ES2626107T3 - Péptidos y compuestos que se unen al receptor de trombopoyetina - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que se une a un receptor de trombopoyetina (TPO), en el que dicho compuesto comprende (HIEGPTLRQ( 2-Nal)LAARX10)2KNH2, en el que X10 se selecciona del grupo que consiste en sarcosina o ß-alanina, en el que 2-Nal es ß-(2-naftilo)alanina, y en el que dicho compuesto se une covalentemente a un polímero hidrófilo.

Description

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Peptidos y compuestos que se unen al receptor de trombopoyetina CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona compuestos peptidicos que se unen y activan el receptor de trombopoyetina (c-mpl o TPO-R) o de otro modo actuar como un agonista de TPO. La invencion tiene aplicacion en los campos de la bioqmmica y la qmmica medicinal y particularmente proporciona agonistas de TPO para uso en el tratamiento de la enfermedad humana.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los megacariocitos son celulas derivadas de medula osea, que son responsables para la produccion de plaquetas sangumeas en circulacion. Aunque comprenden <0,25% de las celulas de medula osea en la mayona de las especies, tienen >10 veces el volumen de celulas tfpicas de la medula. Vease Kuter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.uU. 91: 11104-11108 (1994). Los megacariocitos sufren un proceso conocido como endomitosis por la que replican sus nucleos pero fracasan al sufrir division celular y con ello dan lugar a celulas poliploides. En respuesta a una disminucion del recuento de plaquetas, aumenta la velocidad de endomitosis, se forman megacariocitos de ploidia superiores y el numero de megacariocitos puede aumentar hasta 3 posiciones. Vease Harker, J. Clin. Invest., 47: 458 465 (1968). En contraste, en respuesta a un recuento de plaqueta elevado, la tasa endomitotica se disminuye, se forman megacariocitos de ploidia inferiores y el numero de megacariocitos puede disminuir en un 50%.
El mecanismo de retroalimentacion fisiologico exacto por el cual la masa de plaquetas circulantes regula la tasa endomitotica y el numero de megacariocitos de medula osea no se conoce. Ahora se piensa que el factor trombopoyetico circulante implicado en la mediacion de este bucle de realimentacion es trombopoyetina (TPO). Mas espedficamente, la TPO ha mostrado ser el principal regulador humoral en situaciones que implican trombocitopenia. Vease, por ejemplo, Metcalf, Nature, 369: 519 520 (1994). TPO se ha demostrado en varios estudios para aumentar el recuento de plaquetas, aumenta el tamano de las plaquetas y aumenta la incorporacion de isotopos en plaquetas de animales receptores. Espedficamente, se piensa que la TPO afecta la megacariocitopoyesis de varias formas: (1) produce aumentos en el tamano de megacariocitos y numero; (2) produce un aumento en el contenido de ADN, en forma de poliploidfa, en megacariocitos; (3) aumenta la endomitosis de los megacariocitos; (4) produce mayor maduracion de los megacariocitos; y (5) produce un aumento en el porcentaje de celulas precursoras, en la forma de pequenas celulas positivas en acetilcolinesterasa, en la medula osea.
Las plaquetas (trombocitos) son necesarias para la coagulacion de la sangre. Cuando su numero sea muy bajo, un paciente esta en grave riesgo de muerte por hemorragia catastrofica. por lo tanto, la TPO tiene aplicacion util potencial tanto en el diagnostico como el tratamiento de diversos trastornos hematologicos, por ejemplo, enfermedades primariamente debidas a los defectos plaquetarios. Ensayos clmicos en curso con TPO han indicado que TPO puede administrarse de forma segura a los pacientes. Ademas, estudios recientes han proporcionado una base para la proyeccion de la eficacia de la terapia de TPO en el tratamiento de trombocitopenia y particularmente la trombocitopenia resultante de quimioterapia, terapia de radiacion o trasplante de medula osea como tratamiento para el cancer o linfoma. Vease, por ejemplo, McDonald, Am. J. Ped. Hematology/Oncology 14: 821-(1992).
El gen que codifica TPO ha sido clonado y caracterizado. Vease Kuter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 91: 11104-11108 (1994); Cebada, et al., Cell 77: 11171124 (1994);. Kaushansky et al., Nature 369: 568 571-(1994); Wendling, et al., Nature, 369: 571 574 (1994); y Sauvage et al., Nature 369: 533-538 (1994). La trombopoyetina es una glicoprotema con al menos dos formas, con masas moleculares aparentes de 25 kDa y 31 kDa, con una secuencia de aminoacidos N-terminal comun. Vease, Bartley, et al., Cell, 77: 11171124 (1994). Trombopoyetina parece tener dos regiones distintas separadas por un sitio de escision potencial Arg-Arg. La region aminoterminal esta altamente conservada en el hombre y el raton, y tiene alguna homologfa con eritropoyetina y interferon-a y interferon-b. La region carboxiterminal muestra amplia divergencia entre especies.
Las secuencias de ADN y secuencias de peptido codificado para TPO-R humano (tambien conocido como c-mpl) se han descrito. Vease Vigon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89: 5640-5644 (1992). TPO-R es un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento de hematopoyetina, una familia caracterizada por un diseno estructural comun del dominio extracelular, incluyendo cuatro residuos C conservados en la porcion N- terminal y un motivo WSXWS (SEQ ID NO: 1) cerca de la region transmembrana. Vease Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87: 6934-6938 (1990). La evidencia de que este receptor juega un papel funcional en la hematopoyesis incluye observaciones de que su expresion se restringe a bazo, medula osea o hugado fetal en ratones (vease Souyri, et al., Cell 63: 11371147 (1990)) y a megacariocitos, plaquetas y celulas CD34+ en humanos (vease Methia, et al., Blood 82: 13951401-(1993)). Ademas, la exposicion de celulas CD34+ a oligonucleotidos sinteticos antisentido para mpl ARN inhibe significativamente la aparicion de colonias megacariodticas sin afectar eritroide o la formacion de colonias mieloides. Algunos trabajadores postulan que el receptor funciona como un homodfmero, similar a la situacion con los receptores para G-CSF y eritropoyetina.
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La disponibilidad de los genes clonados para TPO-R facilita la busqueda de agonistas de este importante receptor. La disponibilidad de la protema del receptor recombinante permite el estudio de la interaccion de receptor- ligando en una variedad de sistemas de generacion de diversidad peptidica aleatoria y semialeatoria. Estos sistemas se describen en la Patente de Estados Unidos Nos 6.251.864, 6.083.913, 6.l2l.238, 5.932.546, 5.869.451, 6.506.362, y 6.465.430, y en Cwirla et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 63786382 (1990).
De Serres et al., Stem Cells (1999) 17: 316 326 discute la farmacocinetica y los efectos hematologicos de la GW395058 mimetico peptido de trombopoyetina PEGilado en ratas y monos despues de la administracion intravenosa o subcutanea.
La recuperacion lenta de los niveles de plaquetas en pacientes que sufren de trombocitopenia es un problema grave, y ha hecho urgente la busqueda de un agonista del factor de crecimiento sangumeo capaz de acelerar la regeneracion de plaquetas. La presente invencion proporciona tal agonista.
RESUMEN DE LA INVENCION
La presente invencion esta dirigida a compuestos de bajo peso molecular definidos de peptidos de peso que tienen fuertes propiedades de union a la TPO-R, puede activar el TPO-R, y, potencialmente, permitir efectos secundarios reducidos en comparacion con los agonistas de TPO conocidos. Por consiguiente, los compuestos peptfdicos pueden ser utiles para fines terapeuticos en el tratamiento de condiciones mediadas por la tPo (por ejemplo, trombocitopenia resultante de quimioterapia, terapia de radiacion, o transfusiones de medula osea), asf como con fines de diagnostico en el estudio del mecanismo de la hematopoyesis y para el in vitro expansion de megakaroycytes y celulas progenitoras comprometidas.
Los compuestos peptfdicos adecuados para fines terapeuticos y/o diagnosticos tienen un CI50 de aproximadamente 2 mM o menos, determinada por, por ejemplo, el ensayo de afinidad de union expuesto en el Ejemplo 3 de la Patente de EE.UU. N° 5.869.451, en la que un menor CI50 se correlaciona con una mas fuerte afinidad de union a TPO-R. El ensayo en la Patente de Estados Unidos N° 5.869.451 es el siguiente: Las afinidades de union de compuestos peptfdicos se miden en un ensayo de union competitiva. Los pocillos de una placa de microtitulacion se recubren con 1 mg estreptavidina, se bloquearon con PBS/BSA al 1%, seguido de 50 ng de anticuerpo inmovilizante de antirreceptor biotinilado (Ab179). Los pocillos se tratan entonces con una dilucion 1:10 de la cosecha TPO-R soluble. Varias concentraciones de compuesto peptfdico se mezclan con una cantidad constante de una forma truncada de TPO que consiste en los residuos 1156 fusionados al C-termino de la protema de union a maltosa (MBPTPO156). Las mezclas de peptido MBPTPO156 se anadieron a los pocillos recubiertos de TPO-R, se incubaron durante 2 horas a 4°C y despues se lavaron con PBS. La cantidad de MBPTPO156 que esta enlazado en el equilibrio se mide por la adicion de un antisuero de conejo dirigido contra MBP, seguido por IgG anti- conejo de cabra conjugada por fosfatasa alcalina. La cantidad de fosfatasa alcalina en cada pocillo se determina entonces utilizando metodos estandar. El ensayo se realizo en un intervalo de concentraciones del compuesto de peptidos y los resultados se representan graficamente de tal manera que el eje y representa la cantidad de lfmite MBPTPO156 y el eje X representa la concentracion de compuesto peptfdico. Se puede entonces determinar la concentracion a la que el compuesto peptfdico se reducira en un 50% (CI50) la cantidad de MBPTPO156 unido a TPO- R inmovilizada. La disociacion constante (Kd) para el peptido debe ser similar a la CI50 medida utilizando estas condiciones de ensayo. Para fines farmaceuticos, los compuestos peptfdicos tienen preferiblemente un CI50 de no mas de aproximadamente 100 pM, mas preferiblemente, no mas de 500 nM. En una realizacion preferida, el peso molecular del compuesto de peptido es de aproximadamente 250 a aproximadamente 8.000 daltons. Si los compuestos peptfdicos de esta invencion se oligomerizan, dimerizadan y/o derivan con un polfmero hidrofilo como se describe en la presente memoria, los pesos moleculares de dichos compuestos peptfdicos seran sustancialmente mayores y pueden variar desde aproximadamente 500 a aproximadamente 120.000 daltons, mas preferiblemente desde alrededor de 8.000 a alrededor de 80.000 daltons.
