KR20120078742A - 수용체에 결합하는 펩티드 및 화합물 - Google Patents

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브라이언 알. 맥도날드
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오르토-맥네일 파마슈티칼, 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 트롬보포이에틴 수용체(c-mpl 또는 TPO-R)에 결합하여 활성화시키거나, 달리 언급하지 않는 한, TPO 작용제로서 작용하는 펩티드 화합물을 제공한다.

Description

수용체에 결합하는 펩티드 및 화합물{PEPTIDES AND COMPOUNDS THAT BIND TO A RECEPTOR}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2003년 8월 28일에 출원된 미국 특허 출원 제 60/498,740 호를 우선권으로 주장한다.
기술 분야
본 발명은 트롬보포이에틴 수용체(c-mpl 또는 TPO-R)에 결합하고 활성화시키거나, 달리 언급하지 않는 한, TPO 작용제로서 작용하는 펩티드 화합물을 제공한다. 본 발명은 생화학 및 의료 화학 분야에 적용되고 특히 인간 질환에 사용되는 TPO 작용제를 제공한다.
거대핵세포는 골수-유래 세포로서, 이는 순환 혈소판의 생산을 담당하고 있다. 대부분의 종에서 < 0.25%의 골수 세포를 포함하고 있지만, 통상의 골수 세포의 용적에 >10배를 갖는다. 참조, [Kuter, et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11104-11108 (1994)]. 거대핵세포는 핵속분열로서 공지된 과정이 진행됨으로써 그들의 핵을 복제하지만, 세포 분열이 진행되지 않기 때문에 다배수체 세포를 유발한다. 혈소판 계수 감소에 대한 반응으로 핵속분열 속도는 증가하고, 더 많은 배수성 거대핵세포가 형성되고, 거대핵세포의 수는 3배 이하까지 증가할 수 있다[참조: Harker, J. Clin. Invest. , 47: 458-465 (1968)]. 대조적으로, 혈소판 계수의 증가에 대한 반응으로 핵속분열 속도는 감소하고 소수의 배수성 거대핵세포가 형성되고, 거대핵세포의 수는 50%까지 감소하게 될 수 있다.
순환 혈소판 집단은 핵속분열 속도 및 골수 거대핵세포 수를 조절하는 정확한 생리학적 피드백 메카니즘은 공지되어 있지 않다. 이 피드백 루프를 매개하는 것에 관여하는 순환 트롬보포이에틴은 현재 트롬보포이에틴 (TPO)인 것으로 판단된다. 더욱 특이적으로, TPO는 저혈소판증를 포함하는 상황에서 주요 체액성 조절자인 것으로 밝혀졌다. 참조, 예: [Metcalf, Nature, 369: 519-520 (1994)]. 수개의 연구에서 TPO는 혈소판 계수를 증가시키고, 혈소판 크기를 증가시키고, 수혜 동물의 혈소판내로의 동위원소 도입을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 특히, TPO는 여러 방식으로 거대핵세포에 영향을 준다고 사료된다: (1) 거대핵세포 크기 및 수를 증가시키고; (2) 거대핵세포에서 다배수 형태로 DNA 함량을 증가시키고; (3) 거대핵세포 핵속분열을 증가시키고; (4) 거대핵세포의 성숙도를 증가시키고; (5) 골수내 소수의 아세틸콜린스테라아제-양성 세포 형태로 전구체 세포의 퍼센트를 증가시킨다.
혈소판(platelet)(혈소판(thrombocytes))은 혈액에 필요하다. 그 혈소판의 수가 매우 낮을 경우 환자는 파국적 출혈로부터 사망할 위험이 높으므로 TPO는 다양한 혈액학적 질환, 예로서, 주로 혈소판 결핍에 기인한 질병의 진단 및 치료 모두에서 유용하게 적용된다. TPO를 사용한 현 진행중인 임상 시험을 통해 TPO가 환자에게 안전하게 투여될 수 있다는 것을 제안되었다. 또한, 최근 연구는 저혈소판증, 및 특히 암 또는 림프종의 치료법으로서 화학요법, 방사능 요법, 또는 골수 이식으로부터 유발된 저혈소판증의 치료에서 TPO 요법의 효능의 고안에 대한 기초를 제공하였다. 참조, 예: [McDonald, Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14: 8-21 (1992)].
TPO를 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 특징화하였다. 참조, [Kuter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11104-11108 (1994); Barley, etal., Cell 77: 1117-1124 (1994); Kaushansky etal., Nature 369: 568-571 (1994); Wendling, et al. , Nature, 369: 571-574 (1994); and Sauvage etal., Nature 369: 533-538 (1994)]. 트롬보포이에틴은 적어도 2개의 형태를 갖고, 겉보기 분자량이 25 kDa 및 31 kDa이고, 공통의 N-아미노산 서열을 갖는 당단백질이다. 참조, [Bartley, etal., Cell, 77: 1117-1124 (1994)]. 트롬보포이에틴은 잠재 Arg-Arg 절단 부위에 의해 분리되는 두개의 상이한 부위를 갖는 것으로 보인다. 아미노-말단 부위는 인간 및 마우스에서 고도로 보존되고, 에리트로포에틴 및 인터페론-a 및 인터페론-b와 일부 상동성을 갖는다. 카복시-말단 부위는 광범위한 종간 상이함을 나타낸다.
인간 TPO-R (c-mpl로서 공지됨)에 대한 DNA 서열 및 코딩된 펩티드 서열이 기술되어 있다. 참조, [Vigon, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5640-5644 (1992)]. TPO-R는 N-말단 부분의 4개의 보존성 C 잔기 및 막 부위에 인접한 WSXWS 모티프(서열번호 :1)를 포함하는, 세포외 영역의 공통 주고 디자인을 특징으로 하는 헤마토포이에틴 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원이다. 참조, [Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6934-6938 (1990)]. 수용체가 조혈에서 중요한 작용을 한다는 증거는 그의 발현은 마우스의 경우 지라, 골수, 또는 태아 간(참조, Souyri, et al. , Cell 63: 1137-1147 (1990)), 및 인간의 경우 거대핵세포, 혈소판, 및 CD34+ 세포(참조, Methia, et al. , Blood 82: 1395-1401(1993))로 제한된다는 관찰을 포함한다. 추가로, mpl RNA에 대한 합성 올리고뉴클레오티드 안티센스에 CD34+ 세포를 노출시킬 경우, 적혈구 또는 골수 콜로니 형성에는 영향을 주지 않으면서 거대핵세포 콜로니의 출현을 현저하게 저해한다. 몇몇 연구원들은 G-CSF 및 에리트로포에틴에 대한 수용체를 사용한 상황과 유사하게, 수용체는 호모다이머로서 작용한다고 가정하였다.
TPO-R에 대한 클로닝 유전자의 사용이 중요한 수용체의 작용제 연구를 촉진시킨다. 재조합 수용체 단백질의 사용을 통해 다양한 무작위 및 반작위적 펩티드 다양헝 형성 시스템에서 수용체-리간드 상호작용에 대한 연구를 할 수 있다. 상기 시스템은 미국 특허 제 6,251,864호, 제 6,083,913호, 제 6,121,238호, 제 5,932,546호, 제 5,869,451호, 제 6,506,362호, 제 6,465,430호 및 Cwirla, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382 (1990)에 개시되어 있고, 상기 각각은 본원에 참고 문헌으로서 인용된다.
저혈소판증을 앓는 환자에서 혈소판 수준 회복이 느리다는 것은 심각한 문제가 되며, 혈소판 재생을 가속화시킬 수 있는 혈액 성장 인자 작용제에 대한 연구가 시급화되고 있다. 본 발명은 그러한 작용제를 제공한다.
본 발명은 TPO-R에 대하여 강력한 결합 성질을 갖고, TPO-R을 활성화시킬 수 있으며, 공지된 TPO 작용제에 비해 잠재적으로 부작용을 감소시키는 정의된 저분자 펩티드 화합물에 관한 것이다. 따라서, 펩티드 화합물은 TPO에 의해 매개되는 이상(예: 화학 요법, 방사능 요법, 또는 골수 수혈로부터 유발된 저혈소판증)을 치료할 때의 치료적 목적, 및 조혈 메카니즘 및 거대핵세포 및 수임 선조 세포의 시험관내 확장에 대한 연구에서의 진단 목적에서 유용할 수 있다.
본 발명은 TPO-R에 대하여 강력한 결합 성질을 갖고, TPO-R을 활성화시킬 수 있으며, 공지된 TPO 작용제에 비해 잠재적으로 부작용을 감소시키는 정의된 저분자 펩티드 화합물에 관한 것이다. 따라서, 펩티드 화합물은 TPO에 의해 매개되는 이상(예: 화학 요법, 방사능 요법, 또는 골수 수혈로부터 유발된 저혈소판증)을 치료할 때의 치료적 목적, 및 조혈 메카니즘 및 거대핵세포 및 수임 선조 세포의 시험관내 확장에 대한 연구에서의 진단 목적에서 유용할 수 있다.
도 1은 TPO 화합물 1번과 선행 기술의 펩티드 화합물(본 명세서의 전체에서 "선행 기술의 펩티드 화합물" 이라고 함)의 활성을 나타내고 비교한 것이다. TPO 화합물 1번과 선행 기술의 펩티드 화합물의 차이점은 TPO 화합물 1번에서 (2-Nal)이 있는 자리에 선행 기술의 펩티드 화합물은 β-(1-나프틸)알라닌(1-Nal)를 갖는 것이다.
도 2는 페길화된(PEGylated) TPO 화합물 1번과 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물의 활성을 나타내고 비교한 것이다.
도 3는 페길화된(PEGylated) TPO 화합물 1번과 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물의 상대적인 효능을 입증하는, 래트 생체내에서의 혈소판 계수의 변화를 나타내고 비교한 것이다.
도 4 및 5는 각각 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물과 페길화된 TPO 화합물 1번을 사용할 때 용량에 의존적인 방식으로 순환 혈소판의 갯수 및 용적을 나타내고 비교한 것이다.
