MXPA06002292A

MXPA06002292A - Peptidos y compuestos que se unen a un receptor.

Info

Publication number: MXPA06002292A
Application number: MXPA06002292A
Authority: MX
Inventors: Brian R Macdonald
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2003-08-28
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2006-09-04
Also published as: DK1675606T3; EP1675606A4; RS20060141A; EA009286B1; RS56387B1; PT1675606T; KR20070017942A; CA2537421A1; AR045530A1; ES2626107T3; KR20120078742A; LT1675606T; BRPI0414008B1; EA200600477A1; PL1675606T3; HUE032370T2; CN102241742B; KR101183875B1; EP1675606A2; IL173965A0

Abstract

Se describen peptidos y compuestos que se unen a, y activan el receptor de la trombopoyetina (c-mpl o TPO-R) o actuan de otra manera como un antagonista de la TPO.

Description

PEPT1D0S Y COMPUESTOS QUE SE UNEN A UN RECEPTOR REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la Solicitud de E.U.A. No. de Serie 60/498,740, presentada en Agosto 28, del 2003.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona compuestos peptídicos que se unen a, y activan el receptor de la trombopoyetina (c-mpl o TPO-R), o actúan de otra manera como un agonista de la TPO. La ¡nvención tiene aplicación en los campos de la bioquímica y la química medicinal y particularmente proporciona agonistas de la TPO para utilizarse en el tratamiento de la enfermedad humana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los megacariocitos son células derivadas de la médula ósea, que son responsables de producir las plaquetas que circulan en la sangre.

Aunque comprenden <0.25% de las células de médula ósea en la mayoría de las especies, tienen >10 veces el volumen de las células de médula típicas.

Véase, Kuter, et. al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:11104-11108 (1994). Los megacariocitos experimentan un proceso conocido como endomitosis, mediante el cual replican sus núcleos, pero fallan en experimentar la división celular y por lo tanto dan lugar a células poliploides. En respuesta a un conteo disminuido de plaquetas, la velocidad endomitótica se incrementa, se forman megacariocitos con mayor ploidia, y el número de megacariocitos puede incrementarse hasta 3 veces. Véase, Harker, J. Clin. Invest., 47:458-465 (1968). En contraste, en respuesta a un elevado conteo de plaquetas, la velocidad endomitótica disminuye, se forman megacariocitos con menos ploidia, y el número de megacariocitos puede disminuir en un 50%. El mecanismo exacto de la retroalimentación fisiológica mediante el cual la masa de plaquetas circulantes regula la velocidad endomitótica y el número de megacariocitos de médula ósea, no se conoce. Se piensa ahora que el factor trombopoyético circulante involucrado en mediar este ciclo de retroalimentación, es la trombopoyetina (TPO). Más específicamente, la TPO ha mostrado ser el regulador humoral principal en situaciones que involucran trombocitopenia. Véase, por ejemplo, Metcalf, Nature, 369:519-520 (1994). La TPO se ha conocido en varios estudios por incrementar los conteos de paquetas, incrementar el tamaño de las plaquetas e incrementar la incorporación del isótopo en plaquetas de animales receptores. Específicamente, se piensa que la TPO afecta la megacariocitopoyesis de varias maneras: (1) produce incrementos en el tamaño y número del megacariocito; (2) produce un incremento en el contenido de ADN, en la forma de poliploidia en los megacariocitos; (3) incrementa la endocitosis del megacariocito; (4) produce una maduración incrementada de megacariocitos; y (5) produce un incremento en el porcentaje de células precursoras, en la forma de células pequeñas positivas a acetilcolinesterasa, en la médula ósea. Las plaquetas (trombocitos), son necesarias para la coagulación sanguínea. Cuando su número es muy bajo, un paciente está en serio riesgo de muerte por una hemorragia catastrófica. Por lo tanto, la TPO tiene una aplicación útil potencial tanto en el diagnóstico como en el tratamiento de varios trastornos hematológicos, por ejemplo, enfermedades debidas principalmente a defectos en las plaquetas. Los ensayos clínicos en curso con TPO, han indicado que la TPO puede administrarse de manera segura a los pacientes. Además, los estudios más recientes han proporcionado una base para la proyección de la eficacia de la terapia con TPO en el tratamiento de trombocitopenia, y particularmente trombocitopenia que resulta de quimioterapia, terapia con radiación o transplante de médula ósea como un tratamiento para el cáncer o linfoma. Véase, por ejemplo, McDonald, Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992). El gen que codifica la TPO se ha clonado y caracterizado. Véase, Kuter, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:11104-11108 (1994); Barley, et al., Cell 77:1117-1124 (1994); Kaushansky et al., Nature 369:568-571 (1994); Wendiing, et al., Nature, 369:571-574 (1994); y Sauvage et al., Nature 369: 533-538 (1994). La trombopoyetina es una glucoproteína con al menos dos formas, con masas moleculares aparentes de 25 kDa y 31 kDa, con una secuencia de aminoácidos N terminal común. Véase, Bartley, et al., Cell, 77:1117-1124 (1994). La trombopoyetina parece tener dos regiones distintas separadas por un sitio de escisión Arg-Arg potencial. La región amino terminal está altamente conservada en el hombre y el ratón, y tiene alguna homología con la eritropoyetina y el interferón a y el interferón b. La región carboxi terminal muestra amplia divergencia entre las especies. Se han descrito las secuencias de ADN y las secuencias peptídicas codificadas para el TPO-R humano (también conocido como c-mpl). Véase, Vigon, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5640-5644 (1992). El TPO-R es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento de la hematopoyetlna, una familia caracterizada por un diseño estructural común del dominio extracelular, que ¡ncluye cuatro residuos C conservados N terminal y un motivo WSXWS (SEQ ID NO: 1), cercano a la región transmembranal. Véase, Bazan, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6934-6938 (1990). La evidencia de que este receptor juega un papel funcional en la hematopoyesis, ¡ncluye observaciones de que su expresión está restringida al bazo, médula ósea o al hígado fetal en ratones (véase, Souyri, et al., Cell 63:1137-1147 (1990)) y a los megacariocitos, plaquetas y células CD34+ en humanos (véase, Methia, et al., Blood 82:1395-1401 (1993)). Además, la exposición de las células CD34+ a los oligonucleótidos sintéticos antisentido al ARN mpl inhibe de manera significativa la aparición de colonias de megacariocitos sin afectar la formación de colonias eritroides o mieloides. Algunos trabajadores postulan que el receptor funciona como un homodímero, similar a la situación con los receptores para G-CSF y eritropoyetina.