Cuando se utilizan para fines de diagnostico, los compuestos peptfdicos de la presente invencion preferiblemente se marcan con un marcador detectable y, en consecuencia, los Compuestos peptfdicos sin una etiqueta tal sirven como intermedios en la preparacion de compuestos peptfdicos marcados.
Un compuesto peptfdico que satisfacen los criterios definidos para el peso molecular y afinidad de union por TPO-R comprende 9 o mas aminoacidos en los que los aminoacidos son aminoacidos de origen natural o sintetico (no natural).
De acuerdo con ello, los compuestos peptfdicos preferidos comprenden un compuesto que tiene:
(1) un peso molecular de menos de aproximadamente 5000 daltons, y
(2) una afinidad de union a TPO-R tal como se expresa por un CI50 de no mas de aproximadamente 100 pM,
en el que de cero a la totalidad de los enlaces --C(O)NH-- del compuesto peptfdico han sido reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste de un enlace CH2OC(O)nR--; un enlace fosfonato; un enlace
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--CH2S(O)2NR--; un enlace --CH2NR--; un enlace --C(O)NR6; y un enlace --NHC(O)NH-- donde R es hidrogeno o alquilo inferior y R6 es alquilo inferior,
ademas en el que el N-termino de dicho compuesto peptidico se selecciona del grupo que consiste en un grupo NRR1; un grupo --NRC(O)R; un grupo --NRC(O)OR; un grupo --NRS(O)2R; un grupo --NHC(O)NHR; un grupo succinimida; un grupo benciloxicarbonilo-NH--; y un grupo benciloxicarbonilo-NH-- que tiene de 1 a 3 sustituyentes en el anillo fenilo seleccionado del grupo que consiste en alquilo inferior, alcoxi inferior, cloro, y bromo, donde R y R1 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno y alquilo inferior,
y aun mas en el que el C-termino de dicho compuesto peptfdico tiene la formula C(O)R2, donde R2 se selecciona del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi inferior, y NR3R4, donde R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno y alquilo inferior y donde el atomo de nitrogeno del grupo -NR3R4 puede ser opcionalmente el grupo amina del N-termino del peptido a fin de formar un peptido dclico y sales fisiologicamente aceptables de los mismos.
Tambien se describe aqrn un compuesto peptfdico marcado que comprende un compuesto de peptido descrito como anteriormente que tiene unido covalentemente al mismo un marcador capaz de deteccion.
En particular, el compuesto de peptido central comprende (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXio)2KNH2, en la que X10 se selecciona del grupo que consiste en sarcosina o p-alanina, en el que 2-nal es p-(2-naftilo)alanina, y en el que dicho compuesto es covalentemente unido a un polfmero hidrofilo de acuerdo con las reivindicaciones. Cuando X10 es una sarcosina, el compuesto tiene la siguiente estructura:
IE G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar)
\
K(NH2)
I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar),
en el que (2-Nal) es p-(2-naftilo)alanina y (Sar) es sarcosina (SEQ ID NO: 7). Este compuesto peptfdico, que tambien puede ser representado por la siguiente estructura (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar))2KNH2 se denomina aqrn "Compuesto TPO N° 1".
Polfmeros hidrofilos adecuados incluyen, pero no se limitan a, polialquileteres como se ejemplifica por polietilenglicol y polipropilenglicol, acido politactico, acido poliglicolico, polioxialquenos, polivinilalcohol, polivinilpirrolidona, derivados de celulosa y celulosa, derivados de dextrano y dextrano, etc., como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.869.451.
Los compuestos peptfdicos descritos en el presente documento son utiles para la prevencion y tratamiento de enfermedades mediadas por la TPO, y particularmente para el tratamiento de trastornos hematologicos, incluyendo, pero no limitado a, trombocitopenia resultante de quimioterapia, terapia de radiacion, o transfusiones de medula osea. Por lo tanto, la presente invencion tambien proporciona compuestos para su uso en un metodo para el tratamiento en el que un paciente que tiene un trastorno que es susceptible al tratamiento con un agonista de TPO recibe, o se administra, una dosis o cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto peptfdico de la presente invencion .
La invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas de los compuestos peptfdicos descritos en el presente documento y un portador fisiologicamente aceptable. Estas composiciones farmaceuticas pueden estar en una variedad de formas, incluyendo formas de dosificacion oral, asf como polvos de inhalacion y soluciones y soluciones inyectables e infusibles.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1 muestra y compara la actividad de Compuesto TPO N° 1 a un compuesto peptfdico de la tecnica anterior (que en todo el presente documento como "compuesto peptfdico de la tecnica"). La diferencia entre Compuesto TPO N° 1 y el compuesto peptfdico de la tecnica anterior es que el compuesto peptfdico de la tecnica anterior tiene una p-(1-naftilo)alanina (1-Nal) donde (2-Nal) esta en Compuesto TPO N° 1.
FIG. 2 muestra y compara la actividad de Compuesto TPO PEGilado N° 1 de compuesto peptfdico de la tecnica anterior PEGilado.
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FIG. 3 muestra y compara el cambio in vivo en los recuentos de plaquetas en la rata que demuestra la potencia relativa de Compuesto TPO PEGilado N° 1 de compuesto peptidico de la tecnica anterior PEGilado.
FIGs. 4 y 5 muestran y comparan el numero y el volumen de plaquetas circulantes de una manera dependiente de la dosis, respectivamente, en el uso de compuesto peptfdico de la tecnica anterior pegilado y el uso de Compuesto TPO PEGilado N° 1.
DESCRIPCION DE REALIZACIONES ESPEdFICAS
I. Definiciones y parametros generales
Las siguientes definiciones se exponen para ilustrar y definir el significado y alcance de los diversos terminos utilizados para describir la presente invencion.
"Agonista" se refiere a un ligando biologicamente activo que se une a su receptor biologicamente activo complementario y activa este ultimo o bien para causar una respuesta biologica en el receptor o para mejorar actividad biologica preexistente del receptor.
"Compuesto peptidico" se refiere a una molecula que se hidroliza en aminoacidos y/o derivados de aminoacidos y/o sustitutos de aminoacidos.
"Sales farmaceuticamente aceptables" se refieren a que el metal alcalino no toxico, metal alcalinoterreo, y sales de amonio utilizado comunmente en la industria farmaceutica incluyendo las sales de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, bario, amonio, y sales de zinc de protamina, que se preparan por metodos bien conocidos en la tecnica. El termino tambien incluye sales de adicion de acido no toxicas, que se preparan generalmente haciendo reaccionar los compuestos de esta invencion con un acido organico o inorganico adecuado. Las sales representativas incluyen las sales de clorhidrato, bromhidrato, sulfato, bisulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, napsilato, y similares.
"Sal de adicion de acido aceptable farmaceuticamente" se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia y las propiedades de las bases libres biologicas y que no son biologicamente o de otra manera indeseables, formadas con acidos inorganicos tales como acido clortndrico, acido bromtndrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico y similares, y acidos organicos tales como acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido malico, acido malonico, acido succmico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido cftrico, acido benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p- toluenosulfonico, acido salidlico y similares. Para una descripcion de sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables como profarmacos, vease Bundgaard, H., supra.
"Ester farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellos esteres que retienen, tras la hidrolisis del enlace ester, la eficacia biologica y las propiedades del acido carboxflico o alcohol y no son biologicamente o de otra manera indeseables. Para una descripcion de esteres farmaceuticamente aceptables como profarmacos, vease Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estos esteres se forman tfpicamente a partir del acido carboxflico correspondiente y un alcohol. Generalmente, la formacion del ester se puede lograr a traves de tecnicas sinteticas convencionales. (Vease, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 4a ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1992), 393-396 y las referencias citadas en el mismo, y Mark, et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Nueva York (1980).) El componente de alcohol del ester comprendera generalmente (i) un alcohol alifatico C2-C12 que puede o no puede contener uno o mas dobles enlaces y que puede o no puede contener carbonos ramificados o (ii) alcoholes aromaticos o heteroaromaticos C7- C12. Esta invencion tambien contempla el uso de aquellas composiciones que son tanto esteres tal como se describe en el presente documento como al mismo tiempo son las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptable de los mismos.
"Amida farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellas amidas que retienen, tras la hidrolisis del enlace amida, la eficacia biologica y las propiedades del acido carboxflico o amina y no son biologicamente o de otra manera indeseables. Para una descripcion de amidas farmaceuticamente aceptables como profarmacos, vease Bundgaard, FT., Ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estas amidas se forman tfpicamente a partir del acido carboxflico correspondiente y una amina. Generalmente, la formacion de amida se puede lograr a traves de tecnicas sinteticas convencionales. (Vease, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 4a ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1992), p. 393 y Mark, et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Nueva York (1980) .) Esta invencion contempla tambien el uso de aquellas composiciones que son tanto amidas tal como se describe en el presente documento y al mismo tiempo son las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptable de los mismos.
"Portador farmaceuticamente o terapeuticamente aceptable" se refiere a un medio de portador que no interfiere con la eficacia de la actividad biologica de los ingredientes activos y que no es toxico para el huesped o
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paciente.
"Estereoisomero" se refiere a un compuesto qmmico que tiene el mismo peso molecular, composicion qmmica, y constitucion que otro, pero con los atomos agrupados de manera diferente. Es dedr, determinados restos qmmicos identicos estan en orientaciones diferentes en el espacio y, por lo tanto, cuando puras, tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada. Sin embargo, algunos estereoisomeros puros pueden tener una rotacion optica que es tan leve que es indetectable con la instrumentacion actual. Los compuestos de la presente invencion pueden tener uno o mas atomos de carbono asimetricos y por lo tanto incluir diversos estereoisomeros. Todos los estereoisomeros estan incluidos dentro del alcance de la invencion.