낮은 IC50과 TPO-R에 대한 더욱 강력한 결합 친화성이 관련성을 갖고 있는, 예를 들어, 미국 특허 제 5,869,451호의 실시예 3에서 설명하는 결합 친화성 에세이에 의해 측정된 바, 치료 및/또는 진단 목적에 적절한 펩티드 화합물은 약 2mM 미만의 IC50을 갖는다. 미국특허 제 5,869,451호의 에세이는 다음과 같다: 펩티드 화합물의 결합 친화성을 경합 결합 에세이(competition binding assay)에서 측정한다. 미량 역가판(microtiter plate)의 웰을 1mg 의 스트렙타비딘으로 코팅하고, PBS/1% BSA로 차단시킨 후, 50ng의 바이오티닐화된 항수용체 운동억제 항체(biotinylated anti-receptor immobilizing antibody;Ab179)를 첨가한다. 그리고 나서, 웰을 수용성 TPO-R 하베스트의 1:10 희석액으로 처리한다. 다양한 농도의 펩티드 화합물을 단백질(MBP-TPO156)에 결합하는 말토오스의 C-말단에 융합된 잔기 1-156으로 구성된 일정량의 불완전 형태의 TPO로 혼합시킨다. 펩티드 MBP-TPO156혼합물을 TPO-R 코팅된 웰에 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 배양시킨 후, PBS로 세척한다. 평형에 도약되는 펩티드의 양은 MBP에 대하여 지시되는 토끼의 항혈청을 첨가한 후, 염소 항-래빗 IgG를 활용한 알칼리성 포스파타제를 첨가하여 측정한다. 그 후, 각 웰에 있는 알칼리성 포스파타제의 양을 표준 방법을 사용하여 결정한다. 에세이는 펩티드 화합물 농도의 범위에 걸쳐서 진행되고, 결과는 y축이 결합된 MBP-TPO156의 양을, x축이 펩티드 화합물의 농도를 나타내는 도표로 그려진다. 그리고 나서 펩티드 화합물이 고정된 TPO-R에 결합된 MBP-TPO156 양(IC50)의 50%까지 감소할 때의 농도를 결정할 수 있다. 펩티드의 해리상수(Kd)는 이러한 에세이를 사용하여 측정된 IC50에 유사해야한다. 약제학적 목적을 위해 펩티드 화합물은 바람직하게 약 100μM이하의 IC50을, 더욱 바람직하게 500nM 이하의 IC50을 갖는다. 바람직한 일례로, 펩티드 화합물은 약 250 내지 약 8,000 달톤이다. 본 발명의 펩티드 화합물이 본 명세서에 기술된 바와 같이 친수성 폴리머와 올리고머화, 다이머화, 및/또는 유도화되는 경우, 상기 펩티드 화합물의 분자량은 실질적으로 더욱 클 것이며, 약 500 내지 약 120,000 달톤, 더욱 바람직하게 약 8,000 내지 약 80,000 달톤의 범위일 수 있다.
진단 목적을 위해 사용될 때, 본 발명의 펩티드 화합물은 바람직하게 검출가능한 표지로 표지하고, 따라서, 표지된 펩티드 화합물의 제조에서 상기와 같은 표지를 갖지 않는 펩티드 화합물은 중간체로서 작용한다.
분자량 및 상기 TPO-R에 대한 결합 친화성에 대한 정의된 조건을 충족시키는 펩티드 화합물은 자연발생되거나 합성된(자연적으로 발생되지 않은) 9개 이상의 아미노산을 포함한다.
따라서, 바람직한 펩티드 화합물은
(1) 분자량이 약 5000 달톤 미만이고,
(2) TPO-R에 대한 결합 친화성이 약 100μM이하의 IC50으로 표현되는 화합물 및 그의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함하되,
펩티드 화합물 중의 --C(O)NH-결합 0개 내지 모두는 -CH20C(O)NR--결합; 포스포네이트 결합; --CH2S(O)2NR--결합; --CH2NR--결합; --C(O)NR6--결합; 및 --NHC(O)NH--결합(여기에서, R은 수소 또는 저급 알킬 이고, R6은 저급 알킬이다)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 결합에 의해 대체되고,
펩티드 화합물의 N-말단은 -NRR1 그룹; --NRC(O)R 그룹; --NRC(O)OR 그룹; --NRS(O)2R 그룹; --NHC(O) NHR 그룹; 숙신이미드 그룹; 벤질옥시카보닐-NH--그룹; 및 저급 알킬, 저급 알콕시, 클로로, 및 브로모로 구성된 그룹으로부터 선택되는 페닐 환상에 1 내지 3개의 치환체를 갖는 벤질옥시카보닐-NH--그룹(여기에서, R 및 R1은 수소 및 저급 알킬로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된다)으로 구성된 그룹으로부터 선택되고;
추가로, 펩티드 화합물의 C-말단은 식 --C(O)R2(여기에서, R2는 하이드록시, 저급 알콕시, 및 -NR3R4(여기에서, R3 및 R4는 수소 및 저급 알킬로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, -NR3R4의 질소 원자는 임의로 사이클릭 펩티드를 형성하기 위하여 펩티드의 N-말단의 아민 그룹일 수 있다)로 구성된 그룹으로부터 선택된다)를 갖는다.
관련된 일면에서, 본 발명은 검출가능한 표지에 공유 결합된, 상기 기술된 바와 같은 펩티드 화합물을 포함하는 표지된 펩티드 화합물에 관한 것이다.
일면에서, 코어 펩티드 화합물은 아미노산 서열: (서열번호: 2)를 포함한다:
X9 X8 G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7
(여기에서, X9는 A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T, 또는 V이고; X8은 A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, 또는 V이고; X6은 β-(2-나프틸)알라닌(본 명세서에서 "2-Nal"로 언급함) 잔기이다. 더욱 바람직하게, X9는 A 또는 I이고; X8은 D, E, 또는 K이다. 추가로 X1은 C, L, M, P, Q, V이고; X2는 F, K, L, N, Q, R, S, T 또는 V이고; X3은 C, F,I, L, M, R, S, V 또는 W이고; X4는 20개의 유전적으로 코딩된 L-아미노산중 어느 것이고; X5는 A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V 또는 Y이고; X7은 C, G,I, K, L, M, N, R 또는 V이다).
특히 바람직한 펩티드 화합물은 아미노산 서열(서열번호: 7): I E G P T L R Q (2-Nal)L A A R (Sar)(여기에서, (2-Nal)은 β-(2-나프틸)알라닌이고 (Sar)은 사크로신이다)을 포함한다.
또다른 일면에서, 본 발명의 펩티드 화합물은 바람직하게 화합물의 친화성 및/또는 활성을 증가시키기 위하여 다이머화 또는 올리고머화한다. 다이머화된 바람직한 펩티드의 일례로 제한하는 것은 아니지만 하기를 포함한다:
Figure pat00001
(여기에서, X10은 사코신 또는 β-알라닌 잔기 (서열번호 : 7)이다). 상기 구조식은 하기 구조식:(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2으로 나타낼 수 있다. X10이 사코신인 경우, 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pat00002
(여기에서, (2-Nal)은 β-(2-나프틸)알라닌이고 (Sar)은 사크로신(서열번호: 7)이다). 또한, 본 펩티드 화합물은 본원에서 "TPO 화합물 1번"으로 언급되는 하기 구조식 (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar))2K-NH2으로 나타낼 수 있다.
추가의 일례로, 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 펩티드 화합물은 하나 이상의 다양한 폴리머와 공유 결합하는 펩티드 화합물이다. 적절한 친수성 폴리머는 제한하고자 하는 것은 아니지만, U. S. Patent No. 5,869, 451(상기의 전체 내용은 본 명세서에서 참고문헌으로서 인용된다)에 기술된 바와 같은 폴리알킬에테르, 예로서, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리옥시알켄, 폴리비날알코올, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 등을 포함한다.
본 명세서에 기술된 펩티드 화합물은 TPO에 의해 매개되는 질환의 예방 및 치료, 및 특히, 제한하는 것은 아니지만, 화학 요법, 방사능 요법, 또는 골수 수혈로부터 유할된 저혈소판증을 포함하는 혈액학적 질환을 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 TPO 작용제 치료에 대하여 민감함 질병을 앓는 환자는 치료학적 투여량 또는 용량의 본 발명의 펩티드 화합물을 받거나 투여받는, 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 본 명세서에 기술된 펩티드 화합물 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여용 제형, 및 흡입식 분제 및 액제 및 주사액 및 주입액을 포함하는 다양한 제형일 수 있다.
I. 정의 및 일반 파라미터
하기 정의는 본 명세서에 기술된 본 발명을 설명하기 위하여 사용된 다양한 용어의 범위 및 의미를 정의하고 설명하기 위하여 기술된다.
"작용제"는 그의 상보적인 생물학적으로 활성인 수용체에 결합하고, 후자를 활성화시켜 수용체에서 생물학적 반응을 유발하거나 앞서 존재하는 수용체의 생물학적 활성을 증시키는 생물학적으로 활성인 리간드를 언급한다.
"펩티드 화합물"은 아미노산 및/또는 아미노산 유도체 및/또는 아미노산 치환체로 가수분해하는 분자를 말한다.
"약제학적으로 허용가능한 염"은 의학 산업에서 통상 사용되는 본 분야에 공지된 방법에 의해 제조되는 비독성 알칼리 금속, 알칼리토 금속, 및 암모늄 염을 언급하고, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 바륨, 암모늄, 및 프로타민 아연 염을 포함한다. 용어는 또한 일반적으로 적절한 유기 또는 무기산과 본 발명의 화합물의 반응에 의해 제조되는 비독성 산 부가염을 포함한다. 대표적인 염으로 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 설페이트, 바이설페이트, 아세테이트, 옥살레이트, 발레레이트, 올레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 납실레이트 등을 포함한다.