La disponibilidad de los genes clonados para el TPO-R, facilita la búsqueda de agonistas de este importante receptor. La disponibilidad de la proteína receptora recombinante, permite el estudio de la interacción receptor-ligando, en una variedad de sistemas de generación de diversidad peptídica aleatorios y semialeatorios. Estos sistemas se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,251 ,864, 6,083,913, 6,121 ,238, 5,932,546, 5,869,451 , 6,506,362 y 6,465,430, y en Cwirla et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990), cada una de las anteriores se incorpora en la presente como referencia. La recuperación lenta de los niveles de plaquetas en pacientes que sufren de trombocitopenia es un problema serio, y ha dado urgencia a la investigación de un agonista del factor de crecimiento sanguíneo, capaz de acelerar la regeneración de las plaquetas. La presente ¡nvención proporciona tal agonista.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a compuestos peptídicos definidos de bajo peso molecular que tienen fuertes propiedades de unión al TPO-R, pueden activar el TPO-R, y permiten potencialmente efectos laterales reducidos en comparación con los agonistas conocidos de la TPO. En consecuencia, los compuestos peptídicos pueden ser útiles para propósitos terapéuticos para tratar condiciones mediadas por la TPO (por ejemplo, trombocitopenia que resulta de la quimioterapia, terapia con radiación o transfusiones de médula ósea), así como para propósitos de diagnóstico en estudiar el mecanismo de la hematopoyesis y para la expansión in vitro de los megacariocitos y las células progenitoras comprometidas. Los compuestos peptídicos adecuados para propósitos terapéuticos y/o de diagnóstico, tienen una CI50 de aproximadamente 2 mM o menos, como se determina, por ejemplo, mediante el ensayo de afinidad de la unión expuesto en el Ejemplo 3 de la Patente de E.U.A. No. 5,869,451 , en donde una CI50 se correlaciona con una afinidad de unión más fuerte al TPO-R. El ensayo en la Patente de E.U.A. No. 5,869,451 es como sigue: Las afinidades de unión de los compuestos peptídicos se miden en un ensayo de unión de competencia. Los pozos de una placa microtituladora se recubren con 1 mg de estreptavidina, se bloquean con PBS/BSA al 1%, seguido por 50 ng del anticuerpo biotinilado que inmoviliza el antirreceptor (Ab179). Los pozos se tratan a continuación con una dilución 1 :10 de recolección de TPO-R soluble. Varias concentraciones del compuesto peptídico se mezclan con una cantidad constante de una forma trunca de TPO que consiste de los residuos 1-156 fusionados al término C de la proteína de unión a la maltosa (MBP-TPO?56). Las mezclas del péptido MBP-TPO-^, se agregan a las células recubiertas con TPO-R, se incuban durante 2 horas a 4°C y a continuación se lavan con PBS. La cantidad de MBP-TPO156 que se une al equilibrio, se mide agregando un antisuero de conejo dirigido contra MBP, seguido por la IgG anticonejo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina. La cantidad de fosfatasa alcalina en cada pozo se determina a continuación utilizando métodos estándar. El ensayo se realiza con un intervalo de concentraciones del compuesto peptídico y los resultados se grafican, de manera que el eje y representa la cantidad de MBP-TPO156 unida, y el eje x representa la concentración del compuesto peptídico. Uno puede determinar entonces la concentración a la cual el compuesto peptídico reducirá en un 50% (Cl50) la cantidad de MBP-TPO-?56 unida al TPO-R inmovilizado. La constante de disociación (Kd) para el péptido debe ser similar a la CI50 medida utilizando estas condiciones de ensayo. Para propósitos farmacéuticos, los compuestos peptídicos tienen, de manera preferida, una CI50 de no más que aproximadamente 100 µM, de manera más preferida, no más que 500 nM. En una modalidad preferida, el peso molecular del compuesto peptídico es de aproximadamente 250 a aproximadamente 8,000 daltons. Si los compuestos peptídicos de esta invención son oligomerizados, dimerizados y/o derivados con un polímero hidrofílico como se describe en la presente, los pesos moleculares de tales compuestos peptídicos serán sustancialmente mayores y pueden variar en cualquier lugar de aproximadamente 500 a aproximadamente 120,000 daltons, de manera más preferida de aproximadamente 8,000 a aproximadamente 80,000 daltons. Cuando se utilizan para propósitos de diagnóstico, los compuestos peptídicos de la presente invención, de manera preferida, están marcados con una marca detectable, y en consecuencia, los compuestos peptídicos sin tal marca, sirven como intermediarios en la preparación de compuestos peptídicos marcados. Un compuesto peptídico que cumple con el criterio definido del peso molecular y la afinidad de unión para el TPO-R, comprende 9 o más aminoácidos, en donde los aminoácidos son aminoácidos naturales o sintéticos (no naturales). En consecuencia, los compuestos peptídicos preferidos comprenden un compuesto que tiene: (1) un peso molecular de menos que aproximadamente 5000 daltons, y (2) una afinidad de unión al TPO-R como se expresa por una Cl50 de no más que aproximadamente 100 µM, en donde de cero a todos los enlaces -C(O)NH- del compuesto peptídico se han reemplazado por un enlace seleccionado del grupo que consiste de un grupo que consiste de un enlace -CH2OC(O)NR-; un enlace fosfonato; un enlace -CH2S(O)2NR-; un enlace -CH2NR-; un enlace -C(O)NR6-; y un enlace -NHC(O)NH-, en donde R es hidrógeno o alquilo inferior y R6 es alquilo inferior, además, en donde el término N del compuesto peptídico se selecciona del grupo que consiste de un grupo -NRR1; un grupo -NRC(O)R; un grupo -NRC(O)OR; un grupo -NRS(O)2R; un grupo -NHC(O)NHR; un grupo succinimida; un grupo benciloxicarbonil-NH-; y un grupo benciloxicarbonil-NH-que tiene de 1 a 3 sustituyentes en el anillo de fenilo, seleccionados del grupo que consiste de alquilo inferior, alcoxi inferior, cloro y bromo, en donde R y R1 se seleccionan de manera independiente del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo inferior, y aún además, en donde el término C del compuesto peptídico tiene la fórmula -C(O)R2, en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de hidroxi, alcoxi inferior, y -NR3R4, en donde R3 y R4 se seleccionan de manera independiente del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo inferior, y en donde el átomo de nitrógeno del grupo -NR3R4 puede opcionalmente ser el grupo amina del término N del péptido, para formar un péptido cíclico, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. En una modalidad relacionada, la invención está dirigida a un compuesto peptídico marcado, que comprende un compuesto peptídico descrito como en lo anterior, que tiene unido al mismo de manera covalente, una marca capaz de detección. En una modalidad, el compuesto peptídico del núcleo comprende una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) en donde X9 es A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T o V; y X8 es A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T o V; y X6 es un residuo de ß-(2-naftil)alanina (referido en la presente como "2-Nal"). De manera más preferida, X9 es A o I; y X8 es D, E o K. Además, Xi es C, L, M, P, Q, V; X2 es F, K, L, N, Q, R, S, T o V; X3 es C, F, I, L, M, R, S, V o W; X es cualquiera de los 20 aminoácidos L codificados genéticamente; X5 es A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V o Y; y X7 es C, G, I, K, L, M, N, R o V. Un compuesto peptídico particularmente preferido incluye la secuencia de aminoácidos I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) (SEQ ID NO:7), en donde (2-Nal) es ß-(2-naft¡l)alanina y (Sar) es sarcosina. En otra modalidad, los compuestos peptídicos de la presente invención se dimerizan u oligomerizan de manera preferida para incrementar la afinidad y/o actividad de los compuestos. Un ejemplo de un compuesto peptídico dimerizado incluye, de manera no exclusiva, lo siguiente: E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -X 10 \ K(NH2) E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -X 10 en donde X-?0 es un residuo de sarcosina o ß-alanina (SEQ ID NO: 7). La estructura anterior también puede representarse por la siguiente estructura: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2. Cuando X10 es una sarcosina, el compuesto tiene la siguiente estructura: I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar) K(NH2) I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar) en donde (2-Nal) es ß-(2-naftil)alanina y (Sar) es sarcosina (SEQ ID NO:7). Este compuesto peptídico, el cual también puede representarse por la siguiente estructura (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar)2K-NH2), se refiere en la presente como el "Compuesto No. 1 de TPO". En aún otra modalidad adicional, los compuestos peptídicos preferidos para utilizarse en esta invención incluyen compuestos peptídicos que están unidos de manera covalente a uno o más . de una variedad de polímeros hidrofílicos. Los polímeros hidrofílicos adecuados incluyen, de manera no exclusiva, éteres de polialquilo como se ejemplifica por el polietilenglicol y el polipropilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialquenos, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, celulosa y derivados de celulosa, dextrano y derivados de dextrano, etc., como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,869,451, el contenido total de la cual se incorpora en la presente como referencia. Los compuestos peptídicos descritos en la presente son útiles para la prevención y el tratamiento de enfermedades mediadas por la TPO, y particularmente para tratar trastornos hematológicos, incluyendo, de manera no exclusiva, trombocitopenia que resulta de quimioterapia, terapia con radiación o transfusiones de médula ósea. Así, la presente invención también proporciona un método de tratamiento, en donde un paciente que tiene un trastorno que es susceptible de tratamiento con un agonista de la TPO, recibe o se le administra una dosis terapéuticamente efectiva de un compuesto peptídico de la presente invención. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos peptídicos descritos en la presente y un portador fisiológicamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden estar en una variedad de formas, incluyendo formas de dosificación oral, así como polvos inhalables y soluciones y soluciones inyectables e infundibles.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra y compara la actividad del Compuesto No. 1 de TPO con un compuesto peptídico de la técnica anterior (referido en la presente como "compuesto peptídico de la técnica anterior"). La diferencia entre el Compuesto No. 1 de TPO y el compuesto peptídico de la técnica anterior es que el compuesto peptídico de la técnica anterior tiene una ß-(1-naftil)alanina (1-Nal), en donde (2-Nal) está en el Compuesto No. 1 de TPO. La Figura 2 muestra y compara la actividad del Compuesto No. 1 de TPO PEGilado con el compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior. La Figura 3 muestra y compara el cambio in vivo en los conteos de plaquetas en ratas, demostrando la potencia relativa del Compuesto No. 1 de TPO PEGilado con el compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior. Las Figuras 4 y 5 muestran y comparan el número y volumen de plaquetas circulantes de una manera dependiente de la dosis, respectivamente, tras el uso del compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior y el uso del Compuesto No. 1 de TPO PEGilado.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECIFICAS I. Definiciones y parámetros generales Las siguientes definiciones se exponen para ilustrar y definir el significado y el alcance de los varios términos utilizados para describir la ¡nvención de la presente. "Agonista", se refiere a un ligando biológicamente activo que se une a su receptor complementario biológicamente activo y activa el último para causar una respuesta biológica en el receptor o para mejorar la actividad biológica preexistente del receptor. "Compuesto peptídico", se refiere a una molécula que se hidroliza en aminoácidos y/o derivados de aminoácidos y/o sustitutos de aminoácidos. "Sales farmacéuticamente aceptables", se refiere a sales no tóxicas, de metales alcalinos, metales alcalinotérreos y de amonio, utilizadas comúnmente en la industria farmacéutica, incluyendo las sales de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, bario, amonio y protamina de zinc, que se preparan mediante métodos bien conocidos en la técnica. El término también incluye sales de adición de ácido no tóxicas, las cuales se preparan generalmente haciendo reaccionar los compuestos de la invención con un ácido orgánico o inorgánico adecuado. Las sales representativas incluyen el clorhidrato, bromhidrato, sulfato, bisulfato, acetato, oxalato, valeriato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, napsilato y lo similar. "Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable", se refiere a aquellas sales que retienen la efectividad y las propiedades biológicas de las bases libres y que no son biológicamente o de otra manera indeseables, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y lo similar, y ácidos orgánicos tales como el ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salícílico y lo similar. Para una descripción de las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables como profármacos, véase Bundgaard, H., supra. "Ester farmacéuticamente aceptable", se refiere a aquellos esteres que retienen, tras la hidrólisis del enlace éster, la efectividad y las propiedades biológicas del ácido carboxílico o el alcohol y que no son biológicamente o de otra manera indeseables. Para una descripción de los esteres farmacéuticamente aceptables como profármacos, véase Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estos esteres se forman típicamente a partir del ácido carboxílico correspondiente y un alcohol. Generalmente, la formación del éster puede lograrse vía técnicas sintéticas convencionales. (Véase, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 4a Ed., John Wiley & Sons, New York (1992), 393-396 y las referencias citadas en la misma, y Mark, et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). El componente de alcohol del éster comprenderá generalmente (i) un alcohol alifático de C2-C-?2 que puede o no contener uno o más enlaces dobles y que puede o no contener carbonos ramificados o (¡i) alcoholes aromáticos o heteroaromáticos de C7-C?2. Esta invención también contempla el uso de aquellas composiciones que son tanto los esteres como se describen en la presente como las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de los mismos, al mismo tiempo. "Amida farmacéuticamente aceptable", se refiere a aquellas amidas que retienen, tras la hidrólisis del enlace amida, la efectividad y propiedades biológicas del ácido carboxílico o la amina y que no son biológicamente o de otra manera indeseables. Para una descripción de las amidas farmacéuticamente aceptables como profármacos, véase Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estas amidas se forman típicamente a partir del ácido carboxílico correspondiente y una amina. Generalmente, la formación de la amida puede lograrse vía técnicas sintéticas convencionales. (Véase, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 4a Ed., John Wiley & Sons, New York (1992), p. 393 y Mark, et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). Esta invención también contempla el uso de aquellas composiciones que son tanto amidas como se describen en la presente como las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de las mismas, al mismo tiempo. "Portador farmacéutica o terapéuticamente aceptable", se refiere a un medio portador que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos y que no es tóxico al hospedero o al paciente. "Estereoisómero", se refiere a un compuesto químico que tiene el mismo peso molecular, composición química y constitución que otro, pero con átomos agrupados de manera diferente. Esto es, ciertas porciones químicas idénticas están en orientaciones diferentes en el espacio y, por lo tanto, cuando están puras, tienen la capacidad de girar el plano de la luz polarizada.