"Cantidad terapeuticamente o farmaceuticamente efectiva" tal como se aplica a las composiciones de la presente invencion se refiere a la cantidad de composicion suficiente para inducir un resultado biologico deseado. Ese resultado puede ser el alivio de los signos, smtomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteracion deseada de un sistema biologico. En la presente invencion, el resultado implicara tipicamente una disminucion en las respuestas inmunologicas y/o inflamatorias a la infeccion o lesion tisular.
Los residuos de aminoacidos en los peptidos se abrevian del siguiente modo: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es Ile o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Acido aspartico es Asp o D; Acido glutamico es Glu o E; Cistema es Cys o C; Triptofano es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G. Ademas, t-Buo es terc-buliloxi, Bzl es bencilo, CHA es ciclohexilamina, Ac es acetilo, Me es metilo, Pen es penicilamina, Aib es acido aminoisobutmco, Nva es norvalina, Abu es acido aminobutmco, Thi es tienilalanina, OBn es O-bencilo y hyp es hidroxiprolina.
Los analogos peptfdicos de arco utilizan comunmente en la industria farmaceutica como farmacos no peptfdicos con propiedades analogas a las del peptido de molde. Estos tipos de compuestos no peptfdicos se denominan "peptidemimeticos" o "mimeticos peptidicos" o "peptidomimeticos" (Luthman, et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14: 386 406, segunda Ed, Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew Chem. Int. Ed. Engl., 33: 1699-1720 (1994); Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS, p. 392 (1985); y Evans, et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987) Los mimeticos de peptidos que son estructuralmente similares a peptidos utiles se pueden usar terapeuticamente para producir un efecto equivalente o mejorado terapeutico o profilactico. Generalmente, los peptidomimeticos son estructuralmente similares a un polipeptido paradigma (es dear, un polipeptido que tiene una actividad biologica o farmacologica), tal como en estado natural polipeptido receptorbinding, pero tienen uno o mas enlaces peptfdicos opcionalmente reemplazados por un enlace alternativo tal como --CH2NH--, --CH2S --, etc. por metodos conocidos en la tecnica y ademas se describen en las siguientes referencias: Spatola, A.F. en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds, Marcel Dekker, Nueva York, p.. 267 (1983); Spatola, AF, Vega Data (marzo de 1983), vol. 1, Issue 3, modificaciones del esqueleto peptfdico (revision general); Morley, Trends Pharm. Sci. pp 463 468 (1980), (revision general).; Hudson, et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 14: 177 185 (1979);. Spatola, et al., Life Sci., 38: 12431249 (1986); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1,307314 (1982); Almquist, et al., J. Med. Chem., 23: 13921398, (1980); JenningsWhite, et al., Tetrahedron Left. 23: 2533 (1982); Szelke, et al., Appin Europea. EP 45665 (1982);. Holladay, et al., Tetrahedron Lett., 24: 44014404 (1983);. y Hruby, Life Sci, 31: 189-199 (1982). Un enlace no peptfdico particularmente preferido es -CH2NH--. Tales mimeticos de peptidos pueden tener ventajas significativas sobre realizaciones de polipeptidos, incluyendo, por ejemplo: produccion mas economica, mayor estabilidad qmmica, propiedades farmacologicas mejoradas (vida media, absorcion, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biologicas), antigenicidad reducida, y otros. El etiquetado de los peptidomimeticos usualmente implica la union covalente de una o mas etiquetas, directamente o a traves de un espaciador (por ejemplo, un grupo amida), a la posicion en el peptidomimetico que se predicen por datos de actividad de estructura cuantitativa y/o modelado molecular que no interfiere. Tales posiciones no interferentes en general son posiciones que no forman contactos directos con las macromoleculas (por ejemplo, moleculas de la superfamilia de inmunoglobulinas) a la que el peptidomimetico se une para producir el efecto terapeutico. La derivatizacion (por ejemplo, etiquetado) de peptidomimeticos no debe interferir sustancialmente con la actividad biologica o farmacologica deseada del peptidomimetico. Generalmente, los peptidomimeticos de peptidos de union a receptor se unen al receptor con alta afinidad y poseen una actividad biologica detectable (es dear, son agonistas o antagonistas a uno o mas cambios fenotfpicos mediados por receptor).
La sustitucion sistematica de uno o mas aminoacidos de una secuencia de consenso con un D-amino acido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede utilizar para generar peptidos mas estables. Ademas, los peptidos constrenidos que comprenden una secuencia de consenso o una variacion de secuencia de consenso sustancialmente identica pueden generarse por metodos conocidos en la tecnica (Rizo, et al., Ann Rev. Biochem, 61:387 (1992); por ejemplo, mediante la adicion de residuos de cistema internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclan el peptido.
"Marcador detectable" se refiere a materiales, que cuando se unen covalentemente a los compuestos peptfdicos de esta invencion, permiten la deteccion de los compuestos de peptidos in vivo en el paciente al que se ha administrado el compuesto peptfdico. Los marcadores detectables adecuados son bien conocidos en la tecnica e
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incluyen, a modo de ejemplo, radioisotopos, marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluorescema), y similares. El marcador detectable particular empleado no es cntico y se selecciona en relacion con la cantidad de marcador para ser empleado, asf como la toxicidad de la etiqueta en la cantidad de marcador empleada. La seleccion de la etiqueta en relacion con dichos factores esta bien dentro de la experiencia de la tecnica.
La union covalente del marcador detectable al compuesto peptidico se logra por metodos convencionales bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, cuando el radioisotopo 125I se emplea como el marcador detectable, la union covalente de 125I al compuesto peptfdico se puede lograr mediante la incorporacion del aminoacido de tirosina en el compuesto peptfdico y luego yodar el compuesto peptfdico (vease, por ejemplo, Weaner, et al., Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds, pp. 137-140 (1994)). La incorporacion de tirosina al terminal N o C del compuesto peptfdico se puede lograr mediante qmmica bien conocida. Del mismo modo, 32P se puede incorporar en el compuesto peptfdico como un resto fosfato a traves de, por ejemplo, un grupo hidroxilo en el compuesto peptfdico usando la qmmica convencional.
II. Vision de conjunto
La presente invencion proporciona compuestos peptfdicos que se unen a y activan el TPO-R o de otra forma se comportan como un agonista de TPO de acuerdo con las reivindicaciones. Estos compuestos peptfdicos incluyen compuestos peptfdicos "principales" y "derivados" construidos de manera que tenga la misma o similar estructura molecular o forma que los compuestos peptfdicos principales pero que difieren de los compuestos peptfdicos principales, ya sea con respecto a la susceptibilidad a la hidrolisis o proteolisis y/o con respecto a otras propiedades biologicas, tales como aumento de la afinidad por el receptor. La presente invencion tambien proporciona composiciones, de acuerdo con las reivindicaciones, que comprenden una cantidad eficaz de un compuesto peptfdico, y mas particularmente un compuesto peptfdico, que es util para el tratamiento de trastornos hematologicos y, particularmente, la trombocitopenia asociada con quimioterapia, radioterapia o transfusiones de medula osea.
Se encontro que el compuesto peptfdico central puede comprender una secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2): Xg X8 G X1 X2 X3 X4 X5 Xa X7, donde X6 puede ser p-(2-naftilo)alanina y donde Xg es A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T, o V; y X8 es A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, o V. Mas preferentemente, Xg es A o I; y X8 es D, E, o K. Ademas X1 es C, L, M, P, Q, V; X2 es F, K, L, N, Q, R, S, T o V; X3 es C, F, I, L, M, R, 5, V o W; X4 es cualquiera de los 20 L-aminoacidos codificados geneticamente; X5 es A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V o Y; y X7 es C, G, I, K, L, M, N, R o V.
Sin embargo, como se describe adicionalmente en este documento, se ha encontrado que mediante la sustitucion de X6 con p-(2-naftilo)alanina, el compuesto proporciona propiedades diferentes de compuesto que contiene p-(1- naftilo)alanina. En consecuencia, un peptido particularmente preferido incluye la secuencia de aminoacidos (H- IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX-i0)2K-NH2, en el que X10 se selecciona del grupo que consiste en sarcosina o p-alanina, en el que 2-Nal es p-(2-naftilo)alanina, y en el que dicho compuesto se une covalentemente a un polfmero hidrofilo.
Un compuesto peptfdico preferido es de la siguiente manera:
I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar)
\
K(NEb)
/
I E G P T L R Q (2-Nal) L A AR-(Sar)
en el que (2-Nal) es p-(2-naftilo)alanina y (Sar) es sarcosina (SEQ ID NO: 7). Este compuesto peptfdico se denomina aqm como "Compuesto TPO N° 1".
Compuestos peptfdicos que tienen una CI50 de mas de aproximadamente 100 mM carecen de union suficiente para permitir el uso en cualquiera de los aspectos de diagnostico o terapeuticos de esta invencion. Preferiblemente, para fines de diagnostico, los compuestos peptfdicos tienen un CI50 de aproximadamente 2 mM o menos y, para fines farmaceuticos, los compuestos peptfdicos tienen una CI50 de aproximadamente 100 |jM o menos.
FIG. 1 compara la actividad de tres diferentes lotes de Compuesto TPO N° 1 con un lote de compuesto peptfdico de la tecnica anterior utilizando tecnicas de ensayo de unidades luminiscentes relativas estandar. El ensayo emplea celulas murinas de ingeniena genetica para expresar de forma estable el receptor de TPO humano y un constructo indicador de luciferasa dirigido por el promotor fos. La diferencia entre el Compuesto TPO N° 1 y el compuesto peptfdico de la tecnica anterior es que el compuesto peptfdico de la tecnica anterior tiene un p-(1- naftilo)alanina (1 Nal) donde el (2-Nal) esta en Compuesto tPo N° 1. El Compuesto TPO N° 1 se refiere como 2-Nal y el compuesto peptfdico de la tecnica anterior se conoce como 1 -Nal (tecnica anterior) en la FIG. 1. Como se muestra en la FIG. 1, la actividad es similar para cada compuesto.
