KR20120108967A - 코일드 코일 및/또는 테더 함유 단백질 복합체 및 그의 용도 - Google Patents

코일드 코일 및/또는 테더 함유 단백질 복합체 및 그의 용도 Download PDF

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KR20120108967A
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에린 에이치. 크리스텐센
댄 엘. 이튼
앤드류 씨. 벤델
베른드 브라닉
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 코일드 코일 (coiled coil) 및/또는 테더 (tether)를 사용하여 제작된 조작된 단백질 복합체, 및 그러한 복합체, 예를 들어 다중특이적 항체 또는 다른 다중특이적 Fc 함유 복합체를 제조, 사용 및 정제하기 위한 방법을 제공한다.

Description

코일드 코일 및/또는 테더 함유 단백질 복합체 및 그의 용도{COILED COIL AND/OR TETHER CONTAINING PROTEIN COMPLEXES AND USES THEREOF}
본 발명은 신규한 조작된 단백질, 다중특이적 단백질 복합체, 예를 들어 다중특이적 항체, 그의 제작 및 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다중특이적 단백질 복합체를 얻는데 있어서 유용한 기술의 새로운 용도에 관한 것이다.
상업적 및 치료적 목적을 위해 유용하고 확장가능한 다중특이적 항체를 제작하기 위한 기술을 발견하는 것은 달성하기 힘들었다. 많은 방법이 시도되었지만, 거의 모두 다른 문제 중에서도 예를 들어 난용성이고, 포유동물 세포 내에서 발현가능하지 않고, 낮은 수율의 이종이량체 형성을 나타내고, 기술적으로 제조하기 어렵고, 면역원성이고, 생체 내 반감기가 짧고, 불안정한 것과 같은 심각한 단점이 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., (1993) PNAS 90:6444-6448]; US 5,932,448; US 6,833,441; US 5,591,828; US 7,129,330; US 7,507,796; [Fischer et al., (2007) Pathobiology 74:3-14]; [Booy (2006) Arch. Immunol. Ther. Exp. 54:85-101]; [Cao et al. (2003) 55:171-197]; 및 [Marvin et al., (2006) Current Opinion in Drug Discovery & Development 9(2):184-193]). 따라서, 다중특이적 항체를 제조하기 위해 개선된 기술 및 공정이 필요하다.
<발명의 개요>
본 발명은 신규한 단백질 복합체, 및 단백질 복합체의 생성 및 제조 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 Fc CH 성분에 연결된 코일드 코일 (coiled coil) 도메인을 포함하고, 상기 코일드 코일 도메인은 원하는 경우에 Fc 함유 단백질로부터 절단가능할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 테더 (tether) 및 Fc CH 성분 복합체를 포함하는 단백질을 포함하고, 상기 테더는 단백질로부터 절단가능할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 적합하게는 단백질 복합체를 형성할 수 있는 코일드 코일, 테더 및 Fc CH 성분을 포함하는 단백질을 포함하고, 상기 테더 및/또는 코일드 코일은 목적하는 효과에 따라 단백질로부터 절단가능할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 테더를 포함하는 단백질의 제조 공정을 제공하고, 여기서 테더는 숙주 세포에 의해 절단되거나 시험관 내에서 화학적 또는 효소적 반응에 의해 절단된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 적합하게는 단백질 복합체를 형성할 수 있는 코일드 코일, 테더 및 Fc CH 성분을 포함하는 단백질을 포함하고, 상기 테더 및/또는 코일드 코일은 단백질을 발현하고 단백질로부터 테더 및/또는 코일드 코일을 절단할 수 있는 효소를 과다발현하는 숙주 세포에 의해 단백질로부터 절단가능하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 코일드 코일 및 테더를 포함하는 단백질 또는 단백질 복합체의 제조 공정을 제공하고, 여기서 테더 및/또는 코일드 코일은 숙주 세포에 의해 절단되거나 시험관 내에서 화학적 또는 효소적 반응에 의해 절단된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 단백질 복합체는 Fc CH 성분을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 동일한 또는 상이한 재조합 핵산 서열로부터 2가지 상이한 단백질을 발현하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 이종성 단백질 복합체의 제조 방법을 포함하고, 여기서 각각의 단백질은 코일드 코일 도메인 및 테더를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 테더 및/또는 코일드 코일을 절단할 수 있는 효소를 코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제조 방법은 숙주 세포에 의해 제조된 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제조 방법은 숙주 세포에 의해 생산된 단백질로부터 테더 및/또는 코일드 코일을 절단하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 테더 및/또는 코일드 코일을 갖거나 갖지 않는 본원에 기재된 단백질 복합체를 포함한다. 본원에 제공된 많은 진보와 잇점에 추가로, 본 발명은 실질적으로 균질한 이종다량체성 복합체를 제조하기 위한 간단하고 효율적인 고수율 생산 공정을 제공한다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 2가지 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 제공하고, 여기서
제1 폴리펩티드는 제1 코일드 코일 도메인 (CC) 및 제1 Fc CH 성분 (FcCH)을 포함하고;
제2 폴리펩티드는 (1) 제2 코일드 코일 도메인 (CC) 및 제2 FcCH를 포함하고,
여기서, 제1 CC 및 제2 CC는 서로 복합화하고; 제1 FcCH 및 제2 FcCH는 서로 복합화한다.
