsgáljuk a képességét, hogy tudnak-e rekombináns fehérjeterméket termelni, és rendelkeznek-e a helyes nukleotid szekvenciát tartalmazó génfűsióval. A fehérje expressziós szintjét 50 ml-es rázott lombíkos vizsgálatban határozzuk meg, A teljes sej tlizátum okát vizsgáljuk •a fúzió expressziója szempontjából, Coomassíe Blue-vai festett poíiakrilamid géleíektroforézís géleken.

A fúziós fehérje aminosav szekvenciáját az alábbiakban mutatjuk be, a megfelelő nukleotid szekvenciával együtt:

TCTAGATTTCTTeTAACrAATTAAAGOACGAArAACATATGGACAAAACTCACACATGTC i .....................- +---------------------i------------í------------:.............--- +.................í,·)

AGATGGAAAGAAAATTGATTAATTrCCTCCVrATTGTATACGTGTrT'rGAGTGTGTAGAG

SDSTKTGP

V

GAGC'ATGTCCAGGTGCGGAAGTGGTGGGGGGAGGGTCAGTGTTGGTCTTGGCGGGAAAAG 6i ----------+ ~-------,_4.----------_Ψ----------*-----------------₊ 120

·.: 1 :t.^J \/·<,.·.A'·.?'·..í i Akik.;'-...'.. ί i ·.::’^Λ.·k.··..··..·k.ϊ\. A.kí .1Atkírku'kGGAkxAAkífk^kjikAíkj .·. Λ T ί G

A G P A » £ L L G G i? S V F L F ? Ρ Κ i?

CCAAGGACACGCTCATGATCTCCCGGACGGGTGAGGTCAGATGCG’rGGTGGTGGACGTGA Í2L---------------r------------<·--------~~-i---------------+-----------+-----------»· ISO

GG'rTCCTGGGGGAGTACTAGAGGGCCTGGGGAGTCGAGTGTAGGCACCACCACCTGCAG?

K 0 T LM i s r τ ρ ε y τ c v v y o y s

GCCACGAAGACGCTGAGGTCAAGGTCAACTGGTACGiGGAGGGCG’rGGAGGTGGATAATG 15'---------+.----------j.----------*------------+------------x----------* 24 0

CGGTGGTrGTGGGACTGGAGT’rCAAGTTGAGCATGCAGGTGCGGGAGCTGGACGTATTAG A E 0 P £ V K F N W Υ V 0 G V Ε V Η N A

CCAAGACAAAGGGGCGGGAGGAGGAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGACAGGGTCGTCA 24 ------*-------------4———-------------—4. 300

GGT'TCT GTTTCGGCGGCCTCCTCGTCA'TGT'TGTCG<'TGCATGG€.ACACGAGTCGCAGGAG'?

R T Κ P R £ £ Q Y M S T ϊ R V V S V L T

CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA'CAAAG 00 A~~~ ~ —-----— * 4~-----------------~ ~----4----------~---r~~·----~~~-----$. 350'

GGCAGGACGYGGTCCTGACCGACTTACCGTTCCTCAT'GTTCACGTTCCAGAGGTTGTTTC 7 L G Q 0 W L N G K £ Υ X G Κ V S 8 K A

CCC'mCGAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAMGGGCAGCCCCGAGAACCAC 06k ----------4 420

GGGAGGGTCGGGGGTAGGTGTTTTGGTAGAGGTTTCGGTTTCCCGTCGGGGCTCTTGGTG L P A P X Ε S T I S K A K G Q Ρ R E ? Q

AGGíGTACAGCGTGCCGCGATCCCGGGAíGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCGTGACCT 4 2:1 —----------------4----4------------r---------—— *-----------í------------(· 4 80

TCCACATGTGGGACGGGGGTAGGGCCCGAGTCGACiGGTTGTTGGTGCAGTCGGAGTGGA 7 Y T L P ? S R Ο £ L T X R Q 7 S L T C

GCCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCGGTGGAGTGGGAGAGCAAaGGGCAGC 48Ί---------------;---------------4-----------4---------φ-----------4---------------540

CGGAGÜAGTTTGGGAAGATAGGGTCGCTGTAGCGGGACGTCACCCTCTCGTTACCCGTCG L V K G F Y P S D I A 7 S Sí E S G G Q P

GGGAGAAGAAGTAGAAGACCAGGGCTGGGGTGCTGGACTGGGAGGGC'rGCGGGTTGGGCG 5 4 ;.-----------«·----- - - - ~ - * -------------------------.4---------------4---------------4 δ í j 0 ^:.:·^:·.Λ, x . ί ί : ί GA \ \.ι ί : <, λ :.· i ’',:\.Λ.Λ:<Αί.:χ.:\,<,Αν.Λ^ AÍ..G ΤG'AgGG. ·. GgCGAGG AAGíkA vb AGA Ε N S Y Κ Τ T 5? Ρ V L D S D G S F F (, Y

ACAGC^AAGGTCAC'CGTGGAGAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC'rCATGCTGCG fo ö i - -----------4-------------------i----------------4--------------------i------------------i------------4 6 gQ

TgTGGTTGGAGTGGGAGGGGT'í gTGGTCCAGGGGCGTGCCCTTGGAGAAGAGTACGAGGC 3 K G T ’.·' D K 3 A W G 0 G G V F S C S V

TGATGGA'GAGGCTG'GGAGAAGGACTACAGGCAGAAGAGCGTC?CGGTgTCTGCGGGTA «isi----------4-------------4------------4-------------4-----------_x------------,4 720

AGTACGGAGTCCGAGAGGTGTTGGGGATGTGGGGCTGCrGGGAGAGGGACAGAGGGGCAT Μ Η E A L A N Η Y T Q K S L S L 3 S G K

AAGG'rGGAGGTGGTGGTATCGAAGG'í'CCGACTGGGGGTGAGTGGGTGGCTGCGCGTGCTG 'r'rGGACGTCGACGACCATAGCTTGCAGGGTGAGACGCAGTGAGCGAGCGAGGAGCACGAC G G G G G I £ G S? T L A G W i, A A R A G

C;TGG'rGGAGGTGGGGGGGGAGGGATTGA(íGGGGGAACGGTTGGGCAATGGCTTGGAGCAC ?81-----------4----------------------4-----------4---------4--------------4 340

GAGGAGGTGGACGGGCGGCTGCATAACTGCGGGGTTGGGAAGGGGTTAGCGAAGGTCG'TG G g g G g G G I G G G T G A G' W L A A R

Ba-jsH I

Gg GGÁT.AA7\. .Ά'.·*. AA rCGG 341-----------4------------4_ ggj

GgGGTATTAGAGGTgG'í AGGG A

44, számú szekvencia: (egy szálú lánc, leolvasása 5*-3'}

45, számú szekvencia: (egy szálú lánc, leolvasása 3'~5']

46, számú szekvencia: (a kódolt aminosav szekvencia] pAMG21

A pAMG21 expressziós plazmid az ATCC-től szerezhető (letéti szám 98113, letétbe helyezve 1996, július 24~én).

me $4

Az Amgen #2596 gt

Eschenbhía coá K~ 12 törzs, zékeny cISSSs? lambda represszort a korai ebp régióban, és a lacN represszort a késői ebp régióban (63 perc). Ennek a két űj represszor génnek a jelenléte lehetővé teszi ennek a gazdaszervezetnek számos különböző expressziós rendszerben való használatát, bár mindkét említett represszor irreleváns a IuxPr-főI való expresszié szempontjából. A nem-transzformált gazdaszervezet nem antibiotikum rezisztens.

A cI857s7 gén riboszómális kötőhelyét módosítottuk, hogy tartalmazzon egy javított RBS-t. Ezt az aőp operonba építettük be a 1170 -1141-es nukleotídok közé, amely számozás a Genbank M64441GbJ3a számozásának felel meg, a megszakító ebp gén kivágásával,

A konstrukciót egy kromoszómába juttatjuk be, egy MMebg-cI857s7 javított RBS #4-gyel, az F'tét/393-ba. A rekombináció és a felbontás után csak az előzőkben ismertetett inszert marad a sejtben. Ennek az űj neve Fkot/GM 101.

Az F'tet/GMl Öl-et azután módosítjuk egy laeT# konstrukciónak az ebg ©peronnak a 2493-2937-es nukleotidjai közé való bejuttatásával, amely számozás a Genbank M64441Gb„Bá számozásának felel meg, a megszakító e.ög gén kivágásával.

A konstrukciót a kromoszómába egy AGebg-LaclQ#5 nevű rekombináns tággal juttatjuk be az P'tet/GMlOl-he. A rekombí85 * * < * * * * 4³ náció és a felbontás után csak az előzőkben ismertetett lőszert marad a sejtben. Ennek az- új neve F'tet/GM'22'1. Az F*tet epi szómat. IB táptalajban 25 pg/ml koncentrációjú akridin-narancssal kiirtjuk a törzsből. A tisztított törzset azon az alapon azonosítjuk, hogy tetracíklin rezlsztens, és a GM221 néven tároljuk.

A pAMG21 plazmidban levő Fc fúziós konstrukciót (amit a továbbiakban pAMG2 l-Fc-TMP-TM? néven említünk) tartjuk, ami viszont a G-M.221 gazdatörzsben tartunk (ATCC letéti száma 98957, a letétbe helyezés időpontja 1998. október 22,).