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FIG. 2 compara la actividad de varios lotes diferentes de Compuesto TPO PEGilado N° 1 (pegilacion de los compuestos de la presente invencion se describe con mas detalle a continuacion) para varios lotes de compuesto peptidico PEGilado de la tecnica anterior. Ambos lotes del compuesto peptidico PEGilado de la tecnica anterior de alta actividad previa con esencialmente el mismo nivel de actividad que el compuesto peptfdico de la tecnica anterior no PEGilado. Las lmeas restantes ilustran la actividad de diferentes lotes de Compuesto TPO PEGilado N° 1. Como se muestra en la FIG. 2, en este modelo, los ultimos tienen menos actividad en relacion con los compuestos peptfdicos PEGilados de la tecnica anterior. Compuesto TPO PEGilado N° 1 se conoce como compuesto peptfdico de la tecnica anterior PEG-2-Nal y PEGilada se conoce como PEG-1-Nal (tecnica anterior) en la FIG. 2.
FIG. 3 demuestra la potencia relativa de compuesto peptfdico PEGilado de la tecnica anterior y Compuesto TPO PEGilado N° 1. A traves de un modelo de rata, la FIG. 3 muestra el cambio in vivo en los recuentos de plaquetas despues de la administracion de compuesto peptfdico PEGilado de la tecnica anterior y Compuesto TPO PEGilado N° 1. Como se muestra en la FIG. 3, la dosis mas alta del compuesto TPO PEGilado N° 1 tiene la misma actividad que la dosis mas baja del compuesto peptfdico PEGilado de la tecnica anterior. Un compuesto menos potente puede proporcionar un estfmulo menos drastico a la celula diana, lo que podna reducir el riesgo de efectos secundarios causados por sobreestimulacion de la celula diana, tales como trombocitopenia exacerbada tras subsiguiente ciclo de quimioterapia. El Compuesto TPO PEGilado N° 1 se conoce como compuesto peptfdico de la tecnica anterior PEG2-Nal y PEGilada se conoce como PEG-1-Nal (tecnica anterior) en la FIG. 3.
FIGs. 4 y 5 muestran los resultados de un estudio de respuesta a la dosis cara a cara de un compuesto peptfdico PEGilado de la tecnica anterior y Compuesto TPO PEGilado N° 1 en ratones normales. El Compuesto TPO PEGilado N° 1 se conoce como compuesto peptfdico de la tecnica anterior PEG2-Nal y PEGilada se conoce como PEG-1-Nal (tecnica anterior) en las FIGS. 4 y 5. FIG. 4 muestra los aumentos en los niveles de plaquetas y la FIG. 5 muestra volumen medio de plaquetas seis (6) dfas despues del tratamiento. El intervalo de dosis era de 10 a 3000ug/kg. Ambos compuestos peptfdicos aumentaron el numero de plaquetas circulantes de una manera dependiente de la dosis con incrementos relativos al grupo de control observado a dosis tan bajas como 30ug/kg para ambos compuestos. En la respuesta maxima, estos compuestos peptfdicos elevaron recuentos de plaquetas a niveles que eran hasta 4 posiciones mayores que los valores de control. Las curvas de dosis-respuesta para estos compuestos peptfdicos fueron muy similares, indicando que en este modelo no hubo esencialmente ninguna diferencia entre los dos artmulos de prueba sobre la base de estos criterios de valoracion.
IV. Preparacion de compuestos peptfdicos
A. Smtesis en fase solida
Los compuestos peptfdicos de la invencion se pueden preparar por metodos clasicos conocidos en la tecnica, por ejemplo, utilizando tecnicas de fase solida estandar. Los metodos estandar incluyen la smtesis de fase solida exclusiva, metodos de smtesis en fase solida parciales, condensacion de fragmentos, smtesis clasica en solucion, e incluso por tecnologfa de ADN recombinante. Vease, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963). En fase solida, la smtesis se comenzo tfpicamente desde el extremo C-terminal del peptido utilizando una resina protegida alfa-amino. Un material de partida adecuado puede ser preparado, por ejemplo, uniendo el acido alfaamino requerido a una resina clorometilada, una resina de hidroximetilo, o una resina de benzhidrilamina. Una tal resina clorometilada se vende bajo el nombre comercial BlO-BEADS SX-1 por Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, y la preparacion de la resina de hidroximetilo esta descrita por Bodonszky, et al., Chem. Ind (Londres), 38: 1597 (1966). La resina de benzhidrilamina (BHA) ha sido descrita por pietta y Marshall, Chem. Commn., 650 (1970) y esta comercialmente disponible de Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, Calif., en la forma de hidrocloruro.
Asf, los compuestos peptfdicos de la invencion se pueden preparar por acoplamiento de un aminoacido protegido por alfaamino a la resina clorometilada con la ayuda de, por ejemplo, catalizador de bicarbonato de cesio, segun el metodo descrito por Gisin, Helv. Chim.. Acta, 56: 1467 (1973). Despues del acoplamiento inicial, el grupo protector alfaamino se elimina por una eleccion de reactivos que incluyen el acido trifluoroacetico (TFA) o soluciones de acido clorhfdrico (HC1) en disolventes organicos a temperatura ambiente.
Los grupos protectores alfaamino son los conocidos por ser utiles en la tecnica de la smtesis por etapas de peptidos. Grupos incluidos son protectores de tipo acilo (por ejemplo, formilo, trifluoroacetilo, acetilo), grupos aromaticos protectores de tipo uretano (por ejemplo, benciloxicarboilo (Cbz) y Cbz sustituido), grupos de uretano alifaticos protectores (por ejemplo, t-butiloxicarbonilo (Boc), isopropiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo) y grupos protectores de tipo alquilo (por ejemplo, bencilo, trifenilmetilo). Boc y Fmoc son grupos protectores preferidos. El grupo protector de cadena lateral permanece intacto durante el acoplamiento y no se separa durante la desproteccion del protector de amino-termino o durante el acoplamiento. El grupo protector de cadena lateral debe ser extrafble a la finalizacion de la smtesis del peptido final y bajo condiciones de reaccion que no alteraran el peptido objetivo.
La cadena lateral de los grupos protectores para Tyr incluyen tetrahidropiranilo, terc-butilo, tritilo, bencilo, Cbz, Z--br--CBZ, y 2,5-diclorobencilo. La cadena lateral de los grupos protectores para Asp incluyen bencilo, 2,6-
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diclorobencilo, metilo, etilo y ciclohexilo. La cadena lateral de los grupos protectores para Thr y Ser incluyen acetilo, benzoilo, tritilo, tetrahidropiranilo, bencilo, 2,6-diclorobencilo, y Cbz. El grupo protector de cadena lateral para Thr y Ser es bencilo. La cadena lateral de los grupos protectores para Arg incluyen nitro, tosilo (Tos), Cbz, adamantiloxicarbonilo mesitoilsulfonilo (Mts) o Boc. La cadena lateral de los grupos protectores para Lys incluyen Cbz, 2-clorobenciloxicarbonilo (2-Cl--Cbz), 2-bromobenciloxicarbonilo (2-BrCbz), Tos, o Boc.
Despues de la eliminacion del grupo protector alfa-amino, los restantes aminoacidos protegidos se acoplan paso a paso en el orden deseado. Un exceso de cada aminoacido protegido se utiliza generalmente con un activador del grupo carboxilo apropiado tal como dicielohexilcarbodiimida (DCC) en solucion, por ejemplo, en mezclas de cloruro de metileno (CH2O2), dimetilformamida (DMF).
Despues de la secuencia de aminoacidos deseada ha sido completada, el peptido deseado es desacoplado del soporte de resina mediante tratamiento con un reactivo tal como acido trifluoroacetico o fluoruro de hidrogeno (FH), que no solo escinde el peptido de la resina, sino que tambien escinde todos los grupos protectores restantes de la cadena lateral. Cuando se usa la resina clorometilada, los resultados del tratamiento de fluoruro de hidrogeno en la formacion de los acidos peptfdicos libres. Cuando se usa la resina de benzhidrilamina, el tratamiento de fluoruro de hidrogeno resulta directamente en el amida de peptido libre. Alternativamente, cuando se emplea la resina clorometilada, el peptido protegido de cadena lateral puede ser desacoplado por tratamiento de la resina peptfdica con amornaco para dar la amida protegida de cadena lateral deseada o con una alquilamina para dar una alquilamida o diallcilamida protegida por cadena lateral. La proteccion de la cadena lateral se elimina a continuacion de la forma habitual por tratamiento con fluoruro de hidrogeno para dar las amidas libres, alquilamidas, o dialquilamidas.
Estos procedimientos de smtesis de peptidos en fase solida son bien conocidos en la tecnica y se describen en mas detalle por John Morrow Stewart y Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Syntheses (2a Ed., Pierce Chemical Company, 1984).
B. Aminoacidos sinteticos
Estos procedimientos tambien se pueden utilizar para sintetizar peptidos en los que los aminoacidos distintos de los 20 de origen natural, aminoacidos codificados geneticamente estan sustituidos en una, dos o mas posiciones de cualquiera de los compuestos de la invencion. Uno puede sustituir las cadenas de origen natural laterales de los 20 aminoacidos codificados geneticamente (o aminoacidos D) con otras cadenas laterales, por ejemplo con grupos tales como alquilo, alquilo inferior, alquilo dclico de 4, 5, 6, a 7 miembros, amida, amida de alquilo inferior, diamida (alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi, carboxi y los derivados de ester inferior del mismo, y con 4, 5, 6, a 7 miembros heterodclicos. En particular, analogos de prolina en los que el tamano del anillo del residuo de prolina se cambia de 5 miembros a 4, 6, o 7 miembros se pueden emplear. Los grupos dclicos pueden ser saturados o insaturados, y si estan insaturados, pueden ser aromaticos o no aromaticos. Los grupos heterodclicos contienen preferentemente uno o mas heteroatomas de nitrogeno, oxfgeno y/o azufre. Ejemplos de tales grupos incluyen los grupos frirazanilo, trilo, imidazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo (por ejemplo morfolino), oxazolilo, piperacinilo (por ejemplo 1 -piperazinilo), piperidilo (por ejemplo 1- piperidilo, piperidino), piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo (por ejemplo, 1 -pirrolidinilo), pirrolinilo, pirrolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, tiomorfolinilo (por ejemplo tiomorfolino) y triazolilo. Estos grupos heterodclicos pueden estar sustituidos o no sustituidos. Cuando esta sustituido un grupo, el sustituyente puede ser alquilo, alcoxi, halogeno, oxfgeno o fenilo sustituido o no sustituido.
