BRPI0414008B1 - Compostos que se ligam a um receptor de trombopoietina, composições e métodos in vitro para ativação de um receptor de trombopoietina em uma célula - Google Patents

Abstract

"peptídeos e compostos que se ligam a um receptor". a presente invenção refere-se a peptídeos e compostos que se ligam a e ativam o receptor de trombopoietina (c-mpl ou tpo-r) ou, de outro modo, atuam como um agonista de tpo que são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSTOS QUE SE LIGAM A UM RECEPTOR DE TROMBOPOIETINA, COMPOSIÇÕES E MÉTODOS IN VITRO PARA ATIVAÇÃO DE UM RECEPTOR DE TROMBOPOIETINA EM UMA CÉLULA".

Referência Remissiva a Pedidos Relacionados O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido US N2 de Série 60.498.740, depositado em 28 de agosto de 2003.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a compostos de peptídeos que se ligam a e ativam o receptor de trombopoietina (c-mpl ou TPO-R) ou, de outro modo, atuam como um agonista de TPO. A invenção tem aplicação nos campos de bioquímica e química medicinal e proporciona, particularmente, agonistas de TPO para uso no tratamento de doença humana.

Antecedentes da Invenção Megacariócitos são células derivadas da medula óssea as quais são responsáveis pela produção de plaquetas sangüíneas em circulação. Embora compreendendo <0,25% das células da medula óssea na maioria das espécies, elas têm >10 vezes o volume de células típicas da medula. Veja Ku-ter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 11104-11108 (1994). Megacariócitos sofrem um processo conhecido como endomitose, pelo que eles reproduzem seu núcleo, mas falham em sofrer divisão celular e, desse modo, dão origem a células poliplóides. Em resposta a uma contagem plaquetária diminuída, a taxa endomitótica aumenta, mais megacariócitos plóides são formados e o número de megacariócitos pode aumentar até 3 vezes. Veja Harker, J. Clin. Invest., 47: 458-465 (1968). Em contraste, em resposta a uma contagem plaquetária elevada, a taxa endomitótica diminui, menos megacariócitos plóides são formados e o número de megacariócitos pode diminuir em 50%. O mecanismo de feedback fisiológico exato pelo qual a massa de plaquetas em circulação regula a taxa endomitótica e o número de megacariócitos na medula óssea não é conhecido. Acredita-se, agora, que o fator trombopoiético em circulação envolvido na mediação desse loop de feedback seja a trombopoietina (TPO). Mais especificamente, foi mostrado que a TPO é ο principal regulador humoral em situações envolvendo trombocito-penia. Veja, por exemplo, Metcalf, Nature, 369: 519-520 (1994). Foi mostrado, em vários estudos, que a TPO aumenta as contagens de plaquetas, aumenta o tamanho de plaquetas e aumenta a incorporação de isótopo em plaquetas de animais recipientes. Especificamente, acredita-se que a TPO afete os megacariócitos de várias formas: (1) ela produz aumentos no tamanho e número de megacariócitos; (2) ela produz um aumento no teor de DNA, na forma de poliplóides, em megacariócitos; (3) ela aumenta a endomi-tose de megacariócitos; (4) ela produz maturação aumentada de megacarió-citos; e (5) ela produz um aumento no percentual de células precursoras, na forma de pequenas células acetilcolinesterase-positivas, na medula óssea.

Plaquetas (trombócitos) são necessárias para a coagulação sangüínea. Quando seus números são muito baixos, um paciente está em sério risco de morte por hemorragia catastrófica. Assim, a TPO tem aplicação útil potencial no diagnóstico e tratamento de vários distúrbios hematoló-gicos, por exemplo, doenças primariamente em virtude de defeitos nas plaquetas. Experimentos clínicos em andamento com TPO indicaram que a TPO pode ser administrada seguramente aos pacientes. Além disso, estudos recentes proporcionaram a base para a projeção da eficácia de terapia com TPO no tratamento de trombocitopenia e particularmente trombocitope-nia resultante de quimioterapia, terapia com radiação ou transplante de medula óssea como um tratamento para câncer ou linforma. Veja, por exemplo, McDonald, Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14: 8-21 (1992). O gene que codifica a TPO foi clonado e caracterizado. Veja Kuter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 11104-11108 (1994); Barley et al., Cell 77: 1117-1124 (1994); Kaushansky et al., Nature 369: 568-571 (1994); Wen-dling et al., Nature 369: 571-574 (1994); e Sauvage et al., Nature 369: 533-538 (1994). A trombopoietina é uma glicoproteína com pelo menos duas formas, com massas moleculares evidentes de 25 kDa e 31 kDa, com uma seqüên-cia de aminoácido N-terminal em comum. Veja Barley acetato de etila, Cell 77: 1117-1124 (1994). A trombopoietina parece ter duas regiões distintas separadas por um sítio de divagem Arg-Arg em potencial. A região amino- terminal é altamente conservada no homem e camundongo e tem alguma homologia com a eritropoietina e inferferon-a e interferon-b. A região carbóxi-terminal mostra ampla divergência entre espécies.

As seqüências de DNA e seqüências peptídicas codificadas para TPO-R humano (também conhecido como c-mpl) foram descritas. Veja Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 5640-5644 (1992). O TPO-R é um membro da família do receptor de fator de crescimento de hematopoietina, um família caracterizada por um projeto estrutural comum do domínio extra-celular, incluindo quatro resíduos de C conservados na porção N-terminal e um motivo WSXWS (SEQ ID NO: 1) próxima à região transmembrana. Veja Bazan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 6934-6938 (1990). Evidência de que esse receptor exerce um papel funcional em hematopoiese inclui observações de que sua expressão está limitada ao baço, medula óssea ou fígado fetal em camundongos (veja Souyri et al., Cell 63: 1137-1147 (1990)) e a megacariócitos, plaquetas e células CD34+ em seres humanos (veja Methia et al., Blood 82: 1395-1401 (1993)). Além disso, exposição de células CD34+ a oligonucleotídeos sintéticos anti-sentido ao RNA de mpl inibe significativamente o aparecimento de colônias de megacariócitos sem afetar a formação de colônias eritróides ou mielóides. Alguns pesquisadores postulam que o receptor funciona como um homodímero, similar à situação com os receptores para G-CSF e eritropoietina. A disponibilidade de genes clonados para TPO-R facilita a pesquisa por agonistas desse importante receptor. A disponibilidade da proteína do receptor recombinante permite o estudo da interação receptor-ligante em uma variedade de sistemas de geração de diversidade de peptídeo semi-aleatório. Esses sistemas são descritos nas patentes US Nos. 6.251.864, 6.083.913, 6.121.238, 5.932.546, 5.869.451, 6.506.362, e 6.465.430, e em Cwirla e outros, Proc. Natl. Acad., Sei. USA 87:6378-6382 (1990); cada um dos precedentes sendo aqui incorporados por referência. A lenta recuperação de níveis de plaquetas em pacientes que sofrem de trombocitopenia é um problema grave e levou à urgência para pesquisar um agonista do fator de desenvolvimento sangüíneo capaz de a- celerar a regeneração de plaquetas. A presente invenção proporciona tal agonista.

Sumário da Invenção A presente invenção está direcionada para peptídeos de baixo peso molecular definidos e compostos que têm fortes propriedades de ligação ao TPO-R, podendo ativar o TPO-R, e potencialmente permitir efeitos secundários reduzidos comparados a agonistas de TPO conhecidos. Conse-qüentemente, os compostos de peptídeos podem ser úteis para fins terapêuticos no tratamento de condições mediadas por TPO (por exemplo, tromboci-topenia resultante de quimioterapia, terapia com radiação ou transfusões de medula óssea), bem como para fins diagnósticos no estudo do mecanismo de hematopoiese e para a expansão in vitro de megacariócitos e células progenitoras associadas.

Compostos de peptídeos adequados para fins terapêuticos e/ou diagnósticos têm uma IC50 de cerca de 2 mM ou menos, conforme determinado, por exemplo, pelo ensaio de afinidade de ligação apresentado no E-xemplo 3 da patente US N° 5.869.451, em que uma IC50 menor se correlaciona a uma afinidade de ligação mais forte ao TPO-R. O ensaio na patente US N- 5.869.451 é como segue: as afinidades de ligação dos compostos de peptídeos são medidas em um ensaio de ligação competitiva. As cavidades de uma placa de microtitulação são revestidas com 1 mg de estreptavidina, bloqueado com PBS/1% BSA, seguido por 50 ng de anti-receptor biotinilata-do imobilizando anticorpo (Ab179). As cavidades são, em seguida, tratadas com uma diluição 1:10 do TPO-R solúvel obtido. Várias concentrações do composto de peptídeo são misturadas com uma quantidade constante de uma forma truncada de TPO, consistindo dos resíduos 1-156 fundidos ao terminal C da proteína que liga a maltose (MBP-TPO156). Os peptídeos MBP-TPO156 misturados são adicionados aos poços revestidos de TPO-R, incubados durante 2 horas a 4°C e, em seguida, lavados com PBS. A quantidade de MBP-TPO156 que é ligada em equilíbrio é medida pela adição de anti-soro de coelho direcionado contra MBP, seguido pela fosfatase alcalina conjugada com IgG anticoelho de cabra. A quantidade de fosfatase alcalina em cada cavidade é, em seguida, determinada usando-se métodos padrão. O ensaio é conduzido sobre uma faixa de concentrações de compostos de peptídeo e os resultados são dispostos em um gráfico de modo que o eixo y represente a quantidade de ligante ΜΒΡ-ΤΡΟι56 e o eixo x represente a concentração do composto de peptídeo. Um deles, então, pode determinar a concentração na qual o composto de peptídeo reduzirá por 50% (IC50) a quantidade do ligante MBP-TPO156 para imobilizar TPO-R. A constante de dissociação (Kd) para o peptídeo mostra ser similar para a medida de IC50 usando essas condições de ensaio. Para fins farmacêuticos, os compostos de peptídeos têm, de preferência, um IC50 de não mais do que cerca de 100 μΜ, mais preferivelmente não mais do que cerca de 500 nM. Em uma modalidade preferida, o peso molecular do composto de peptídeo é de cerca de 250 a cerca de 8.000 dáltons. Se os compostos de peptídeos da presente invenção são olligomerizados, dimerizados e/ou derivatizados com um polímero hidrofílico conforme descrito aqui, os pesos moleculares de tais compostos de peptídeos serão substancialmente maiores e podem oscilar qualquer coisa entre cerca de 500 a cerca de 120.000 dáltons, mais preferivelmente de cerca de 8.000 a cerca de 80.000 dáltons.