Sin embargo, algunos estereoisómeros puros pueden tener una rotación óptica que es tan ligera que es indetectable con la instrumentación presente.

Los compuestos de la presente invención pueden tener uno más átomos de carbono asimétricos, y por lo tanto, incluir varios estereoisómeros. Todos los estereoisómeros se incluyen dentro del alcance de la invención. "Cantidad terapéutica o farmacéuticamente efectiva", como se aplica a las composiciones de la presente invención, se refiere a la cantidad de composición suficiente para inducir un resultado biológico deseado. Ese resultado puede ser el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. En la presente invención, el resultado involucrará típicamente una disminución en las respuestas inmunológicas y/o inflamatorias a la infección o lesión del tejido. Los residuos de aminoácido en los péptidos se abrevian como sigue: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es He o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Acido Aspártico es Asp o D; Acido Glutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptofano es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G. Adicionalmente, t-Buo es ter-buliloxi, Bzl es bencilo, CHA es ciclohexilamina, Ac es acetilo, Me es metilo, Pen es penicilamina, Aib es ácido aminoisobutírico, Nva es norvalina, Abu es ácido aminobutírico, Thi es tienilalanina, OBn es O-bencilo y hyp es hidroxiprolina. Los análogos peptídicos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquéllas del péptido patrón. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "peptidomiméticos" o "miméticos peptídicos" o "peptidomiméticos" (Luthman, et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2a Ed., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720 (1994); Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS, p. 392 (1985); y Evans, et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), las cuales se incorporan en la presente como referencia).

Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles, pueden utilizarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente o mejorado. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene actividad biológica o farmacológica), tales como el polipéptido que se une al receptor natural, pero tienen uno o más enlaces peptídicos reemplazados opcionalmente por un enlace alterno, tal como -CH2NH-, -CH2S-, etc., mediante métodos conocidos en la técnica y descritos además en las siguientes referencias: Spatola, A. F. ¡n Chemistry and Biochemistr? of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (Mazo 1983), Vol. 1 , Tomo 3, Peptide Backbone Modifications (revisión general); Morley, Trends Pharm. Sci. pp. 463-468 (1980), (revisión general); Hudson, et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 14:177-185 (1979); Spatola, et al., Life Sci., 38:1243-1249 (1986); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982); Almquist, et al., J. Med. Chem., 23:1392-1398, (1980); Jennings-White, et al., Tetrahedron Lett. 23:2533 (1982); Szelke, et al., Solicitud Europea EP 45665 (1982); Holladay, et al., Tetrahedron Lett., 24:4401-4404 (1983); y Hruby, Life Sci., 31 :189-199 (1982); cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. Un enlace no peptídico particularmente preferido es -CH2NH-. Tales miméticos peptídicos pueden tener ventajas significativas con respecto a las modalidades polipeptídicas incluyendo, por ejemplo: producción más económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas mejoradas (vida media, absorción, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida y otras. El marcado de dos peptidomiméticos usualmente involucra la unión covalente de una o más marcas, directamente o a través de un separador (por ejemplo, un grupo amida), en posiciones no interfirientes del peptidomimético que se predicen mediante datos cuantitativos de actividad de la estructura y/o modelado molecular. Tales posiciones no interfirientes generalmente son posiciones que no forman contactos directos con las macromoléculas (por ejemplo, moléculas de la superfamilia de la inmunoglobulina) a las cuales el peptidomimético se une para producir el efecto terapéutico. La derivación (por ejemplo, marcado) de los peptidomiméticos no debe interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del peptidomimético. Generalmente, los peptidomiméticos de los péptidos que se unen al receptor se unen al receptor con alta afinidad y poseen actividad biológica detectable (es decir, son agonistas o antagonistas a uno o más cambios fenotípicos mediados por el receptor). Las sustituciones sistemáticas de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina), puede utilizarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de la secuencia del consenso sustancialmente idéntica, pueden generarse mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo, et al., Ann. Rev. Biochem., 61 :387 (1992), incorporada en la presente como referencia); por ejemplo, agregando residuos internos de cisteína capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido. "Marca detectable" se refiere a materiales, los cuales cuando se unen de manera covalente a los compuestos peptídicos de esta invención, permiten la detección de los compuestos peptídicos in vivo en el paciente, a quien se le ha administrado el compuesto peptídico. Las marcas detectables adecuadas son bien conocidas en la técnica e incluyen, a manera de ejemplo, radioisótopos, marcas fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína) y lo similar. La marca detectable particular empleada no es crítica, y se selecciona con relación a la cantidad de marca a emplearse, así como la toxicidad de la marca a la cantidad de marca empleada. La selección de la marca con relación a tales factores, está dentro de la experiencia en la técnica. La unión covalente de la marca detectable al compuesto peptídico, se logra mediante métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, cuando se emplea el radioisótopo 125l como la marca detectable, la unión covalente del 125l al compuesto peptídico puede lograrse Incorporando el aminoácido tirosina en el compuesto peptídico y a continuación yodando el compuesto peptídico (véase, por ejemplo, Weaner, et al., Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds, pp. 137-140 (1994)). La incorporación de la tirosina en el término N o C del compuesto peptídico, puede lograrse mediante una química bien conocida. De igual manera, el 32-P puede incorporarse en el compuesto peptídico como una porción fosfato a través de, por ejemplo, un grupo hidroxilo en el compuesto peptídico, utilizando la química convencional.