"약제학적으로 허용가능한 산 부가염"은 유리 염기의 생물학적 효능 및 성질을 유지하고, 달리 바람직하지 않은 경우 무기산, 염산, 브롬산, 황산, 질한, 인사 등, 유기산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피브르산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 시남산, 만델산, 메탄폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 함께 생물학적으로 형성되지 않는 염을 언급한다. 프로드럭으로서의 약제학적으로 허용가능한 산 부가염의 설명을 위해 [Bundgaard, H. , supra]을 참조한다.
"약제학적으로 허용가능한 에스테르"는 에스테르 결합 가수분해시 카복실산 또는 알코올의 생물학적 효능 및 성질을 유지하고 달리 바람직하지 않은 경우 생물학적으로 형성되지 않는 에스테르를 언급한다. 프로드럭으로서의 약제학적으로 허용가능한 에스테르의 설명을 위해 [Bundgaard, H. , ed. , Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)]을 참조한다. 에스테르는 통상 상응하는 카복실산 및 알코올로부터 형성된다. 일반적으로, 통상의 합성 기술(참조, 예:March, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed. , John Wiley & Sons, New York (1992), 393-396 및 그의 인용된 참고문헌, 및 Mark, et al. , Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980).)에 의해 에스테르 형성을 수행할 수 있다. 에스테르의 알코올 성분은 통상 (i) 하나 이상의 이중 결합을 포함하거나 포함할 수 없고 분지형 탄소를 포함하거나 포함하지 않는 C2-C12 지방족 알코올 또는 (ii) C7-C12 방향족 또는 헤테로방향족 알코올을 포함할 것이다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 두개의 에스테르 및 동시에 그의 약제학적으로 허용가능한 산 부가염인 조성물의 용도를 주시한다.
"약제학적으로 허용가능한 아미드"는 아미드 결합 가수분해시 카복실산 또는 아민의 생물학적 효능 및 성질을 유지하고 달리 바람직하지 않은 경우 생물학적으로 형성되지 않는 아미드를 언급한다. 프로드럭으로서의 약제학적으로 허용가능한 아미드의 설명을 위해 [Bundgaard, H.,ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)]을 참조한다. 상기 아미드는 상응하는 복실산 및 아민으로부터 형성된다. 일반적으로, 아미드 형성은 통상의 합성 기술(참조, 예: March, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed. , John Wiley & Sons, New York (1992), p. 393 and Mark, et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980).)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 두개의 아미드 및 동시에 그의 약제학적으로 허용가능한 산 부가염인 조성물의 용도에 관한 것이다.
"약제학적으로 또는 치료학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 효능 및 생물학적 활성을 방해하지 않고 숙주 또는 환자에 비독성인 담체를 언급한다.
"입체이성체"는 분자량, 화학 조성, 및 구성이 동일하고 상이하게 그룹화된 원자를 갖는 화학 물질을 언급한다. 즉, 특정의 동일한 화학 부위는 공간상 상이한 오리엔테이션을 갖고 따라서, 순수한 경우, 편광 면을 회전시키는 능력을 갖는다. 그러나, 일부의 순수한 입체이성체는 너무 경미하기때문에 현 방법으로는 검출할 수 없는 광학 회전을 가질 수 있다. 본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 가질 수 있고, 이로써 다양한 입체이성체를 포함한다. 모든 입체이성체가 본 발명의 범주내 포함된다.
본 발명의 조성물에 적용되는 "치료학적-또는 약제학적-유효량"은 원하는 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 조성물의 양을 언급한다. 이 결과는 징후, 증상의 경감, 또는 질환의 유발, 또는 생물학적 시스템의 다른 원하는 변화일 수 있다. 본 발명에서 결과는 통상 감염 또는 조직 손상에 대한 면역학적 및/또는 염증 반응을 증가시키는 것을 포함할 것이다.
펩티드에서 아미노산 잔기는 하기와 같이 약칭된다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F; 류신은 Leu 또는 L; 이소류신은 Ile 또는 I; 메티오닌은 Met 또는 M; 발린은 Val 또는 V이고; 세린은 Ser 또는 S; 프롤린은 Pro 또는 P; 트레오닌은 Thr 또는 T; 알라닌은 Ala 또는 A; 티로신은 Tyr 또는 Y; 히스티딘은 His 또는 H; 글루타민은 Gln 또는 Q; 아스파라긴은 Asn 또는 N; 리신은 Lys 또는 K; 아스파트산은 Asp 또는 D; 글루탐산은 Glu 또는 E; 시스테인은 Cys 또는 C; 트립토판은 Trp 또는 W; 아르기닌은 Arg 또는 R; 및 글리신은 Gly 또는 G이다. 추가로, t-Buo는 t-부릴옥시 Bzl은 벤질, CHA는 사이클로헥실, Ac는 아세틸, Me는 메틸, Pen는 펜실아민, Aib는 아미노이소부티르산, Nva는 노르발린, Abu는 아미노부티르산, Thi는 티에닐알라닌, OBn는 O-벤질, hyp는 하이드록시프롤린이다.
펩티드 유사체는 주형 펩티드의 것과 유사한 성질을 갖는 비펩티드성 약물로서 의약 산업에 통상 사용된다. 비펩티드 화합물 타입을 "펩티드모사물질" 또는 "펩티드모사물질" 또는 "펩티드 모사물질"로 명명한다(Luthman, et al. , A Textbook of Drug Design and Development, 14: 386-406,2nd Ed. , Harwood Academic Publisher(1996); Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 33: 1699-1720 (1994); Fauchere, J. , Adv. Drug Res., 15: 29 (1986); Veber and Freidinger TINS, p. 392 (1985); and Evans, et al. , J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)(본 명세서에서 참고문헌으로서 인용된다). 치료학적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모사물질을 사용하여 동일하거나 증진된 치료학적 또는 예방학적 효능을 얻는다. 일반적으로, 펩티드 모사물질은 패러다임 폴리펩티드 (즉, 생물학적 또는 약물학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예로서, 자연발생적으로 발생된 수용체-결핍 폴리펩티드와 구조적으로 유사하지만, 하기 문헌 [Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of amidno acid, peptide, and [proteins, B. Weinstein,eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F. , Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, 펩티드 Backbone Modification(general review); Morley, Trends Pharm. Sci. pp. 463-468 (1980), (general review); Hudson, et al. , Int. J. Pept. Prot. Res. , 14: 177-185 (1979); Spatola, etal., Life Sci., 38: 1243-1249 (1986); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans.I, 307-314 (1982);Almquist, etal. , J. Med. Chem. , 23: 1392-1398, (1980); Jennings-White, et al., tetrahedron Lett. 23: 2533 (1982); Szelke, et al. , European Appln. EP 45665 (1982); Holladay, et al., tetrahedron Lett. , 24: 4401-4404 (1983); and Hruby, Life Sci. , 31: 189-199(1982)](본 명세서에서 참고문헌으로서 인용된다)에 기술된 본 분야의 공지 방법에 의해 하나 이상의 펩티드 결합은 임의로 대체 결합, --CH2NH--, --CH2S--등으로 대체될 수 있다. 특히 바람직한 비펩티드 결합은 --CH2NH--이다. 상기 펩티드 모사물질은 예를 들면, 생산면에서 더욱 경제적이고, 화학적 안정성이 우수하고, 약물학적 성질(반감기, 흡수도, 잠재능, 효능 등)이 더욱 우수하고, 특이성(예: 생물학적 활성의 광범위한 범위)이 변화되고, 항원성이 감소된 것과 같이, 폴리펩티드 일례로부터 현저한 장점을 가질 수 있다. 펩티드 모사물질의 표지화는 일반적으로 직접 또는 스페이서(예: 아미드 그룹)을 통해 측량적 구조-활성 데이타 및/또는 분자 모델링에 의해 예측되는 펩티도모사물질상의 비간섭(non-interfering) 위치(들)과 하나 이상의 표지의 공유 결합을 포함한다. 비간섭 위치는 일반적으로 펩티도모사물질이 결합하는 거대분자(들)(예: 이뮤노글루블린 슈퍼패밀리 분자)와 직접 접촉하지 않고 이로써 치료학적 효능을 일으키는 위치이다. 펩티드 모사물질의 유도화(예: 표지화)는 실질적으로 펩티도모사물질의 바람직한 생물학적 또는 약물학적 활성을 간섭해서는 안된다. 일반적으로, 수용체-결합 펩티드의 펩티드 모사물질은 고도의 친화성으로 수용체과 결합하고, 검출가능한 생물학적 활성을 갖는다(즉, 하나 이상의 수용체-매개의 표현형 변화에 대한 작용제 또는 길항제이다).
공통 서열중 하나 이상의 아미노산을 동일한 타입의 D-아미노산으로 치환(예: L-리신 대신 D-리신)하여 더욱 안정적인 펩티드를 생산할 수 있다. 추가로, 본 분야에 공지된 방법(Rizo, et al. , Ann. Rev. Biochem. , 61: 387 (1992), (참고문헌으로 인용됨); 예로서, 펩티드를 폐환화시키는 분자내 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 가하여 공통 서열 또는 실질적으로 일치하는 공통 서열 변이를 포함하는 제약적 펩티드를 생산할 수 있다.
"검출가능한 표지"는 본 발명의 펩티드 화합물과 공유 결합하였을 때, 펩티드 화합물을 투여받은 환자의 생체내에서 펩티드 화합물이 검출되도록 하는 물질을 언급한다. 적절한 검출가능한 표지는 본 분야에 잘 공지되어 있고, 예로서, 방사선동위원소, 형광 표지(예: 플루오레세인) 등을 포함한다. 사용하는 특정 검출가능한 표지는 중요하지 않고, 사용하는 표지의 양에 비례하여, 사용하는 표지의 양에서의 표지의 독성에 따라 선택한다. 상기 인자에 대한 표지의 선별은 본 분야의 기술내 존재하다.