Quando usados para fins diagnósticos, os compostos de peptídeos da presente invenção são, de preferência, rotulados com um rótulo de-tectável e, conseqüentemente, os compostos de peptídeos sem tal rótulo servem como intermediários na preparação de compostos de peptídeos rotulados.

Um composto de peptídeo que vai de encontro aos critérios definidos para peso molecular e afinidade de ligação para o TPO-R compreende 9 ou mais aminoácidos, em que os aminoácidos são aminoácidos que ocorrem naturalmente ou sintéticos (não ocorrem naturalmente).

Conseqüentemente, compostos de peptídeos preferidos compreendem um composto tendo: (1) um peso molecular de menos do que cerca de 5000 dáltons e (2) uma afinidade de ligação ao TPO-R, quando expressa por uma IC50de não mais do que cerca de 100 μΜ, em que de zero a todas as ligações ~C(0)NH~ do composto de peptídeo foram substituídas por uma ligação selecionada do grupo consistindo em uma ligação --CH20C(0)NR--; uma ligação de fosfonato; uma ligação --CH2 S(0)2NR--; uma ligação --CH2NR-; uma ligação --C(0)NR6--; e uma ligação --NHC(0)NH--, onde R é hidrogênio ou alquila inferior e R6 é alquila inferior; adicionalmente, em que o terminal N do referido composto de peptídeo é selecionado do grupo consistindo em um grupo -NRR1; um grupo -NRC (O)R; um grupo --NRC(0)0R; um grupo ~NRS(0)2R; um grupo --NHC(0)NHR; um grupo succinimida; um grupo benziloxicarbonil-NH-; e um grupo benziloxicarbonil-NH-- tendo de 1 a 3 substituintes sobre o anel de fenila selecionados do grupo consistindo em alquila inferior, alcóxi inferior, cloro e bromo, onde ReR1 são, independentemente, selecionados do grupo consistindo em hidrogênio e alquila inferior, e adicionalmente em que 0 terminal C do referido composto de peptídeo tem a fórmula --C(0)R2, onde R2 é selecionado do grupo consistindo em hidróxi, alcóxi inferior e -NR3R4, onde R3 e R4 são, independentemente, selecionados do grupo consistindo em hidrogênio e alquila inferior e onde o átomo de nitrogênio do grupo -NR3R4 pode, opcionalmente, ser o grupo amina do terminal N do peptídeo de modo a formar um peptídeo cíclico, e sais fisiologicamente aceitáveis dos mesmos.

Em uma modalidade relacionada, a invenção refere-se a um composto de peptídeo rotulado compreendendo um composto de peptídeo, conforme descrito acima, tendo covalentemente preso ao mesmo um rótulo capaz de detecção.

Em uma modalidade, o composto de peptídeo central compreende a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2): X9X8GX1X2X3X4X5X6X7 onde Xg é um resíduo de A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T ou V; X8 é A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T ou V; e Χβ é p-(2-naftil)alanina (referido aqui como "2-Nal"). Mais preferivelmente, X9 é A ou I; e X8 é D, E ou K. Ainda, X1 é C, L, Μ, P, Q, V; X2 é F, K, L, N, Q, R, S, T ou V; X3 é C, F, I, L, M, R, S, V ou W; X4 é qualquer um dos 20 L-aminoácidos geneticamente codificados; X5 é A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V ou Y; e X7 é C, G, I, K, L, Μ, N, R ou V.

Um composto de peptídeo particularmente preferido inclui a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 7): I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar), em que (2-Nal) é p-(2-naftil)alanina e (Sar) é sarcosina.

Em outra modalidade, os compostos peptídicos da presente invenção são, de preferência, dimerizados ou oligomerizados para aumentar a afinidade e/ou atividade dos compostos. Um exemplo de um composto pep-tídico dimerizado preferido inclui, mas não está limitado, ao seguinte: onde X-io é uma sarcosina ou resíduo de β-alanina (SEQ ID NO: 7). A estrutura acima também pode ser representada pelo seguinte: (H-IEGPTLRQ z(2-Nal) LAARX10)2K-NH2. Quando X10 for uma sarcosina, o composto tem a seguinte estrutura: onde (2-Nal) é p-(2-naftil)alanina e (Sar) é sarcosina (SEQ ID NO: 7). Este composto de peptídeo, o qual também pode ser representado pela seguinte estrutura (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar))2K-NH2 é aqui referido como “Composto TPO Ne 1”.

Em ainda outra modalidade, compostos de peptídeos preferidos para uso na presente invenção incluem compostos de peptídeos que são covalentemente presos a um ou mais de uma variedade de polímeros hidro-fílicos. Polímeros hidrofílicos adequados incluem, mas não estão limitados a, polialquiléteres, conforme exemplificado por polietileno glicol e polipropileno glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialcenos, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, celulose e derivados de celulose, dextrano e derivados de dextrano, etc., conforme descrito na Patente U.S. N2 5.869.451, o conteúdo todo da qual é aqui incorporado por referência.

Os compostos de peptídeo descritos aqui são úteis para a prevenção e tratamento de doenças mediadas por TPO e particularmente para o tratamento de distúrbios hematológicos incluindo, mas não limitado a, trom-bocitopenia resultante de quimioterapia, terapia com radiação ou transfusões da medula óssea. Assim, a presente invenção também proporciona um método de tratamento, em que um paciente tendo um distúrbio que seja passível de tratamento com um agonista de TPO recebe, ou é administrada, uma dose ou quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de peptídeo da presente invenção. A invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo um ou mais dos compostos de peptídeos descritos aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável. Essas composições farmacêuticas podem estar em uma variedade de formas, incluindo formas de dosagem oral, bem como pós inaláveis e soluções e soluções injetáveis e para infusão.

Breve Descrição das Figuras A figura 1 mostra e compara a atividade do Composto TPO N2 1 ao composto de peptídeo da técnica anterior (referido aqui por diante como “composto de peptídeo da técnica anterior"). A diferença entre o Composto TPO N2 1 e o composto de peptídeo da técnica anterior é que o composto de peptídeo da técnica anterior tem uma β-(1 -naftil)alanina(1 -Nal) onde (2-Nal) está no Composto TPO N2 1. A figura 2 mostra e compara a atividade do Composto TPO N2 1 PEGuilado em relação ao composto de peptídeo da técnica anterior PEGui-lado. A figura 3 mostra e compara a alteração in vivo na contagem de plaquetas em ratos, demonstrando a relativa potência do Composto TPO N2 1 PEGuilado em relação ao composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado.

As figuras 4 e 5 mostram e comparam o número e volume de plaquetas em circulação de uma maneira dose-dependente, respectivamente, sob o uso do composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado e o uso do Composto TPO Ns 1 PEGuilado.