II. Generalidades La presente invención proporciona compuestos que se unen a y activan el TPO-R o se comportan de otra manera como un agonista de la TPO. Estos compuestos peptídicos incluyen compuestos peptídicos "líderes" y compuestos peptídicos "derivados", construidos para tener la misma o similar estructura o forma molecular que los compuestos peptídicos líder, pero que difieren de los compuestos peptídicos líder con respecto a la susceptibilidad a la hidrólisis o proteólisis y/o con respecto a otras propiedades biológicas, tales como una afinidad incrementada por el receptor. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un compuesto peptídico, y más particularmente, un compuesto peptídico que es útil para tratar trastornos hematológicos, y particularmente, trombocitopenia asociada con quimioterapia, terapia con radiación o transfusiones de médula ósea. Se encontró que el compuesto peptídico del núcleo puede comprender una secuencia de aminoácidos: (SEQ ID NO:2) X9 X8 G Xi X2 X3 X4 X5 Xß X7, en donde XQ puede ser ß-(2-naftil)alanina y en donde Xg es A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T o V; y X8 es A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T o V. De manera más preferida, Xg es A o I; y X8 es D, E o K. Además X-i es C, L, M, P, Q, V; X2 es F, K, L, N, Q, R, S, T o V; X3 es C, F, I, L, M, R, S, V o W; X4 es cualquiera los 20 aminoácidos L codificados genéticamente; X5 es A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V o Y; y X7 es C, G, I, K, L, M, N, R o V. Sin embargo, como se describe además en la presente, se ha encontrado que reemplazando XQ con ß-(2-naftil)alanina, el compuesto proporciona diferentes propiedades del compuesto que contiene ß-(1-naftil)alanina. En consecuencia, un péptido particularmente preferido incluye la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:4): I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar). En otra modalidad, los compuestos peptídicos de la presente ¡nvención se dimerizan u oligomerizan de manera preferida para incrementar la afinidad y/o actividad de los compuestos. Un ejemplo de un compuesto peptídico dimerizado preferido incluye, de manera no exclusiva, lo siguiente: I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -X 10 \ K(NH2J I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -X / 10 en donde X10 es un residuo de sarcosina o ß-alanina (SEQ ID NO: 7). Deberá notarse que un residuo X10 puede ser sarcosina y el otro residuo puede ser ß-alanina. La estructura anterior también puede representarse mediante lo siguiente: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)l_AARX10)2K-NH2. Un compuesto peptídico preferido es como sigue: en donde (2-Nal) es ß-(2-naftil)alanina y (Sar) es sarcosina (SEQ ID NO:7). Este compuesto peptídico se refiere en la presente como el "Compuesto No. 1 de TPO". Los compuestos peptídicos que tienen una Cl50 mayor que aproximadamente 100 mM, carecen de suficiente unión para permitir el uso en aspectos de diagnóstico o terapéuticos de esta invención. De manera preferida, para propósitos de diagnóstico, los compuestos peptídicos tienen una CI50 de aproximadamente 2 mM o menos, y para propósitos farmacéuticos, los compuestos peptídicos tienen una CI50 de aproximadamente 100 µM o menos. La Figura 1 compara la actividad de tres diferentes lotes del Compuesto No. 1 de TPO con un lote del compuesto peptídico de la técnica anterior, utilizando técnicas de ensayo con unidades luminiscentes relativas estándar. El ensayo emplea células murinas modificadas genéticamente para expresar de manera estable el receptor de la TPO humana y un constructo reportero de luciferasa dirigido por el promotor fos. La diferencia entre el Compuesto No. 1 de TPO y el compuesto peptídico de la técnica anterior es que el compuesto peptídico de la técnica anterior tiene una ß-(1-naftil)alanina (1-Nal), en donde la (2-Nal) está en el Compuesto No. 1 de TPO. El Compuesto No. 1 de TPO se refiere como 2-Nal, y el compuesto peptídico de la técnica anterior se refiere como 1-Nal (técnica anterior en la Figura 1). Como se muestra en la Figura 1 , la actividad es similar para cada compuesto. La Figura 2 compara la actividad de varios lotes diferentes del Compuesto No. 1 de TPO PEGilado (la pegilación de los compuestos de la presente invención se describe con mayor detalle a continuación), con varios lotes del compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior. Ambos lotes de los compuestos peptídicos PEGilados de la técnica anterior muestra alta actividad con esencialmente el mismo nivel de actividad que el compuesto peptídico no PEGilado de la técnica anterior. Las líneas restantes ilustran la actividad de diferentes lotes del Compuesto No. 1 de TPO PEGilado. Como se muestra en la Figura 2, en este modelo, el último tiene menos actividad con relación a los compuestos peptídicos PEGilados de la técnica anterior. El Compuesto No. 1 de TPO PEGilado se refiere como PEG-2-Nal y el compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior se refiere como PEG-1-Nal (Técnica Anterior) en la Figura 2. La Figura 3 demuestra la potencia relativa de un péptido PEGilado de la técnica anterior y el Compuesto No. 1 de TPO PEGilado. Mediante un modelo de rata, la Figura 3 muestra el cambio ¡n vivo en los conteos de plaquetas después de la administración del compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior y el Compuesto No. 1 de TPO PEGilado. Como se muestra por la Figura 3, la dosis más alta del Compuesto No. 1 de TPO PEGilado, tiene la misma actividad que la dosis más baja del compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior. Un compuesto menos potente puede proporcionar un estímulo menos dramático a la célula objetivo, lo cual podría reducir el riesgo de efectos laterales causados por la sobreestimulación de la célula objetivo, tal como trombocitopenia exacerbada, después del ciclo subsiguiente de quimioterapia. El Compuesto No. 1 de TPO PEGilado se refiere como PEG-2-Nal y el compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior se refiere como PEG-1-Nal (Técnica Anterior) en la Figura 3. Las Figuras 4 y 5 muestran los resultados de un estudio de respuesta a la dosis cabeza a cabeza de un compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior y el Compuesto No. 1 de TPO PEGilado en ratones normales. El Compuesto No. 1 de TPO PEGilado se refiere como PEG-2-Nal y el compuesto peptídico PEGilado de la técnica anterior se refiere como PEG-1-Nal (Técnica Anterior) en las Figuras 4 y 5. La Figura 4 muestra los incrementos en los niveles de plaquetas y la Figura 5 muestra el Volumen Medio de las Plaquetas, seis (6) días después del tratamiento. El intervalo de la dosis fue de 10 a 3000 ug/kg. Ambos compuestos peptídicos incrementan el número de plaquetas circulantes de una manera dependiente de la dosis con incrementos relativos para el grupo de control observados a dosis tan bajas como 30 ug/kg para ambos compuestos. A la respuesta máxima, estos compuestos peptídicos elevaron los conteos de paquetas a niveles que fueron hasta 4 veces mayores que los valores de control. Las curvas de dosis-respuesta para estos compuestos peptídicos fueron muy similares, indicando que en este modelo esencialmente no hubo diferencia entre los dos artículos de prueba basándose en estos puntos finales.

III. Preparación de los compuestos peptídicos A. Síntesis en fase sólida Los compuestos peptídicos de la ¡nvención pueden prepararse mediante métodos clásicos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando técnicas estándar en fase sólida. Los métodos estándar incluyen métodos de síntesis exclusiva en fase sólida, síntesis parcial en fase sólida, condensación fragmentada, síntesis en solución clásica, e incluso mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1963), incorporada en la presente como referencia. En la fase sólida, la síntesis comienza típicamente desde el extremo C terminal del péptido, utilizando una resina protegida con un alfa-amino. Una materia prima adecuada puede prepararse, por ejemplo, uniendo el alfa-aminoácido requerido a una resina clorometilada, o una resina de hidroximetilo o una resina de benzhidrilamina. Tal resina clorometilada se vende bajo la marca BIO-BEADS SX-1 por Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, y la preparación de la resina de hidroximetilo se describe por Bodonszky, et al., Chem. Ind. (Londres), 38:1597 (1966). La resina de benzhidrilamina (BHA) se ha descrito por Pietta y Marshall, Chem. Commn., 650 (1970), y está comercialmente disponible de Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, Calif., en la forma de clorhidrato. Así, los compuestos peptídicos de la invención pueden prepararse acoplando un aminoácido protegido con un alfa-amino a la resina clorometilada con la ayuda de, por ejemplo, catalizador de bicarbonato de cesio, de acuerdo con el método descrito por Gisin, Helv. Chim. Acta., 56:1467 (1973). Después del acoplamiento inicial, el grupo protector alfa-amino se elimina mediante una elección de reactivos, incluyendo soluciones de ácido trifluoroacético (TFA) o ácido clorhídrico (HCl) en solventes orgánicos a temperatura ambiente. Los grupos protectores alfa-amino son aquéllos conocidos por ser útiles en la técnica de la síntesis paso a paso de los péptidos. Se incluyen los grupos protectores del tipo acilo (por ejemplo, formilo, trifluoroacetilo, acetilo), los grupos protectores del tipo uretano aromático (por ejemplo, benciloxicarbonilo (Cbz) y Cbz sustituido), grupos protectores de uretano alifático (por ejemplo, t-butiloxicarbonilo (Boc), isopropiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo) y grupos protectores del tipo alquilo (por ejemplo, bencilo, trifenilmetilo). Boc y Fmoc son los grupos protectores preferidos. El grupo protector de la cadena lateral permanece intacto durante el acoplamiento y no se separa durante la desprotección del grupo protector del término amino o durante el acoplamiento. El grupo protector de la cadena lateral debe ser eliminable tras la terminación de la síntesis del péptido final y bajo las condiciones de reacción que no alterarán el péptido objetivo.

Los grupos protectores de la cadena lateral para Tyr incluyen tetrahidropiranilo, ter-butilo, tritilo, bencilo, Cbz, Z-Br-Cbz y 2,5-diclorobencilo. Los grupos protectores de la cadena lateral para Asp incluyen bencilo, 2,6-diclorobencilo, metilo, etilo y ciciohexilo. Los grupos protectores de la cadena lateral para Thr y Ser incluyen acetilo, benzoilo, tritilo, tetrahidropiranilo, bencilo, 2,6-diclorobencilo y Cbz. El grupo protector de la cadena lateral para Thr y Ser es bencilo. Los grupos protectores de la cadena lateral para Arg incluyen nitro, Tosilo (Tos), Cbz, adamantiloxicarbonil mesitoilsulfonilo (Mts) o Boc. Los grupos protectores de la cadena lateral para Lys incluyen Cbz, 2-clorobenciloxicarbonilo (2-CI-Cbz), 2-bromobenciloxicarbonilo (2-BrCbz), Tos o Boc. Después de la eliminación del grupo protector alfa-amino, los aminoácidos protegidos restantes se acoplan paso a paso en el orden deseado. Se utiliza generalmente un exceso de cada aminoácido protegido con un activador del grupo carboxilo apropiado, tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) en solución, por ejemplo, en mezclas de cloruro de metileno (CHzClz), dimetil formamida (DMF). Después de que la secuencia de aminoácidos deseada se ha terminado, el péptido deseado se desacopla del soporte de la resina mediante el tratamiento con un reactivo tal como ácido trifluoroacético o fluoruro de hidrógeno (HF), el cual no sólo escinde el péptido de la resina, sino también escinde todos los grupos protectores de la cadena lateral restantes. Cuando se utiliza la resina clorometilada, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno resulta en la formación de los ácidos peptídicos libres. Cuando se utiliza resina de benzhidrilamina, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno resulta directamente en la amida peptídica libre. De manera alterna, cuando se emplea la resina clorometilada, el péptido protegido de la cadena lateral puede desacoplarse mediante el tratamiento de la resina peptídica con amoniaco para dar la amida protegida de la cadena lateral deseada o con una alquilamina para dar una alquilamida o dialquilamida protegida de la cadena lateral. La protección de la cadena lateral se elimina a continuación de la manera usual mediante tratamiento con fluoruro de hidrógeno para proporcionar las amidas, alquilamidas o dialquilamidas libres. Estos procedimientos de síntesis peptídica en fase sólida son bien conocidos en la técnica, y se describen además por John Morrow Stewart y Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Syntheses (2a Ed., Pierce Chemical Company, 1984).