펩티드 화합물과 검출가능한 표지의 공유 결합은 본 분야의 공지된 통상의 방법에 의해 수행된다. 예로서, 검출가능한 표지로서 125I 방사능동원소를 사용할 경우, 아미노산 티로신을 펩티드 화합물로 혼입시키고 펩티드를 요오드화하여 펩티드 화합물과 125I의 공유 결합을 수행할 수 있다(참조, 예: Weaner, etal., Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compound, pp. 137-140 (1994)). 본 분야에 공지되어 있는 화학법에 의해 티로신을 펩티드 화합물의 N 또는 C 말단에 혼입시킬 수 있다. 유사하게, 32P는 예로서, 통상의 화학법에 의해 펩티드 화합물상의 하이드록실 그룹을 통해 포스펩티드 부위로서 펩티드 화합물상에 혼입될 수 있다.
II . 개요
본 발명은 TPO-R과 결합하고 그를 활성화시키거나, 달리 언급하지 않는 한, TPO 작용제로서 작용하는 펩티드 화합물을 제공한다. 이들 펩티드 화합물은 "리드" 펩티드 화합물 및 리드 펩티드 화합물과 동일하거나 유사한 분자 구조 또는 모양을 갖지만, 가수분해 또는 단백질분해에 대한 감수성과 관련하여, 및/또는 다른 생물학적 성질과 관련하여 상이한, 예로서 수용체에 대한 친화성이 증가되도록 구성된 "유도체" 펩티드 화합물을 포함한다. 본 발명은 또한 유효량의 펩티드 화합물, 및 특히 혈액학적 질환, 및 특히, 화학 요법, 방사능 요법, 또는 골수 수혈과 관련된 저혈소판증의 치료에 유용한 펩티드 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
코어 펩티드 화합물은 아미노산 서열: (서열번호 : 2) X9 X8 G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7, (여기에서, X6는 β-(1-나프틸)알라닌이고 X9는 A, C, E, G,I, L, M, P, R, Q, S, T, 또는 V이고; X8은 A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, 또는 V이다. 더욱 바람직하게, X9는 A 또는 I이고; X8은 D, E, 또는 K이다. 추가로, X1은 C, L, M, P, Q, V이고; X2 는 F, K, L, N, Q, R, S, T 또는 V이고; X3은 C, F,I, L, M, R, S,V 또는 W이고; X4 는 유전적으로 코딩된 20개의 L-아미노산중 하나이고; X5는 A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V 또는 Y이고; X7은 C, G,I, K, L, M, N,R 또는 V이다)을 포함할 수 있다.
그러나, 본 명세서에 추가로 기술되는 바와 같이, X6을 β-(2-나프틸)알라닌으로 대체하여 화합물은 β-(1-나프틸)알라닌을 포함하는 화합물과 상이한 특성을 제공할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 특히 바람직한 펩티드는 아미노산 서열 (서열번호 : 7):I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar)를 포함한다.
또다른 일면에서, 본 발명의 펩티드 화합물은 바람직하게 다이머 또는 올리고머화되어 화합물의 활성 및/또는 친화성을 증가시킨다. 바람직한 다이머화된 펩티드 화합물의 예로서 제한하는 것은 아니지만, 하기를 포함한다:
Figure pat00003
여기에서, X10은 사코신 또는 β-알라닌 잔기(서열번호 : 7)이다. 하나의 X10 잔기는 사르코신일 수 있고 다른 잔기는 β-알라닌일 수 있다. 상기 구조는 하기 (H-IEGPTLRQ (2-Nal)LAARX10)2K-NH2으로 나타낼 수 있다.
바람직한 펩티드 화합물은 하기와 같다:
Figure pat00004
여기에서, (2-Nal)은 β-(2-나프틸)알라닌이고, (Sar)은 사르코신(서열번호: 7)이다. 이러한 펩티드 화합물은 본 명세서에서 "TPO 화합물 1번"으로 언급된다.
IC50이 약 100 mM 초과인 펩티드 화합물에는 본 발명의 진단 또는 치료적 일면에서의 사용을 허용하는 충분한 결합능이 결여되어 있다. 바람직하게, 진단 목적을 위해 펩티드 화합물의 IC50은 약 2 mM 미만이고, 약제학적 목적을 위해서 펩티드 화합물의 IC50은 약 100μM 미만이다.
도 1은 표준 상대 발광 유니트 에세이 기술을 사용하여 선행 기술의 펩티드 화합물 1개 배취와 3개의 상이한 배취의 TPO 화합물 1번의 활성을 비교한다. 에세이에서는 인간 TPO 수용체를 안정적으로 발현시키도록 공학처리된 뮤린 세포 및 fos 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라제 리포터 작제물을 사용한다. 선행 기술의 펩티드 화합물과 TPO 화합물 1번의 차이점은 TPO 화합물 1번에서 (2-Nal)자리에 선행 기술의 펩티드 화합물은 β-(1-나프틸)알라닌(1-Nal)을 갖는 것이다. 도 1에서 TPO 화합물 1번은 2-Nal로, 선행 기술의 펩티드 화합물은 1-Nal(선행 기술)로 언급된다. 도 1로부터 나타낸 바와 같이, 활성은 각 화합물에 대하여 유사하다.
도 2는 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물의 여러 개의 배취와 페길화된 TPO 화합물 1번의 여러 개의 상이한 배취의 활성을 비교한다(본 발명의 화합물의 페길화는 하기에 더욱 상세히 설명한다). 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물의 두개의 배취 모두는 실질적으로 비-페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물과 동일한 수준의 활성을 갖는 고도한 활성을 나타낸다. 남아있는 라인들은 페길화된 TPO 화합물 1번의 상이한 배취들의 활성을 설명해 준다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 이 모델에서, 후자는 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물과 비교하여 더욱 낮은 활성을 갖는다. 도 2에서, 페길화된 TPO 화합물 1번은 PEG-2-Nal로, 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물은 PEG-1-Nal(선행 기술)로 나타내었다.
도 3은 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물과 페길화된 TPO 화합물 1번의 상대적인 효능을 입증하는 것이다. 래트 모델을 통해, 도 3은 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물과 페길화된 TPO 화합물 1번을 투여한 후 생체 내에서 혈소판 계수의 변화를 나타낸다. 도 3에 나타난 바와 같이, 페길화된 TPO 화합물 1번의 최고 투여량은 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물의 최저 투여량과 동일한 활성을 갖는다. 효능이 더 낮은 화합물이 표적 세포에 대하여 덜 자극적일 수 있고, 이는 차후 사이클의 화학 요법에 따른 악화된 저혈소판증과 같은 표적 세포의 과잉자극에 의해 유발되는 부작용의 위험을 감소시킬 수 있다. 도 3에서, 페길화된 TPO 화합물 1번은 PEG-2-Nal로, 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물은 PEG-1-Nal(선행 기술)로 나타내었다.
도 4 및 5는 정상 마우스에서 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물 및 페길화된 TPO 화합물 1번의 머리머리(head-to-head) 투여 반응의 결과를 나타낸다. 도 4 및 5에서, 페길화된 TPO 화합물 1번은 PEG-2-Nal로, 페길화된 선행 기술의 펩티드 화합물은 PEG-1-Nal(선행 기술)로 나타내었다. 도 4는 혈소판 수준의 증가를 나타내고 도 5는 처리 6일 후 평균 혈소판 용적을 나타낸다. 투여량 범위는 10 내지 3000μg/kg이었다. 두 펩티드 화합물은 두 화합물에 대하여 30ug/kg만큼 낮은 투여량에서 관찰된 대조군 그룹에 상대적으로 증가시키면서 투여량-의존 방식으로 순환 혈소판 개수를 증가시켰다. 최대 반응에서, 이들 펩티드 화합물은 대조군 값의 4배 초과의 수준까지 혈소판 계수를 증가시켰다. 이들 화합물에 대한 용량-반응 곡선은 유사하고, 이는 이들 모델에서 이들 엔드포인트에 기초한 2개의 시험 아티클간에는 실질적으로 차이가 없다는 것을 나타낸다.
IV . 펩티드 화합물의 제조
A. 고체상 합성
본 발명의 펩티드 화합물을 예로서, 표준 고체상 기술과 같은 본 분야의 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 표준 방법은 배제 고체상 합성, 부분 고체상 합성 방법, 단편 축합, 통상의 용액 합성, 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 참조, 예:Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 85: 2149 (1963)(본 명세서에서 참고문헌으로서 인용된다). 고체상에서 합성은 통상 알파-아미노 보호 수지를 사용하여 펩티드의 C-말단으로부터 시작된다. 적절한 출발 물질은 예로서, 필요한 알파-아미노산을 클로로메틸화된 수지, 하이드록시메틸 수지, 또는 벤질하이드릴아민 수지에 부착시켜 제조할 수 있다. Bio Rad Laboratories(Richmond, CA)에 의해 상표명 BIO-BEADS SX-1로 시판되고 있고, 하이드록시메틸 수지의 제조법은 [Bodonszky, et al. , Chem. Ind. (London), 38: 1597 (1966)]에 기술되어 있다. 벤질하이드릴아민(BHA)수지는 [Pietta and Marshall, Chem. Commn. , 650 (1970)]에 기술되어 있고, 하이드로클로라이드 형태로 Beckman Instruments, Inc.(Palo Alto, Calif._로부터 상업적으로 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩티드 화합물은 [Gisin, Helv. Chim. Acta., 56: 1467 (1973)]에 기술된 방법에 따라 세슘 중탄산염 촉매의 도움으로 클로로메틸화된 수지와 알파-아미노 보호된 아미노산을 커플링시켜 제조될 수 있다. 개시 커플링 후, 알파-아미노 보호된 아미노산을 실온에서 유기 용매중 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 염산(HCl) 용액을 포함하는 시약을 선택하여 제거한다. 알파-아미노 보호 그룹은 펩티드의 단계별 합성 분야에서 유용한 것으로 공지되어 있는 것이다.