Descrição de Modalidades Específicas I. Definições e Parâmetros Gerais As definições a seguir são apresentadas para ilustrar e definir o significado e escopo dos vários termos usados para descrever a invenção aqui. "Agonista" refere-se a um ligante biologicamente ativo, o qual se liga a seu receptor biologicamente ativo complementar e ativa o último para causar uma resposta biológica no receptor ou intensificar a atividade biológica preexistente do receptor. “Composto de peptídeo” refere-se a uma molécula que hidrolisa no interior de aminoácidos e/ou derivados de aminoácidos e/ou substitutos de aminoácidos. "Sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais de metal alcalino, metal alcalino-terroso e de amônio não-tóxicos comumente usados na indústria farmacêutica, incluindo os sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, bário, amônio e protamina de zinco, os quais são preparados por meio de métodos bem-conhecidos na técnica. O termo também inclui sais de adição de ácido não-tóxicos, os quais são geralmente preparados através de reação dos compostos da presente invenção com um ácido orgânico ou inorgânico adequado. Sais representativos incluem cloridrato, bromidrato, sulfato, bissulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lacta-to, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, napsilato e semelhantes. "Éster farmaceuticamente aceitável" refere-se àqueles ésteres os quais retêm, quando de hidrólise da ligação de éster, a eficácia e propriedades biológicas do ácido carboxílico ou álcool e não são biológica ou, de outro modo, indesejáveis. Para uma descrição de ésteres farmaceuticamente aceitáveis como pró-drogas veja Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Esses ésteres são, tipicamente, formados a partir do ácido carboxílico correspondente e um álcool. Geralmente, a formação de éster pode ser realizada via técnicas sintéticas convencionais. (Veja, por exemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 4a Ed., John Wiley & Sons, New York (1992), 393-396 e referências citadas no mesmo e Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). O componente álcool do éster geralmente compreenderá (i) um C2-C12 álcool alifático que pode ou não conter uma ou mais ligações duplas e pode ou não conter carbonos ramificados ou (ii) um C7-C12 álcool aromático ou heteroaromático. A presente invenção também considera o uso dessas composições as quais são ésteres, conforme descrito aqui e, ao mesmo tempo, são sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis das mesmas. "Amida farmaceuticamente aceitável" refere-se àquelas amidas as quais retêm, quando da hidrólise da ligação da amida, a eficácia e propriedades biológicas do ácido carboxílico ou amina e não são biológicas ou, de outro modo, indesejáveis. Para uma descrição de amidas farmaceuticamente aceitáveis como pró-drogas veja Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Essas amidas são, tipicamente, formadas a partir do ácido carboxílico correspondente e uma amida. Geralmente, a formação de amida pode ser realizada via técnicas sintéticas convencionais. (Veja, por exemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 4a Ed., John Wiley & Sons, New York (1992), página 393 e Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). A presente invenção também considera o uso dessas composições as quais são amidas, conforme descrito aqui e, ao mesmo tempo, são sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis das mesmas. "Veículo terapêutica ou farmaceuticamente aceitável" refere-se a um meio veículo o qual não interfere com a eficácia da atividade biológica dos ingredientes ativos e o qual não é tóxico para o hospedeiro ou paciente. "Estereoisômero" refere-se a um composto químico tendo o mesmo peso molecular, composição química e constituição que outro, mas com os átomos agrupados diferentemente. Isto é, determinadas porções químicas estão em diferentes orientações no espaço e, portanto, quando puras, têm a capacidade de girar o plano de luz polarizada. Contudo, alguns estereoisômeros puros podem ter uma rotação óptica que é mais ligeira do que seria detectável com os instrumentos atuais. Os compostos da presente invenção podem ter um ou mais átomos de carbono assimétricos e, portanto, incluem vários estereoisômeros. Todos os estereoisômeros estão incluídos dentro do escopo da invenção. "Quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz", conforme aplicado às composições da presente invenção, refere-se à quantidade de composição suficiente para induzir a um resultado biológico desejado. Esse resultado pode ser alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Na presente invenção, o resultado envolverá, tipicamente, uma diminuição nas respostas imunológicas e/ou inflamatórias à infecção ou lesão tecidual.

Resíduos de aminoácidos em peptídeos são abreviados como segue: Fenilalanina é Phe ou F; Leucina é Leu ou L; Isoleucina é lie ou I; Metionina é Met ou M; Valina é Vai ou V; Serina é Ser ou S; Prolina é Pro ou P; Treonina é Thr ou T; Alanina é Ala ou A; Tirosina é Tyr ou Y; Histidina é His ou H; Glutamina é Gin ou Q; Asparagina é Asn ou N; Lisina é Lyz ou K; Ácido Aspártico é Asp ou D; Ácido Glutâmico é Glu ou E; Cisteína é Cys ou C; Triptofano é Trp ou W; Arginina é Arg ou R; e Glicina é Gly ou G. Adicionalmente, t-Buo é terc-butilóxi, Bzl é benzila, CHA é ciclohexilamina, Ac é acetila, Me é metila, Pen é penicilamina, Aib é ácido aminoisobutírico, Nva é norvalina, Abu é ácido aminobutírico, Thi é tienilalanina, OBn é O-benzila e hyp é hidroxiprolina.

Análogos de peptídeo são comumente usados na indústria farmacêutica como drogas não-peptídicas com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Esses tipos de compostos não-peptídicos são denominados "peptideomiméticos" ou "miméticos peptídicos” ou "peptidomiméticos" (Luthman et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14: 386-406, 2a Ed., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew.

Chem. Int. Ed. Engl., 33: 1699-1720 (1994); Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15: 29 (1986); Veber e Freidinger TINS, página 392 (1985); e Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), os quais são incorporados aqui por referência). Miméticos peptídicos que são estruturalmente similares a peptídeos terapeu-ticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente ou intensificado. Geralmente, peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo paradigma (isto é, um polipeptí-deo que tem uma atividade biológica ou farmacológica), tal como o polipeptídeo de ligação ao receptor que ocorre naturalmente, mas têm uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação alternativa, tal como --CH2NH--, -CH2S--, etc. por meio de métodos conhecidos na técnica e ainda descritos nas seguintes referências: Spatola, A.F. em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, Eds., Marcei Dekker, New York, página 267 (1983); Spatola, A.F., Vega Data (março de 1983), Vol. 1, Edição 3, Peptide Backbone Modifications (revisão geral); Morley, Trends Pharm. Sei., páginas 463-468 (1980) (revisão geral); Hudson et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 14: 177-185 (1979); Spatola et al., Life Sei., 38: 1243-1249 (1986); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982) ; Almquist et al., J. Med. Chem., 23: 1392-1398 (1980); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett. 23: 2533 (1982); Szelke et al., Pedido Europeu EP 45665 (1982); Holladay et al., Tetrahedron Lett., 24: 4401-4404 (1983) ; e Hruby, Life Sei. 31: 189-199 (1982); cada um dos quais sendo incorporado aqui por referência. Uma ligação não-peptídica particularmente preferida é --CH2NH--. Tais miméticos peptídicos podem ter vantagens significativas com relação às modalidades com polipeptídeo incluindo, por exemplo: produção mais econômica, maior estabilidade química, propriedades farmacológicas intensificadas (meia-vida, absorção, potência, eficácia, etc.), especificidade alterada (por exemplo, um amplo espectro de atividades biológicas), antigenicidade reduzida e outros. A rotulação de peptidomiméticos usualmente envolve fixação covalente de um ou mais rótulos, diretamente ou através de um espaçador (por exemplo, um grupo amida), a posição(ões) de não-interferência sobre 0 peptidomimético que é(são) previstas através de dados de atividade-estrutura quantitativos e/ou modelagem molecular. Tais posições de não-interferência geralmente são posições que não formam contatos diretos com a(s) macromolécula(s) (por exemplo, moléculas de su-perfamília de imunoglobulinas) à(s) qual(is) o peptidomimético se liga para produzir o efeito terapêutico. A derivatização (por exemplo, rotulação) de peptidomiméticos não deverá interferir substancialmente com a atividade biológica ou farmacológica desejada do peptidomimético. Geralmente, peptidomiméticos de peptídeos de ligação a receptor que se ligam ao receptor com elevada afinidade e possuem atividade biológica detectável (isto é, são agonistas ou antagonistas de uma ou mais alterações fenotípicas receptor-mediadas).

Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência de consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina em lugar de L-lisina) pode ser usada para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, peptídeos limitados compreendendo uma seqüência de consenso ou uma variante com seqüência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados através de métodos conhecidos na técnica (Rizo et al., Ann. Rev. Biochem., 61: 387 (1992), incorporado aqui por referência); por exemplo, através de adição de resíduos de cisteína internos capazes de formação de ligações em ponte de dissulfeto intramoleculares as quais cicli-zam o peptídeo. "Rótulo detectável" refere-se a materiais os quais, quando cova-lentemente presos aos compostos de peptídeos da presente invenção, permitem detecção do composto de peptídeo in vivo no paciente ao qual o composto de peptídeo tenha sido administrado. Rótulos detectáveis adequados são bem-conhecidos na técnica e incluem, à guisa de exemplo, radioisó-topos, rótulos fluorescentes (por exemplo, fluoresceína) e semelhantes. O rótulo detectável empregado em particular não é crítico e é selecionado com relação à quantidade de rótulo a ser empregada, bem como a toxicidade do rótulo na quantidade de rótulo empregada. Seleção do rótulo com relação a tais fatores está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica.

Fixação covalente do rótulo detectável ao composto de peptídeo é realizada por meio de métodos convencionais bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, quando o radioisótopo 125 I é empregado como o rótulo detec-tável, fixação covalente de 125 I ao composto de peptídeo pode ser obtida através de incorporação da tirosina do aminoácido no composto de peptídeo e, em seguida, iodinação do composto de peptídeo (veja, por exemplo, We-aner et al., Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds, páginas 137-140 (1994)). Incorporação da tirosina ao terminal N ou C do composto de peptídeo pode ser obtida através de química bem-conhecida. Da mesma forma, 32 P pode ser incorporado sobre o composto de peptídeo como uma porção fosfato, por exemplo, através de um grupo hidroxila sobre o composto de peptídeo usando química convencional. II. Visão Geral A presente invenção proporciona compostos de peptídeo que se ligam a e ativam o TPO-R ou, de outro modo, se comportam como um ago-nista de TPO. Esses compostos de peptídeo incluem compostos peptídicos "principais" e compostos de peptídeo "derivados" construídos de modo a ter a mesma ou uma estrutura molecular ou formato diferente dos compostos de peptídeo principais, mas que diferem dos compostos de peptídeo principais com relação à suscetibilidade à hidrólise ou proteólise e/ou com relação a outras propriedades biológicas, tais como afinidade aumentada pelo receptor. A presente invenção também proporciona composições compreendendo uma quantidade eficaz de um composto de peptídeo e, mais particularmente, um composto de peptídeo que é útil para o tratamento de distúrbios hematológi-cos e particularmente trombocitopenia associada à quimioterapia, terapia com radiação ou transfusões de medula óssea.