B. Aminoácidos sintéticos Estos procedimientos también pueden utilizarse para sintetizar péptidos en los cuales los aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos naturales codificados genéticamente, están sustituidos en una, dos o más posiciones de cualquiera de los compuestos de la invención. Uno puede reemplazar las cadenas laterales naturales de los 20 aminoácidos codificados genéticamente (o aminoácidos D), con otras cadenas laterales, por ejemplo, con grupos tales como alquilo, alquilo inferior, alquilo cíclico de 4, 5, 6 a 7 miembros, amida, amida alquilo ¡nferior, amida di(alquilo ¡nferior), alcoxi ¡nferior, hidroxi, carboxi y los derivados de éster ¡nferior de los mismos, y con un grupo heterocíclico de 4, 5, 6 a 7 miembros. En particular, pueden emplearse los análogos de prolina en los cuales el tamaño del anillo del residuo de prolina se cambia de 5 miembros a 4, 6 ó 7 miembros. Los grupos cíclicos pueden ser saturados o no saturados, y si no están saturados, pueden ser aromáticos o no aromáticos. Los grupos heterocíclicos contienen de manera preferida uno o más heteroátomos de nitrógeno, oxígeno y/o azufre. Los ejemplos de tales grupos incluyen el furazanilo, furilo, imidazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo (por ejemplo, morfolino), oxazolilo, piperacinilo (por ejemplo, 1 -piperacinilo), piperidilo (por ejemplo, 1-piperidilo, piperidino), piranilo, piracinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridacinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo (por ejemplo, 1-pirrolidinilo), pirrolinilo, pirrolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, tiomorfolinilo (por ejemplo, tiomorfolino) y triazolilo. Estos grupos heterocíclicos pueden estar sustituidos o no sustituidos. En donde un grupo está sustituido, el sustituyente puede se alquilo, alcoxi, halógeno, oxígeno o fenilo sustituido o no sustituido. Uno también puede modificar fácilmente los péptidos de la presente invención mediante fosforilación (véase, por ejemplo, W. Bannwarth, et al., Biorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6(17):2141 -2146 (1996)), y otros métodos para hacer derivados peptídicos de los compuestos de la presente invención, como se describe en Hruby, et al., Biochem. J., 268(2):249-262 (1990). Así, los compuestos peptídicos de la invención también sirven como una base para preparar miméticos peptídicos con actividad biológica similar.

C. Modificaciones terminales Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que está disponible una variedad de técnicas para construir compuestos peptídicos con la misma o similar actividad biológica deseada que el compuesto peptídico correspondiente, pero con una actividad más favorable que el compuesto peptídico con respecto a la solubilidad, estabilidad y susceptibilidad a hidrólisis y proteólisis. Véase, por ejemplo, Morgan, et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252 (1989). Lo siguiente describe métodos para preparar compuestos peptídicos modificados en el grupo amino N terminal, el grupo carboxilo C terminal y/o cambiar uno o más enlaces amida en el péptido a un enlace que no es de amido. Se entenderá que dos o más de tales modificaciones pueden acoplarse en una estructura del compuesto peptídico (por ejemplo, modificación en el grupo carboxilo C terminal e inclusión de un enlace carbamato -CH2- entre dos aminoácidos en el compuesto peptídico). 1. Modificaciones N terminales Los compuestos peptídicos típicamente se sintetizan como el ácido libre pero, como se indicó anteriormente, pueden prepararse fácilmente como la amida o el éster. Uno también puede modificar los términos amino y/o carboxi de los compuestos peptídicos de la invención, para producir otros compuestos de la invención. Las modificaciones del término amino incluyen metilación, acetilación, adición de un grupo benciloxicarbonilo o bloqueo del término amino con cualquier grupo de bloqueo que contenga una funcionalidad carboxilato definida por RCOO-, en donde R se selecciona del grupo que consiste de naftilo, acridinilo, esteroidilo y grupos similares. Las modificaciones del término carboxi incluyen reemplazar el ácido libre con un grupo carboxamida o formar una lactama cíclica en el término carboxi para introducir restricciones estructurales. Las modificaciones del término amino son como se expuso anteriormente, e incluyen alquilación, acetilación, adición de un grupo carbobenzoilo, formación de un grupo succinimida, etc. (Véase, por ejemplo, Murray, et al., Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5a ed., Vol. 1 , Manfred E. Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc. (1995)). Específicamente, el grupo amino N terminal puede hacerse reaccionar como sigue: (a) para formar un grupo amida de la fórmula RC(O)NH-, en donde R es como se definió anteriormente mediante la reacción con un haluro ácido o un anhídrido simétrico. Típicamente, la reacción puede conducirse poniendo en contacto cantidades aproximadamente equimolares o en exceso (por ejemplo, aproximadamente 5 equivalentes) de un haluro ácido con el péptido en un diluyente inerte (por ejemplo, diclorometano), de manera preferida que contenga un exceso (por ejemplo, aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina, para eliminar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son de otra manera convencionales (por ejemplo, temperatura ambiente durante 30 minutos). La alquilación del amino terminal para proporcionar una sustitución N del alquilo inferior seguida por la reacción con un haluro ácido, como se describió anteriormente, proporcionará un grupo N alquil amida de la fórmula RC(O)NR-; (b) para formar un grupo succinimida mediante la reacción con anhídrido succínico. Como anteriormente, puede emplearse una cantidad aproximadamente equimolar o un exceso de anhídrido succínico (por ejemplo, aproximadamente 5 equivalentes) y el grupo amino se convierte a succinimida mediante métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo el uso de un exceso (por ejemplo, diez equivalentes) de una amina terciaria tal como diisopropiletilamina en un solvente inerte adecuado (por ejemplo, diclorometano). Véase, por ejemplo, Wollenberg, et al., Patente de E.U.A. No. 4,612,132, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Se entiende que el grupo succínico puede sustituirse con, por ejemplo, sustituyentés alquilo o -SR que se preparan de una manera convencional para proporcionar la succinimida sustituida en el término N del péptido. Tales sustituyentes alquilo se preparan mediante la reacción de una olefina inferior con anhídrido maleico de la manera descrita por Wollenberg, et al., supra y los sustituyentes -SR se preparan mediante la reacción de RSH con anhídrido maleico, en donde R es como se definió anteriormente; (c) para formar un grupo benciloxicarbonil-NH- o benciloxicarbonil-NH- sustituido, mediante la reacción con aproximadamente una cantidad equivalente o un exceso de CBZ-Ci (es decir, cloruro de benciloxicarbonilo) o un CBZ-CI sustituido en un diluyente inerte adecuado (por ejemplo, diclorometano) que contiene de manera preferida una amina terciaria para eliminar el ácido generado durante la reacción; (d) para formar un grupo sulfonamida mediante la reacción con una cantidad equivalente o un exceso (por ejemplo, 5 equivalentes) de R-S(O)2CI en un diluyente inerte adecuado (diclorometano), para convertir la amina terminal en una sulfonamida, en donde R es como se definió anteriormente. De manera preferida, el diluyente inerte contiene un exceso de amina terciaria (por ejemplo, diez equivalentes), tal como diisopropiletilamina, para eliminar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son de otra manera convencionales (por ejemplo, temperatura ambiente durante 30 minutos); (e) para formar un grupo carbamato mediante la reacción con una cantidad equivalente o un exceso (por ejemplo, 5 equivalentes) de R-OC(O)CI o R-OC(O)OC6H4-p-NO2 en un diluyente inerte adecuado (por ejemplo, diclorometano), para convertir la amina terminal en un carbamato, en donde R es como se definió anteriormente. De manera preferida, el diluyente inerte contiene un exceso (por ejemplo, diez equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina, para eliminar cualquier ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son de otra manera convencionales (por ejemplo, temperatura ambiente durante 30 minutos); y (f) para formar un grupo urea mediante la reacción con una cantidad equivalente o un exceso (por ejemplo, 5 equivalentes) de R-N=C=O en un diluyente inerte adecuado (por ejemplo, diclorometano), para convertir la amina terminal en un grupo urea (es decir, RNHC(O)NH-), en donde R es como se definió anteriormente. De manera preferida, el diluyente inerte contiene un exceso (por ejemplo, aproximadamente diez equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina. Las condiciones de reacción son de otra manera convencionales (por ejemplo, temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos). 2. Modificaciones C Terminales En la preparación de los compuestos peptídicos en donde el grupo carboxilo C terminal está reemplazado por un éster (es decir,-C(O)OR en donde R es como se definió anteriormente), se emplean las resinas utilizadas para prepara los ácidos peptídicos, y el péptido protegido de la cadena lateral se escinde con una base y un alcohol apropiado, por ejemplo, metanol. Los grupos protectores de la cadena lateral se eliminan de la manera usual mediante tratamiento con fluoruro de hidrógeno para obtener el éster deseado. En la preparación de los compuestos peptídicos en donde el grupo carboxilo C terminal está reemplazado por la amida -C(O)NR3R4, se utiliza una resina de benzhidrilamina como el soporte sólido para la síntesis peptídica. Tras la terminación de la síntesis, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno para liberar el péptido del soporte resulta directamente en la amida del péptido libre (es decir, el término C es -C(O)NH2). De manera alterna, el uso de la resina clorometilada durante la síntesis peptídica, acoplada con amoniaco para escindir el péptido protegido de la cadena lateral del soporte, proporciona la amida del péptido libre y la reacción con una alquilamina o una dialquilamina proporciona una alquilamida o dialquilamida protegida de la cadena lateral (es decir, el término C es -C(O)NRR1, en donde R y R1 son como se definió anteriormente). La protección de la cadena lateral se elimina de la manera usual mediante tratamiento con fluoruro de hidrógeno para proporcionar las amidas, alquilamidas o dialquilamidas libres. Uno también puede ciclar los compuestos peptídicos de la invención, o incorporar un residuo desamino o descarboxi en los términos del compuesto peptídico, de manera que no hay un grupo amino o carboxilo terminal, para disminuir la susceptibilidad a las proteasas o para restringir la conformación del compuesto peptídico. Los grupos funcionales C terminales de los compuestos peptídicos de la presente invención incluyen amida, amida alquilo inferior, amida di(alquilo inferior), alcoxi ¡nferior, hidroxi y carboxi, y los derivados del éster inferior de los mismos, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Además de las anteriores modificaciones N terminales y C terminales, los compuestos peptídicos de la invención, incluyendo los peptidomiméticos, pueden modificarse de manera ventajosa con o acoplarse de manera covalente a uno o más de una variedad de polímeros hidrofílicos. Se ha encontrado que cuando los compuestos peptídicos se derivan con un polímero hidrofílico, su solubilidad y vidas medias en circulación se incrementan y su inmunogenicidad se enmascara. Lo anterior puede lograrse con poca, si la hay, disminución en su actividad de unión. Los polímeros no proteináceos adecuados para utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen, de manera no exclusiva, polialquiléteres, como se ejemplifica por el polietilenglicol y el polipropilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialquenos, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, celulosa y derivados de celulosa, dextrano y derivados de dextrano, etc. Generalmente, tales polímeros hidrofílicos tienen un peso molecular promedio que varía de aproximadamente 500 a aproximadamente 100,000 daltons, de manera más preferida de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 40,000 daltons e incluso de manera más preferida, de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 20,000 daltons. En las modalidades preferidas, tales polímeros hidrofílicos tienen pesos moleculares promedio de aproximadamente 5,000 daltons, 10,000 daltons y 20,000 daltons. Los compuestos peptídicos de la invención pueden derivarse con o acoplarse con tales polímeros utilizando cualquiera de los métodos expuestos en Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995); Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995); Patente de E.U.A. No. 4,640,835; Patente de E.U.A. No. 4,496,689; Patente de E.U.A. No. 4,301,144; Patente de E.U.A. No. 4,670,417; Patente de E.U.A. No. 4,791 ,192; Patente de E.U.A. No. 4,179,337 o WO 95/34326, todas las cuales se incorporan como referencia en su totalidad en la presente. En una modalidad actualmente preferida, los compuestos peptídicos de la presente ¡nvención se derivan con polietilenglicol (PEG). El PEG es un polímero lineal, soluble en agua, de unidades que se repiten de óxido de etileno con dos grupos hidroxilo terminales. Los PEG se clasifican por sus pesos moleculares, que varían típicamente de aproximadamente 500 daltons a aproximadamente 40,000 daltons. En una modalidad actualmente preferida, los PEG empleados tienen pesos moleculares que varía de 5,000 daltons a aproximadamente 20,000 daltons. Los PEG acoplados a los compuestos peptídicos de la presente ¡nvención pueden ser ramificados o no ramificados. (Véase, por ejemplo, Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem., 6: 62-69 (1995)). Los PEG están comercialmente disponibles de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.), (ahora parte de Nektar Therapeutics (San Cario, CA), Sigma Chemical Co. y otras compañías. Tales PEG incluyen, de manera no exclusiva, monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenglicol-succinato de succinimidilo (MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenglicol-tresilato (MePEG-TRES) y monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM). De manera breve, en una modalidad, el polímero hidrofílico que se emplea, por ejemplo, PEG, está coronado, de manera preferida, en un extremo con un grupo no reactivo tal como un grupo metoxi o etoxi. Posteriormente, el polímero se activa en el otro extremo mediante la reacción con un agente activante adecuado, tal como haluros cianúricos (por ejemplo, cloruro, bromuro o fluoruro cianúrico), diimadozle, un reactivo anhídrido (por ejemplo, un anhídrido dihalosuccínico, tal como anhídrido dibromosuccínico), acil azida, éter p-diazoiobencílico, 3-(p-diazoniofenoxi)-2-hidroxipropiléter) y lo similar. El polímero activado se hace reaccionar a continuación con un compuesto peptídico de la presente invención para producir un compuesto peptídico derivado con un polímero. De manera alterna, un grupo funcional en los compuestos peptídicos de la invención puede activarse para la reacción con el polímero, o los dos grupos pueden unirse en una reacción de acoplamiento concertado utilizando métodos de acoplamiento conocidos. Se apreciará fácilmente que los compuestos peptídicos de la ¡nvención pueden derivarse con PEG utilizando una miríada de otros esquemas de reacción conocidos por, y utilizados por aquellos con experiencia en la técnica. Cuando estos compuestos peptídicos se derivan con un polímero hidrofílico, su solubilidad y vidas medias en circulación se incrementan y su inmunogenicidad disminuye. Lo anterior puede lograrse con poca, si la hay, pérdida de su actividad biológica. En las modalidades preferidas, los péptidos derivados tienen una actividad que es 0.1 a 0.01 veces aquélla de los péptidos no modificados. En las modalidades más preferidas, los péptidos derivados tienen una actividad que es 0.1 a 1 vez aquélla de los péptidos no modificados. En las modalidades aún más preferidas, los péptidos derivados tienen una actividad que es mayor que la de los péptidos no modificados.