알파-아미노 보호 그룹은 펩티드의 단계적인 합성 분야에서 유용한 것으로 알려져 있다. 아실형 보호 그룹(예: 포르밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸), 방향족 우레탄형 보호 그룹(예: 벤질옥시카보닐 (Cbz) 및 치환된 Cbz), 지방족우레탄 보호 그룹(예: t-부틸옥시카보닐 (Boc), 이소프로필옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐) 및알킬형 보호 그룹(예: 벤질, 트리페닐메틸)이 포함된다. Boc 및 Fmoc가 바람직한 보호 그룹이다. 측쇄 보호 그룹은 커플링시 손상되지 않고 커플링시 또는 아미노-말단 보호 그룹 탈보호시 분리되지 않는다. 측쇄 보호 그룹은 표적 펩티드를 변화시키지 않는 반응 조건하에서 최종 펩티드의 합성이 종결되었을 때 제거될 수 있다.
Tyr에 대한 측쇄 보호 그룹은 테트라하이드로피라닐, t-부틸, 트리틸, 벤질, Cbz, Z--Br--Cbz, 및 2,5-디클로로벤질을 포함한다. Asp에 대한 측쇄 보호 그룹은 벤질, 2,6-디클로로벤질, 메틸, 에틸 및 사이클로헥실을 포함한다. Thr 및 Ser에 대한 측쇄 보호 그룹은 아세틸, 벤조일, 트리틸, 테트라하이드로피라닐, 벤질, 2,6-디클로로벤질, 및 Cbz를 포함한다. Thr 및 Ser에 대한 측쇄 보호 그룹은 벤질이다. Arg에 대한 측쇄 보호 그룹은 니트로, 토실(Tos), Cbz, 아다만틸옥시카보닐 메시토일설포닐(Mts), 또는 Boc를 포함한다. Lys에 대한 측쇄 보호 그룹은 Cbz, 2-클로로벤질옥시카보닐 (2-Cl--Cbz), 2-브로모벤질옥시카보닐 (2-BrCbz), Tos, 또는 Boc를 포함한다.
알파-아미노 보호 그룹를 제거한 후, 남은 보호된 아미노산을 원하는 순서에 따라 단계적으로 커플링시킨다. 과량의 각 보호된 아미노산을 적절한 카복실 그룹 활성제, 예로서, 용액, 예를 들면, 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2), 디메틸 포름아미드 (DMF) 혼합물중 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC)를 사용한다.
원하는 아미노산 서열을 완성시킨 후, 원하는 펩티드를 트리플루오로아세트산 또는 수소 플루오라이드(HF)와 같은 시약으로 처리하여 수지 지지체로부터 해리시켜, 수지로부터 펩티드를 절단시킬 뿐만 아니라 남아있는 모든 측쇄 보호 그룹을 절단시킨다. 클로로메틸화된 수지를 사용할 때, 수소 플루오라이드 처리하여 유리 펩티드산을 형성한다. 벤즈하이드릴아민 수지를 사용할 경우, 수소 플루오라이드 처리하여 직접 유리 펩티드 아미드를 수득한다. 다르게는, 클로로메틸화된 수지를 사용할 경우, 암모니아로 펩티드 수지를 처리하여 측쇄 보호된 펩티드를 해리시켜 원하는 측쇄 보호된 아미드를 수득하거나, 알킬아민으로 처리하여 측쇄 보호된 알킬아미드 또는 디알킬아미드를 수득할 수 있다. 측쇄 보호는 수소 플루오라이드로 처리하는 통상의 양식으로 제거하여 유리 아미드, 알킬아미드, 또는 디알킬아미드를 수득한다.
이들 고체상 펩티드 합성 공정은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 추가로 [John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid phase Peptide Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984)]에 기술되어 있다.
B. 합성아미노산
본 방법을 사용하여 20개의 자연발생적으로 발생된 유전적으로 코딩된 아미노산외의 아미노산이 본 발명의 화합물의 1, 2개 이상의 위치에서 치환된 펩티드를 합성할 수 있다. 다른 측쇄, 예로서, 알킬, 저급 알킬, 사이클릭 4-, 5-, 6-, 내지 7-원 알킬, 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 하이드록시, 카복시 및 그의 저급 에스테르 유도체 그룹, 및4-, 5-, 6-, 내지 7-원 헤테로사이클릭으로 20개의 유전적으로 코딩된 아미노산(또는 D 아미노산)의 자연발생적으로 발생된 측쇄를 대체할 수 있다. 특히, 프롤린 잔기의 환 크기가 5원으로부터 4,6, 또는 7원으로 변형된 프롤린 유사체를 사용할 수 있다. 사이클릭 그룹은 포화되거나 불포화될 수 있고, 불포화인 경우, 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 헤테로사이클릭 그룹은 바람직하게 하나 이상의 질소, 산소, 및/또는 황 헤테로원자를 포함한다. 상기 그룹의 예로서, 푸라자닐, 푸릴,이미다졸리디닐, 이미다졸릴,이미다졸리닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 모르폴리닐 (예: 모르폴리노), 옥사졸릴, 피페라지닐 (예: 1-피페라지닐), 피페리딜 (예:1-피페리딜, 피페리디노), 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐 (예:1-피롤리디닐), 피롤리닐, 피롤릴, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 티오모르폴리닐 (예: 티오모르폴리노), 및 트리아졸릴을 포함한다. 이들 헤테로사이클릭 그룹은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 그룹이 치환되는 경우, 치환체는 알킬, 알콕시, 할로겐, 산소, 또는 치환되거나 치환되지 않은 페닐일 수 있다.
인산화에 의해 본 발명의 펩티드를 용이하게 변형시킬 수 있고(참조, 예: W. Bannwarth, et al. , Biorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6 (17): 2141-2146 (1996) ), 본 발명의 화합물의 펩티드 유도체를 제조하는 다른 방법은 [Hruby, et al., Biochem. J.,268 (2): 249-262 (1990)]에 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드 화합물은 또한 유사한 생물학적 활성을 갖는 펩티드 모사물질을 제조하기 위한 기초로서 작용한다.
C. 말단 변형
본 분야의 기술자들은 상응하는 펩티드 화합물과 동일하거나 유사한 바람직한 생물학적 활성을 갖되, 용해도, 안정성, 및 가수분해 및 단백질 분해에 대한 감수성과 관련하여 펩티드 화합물보다 더욱 바람직한 활성을 갖는 펩티드 화합물을 작제하기 위하여 다양한 기술이 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 참조, 예로서, [Morgan, et al. , Ann. Rep. Med. Chem. , 24: 243-252 (1989)]. 하기는 N-말단 아미노 그룹, C-말단 카복실 그룹에서 변형된 펩티드 화합물을 제조하고/거나 펩티드중 하나 이상의 아미도 결합을 비아미도 결합으로 변화시키는 방법을 기술한다. 2개 이상의 변형은 펩티드 화합물 구조에서 커플링될 수 있다는 것을 이해할 것이다(예: C-말단 카복실 그룹에서의 변형 및 펩티드 화합물 중 2개의 아미노산 사이의 -CH2-카바메이트 결합 포함).
1. N-말단 변형
펩티드 화합물은 통상 유리산으로서 합성되지만, 상기 언급한 바와 같이 아미드 또는 에스테르로서 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 펩티드 화합물의 아미노 및/또는 카복실 말단을 변형시켜 본 발명의 다른 화합물을 생산할 수 있다. 아미노 말단 변형은 메틸화, 아세틸화, 벤질옥시카보닐 그룹 첨가, 또는 RCOO--(여기에서, R은 그룹은 나프틸, 아크리디닐, 스테로이딜, 및 유사 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택된다)으로 정의되는 카복실레이트 작용기를 포함하는 차단 그룹으로 아미노 말단 차단을 포함한다. 카복시 말단 변형은 유기산을 카복스아미드 그룹으로 대체하거나 카복시 말단에서 사이클릭 락탐을 형성하여 구조적 제한을 도입하는 것을 포함한다.