Tambien se puede modificar facilmente los peptidos de la presente invencion por fosforilacion (vease, por ejemplo, W. Bannwarth, et al., Biorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6(17): 2141-2146 (1996)), y otros metodos para hacer derivados de peptidos de los compuestos de la presente invencion se describen en Hruby, et al., Biochem. J., 268 (2): 249262 (1990). Por lo tanto, los compuestos peptfdicos de la invencion tambien sirven como base para preparar mimeticos peptfdicos con actividad biologica similar.
C. Modificaciones terminales
Los expertos en la tecnica reconocen que una variedad de tecnicas estan disponibles para la construccion de compuestos peptfdicos con la misma o similar actividad biologica deseada que el compuesto peptfdico correspondiente pero con actividad mas favorable que el compuesto peptfdico con respecto a la solubilidad, estabilidad y susceptibilidad a la hidrolisis y proteolisis. Vease, por ejemplo, Morgan, et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24: 243 252 (1989). A continuacion se describen metodos para la preparacion de compuestos peptfdicos modificados en el grupo amino N-terminal, el grupo carboxilo C-terminal, y/o cambiar uno o mas de los enlaces amido en el peptido a un enlace nonamido. Se ha de entender que dos o mas de tales modificaciones pueden ser acopladas en una estructura de compuesto peptfdico (por ejemplo, la modificacion en el grupo carboxilo C-terminal e inclusion de un enlace carbamato -CH2 entre dos aminoacidos en el compuesto peptfdico).
1. Modificaciones N-terminales
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Los compuestos peptidicos tipicamente se sintetizan como el acido libre pero, como se senalo anteriormente, se podnan preparar facilmente como la amida o ester. Tambien se puede modificar el amino y/o termino carboxi de los compuestos peptidicos de la invencion para producir otros compuestos de la invencion. Modificaciones de termino amino incluyen la metilacion, acetilacion, anadiendo un grupo benciloxicarbonilo, o el bloqueo del termino amino con cualquier grupo bloqueante que contiene una funcionalidad de carboxilato definida por RCOO--, En donde R se selecciona del grupo que consiste en naftilo, acridinilo, esteroidilo, y grupos similares. Modificaciones carboxi terminal incluyen el reemplazo del acido libre con un grupo carboxamida o la formacion de una lactama dclica en el termino carboxi para introducir restricciones estructurales.
Modificaciones de termino amino tienen los significados definidos anteriormente e incluyen alquilacion, acetilacion, anadiendo un grupo carbobenzoilo, formando un grupo succinimida, etc. (Vease, por ejemplo, Murray, et al., Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, quinta ed., Vol. 1, Manfred E. Wolf, ed, John Wiley and Sons, Inc. (1995)) Espedficamente, el grupo amino N-terminal se puede hacer reaccionar de la siguiente manera:
(a) para formar un grupo amida de la formula RC(O)NH--donde R es como se definio anteriormente por reaccion con un haluro de acido o anddrido simetrico. Tfpicamente, la reaccion puede ser llevada a cabo poniendo en contacto cantidades aproximadamente equimolares o en exceso (por ejemplo, aproximadamente 5 equivalentes) de un haluro de acido con el peptido en un diluyente inerte (por ejemplo, diclorometano) que contiene preferiblemente un exceso (por ejemplo, aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina, para secuestrar el acido generado durante la reaccion. Las condiciones de reaccion son por lo demas convencionales (por ejemplo, temperatura ambiente durante 30 minutos). La alquilacion del amino terminal para proporcionar una N-sustitucion de alquilo inferior seguida de reaccion con un haluro de acido como se describe anteriormente proporcionara un grupo de amida N-alquilo de la formula RC(O)NR--;
(b) para formar un grupo succinimida por reaccion con anddrido sucdnico. Como antes, una cantidad aproximadamente equimolar o un exceso de anddrido succmico (por ejemplo, aproximadamente 5 equivalentes) puede emplearse y el grupo amino se convierte en la succinimida por metodos bien conocidos en la tecnica incluyendo el uso de un exceso (por ejemplo, diez equivalentes) de una amina terciaria tal como diisopropiletilamina en un disolvente inerte adecuado (por ejemplo, diclorometano). Vease, por ejemplo, Wollenberg, et al., Patente de Estados Unidos. N° 4.612.132. Se entiende que el grupo succmico se puede sustituir con, por ejemplo, alquilo o--sustituyentes SR, que se preparan de una manera convencional para proporcionar la succinimida sustituida en el N-termino del peptido. Dichos sustituyentes de alquilo se preparan por reaccion de una olefina inferior con anddrido maleico en la forma descrita por Wollenberg, et al., supra y--sustituyentes SR se preparan por reaccion de RSH con anddrido maleico, donde R es como se define anteriormente;
(c) para formar un grupo de benciloxicarbonilo-NH-- o benciloxicarbonilo-NH-- sustituido por reaccion con aproximadamente una cantidad equivalente o un exceso de CBZ--Cl (es dear, cloruro de benciloxicarbonilo) o un CBZ--Cl sustituido en un diluyente inerte adecuado (por ejemplo, diclorometano) que contiene preferiblemente una amina terciaria para depurar el acido generado durante la reaccion;
(d) para formar un grupo sulfonamida por reaccion con una cantidad equivalente o un exceso (por ejemplo, 5 equivalentes) de R--S(O)2 Cl en un diluyente inerte adecuado (diclorometano) para convertir la amina terminal en una sulfonamida en la que R es como se define anteriormente. Preferiblemente, el diluyente inerte contiene un exceso de amina terciaria (por ejemplo, diez equivalentes) tal como diisopropiletilamina, para depurar el acido generado durante la reaccion. Las condiciones de reaccion son de otra manera convencionales (por ejemplo, temperatura ambiente durante 30 minutos);
(e) para formar un grupo de carbamato por reaccion con una cantidad equivalente o un exceso (por ejemplo, 5 equivalentes) de R--OC(O)Cl o R--OC(O)OC6 H4 p-NO2 en un diluyente inerte adecuado (por ejemplo, diclorometano) para convertir la amina terminal en un carbamato, donde R es como se define anteriormente. Preferiblemente, el diluyente inerte contiene un exceso (por ejemplo, aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina, para depurar cualquier acido generado durante la reaccion. Las condiciones de reaccion son por lo demas convencionales (por ejemplo, temperatura ambiente durante 30 minutos); y
(f) para formar un grupo urea por reaccion con una cantidad equivalente o un exceso (por ejemplo, 5 equivalentes) de R-N=C=O en un diluyente inerte adecuado (por ejemplo, diclorometano) para convertir la amina terminal en un grupo de urea (es dear, RNHC(O)NH--) en el que R es como se define anteriormente. Preferiblemente, el diluyente inerte contiene un exceso (por ejemplo, aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamina. Las condiciones de reaccion son por lo demas convencionales (por ejemplo, temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos).
2. Modificaciones C-terminales
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En la preparacion de compuestos peptidicos en los que el grupo carboxilo C-terminal se sustituye por un ester (es dedr, --C(O)OR en el que R es como se ha definido anteriormente), se emplean las resinas utilizadas para preparar los acidos peptidicos y el peptido de cadena lateral protegido se escinde con la base y el alcohol apropiado, por ejemplo, metanol. Grupos protectores de cadena lateral se retiran entonces de la forma habitual por tratamiento con fluoruro de hidrogeno para obtener el ester deseado.
En la preparacion de compuestos peptfdicos en los que el grupo carboxilo C-terminal se sustituye por la amida --C(O)NR3R4, una resina de benzhidrilamina se utiliza como soporte solido para la smtesis de peptidos. Al completarse la smtesis, el tratamiento de fluoruro de hidrogeno para liberar el peptido a partir de los resultados de apoyo directamente en la amida de peptido libre (es dedr, el C-termino es --C(O)NH2). Alternativamente, el uso de la resina clorometilada durante la smtesis peptfdica acoplada con reaccion con amoniaco para escindir el peptido protegido de cadena lateral del soporte produce la amida de peptido libre y la reaccion con una alquilamina o una dialquilamina produce una alquilamida o dialquilamida de cadena lateral protegida (es dedr, el C-termino es -- C(O)NRR1 donde R yR1 son como se define arriba). Proteccion de la cadena lateral se elimina a continuacion de la forma habitual por tratamiento con fluoruro de hidrogeno para producir las amidas libres, alquilamidas o dialquilamidas.
Tambien se puede ciclar los compuestos peptfdicos de la invencion, o incorporar un desamino o residuo descarboxi en los terminos del compuesto peptfdico, de modo que no existe un grupo amino terminal o carboxilo, para disminuir la susceptibilidad a proteasas o para restringir la conformacion del compuesto peptidico. Los grupos funcionales C-terminales de los compuestos peptfdicos de la presente invencion incluyen amida, amida de alquilo inferior, amida di(alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi y carboxi, y los derivados de ester inferior de los mismos, y las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
Ademas de las modificaciones N-terminal y C-terminales anteriores, los compuestos peptfdicos de la invencion, incluyendo peptidomimeticos, ventajosamente se pueden modificar con o covalentemente acoplarse a una o mas de una variedad de polfmeros hidrofilos. Se ha encontrado que cuando los compuestos peptfdicos son derivatizados con un polfmero hidrofilo, su solubilidad y vidas medias de circulacion se aumentan y su inmunogenicidad se enmascara. Lo anterior se puede lograr con poca, o ninguna disminucion en su actividad de union. Polfmeros no proteicos adecuados para su uso de acuerdo con la presente invencion incluyen, pero no se limitan a polialquileteres como se ejemplifica por polietilenglicol y polipropilenglicol, acido polilactico, acido poliglicolico, polioxialquenos, polivinilalcohol, polivinilpirrolidona, celulosa y derivados de celulosa, dextrano y derivados de dextrano, etc. Generalmente, tales polfmeros hidrofilos tienen un peso molecular medio que vana de aproximadamente 500 a aproximadamente 100.000 daltons, mas preferiblemente de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 40.000 daltons y, lo mas preferiblemente, de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 20.000 daltons. En realizaciones preferidas, tales polfmeros hidrofilos tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 5.000 daltons, 10.000 daltons y 20.000 daltons.