D. Modificaciones de la Cadena Principal Oíros métodos para hacer los derivados peptídicos de los compuestos de la presente ¡nvención se describen en Hruby, et al., Biochem J., 268 (2): 249-262 (1990), incorporada en la presente como referencia. Así, los compuestos peptídicos de la ¡nvención también sirven como modelos estructurales para los compuestos no peptídicos con una actividad biológica similar. Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que está disponible una variedad de técnicas para construir compuestos con la misma o similar actividad biológica deseada, como la del compuesto peptídico líder, pero con una actividad más favorable que la del líder con respecto a la solubilidad, estabilidad y susceptibilidad a la hidrólisis y la proteólisis. Véase, Morgan, et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252 (1989), incorporada en la presente como referencia. Estas técnicas incluyen reemplazar la cadena principal peptídica con una cadena principal compuesta de fosfonatos, amidatos, carbamatos sulfonamidas, aminas secundarias, y N-metilaminoácidos. Los reactivos adecuados incluyen, por ejemplo, análogos de aminoácidos en donde el grupo carboxilo del aminoácido se ha reemplazado con una porción adecuada para formar uno de los enlaces anteriores.

De manera similar, el reemplazo de un enlace amido en el péptido con un enlace fosfonato puede lograrse de la manera expuesta en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,359,115 y 5,420,328, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

E. Formación del Enlace Disulfuro Los compuestos de la presente invención pueden existir en una forma ciclizada con un enlace disulfuro intramolecular entre los grupos tiol de las cisteínas incorporadas, si están presentes. De manera alterna, puede producirse un enlace disulfuro ¡ntermolecular entre los grupos tiol de las cisteínas, para proporcionar un compuesto dimérico (u oligomérico superior). Uno o más de los residuos de cisteína también pueden sustituirse con una homocisteína.

IV. Utilidad Los compuestos peptídicos de la invención son útiles in vitro como herramientas únicas para entender el papel biológico de la TPO, incluyendo la evaluación de muchos factores que se piensa influyen y son influenciados por la producción de la TPO y el proceso de unión al receptor. Los presentes compuestos peptídicos también son útiles en el desarrollo de otros compuestos que se unen a, y activan el TPO-R, puesto que los presentes compuestos peptídicos proporcionan información importante sobre la relación entre la estructura y la actividad que facilitaría tal desarrollo.

Los compuestos peptídicos también son útiles como enlaces competitivos en ensayos para seleccionar nuevos agonistas del receptor de la TPO. En tales modalidades de ensayo, los compuestos peptídicos de la invención pueden utilizarse sin modificación o pueden modificarse en una variedad de formas; por ejemplo, mediante marcado, tal como uniendo de manera covalente o no covalente una porción, la cual proporciona directa o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, los materiales de los mismos pueden marcarse directa o indirectamente. Las posibilidades para el marcado directo incluyen grupos de marcas tales como: radiomarcas tales como 125-l, enzimas (Patente de E.U.A. No. 3,645,090) tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcas fluorescentes (Patente de E.U.A. No. 3,940,475) capaz de verificar el cambio en la intensidad de la fluorescencia, desplazamiento de la longitud de onda o polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para el marcado indirecto incluyen la biotinilación de un constituyente, seguido por la unión a avidina acoplada a uno de los grupos de marcas anteriores. Los compuestos peptídicos también pueden incluir separadores o enlazantes en los casos en donde los compuestos peptídicos se van a unir a un soporte sólido. Además, basándose en su capacidad para unirse al receptor de la TPO, los compuestos peptídicos de la presente ¡nvención pueden utilizarse como reactivos para detectar los receptores de la TPO en células vivientes, células fijas, en fluidos biológicos, en homogenados de tejido, en materiales biológicos naturales, purificados, etc. Por ejemplo, marcando tales compuestos peptídicos, uno puede identificar las células que tienen TPO-R en sus superficies. Además, basándose en su capacidad para unirse al receptor de la TPO, los compuestos peptídicos de la presente invención pueden utilizarse en la tinción in situ, FACS (clasificación celular activada por la fluorescencia), Western blotting, ELISA, etc. Además, basándose en su capacidad para unirse al receptor de la TPO, los compuestos peptídicos de la presente invención pueden utilizarse en la purificación del receptor, o en la purificación de células que expresan los receptores de la TPO en la superficie celular (o dentro de las células permeabilizadas). Los compuestos peptídicos de la presente invención también pueden utilizarse como reactivos comerciales para varios usos de investigación y diagnóstico médico. Tales usos incluyen de manera no exclusiva: (1) uso como un estándar de calibración para cuantificar las actividades de los agonistas de la TPO candidatos, en una variedad de ensayos funcionales; (2) uso para mantener la proliferación y crecimiento de líneas celulares dependientes de la TPO; (3) uso en análisis estructural del receptor de la TPO mediante cocristalización; (4) uso para investigar el mecanismo de la transducción de la señal/activación del receptor de la TPO; y (5) otras aplicaciones de investigación y diagnóstico en donde el receptor de la TPO está activado de manera preferida, o tal activación es calibrada de manera conveniente contra una cantidad conocida de un agonista de la TPO y lo similar.