아미노 말단 변형은 상기 언급한 바와 같고 알킬화, 아세틸화, 카보벤조일 그룹 첨가, 숙신이미드 그룹 형성 등을 포함한다(참조, 예: Murray, et al. , Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5thed., Vol. 1, Manfred E. Wolf, ed. , John Wiley and Sons, Inc. (1995).) 특히, N-말단 아미노 그룹은 하기와 같이 반응시킬 수 있다:
(a) 산 할라이드 또는 대칭형 무수물과 반응시켜 식 RC(O)NH--(여기에서, R은 상기 정의된 바와 같다)의 아미드 그룹을 형성한다. 전형적으로, (예: 디클로로메탄) 바람직하게 과량(예: 약 10 동등량)의 3급 아민, 예로서, 디이소프로필에틸아민을 포함하는 불활성 희석제중 펩티드에 약 동몰량 또는 과량(예: 약 5 동등량)의 산 할라이드를 접촉시켜 반응시 생성된 산을 제거하여 반응을 수행할 수 있다. 반응 조건은 달리 언급하지 않는 한 통상의 것이다(예: 30분동안 실온). 저급 알킬 N-치환을 제공하기 위하여 말단 아미노를 알킬화한 후 상기 기술한 바와 같은 산 할라이드로 반응시켜 식 RC(O)NR--의 N-알킬 아미드 그룹을 제공할 것이다;
(b) 숙신산 무수물과 반응시켜 숙신아미드 그룹을 형성한다. 이에 앞서, 대략 동등량 또는 과량의 숙신산 무수물 (예: 약 5 동등량)을 사용할 수 있고 아미노 그룹은 적절한 불활성 용매(예: 디클로로메탄)중 과량(예: 10 동등량)의 3급 아민, 예로서 디이소프로필에틸아민을 사용하는 것을 포함하는 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해 숙신이미드로 전환된다. 참조, 예로서, Wollenberg, et al. , U. S. Pat. No. 4,612, 132(본 명세서에서 참조 문헌으로서 인용된다). 숙신 그룹은 예를 들면, 통상의 방식으로 제조된 --SR 치환체 또는 알킬로 치환되어 펩티드 N-말단에 치환된 숙신아미드를 제공하는 것을 이해할 것이다. 상기 알킬 치환체는 [Wollenberg, et al. , supra]에 기술된 방식으로 저급 올레핀을 말레산 무수물과 반응시켜 제조하고, --SR 치환체는 RSH를 말레산 무수물(여기에서, R은 상기 정의된 바와 같다)과 반응시켜 제조한다;
(c) 바람직하게 3급 아민을 포함하는 적절한 불활성 희석제(예: 디클로로메탄)중 대략 동량 또는 과량의 CBZ--Cl (즉, 벤질옥시카보닐 클로라이드) 또는 치환된 CBZ--Cl과 반응시켜 벤질옥시카보닐-NH--또는 치환된 벤질옥시카보닐-NH--그룹을 형성하여 반응시 생성된 산을 제거한다;
(d) 적절한 불활성 희석제(디클로로메탄)중 동량 또는 과량(예: 5 동등량)의 R--S(O)2 Cl과 반응시켜 설폰아미드 그룹을 형성하여 설폰아미드로 말단 아미드를 전환시킨다(여기에서, R은 상기 정의된 바와 같다). 바람직하게, 반응시 생성된 산을 제거하기 위하여 불활성 희석제는 과량의 3급 아민 (예: 10 동등량), 예로서, 디이소프로필에틸아민을 포함한다. 반응 조건은 달리 언급하지 않는 한 통상의 것이다(예: 실온에서 30분);
(e) 적절한 불활성 희석제(예: 디클로로메탄)중 동등량 또는 과량(예: 5 동등량)의 R--OC(O)Cl 또는 R--OC(O)OC6H4-p-N02과 반응시켜 카바메이트 그룹을 형성하여 말단 아민을 카바메이트로 전환시킨다(여기에서, R은 상기 정의된 바와 같다). 바람직하게, 반응시 생성된 산을 제거하기 위하여 불활성 희석제는 과량의(예: 약 10 동등량) 3급 아민, 예로서, 디이소프로필에틸아민을 포함한다. 반응 조건은 달리 언급하지 않는 한 통상의 것이다(예: 실온에서 30분);
(f) 적절한 불활성 희석제(예: 디클로로메탄)에서 동량 또는 과량(예: 5 동등량)의 R-N=C=O과 반응시켜 우레아 그룹을 형성하여 말단 아민을 우레아 그룹으로 전환시킨다(즉, RNHC(O)NH--)(여기에서, R은 상기 정의된 바와 같다). 바람직하게, 불활성 희석제는 과량의(예: 약 10 동등량) 3급 아민, 예로서, 디이소프로필에틸아민을 포함한다. 반응 조건은 달리 언급하지 않는 한 통상의 것이다(예: 실온에서 약 30분).
2. C-말단 변형
C-말단 카복실 그룹이 에스테르로 대체된 펩티드 화합물(즉, --C(O)OR (여기에서, R은 상기 정의된 바와 같다))을 제조할 때, 펩티드 산을 제조하기 위하여 사용된 수지를 사용하고, 측쇄 보호된 펩티드를 염기 및 적절한 알코올, 예로서 메탄올로 절단시킨다. 불소화수소를 처리하는 통상의 양식으로 측쇄 보호 그룹을 제거하여 원하는 에스테를 수득한다.
C-말단 카복실 그룹이 아미드--C(O)NR3R4로 대체된 펩티드 화합물을 제조할 때, 벤질하이드릴아민 수지를 펩티드 합성용 고체 지지체로서 사용한다. 합성 종결시 지지체로부터 펩티드를 유리시키기 위한 수소화불소 처리를 통해 유리 펩티드 아미드를 수득한다(즉, C-말단은 --C(O)NH2이다). 다르게는, 지지체로부터 측쇄 보호된 펩티드를 절단하기 위한 암모니아와의 반응과 커플링된 펩티드 합성시 클로로메틸화된 수지를 사용하여 유리 펩티드 아미드를 수득하고 알킬아민 또는 디알킬아민과의 반응을 통해 측쇄 보호된 알킬아미드 또는 디알킬아미드 (즉, C-말단은 C(O)NRR1(여기에서, R 및 R1은 상기 정의된 바와 같다)을 수득한다. 측쇄 보호는 수소화불소와의 처리에 의해 통상의 양식으로 제거하여 유리 아미드, 알킬아미드, 또는 디알킬아미드를 수득한다.
본 발명의 펩티드 화합물을 폐환화시키거나, 펩티드 화합물의 말단에서 데스아미노 또는 데스카복시를 도입시켜 펩티드 화합물의 구조를 제한하거나 프로테아제의 감수성을 감소시키기 위하여 말단 아미노 또는 카복시 그룹을 존재하지 않도록 할 수 있다. 본 발명의 화합물의 C-말단 작용성 그룹은 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 하이드록시, 및 카복시, 및 그의 저급 에스테르 유도체, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
N-말단 및 C-말단 변형외에도, 펩티드 모사물질을 포함하는 본 발명의 펩티드 화합물은 하나 이상의 다양한 친수성 폴리머로 변형되거나 그와 함께 공유 결합할 수 있다. 친수성 폴리머로 펩티드 화합물을 유도화시킬 때 그의 용해도 및 폐환화 반감기는 증가되고 그의 면역원성은 차단된다는 것을 발견하게 되었다. 거의 없거나 있다면 그의 결합 활성은 감소하여 하기는 수행될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기에 적절한 비단백질성 폴리머는 제한하고자 하는 것은 아니지만, 폴리알킬에테르, 예로서, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리옥시알켄, 폴리비날알코올, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 덱스트란 및 덱스트란 유도체 등을 포함한다. 일반적으로, 상기 친수성 폴리머의 평균 분자량은 약 500 내지 약 100,000 달톤, 더욱 바람직하게 약 2,000 내지 약 40,000 달톤 및, 더욱더 바람직하게, 약 5,000 내지 약 20,000 달톤 범위이다. 바람직한 일면에서, 상기 친수성 폴리머의 평균 분자량은 약 5,000 달톤, 10,000 달톤 및 20,000 달톤이다.
본 발명의 펩티드 화합물은 Zallipsky, S. , Bioconjugate Chem. , 6: 150-165 (1995); Monfardini, C, et al. , Bioconjugate Chem. , 6: 62-69 (1995); U. S. Pat. No. 4,640, 835; U. S. Pat. No. 4,496, 689; U. S. Pat. No. 4,301, 144; U. S. Pat. No. 4,670, 417; U. S. Pat. No. 4,791, 192; U. S. Pat. No. 4,179, 337 또는 WO 95/34326(본 명세서에서 참조문헌으로서 전체적으로 인용된다)에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 상기 폴리머에 커플링되거나 그로 유도화될 수 있다.
현 바람직한 일면에서, 본 발명의 펩티드 화합물은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 유도화된다. PEG는 2개의 말단 하이드록실 그룹을 갖는 에틸렌 옥사이드 반복 유니트의 선형, 수용성 폴리머이다. PEGs는 통상 약 500 달톤 내지 약 40,000 달톤 범위의 분자량에 의해 분류된다. 현 바람직한 일면에서, 사용되는 PEGs의 분자량은 5,000 달톤 내지 약 20,000 달톤 범위이다. 본 발명의 펩티드 화합물과 커플링되는 PEGs는 분지형 또는 비분지형일 수 있다(참조, 예: Monfardini, C. , et al. , Bioconjugate Chem. , 6: 62-69 (1995)). PEGs는 Shearwater Polymers, Inc.(Huntsville, Ala.)(현재 Nektar Therapeutics(San Carlo, CA)의 일부), Sigma Chemical Co. 및 다른 회사로부터 상업적으로 이용할 수 있다. 상기 PEGs는 제한하고자 하는 것은 아니지만, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜숙시네이트(MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES), 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카보닐 (MePEG-IM)을 포함한다.
간략하게, 일 실시예에 있어서, 사용하는 친수성 폴리머, 예로서, PEG는 비반응성 그룹 예를 들면, 메톡시 또는 에톡시 그룹에 의해 말단에 바람직하게 캡핑된다. 이하, 폴리머는 시아누 할라이드(예: 시아누 클로라이드, 브로마이드 또는 플루오라이드)와 같은 적절한 활성화제, 디이미다졸, 및 무수화물(예: 디할로숙신산 무수물, 예로서, 디브로모숙신산 무수물), 아실 아지드, p-이다조이움벤질 에테르, 3-(p-디아조늄페녹시)-2-하이드록시프로필에테르) 등과 반응시켜 다른 말단을 활성화시킨다. 활성화된 폴리머를 본 발명의 펩티드 화합물과 반응시켜 폴리머로 유도화된 펩티드 화합물을 수득한다. 다르게는 본 발명의 펩티드 화합물의 작용성 그룹을 폴리머와의 반응을 위해 활성화시키거나, 두개의 그룹을 공지된 커플링 방법을 사용하여 협동 커플링 반응에서 결합시킬 수 있다. 본 발명의 화합물은 본 분야의 기술자에 공지되고 그에 의해 사용될 수 있는 다수의 다른 반응 도식을 사용하여 PEG도 유도화될 수 있다.
펩티드 화합물이 친수성 폴리머로 유도화되는 경우, 그의 용해도 및 폐환화 반감기는 증가되고 그의 면역원성은 감소하게 된다. 상기는 그의 생물학적 활성을 거의 손실시키지 않고 수행될 수 있다. 바람직한 일면에서, 유도화된 펩티드는 변형되지 않는 펩티드보다 0.1 내지 0.01배의 활성을 갖는다. 더욱 바람직한 일면에서, 유도화된 펩티드는 변형되지 않는 펩티드보다 0.1 내지 1배의 활성을 갖는다. 더욱더 바람직한 일면에서 유도화된 펩티드는 변형되지 않는 펩티드보다 우수한 활성을 갖는다.