한 실시양태에서, 제1 CC는 본원의 화학식 I의 서열을 포함하고, 제2 CC는 본원의 화학식 II의 서열을 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 (a) 제1 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제1 폴리펩티드 (여기서, 제1 CC는 화학식 I의 7개체 반복체를 포함한다); 및 (b) Fc CH 성분 및 제2 코일드 코일 (CC)을 포함하는 제2 폴리펩티드 (여기서, 제2 CC는 화학식 II의 7개체 반복체를 포함한다)를 포함하는 단백질 복합체를 특징으로 하고, 여기서 화학식 I 및 II에서 n은 2보다 크거나 같고, 각각의 7개체 반복체에서, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'7 잔기와 반대 전하의 X5 잔기를 포함하고, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'5 잔기와 반대 전하의 X7 잔기를 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 VH 도메인 및 VL 도메인을 추가로 포함하고, 제2 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩티드의 VH 및 VL 도메인은 N-말단에서 C-말단 순서로 VL-CL-테더-VH로 서로에 연결된다.
추가의 실시양태에서, 각각의 폴리펩티드의 VH 도메인은 서로 상이하다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 폴리펩티드의 VL 도메인은 서로 상이하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단백질 복합체는 힌지 영역을 포함하고, 여기서 힌지 영역은 그의 힌지 영역 내에 K222A 돌연변이, 그의 힌지 영역 내에 C220A 돌연변이, 또는 그의 힌지 영역 내에 K222A 및 C220A 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 단백질 복합체는 항체, 면역어드헤신 (immunoadhesin), 펩티바디 (peptibody) 또는 아피바디 (affibody)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 따라서, 추가의 실시양태에 따라, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항체 (예를 들어, VH 또는 VL 도메인), 펩티바디 (예를 들어, 펩티드), 면역어드헤신 (예를 들어, 세포외 도메인), 또는 표적에 결합하는 서열을 포함하는 스캐폴드 (scaffold) 단백질의 표적 결합 서열을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에 따라, 단백질 복합체는 1 아암형 (one-armed) 항체이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 하기 화학식 I의 7개체 반복체를 포함하는 제1 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제1 폴리펩티드
<화학식 I>
Figure pct00001
(여기서, X1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
X2, X3, 및 X6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
X4는 소수성 아미노산 잔기이고,
X5 및 X7은 각각 하전된 아미노산 잔기임); 및
(b) 하기 화학식 II의 7개체 반복체를 포함하는 제2 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제2 폴리펩티드
<화학식 II>
Figure pct00002
(여기서, X'1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
X'2, X'3, 및 X'6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
X'4는 소수성 아미노산 잔기이고,
X'5 및 X'7은 각각 하전된 아미노산 잔기임)
를 포함하는 코일드 코일을 포함하는 단백질 복합체를 제공하고, 여기서 화학식 I 및 II에서 n은 2보다 크거나 같고; 각각의 7개체 반복체에서, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'7 잔기와 반대 전하의 X5 잔기를 포함하고, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'5 잔기와 반대 전하의 X7 잔기를 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 VH 및 CH1 도메인을 포함하고, 각각 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 CH2 및 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 서로에 대해 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1-힌지-CH2-CH3으로 위치하는 VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 도메인을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) VH 도메인 및 화학식 I의 7개체 반복체를 포함하는 제1 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제1 폴리펩티드
<화학식 I>
Figure pct00003
(여기서, X1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
X2, X3, 및 X6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
X4는 소수성 아미노산 잔기이고,
X5 및 X7은 각각 하전된 아미노산 잔기임); 및
(b) VH 도메인 및 화학식 II의 7개체 반복체를 포함하는 제2 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제2 폴리펩티드
<화학식 II>
Figure pct00004
(여기서, X'1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
X'2, X'3, 및 X'6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
X'4는 소수성 아미노산 잔기이고,
X'5 및 X'7은 각각 하전된 아미노산 잔기임)
를 포함하는 항체를 제공하고, 여기서 화학식 I 및 II에서 n은 2보다 크거나 같고; 각각의 7개체 반복체에서, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'7 잔기와 반대 전하의 X5 잔기를 포함하고, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'5 잔기와 반대 전하의 X7 잔기를 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 VH 및 CH1 도메인을 포함하고, 각각 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 CH2 및 CH3 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 서로에 대해 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1-힌지-CH2-CH3으로 위치하는 VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체는 제3 및 제4 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기서 제3 폴리펩티드는 제1 VL 도메인을 포함하고, 제4 폴리펩티드는 제2 VL 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드의 VH 도메인은 테더에 의해 제3 폴리펩티드의 VL 도메인에 연결되고, 제2 폴리펩티드의 VH 도메인은 테더에 의해 제4 폴리펩티드의 VL 도메인에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 제3 폴리펩티드는 제1 CL 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 제1 VL 및 CL 도메인은 제3 폴리펩티드 내에서 N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL로 서로에 대해 위치하고, 제4 폴리펩티드는 제2 CL 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 제2 VL 및 CL 도메인은 제4 폴리펩티드 내에서 N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL로 서로에 대해 위치한다.