Descobriu-se que o composto de peptídeo central pode compreender uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) X9X8GX1X2X3X4X5X6X7. onde Χβ pode ser p-(2-naftil)alanina e onde X9 é A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T ou V; X8 é A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T ou V. Mais preferivelmente, X9 é A ou I; e X8 é D, E ou K. Ainda, Xt é C, L, Μ, P, Q, V; X2 é F, K, L, N, Q, R, S, T ou V; X3 é C, F, I, L, M, R, S, V ou W; X4 é qualquer um dos 20 L-amínoácidos geneticamente codificados; X5 é A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V ou Y; e X7 é C, G, I, K, L, Μ, N, R ou V.

Contudo, conforme ainda descrito neste, descobriu-se que através de substituição de X6 por p-(2-naftil)alanina, o composto proporciona diferentes propriedades daquelas do composto contendo p-(1-naftil)alanina. Conse-qüentemente, um peptídeo particularmente preferido inclui a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4): I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar).

Em outra modalidade, os compostos peptídicos da presente invenção são, de preferência, dimerizados ou oligomerizados para aumentar a afinidade e/ou atividade dos compostos. Um exemplo de um composto pep-tídico dimerizado preferido inclui, mas não está limitado, ao seguinte: onde X-io é um resíduo de sarcosina ou β-alanina (SEQ ID NO: 7). Deverá ser observado que um resíduo X10 pode ser sarcosina e o outro resíduo pode ser β-alanina. A estrutura acima também pode ser representada pelo seguinte: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2.

Um composto de peptídeo preferido é como segue: onde (2-Nal) é β-^-ηθίΐ'ιΟθΙθηιηθ e (Sar) é sarcosina (SEQ ID NO: 7). Este composto de peptídeo é referido daqui por diante como “Composto TPO N0.1”.

Compostos de peptídeos tendo um IC50 maior do que cerca de 100 mM carecem de ligação suficiente para permitir o uso em aspectos diagnósticos ou terapêuticos da presente invenção. De preferência, para fins diagnósticos, os compostos de peptídeos têm um IC50 de cerca de 2 mM ou menos e, para fins farmacêuticos, os compostos de peptídeos têm um IC50 de cerca de 100 μΜ ou menos. A figura 1 compara a atividade de três bateladas diferentes de Composto TPO Na 1 com uma batelada do composto de peptídeo da técnica anterior, usando técnicas padrão de ensaio de unidades luminescentes relativa. O ensaio emprega células de murino manipuladas para expressar esta-velmente o receptor de TPO humano e um constructo repórter de luciferase acionado pelo promotor fos. A diferença entre o Composto TPO N-1 eo composto de peptídeo da técnica anterior é que o composto de peptídeo da técnica anterior tem uma p-(2-naftil)alanina(1-Nal) onde o (2-Nal) está no Composto TPO N2 1. O Composto TPO N2 1 é referido como 2-Nal e o composto de peptídeo da técnica anterior é referido como 1-Nal (Técnica Anterior) na Fig.1. Conforme mostrado na figura 1, a atividade é similar para cada composto. A figura 2 compara a atividade de várias bateladas diferentes de Composto TPO N2 1 PEGuilado (a peguilação dos compostos da presente invenção é descrita em maiores detalhes abaixo) em relação a várias bateladas do composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado. Ambas bateladas dos compostos de peptídeo da técnica anterior PEGuilados mostram elevada atividade, com essencialmente o mesmo nível de atividade que o composto de peptídeo da técnica anterior não-PEGuilado. As linhas restantes ilustram a atividade de diferentes bateladas do Composto TPO N2 1 PEGuilado. Conforme mostrado pela figura 2, nesse modelo, os últimos têm menos atividade com relação aos compostos de peptídeo da técnica anterior. O Composto TPO N2 1 PEGuilado é referido como PEG-2-Nal e o composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado é referido como PEG-1-Nal (Técnica Anterior) na Fig.2. A figura 3 demonstra a potência relativa do composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado e Composto TPO N2 1 PEGuilado. Através de um modelo com ratos, a figura 3 mostra a alteração in vivo nas contagens de plaquetas após a administração do composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado e do Composto TPO N2 1 PEGuilado. Conforme mostrado pela figura 3, a maior dose do Composto TPO N2 1 PEGuilado tem a mesma atividade que a menor dose do composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado. Um composto menos potente pode proporcionar um estímulo menos drástico à célula alvo, o que poderia reduzir o risco de efeitos colate- rais causados pela superestimulação da célula alvo, tal como trombocitope-nia exacerbada após subsequente ciclo de quimioterapia. O Composto TPO N2 1 PEGuilado é referido como PEG-2-Nal e o composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado é referido como PEG-1-Nal (Técnica Anterior) na Fig.3.

As figuras 4 e 5 mostram os resultados de um estudo de dose-res-posta, em paralelo, de um composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado e do Composto TPO N2 1 PEGuilado em camundongos normais. O Composto TPO N2 1 PEGuilado é referido como PEG-2-Nal e o composto de peptídeo da técnica anterior PEGuilado é referido como PEG-1-Nal (Técnica Anterior) nas Figuras 4 e 5. A figura 4 mostra aumentos nos níveis de plaquetas e a figura 5 mostra o Volume Plaquetário Médio seis (6) dias após tratamento. A faixa de dose era de 10 a 3000 ug/kg. Ambos os compostos de peptí-deos aumentaram o número de plaquetas em circulação de uma maneira dose-dependente com aumentos relativos ao grupo de controle, observados em doses tão baixas quanto 30 ug/kg para ambos os compostos. Na resposta máxima, esses compostos de peptídeos elevaram as contagens de plaquetas para níveis que eram até 4 vezes maiores do que os valores do controle. As curvas de dose-resposta para esses compostos de peptídeos eram muito similares, indicando que, nesse modelo, não havia essencialmente diferença entre os dois artigos de teste, baseado nesses pontos finais. IV. Preparação de Compostos de Peptídeos A. Síntese em Fase Sólida Os compostos de peptídeos da invenção podem ser preparados através de métodos clássicos conhecido na técnica, por exemplo, através de uso de técnicas padrão em fase sólida. Os métodos padrão incluem síntese em fase sólida exclusiva, métodos de síntese em fase sólida parcial, condensação de fragmento, síntese em solução clássica e mesmo através da tecnologia de DNA recombinante. Veja, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963), incorporado aqui por referência. Sobre fase sólida, a síntese é, tipicamente, iniciada a partir da extremidade C-terminal do peptídeo usando uma resina alfa-amino protegida. Um material de partida ade- quado pode ser preparado, por exemplo, através de fixação do alfa-amino-ácido requerido a uma resina clorometilada, uma resina de hidroximetila ou uma resina de benzidrilamina. Uma de tais resinas clorometiladas é vendida sob a marca comercial BIO-BEDS SX-1 pelo Bio Rad Laboratories, Rich-mond, CA e a preparação da resina de hidroximetila é descrito por Bo-donszky et al., Chem. Ind. (Londres), 38: 1597 (1966). A resina de benzidrilamina (BHA) foi descrita por Pietta e Marshall, Chem. Commun. 650 (1970) e está comercialmente disponível da Beckman Instruments, Inc., Paio Alto, Calif., na forma de cloridrato.

Assim, os compostos de peptídeos da invenção podem ser preparados através de acoplamento de um aminoácido alfa-amino protegido à resina clorometilada com o auxílio, por exemplo, de catalisador de bicarbo-nato de césio, de acordo com o método descrito por Gisin, Helv. Chim. Acta., 56: 1467 (1973). Após o acoplamento inicial, o grupo de proteção alfa-amino é removido através de escolha dos reagentes, incluindo soluções de ácido trifluoroacético (TFA) ou ácido clorídrico (HCI) em solventes orgânicos em temperatura ambiente.

Os grupos de proteção alfa-amino são aqueles conhecidos como sendo úteis na técnica de síntese gradual de peptídeos. Incluídos estão grupos de proteção do tipo acila (por exemplo, formila, trifluoroacetila, acetila), grupos de proteção do tipo uretano aromático (por exemplo, benziloxicarbo-nila (Cbz) e Cbz substituído), grupos de proteção de uretano alifático (por exemplo, t-butiloxicarbonila (Boc), isopropiloxicarbonila, ciclohexiloxicarboni-la) e grupos de proteção do tipo alquila (por exemplo, benzila, trifenilmetila). Boc e Fmoc são grupos de proteção preferidos. O grupo de proteção de cadeia lateral permanece intacto durante acoplamento e não é dividido durante a desproteção do grupo de proteção amino-término ou durante acoplamento. O grupo de proteção de cadeia lateral deve ser removível quando de término da síntese do peptídeo final e sob condições de reação que não alterarão o peptídeo alvo.

Os grupos de proteção de cadeia lateral para Tyr incluem tetra-hidropiranila, terc-butila, tritila, benzila, Cbz, Z—Br—Cbz e 2,5-dicloroben- zila. Os grupos de proteção de cadeia lateral para Asp incluem benzila, 2,6-diclorobenzila, metila, etila e ciclohexila. Os grupos de proteção de cadeia lateral para Thr e Ser incluem acetila, benzoíla, tritila, tetrahidropiranila, benzila, 2,6-diclorobenzila e Cbz. O grupo de proteção de cadeia lateral para Thr e Ser é benzila. Os grupos de proteção de cadeia lateral para Arg incluem nitro, tosila (Tos), Cbz, adamantiloxicarbonil mesitoil-sulfonila (Mts) ou Boc. Os grupos de proteção de cadeia lateral para Lys incluem Cbz, 2-clorobenzi-loxicarbonila (2-CI—Cbz), 2-bromobenziloxicarbonila (2-BrCbz), Tos ou Boc.