SZÍO

Az Eschariohía colt GM221 tenyészetben levő pAMG21-Fc~ TMP-TMP~t, amely tenyészetet 40 pg/ml kanamidnf tartalmazó Luria Broth táptalajban tenyésztünk, az indukció előtt 37 ^cC-on inkubáiunk. Az Fc-TMP-TMP géntermék expresszióját a luxPR promoterrői az alábbi szintetikus auto-índukálószernek 20 ng/ml végkoncentrációban a tenyészkőzeghez való hozzáadásával érjük el: M-í3--oxohexanoil}~D-t~homoszerin lakion, majd a tenyészeteket további 3 óra hosszat 37 °C-on Ínkubáljuk. 3 óra elteltével a bakteriális tenyészeteket mii

VÍZSÍ hogy tartalmaznak-e zárvány testeket, majd centrifugál ássál összegyűjtjük őket. A fénytőrő zárványtesteket az indukált tenyészetekben figyelhetjük meg, jelezve, hogy az Fc-TMP-TMP Escherichia cofi-ban legnagyobb valószínűséggel az oldhatatlan frakcióban termelődik. A sejtüledékeket közvetlenül lizálfatjuk, Laemmli míntafeivivó pufferben reszuszpendálva, ami 10% β~

Φ ,φ * X * « ex ΛΑ 6 X X 4

ΧΧ < Φ Φ ·* ♦ * merkaptoetanolt tartalmaz, majd SDS-PAGE-val elemezzük, -Az SDS-PAGE gélen egy Coomassie Bitié-val intenzíven festődé, körülbelül 30 kDa méretű csík volt megfigyelhető. A várt géntermék 269 amínosavat tartalmaz, és a várt molekulasúlya körülbelül 29,5 kDa. A fermentációt 10 literes méretben is elvégeztük, standard sarzs-körülmények között, ekkor az Pc-TMP-TMP expressziós szintje hasonló volt a laboratóriumi szinthez.

Az Fc-TMP-TMP tisztítása

A sejteket vizben tárjuk fel (1 /10) nagynyomású homogenizáciőval (2 átpréselés 96,5 Mpa nyomáson), majd a zárványtesteket centrifugálással nyerjük ki (4200' per perc fordulatszám,. J-6B centrifugában, 1 óra hosszat), A zárvány teste két 6 mol/l guanidin, 50 mmol/l TRIS, 8 m.mol/1 DTT pH«8,7 összetételű oldatban szolubílizáljuk, 1 óra hosszat, 1/10 arányban. A szolufeílizált keveréket 20-szorosra hígítjuk, 2 mol/l karbamid, 50 mmol/l TRISZ, '160 mmol/l arginin, 3 mmol/l cisztein pH«S,5 Összetételű oldattal. A keveréket éjszakán át szobahőmérsékleten hidegben keverteijük. Az eljárásnak ebben a pontjában az FcTMP-TMP monomer alegység dímerizálódík, igy jön létre a diszulfid-híddal összekapcsolt vegyület, aminek a struktúráját a 6C. ábrán láthatjuk, majd ultraszüréssel körülbelül tízszeresre töményíijük. Ezután háromszorosra hígítjuk 10 mmol/l TRISZ, 1,5 mol/l karbamid pH~9 összetételű oldattal. Ennek a keveréknek a pH-ját ecetsawal 5-re állítjuk. A csapadékot centrifugálással eltávolítjuk, majd a felülüszőt SP-Sepharose Fást Flow oszlopra

8?

♦ ««♦ visszük, amit 20 mmol/1 nátrium-acetát, IÖÖ mmol/1 nátriumklorid pH=5 összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba (10 mg/ml felvitt fehérje, szobahőmérséklet). A fehérjét 20 oszloptérfogatnyi gradienssel eluáljuk, amit az előzőkben ismertetett pufferben készítünk el, és 100-500 mmol/1 nátrium-klorid a terjedelme. Az oszlopról lejött pool-t háromszorosra hígítjuk, majd SP-Sepharose HP oszlopra visszük, 20 mmol/'l náfríum-acetát, 150 mmol/1 nátrium-klorid pH=5 összetételű oldatban (lö mg/ml fehérje, szobahőmérséklet). A fehérjét 20 oszloptérfogatnyi gradienssel eluáljuk, amit az előzőkben ismertetett pufferben készítünk el, és 150-400 mmol/1 nátrium-klorid a terjedelme. A csúcsot egyesítjük és megszűrjük.

Hl. Az alábbiakban a találmány szerinti különböző vegyületekkel egerekben kapott ín vívó adatok összefoglalását adjuk meg

Egerek

Normális nőstény BDFI egerek, életkoruk 10-12 hét.

Vérvételi terv⁷

Csoportonként tíz egeret kezelünk a nulladik napon, két csoport 4 nap különbséggel indul, és csoportonként összesen 20 egér van. Az egyes időpontokban öt egértől veszünk vért, és az egerektől minimum hetente háromszor veszünk vért. Az egereket isoflurane-nai érzéstelenítjük, és összesen 140-160 μΐ vért veszünk tőlük, orbitálís sinus küyukasztásával A vért Technikon.

X

SS > * ·*·χ

H1E vérelemzövel mérjük meg, amin a rágcsáló vérre készített szoftver fut. A mért paraméterek: fehér vérsejtszám, vörös vérsejtszám., hematokrit, hemoglobin, vérlemezke, neutroűlek.

Az egereket vagy szubkután injekciózzuk plusz bolusz kezelést kapnak, vagy egy hétnapos mikro-ozmotikus pumpát építünk be a folyamatos bejuttatás céljából. A szubkutén injekciókat 0,2 ml térfogatban juttatjuk be. Az ozmotikus pumpákat, érzéstelenített egerek lapockái közé a bőrbe tett szubkután bevágással visszük be. A vegyületeket 0,1% BSA-t tartalmazó 'Κ'λν·' relt sóoldattal hígítja egy kontroll csoport, ennek, a jelzése „hordozó”, amiket csak ezzel a hígítószerrel kezelünk. A vizsgált anyagok koncentrációját ezekben a pumpákban úgy állítjuk be, hogy a pumpákból a kalibrált áramlási sebesség a grafikonokon megadott kezelési szinteket adia.

kísérletben vart

A vegyület dózis-bírálását az egereknek hétnapos mikroozmotikus pumpákkal juttatjuk be. Az egereket a különböző vegyületekkei egyetlen 100 pg/kg dózissal kezeljük, hétnapos ozmotikus pumpákkal. Ezek közül a vegyületek közül néhányat egyetlen bolus injekcióban adunk be az egereknek.

Az aktivitási teszt eredményei

Az aktivitási kísérlet eredményeit a 4. és S. ábrán mutatjuk be. A dózis-válasz vizsgálatokban, amikhez hétnapos mikroozmotikus pumpákat használunk (nem közölt adatok), a maximális hatást a 18. számú szekvenciával rendelkező vegyülettei kaptuk, löö pg/kg/nap dózisban, a lö pg/kg/nap dózis körülbelül 50%-a a maximális aktivitásnak és az 1 pg/kg/nap a legalacsonyabb dózis, aminél ebben a rendszerben aktivitás egyáltalán megfigyelhető. A vegyület 10 pg/kg/nap dózisa körülbelül azonos aktivitású mint a 100 pg/kg/nap nem-pegílezett rHu-MGDF, ugyanabban a kísérletben.

IV. Megbeszélés

Az teljesen elfogadott, hogy az MODF hasonló módon hat mint a humán növekedési hormon (hGH), azaz a fehérje ligándumnak egy molekulája két receptor molekulát kőt meg az aktiválásához [Wells, J.A.i Annu, Rév, Biochem. 65, 609-634 (1996)], Ezt a kölcsönhatást utánozza a sokkal kisebb TMP hatása. Azonban a jelen vizsgálatok azt sugallják, hogy ehhez a mimikrihez két TMP molekula összehangolt akciójára van szükség, mivel a TMP kovalens dimerizáeiója akár a C-C párhuzamos, akár az N-C soros módon körülbelül tízszeresre fokozza az eredeti monomer in oitro biológiai hatását. A monomer 'viszonylag alacsony biológiai hatása, valószínűleg a nem-kovalens dimer nem kialakult kovalens dimernek megvan ekmínálja az entrópia korlátot egy yge natasos a következménye. Egy előre képessége, hogy nem-kovalens dimer :« «

W « « « *

V « « » « képződése előtt, arait kizárólag gyenge nem-kovalens kölcsönhatások hajtanak a kis, 14 csoportból álló peptld két molekulája között.

Érdekes megjegyezni, hogy a legtöbb tandem dimer sokkal hatásosabb mind a C-terminális párhuzamos dimer. Úgy tűnik, hogy a tandem dimerizáció a molekulának egy jobban Illeszkedő konformációt biztosít, mint a C-C párhuzamos dimerizáció. Egy tandem látszólag aszimmetrikus tulajdonsága közelebb viheti a természetes ligandumhoz, ami, mivel egy aszimmetrikus molekula, két különböző helyet használ a két azonos receptor molekula megkötésére.

A PEG egység beviteléről azt gondoltuk, hogy fokozza a módosított peptid in vivő aktivitását, védelmet biztosítva a proteolítikus lebomlással szemben, és lelassítva a vesén keresztül való kiürülését. Váratlan volt, hogy a pegilezés emellett tovább fokozhatja egy tandem dimerizált TMP peptid ín vitro biológiai aktiviV. Az alábbiakban a találmány szerinti különböző vegyél· letekkel majmokban kapott in vívó adatok összefoglalását adjuk meg

Ahhoz, hogy kiértékeljük az TMP szubkután beadásával kezelt nőstény rhesus majmokkal kapott hematológiai paramétereket, az alábbi protokollt terveztük meg és alkalmaztuk. Öt darab, 3-3 majomból álló csoportot állítunk össze. Az 1-es csoport a kontroll, ez csak acetát puffért kap (20 mmol/1 nátrium9 ·* ♦♦ acetát, 0,25 m.ol/1 nátrium-ldorid, pH=5), ami sem TMP-t, sem pegilezett, rekombináns humán MGD.F~et (PBG-rHuMGDF) nem tartalmaz. A 2-es csoport egy vagy több TMP dózist kap, az alábbiakban jelzett intervallumokban; a 3-as csoport 1ÖOÖ pg/kg TMP-t kap az alábbiakban jelzett intervallumokban; a 4-es csoport 5000 pg/kg TMP-t kap az alábbiakban jelzett intervallumokban; és az 5-ös csoport 100 ug/kg PEG-rHuMGDFet kap az alábbiakban jelzett intervallumokban.