추가의 실시양태에서, 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인의 서열은 동일하다. 추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 폴리펩티드 중 적어도 하나의 VH의 N-말단은 테더를 사용하여 CL의 C-말단에 연결된다.
제2 측면에서, 본 발명은 (a) VH 도메인 및 제1 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제1 폴리펩티드 (여기서, 제1 CC는 화학식 I의 7개체 반복체를 포함한다); (b) CH2 및 CH3 도메인 및 제2 코일드 코일 (CC)을 포함하는 제2 폴리펩티드 (여기서, 제2 CC는 화학식 II의 7개체 반복체를 포함한다)를 포함하는 항체를 특징으로 하고, 여기서 화학식 I 및 II에서 n은 2보다 크거나 같고, 각각의 7개체 반복체에서, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'7 잔기와 반대 전하의 X5 잔기를 포함하고, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'5 잔기와 반대 전하의 X7 잔기를 포함한다.
본 발명의 제2 측면의 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 VH 및 CH1 도메인을 포함하고, 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 CH2 및 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 본 발명의 제2 측면의 추가의 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1-힌지-CH2-CH3으로 서로에 대해 위치하는 VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 도메인을 포함한다. 본 발명의 제2 측면의 또 다른 실시양태에서, 항체는 제3 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기서 제3 폴리펩티드는 VL 도메인을 포함한다. 하나의 예에서, 제3 폴리펩티드는 CL 도메인을 추가로 포함하고, VL 및 CL 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL로 서로에 대해 위치한다. 본 발명의 제2 측면의 또 다른 실시양태에서, 제1 폴리펩티드의 VH의 N-말단은 테더를 사용하여 CL의 C-말단에 연결된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 2 아암형 (two armed) 항체는 2개가 아니라 1개의 테더를 포함하고, 따라서, 항체는 (1) 코일드 코일 도메인 및 본 발명에 따른 경쇄에 묶인 (tethered) 중쇄를 포함하는 폴리펩티드, (2) 코일드 코일 도메인 및 중쇄를 포함하는 폴리펩티드, 및 (3) 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 그러한 2 아암형 항체를 발현하는 숙주 세포가 고려된다.
다른 실시양태에서, 임의의 X1, X'1, X4, 및 X'4에서 소수성 아미노산 잔기는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 트립토판, 페닐알라닌, 및 메티오닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 임의의 X5, X'5, X7, 및 X'7에서 하전된 아미노산 잔기는 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 및 글루탐산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 제1 CC의 적어도 하나의 7개체 반복체에서, X1은 아스파라긴이고, 각각의 X'1은 제2 CC의 적어도 하나의 7개체 반복체에서 아스파라긴이다.
또 다른 실시양태에서, 제1 CC는 7개체 반복체를 포함하고, 여기서 X1은 류신 또는 아스파라긴이고, X2는 알라닌 또는 글루타민이고, X3은 알라닌 또는 글루타민이고, X4는 류신이고, X5는 글루탐산이고, X6은 리신 또는 트립토판이고, X7은 글루탐산이고; 제2 CC는 7개체 반복체를 포함하고, 여기서 X'1은 류신 또는 아스파라긴이고, X'2는 알라닌 또는 글루타민이고, X'3은 알라닌 또는 글루타민이고, X'4는 류신이고, X'5는 리신이고, X'6은 리신 또는 트립토판이고, X'7은 리신이다.
추가의 실시양태에서, 화학식 I 및 II에서 n은 3보다 크거나 같고, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100보다 크거나 같다.