Após remoção do grupo de alfa-amino proteção, os aminoácidos protegidos restantes são acoplados gradualmente na ordem desejada. Um excesso de cada aminoácido protegido é, geralmente, usado com um ativa-dor de grupo carboxila apropriado, tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) em solução, por exemplo, em misturas de cloreto de metileno (CH2CI2), di-metilformamida (DMF).

Após a seqüência de aminoácido desejada ter sido completa, 0 peptídeo desejado é desacoplado do suporte de resina através de tratamento com um reagente, tal como ácido trifluoroacético ou fluoreto de hidrogênio (HF), o que não apenas cliva o peptídeo da resina, mas também cliva todos os grupos de proteção de cadeia lateral restantes. Quando a resina clorome-tilada é usada, tratamento com fluoreto de hidrogênio resulta na formação dos ácidos peptídicos livres. Quando a resina de benzidrilamina é usada, tratamento com fluoreto de hidrogênio resulta diretamente na amida peptídi-ca livre. Alternativamente, quando a resina clorometilada é empregada, o peptídeo com cadeia lateral protegida pode ser desacoplado através de tratamento da resina peptídica com amônia a fim de proporcionar a amida com cadeia lateral protegida desejada ou com uma alquilamina para proporcionar uma alquilamida ou dialquilamida com cadeia lateral protegida. Proteção da cadeia lateral é removida, então, da maneira usual através de tratamento com fluoreto de hidrogênio a fim de proporcionar as amidas, alquilamidas ou dialquilamidas livres.

Esses procedimentos de síntese de peptídeo em fase sólida são bem-conhecidos na técnica e ainda descritos por John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Synthesis (2a Ed., Pierce Chemical Company, 1984). B, Aminoácidos Sintéticos Esses procedimentos também podem ser usados para sintetizar peptídeos nos quais outros aminoácidos que não os 20 aminoácidos geneticamente codificados que ocorrem naturalmente são substituídos em uma, duas ou mais posições de qualquer um dos compostos da invenção.

Pode-se substituir as cadeias laterais que ocorrem naturalmente dos 20 aminoácidos geneticamente codificados (ou D aminoácidos) por outras cadeias laterais, por exemplo, por grupos tais como alquila, alquila inferior, alquila cíclica de 4, 5, 6 a 7 elementos, amida, alquil amida inferior, di (alquil)amida inferior, alcóxi inferior, hidróxi, carbóxi e os derivados de éster inferior dos mesmos e por heterocíclicos de 4, 5, 6 a 7 elementos. Em particular, análogos de prolina nos quais o tamanho de anel do resíduo de prolina é alterado de 5 elementos para 4, 6 ou 7 elementos podem ser empregados. Grupos cíclicos podem ser saturados ou insaturados e, se insaturados, podem ser aromáticos ou não-aromáticos. Grupos heterocíclicos contêm, de preferência, um ou mais heteroátomos de nitrogênio, oxigênio e/ou enxofre. Exemplos de tais grupos incluem furazanila, furila, imidazolidinila, imidazoli-la, imidazolinila, isotiazolila, isoxazolila, morfolinila (por exemplo, morfolino), oxazolila, piperazinila (por exemplo, 1-piperazinila), piperidila (por exemplo, 1-piperidila, piperidino), piranila, pirazinila, pirazolidinila, pirazolinila, pirazoli-la, piridazinila, piridila, pirimidinila, pirrolidinila (por exemplo, 1-pirrolidinila), pirrolininla, pirrolila, tiadiazolila, tiazolila, tienila, tiomorfolinila (por exemplo, tiomorfolino) e triazolila. Esses grupos heterocíclicos podem ser substituídos ou não-substituídos. Onde um grupo é substituído, o substituinte pode ser alquila, alcóxi, halogênio, oxigênio ou fenila substituída ou não-substituída.

Pode-se também modificar prontamente os peptídeos da presente invenção através de fosforilação (veja, por exemplo, W. Bannwarth et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6 (17): 2141-2146 (1996)) e outros métodos para fazer derivados peptídicos dos compostos da presente invenção são descritos em Hruby et al., Biochem. J., 268 (2): 249-262 (1990). Assim, os compostos peptídicos da invenção também servem como uma base para preparar miméticos peptídicos com atividade biológica similar. C. Modificações Terminais Aqueles versados na técnica reconhecerão que uma variedade de técnicas estão disponíveis para construção de compostos de peptídeos com a mesma ou uma atividade biológica desejada similar ao composto pep-tídico correspondente, mas com uma atividade mais favorável do que o composto de peptídeo com relação à solubilidade, estabilidade e suscetibili-dade à hidrólise e proteólise. Veja, por exemplo, Morgan et al., Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243-252 (1989). O seguinte descreve métodos para a preparação de compostos de peptídeos modificados no grupo amina N-terminal, no grupo carboxila C-terminal e/ou alteração de uma ou mais das ligações amido no peptídeo para uma ligação não-amido. Deve ser compreendido que duas ou mais de tais modificações podem ser associadas em uma estrutura de composto de peptídeo (por exemplo, modificação no grupo carboxila C-terminal e inclusão de uma ligação de -CH2-carbamato entre dois amino-ácidos no composto de peptídeo). 1. Modificações N-terminais Os compostos de peptídeos são, tipicamente, sintetizados como o ácido livre mas, conforme observado acima, poderíam ser prontamente preparados como a amida ou éster. Pode-se também modificar a amina e/ou carbóxi término dos compostos peptídicos da invenção para produzir outros compostos da invenção. Modificações na amina término incluem metilação, acetilação, adição de um grupo benziloxicarbonila ou bloqueio da amina término com qualquer grupo de bloqueio contendo uma funcionalidade carboxi-lato definida por RCOO--, onde R é selecionado do grupo consistindo em naftila, acridinila, esteroidila e grupos similares. Modificações no carbóxi término incluem substituição do ácido livre por um grupo carboxamida ou formação de uma lactama cíclica no carbóxi término para introduzir restrições estruturais.

Modificações na amina término são conforme mencionadas aci- ma e incluem alquilação, acetilação, adição de um grupo carbobenzoíla, formação de um grupo succinimida, etc. (Veja, por exemplo, Murray et al., Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5a Ed., Vol. 1, Manfred E. Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc. (1995)). Especificamente, o grupo ami-na N-terminal pode, então, ser reagido como segue: (a) para formar um grupo amida da fórmula RC(0)NH-onde R é conforme definido acima através de reação com um haleto ácido ou anidrido sintético. Tipicamente, a reação pode ser conduzida através de contato de quantidades em excesso ou em torno das equimolares (por exemplo, cerca de 5 equivalentes) de um haleto ácido ao peptídeo em um diluente inerte (por exemplo, diclorometano), de preferência contendo um excesso (por e-xemplo, cerca de 10 equivalentes) de uma amina terciária, tal como diiso-propiletilamina, para remover o ácido gerado durante reação. As condições de reação são, de outro modo, convencionais (por exemplo, temperatura ambiente durante 30 minutos). Alquilação da amina terminal proporcionando uma N-substituição de alquila inferior seguida por reação com um haleto ácido, conforme descrito acima, proporcionará o grupo N-alquil amida da fórmula RC(0)NR~; (b) para formar um grupo succinimida através de reação com anidrido succínico. Conforme antes, uma quantidade aproximadamente equi-molar ou um excesso de anidrido succínico (por exemplo, cerca de 5 equivalentes) pode ser empregado e o grupo amina é convertido à succinimida a-través de métodos bem-conhecidos na técnica, incluindo o uso de um excesso (por exemplo, dez equivalentes) de uma amina terciária, tal como dii-sopropiletilamina, em um solvente inerte adequado (por exemplo, diclorometano). Veja, por exemplo, Wollenberg et al., Pat. U.S. N2 4.612.132, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Deve ser compreendido que o grupo succínico pode ser substituído, por exemplo, por substituintes alquila ou --SR, os quais são preparados de uma maneira convencional, para proporcionar succinimida substituída no Terminal N do peptídeo. Tais substituintes alquila são preparados através de reação de uma olefina inferior com anidrido maléico da maneira descrita por Wollenberg et al., supra e substituintes --SR são preparados através de reação de RSH com anidrido maléico, onde R é conforme definido acima; (c) para formar um grupo benziloxicarbonil-NH-- ou benziloxicar-bonil-NH—substituído através de reação com uma quantidade aproximadamente equivalente ou um excesso de CBZ--CI (isto é, cloreto de benziloxi-carbonila) ou um CBZ--CI substituído em um diluente inerte adequado (por exemplo, diclorometano), de preferência contendo uma amina terciária para remover o ácido gerado durante a reação; (d) para formar um grupo sulfonamida através de reação com uma quantidade equivalente ou um excesso (por exemplo, 5 equivalentes) de R--S(0)2 Cl em um diluente inerte adequado (diclorometano) para converter a amina terminal em uma sulfonamida, onde R é conforme definido acima. De preferência, o diluente inerte contém excesso de amina terciária (por exemplo, dez equivalentes), tal como diisopropiletilamina, para remover o ácido gerado durante reação. As condições de reação são, de outro modo, convencionais (por exemplo, temperatura ambiente durante 30 minutos); (e) para formar um grupo carbamato através de reação com uma quantidade equivalente ou um excesso (por exemplo, 5 equivalentes) de R— OC(0)CI ou R—0C(0)0C6H4-p-N02 em um diluente inerte adequado (por exemplo, diclorometano) para converter a amina terminal em um carbamato, onde R é conforme definido acima. De preferência, o diluente inerte contém um excesso (por exemplo, cerca de 10 equivalentes) de uma amina terciária, tal como diisopropiletilamina, para remover qualquer ácido gerado durante reação. As condições de reação são, de outro modo, convencionais (por e-xemplo, temperatura ambiente durante 30 minutos); e (f) para formar um grupo uréia através de reação com uma quantidade equivalente ou um excesso (por exemplo, 5 equivalentes de R— N=C=0 em um diluente inerte adequado (por exemplo, diclorometano) para converter a amina terminal em uma uréia (isto é, um grupo RNHC(0)NH--), onde R é conforme definido acima. De preferência, o diluente inerte contém um excesso (por exemplo, cerca de 10 equivalentes) de uma amina terciária, tal como diisopropiletilamina. As condições de reação são, de outro modo, convencionais (por exemplo, temperatura ambiente durante cerca de 30 minutos). 2. Modificações C-terminais Na preparação de compostos de peptídeos em que o grupo car-boxila C-terminal é substituído por um éster (isto é, ~C(0)0R, onde R é conforme definido acima), as resinas usadas para preparar os ácidos peptídicos são empregadas e o peptídeo com cadeia lateral protegida é clivado com base e o álcool apropriados, por exemplo, metanol. Os grupos de proteção de cadeia lateral são, então, removidos da maneira usual através de tratamento com fluoreto de hidrogênio para obter o éster desejado.