D. 백본 변형
본 발명의 화합물의 펩티드 유도체를 제조하는 다른 방법은 [Hruby, et al., Biochem J. , 268 (2): 249-262 (1990)(본 명세서에 참고문헌으로 인용된다)]에 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드 화합물은 또한 유사한 생물학적 활성을 갖는 비펩티드성 화합물에 대한 구조 모델로서 작용한다. 본 분야의 기술자는 다양한 기술은 리드 펩티드 화합물과 동일하거나 유사하지만, 가수분해 또는 단백질분해에 대한 감수성과 관련하여 리드보다 더욱 바람직한 활성을 갖는 화합물을 작제하는 것에 이용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. [참조, Morgan, et al. , Ann. Rep. Med. Chem. , 24: 243-252 (1989)(참고 문헌으로서 인용됨)]. 이 기술은 포스포네이트, 아미데이트, 카바메이트, 설폰아미드, 2차 아민, 및 N-메틸아미노산으로 구성된 백본으로 펩티드 백본을 대체하는 것을 포함한다.
적절한 시약은 예로서, 아미노산의 카복실 그룹이 상기 결합중 하나를 형성하기에 적절한 부위로 대체된 아미노산 유사체를 포함한다.
유사하게, 펩티드중 아미도 결합과 포스포네이트 결합로의 대체는 U. S. 특허 제 5,359,115호 및 제 5,420,328호(본 명세서에서 전체적으로 참조문헌으로서 인용된다)에 기술된 방법으로 수행될 수 있다.
E. 디설파이드 결합 형성
본 발명의 화합물은 존재하는 경우 결합된 시스테인의 티올 그룹 사이에 분자내 디설파이드 결합을 포함하는 폐환 형태로 존재할 수 있다. 다르게는 시스테인의 티올 그룹 사이에 분자내 디설파이드 결합은 생산되어 다이머(또는 고분자 올리고머) 화합물을 생산할 수 있다. 하나 이상의 시스테인 잔기는 또한 호모시스테인으로 치환될 수 있다.
V. 유용성
본 발명의 펩티드 화합물은 TPO 생산 및 수용체 결합 과정에 영향을 주고, 그에 영향을 받는 것으로 판단되는 다수의 인자를 평가하는 것을 포함하는 TPO의 생물학적 작용을 이해하기 위한 실험관내 도구로서 유용하다. 본 펩티드 화합물은 TPO-R에 결합하고 그를 활성화시키는 다른 화합물의 개발을 촉진시켜야 하는 구조 및 활성간의 관계에 대한 중요한 정보를 제공하여야 하기 때문에 본 펩티드 화합물은 상기 개발에 유용하다.
본 펩티드 화합물은 또한 신규한 TPO 수용체 작용제 선별하기 위한 에세이에서 경쟁 결합제로서 유용한다. 에세이 일면에서, 본 발명의 펩티드 화합물은 직접 또는 간접적으로 검출가능한 시그날을 제공하는 공유 또는 비공유 결합 부위를 표지화하는 다양한 방식으로 변형될 수 있거나 변형되지 않고 사용될 수 있다. 이들 에세이에서 그에 대한 물질은 직접 또는 간접적으로 표지화될 수 있다. 직접 표지에 대한 가능성은 형광 세기, 파장 쉬프트, 또는 형광 분극화의 변화를 모니터할 수 있는 있는 표지 그룹, 예로서, 방사능표지, 예로서, 125I, 효소(U. S. Pat. No. 3,645, 090), 예로서, 퍼옥시다아제 및 알칼리성 포스파타아제, 및 형광 표지(U. S. Pat.No. 3, 940,475)을 포함한다. 간접 표지에 대한 가능성은 하나의 성분을 바이오틴화한 후, 상기 표지 그룹중 하나에 커플링된 아비딘과 결합시키는 것을 포함한다. 또한 펩티드 화합물을 고체 지지체에 결합시키고자 하는 경우 스페이서 또는 링커를 포함할 수 있다.
또한, TPO 수용체에 결합하는 능력에 기초하여 본 발명의 펩티드 화합물은 살아있는 세포, 고정 세포, 생물학적 체액, 조직 균질물, 정제된 천연 생물학적 물질중에서 TPO 수용체를 검출하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 예로서, 펩티드 화합물을 표지화하여 표면상에 TPO-R을 갖는 세포를 확인할 수 있다. 또한, TPO 수용체에 결합하는 능력에 기초하여 본 발명의 펩티드 화합물은 동소 염색, FAC(형광표지세포분리), 웨스턴 블랏팅, ELISA에 사용될 수 있다. 추가로 TPO 수용체에 결합하는 능력에 기초하여 본 발명의 펩티드 화합물은 수용체 정제, 또는 세포 표면상(또는 침투가능한 세포내)의 TPO 수용체를 발현시키는 세포의 정제에 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드 화합물은 또한 다양한 의료 연구 및 진단용의 상업적 시약으로서 사용될 수 있다. 상기 용도는 제한하고자 하는 것은 아니지만: (1) 다양한 작용 에세이에서 후보물질 TPO 작용제의 활성을 측량하기 위한 보정 기준으로서의 용도; (2) TPO-의존 세포주의 증식 및 성장을 유지시키기 위한 용도; (3) 공결정화를 통한 TPO-수용체의 구조 분석에서의 용도; (4) TPO 시그날 트랜스덕션/수용체 활성화의 메커니즘을 조사하기 위한 용도; 및 (5) TPO-수용체가 바람직하게 활성화되거나, 상기 활성화는 TPO 작용제의 공지된 측량에 대해 통상적으로 보정되는 다른 연구 또는 진단 적용등을 포함한다.
본 발명의 펩티드 화합물은 추가의 사이토카인과 결합하거나 그들 스스로 거대핵세포 및 그의 수임 선조체의 시험관내 확장에 사용될 수 있다. 참조, 예: DiGiusto, et al. , PCT Publication No. 95/05843(본 명세서에서 참조문헌으로서 인용됨). 화학 요법 및 방사능 요법은 신속하게 분할하고, 더욱 성숙한 거대핵세포 군집을 사멸시킴으로써 저혈소판증을 유발한다. 그러나, 치료 요법은 또한 미성숙한, 유사분열성이 덜 활성인 거대핵세포 전구세포의 생육성 및 수를 감소시킬 수 있다. 시험관내 배양액에 의해 거대핵세포 및 미성숙 전구체가 풍부화된 그 또는 그녀 자신의 세포 군집을 화학 요법 또는 방사능 요법 후의 환자에 주입하여 따라서, 본 발명의 펩티드 화합물 또는 TPO에 의한 혈소판의 호전을 가속화시킬 수 있다.
본 발명의 펩티드 화합물은 또한 생체내 TPO-R을 가속화시키기 위하여 인간을 포함하는 온혈동물에 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 생체내에서 TPO-R에 대한 효능을 모사하기에 충분한 양으로 본 발명의 펩티드 화합물을 투여하는 것을 포함하는 TPO 관련 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 예로서, 본 발명의 펩티드 화합물은, 이에 한하지 않으나, 혈소판 질환 및 저혈소판증(특히 골수 수혈, 방사능 요법 및 화학 요법과 관련되는 경우)을 포함하는 다양한 혈액학적 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 일면에서 TPO 길항제는 바람직하게, 화학 요법 또는 방사능 요법을 받은 환자에게 먼저 투여된 후, 본 발명의 TPO 작용제가 투여된다.
McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992)(본 명세서에서 참고문헌으로 인용됨)에 기술된 다양한 모델중 하나로 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 펩티드 화합물의 활성을 평가할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 골수 수혈, 방사능 요법, 또는 화학 요법과 관련된 저혈소판증 치료에 유용하다. 펩티드 화합물은 통상 화학 요법, 방사능 요법, 또는 골수 이식전 또는 상기에 노출된 후 예방학적으로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 약제학적 담체 또는 희석제와 함께 적어도 하나의 본 발명의 펩티드 화합물을 활성성분으로서 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩티드 화합물은 경구, 폐, 비경구(근육내, 복강내, 정맥내(IV) 또는 피하 주사), 흡식(비새 분말 제조에 의해), 경피, 비강내, 질내, 직장내, 또는 설하 투여 경로에 의해 투여될 수 있고, 각 투여 경로에 적절한 제형으로 제형화될 수 있다. [참조, 예: Bernstein, et al., PCT 특허 공개공보 No. WO93/25221 ; Pitt, et al. , PCT 특허 공개공보 No. WO 94/17784; and Pitt, etal,., European 특허 출원 613, 683](각각은 본 명세서에서 참조문헌으로서 인용된다).
경구 투여에 적절한 고체 제형은 캡슐제, 정제, 환제, 분말제, 및 과립제를 포함한다. 이러한 고체 제형에 있어서, 활성 펩티드 화합물은 적어도 하나의 불활성 약제학적으로 허용가능한 담체, 예로서, 수크로스, 락토오스, 또는 전분과 혼합된다. 제형은 또한 마그네슘 스테아레이트와 같은 활탁제와 같은 불활성 희석제외의 추가의 물질을 포함할 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 제제는 완충제를 포함할 수 있다. 정제 및 환제는 추가로 장용 코팅제를 추가적으로 제조할 수 있다.
경구 투여용 액상 제형은 물과 같이 본 분야에 통상 사용되는 불활성 희석제를 포함하는 엑시르제와 함께 약제학적으로 허용가능한 유제, 액제, 현탁제, 시럽제를 포함한다. 불활성 희석제외에도 조성물은 또한 습윤제, 유제 및 현탁화제 및 감미제, 향미제, 향수와 같은 애쥬번트를 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 본 발명에 따른 제제는 멸균 수용액 또는 불용액, 현탁액 또는 유액을 포함한다. 불용성 용매 또는 비히클의 예로서, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유, 예로서, 올리브유 및 옥수수 유, 젤라틴, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예로서, 에틸 올레이트를 포함한다. 상기 제제는 애주번트, 예로서, 방부제, 유화제, 및 분산제를 포함할 수 있다. 예로서, 박테리아 보전 필터를 통한 여과, 조성물내로의 멸균제 혼입, 조성물 조사, 또는 조성물 가열을 통해 멸균시킬 수 있다. 멸균수 또는 몇몇의 다른 멸균 주사용 배지를 사용하여 사용직전에 제조할 수 있다.