Los compuestos peptfdicos de la invencion se pueden derivatizar con o acoplarse a dichos polfmeros usando cualquiera de los metodos establecidos en Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6: 150-165 (1995); Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem., 6: 6269 (1995); Patente de Estados Unidos. N° 4.640.835; Patente de Estados Unidos. N° 4.496.689; Patente de Estados Unidos. N° 4.301.144; Patente de Estados Unidos. N° 4.670.417; Patente de Estados Unidos. N° 4.791.192; Patente de Estados Unidos. N° 4.179.337 o WO 95/34326.
En una realizacion actualmente preferida, los compuestos peptfdicos de la presente invencion se derivatizan con polietilenglicol (PEG). PEG es un polfmero lineal, soluble en agua de unidades de repeticion de oxido de etileno con dos grupos hidroxilo terminales. pEg se clasifican por sus pesos moleculares que tfpicamente vanan desde aproximadamente 500 daltons a aproximadamente 40.000 daltons. En una realizacion actualmente preferida, los PEG empleados tienen pesos moleculares que vanan de 5.000 daltons a aproximadamente 20.000 daltons. PEG acoplado a los compuestos peptfdicos de la presente invencion puede ser o bien ramificado o no ramificado. (Vease, por ejemplo, Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem., 6: 6269 (1995)). Los PEG estan disponibles comercialmente de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.) (ahora parte de Nektar Therapeutics (San Carlo, CA), Sigma Chemical Co. y otras empresas. Tales PEG incluyen, pero no se limitan a, monometoxipolietilenglicol (MePEGOH), glycolsuccinate monometoxipolietileno (MePEGS), monometoxipolietileno glicolsuccinimidilo succinato (MePEGS- NHS), glicolamina monometoxipolietileno (MePEGNH2), monometoxipolietileno glicoltresilato (MePEG-TRES), y monometoxipolietileno glicolimidazolilcarbonilo (MePEG-IM).
Brevemente, en una realizacion, el polfmero hidrofilo que se emplea, por ejemplo, PEG, tiene un tope preferiblemente en un extremo por un grupo no reactivo tal como un grupo metoxi o etoxi. A partir de entonces, el polfmero se activa en el otro extremo mediante reaccion con un agente de activacion adecuado, tal como haluros cianuricos (por ejemplo, cloruro cianurico, bromuro o fluoruro), diimadozle, un reactivo de anhfdrido (por ejemplo, un anhfdrido dihalosuccmico, tales como anhfdrido dibromosuccmico), acilo azida, p-diazoiumbencilo eter, 3-(p- diazoniofenoxi)-2-hidroxipropileter) y similares. El polfmero activado se hace reaccionar entonces con un compuesto peptfdico de la presente invencion para producir un compuesto peptfdico derivatizado con un poifmero. Alternativamente, un grupo funcional en los compuestos peptfdicos de la invencion puede ser activado para la reaccion con el polfmero, o los dos grupos se pueden unir en una reaccion de acoplamiento concertado utilizando
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los metodos de acoplamiento conocidos. Se apreciara facilmente que los compuestos peptidicos de la invencion se pueden derivatizar con PEG utilizando un gran numero de otros esquemas de reaccion conocidos y usados por los expertos en la tecnica.
Cuando los compuestos peptidicos son derivatizados con un polfmero hidrofflico, su solubilidad y vidas medias de circulacion se aumentan y su inmunogenicidad se reduce. Lo anterior se puede lograr con poca, o ninguna, perdida en la actividad biologica. En realizaciones preferidas, los peptidos derivatizados tienen una actividad que es de 0,1 a 0,01 veces de los peptidos no modificados. En realizaciones mas preferidas, los peptidos derivatizados tienen una actividad que es de 0,1 a 1 veces de los peptidos no modificados. En formas de realizacion aun mas preferidas, los peptidos derivatizados tienen una actividad que es mayor que los peptidos no modificados.
D. Modificaciones de la columna
Otros metodos para hacer derivados de peptidos de los compuestos de la presente invencion se describen en Hruby, et al., Biochem J., 268 (2): 249-262 (1990). Por lo tanto, los compuestos peptfdicos de la invencion tambien sirven como modelos estructurales para compuestos no peptfdicos con actividad biologica similar. Los expertos en la tecnica reconocen que una variedad de tecnicas estan disponibles para la construccion de compuestos con la misma o similar actividad biologica deseada que el compuesto peptfdico mas destacado pero con actividad mas favorable que la ventaja con respecto a la solubilidad, estabilidad y susceptibilidad a la hidrolisis y proteolisis. Vease Morgan, et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24: 243-252 (1989). Estas tecnicas incluyen la sustitucion de la cadena principal del peptido con una cadena principal compuesta de fosfonatos, amidatos, carbamatos, sulfonamidas, aminas secundarias y acidos N-metilamino.
Los reactivos adecuados incluyen, por ejemplo, los analogos de aminoacidos en el que el grupo carboxilo del aminoacido ha sido reemplazado con un resto adecuado para formar uno de los enlaces anteriores. Del mismo modo, la sustitucion de un enlace amido en el peptido con un enlace fosfonato se puede conseguir de la manera expuesta en la Patente de EE.UU. Nos 5.359.115 y 5.420.328.
E. Formacion de enlace de disulfuro
Los compuestos de la presente invencion pueden existir en una forma ciclada con un enlace de disulfuro intramolecular entre los grupos tiol de las cistemas incorporadas, si esta presente. Como alternativa, un enlace de disulfuro intermolecular entre los grupos tiol de las cistemas puede producirse para producir un compuesto dimerico (u oligomerico superior). Uno o mas de los residuos de cistema tambien pueden estar sustituidos con una homocistema.
V. Utilidad
Los compuestos peptfdicos de la invencion son utiles in vitro como herramientas unicas para entender la funcion biologica de la TpO, incluyendo la evaluacion de los muchos factores que se cree que influyen, y son influenciados por, la produccion de TPO y el proceso de union al receptor. Los presentes compuestos de peptidos tambien son utiles en el desarrollo de otros compuestos que se unen y activan el TPO-R, debido a que los presentes compuestos peptfdicos proporcionan informacion importante sobre la relacion entre estructura y actividad que debe facilitar dicho desarrollo.
Los compuestos peptfdicos tambien son utiles como ligantes competitivos en ensayos para pantalla para nuevos agonistas del receptor de TPO. En tales ensayos, los compuestos peptfdicos de la invencion se pueden usar sin modificacion o se pueden modificar en una variedad de maneras; por ejemplo, mediante el etiquetado, tal como unir covalentemente o no covalentemente un resto que proporciona directa o indirectamente una senal detectable. En cualquiera de estos ensayos, los materiales de la misma se pueden marcar directa o indirectamente. Las posibilidades para el marcaje directo incluyen grupos de marcadores tales como: radiomarcadores tales como 125I, enzimas (Patente de Estados Unidos N° 3.645.090) tal como peroxidasa y fosfatasa de alcalina (Patente de Estados Unidos N° 3.940.475), y marcadores fluorescentes capaces de monitorizar el cambio en la intensidad de fluorescencia, cambio de longitud de onda, o polarizacion de fluorescencia. Las posibilidades para el marcaje indirecto incluyen biotinilacion de un constituyente seguida de union a avidina acoplada a uno de los grupos marcadores anteriores. Los compuestos peptfdicos pueden incluir tambien espaciadores o enlazadores en los casos en que los compuestos peptfdicos han de ser unidos a un soporte solido.
Ademas, basandose en su capacidad para unirse al receptor de TPO, los compuestos peptfdicos de la presente invencion se pueden utilizar como reactivos para detectar receptores de TPO en celulas vivas, celulas fijas, en fluidos biologicos, en homogeneizados de tejido, en materiales purificados, biologicos naturales, etc. Por ejemplo, mediante el etiquetado de dichos compuestos peptfdicos, se puede identificar celulas que tienen TPO-R en sus superficies. Ademas, en base a su capacidad para unir el receptor de TPO, los compuestos peptfdicos de la presente invencion pueden utilizarse en tincion in situ, FACS (clasificacion de celulas activada por fluorescencia), transferencia de Western, ELISA, etc. Ademas, en base a su capacidad para unirse al receptor de TPO, los compuestos peptfdicos de la presente invencion se pueden utilizar en la purificacion del receptor, o en la purificacion
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de celulas que expresan receptores de TPO en la superficie celular (o dentro de celulas permeabilizadas).
Los compuestos peptidicos de la presente invencion tambien pueden utilizarse como reactivos comerciales para diversos usos de investigacion medica y de diagnostico. Tales usos incluyen, pero no se limitan a: (1) uso como un estandar de calibracion para cuantificar las actividades de los candidatos agonistas de TPO en una diversidad de ensayos funcionales; (2) uso para mantener la proliferacion y el crecimiento de lmeas celulares dependientes de TPO; (3) uso en el analisis estructural del receptor TPO a traves de cocristalizacion; (4) uso para investigar el mecanismo de activacion de transduccion/receptor de senal TPO; y (5) otras aplicaciones de investigacion y de diagnostico donde el receptor TPO se activa preferiblemente o dicha activacion es convenientemente calibrada frente a una cantidad conocida de un agonista de TPO, y similares.
Los compuestos peptfdicos de la presente invencion se pueden utilizar para la expansion in vitro de megacariocitos y sus progenitores comprometidos, tanto en conjuncion con citocinas adicionales como por su cuenta. Vease, por ejemplo, DiGiusto, et al., Publicacion PCT N° 95/05843. Las terapias de quimioterapia y de radiacion causan trombocitopenia mediante la eliminacion de la poblacion de megacariocitos mas madura que se divide rapidamente. Sin embargo, estos tratamientos terapeuticos pueden reducir tambien el numero y la viabilidad de las celulas precursoras de megacariocitos inmaduras, menos mitoticamente activas. Por lo tanto, la mejora de la trombocitopenia por la TPO o los compuestos peptfdicos de la presente invencion pueden acelerarse mediante la infusion de los pacientes tras quimioterapia o terapia de radiacion con una poblacion de sus propias celulas enriquecidas para megacariocitos y precursores inmaduros por cultivo in vitro.