Na preparação de compostos de peptídeos em que o grupo car-boxila C-terminal é substituído pela amida --C(0)NR3R4, uma resina de ben-zidrilamina é usada como o suporte sólido para síntese do peptídeo. Quando de término da síntese, tratamento com fluoreto de hidrogênio para liberar o peptídeo do suporte resulta diretamente na amida peptídica livre (isto é, o Terminal C é --C(0)NH2). Alternativamente, o uso da resina clorometilada durante síntese do peptídeo associado à reação com amônia para clivar o peptídeo com cadeia lateral protegida do suporte proporciona a amida peptídica livre e reação com uma alquilamina ou uma dialquilamina proporciona uma alquilamida ou dialquilamida com cadeia lateral protegida (isto é, o Terminal C é --C(0)NRR1, onde R e R1 são conforme definidos acima). Proteção da cadeia lateral é, então, removida da maneira usual através de tratamento com fluoreto de hidrogênio para proporcionar as amidas, alquilami-das ou dialquilamidas livres.

Pode-se também ciclizar os compostos de peptídeos da invenção ou incorporar um resíduo de desamino ou descarbóxi no término do composto de peptídeo, de modo que não exista grupo amina ou carbóxi terminal, para diminuir a suscetibilidade a proteases ou limitar a conformação do composto de peptídeo. Grupos funcionais C-terminais dos compostos de peptídeos da presente invenção incluem amida, alquil amida inferior, di(alquil)amida inferior, alcóxi inferior, hidróxi e carbóxi e os derivados de éster inferior derivados dos mesmos e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Além das modificações N-terminais e C-terminais precedentes, os compostos peptídicos da invenção, incluindo peptidomiméticos, podem, vantajosamente, ser modificados com ou covalentemente acoplados a um ou uma variedade de polímeros hidrofílicos. Descobriu-se que, quando os compostos peptídicos são derivatizados com um polímero hidrofílico, sua solubi-lidade e meias-vidas em circulação são aumentadas e sua imunogenicidade é disfarçada. O precedente pode ser obtido com pouca, se houver, diminuição em sua atividade de ligação. Polímeros não-proteináceos adequados para uso de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, polialquiléteres, conforme exemplificado por polietileno glicol e poli-propileno glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialcenos, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, celulose e derivados de celulose, dextrano e derivados de dextrano, etc. Geralmente, tais polímeros hidrofílicos têm um peso molecular médio oscilando de cerca de 500 a cerca de 100.000 dál-tons, mais preferivelmente de cerca de 2.000 a cerca de 40.000 dáltons e, ainda mais preferivelmente, de cerca de 5.000 a cerca de 20.000 dáltons. Em modalidades preferidas, tais polímeros hidrofílicos têm pesos moleculares médios de cerca de 5.000 dáltons, 10.000 dáltons e 20.000 dáltons.

Os compostos peptídicos da invenção podem ser derivatizados com ou acoplados a tais polímeros usando qualquer um dos métodos apresentados em Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6: 150-165 (1995); Monfar-dini, C. et al., Bioconjugate Chem., 6: 62-69 (1995); Pat. U.S. N- 4.640.835; Pat. U.S. Ns 4.496.689; Pat. U.S. N° 4.301.144; Pat. U.S. N2 4.670.417; Pat. U.S. Ns 4.791.192; Pat. U.S. N2 4.179.337 ou WO 95/34326, todos os quais são incorporados por referência em sua totalidade aqui.

Em uma modalidade presentemente preferida, os compostos peptídicos da presente invenção são derivatizados com polietileno glicol (PEG). PEG é um polímero linear solúvel em água de unidades repetidas de óxido de etileno com dois grupos hidroxila terminais. PEGs são classificados pelos seus pesos moleculares os quais, tipicamente, oscilam de cerca de 500 dáltons a cerca de 40.000 dáltons. Em uma modalidade presentemente preferida, os PEGs empregados têm pesos moleculares oscilando de 5.000 dáltons a cerca de 20.000 dáltons. PEGs acoplados aos compostos peptídi-cos da presente invenção podem ser ramificados ou não-ramificados. (Veja, por exemplo, Monfardini, C. et al., Bioconjugate Chem., 6: 62-69 (1995)). PEGs estão comercialmente disponíveis da Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)(agora parte da Nektar Therapeutics (San Cario, CA)), Sigma Chemical Co. e outras companhias. Tais PEGs incluem, mas não estão limitados a, monometoxipolietileno glicol (MePEG-OH), monometoxipolitileno glicol-succi-nato (MePEG-S), monometoxipolietileno glicol-succinato de succinimidila (MePEG-S-NHS), monometoxipolietileno glicol-amina (MePEG-Nhb), monometoxipolietileno glicol-tresilato (MePEG-TRES) e monometoxipolietileno glicol -imidazolil-carbonila (MePEG-IM).

Resumidamente, em uma modalidade, o polímero hidrofílico o qual é empregado, por exemplo, PEG, é, de preferência, revestido em uma extremidade por um grupo não-reativo, tal como um grupo metóxi ou etóxi. Após o que, o polímero é ativado na outra extremidade através de reação com um agente de ativação adequado, tal como haletos cianúricos (por exemplo, cloreto, brometo ou fluoreto cianúrico), diimidazol, um reagente de ani-drido (por exemplo, um anidrido dihalossuccínico, tal como anidrido dibro-mossuccínico), azida de acila, p-diazoniobenzil éter, 3-(p-diazoniofenóxi)-(2-hidroxipropiléter) e similares. O polímero ativado é, então, reagido com um composto peptídico da presente invenção para produzir um composto peptí-dico derivatizado com um polímero. Alternativamente, um grupo funcional nos compostos peptídicos da invenção pode ser ativado para reação com o polímero ou os dois grupos podem ser unidos em uma reação de acoplamento associada usando métodos de acoplamento conhecidos. Será prontamente apreciado que os compostos peptídicos da invenção podem ser de-rivatizados com PEG usando uma miríade de outros esquemas de reação conhecidos e usados por aqueles versados na técnica.

Quando esses compostos de peptídeos são derivatizados com um polímero hidrofílico, sua solubilidade e meia-vidas em circulação podem ser aumentadas e sua imunogenicidade é diminuída. O precedente pode ser obtido com pouca, se houver, perda na atividade biológica. Em modalidades preferidas, os peptídeos derivatizados têm uma atividade que é 0,1 a 0,01 vez aquela dos peptídeos não-modificados. Em modalidades mais preferidas, os peptídeos derivatizados têm uma atividade que é 0,1 a 1 vez aquela dos peptídeos não-modificados. Em modalidades ainda mais preferidas, os peptídeos derivatizados têm uma atividade que é maior do que os peptídeos não-modificados. D. Modificações da Cadeia Principal Outros métodos para fazer derivados peptídicos dos compostos da presente invenção são descritos em Hruby et al., Biochem. J., 268 (2): 249-262 (1990), incorporados aqui por referência. Assim, os compostos peptídicos da invenção também servem como modelos estruturais para compostos não-peptídicos com atividade biológica similar. Aqueles versados na técnica reconhecerão que uma variedade de técnicas estão disponíveis para a construção de compostos com a mesma ou uma atividade biológica desejada similar como o composto peptídico principal, mas com uma atividade mais favorável do que o principal com relação à solubilidade, estabilidade e suscetibilidade à hidrólise e proteólise. Veja Morgan et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24: 243-252 (1989), incorporado aqui por referência. Essas técnicas incluem substituição da parte principal do peptídeo por uma cadeia principal composta da fosfonatos, amidatos, carbamatos, sulfonamidas, aminas secundárias e N-metilaminoácidos.