직장내 또는 질내 투여용 조성물은 활성 물질외에도 코코넛 버터 또는 좌제 왁스와 같은 부형제를 포함할 수 있는 바람직한 좌제이다. 비강내 또는 설하 투여용 조성물은 또한 본 분야에 공지되어 있는 표준 부형제를 사용하여 투여된다.
펩티드 화합물을 포함하는 조성물은 치료학적 및/또는 예방학적 요법를 위해 투여될 수 있다. 치료학적 적용에서, 질환 증상 및 그의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지시키기에 충분한 양으로 상기 기술된 바와 같이 이미 질환을 앓고 있는 환자에 조성물을 투여한다. 이를 수행하기에 적절한 양을 "치료학적 유효량"으로 정의한다. 상기 용도에 유용한 양은 환자의 일반 상태 및 체중, 및 질환의 중증도에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 조성물은 또한 예로서 Tice 및 Bibi의 방법[(in Treatise on Controlled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus, Marcel Dekker, New York (1992), pp. 315-339)]에 의해 미세캡슐화될 수 있다.
예방학적 적용에서 본 발명의 펩티드 화합물을 포함하는 조성물은 특정 질환에 걸리기 쉽거나 그럴 위험이 있는 환자에 투여된다. 상기 양을 "예방학적 유효량"으로 정의한다. 상기와 같은 사용에서 정확한 양은 환자의 건강 상태 및 체중에 따라 달라질 것이다.
유효한 요법에 필요한 펩티드 화합물의 양은 다수의 상이한 요소, 예로서, 투여수단, 표적 부위, 환자의 생릭학적 상태, 및 투여하는 다른 약제에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료 용량은 효능 및 안전성을 최적화하기 위하여 적정되어야 한다. 통상, 생체내 사용되는 용량은 시약의 동소 투여에 유용한 양으로 유용한 가이던스를 제공할 것이다. 특정 질환 치료를 위한 유효량의 동물 시험이 추가로 인간 용량에 대한 예시적 지시를 제공할 것이다. 다양한 고려사항이 기술되어 있다. [예: inGilman, et al. (eds), Goodman and Gilman's : The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Pres(1990); and Remington's Pharmaceutical Sciences, 7th Ed. , Mack Publishing Co. , Easton, Pa. (1985)(각각은 본 명세서에서 참조문헌으로서 인용된다)].
본 발명의 펩티드 화합물은 1일당 약 약 0.001 mg 내지 약 10 mg/kg(체중)의 용량 범위로 투여될 때 TPO 매개 이상 치료에 효능이 있다. 이상의 중증도, 환자의 일반 상태 및 연령 등의 요소에 따라 사용되는 특정량은 치료하는 특정 이상, 투여 경로, 및 의사의 판단에 의해 조절된다.
실시예
실시예 1
고체상 펩티드 합성
본 발명의 펩티드 화합물을 Merrifield 고체상 합성 기술(참조 Steward and Young, Solid Peptide Synthesis, 2d. edition, Pierce Chemical, Rockford, Ill. (1984) and Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 85: 2149 (1963)) 또는 AppliedBioSystems Inc. Model431A 또는 433A 펩티드 합성기를 사용하여 합성할 수 있었다. 펩티드 화합물을 Applied BioSystems Inc. Synth Assist. TM.1.0.0 또는 Synth Assist. TM. 2.0.2의 표준 프로토콜을 사용하여 어셈블리할 수 있었다. 각 커플링은 HBTU(2-H-벤자트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트) 및 HOBt (1-하이드록시벤조트리아졸)로 30분동안 2회에 걸쳐 수행할 수 있었다.
사용된 수지는 HMP 수지 (p-하이드록시메틸 페녹시메틸) 폴리스티렌 수지 또는 PAL(Milligen/Biosearch)가 될 수 있으며, 이는 링커로서 5-(4'-Fmoc-아미노메틸-3,5'-디메티옥시페녹시) 발레산과 가교 결합된 폴리스티렌 수지이다. PAL 수지를 사용하여 수지로부터 펩티드를 절단할 때 카복실 말단 아미드 작용기를 수득하였다. 절단시, HMP 수지는 최종 산물의 C-말단에 카복실산 부위를 생산하였다. 대부분의 시약, 수지, 및 보호된 아미노산 (유리 또는 수지상)은 Millipore 또는 Applied BioSystems Inc.으로부터 구입할 수 있었다.
커플링 공정시 아미노 보호에 The Fmoc 그룹을 사용할 수 있었다. 아미노산상의 1차 아민 보호는 Fmoc 및 세린, 티로신, 글루탐산, 및 트레오닌에 대하여 t-부틸과 같은 측쇄 보호 그룹; 글루타민에 대하여 트리틸; 아르기닌에 대하여 PmC(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐); 트립토판에 대하여 N-t-부틸옥시카보닐; 히스티딘에 대하여 N-트리틸 및 시스테인에 대하여 S-트리틸로 수행할 수 있었다.
수지로부터 펩티드 화합물의 제거 및 동시의 측쇄 작용기의 탈보호는 시약 K의 처리 및 그의 미세한 변형에 의해 수행할 수 있었다. 다르게는, 아미드화된 카복실 말단과의 펩티드 합성에서 전체적으로 어셈블리된 펩티드는 초기 온도 4℃에서 시작하여 점차적으로 실온까지 증가시키면서 90% 트리플루오로아세트산, 5% 에탄디티올, 및 5% 물의 혼합물로 절단시킬 수 있었다. 탈보호화된 펩티드 화합물은 디에틸 에테르로 침전시킬 수 있었다. 정제는 분취용, 역상, 0.1% 트리플루오로아세트산중 아세토니트릴/물의 구배를 갖는 C18 결합 실리카겔 칼럼상에서의 고성능 액상 크로마토그래피에 의할 수 있었다. 균질한 펩티드 화합물은 적용시 Fast Atom Bombardment 질량 분광법 또는 전기분무 질량 분광법 및 아미노산 분석법에 의해 특징화될 수 있었다.
바람직한 일례로, 본 발명의 펩티드 화합물은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있고 그를 사용하여는 표준 합성 방법을 사용하여 다이머화하였다. 이들 합성 방법에 따라 본 분야의 기술자는 본 발명에 따른 다이머 펩티드 화합물을 용이하게 제조할 수 있다. 추가로, 공지된 방법 및 링커를 사용하여 다이머 서브유니트가 용이하게 결합될 수 있다는 것을 본 분야의 기술자는 용이하게 이해할 것이다.
실시예 2
펩티드의 페길화
본 발명의 펩티드 화합물의 페길화를 주지 기술로 수행할 수 있었다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드 화합물을 10 mg/ml의 농도로 100mM 바이신 pH 8.0에 용해시키고, 1.25배 몰 과량의 분말형 PEG2 (Shearwater Polymer, Inc. (Huntsville, Ala.)으로부터 상업적으로 이용가능)에 가하고 반응 종결시까지, 통상 1-2시간동안 실온에서 교반시킬 수 있었다. YMC ODS AQ 칼럼을 포함하는 40-65% 아세토니트릴 구배를 사용하여 역상 HPLC에 의해 반응을 모니터하였다. 반응 종결시 용액을 제 2의 1.25 몰 과량의 분말형 PEG2에 가하고 각 몰의 폴리펩티드에 대하여 총 5몰의 PEG2를 사용하여 상기 공정을 4회 반복하였다. 점성을 감소시키기 위하여 PBS를 사용하여 용액을 2배로 희석하고 앞서 PBS로 평형화되고 용출시킨 superdex 200 칼럼 (Pharmacia)상에 로딩하였다. 크기 배제 칼럼으로부터의 분획을 역상 HPLC에 의해 분석할 수 있었다. 임의의 모노-PEG-펩티드 화합물에 앞서 용출된 디-PEG-펩티드 화합물을 포함하는 분획을 풀링하고 5℃에 저장하거나 동결건조시킬 수 있었다.
앞서, 오직 본 발명의 바람직한 일례만을 상세하게 기술하였지만, 본 발명의 수정 및 변화는 본 발명이 의도하는 범위 및 정신을 벗어나지 않고 가능하다는 것을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MACDONALD, BRIAN R. WEIS, JEFFERY KENNETH YURKOW, EDWARD JOHN <120> PEPTIDES AND COMPOUNDS THAT BIND TO A RECEPTOR <130> TDP-5001-USANP <140> 10/918,561 <141> 2004-08-13 <150> 60/498,740 <151> 2003-08-28 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide motif <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Variable amino acid <400> 1 Trp Ser Xaa Trp Ser 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Ala, Cys, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Gln, Ser, Thr, or Val, preferably Ala or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Lys, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, or Val, preferably Asp, Glu, or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Cys, Leu, Met, Pro, Gln, or Val <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Phe, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, or Val <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Cys, Phe, Ile, Leu, Met, Arg, Ser, Val, or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Ala, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> b-(2-naphthyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> Cys, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Arg, or Val <400> 2 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> b-(2-naphthyl)alanine <400> 3 Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Xaa Leu Ala Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> b-(2-naphthyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> sarcosine or beta-alanine <400> 4 Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Xaa Leu Ala Ala Arg Ala Xaa 1 5 10 15 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> b-(2-naphthyl)alanine <400> 5 Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Xaa Leu Ala Ala Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> b-(1-naphthyl)alanine <400> 6 Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Xaa Leu Ala Ala Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> b-(2-naphthyl)alanine <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> sarcosine or beta-alanine <400> 7 Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Xaa Leu Ala Ala Arg Xaa 1 5 10

Claims (1)

  1. (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2(상기 식에서, X10은 사르코신 및 β-알라닌으로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 2-Nal은 β-(2-나프틸)알라닌이다)를 포함하는, 트롬보포이에틴(TPO) 수용체에 결합하는 펩티드 화합물.
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