Azt a napot, amelyen az első egyetlen dózist beadjuk, az egyes ciklus nulladik napjának nevezzük. A kettes ciklusban a dózisokat a 21., 23., 28., 30. és 32. napon adjuk be. A 3-as ciklusban egyetlen dózist adunk be a 84. napon, és a 4-es ciklusban egyetlen dózist adunk be a 123. napon. Az állatokon az akklimatizáciös periódusban naponta egyszer figyeljük a klinikai tüneteket, a dőzisos napokon naponta háromszor (a dózis előtt, a dózis után közvetlenül 30 perc múlva és a dózis után 2-3 órával), valamint a dőzísmentes napokon naponta egyszer. A táplálékfogyasztást naponta számítjuk ki, az egyes állatoknak kiadott kiadott ételdarabok és a megmaradt ételdarábok száma alapján, a megfigyelést 7 nappal a dőzisos periódus előtt kezdve, egészen a regenerálódás! periódus végéig. Az egyes állatok testsúlyát a dőzisos periódus előtt kétszer mérjük meg. és még kétszer megmérjük a dőzisos periódusban és a regenerálódásí periódusban, A hematolögiához a vérmintákat a. dozírozás megkezdése előtt egyszer készítjük el, majd egyszer elkészítjük az 1., 3., 5., 7., 9.,

11., 13., 15., 20., 22-, 24., 26., 29., 31,, 33., 35., 37., 39,, 41., $2 *X «

43., 45., 47., 49., 55.., 62., 69., 76., 83., 85., 87.

91., 93.,

95., 97., 99., 101,, 103., 105., 11., 122., 124., 126., 128,, 130,,

132., 134., 136., 138., 140,, 142,, 144., 150. napon, A farmakokinetikai elemzéshez 0,5 ml szérummintát veszünk egyszer a dozirozás előtt, és a dozírozás után 1, 4 és 24 órával. A min tákat a 0,, 21., 32., 84, és 123. napon vesszük le, majd az elemzésig-70 °C-on tartjuk. Az ellenanyag elemzéshez 2 ml vérmintát veszünk az egyetlen dózis előtt egy héttel, majd naponta egyszer a 0. napon (a dózis előtt), majd a 6.., 13., 20., 34., 41., 55., 62., 76.,

83., 90,, 97,. 104., 111., 118,, 129., 136., 143, és 150. napon. A mintákat az elemzésig ~7Ö *C-on tárolj uk.

Az eredmények azt mutatják, hogy a vérlemezke számok minden kezeit csoportban nőnek, és a .legnagyobb változás a PEG-rHuMGDF csoportban és a magas dözisú ATMP csoportban figyelhető meg. Az 1 -es ciklusban a vérlemezke értékek körülbelül 3,3-szeresre nőttek, míg 3,1.-szeresre nőttek a PEG-rHuMGDF csoportban (9. nap) és az 5000 gg/kg AMP2 csoportban (9. nap), a kontroll csoport átlagos vérlemezke számával Összehasonlítva. Az alacsony dózisú TMP-néi a vérlemezke számok a kontrollnak körülbelül 15-szeresére nőttek, ugyanazon a vizsgálati napon. Hasonló válaszok voltak megfigyelhetők minden más ciklusban is.

Azonban a 4-es ciklusban a PEG-rHuMGDF csoport nem mutatott ugyanolyan nagy vérlemezke szám növekedést mint az. előző ciklusokban. A PEG-rHuMGDF csoportban a vérlemezke szám körülbelül kétszerese mint a kontroll csoportban kapott ***« »« * * * φ · χ szám, 9 nappal az ebben a csoportban beadott dózis után. összehasonlításként, a legmagasabb dózisú TMP csoportban a 4es ciklusban az átlagos vérlemezke szám 3,3-szer magasabb mint a kontroll csoportban. Emellett a PEG-rHuMGDF-íel kezelt állatokban a 4-es ciklus kezdetén (per dózis) az átlagos vérlemezke szám. 53%-kal alacsonyabb mint a kontroll állatok átlagos vérlemezke száma, és a 4~es ciklus végén* (27 nappal a dózis után) az átlagos vérlemezke szám 79%-kal alacsonyabb mint a kontroll csoportban. Mindegyik TMP állat esetében az átlagos vérlemezke szám a 4-es ciklus elején és végén ±15%-os eltéréssel ugyanaz, mint a kontroll csoportban.

Az 1-es és 2-es ciklusban mindegyik kezelt csoportban a vörös vérsejtek (W'S) csökkenésének trendje volt me^igyelhető a kontrollal összehasonlítva, A csökkenés a 41. és 43. napon a legnyilvánvalóbb, és a WS szám legnagyobb csökkenését a PEGrHuMGDF csoportnál lehetett megfigyelni. A. vörös vérsejt számok legkorábban a 47. napon kezdtek visszatérni a normális szintre (a kontrollal összehasonlítva). Áz 1-es és 2-es ciklusban a 33. napon a fehér vérsejt (FVS) szintek drámaian megnőttek a kontrollal összehasonlítva. A 33« napon enyhe növekedés figyelhető meg az 5OÖÖ pg/kg TMP csoportnál. Az értékek a 37. napon kezdtek visszatérni a normális (kontroll) szintre. Hasonló válasz volt megfigyelhető a 3-as ciklusban, és a 4-es ciklusban nem volt megfigyelhető válasz a fehér vérsejt számban, egyetlen kezelt csoportban sem.

* Ν « « «X Φ X ΦΦ « Μ «Φ ΦΦ»

TMP a vérlemezke számok növekedését eredményezte a kezelés különböző ciklusaiban. Kiderült, hogy a. vérlemezke szám eredmenyek alapján nincs biölőgíaíl&g szignifikáns immun-közvetített válasz az TMP-re. Ezzel ellentétben a különböző ciklusokban

PEG-rHuMGDF-fel végzett kezelés nem mutatta a vérlemezke válasz gátlását a 4-es ciklusig. sugallva, hogy PEG-rHuMGDF elleni ellenanyagok keletkeztek, és ezek az anti-MGDF ellenanyag

Kereszti ax ax e

Ax alábbiakban Ismertetjük a leírásban említett szekvenS2BKVENCIÁ LISTA <170> Patentul Ver. 2.0 <210> 1 <211> 14 <212>Fehérje <213> mesterséges szekvencia <OOQ>

Xw .aivr U <223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 1 η Λ.

X Φ -i ♦ Φ* φφ * *»»Φ ΧΦΦΦ ♦ χ * * * φ φ φ « « * * Φ * Α

ΦΦ ΦΦΧ 9»

A 3-as ciklusban a 13. napra az összes kezelt csoportban enyhén csökkent a vörös vérsejt szám (az egyetlen 3-as ciklus dózis után), az 500 pg/kg TMP csoport kivételével. A vörös vérsejt értékek a normál szintre (a. kontrollal összehasonlítva) a 17, napon kezdtek visszatérni.

A 4~es ciklusban a vörös vérsejt számok minden kezelt csoportban csökkentek a kontrolihoz viszonyítva, az 500 ug/kg TMP csoport kivételével. Más ciklusoktól eltérően egynél több mélypont volt megfigyelhető ebben a ciklusban. Ezek a csökkenések a dózis után 1-9 nappal léptek fel, és legkorábban 11 nappal később kezdtek normalizálódni.

Az eredmények azt mutatják, hogy a számokban a kontroll állatokkal Összehasonlítva mindegyik állatban növekedés volt kimutatható a dózis után 7-9 nappal, az összes vizsgált ciklusban. Úgy tűnt, hogy az ismételt dózis fázis erősebb választ, adott a vérlemezke termelésben mint az egyetlen dózísos fázisokban, A 4-es ciklusra a PEG-rHuMGDF által kiváltott vérlemezke válasz a korábbi ciklusokkal összehasonlítva alacsonyabb, és a magas dózísú TMP válasszal, összehasonlítható. A legtöbb kezelt csoportnál vörös vérsejt számok csökkenése figyelhető meg az 1-es, 2-es, 3-as és 4-es ciklusban, a vizsgálat minden ciklusának valamelyik pontjában, azonban a dózis megszakítása után minden hematológiai paraméter visszatért. a normális szintre (a kontrollal összehasonlítva).

Összegezve, ezek az eredmények azt mutatják, hogy az

TMP-vel végzett kezelést a. rhesus majmok jól tolerálták, és a * _Λ *·_# * ♦ * * «««Α φ* «μ >* <2102 =211 > 14 <212>

<213> mesterséges szekvencia <22ö>

<223> A mesterséges szekvencia <220 <223> A peptid egy homodimer egy alegysége: a dimerben levő alegységek kovalens egyes C-termínálíson,

NH2~CH2-CH2-CH2~CH2-CH(CONH21 s az

-CH2~CH2~NH2-vel <400 2

Iie Glu Giy Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Aia Alá Arg ftle iö <210>3 <211> 684 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220 <223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid «

<4Üv> 3

atqqaeaaaa	'2t. C >:í Ό <3 03	tccacet tat	ccagctcceq	aacaccteee	gggaccgtea	60
Γ c'.t cetet	£. COX'OCü <323.	a cca a a qqa c	aecateatea	:: c·: cccggac	c c c t gaggtc	120
aeatqcgtgq		g a ec c a.c qa a	qaccctgagg	••.caaqttcaa	c;: getaegtq	1.80
gaeqqcgteg		tgccaaqaca	aagccgcqqq	aqgaqcagta	caacaqcacg	240
t accgc qt eq	':·. v.*í3<XC\$£ ΐ?·<7 >*·	c a cc g t cc tg	ca ccagga c t	qqccqaatge	caaggagtac	300
caetgcaacg	i;ctcc<:xJcaa	agccctccca	q c C e c ca t c q	agaaaaceat	c *; c c a a a e c a	360
aaaqqqcaec	í* 7 C <5 >·$ <5 3 <3 Cí*	acaqqtq': ae	a c cc t g e c cc	cac cccggga	s: qaqcagaec	4 20
a aeáaceaqq	•MCiqOCuQÓC	ctgcctqqt c	aaaqgettct	a rcccagcea	eatcgecatg	4 80
	?’: etgggca	ecccgccaac	aacíaeaaqa	cca ccc ~tcc	cgtgc”geac	34 0
t ccqacqgct	cet tett cet	ctacagcaag	etcaecgtgg	acaagagcae	gtgecagcag	600
qqgaacg?; et	ix e t \· a t g c t e	cgtqatgcat	g-aqgctctgc	a cg a ccac t a	cacgaagaag	860
•ccc tctccc	tqtctccgqq	caaa				684

<210>4 <21.l> 684 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: olígonukleoüd <400>4

“aectgtfctt	qagtgSgfcac	aggcggaacs	ggtcgagqcc	ttgageaccc	accfcggeagt	60
cagaaggaga	aggggqgttt	tgggttcctq	tqggagtsct	agaggeccá g	gegactccag	120
tgcacgeacc	accacctgca	eteggtgett	ctgegactcc	agttcsagtt	g —a,. g^a c	180
cteccgcacc	tccacgfcatt	acggttetet	fctcggcgcce	tcctcgtcat	gttqtcgtgc	240
a t egeac ac c	aategaagga	qtqgcaqeac	gtqetectga	ccgacttacc	gttccteatg	300

* ♦ * fc ♦

r. rcacgh cc	sqaqqt: Í:í5‘; í;	tcqqqagqqt:	cqqggqí.ago	rctLtTqcha	qcqqtttcqq	360
t: ·; tcccq cq	qqqr Let: ·: qq	tqhccacatq	Oqqqacgqgq	q *aqqqoo c 5	achcgactqg	-Ϊ 20
t.tcí: hgqoec	agfccggacTq	q a c qqac ca g	h ·. l C’k-qaaq<j	taggqtcqcí	gtagcggcao	4S-0
·;: í.caccctct	eqfctacceqh	cqgccrcttg	rcqatqttqr	ggfcgcggagg	q··— ’íi'v.· qa o u <. q	54 ö
aqgcrqccga	qoaaqaagga	qatgtcgtte	gaq-ggcacc	tgttetegte	caccgtcgte	600
c<:cf. ·: qraqa	acaqtaogaq	qcacracqta	cxccgaqacg	r.qttqqtgat	qtqcqtcttc	66ö
iccqaqa::cq	—ca c a ggc cc	attt				68 4

<210>5 <211>228 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása:

Za;.

Asp

Lys

Thr

H i s

Thr

Cys

Pre

Pro

Cys

Pro

Aia

Pro

Giu

Lau

Loa

ΐ

5

lö

15

Giy

Gly

Pro

Ser

Vai

Aha

Lee

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asc

Thr

Leó

20

25

30

Get

Iis

Sor

Arg

Thr

Pro

Giu

Val

Thr

Gys

Vai

Val

Vai

Asp

Vai

Ser

35

40

4 5

His

Giu

Asp

Aro

GIc

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Vai

Asp

Gly

Vai

Glu

Sü

Ή · μ·:· <3<ί ?yr Asn Ser /al Ser Val Leu. Thr Val Leu His Gin Aso Trp Leu Asn

SO

,.ys Gin Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Aia Leu Pro Alá Pro

VOö 105 110

Up GLu Lvs· Thr lle Ser Lys Alá Lys Giv Gin

120

Arg Glu Pro Gin

125

Λιί. Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn .·. oo r u 5 x 4 0

Val

I 75 ,ea Thr Cys Leu. Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Aia

150 155

6o

Trp Giu Ser Asn Giv Gin Pro Giu· Asn Asn Tvr Lys Thr Thr Pre

1ÖS

170

175

Val Leu Asp Ser Asp Giy Ser Phe. Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

ISI

130

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn V-al Phe Ser Cys Ser Vaj 195 200 205

Alá Lsu H vs Ser Leu Ser Les270

215

220

Ser Pro Giv Lys <211> 8 iöO

Φ *56 ΦφΚφ A Α φ* ♦ »''· Φ » * ♦ ♦ *V « » * » • * ♦« »Κ ** Φ* <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <22Ö>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 6

-·4.ί y <2IÖ> 7 <21t> 8 <212>

<213> mesterséges szekvencia <220>

:223> A mesterséges szekvencia leírása:

y Asn Gly Ser Giy Sly

ΙΟΙ <210>8 <211>8 <2Ι2>

<213> mesterséges szekvencia <22ö>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <4ÖG> S

Giy G.ky Gly Cys Giy Giy G.ly Giy 1 S <21Ö>9 <211>4 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <4Q0> 9 xy Pxc Asn fo.ty

Í02 ♦ ♦-* a χ « ♦

Φ Φ Φ .φ φ φ < *

φ. * Φν <κ* φΛ¹ <210» 10 <211> 32 «212> fehérje «213» mesterséges szekvencia <220» «400» 10 ΐ Le Glu Gly P.ro Thr L«u Arg Gin Trp Let: Alá Aia Arg Alá Gly Pro l 5 10 3

Asn Gly Xie Glu Gty Pro Thr tea Arg Gin Trp tee Ale Aia Arg Ale

25 30 <210> 11 <211» 36 <212»fehérje <213> mesterséges szekvencia <220» «223» A mesterséges szekvencia leírása: peptid <220» «223» Ciklikus peptid: a szekunder struktúrát diszulfid-hid tartja fenn a 9-es és 31-es pozícióban levő Cys csoportok között

ÍÖ3 *v

Κ· Φ >4 , « * ♦ * < fr * « Φ W ’ ** ** ·φ

Gly 'Pro Thr Le a Arq Gin Cys teu Aid Alá Arq Alá Gly Gly in

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Xle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin.

25 30

q.vs Let

Alá Arq Alá <210> 12 <211> 36 <213» szekvencia <400> 12

Thr Leu Arq Gis lys Leu Ma Alá Arg Alá ily Gly Gly .Xle Gla Gly Pro Thr Arg Leu

q. v:

Alá Ale /-'.re .Als <210» 13 ív. # <2 1 I >

=212> fehérje '£3 <22 leirasa:

<400> 13 }· l. ^; ί x a L.eu Ara Alii Arg Aia Ciy

G ι v ^:G ι ν G λ y

G.iy Giy Oly •iu Gly Pro Thr ieu Arg Cin Aia teu

30

Alá A.La Arg Aia :210> 14 <211>

<212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <4ÖO> 14

Itt- Gitt tttty

Lí'í ‘http ttíítt Al<i Att-s ΑΙρ .Ais. Gly G.i.y löS y í>vís a?ιv fe ι v fetV feíy xx^ feru Giy £>xo Thr feei óv'·

T v'*n : <Λ γ <210> 15 <211> 36 <2 I3> mesterséges szekvencia <22ö>

van <400> 15 υ Gly Pro i’hr Leu Arg Gin Trp tea Alá Alá Arg Alá Gly Gl lö 15

Lys GLy Gly Gly Gly 11. Glu Gly Pro Thr Leu Arc :o z:s.

Alá As <21Ö> 16

106 *Φ φφ *Χ*Φ Λ, φ *Χ * ♦ Φ ♦ Φ* <21.1> 36 <212> fehérje sz :400> 16 sj j. %

Leu Arq Gle Tro Leu A.l a Aln Arq A.L* GIv

Giy Gyo Giy G.ty Giy

Le Glu Gly Pro Tor Leu Arq Gin Top Leu

Aló Al* Áru Alá

Ί λ <210> 17

<223> A 18-as van

507 φ φ ί φ ΦΦ > X

X X # Μ Φ * X X » * φ * Λ Φ * ♦ ♦ Φ * X » Φ « «ΦΦΧ ΦΦ φφ Φ <400» 17

Giu Giy Pro Thx Leu Arg Gin Trp Lau Aie Alá Arg Aia Gly Giy

i.í.ív u.Ly λ kí?

Giu Giy Pro Thr Leu Arg Glo Trp Lei

Alá Aia Arg Aia <210» 13 <211» 36 «212» fehérje «223» A 18-as <220» van «223» A mesterséges szekvencia leírása: pepiid-származék

Pro Thr Leu Arg. Gin Trp Leu Aie Aia Arg Aie -Giy -Gly

Giy Cys Giy Giy Giy Giy lie Giu Giy Pro Thr Leu Arg Gin Trp .Leu ag

Alá Aia Arq Al;

<2iü> 19 <211> 36 &Γ· < « ** * » >* «·* «220<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 19 l<s Glu Gly Pro Tbc Gsu Arg Sin

5

Trs Lsu Alá Al® Arg Alá Gly Gly

Atsn Ai.y

Pro Tbc tea Ara Gin Tr c*'·' · »s: <

dO

A.á<l Ax<?< AíTQ A.léi <211> 36 <213> mesterséges

1(19 <223> Egy homodimer monomer alegysége; A homodímerben levő alegységeket minden egyes alegységben a 18-as pozícióban levő Cys csoportok közötti diszulfid-híd köti össze szekvencia leírása:

<4ÖO> 20 dt ? \5í.u ty.LV

Ar

-i-X /-sk8 •A.i'8 ’5 <210> 21 <211> 36 <212> fehérje

Aia

ÁX8 Ax'9’ Ax8 »V :220>

JO

Gly Giy Giy Giy Gly 'Giy íle Giu Gly Pro Thr Leu Arg Gin 23 25 33 :210> 22 <211> 32 <220>

msen ^A$Ö va

<400> 22

He Giu Giy Pro Thr Leu Arg Glu Trp Leu Aia Aia Arg Aia Gly Gr-;

S ΐ c ΐ a

Asn- Glv Xle Glu Giy Pro Thr Leu. Arg Gin Trp Leu Aia Ale: Arg _AAia

G<;

<210> 23 <211> 32 ♦* ♦ <212>

<213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobu lm Fc régié C-terminálisához és ^-terminálisához <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 23

Oiu Oly Pro Thr L-e-u Arg Gin Trp L«u Aia Aia Arg Alá. Gly Pro a 10 IS

Asn Oiv íis Gin GIv Fro Thr tsu Aro Cin Trp Lsn Aia Aia Arg Aia <21O> 24 <211> 36 <213> mesterséges szekvencia <223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobu lín Fc régió C-terminálisához <220>

152 * ♦ * ♦

00> 24 urasa;

i. v.i. V

Pro Th.r 5..O1.S Ara Gin Trp Leu Alá Alá As

Alá Gly G ly Gly Gly Gly Gly Ils Giu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

Alá Alá A r-α Ale <210> 25 <211> 34 <213> mesterséges szekvencia <223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egv immunglobulin Fc régió C·· terminálisához <220>

<400> 25 od v íj.::' ο?.