Los compuestos peptfdicos de la invencion tambien se pueden administrar a animales de sangre caliente, incluyendo seres humanos, para activar el TPO-R in vivo. Asf, la presente invencion abarca el uso de los compuestos reivindicados en metodos para el tratamiento terapeutico de trastornos relacionados con TPO que comprenden la administracion de un compuesto peptfdico de la invencion en cantidades suficientes para imitar el efecto de TPO en TPO-R in vivo. Por ejemplo, los compuestos peptfdicos de la invencion se pueden administrar para tratar una variedad de trastornos hematologicos, incluyendo pero no limitados a trastornos de las plaquetas y la trombocitopenia, particularmente cuando se asocian con transfusiones de medula osea, radioterapia, y quimioterapia.
Antagonistas de TPO se pueden administrar primero a pacientes sometidos a quimioterapia o radioterapia, seguido por la administracion de los agonistas de TPO de la invencion.
La actividad de los compuestos peptfdicos de la presente invencion se puede evaluar, ya sea in vitro o in vivo en uno de los numerosos modelos descritos en McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992).
De acuerdo con una realizacion, las composiciones de la presente invencion son utiles para tratar la trombocitopenia asociada con transfusiones de la medula osea, radioterapia o quimioterapia. Los compuestos peptfdicos tfpicamente seran administrados profilacticamente antes de la quimioterapia, radioterapia o trasplante de medula osea o despues de tal exposicion.
De acuerdo con ello, la presente invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden, como ingrediente activo, al menos uno de los compuestos peptfdicos de la invencion en asociacion con un portador o diluyente farmaceutico. Los compuestos peptfdicos de esta invencion se pueden administrar por via oral, pulmonar, parental (intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutanea), inhalacion (a traves de una formulacion en polvo fino), transdermica, nasal, vaginal, rectal, o sublingual de administracion y puede formularse en formas de dosificacion apropiadas para cada via de administracion. Vease, por ejemplo, Bernstein, et al., Publicacion de Patente PCT N° WO 93/25221; Pitt, et al., Publicacion de Patente PCT N° WO 94/17784.; y Pitt, et al., Solicitud de Patente Europea 613.683.
Formas de dosificacion solidas para administracion oral incluyen capsulas, comprimidos, pfldoras, polvos, y granulos. En tales formas de dosificacion solidas, el compuesto peptfdico activo se mezcla con al menos un portador farmaceuticamente aceptable inerte tal como sacarosa, lactosa o almidon. Tales formas de dosificacion tambien pueden comprender, como es practica normal, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, agentes tales como estearato de magnesio lubricante. En el caso de capsulas, comprimidos, y pfldoras, las formas de dosificacion tambien pueden comprender agentes tamponantes. Los comprimidos y pfldoras pueden prepararse adicionalmente con recubrimientos entericos.
Formas de dosificacion lfquidas para administracion oral incluyen emulsiones farmaceuticamente aceptables, soluciones, suspensiones, jarabes, con los elixires que contienen diluyentes inertes usados comunmente en la tecnica, tales como agua. Ademas de dichos diluyentes inertes, las composiciones tambien pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspension, y edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes.
Las composiciones segun esta invencion para administracion parental incluyen soluciones esteriles acuosas
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o no acuosas, suspensiones o emulsiones. Ejemplos de disolventes o portadores no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de mafz, gelatina, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Tales formas de dosificacion tambien pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes y agentes dispersantes. Se pueden esterilizar mediante, por ejemplo, filtracion a traves de un filtro de retencion, mediante la incorporacion de agentes esterilizantes en las composiciones, irradiando las composiciones bacterianas, o calentando las composiciones. Tambien se pueden fabricar utilizando agua esteril, o algun otro medio inyectable esteril, inmediatamente antes del uso.
Las composiciones para la administracion rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden contener, ademas de la sustancia activa, excipientes tales como manteca de cacao o una cera de supositorio. Las composiciones para administracion nasal o sublingual tambien se preparan con excipientes estandar bien conocidos en la tecnica.
Las composiciones que contienen los compuestos peptfdicos se pueden administrar para tratamientos profilacticos y/o terapeuticos. En aplicaciones terapeuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya padece una enfermedad, como se describio anteriormente, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los smtomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapeuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependeran de la gravedad de la enfermedad y del peso y estado general del paciente.
Las composiciones de la invencion tambien se pueden microencapsular mediante, por ejemplo, el metodo de Tice y Bibi (en Treatise on Controlled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus, Marcel Dekker, Nueva York (1992), pp. 315-339).
En aplicaciones profilacticas, las composiciones que contienen los compuestos peptfdicos de la invencion se administran a un paciente susceptible a o de otra manera en riesgo de una enfermedad particular. Tal cantidad se define para ser una "dosis profilacticamente eficaz". En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud y el peso del paciente.
Las cantidades de compuesto peptfdico necesarias para una terapia eficaz dependeran de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administracion, sitio diana, estado fisiologico del paciente, y otros medicamentos administrados. Por lo tanto, las dosis de tratamiento deben titularse para optimizar la seguridad y eficacia. Tfpicamente, las dosificaciones usadas in vitro pueden proporcionar una grna util en las cantidades utiles para la administracion in situ de estos reactivos. Las pruebas en animales de dosis eficaces para el tratamiento de trastornos particulares proporcionara una indicacion predictiva adicional de la dosificacion humana. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en Gilman, et al. (eds), Goodman y Gilman: Las bases farmacologicas de la terapeutica, 8a ed., Pergamon Press (1990); y Remington's Pharmaceutical Sciences, 7a Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985).
Los compuestos peptfdicos de esta invencion son eficaces en el tratamiento de condiciones mediadas por TPO cuando se administra en un intervalo de dosificacion de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por dfa. La dosis espedfica empleada esta regulada por la afeccion particular a tratar, la via de administracion, asf como por el juicio del medico a cargo dependiendo de factores tales como la gravedad de la condicion, la edad y el estado general del paciente, y similares .
EJEMPLO 1
Smtesis de peptidos de fase solida
Los compuestos peptfdicos de la invencion se pueden sintetizar, por ejemplo, utilizando las tecnicas de smtesis en fase solida de Merrifield (vease Steward y Young, smtesis de peptidos en fase solida, 2a edicion, Pierce Chemical, Rockford, Ill., (1984) y MelTifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963)) o un Applied Biosystems Inc. Sintetizador de peptidos de Modelo 431A o 433A. Los compuestos peptfdicos pueden ser ensamblados utilizando protocolos estandar de Applied Biosystems Inc. Synth Assist™ 1.0.0 o Synth Assist™ 2.0.2. Cada acoplamiento se puede realizar para 2x30 mm. con HBTU (2-(1H-benzatriazol-1-ilo)-1,1,3,3-hexafluorofosfato de tetrametiluronio) y HOBt (1-hidroxibenzotriazol).
La resina utilizada puede ser de resina HMP (p-hidroximetilo fenoximetilo) resina de poliestireno o PAL (Milligen/Biosearch), que es una resina de poliestireno reticulado con 5-(4'-Fmoc-aminometilo-3,5'-dimetioxifenoxi) acido valerico como enlazador. El uso de resina PAL resulta en una funcionalidad de amida terminal de carboxilo tras la escision del peptido de la resina. Tras la escision, la resina de HMP produce un resto de acido carboxflico en el C-termino del producto final. La mayona de los reactivos, resinas y aminoacidos protegidos (libres o en la resina) se pueden comprar de Millipore o Applied Biosystems Inc.
El grupo Fmoc se puede utilizar para la proteccion de amino durante el procedimiento de acoplamiento.
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proteccion amina primaria en los aminoacidos se puede lograr con los grupos de proteccion Fmoc y la cadena lateral, tales como t-butilo para serina, tirosina, acido glutamico, y treonina; tritilo para glutamina; Pme (2,2,5,7,8- pentametilcroman-6-sulfonilo) para arginina; Nt-butiloxicarbonilo para triptofano; N-tritilo para histidina y S-tritilo para cistema.
La eliminacion de los compuestos peptidicos de la resina y desproteccion simultanea de las funciones de la cadena lateral se pueden lograr por tratamiento con reactivo K o leves modificaciones. Alternativamente, en la smtesis de los peptidos, con un termino de carboxilo amidado, el peptido totalmente ensamblado se puede escindir con una mezcla de 90% de acido trifluoroacetico, 5% de etanoditiol y 5% de agua, inicialmente a 4°C, y aumentandose gradualmente a temperatura ambiente. Los compuestos peptfdicos desprotegidos se pueden precipitar con eter dietflico. La purificacion puede ser mediante cromatograffa preparativa, reversa, lfquida de alto rendimiento en una columna de gel de sflice enlazada C18 con un gradiente de acetonitrilo/agua en acido trifluoroacetico al 0,1%. Los compuestos peptfdicos homogeneos pueden caracterizarse por espectrometna de masa Bombardeo de Atomo Rapido o de masas de electrospray y analisis de aminoacidos cuando sea aplicable.
Los compuestos peptfdicos de esta invencion se dimerizan utilizando procedimientos sinteticos estandar conocidos y utilizados por los expertos en la tecnica. Despues de estos esquemas sinteticos, los expertos en la tecnica pueden preparar facilmente compuestos de peptidos dimericos de acuerdo con la presente invencion. Ademas, sera facilmente evidente para los expertos en la tecnica que las subunidades dimericas facilmente se pueden ligar utilizando metodologfas y enlazadores conocidos.