Reagentes adequados incluem, por exemplo, análogos de ami-noácidos em que o grupo carboxila do aminoácido tenha sido substituído por uma porção adequada para formação de uma das ligações acima.

Similarmente, substituição de uma ligação amido no peptídeo por uma ligação fosfonato pode ser obtida da maneira apresentada nas patentes U.S. Nes 5.359.115 e 5.420.328, as descrições das quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. E. Formação de Ligação de Dissulfeto Os compostos da presente invenção podem existir em uma forma ciclizada com uma ligação de dissulfeto intramolecular entre os grupos tióis das cisteínas incorporadas, se presentes. Alternativamente, uma ligação de dissulfeto intermolecular entre os grupos tiol das cisteínas pode ser produzida para proporcionar um composto dimérico (ou oligomérico superior). Um ou mais dos resíduos de cisteína podem também ser substituídos por uma homocisteína. V. Utilidade Os compostos da invenção são úteis in vitro como ferramentas únicas para compreensão do papel biológico da TPO, incluindo a avaliação dos muitos fatores que se acredita influenciar, e serem influenciados, pela produção de TPO e o processo de ligação ao receptor. Os presentes compostos também são úteis no desenvolvimento de outros compostos que se ligam a e ativam o TPO-R, porque os presentes compostos de peptídeos proporcionam informação importante sobre a relação entre estrutura e atividade que facilitaria tal desenvolvimento.

Os compostos de peptídeos também são úteis como aglutinan-tes competitivos em ensaios para selecionar novos agonistas do receptor de TPO. Em tais modalidades de ensaio, os compostos de peptídeos da invenção podem ser usados sem modificação ou podem ser modificados de uma variedade de formas; por exemplo, através de rotulação, tal como união co-valente ou não-covalente de uma porção a qual proporciona, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Em qualquer um desses ensaios, os materiais para os mesmos podem ser rotulados, quer direta ou indiretamente. Possibilidades para rotulação direta incluem grupos de rótulos tais como: radiomar-cadores, tal como 125l, enzimas (Pat. U.S. Na 3.645.090), tais como peroxi-dase e fosfatase alcalina e rótulos fluorescentes (Pat. U.S. Na 3.940.475) capazes de monitoramento da alteração na intensidade de fluorescência, desvio de comprimento de onda ou polarização de fluorescência. Possibilidades para rotulação indireta incluem biotinilação de um constituinte, seguido por ligação à avidina acoplada a um dos grupos de rótulos acima. Os compostos de peptídeos também podem incluir espaçadores ou ligantes em casos onde os compostos de peptídeos têm de ser presos a um suporte sólido.

Além disso, baseado em sua capacidade de se ligar ao receptor de TPO, os compostos de peptídeos da presente invenção podem ser usados como reagentes para a detecção de receptores de TPO em células vivas, células fixas, em fluidos biológicos, em homogenatos teciduais, em materiais biológicos naturais purificados, etc. Por exemplo, através de rotulação de tais peptídeos, pode-se identificar células tendo TPO-R sobre suas superfícies. Além disso, baseado em sua capacidade de se ligar ao receptor de TPO, os peptídeos da presente invenção podem ser usados em coloração in situ. FACS (seleção de células fluorescência-ativada), Western blotting, ELISA, etc. Além disso, baseado em sua capacidade de se ligar ao receptor de TPO, os peptídeos da presente invenção podem ser usados em purificação de receptor ou na purificação de células expressando receptores de TPO sobre a superfície celular (ou dentro de células impermeabilizadas).

Os compostos de peptídeos da presente invenção também podem ser utilizados como reagentes comerciais para vários usos diagnósticos e de pesquisa médica. Tais usos incluem, mas não estão limitados, a: (1) uso como um padrão de calibração para quantificação das atividades dos agonistas de TPO candidatos em uma variedade de ensaios funcionais; (2) uso para manter a proliferação e crescimento de linhagens de células TPO-dependen-tes; (3) uso em análise estrutural do receptor de TPO através de co-cristalização; (4) uso para investigar o mecanismo de transdução de sinal/ ativação de receptor de TPO; e (5) outras aplicações diagnosticas e de pesquisa, em que o receptor de TPO é, de preferência, ativado ou tal ativação é, convenientemente, calibrada contra uma quantidade conhecida de agonista de TPO e similares.

Os compostos de peptídeos da presente invenção podem ser usados para a expansão in vitro de megacariócitos e seus progenitores associados, em conjunto com citocinas adicionais ou em si. Veja, por exemplo, DiGiusto et al., Publicação PCT Ns 95/05843, a qual é incorporada aqui por referência. Quimioterapia e terapia com radiação causam trombocitopenia através de morte da população de megacariócitos mais madura que estão se dividindo rapidamente. Contudo, esses tratamentos terapêuticos também podem reduzir o número e viabilidade de células precursoras de megacarió-citos imaturas menos mitoticamente ativas. Assim, alívio da trombocitopenia pela TPO ou os compostos de peptídeos da presente invenção pode ser acelerado através de infusão, a pacientes em pós-quimioterapia ou terapia com radiação, de uma população de suas próprias células enriquecidas com megacariócitos e precursores imaturos através de cultura in vitro.

Os compostos de peptídeos da invenção também podem ser administrados a animais de sangue quente, incluindo seres humanos, para ativar o TPO-R in vivo. Assim, a presente invenção abrange métodos para o tratamento terapêutico de distúrbios TPO-relacionados que compreendem administração de um composto da invenção em quantidades suficientes para imitar o efeito da TPO ou TPO-R in vivo. Por exemplo, os compostos de peptídeos da invenção podem ser administrados para tratar uma variedade de distúrbios hematológicos incluindo, mas não limitado a, distúrbios plaquetá-rios e trombocitopenia, particularmente quando associada a transfusões da medula óssea, terapia com radiação e quimioterapia.

Em algumas modalidades da invenção, antagonistas de TPO são, de preferência, primeiro administrados a pacientes que estão sofrendo quimioterapia ou terapia com radiação, seguido por administração dos ago-nistas de TPO da invenção. A atividade dos compostos de peptídeos da presente invenção pode ser avaliada in vitro ou in vivo em um dos números modelos descritos em McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14: 8-21 (1992), o qual é incorporado aqui por referência.

De acordo com uma modalidade, as composições da presente invenção são úteis para o tratamento de trombocitopenia associada a transfusões da medula óssea, terapia com radiação ou quimioterapia. Os compostos de peptídeos, tipicamente, serão administrados profilaticamente antes de quimioterapia, terapia com radiação ou transplante de medula óssea ou após tal exposição.

Conseqüentemente, a presente invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo, como um ingrediente ativo, pelo menos um dos compostos de peptídeos da invenção em associação com um veículo ou diluente farmacêutico. Os compostos de peptídeos da presente invenção podem ser administrados através das vias de administração oral, pulmonar, parenteral (intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou subcutânea), inalação (através de uma formulação em pó fino), transdérmi-ca, nasal, vaginal, retal ou sublingual e podem ser formulados em formas de dosagem apropriadas a cada via de administração. Veja, por exemplo, Bernstein et al., Publicação de Patente PCT N° WO 93/25221; Pitt et al., Publicação de Patente PCT Ne WO 94/17784; e Pitt et al., Pedido de Patente Européia 613.683, cada um dos quais é incorporado aqui por referência.

Formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólida, o composto de peptídeo ativo é misturado com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como sacarose, lactose ou amido. Tais formas de dosagem também podem compreender, conforme é prática normal, outras substâncias adicionais que não diluentes inertes, por exemplo, agentes de lubrificação, tal como estearato de magnésio. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem também podem compreender agentes de tamponamento. Comprimidos e pílulas podem, adicionalmente, ser preparados com revestimentos entéricos.

Formas de dosagem líquidas para administração oral incluem emulsões farmaceuticamente aceitáveis, soluções, suspensões, xaropes, com os elixires contendo diluentes inertes comumente usados na técnica, tal como água. Além de tais diluentes inertes, as composições também podem incluir adjuvantes, tais como agentes de umedecimento, agentes de emulsi-ficação e suspensão e adoçantes, flavorizantes e agentes aromáticos.

As preparações de acordo com a presente invenção para administração parenteral incluem soluções estéreis aquosas ou não-aquosas, suspensões ou emulsões. Exemplos de solventes ou veículos não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e óleo de milho, gelatina e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Tais formas de dosagem também podem conter adjuvantes, tais como agentes de conservação, umedecimento, emulsificação e dispersão. Elas podem ser esterilizadas, por exemplo, por meio de filtração através de um filtro de retenção de bactérias, através de incorporação de agentes de esterilização nas composições, através de irradiação das composições ou através de aquecimento das composições. Elas também podem ser fabricadas u-sando água estéril ou algum outro meio estéril injetável, imediatamente antes de uso.

Composições para administração retal ou vaginal são, de preferência, supositórios os quais contêm, além da substância ativa, excipientes, tais como manteiga de cacau ou uma cera para supositório. Composições para administração nasal ou sublingual são também preparadas com excipientes padrão bem-conhecidos na técnica.

As composições contendo os compostos de peptídeos podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente que já sofre de uma doença, conforme descrito acima, em uma quantidade suficiente para curar ou impedir, pelo menos parcialmente, os sintomas da doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para obter isso é definida como "dose terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para esse uso dependerão da gravidade da doença e do peso e estado geral do paciente.