;iu gí· §

<213> mesterséges szekvencia <22ö>

<223» A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-termináKsához <223» A mesterséges szekvencia leírása:

:H Giy Oly. Pro· Tar Leu Arg Gin Trp Leu Alá Aia Arg Als Gly Giy

Giy Glv Giy Oiy Giy Giy Ile Giu. Gly Pro Thr La-u Arg r?p

Aia Alá Arg Aia

«»φ» *> φ» φ·* <213» mesterséges szekvencia <220» <223» A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-termínálisához <220» <223» Ciklikus peptid; a szekunder struktúrát a 9-es és 3 l~es pozieióban levő Cys csoportok közötti díszulfid-híd tartja <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400»2 lie Giu Gly Pro Thr Leu Acq Gin Gye Len Alá AÍ& Arq Al<=i Gly Gly

Glv Gly Glv Gly Xle Giu Gly Pro Thr Leu Arq Gin Gye L^u.

Mia nru Axa

CA

SIS κ ·.

rt χφ v* •OQ <212» fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223>

Fc régió C-termínálisához

<400» 28

11« Glu Gly Pro Thr leu Arg Gin Cys Lsu Alá Alá Arg Als Gly Gly

2? 1 y (J.áy Giy h>.ky G.iy Xj-ky

20:

<ϊλί.^; GXy 5?.rc Thr kriS’-í Ar íj χ?Χ·π Cyy íuSa h -s ··>

Alá Alá Arg Alá <211» 36 <212» fehérje ^VO' ♦ * X * Φ * X * * » X * « φ- φ «β

ΦΦΦ X X Φ Φ Λ· Φ Φ χ χ ΦΦ «Φ *e* <223» A mesterséges szekvencia leírása:

<220» <223» A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy ímmunglobu Hn Fc régió €- terminálisához <400» 29

T i.« Glu Gly Pro Thr Uso Arg Gin Alá Leu Als Alá Arg Als Gly Gly lu /- ' . , > V ' V .· z f’* * V ' Γ*' V - Z * '' »·>

U.i.y '•Ja y ··.;.> y i-idd >ly Pro leu Arg ( κϊ.^Π ué •V Λ

Arc ΆΧ&

<210» 30 <211» 36 o13» mesterséges szekvencia <223» A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy ímmunglobu lin Fc régió C-termmálísához <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400» 30 ♦ ♦ •X 'φ ♦ * » Κφ XX» Φ Φ < » Φ Φ Φ χ * Φ * >Φ Φ * Φ» »* φφ «*

5 19 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 le Glu Gly Pro Thr Lau Ara Gin Trp Leu

25 30

Aid Aid Arg Alá <210> 31 <211 >36 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <22ö>

<223> A pepiid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-termínális&höZ <400> 31

Glu Gly Pro Thr Leu Arq Gin. Trp Leu Aia Alá Arq Aid Gly Gl\

Cys Gly Giy Giy Giy lie Glu Gly ?ro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Alá Ara .Alá

RS

Φ 4

ί.

φφ <21.0> 32 <211> 36 <212» fehérje <213» mesterséges szekvencia <220>

<223» A mesterséges szekvencia leírása: peptid <220>

<223» A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobu lin Fc régió C~ terminálisához <400» 32 lle Giu Giy Pre Thr Leu Arg Gin Trp Leu Aie Aie Arc Aia Giy Giy i 5 10 15

Gly Asn· G.1 y Ser Giy Giy lie Giy Giy Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

25 30

Aia Alá Arg Alá <210» 33 <211> 36 <21.2» febérj <213> mesterséges szekvencia

ΦΧ

ΦΦ ΦΦ ΧΦΦΦ φφ

Φ φ. φ * χ φ φ χ χ

Φ ΧΦ ΧΧΦΦ φ ίφ Φ φ φ X φ φ X Φ φ φ X * Φ φΦ «Φ <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírásai peptid <220>

<223> A peptid egy homodimer alegysége; Á homodímerben levő alegységek az egyes alegységek 18~as pozíciójában levő Cys csoportok közötti diszulfíd-hidak révén kovalens kötéssel vannak összekötve <22ö>

<223> A peptid kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunglobulin Fc régió C-terminálisához <400> 33

Xle Glu Oly P.ro T:hr L«u Arg Olo Trp

Leu Alá Alá Arg Alá Gly Oly

15

Pro· Thr Leu Arg Gin Tcp Leu <210> 34 <211>41 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <oon>

> Λνί \rt^f · no

ί.

*-» « * y ♦ ♦ * χ « χ $ ♦ « « Λ X ♦ « ♦ ♦ * * *» <220>

<400> 34

Giy Giy Giy Giy Giy ile Glu Giy Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Aia

IS iO iü

Aia A::

Alá Giy Giy Giy

-- y y Giy Giy

i. ,i. U

Iu Giy Pro Thi

Z\>

Leu Arg Gin Trp Leu Aia Aía Arg Aia

40 <210> 35 <211> 60 <212> DNS <22ü>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: öligőhükleötid <4ÖO> 35 aaaggfcggag gtggtgg'tat cgaaggtccg actctgcgt-c agtg<g év <21ö> 36

9# ΧΦΦΧ ♦> *·* « X 4 « X ♦ Φ X * ♦ ♦ * * « 4 4 φ * X Φ Φ Φ * Φ Φ φ >*** »φ »Χ λΦ ΦβΦ «211 >48 «223» A mesterséges szekvencia leírása; oligonukleotíd «400» 36 accc-ccacca ocagcacqag caqcesqcca ctqacgcaga qtcqqacc 48

«212» «223» A meste «400» 37 cgc.qca.

<5 t?

<21ö> 38 «211» 76

322 t-tf <212» DNS <213» mesterséges szekvencia <220>

<223» A mesterséges szekvencia leírása: oiigonukleotid <400» 38 aa.aaaaagga scctcgagat catgcgcgüg ctgcaagcea fctggcgaagg g-tqggccc': 60 •raafcacctcc gc:cgc<: 76 <210» 39 <211» 126 <212» DNS <213» mesterséges szekvencia <220» <223> A mesterséges szekvencia leírása: oiigonukleotid <400» 39 aaaggtggag gtggsggtafc egaaggfeceg actctgcgfcc agtggctggc tgctcgtgct 6ö ggtggtggag gtgqcggcgg aggta-tfcgag ggcccaaccc tccgccaatg gcttgcagca 120 cgcgoa 126 .4.

10» 40 <211» 124 »4 <2í2> DNS <213> mesterséges szekvencia <2207* rV # a > X « ♦

♦ « *♦ 4* * « « * a » **

A*

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oligonukleotid <ⁱj’ÖÖ-^s' 40 c ca g q c t q a g a cg c -a g fc-c a c cg ac cga c g a g c ac g acc a c

Occcrcccgg gttgggaagc ggrPaccgaa cgtcgcgcgc :C·-:

cacotocacc gccgcctcca 60 gtattagagc tcctaggaaa 120 •r η x <2!0> 41 <211> 42 <212> fehérje <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: pepiid <4ÖÖ>41

DVS hiy hí.·. V k?.L\

Gly Gly He Glu Gly Pro Thr Leu Ax

10

VJ.n x rp Ú«U

A X 3 A.:.·:: AW AX 3 \;X V G.l V G-^:->·' 5:.:.y Gl V V.i. j·'* :iö Giu Giv Pro

25 ,ft-u Arc vj

Trp Leu .Alá. Alá

A.rg Aia

EU ***·$ * Ψ « Ά 9 * * V « *·> 4 * Ο «

Í* » * * » * « > Λ ** ♦ “ ** <Α <2 ΙΟ» 42 <2Π> 22 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: oiigonukleotid aa-ca's.aagi:a cctgsagga-r. cg <2ÍO> 43 <21!> 52 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <223> A mesterséges szekvencia leírása: oiigonukleotid <400> 43 cctccac ;ttaccc tgacagggag agg • vvCT, <210> 44 * * Sí <211> 861 «212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása; oligonukieotid <400 44

te?: aga f.fcg	fc ·:·;·:;··κ::·:·5	ttaaaggagg	aataacatat	ggacaaaacfc	cacacatgtc	60
caeettgf.ee	agcfceeggaa	etectggggg	gaeegtcagfc	cfctaetettc	CCC CCA A ·:: AC	100
ccaeggacae	ccteatgate	tcccggacec	oxgaggtcac	atgegtggtg	gtggaegtga	130
geeeegeege	cecfcgaggfce	aagttcaaet	gqfcaegtgg,··	eggegtggag	qtgeataatg	240
C·:ί <-i m 4’C·:ί :<	gcegegggag	gagcagtaea	aeageacgta	eegfcgtggtc	agegfceetea	300
ccgfcectgea	ccaggactqg	efcgaa.fc.ggea	aggagtacaa	gfc.geaaggtc	fceeaacaaag	360
ce e f. Cíxa g c	fccceafccgag	aaaaccafcet	ocaaagaeaa	agegeageee	e g & gaa c e a	4 20
aggfcqfcacae	uctqeeecea	toccgggatg	agefcgaceaa	gaaeeaggtc	agccfcgaeet	4 30
gcefcggtcaa	aggottctat	cccagcgaea	fcegecgtgga	gtgggagagc	aatgggcage	340
eggagaataa	etacaaga-ec	segccteeeg	tgefcggacte	cgacggetce	fcte-fcfceetet	600
acagcaagct	eaccgfcggac	aagagcaggfc	ggcagcaggg	gaacgtettc	teatgctccg	660
fcgafgcafcga	ggctcfcqeac	saccactaca	egeagaagag·	ceteteeetg	tetcegggta	720
aaggtggagg	fcggtggfcatc	gaaggteega	ctcfcgeefcea	gtggctggct	getcgtgctg	730
gtggtggagg	fcggcggegga	ggtattgagg	gcccaaceet	tegeeaatgg	cfctgeagcac	34 0
gcgeataate	tcgsggatcc	g				361