Los compuestos peptídicos de la presente invención pueden utilizarse para la expansión in vitro de los megacariocitos y sus progenitores comprometidos, ambos en conjunto con citocinas adicionales o por sí solos. Véase, por ejemplo, DiGiusto, et al., Publicación del PCT No. 95/05843, la cual se incorpora en la presente como referencia. La quimioterapia y las terapias con radiación causan trombocitopenia al destruir la población de megacariocitos más madura, que se divide rápidamente. Sin embargo, estos tratamientos terapéuticos también pueden reducir el número y la viabilidad de las células precursoras del megacariocito, inmaduras, menos mitóticamente activas. Así, la mejora de la trombocitopenia por la TPO o los compuestos peptídicos de la presente invención puede acelerarse infundiendo a los pacientes postquimioterapia o terapia con radiación con una población de sus propias células enriquecidas con megacariocitos y precursores inmaduros mediante el cultivo in vitro. Los compuestos peptídicos de la invención también pueden administrarse a animales de sangre caliente, incluyendo humanos, para desactivar el TPO-R in vivo. Así, la presente invención abarca métodos para el tratamiento terapéutico de trastornos relacionados con la TPO, que comprenden administrar un compuesto peptídico de la invención en cantidades suficientes para imitar el efecto de la TPO en el TPO-R ¡n vivo. Por ejemplo, los compuestos peptídicos de la invención pueden administrarse para tratar una variedad de trastornos hematológicos, incluyendo, de manera no exclusiva a los trastornos de las plaquetas y la trombocitopenia, particularmente cuando se asocia con transfusiones de médula ósea, terapia con radiación y quimioterapia. En algunas modalidades de la invención, los antagonistas de la TPO son, de manera preferida, administrados a pacientes que se someten a quimioterapia o terapia con radiación, seguido por la administración de los agonistas de la TPO de la invención. La actividad de los compuestos peptídicos de la presente ¡nvención puede evaluarse in vitro o in vivo en uno de los numerosos modelos descritos en McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992), que se incorpora en la presente como referencia. De acuerdo con una modalidad, las composiciones de la presente ¡nvención son útiles para tratar la trombocitopenia asociada con las transfusiones de médula ósea, terapia con radiación o quimioterapia. Los compuestos peptídicos típicamente se administrarán profilácticamente antes de la quimioterapia, terapia con radiación o transplante de médula ósea o después de tal exposición. En consecuencia, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden, como un ingrediente activo, al menos uno de los compuestos peptídicos de la invención, en asociación con un portador o diluyente farmacéutico. Los compuestos peptídicos de esta invención pueden administrarse mediante rutas de administración oral, pulmonar, parenteral (inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), inhalación (vía una formulación de polvo fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal o sublingual, y pueden formularse en formas de dosificación apropiadas para cada ruta de administración. Véase, por ejemplo, Bemstein, et al., Publicación de Patente del PCT No. WO 93/25221 ; Pitt, et al., Publicación de Patente del PCT No. WO 94/17784 y Pitt, et al., Solicitud de Patente Europea 613,683, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. Las formas de dosificación sólida para la administración oral incluyen cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y granulos. En tales formas de dosificación sólida, el compuesto peptídico activo se mezcla con al menos un portador inerte farmacéuticamente aceptable, tal como sucrosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación pueden comprender también, como es normal en la práctica, sustancias adicionales diferentes a los diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las formas de dosificación pueden comprender también agentes amortiguantes. Las tabletas y pildoras pueden prepararse además con recubrimientos entéricos. Las formas de dosificación líquida para la administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes farmacéuticamente aceptables, con los elíxires que contienen diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tales como agua. Además de tales diluyentes inertes, las composiciones también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión, y agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes.

Las preparaciones de acuerdo con esta ¡nvención para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones o emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de solventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y esteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Tales formas de dosificación pueden contener también adyuvantes tales como agentes conservadores, humectantes, emulsificantes y de dispersión. Pueden ser esterilizados, mediante por ejemplo, filtración a través de un filtro que retiene las bacterias, incorporando agentes esterilizantes en las composiciones, irradiando las composiciones o calentando las composiciones. Pueden también fabricarse utilizando agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril, inmediatamente antes del uso. Las composiciones para la administración rectal o vaginal son de manera preferida, supositorios que pueden contener, además de la sustancia activa, excipientes tales como manteca de cacao o cera para supositorio. Las composiciones para la administración nasal o sublingual también se preparan con excipientes estándar bien conocidos en la técnica. Las composiciones que contienen los compuestos peptídicos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya sufre de una enfermedad, como se describió anteriormente, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad y el peso y el estado general del paciente. Las composiciones de la invención también pueden microencapsularse mediante, por ejemplo, el método de Tice y Bibi (en Treatise on Controlled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus, Marcel Dekker, New York (1992), pp. 315-339). En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los compuestos peptídicos de la invención, se administran a un paciente susceptible de, o de otra manera en riesgo de una enfermedad particular. Tal cantidad se define como una "dosis profilácticamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas dependen nuevamente del estado de salud del paciente y del peso. Las cantidades del compuesto peptídico, necesarias para una terapia efectiva, variarán dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Así, las dosificaciones del tratamiento deberán titularse para optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente, las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proporcionar una guía útil para las cantidades útiles para la administración ¡n situ de estos reactivos. Las pruebas con animales de las dosis efectivas para el tratamiento de trastornos particulares, proporcionarán una indicación predictiva adicional de la dosificación en humanos. Varias consideraciones se describen, por ejemplo, en Gilman, et al. (eds), Goodman y Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a ed., Pergamon Press (1990); y Remington's Pharmaceutical Sciences, 7a Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985); cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia. Los compuestos peptídicos de esta invención son efectivos para tratar condiciones mediadas por la TPO cuando se administran a un intervalo de dosificación de aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día. La dosis específica empleada se regula por la condición particular que está siendo tratada, la ruta de administración, así como por el juicio del clínico que atiende, dependiendo de factores tales como la severidad de la condición, la edad y la condición general del paciente y lo similar.

EJEMPLO 1 Síntesis peptídica en fase sólida Los compuestos peptídicos de la invención pueden sintetizarse, por ejemplo, utilizando las técnicas de síntesis en fase sólida de Merrifield (véase, Steward y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a edición, Pierce Chemical, Rockford, lll. (1984) y Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1963)) o un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems Inc. Modelo 431 A o 433A. Los compuestos peptídicos pueden montarse utilizando protocolos estándar de Synth Assist.™' 1.0.0 o Synth Assist.™' 2.0.2 de Applied Biosystems Inc. Cada acoplamiento puede realizarse durante 2 x 30 minutos, con HBTU (hexafluorofosfato de 2-1 H-benzatriazol-1 -il)-1 , 1 ,3,3-tetrametiluronio) y HOBt (1-hidroxibenzotriazol). La resina utilizada puede ser resina HMP, resina de (p-hidroximetil fenoximetil) poliestireno o PAL (Milligen/Biosearch), la cual es una resina de poliestireno reticulada con ácido 5-(4'-Fmoc-aminometil-3,5'-dimetioxifenoxi) valérico como el enlazante. El uso de la resina PAL resulta en una funcionalidad de amida carboxi terminal tras la escisión del péptido de la resina. Tras la escisión, la resina HMP produce una porción de ácido carboxílico en el término C del producto final. La mayoría de los reactivos, resinas y aminoácidos protegidos (libres o sobre la resina) pueden comprarse de Millipore o Applied Biosystems Inc. El grupo Fmoc puede utilizarse para la protección del amino durante el procedimiento de acoplamiento. La protección de la amina primaria en los aminoácidos puede lograrse con Fmoc y grupos de protección de la cadena lateral tales como t-butilo para serina, tirosina, ácido glutámico y treonina; tritilo para la glutamina; Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo) para arginina; N-t-butiloxicarbonilo para triptofano; N-tritilo para histidina y S-tritilo para cisteína. La eliminación de los compuestos peptídicos de la resina y la desprotección simultánea de las funciones de la cadena lateral puede lograrse mediante el tratamiento con el reactivo K o con ligeras modificaciones del mismo. De manera alterna, en la síntesis de estos péptidos, con un término carboxilo amidado, el péptido completamente montado puede escindirse con una mezcla de 90% de ácido trifluoroacético, 5% de etanditiol y 5% de agua, inicialmente a 4°C, e incrementándose gradualmente a temperatura ambiente.

Los compuestos peptídicos desprotegidos pueden precipitarse con éter i dietílico. La purificación puede ser mediante cromatografía líquida de alto rendimiento, preparativa, en fase inversa, en una columna de gel de sílice unido C18, con un gradiente de acetonitrilo/agua en ácido trifluoroacético al 0.1%. Los compuestos peptídicos homogéneos pueden caracterizarse mediante espectrometría de masas con Bombardeo Rápido de Átomos o espectrometría de masas con electrorrocío y análisis de los aminoácidos, cuando es aplicable. En una modalidad preferida, los compuestos peptídicos de esta invención se dimerizan utilizando procedimientos sintéticos estándar conocidos por y utilizados por aquellos con experiencia en la técnica. Siguiendo estos esquemas sintéticos, aquellos con experiencia en la técnica pueden preparar fácilmente compuestos peptídicos diméricos, de acuerdo con la presente invención. Además, será fácilmente evidente para aquellos con experiencia en la técnica, que las subunidades diméricas pueden enlazarse fácilmente utilizando metodologías y enlazantes conocidos.

EJEMPLO 2 Pegilación de los compuestos peptídicos La pegilación de un compuesto peptídico de la presente invención puede llevarse a cabo mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, un compuesto peptídico de la invención puede disolverse en bicina 100 mM pH 8.0 a una concentración de 10 mg/ml, agregarse a un exceso molar de 1.25 veces de PEG2 en polvo (comercialmente disponible de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)) y agitarse a temperatura ambiente hasta que la reacción está completa, típicamente 1-2 horas. La reacción se verifica mediante HPLC en fase inversa utilizando un gradiente de acetonitrilo de 40-65% con una columna YMC ODS AQ. Cuando la reacción está completa, la solución se agrega a un segundo exceso molar de 1.25 de PEG2 en polvo y el procedimiento se repite 4 veces, utilizando un total de 5 moles de PEG2 por cada mol de polipéptido. La solución se diluye 2 veces con PBS para reducir la viscosidad y se carga en una columna superdex 200 (Pharmacia), equilibrada previamente y eluida con PBS. Las fracciones de la columna de exclusión de tamaño pueden analizarse mediante HPLC en fase inversa. Las fracciones que contienen el compuesto di-PEG-peptídico que eluyen antes de cualquier compuesto mono-PEG-peptídico, pueden reunirse y almacenarse a 5°C o liofilizarse. Aunque sólo las modalidades preferidas de la invención se describen específicamente en lo anterior, se apreciará que son posibles modificaciones y variaciones de la invención, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto peptídico que se une a un receptor de la trombopoyetina, en donde el compuesto peptídico comprende (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX?o)-K(NH2)-(X?oRAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, (SEQ ID NO: 7), en donde X10 se selecciona del grupo que consiste de sarcosina o ß-alanina.