EJEMPLO 2
La pegilacion de los compuestos peptfdicos
La pegilacion de un compuesto peptfdico de la presente invencion puede llevarse a cabo por tecnicas bien conocidas. Por ejemplo, un compuesto peptfdico de la invencion se puede disolver en 100 mM de bicina pH 8,0 a una concentracion de 10 mg/ml, se anadio a un exceso molar 1,25 veces de PEG2 pulverizado (comercialmente disponible de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)) y se agito a temperatura ambiente hasta completarse la reaccion, tipicamente 12 horas. La reaccion se controlo por HPLC de fase inversa usando un gradiente de acetonitrilo 40-65% con una columna YMC ODS AQ. Cuando la reaccion es completa, se anade la solucion a un segundo exceso molar de 1,25 de polvo PEG2 y el proceso se repite 4 veces utilizando un total de 5 moles de PEG2 para cada mol de polipeptido. La solucion se diluye 2 veces con PBS para reducir la viscosidad y se cargo en una columna Superdex 200 (Pharmacia), previamente equilibrada y se eluyo con PBS. Las fracciones de la columna de exclusion de tamano se pueden analizar por HPLC de fase inversa. Las fracciones que conteman compuesto di- PEG-peptfdico que se eluye antes de cualquier compuesto mono-PEG-peptidico puede combinarse y almacenarse a 5° C o liofilizarse.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ORTHO-MCNEIL PHARMACEUTICAL INC.
<120> PEPTIDOS Y COMPUESTOS QUE UNEN A UN RECEPTOR
<130> P043113EP
<140> EP 04781153.4
<141> 2004-08-13
<150> US 60/498,740 <151> 2003-08-28
<160>7
<170> PatentIn ver. 3.3
<210> 1 <211>5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Motivo de peptido sintetico
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<221> misc_feature <222> 3
<223> Xaa = cualquier amino acido
<400> 1
Trp ser xaa Trp Ser 1 5
<210>2 <211> 10 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> misc_feature <222> 1
<223> Xaa = Ala, Cys, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Gln, Ser, Thr, or Val <220>
<221> Misc_feature <222> 2
<223> Xaa = Ala, Cys, Asp, Glu, Lys, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, or Val <220>
<221> Misc_feature <222> 4
<223> Xaa = Cys, Leu, Met, Pro, Gln, or Val <220>
<221> Misc_feature <222> 5
<223> Xaa = Phe, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, or Val <220>
<221> Misc_feature <222> 6
<223> Xaa = Cys, Phe, Ile, Leu, Met, Arg, Ser, Val, or Trp <220>
<221> Misc_feature <222>7
<223> Xaa = cualquier amino acido <220>
<221> Misc_feature <222>8
<223> Xaa = Ala, Asp, Glu, Gly, Lys, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, or Tyr <220>
<221> Misc_feature <222>9
<223> Xaa = b-(2-naftilo)alanina <220>
<221> Misc_feature <222> 10
<223> Xaa = Cys, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Arg, or Val
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<400>2
xaa Xaa Gly xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa Xaa 1 5 10
<210>3 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223>Peptido sintetico <220>
<221> Misc_feature <222>9
<223> Xaa = b-(2-naftilo)alanina <400> 3
lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Xaa Leu Ala Ala Arg Ala 1 5 10
<210> 4 <211> 15 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> Misc_feature <222> 9
<223> Xaa = b-(2-naftilo)alanina <220>
<221> Misc_feature <222> 15
<223> Xaa = sarcosina o beta-alanina <400> 4
lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Xaa Leu Ala Ala Arg Ala xaa 15 10 15
<210> 5 <211> 13 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> Misc_feature <222> 9
<223> Xaa = b-(2-naftilo)alanina <400> 5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
lie
1
Glu Gly Pro
Thr
5
Leu Arg Gin Xaa
Leu
10
Ala Ala Arg
<210>6 <211> 13 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Peptido sintetico
<220>
<221> Misc_feature <222>9
<223> Xaa = b-(1-naftilo)alanina <400> 6
lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Xaa Leu Ala Ala Arg 1 5 10
<210>7 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Peptido sintetico <220>
<221> Misc_feature <222> 9
<223> Xaa = b-(2-naftilo)alanina <220>
<221> Misc_feature <222> 14
<223> Xaa = sarcosina o beta-alanina <400> 7
lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin xaa Leu Ala Ala Arg xaa 1 5 10

Claims (31)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto que se une a un receptor de trombopoyetina (TPO), en el que dicho compuesto comprende (H- IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXio)2KNH2, en el que X10 se selecciona del grupo que consiste en sarcosina o p-alanina, en el que 2-Nal es p-(2-naftilo)alanina, y en el que dicho compuesto se une covalentemente a un polfmero hidrofilo.
  2. 2. El compuesto de la reivindicacion 1, en el que X10 es sarcosina.
  3. 3. El compuesto de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que dicho polfmero hidrofilo tiene un peso molecular medio de entre aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 daltons.
  4. 4. El compuesto de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que dicho polfmero hidrofilo tiene un peso molecular medio de entre aproximadamente 5.000 a aproximadamente 20.000 daltons.
  5. 5. El compuesto de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde dicho polfmero se selecciona de entre el grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, acido polilactico y acido poliglicolico.
  6. 6. El compuesto de la reivindicacion 5, en el que dicho compuesto se une covalentemente a polietilenglicol.
  7. 7. El compuesto de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que cada una de las subunidades dimericas de dicho compuesto se une covalentemente a un polfmero hidrofilo.
  8. 8. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable.
  9. 9. El compuesto de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 para su uso en el tratamiento de un paciente que sufre de un trastorno que es susceptible al tratamiento con un agonista de la trombopoyetina, que comprende la administracion al paciente de una dosis o cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la reivindicacion 1.
  10. 10. Una composicion de polipeptido soluble en agua sustancialmente no inmunogenica fisiologicamente activa, que comprende un compuesto de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, y en el que dicho polfmero se selecciona de entre el grupo que consiste en polietilenglicol y polipropilenglicol, y en el que dicho polfmero esta insustituido o sustituido con grupos alcoxi o alquilo, dicho alcoxi o grupos alquilo que poseen menos de 5 atomos de carbono.
  11. 11. La composicion de polipeptido segun la reivindicacion 10, en el que dicho polfmero tiene un peso molecular de aproximadamente 750 a aproximadamente 15.000 daltons.
  12. 12. La composicion de polipeptido segun la reivindicacion 10, en el que dicho polfmero tiene un peso molecular de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 10.000 daltons.
  13. 13. La composicion de polipeptido segun la reivindicacion 11, en el que dicho polfmero es polietilenglicol.
  14. 14. Una composicion de polipeptido soluble en agua sustancialmente no inmunogenica que comprende la composicion de la reivindicacion 10 y un portador farmaceuticamente aceptable.
  15. 15. Un compuesto para uso en la activacion de un receptor de trombopoyetina (TPO) en una celula, en el que dicho compuesto comprende (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX-i0)2KNH2, en el que X10 se selecciona del grupo que consiste en sarcosina o p-alanina, en el que 2-Nal es p-(2-naftilo)alanina, y en el que dicho compuesto se une covalentemente a un polfmero hidrofilo.
  16. 16. El compuesto para uso segun la reivindicacion 15, en el que X10 es sarcosina.
  17. 17. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 15 o 16, en donde dichas celulas comprenden megacariocitos humanos, plaquetas o celulas CD34+.
  18. 18. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 15 o 16, en donde dichas celulas comprenden celulas dependientes de TPO.
  19. 19. El compuesto de la reivindicacion 1 o 2 para uso en un metodo de tratamiento de la trombocitopenia en un sujeto, comprendiendo el metodo:
    (a) obtener una poblacion de dichas celulas del sujeto que comprende celulas precursoras de megacariocitos;
    (b) poner en contacto dichas celulas con el compuesto para activar los receptores de trombopoyetina en las celulas; y
    (c) administrar dichas celulas puestas en contacto a dicho sujeto, para aumentar el numero de
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    megacariocitos presentes en dicho sujeto en comparacion con la que se producina sin tal tratamiento.
  20. 20. El compuesto para uso segun la reivindicacion 19 en el que dicha trombocitopenia es debido a la quimioterapia.
  21. 21. El compuesto para uso segun la reivindicacion 20, donde dicha poblacion de celulas es obtenido antes de dicha quimioterapia.
  22. 22. El compuesto para uso segun la reivindicacion 19 en el que dicha trombocitopenia se debe a la terapia de radiacion.
  23. 23. El compuesto para uso segun la reivindicacion 22, donde dicha poblacion de celulas es obtenida antes de dicha terapia de radiacion.
  24. 24. Un compuesto para uso en el tratamiento de un paciente que sufre de thromboeytopenia, que comprende la administracion a dicho paciente de una dosis terapeuticamente eficaz de un compuesto que comprende (H- IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXi0)2KNH2, en el que X10 se selecciona del grupo que consiste en sarcosina o p-alanina, en el que 2-Nal es p-(2-naftilo)alanina, y en el que dicho compuesto es covalentemente unido a un polfmero hidrofilo.
  25. 25. El compuesto para uso segun la reivindicacion 24, en el que X10 es sarcosina.
  26. 26. El compuesto para uso segun la reivindicacion 24 o 25 en el que dicha trombocitopenia es debida a la quimioterapia o terapia de radiacion.
  27. 27. El compuesto para uso segun la reivindicacion 24 o 25, en donde un antagonista de TPO se administra a dicho paciente antes de dicha terapia de quimioterapia o radiacion.
  28. 28. El compuesto para uso segun la reivindicacion 24 o 25 en el que dicha trombocitopenia es debida a la transfusion de medula osea.
  29. 29. Un compuesto para su uso en el tratamiento profilactico de un paciente en riesgo de trombocitopenia, que comprende la administracion a dicho paciente de una cantidad profilacticamente eficaz de un compuesto que comprende (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2KNH2, en el que X10 se selecciona del grupo que consiste en sarcosina o 1p-alanina, en el que 2-Nal es p-(2-naftilo)alanina, y en el que dicho compuesto se une covalentemente a un polfmero hidrofilo.
  30. 30. El compuesto para uso segun la reivindicacion 29, en el que X10 es sarcosina.
  31. 31. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicacion 29 o 30 en el que dicho compuesto es administrado antes del trasplante de medula osea, quimioterapia o terapia de radiacion.
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