«210 45 <211> 861 «212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása; oligonukleotid

<4ÖO> 45
agatetaaac	aaaafctgatt	aatfctcctcc	fctafctgfcata	cctgtttfcga	gtgtgtacag	60
gtggaacagg	tcgaggcctt	qaggaeccec	ctggcagtca	gaaggagaag	gggggtfcfctg	120
ggttcctgtg	ggagtacfcaq	agggcctggg	gactccagtg	tacgcaccac	cacctgcact	100
cgqtgcttct	gggacfcccag	ttcaagttga	ccatgcaecfc	gccgcaccfcc	cacgtafcfcac	240
ggttctgttt	cggcgccctc	etegteatgt	fcgtcgtgcat	ggcacaccag	tcgcaggagt	300
ggcaggacgt	ggfccct gacc	gactfcaccgt	fccetcatgfcfc	cacgttccag	aggttgtfctc	.5 60
ggq.aqqgtcg	gqqqrqgctc	ttttggtaga	ggfcttcggtfc	tcccgtcggg	g cc t:: q g t q	420
tqq.acctgtg	ggacgggggt	agggecctac·	fccgactggt fc	cttggtccag	tcggactgga	430
cgqaccsgtt	tccgaagata	gggtcgcfcgt	agcggcaccr.	caccctctcg	ttac-ecgfccg	S40
gcctcttgtt	gafcgttctgg-	tqcggaggqc	acgacctgag	gcfcgccgagg	aagaaggaga	000
tgtcgttcga	gfcg.gc.acc tg	ttcccgfccca	ccgfccgtccc	cfcfcgcagaag	agtacgaggc	000
acfcacgfcact	ccgagacgfcg	fctggt.gafcgt	gcgfccttctc	ggagagggac	aqaggcccafc	20
t: í’/xacctcc	accaceatag	cttccaggct	gagacgcagfc	caccgaccga	cgagcacgac	200
ccccacctcc	.ac cgccgcc ::	ccataacfccc	egggttggga:	ageggttacc	g a a· cgt cg u c	8 40
cgcgta t:t ag	a get cet .agg	r:				801

<2K)>

<211> 269 <212>

<213> mesterséges encia * * :223> A mesterséges szekvencia, leírása: peptid <400> 46

Met Aso Lvs- Thr His Thr •ro Pro Cys Pro Aia Pro Gh ív

Val Phe Leu Phe Pro Pro .Lys Pro· Lys Asp Thr Leu va „i

VB VB·. V‘·:

_k-»> Í \

Pro Glu Val Lys Phe Aso Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu (íís Asn Aia Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr

V3B v\ji ÍJAÍ.C v‘3 i <V4

Gly Lys Giu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Aia Leu Pro- Alá

100 1ÖS 110 .e ciu Lys a is uer s γ 4>

120 bíy vln Ar<j v.iu ΟχΌ

Val Tyr Thr Leu Pro Pro .Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Sin Pro Glu- Asn As.n Tyr Lys Thr

163 \r Pro:

170

150 ♦ ·>

Pro val Leu Asp Sár

ISO

Vtü,;. A;$p όνο Sex Arg :er ?'vs Phe Le ti bér bys

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

Mer

A.;.-:: L.SU

His Asn His

215

Thr Gin Lvs

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Tle Glu Gly Pro Thr Leu

2<;a í'! Τ -Ί rrg Aia Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly G.ry :ae

Glu Gly Pro Thr Leu 'Arg Gin Trp Leu Ale Ale Arg A1&

260 265

A találmányt az előzőkben teljes részletességgel ismertettük, és a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy számos módosítás és eltérnénk a találmány oltalmi kórétól

Claims (49)

1. Vegyület, ami az mpl receptorhoz kötődik, és a <ÜiT általános képletü szerkezetet tartalmazza, ahol a ΤΜΡί-et és a TMPa-t egymástól függetlenül az alábbi,

   Xz-Xs-Xa-Xs-X6-X7-Xs-X9-Xio szerkezetet tartalmazó vegyületek közül választjuk, amiben

   Xz-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu. Lys és Val;

   Xe-at az alábbi csoportból választjuk kk Gly és Ála;

   X4 jelentése Pro;

   Xs ót az alábbi csoportból választjuk ki; Thr és Ser;

   Xő-ot az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, Ile, Val, Alá és Phe;

   X?-et az alábbi csoportból választjuk ki; Arg és Lys;

   Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gin, Asn és Glu;

   Xo-et az alábbi csoportból választjuk, ki: Trp, Tyr, Cys, Ála és Phe;

   Xw-et az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, Ile, Val, Alá, Phe, Met és Lys;

   Ls egy linker; és n értéke 0 vagy 1;

   valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.
2. 2. Vegyület, ami az mpl receptorhoz kötődik, és a

   TMPt-(Ldn-TMP₂
3. 3ö általános képletü szerkezetet tartalmazza, ahol a TMPi-et. és a TMPg-t egymástól függetlenül az alábbi,

   X2-X3-X4-X5-X&~X7-Xs--X9-X!0 szerkezetet tartalmazó vegyületek közül választjuk, amiben

   X2-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

   Χ3 jelentése Aia;

   X₄ jelentése Pro;

   Xs-őt az alábbi csoportból választjuk ki: Tbr és Ser:

   Χβ-ot az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, He, Val, Aia és Phe;

   X₇-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

   Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gin, Asn és Glu;

   Xg-et az alábbi csoportból választjuk ki: Trp, Tyr, Cys, Alá és Phe;

   Χίο-et az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, Ile, Val, Alá, Phe, Met és Lys;

   Li egy linken; és n értéke 0 vagy 1;

   valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.

   3, Vegyület, ami az mp! receptorhoz kötődik, és a.

   általános képletü szerkezetet tartalmazza, ahol a TMPr-et és a TMPa-t egymástól függetlenül az alábbi,

   -X₃-X₄-X₅~X<eX7-Xs-X9-Xiö szerkezetet tartalmazó vegyületek közül választjuk, amiben

   S3i

   Xa-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val; Xa-at az alábbi csoportból választjuk: Gly és Alá;

   X<; jelentése Pro;

   Xs jelentése Ser;

   Xö-ot az alábbi csoportból, választjuk ki: Leu, ile, Val, Alá. és

   X?-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

   X«-at az alábbi csoportból választjuk kí; Gin, Asn és Glu;

   Xv-et az alábbi csoportból választjuk kí: Trp, Tyr, Cys, Alá és Xw-et az alábbi csoportból választjuk ki; Leu, Ile, Val, Alá, Phe, Met és Lys;

   U egy Imker; és n értéke 0 vagy 1.;
4. 4. Vegyület, ami az mpl receptorhoz kötődik, és a

   TMPi-(Li)n-TMP2 általános képletű szerkezetet tartalmazza, ahol a TMPi-et és a TMPs-t egymástól függetlenül az alábbi,

   X^-Xs-Xq-Xs-Xe-X-z-Xs-Xo-Xio szerkezetet tartalmazó vegyűletek közül választjuk, amiben Xs~t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val: Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gly és Alá;

   X4 jelentése Pro;

   Xs-öt az alábbi csoportból választjuk ki; Thr és Ser;

   Xe-ot az alábbi csoportból választjuk ki: Ile, Val, Alá és Phe; X?-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

   Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gin, Asn és Glu;

   Xg-et az alábbi csoportból választjuk ki; Trp, Tyr, Cys, Aia és Phe:

   Xio-e.t az alábbi csoportból vak .szíjuk ki: Leu, lle, Vak Alá, es

   Lys;

   Li egy linker: és n értéke ö vagy 1;

   valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.
5. 5. Vegyület, ami az mpl receptorhoz kötődik, és a.

   általános képietü szerkezetet tartalmazza, ahol a TMPi-et és a. TMPy- t egymástól függetlenül az alábbi,

   Xa-Xs-XA-Xs-Xö-Xr-Xs-Xy-Xío szerkezetet tartalmazó vegyületek közül választjuk, amiben

   Xa-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

   .Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gly és Alá;

   Xá jelentése .Pro;

   Xs-öt az alábbi csoportból választjuk ki: Thr és Ser;

   Xs-ot az alábbi csoportból választjuk ki; Leu, Ile, Val, Ála és Phe;

   X? jelentése Lys;

   Xs-at. az alábbi csoportból választjuk ki; Gin, Asn és Glu;

   Χθ-et az alábbi csoportból választjuk kb Trp, Tyr, Cys, Aia és Phe;

   Xio-et az alábbi csoportból választjuk ki; Leu, He, Val, Alá, Phe, Met és Lys;

   Li egy linker; és n értéke 0 vagy 1;

   valamint ezek fiziológiásán elfogadható sőt.