2.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto peptídico está unido covalentemente a un polímero hidrofílico.

3.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el polímero hidrofílico tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 500 a aproximadamente 40,000 daltons.

4.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el polímero hidrofílico tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 5,000 a aproximadamente 20,000 daltons.

5.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el polímero hidrofílico se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol, polipropilenglicol, ácido poliláctico y ácido poliglicólico.

6.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el polímero hidrofílico es polietilenglicol.

7.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada una de las subunidades diméricas del compuesto peptídico está unida covalentemente a un polímero hidrofílico.

8.- Una composición farmacéutica que comprende el compuesto peptídico que se define en la reivindicación 1, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

9.- El uso de un compuesto peptídico como el que se define en la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para tratar a un paciente que sufre de un trastorno que es susceptible de tratamiento con un agonista de trombopoyetina.

10.- Una composición polipeptídica fisiológicamente activa, sustancialmente no inmunogénica, soluble en agua, que comprende un compuesto peptídico como el que se define en la reivindicación 1 , acoplado con un agente de acoplamiento a al menos un polímero que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 500 a aproximadamente 20,000 daltons, seleccionado del grupo que consiste de polietilenglicol y propilenglicol, en donde el polímero está no sustituido o sustituido con grupos alcoxl o alquilo, los grupos alcoxi o alquilo poseen menos que 5 átomos de carbono.

11.- La composición polipeptídica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el polímero tiene un peso molecular de aproximadamente 750 a aproximadamente 15,000 daltons.

12.- La composición polipeptídica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el polímero tiene un peso molecular de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 10,000 daltons.

13.- La composición polipeptídica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el polímero es polietilenglicol.

14.- Una composición polipeptídica sustancialmente no inmunogénica, soluble agua, que comprende la composición que se define en la reivindicación 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.

15.- Un método para activar un receptor de la trombopoyetina en una célula, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un compuesto peptídico que comprende (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)-K(NH2)-(X10RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, (SEQ ID NO: 7), en donde X-?o se selecciona del grupo que consiste de sarcosina o ß-alanina.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque las células comprenden megacariocitos, plaquetas o células CD34+ humanas.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque las células comprenden células dependientes de la TPO.

18.- El uso de células tratadas con el método que se describe en la reivindicación 15, para preparar un medicamento para tratar la trombocitopenia en un sujeto.

19.- El uso que se reclama en la reivindicación 18, en donde la trombocitopenia es debida a la quimioterapia.

20.- El uso que se reclama en la reivindicación 19, en donde la población de células se obtiene antes de la quimioterapia.

21.- El uso que se reclama en la reivindicación 18, en donde la trombocitopenia es debida a la terapia con radiación.

22.- El uso que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la población de células se obtiene antes de la terapia con radiación.

23.- El uso de un compuesto peptídico que comprende (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)-K(NH2)-(X?0RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, (SEQ ID NO: 7), en donde X-?o se selecciona del grupo que consiste de sarcosina o ß-alanina, para preparar un medicamento para tratar a un paciente que sufre de trombocitopenia.

24.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde la trombocitopenia es debida a la quimioterapia o terapia con radiación.

25.- El uso que se reclama en la reivindicación 24, en donde un antagonista de la TPO es administrable a un paciente antes de la quimioterapia o terapia con radiación.

26.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde la trombocitopenia es debida a una transfusión de médula ósea.

27.- El uso de un compuesto peptídico que comprende

(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)-K(NH2)-(X10RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, (SEQ

ID NO: 7), en donde X-?0 se selecciona del grupo que consiste de sarcosina o ß-alanina, para preparar un medicamento para tratar profilácticamente a un paciente en riesgo de trombocitopenia. 28.- El uso que se reclama en la reivindicación 27, en donde el compuesto peptídico es administrable antes del transplante de médula ósea, quimioterapia o terapia con radiación. 29.- Un compuesto que se une a un receptor de la trombopoyetina, el compuesto peptídico tiene: (1) un peso molecular de menos que aproximadamente 8000 daltons, y (2) una afinidad de unión al receptor de la trombopoyetina como se expresa por una Cl50 de no más que aproximadamente 100 mM, en donde el compuesto peptídico comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: en donde X9 es A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T o V; y X8 es A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T o V, Xi es C, L, M, P, Q, V; X2 es F, K, L, N, Q, R, S, T o V; X3 es C, F, I, L, M, R, S, V o W; X4 es cualquiera de los 20 aminoácidos L codificados genéticamente; X5 es A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V o Y; X7 es C, G, I, K, L, M, N, R o V, y X6 es ß-(2-naft¡l)alanina.

30.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos está ciclizada.

31.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos está dimerizada.

32.- Un método para activar un receptor de la trombopoyetina en una célula, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un compuesto peptídico que tiene un peso molecular de menos que aproximadamente 8000 daltons, el compuesto peptídico comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: X9 X8 G ^ X2 X3 X4 X5 Xe X7 (SEQ ID NO:2) en donde X9 es A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T o V; y X8 es A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T o V, Xi es C, L, M, P, Q, V; X2 es F, K, L, N, Q, R, S, T o V; X3 es C, F, I, L, M, R, S, V o W; X4 es cualquiera de los 20 aminoácidos L codificados genéticamente; X5 es A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V o Y; X7 es C, G, I, K, L, M, N, R o V, y X6 es ß-(2-naftil)alanina.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos está ciclizada.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos está dimerizada.

35.- Un método para activar un receptor de la trombopoyetina en una célula, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un compuesto peptídico unido covalentemente a un polímero hidrofílico, el compuesto peptídico comprende la secuencia de aminoácidos I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) (SEQ ID NO:7).

36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el polímero hidrofílico tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 500 a aproximadamente 40,000 daltons.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el polímero hidrofílico tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 5,000 a aproximadamente 20,000 daltons.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el polímero se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol, polipropilenglicol, ácido poliláctico y ácido poliglicólico.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque el compuesto peptídico está unido covalentemente al polietilenglicol.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque las células están in vitro.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque las células comprenden megacariocitos, plaquetas o células CD34+ humanas.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque las células comprenden células dependientes de la TPO.

43.- El uso de las células tratadas de acuerdo con el método que se describe en la reivindicación 35, para preparar un medicamento para tratar la trombocitopenia en un sujeto.

44.- El uso que se reclama en la reivindicación 43 en donde la trombocitopenia es debida a la quimioterapia.

45.- El uso que se reclama en la reivindicación 44, en donde la población de células se obtiene antes de la quimioterapia.

46.- El uso que se reclama en la reivindicación 43, en donde la trombocitopenia es debida a la terapia con radiación.

47.- El uso que se reclama en la reivindicación 46, en donde la población de células se obtiene antes de la terapia con radiación.

48.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el compuesto peptídico comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) (SEQ ID NO:7).

49.- Un compuesto peptídico que se une a un receptor de la trombopoyetina, en donde dicho compuesto peptídico comprende (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar)2K-NH2.

50.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el compuesto peptídico está unido covalentemente a un polímero hidrofílico.

51.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el polímero hidrofílico se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol, polipropilenglicol, ácido poliláctico y ácido poliglicólico.

52.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque el polímero hidrofílico es polietilenglicol.

53.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 5,000 a aproximadamente 20,000 daltons.

54.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque el polietilenglicol se selecciona del grupo que consiste de monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenglicol-succinato de succinimidilo (MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenglicol-tresilato (MePEG-TRES) y monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carboniio (MePEG-IM). 55.- Un compuesto peptídico que se une al receptor de la trombopoyetina que tiene la siguiente fórmula:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar) KCNI-b) / I E G P T L R Q ( -Nal) L A A R-(Sar) en donde (2-Nal) es ß-(2-naft¡l)alanina y (Sar) es sarcosina.

56.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el compuesto peptídico está unido covalentemente a un polímero hidrofílico.

57.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el polímero hidrofílico se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol, polipropilenglicol, ácido poliláctico y ácido poliglicólico.

58.- Ei compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el polímero hidrofílico es polietilenglicol.

59.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 5,000 a aproximadamente 20,000 daltons.

60.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque el polietilenglicol se selecciona del grupo que consiste de monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenglicol-succinato de succinimidilo (MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenglicol-tresilato (MePEG-TRES) y monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM).

61.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque cada una de las subunidades diméricas del compuesto peptídico están unidas covalentemente a un polímero hidrofílico.

62.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque el polímero hidrofílico se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol, polipropilenglicol, ácido poliláctico y ácido poliglicólico.

63.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado además porque el polímero hidrofílico es polietilenglicol.

64.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado además porque el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 5,000 a aproximadamente 20,000 daltons.

65.- El compuesto peptídico de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque el polietilenglicol se selecciona del grupo que consiste de monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenglicol-succinato de succinimidilo (MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenglicol-tresilato (MePEG-TRES) y monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM).

66.- El uso de un compuesto peptídico covalentemente unido a un polímero hidrofílico, dicho compuesto peptídico comprende la secuencia de aminoácidos IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar) (SEQ ID No: 7), para preparar un medicamento para activar un receptor de tromboyetina en una célula.