As composições da invenção também podem ser microencapsu-ladas, por exemplo, através do método de Tice e Bibi (em Treatise on Con-trolled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus, Marcei Dekker, New York (1992), páginas 315-339).

Em aplicações profiláticas, composições contendo os compostos de peptídeos da invenção são administradas a um paciente suscetível a ou, de outro modo, em risco de uma doença em particular. Tal quantidade é definida como sendo uma "dose profilaticamente eficaz". Nesse uso, as quantidades precisas dependem, novamente, do estado de saúde e peso do paciente.

As quantidades dos compostos de peptídeos necessárias para terapia eficaz dependerão de muitos fatores diferentes, incluindo meio de administração, local-alvo, estado fisiológico do paciente e outros medicamentos administrados. Assim, as dosagens de tratamento deverão ser tituladas para otimizar a segurança e eficácia. Tipicamente, as dosagens usadas in vitro proporcionam orientação útil quanto às quantidades úteis para administração in situ desses reagentes. Testagem em animais de doses eficazes para tratamento de distúrbios em particular proporcionarão indicação previsível adicional quanto à dosagem humana. Várias considerações são descritas, por exemplo, em Gilman et al. (eds.), Goodman and Gilman’s: The Pharmacolo-gical Basis of Therapeutics, 8a Ed., Pergamon Press (1990); e Remington’s Pharmaceutical Sciences, 7a Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985); cada um dos quais é incorporado aqui por referência.

Os compostos de peptídeos da presente invenção são eficazes no tratamento de condições TPO-mediadas quando administrados em uma faixa de dosagem de cerca de 0,001 mg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia. A dose específica empregada é regulada pela condição que está sendo tratada em particular, a via de administração, bem como o julgamento do médico, dependendo de fatores tais como a gravidade da condição, a idade e condição geral do paciente e similares.

Exemplo 1 Síntese de Peptídeo em Fase Sólida Os compostos de peptídeos da invenção podem ser sintetizados, por exemplo, usando técnicas de síntese em fase sólida de Merrifield (veja Steward e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a edição, Pierce Chemical, Rockford, III. (1984) e Merrifield, J. Am, Chem. Soc.. 85: 2149 (1963)) ou um sintetizador de peptídeo Modelo 431A ou 433A da Applied Biosystems Inc. Os compostos de peptídeos podem ser montados usando os protocolos padrão Synth. Assis.® 1.0.0 ou Synth Assis.® 2.0.2 da Applied Biosystems Inc. Cada acoplamento pode ser realizado 2 vezes durante 30 minutos com HBTU (hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetra-metilurônio) e HOBt (1-hidroxibenzotriazol). A resina usada pode ser resina HMP (resina de (p-hidroximetil fenoximetil)poliestireno) ou PAL (Milligen/Biosearch), a qual é uma resina de poliestireno reticuladamente ligada, com ácido 5-(4-Fmoc-aminometil-3,5’-di-metiloxifenóxi)valérico como um ligante. O uso da resina PAL resulta em uma funcionalidade amida carboxila terminal quando de divagem do peptí-deo da resina. Quando de divagem, a resina HMP produz uma porção ácido carboxílico no Terminal C do produto final. A maioria dos reagentes, resinas e aminoácidos protegidos (livres ou na resina) podem ser adquiridos da Mil-lipore ou Applied Biosystems Inc. O grupo Fmoc pode ser usado para amino-proteção durante o procedimento de acoplamento. Proteção da amina primária nos aminoácidos pode ser obtida com Fmoc e os grupos de proteção de cadeia lateral tais como t-butila para serina, tirosina, ácido glutâmico e treonina; tritila para glu-tamina; Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonila) para arginina; N-t-bu-tiloxicarbonila para triptofano; N-tritila para histidina e S-tritila para cisteína.

Remoção dos compostos de peptídeos da resina e simultânea desproteção das funções da cadeia lateral podem ser obtidas através de tratamento com reagente K ou ligeiras modificações do mesmo. Alternativamente, na síntese desses peptídeos, com uma carboxila término amidada, o peptídeo totalmente montado pode ser clivado com uma mistura de ácido trifluoroacético a 90%, 5% de etanoditiol e 5% de água, inicialmente a 4°C e gradualmente aumentando para a temperatura ambiente. Os compostos de peptídeos desprotegidos podem ser precipitados com di-etil éter. A purificação pode ser através de cromatografia de líquido preparativa de elevado desempenho em fase reversa sobre uma coluna de sílica-gel ligada C18 com um gradiente de acetonitrila/água em ácido trifluoroacético a 0,1%. Os compostos de peptídeos homogêneos podem ser caracterizados através de es-pectrometria de massa Fast Atom Bombardment ou espectrometria de massa por eletropulverização e análise de aminoácido quando aplicável.

Em uma modalidade preferida, os compostos de peptídeos da invenção são dimerizados usando procedimentos sintéticos padrão conhecidos e usados por aqueles versados na técnica. Seguindo esses esquemas sintéticos, aqueles versados na técnica podem preparar prontamente compostos peptídicos diméricos de acordo com a presente invenção. Além disso, será prontamente evidente para aqueles versados na técnica que as subuni-dades diméricas podem ser prontamente ligadas usando metodologias e ligantes conhecidos.

Exemplo 2 Pequilação dos Compostos de Peptídeos Peguilação do composto de peptídeo da presente invenção pode ser realizada através de técnicas bem conhecidas. Por exemplo, um composto de peptídeo da presente invenção pode ser dissolvido em bicina a 100 mM, pH de 8,0, em uma concentração de 10 mg/ml, adicionado em um excesso molar de 1,25 vez de PEG2 em pó (comercialmente disponível da Shear-water Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)) e agitado em temperatura ambiente até que a reação esteja completa, tipicamente 1-2 horas. A reação é monitorada através de HPLC em fase reversa usando um gradiente de acetonitrila a 40-65% com uma coluna YMC ODS AQ. Quando a reação estiver completa, à solução é adicionado um segundo excesso molar de 1,25 de PEG2 em pó e o processo é repetido 4 vezes usando um total de 5 moles de PEG2 para cada mol de polipeptídeo. A solução é diluída 2 vezes com PBS para reduzir a viscosidade e carregada sobre uma coluna Superdex 200 (Pharmacia), previamente equilibrada e eluída com PBS. Frações da coluna de exclusão por tamanho podem ser analisadas através de HPLC de fase reversa. Frações contendo composto de peptídeo di-PEG, as quais eluíram antes de qualquer composto de peptídeo mono-PEG, foram reunidas e armazenadas a 5 °C ou liofilizadas.

Embora somente modalidades preferidas da invenção sejam descritas especialmente acima, será apreciado que modificações e variações da invenção são possíveis sem se afastar do espírito e escopo pretendido da invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims (20)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que se liga a um receptor de trombopoietina, em que o referido composto compreende (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXio)2K-NH2 (SEQ ID NO: 4), em que X10 é selecionado do grupo consistindo em sarcosina ou β-alanina, e em que o referido composto está covalentemente ligado a um polímero hidrofílico que tem um peso molecular médio entre cerca de 500 a cerca de 40.000 dáltons.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xi0 é sarcosina

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xi0 é β-alanina.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polímero hidrofílico tem um peso molecular médio de entre cerca de 5.000 a cerca de 20.000 dáltons.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polímero hidrofílico é selecionado do grupo consistindo em polietileno glicol, polipropileno glicol, ácido poliláctico e ácido poli-glicólico.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polímero hidrofílico é polietileno glicol.

7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada uma das subunidades diméricas do referido composto está covalentemente ligada a um polímero hidrofílico.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido na reivindicação 1, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido na reivindicação 1, acoplado com um agente de acoplamento a pelo menos um polímero tendo um peso molecular de entre cerca de 500 a cerca de 20.000 dáltons selecionado do grupo consistindo em polietileno glicol e polipropileno glicol, em que o referido polímero é não-substituído ou substituído por grupos alcóxi ou alquila, os referidos grupos alcóxi ou alquila possuindo menos do que 5 átomos de carbono.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o referido polímero tem um peso molecular de cerca de 750 a cerca de 15.000 dáltons.

11. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o referido polímero tem um peso molecular de cerca de 5.000 a cerca de 10.000 dáltons.

12. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o referido polímero é polietileno glicol.

13. Método in vitro para ativação de um receptor de trombopoie-tina em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da referida célula com uma quantidade eficaz de um composto que se liga a um receptor de trombopoietina, em que o referido composto compreende (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXio)2K-NH2 (SEQ ID NO: 4), em que Xi0 é selecionado do grupo consistindo em sarcosina ou β-alanina, e em que o referido composto está covalentemente ligado a um polímero hidrofílico que tem um peso molecular médio de entre cerca de 500 a cerca de 40.000 dáltons.

14. Método in vitro de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que X10 é sarcosina.

15. Método in vitro de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido polímero hidrofílico tem um peso molecular de entre cerca de 5.000 a cerca de 20.000 dáltons.

16. Método in vitro de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido polímero é selecionado do grupo consistindo em polietileno glicol, polipropileno glicol, ácido poliláctico e ácido poliglicóli-co.

17. Método in vitro de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido composto está covalentemente ligado a polietileno glicol.

18. Método in vitro de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que Xi0 é β-alanina.

19. Método in vitro de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zado pelo fato de que as referidas células compreendem megacariócitos humanos, plaquetas ou células CD34+.

20. Método in vitro de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as referidas células compreendem células TPO-dependentes.