   ő. Vegyület, ami az mpl receptorhoz kötődik, és a általános képletű szerkezetet tartalmazza, ahol a TMPi-et és a TMFz-t egymástól függetlenül az alábbi,

   X2-X3-X4-XS-Λ.8·

   Xo-X szerkezetet tartalmazó vegyületek: közül választjuk, amiben.

   'X-2~í az alábbi csoportból választj uk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

   Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gly es Alá;

   X4 jelentése Pro:

   Xs-őt az alábbi csoportból választjuk ki: Thr és Ser;

   Xe-oi az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, lle, Val, Alá és Phe;

   Xz-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

   Χβ-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gin és Asn;

   X«-et az alábbi csoportból választjuk ki: Trp, Tyr, Cvs, Alá és Pbe;

   Χίο-et az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, he, Val, Alá, Phe, Met és Lys:

   n értéke 0 vagy 1;

   valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.
6. 7. Vegyület, ami az mpl receptorhoz kötődik, és a

   134 általános képletű szerkezetet tartalmazza, ahol a egymástól függetlenül az alábbi.

   j-et és a TMPz-t

   Χ2-Χ3-Χ4-Χ5-Χδ-Χ7~Χ
7. 8-Χθ-Χΐ0 szerkezetet tartalmazó vegyüietek közül választjuk, amiben

   Xy-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

   Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gly és Alá;

   X.4 jelentése Pro;

   Xs-öt az alábbi csoportból választjuk ki: Thr és Ser;

   Xó-ot az alábbi csoportból választjuk ki: leu. He, Val. Alá és Phe;

   X7-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

   Xs-at az· alábbi csoportból választjuk ki; Gin, Asn. és Glu;

   X«-et az alábbi csoportból választjuk ki: Tyr, Cys. Alá és Phe;

   Xie-et az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, Ile, Val. Alá, Phe, Met és Lys;

   Li egy' linker; és n értéke 0 vagy 1;

   valamint, ezek fiziológiásán elfogadható sói.

   Vegyület, ami az mpl receptorhoz kötődik, és a

   TMPi-(Lí)_K-TMFb általános képletü szerkezetet tartalmazza, ε egymástól függetlenül az alábbi.

   a TMPi-et és a TMP₂-t

   Xa-Xg-X^-Xs-Xe-Xr-Xs-Xö-Xio szerkezetet tartalmazó vegyüietek közül választjuk, amiben

   Xa-t az alábbi csoportból választjuk ki: Glu, Asp, Lys és Val;

   Xs-aí az alábbi csoportból választjuk ki: Gly és Alá;

   Xg jelentése Pro;

   Xs-őt az alábbi csoportból választjuk ki: Thr és Ser;

   Xe-ot az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, Ile, Val, Alá és Phe;

   Χ'7-et az alábbi csoportból választjuk ki: Arg és Lys;

   Xs-at az alábbi csoportból választjuk ki: Gin, Asn és Glu;

   Xy-et az alábbi csoportból választjuk ki: Trp, Tyr, Cys, Alá és Phe; Χ.κτ-et. az alábbi csoportból választjuk ki: Leu, Val, Alá, Phe, Met és Lys; Li egy linker; és n értéke 0 vagy 1;

   valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.
8. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amiben TMPr-et és TMPy-f egymástól függetlenül az alábbi csoportból választhatjuk ki:

   Xa-Xs-XA-Xs-Xe-Xr-Xs-Xs-Xw-Xn;

   Xg-X3-X4-Xs-X6~X7-Xs-X?uXiG-Xn-Xn;

   X2-X3-X4-X3-X6~X7-Xs-Xo-XiG-Xn-Xn-Xi3;

   Xs-Xs-X^í-Xs-Xö-Xt-Xs-Xo-Xio-Xu-Xu-Xis-Xu;

   Χϊ-Χ2-Χ3-Χ4-Χ5-Χ6··'Χ7-Χ8-Χ9-Χΐί);

   Χι- X2-X3-X4.-Xs-X6-X7-Xs-X0-Xi.0-Xu;

   Xi - X2-X3-X4 -Xs- Xo -Xt-Xs -Xo-X io-X: 1-X12;

   Xi- Xa-Xs-XA-Xs-^-Xr-Xs-Xs-Xio-Xu-Xrs-Xu: és

   X:- X₃ X3-X4-X5-X6-X7-XS-X9-X10-XirXuXuXy amelyekben Xa-Xio jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megadtunk;

   Χι-et az alábbi csoportból választjuk ki: Ile, Val, Leu, Ser és Arg;

   &z alábbi csoportból választjuk ki; Alá, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr,

   Xir-t az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, Ile, Val, Leu,

   Ser es

   Xis~a.t az alábbi csoportból választjuk ki; Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin és Gly; és

   Xu-et az alábbi csoportból választjuk ki; Aia, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu és Gly.
9. 10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amiben választ1 függetlenül az •et es hatjuk ki;

   X2-X:rX4-X5-X&-X₇-X8~X<uXw-Xn:

   Xr-Xr· X-4 -Xs-Xo-Xv-Xe-Xv-XHeXi i -XiX

   XuXr-X, -Xs-Xe-XT-Xs-Xv-Xm-Xu-Xis-Xn:

   X2-X3-X4-X5-X6-X7-X3-X9“Xl0“XuXl2-Xl3-Xl4;

   Xi-X2-X3-X4-Xs~X6-X7~Xs-X9-Xw;

   X.· · X2-X3-X4-X5-X0-X7-X8-XV-X10-X1 :

   Xi~X2-X3-X4-X5-X6-X7-X3-Xv-Xio-Xu-Xi2;

   Xl~ X2-X3~X4-X5-Xö”X7-Xs-X9-Xl0”Xn-Xl2-Xí3.; és

   Xí~ X2-X3-X4“X5-XérX7-Xs-XfrXi0~Xn-Xl2-Xl3-Xl4;

   amelyekben Xs-Xív jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megad

   Χι-et az alábbi csoportból választjuk ki; he, Val, Len, Ser és Arg;

   Xii-et az alábbi csoportból, választjuk ki: Alá, lle, Val, Leu, Phe, Thr, Lys His és Giu;

   X-j.2-t az alábbi csoportból·választjuk ki; Aia, lle, Val, Leu, Phe, Giy, és

   Xn-at. az alábbi csoportból választjuk ki; Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin és Glv: és

   Xi4~et az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, lle, Val,. Leu, Phe, Thr, Arg, Glu és Gly,
10. 11. Az 1~8, igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amiben TMPi-et és TMPa-t egymástól függetlenül az alábbi csoportból választhatjuk ki;

    Xe · X3-X4-X0-X6-X7-XS-X9-XW-X1 ϊ ;

    X2-X₃-X4-X-5-X6~X7-Xs-X9-Xiö-Xn-Xi2;

    Xa-Xs-Xu-Xs-Xe-Xr-Xe-Xy-Xm-Xn-Xn-Xu;

    Xa-Xs-X^-Xs-Xö-Xv-Xe-Xy-XíO-Xu-Xu-Xn-Xiy;

    XuXa-X3-X4-X_s-XvX7~X«-XyXio;

    Xi- Xs-Xs-X^-Xs-Xfj-X'z-Xs-Xs-Xiö-Xri.;

    Xi - X2-X3-X4~Xs-X6~X7-Xs-Xs-Xiö-Xi 1-X
11. 12;

    Xr- X2-X3-X4~X5-X&-X7-Xs-XyXro-Xn-Xn-Xn; és

    Xi- X₂-X₃-X4--X5--X&~X?-Xs~Xy-XKrX.n-Xn-Xu-Xi4;

    amelyekben. Xa-Xw jelentése ugyanaz, mint amit az előzőkben megadtunk;

    Xe-et az alábbi csoportból választjuk ki; He, Val, Leu, Ser és Arg;

    Xii-et az alábbi csoportból választjuk ki; Alá, lle, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His és Glu;

    Xia-t az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, lle, Vai, Leu, Gly, Ser és

    Glu;

    Xi3-at az alábbi csoportból választjuk ki: Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gin és Glv; és

    Xu-et az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, lle, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu és Gly.

    IX em

    Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amiben as tt ΤΜΡι-nek és/vagy a TMPs-nek a származékai

    Í38 amiket az alábbiakban megadott módszerek közül eggyel vagy többel állítunk elő:

    a peptidil (-CO(O^:)NR-| kapcsolatok (kötések) közül egyet vagy többet egy nem-peptidíl kötéssel helyettesítünk, amelyet az alábbiak közül választunk ki: egy -CHs-karbamát kötés [-CH2-OC{O)NR~j; egy foszfonát kötés; egy -CH^-szulfonamíd (-CH2-S(öüNR-j kötés; egy karfoamid (-NHC(O)NR-J kötés; egy --CHa- szekunder amin kötés; és egy alkilezett peptid kötés |-C(Ö)NR⁶, amiben R⁶ jelentése rövidszénláncú alkiicsoport];

    a pepüdekben az N-terminálisból egy -NRR- csoporttal; egy NRC(O)R csoporttal; egy -~HRC(O)OR csoporttal; egy NRS(ÖGR csoporttal; egy MHC(O)NHR csoporttal készítünk származékot, amikben R¹ jelentése hidrogénatom vagy alacsony szénatomszámú alkiicsoport, azzal a feltétellel, hogy R és R¹ egyszerre nem lehet hidrogénatom; egy szukcinímid. csoport; egy benziIoxÍka.rborál-ΝΗ-(CBZ-NH-j csoport; vagy egy benziloxikarbonil-Hlí-csoport, ami a fenilgyűrün 1-3 helyettesítést tartalmaz, amely helyettesitőket, az alábbi csoportból választunk ki: alacsony szénatomszámú alkiicsoport, alacsony szénatomszámü alkoxi csoport, klőratom és brőmatom; és azok a peptidek, amikben a szabad C-terminálisböl a -C(O)R²~vel készítünk származékot, amiben RM és íü~et egymástól függetlenül az alábbi csoportból választjuk ki: hidrogénatom és alacsony szénatomszámú alkiicsoport.
12. 13. Az l~8, igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amiben az összes aminosav konfigurációja D.
13. 14. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amiben legalább egy aminosavnak D konfigurációja van.

    . Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület,. ami ciklikus.
14. 16. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amiben TMFx és TMFy jelentése egyaránt ne-Glu-Gly-Pro-Thr-teu-Arg~Gln-Trp-Leu-Ala-Ala~Arg~Ala (1. számú szekvencia)
15. 17. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, ahol Li egy pép

    IS, A 17, igénypont szerinti, vegyület, amiben Li tartalmazza ¥« t, és Y jelentése egy természetes aminosav, vagy annak sztereeizomerj’e, és n értéke 1
16. 19. A 17. igénypont szerinti vegyület amiben Li tartalmazza (Gly)n-t, n értéke 1-20 között van, és ba. n értéke egynél nagyobb, akkor a Glv csoportoknak maximum a felét egy másik aminosawal helyettesíthetjük, amit a többi 19 természetes aminosav közül választhatunk ki, vagy lehet annak sztereoizomerje.
17. 20. A 17. igénypont szerinti vegyület, amiben L.i-et az alábbi csoportból választhatjuk ki:

    (GlykLysíGIyU (6. számú szekvencia);

    (Gly’isAsnGlySer{Gly|2 (7. számú szekvencia);

    (Gly)sCys(GlyÍ4. (8, számú szekvencia); és Gly.ProÁsnGly (9. számú szekvencia)
18. 21. A. 17. igénypont szerinti vegyület, amiben Li tartalmaz egy

    Cys csoportot.

    540
19. 22. A 21. igénypont szerinti vegyület dimerje.
20. 23. A 22. igénypont szerinti clímer, aminek a szerkezete az alábbi:

    TMP? -Giys-Gys-Glyu-TMPs TMPi-Glys-Cys-Glyg-TMPa
21. 24, Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amiben Li (Gbbü-ΐ tartalmaz, és n értéke 1 -20.
22. 25. Az 1-8, igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amit az alábbi csoportból választhatunk ki: lEGPTLRQWLÁARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (10. számú szekvencia)

    IEGPTLRQCLAARA-G-GGGGGGG 4EGPTLRQCLAARÁ (ciklikus) ! t

    !....................................................!

    (II. számú szekvencia)

    IEGRTLRQCLAARA-GGGGGGGG4EGPTLRQCLAARA (lineáris) (12. számú szekvencia) lEGPTLEQALÁARA- GGGGGGGG- 1EGPTLRQALAARA (13. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (14. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGR(BrAc)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (15. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (16. számú szekvencia)

    IEGPTLRQWLAARA- GGGR(PEG)GGGG- IEGPTLRQWLAARA (17, számú, szekvencia) lEGPTLRQWLAARA- GGGC(PEG)GGGG- lEGPTLRQWLAARA (18. számú szekvencia) lEGPTLRQWLAARA- GGGHGSGGG-- lEGPTLRQWLAARA

    (.19, számú szekvencia) lEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- lEGPTLRQWLAARA lEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- lEGPTLRQWLAARA (20. számú szekvencia) lEGPTLRQWLAARA- GGGGGGGG- lEGPTLRQWLAARA (21, számú szekvencia) a2
23. 26.

    Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, aminek s képlete;

    (Fc)m~(L2)_(rTMPn(L2)n-TMP2-(L3)r-(Fc)p_: amiben Ln L>₅ és Ls jelentése linkeresoport, amiket egymástól függetlenül az itt ismertetett línkercsoportok közül választunk kb

    Y_n>. aholis ¥ jelentése egy természetes aminosav, vagy annak sztereoizornerje, és n értéke 1-20;.

    (Gly)n,· amiben n értéke 1-2(5, és ha n. értéke l-nél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak maximum a. fele helyettesíthető egy másik .aminosavvál, amit a többi természetes aminosav, vagy azok sztereoizomerei közül választunk ki;

    (Gly)3Lys(Gly)4 (6, számú szekvencia);

    (GlyLAsnGlySerjGlyb (7. számú szekvencia);

    (GlylsCysCGlyh (8. számú szekvencia); és GlyProAsnGly (9. számú szekvencia) egy Cys csoport; és (CPb)_£i, amiben n értéke 1-20, az Fc egy immunglobulin Fc régiója; m, p, q és r értéke egymástól függetlenül Ö és 1, és m vagy p közül legalább az egyik 1, továbbá ha m

    142 egyenlő O~va.l, akkor q értéke is 0, és ha p értéke 0, akkor r értéke ö, valamint ezek fiziológiásán elfogadható sói.
24. 27, A 26. igénypont szerinti vegyület, amiben Li-et, Lat és Ls-at egymástól függetlenül az Y_;v-t tartalmazó csoportból választhatjuk, amiben Y~t, a természetes aminosavak, vagy azok sztereoizomerjeí köve es n értéké 1-20.
25. 28. A 27. igénypont szerinti vegyület, amiben Li (Glyjrrt tartalmaz, és n értéke 1-20 között van, és ha n értéke egynél nagyobb, akkor a Gly csoportoknak maximum a felét egy másik aminosavval helyette síthetjük, amit a többi 19 természetes aminosav közül vá ki, vagy lehet annak sztereoízomerje.
26. 29. A 27. igénypont szerinti vegyület, amiben Li-et az alábbi csoportból választhatjuk ki:

    (GlyjsbysjGlyjk (6. .számú szekvencia);

    (GlyjsAsnGlySeriGly);? (7. számú szekvencia);

    (Glv)3CysfGly)4 (8. számú szekvencia.); és GlyP.roAsnGly (9. számú szekvencia).
27. 30. A 27. igénypont szerinti vcsoportot tartalmaz.

    , amiben Lx, La vagy Ls Cys
28. 31. A 30. igénypont szerinti vegyület dimerje.
29. 32. A 26. igénypont szerinti vegyület, amiben L?<, La vagy Ls íCH_:>k csoportot tartalmaz, és n értéke 1-20.
30. 33. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amit az alábbi csoportból választhatunk ki:

    FcIEGPl'LRQWLAARAGPNG-íEÖPTLRQWLAARA (22. számú szekvencia)

    FcriEGPTLRQWLAARA-GPNG-iEGPTLRQWLAARA-Fc (23. számú szekvencia)

    Fc- ÍEGPTLRQ WLAARA-GGGGGGGG - lEGPTLRQWLAARA-Fc (24. számú szekvencia)

    Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GFRG-IEGPTLRQWLAARA (25. számú szekvencia)

    Fc-IEGFTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRGWLAARA

    26. számú szekvencia)

    Fe-IEGFTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGFTLRQCLAARA (ciklikus) (27. szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineáris) (28. számú szekvencia)

    Fc-1EGPTLRQALAARA-GGGGGGGG4EGPTLR.QALAARA (29. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQW.LAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA.

    (30. számú szekvencia.)

    Fc-IEGPTLRQWLAARA~GGGCGGGG4EGPTLRQWLAARA (31. számú szekvencia)

    Fc-ÍEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG~IEGPTLRQWLAARA (32. számú szekvencia)

    Fc-IEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- lEGPIXRQWLAARA.

    FclEGPTLRQWLAARA- GGGCGGGG- 1EGPTLRQWLAARA (33. számú szekvencia)

    Fc-GGGGG-lEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-lEGFTLRQWLAARA (<

    számú szekvencia) t Ad
31. 34. Gyógyászatilag elfogadható készítmény, ami az 1-8, igénypontok bármelyike szerinti vegyűletet tartalmazza egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverve.
32. 35, Polinukleotid., ami az 1-8. igénypontok bármelyike vegyüetet kodoka
33. 36, Polinukleotid, ami a 22. igénypont szerinti vegyü letet kódolja
34. 37. Polinukleotid, ami a 27, igénypont szerinti vegyűletet kódolja.
35. 38, Polinukleotid, ami a 31, igénypont szerinti vegyűletet kódolia...
36. 39. Vektor, ami a. 37-
37. 40. igénypontok bármelyike szerinti poli nukleotidot tarta

    Gazdasejt, ami a. 41. igénypent szerinti vektort tartalmazza.
38. 41. Eljárás a 17., 22., 27. vagy 31, igénypont szerínti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a 33. igénypont szerinti gazdasejtet megfelelő táptalajon szaporítjuk, majd az említett vegyűletet izoláljuk az említett sejtből vagy táptalajból.
39. 42. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület alkalmazása .^«kariocíták vagy vérlemezkék számának növelésére egy betegben.
40. 43. Áz 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület alkalmazása egy betegben megakariocíták vagy vérlemezkék számának növelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.

    A 42, vagy 43. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a vegyület löüpg/k.g mennyiségét használjuk.
41. 45, Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amely tartalmazza a 46. sz, szekvencia szerinti pepiidet.
42. 46, A 45. igénypont szerinti vegyület, amely egy dimer.
43. 47. A 45. igénypont szerinti vegyület alkalmazása egy olyan gyógyszer előállítására, amelyet egy erre szoruló beteg megakaríocitáí vagy vérlemezkéi számának növelésére szolgáló eljárás során használunk, ahol az eljárás során az említett betegnek az említett vegyület hatékony mennyiséget adjuk be.

    líte
44. 48. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az emmennyiség 1. pg/kg és 100 mg/kg közötti.
45. 49, Gyógyászati készítmény, .amely a 45. igénypont szerinti 47-es mse tartalmazza egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval elkeverve.
46. 50. Polinukleotid, amely a 45, igénypont szerinti vegyületet kó~
47. 51. Vektor, amely az 50. igénypont szerinti polínukleotidot tartaimazza.
48. 52. Gazdasejt, amely az ól. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
49. 53. Eljárás egy vegyület előállítására, amelynek során az 52 igénypont szerinti gazdasejtet egy megfelelő tápközegben tenyésztjük majd az említett vegyűletet az említett sejtből vagy tápközegből izoláls