추가의 실시양태에서, 제1 또는 제2 CC 중 적어도 하나는 단백질의 불변 도메인의 C-말단에 연결된다. 예를 들어, 불변 도메인은 CH3 도메인이고, 제1 CC는 제1 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되고, 제2 CC는 제2 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된다. 연결은 예를 들어, 절단가능한 링커 서열에 의해 이루어진다. 다른 실시양태에서, Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위가 제1 또는 제2 CC 중 적어도 하나의 N-말단에 위치한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단 방향으로
Figure pct00005
(화학식 III)으로 서로에 대해 위치하는 VL, CL, 테더, VH, CH1, CH2, 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 항체를 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 항체는 화학식 III의 제2 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 다중특이적이다. 예를 들어, 항체는 적어도 2개의 항원에 결합할 수 있거나, 항체는 동일한 항원 상의 적어도 2개의 에피토프에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 이중특이적이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 글리신 (G) 및 세린 (S) 잔기를 포함하는 테더를 포함한다. 한 실시양태에서, 테더는 예를 들어 15 내지 50개 아미노산의 길이이다. 특정 실시양태에서, 테더는 20 내지 32개 아미노산의 길이, 예를 들어, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개 아미노산의 길이이다. 한 실시양태에서, 테더는 GGS 반복체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 테더는 절단가능하다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 테더는 테더의 동일한 효소에 의해 N 및 C 말단 또는 그 부근에서 2개의 부위 내에서 절단가능하다. 한 실시양태에서, 테더는 푸린 (furin)에 대한 절단 부위를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 푸린 절단 부위는
Figure pct00006
이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하는 돌연변이를 포함한다. 하나의 예에서, Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하는 돌연변이는 힌지 도메인 내에 있다. 예를 들어, 항체는 K222A 치환 (EU 넘버링 시스템)을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 테더 또는 링커는 다음 엔도펩티다제 중 하나 이상에 의해 절단가능하다: 푸린, 트롬빈, 게네나제, Lys-C, Arg-C, Asp-N, Glu-C, 인자 Xa, 담배 식각 바이러스 프로테아제 (TEV), 엔테로키나제, 인간 리노바이러스 C3 프로테아제 (HRV C3), 또는 키니노게나제. 특정 실시양태에서, 테더 또는 링커는 아스파라긴-글리신 펩티드 결합, 예를 들어, 히드록실아민에 의해 절단가능한 아스파라긴-글리신 펩티드 결합을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 KnH 기술을 이용하여 CL/CH1 및/또는 VH/VL 계면 내의 돌연변이를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 항체는 본 발명의 코일드 코일 및 CL/CH1 계면에서 놉 (knob) 및 홀 (hole)을 이용하여 제작되었다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 세포독성제에 접합된 불변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포에 의해 발현된다. 별도의 실시양태에서, 항체는 원핵 세포, 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli) 세포에 의해 발현된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 단백질 복합체, 예를 들어 항체의 생산 방법을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 몇몇 새로운 측면을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 단백질을 코딩하는 벡터를 포함하는 세포를 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 세포 또는 배양 배지로부터 단백질을 회수하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 (a) 항체를 단백질 A를 포함하는 칼럼 상에 포획하고, (b) 칼럼으로부터 항체를 용리시키고, (c) 용리된 항체를 무질서유발제 (chaotropic agent) 또는 연성 세제 (mild detergent)를 함유하는 용액 내로 희석하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 코일드 코일 함유 항체를 용액으로 유지시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 항체를 무질서유발제 또는 연성 세제의 존재 하에 유지하는 것을 포함한다. 상기 방법에 사용할 수 있는 무질서유발제 또는 연성 세제의 예는 아르기닌, 구아니딘-HCl, 우레아, 과염소산리튬, 히스티딘, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 트윈 (Tween), 트리톤 (Triton), 및 NP-40을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체성 복합체는 2개 이상의 표적 분자에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 이종다량체성 복합체 내의 각각의 폴리펩티드는 상이한 표적 분자에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 이종다량체성 복합체는 그가 결합하는 표적 분자(들)의 생물학적 활성을 억제한다. 한 실시양태에서, 목적하는 생물학적 효과가 세포를 효과기 세포 (예를 들어, T 림프구, 천연 킬러 세포 (NK), 대식세포 또는 다른 단핵 세포에 근접할 때 고갈 또는 불활성화되도록 하는 것인 경우에, 표적 분자 중 하나는 CD3, CD16, 또는 CD64일 수 있다.
한 실시양태에 따라, 본 발명의 이종다량체성 복합체는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 표적 분자에 결합한다: IL-1알파 및 IL-1베타, IL-12 및 IL-18; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1베타; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF-β; IL-13 및 LHR 효현제; IL-12 및 TWEAK, IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAM8, IL-13 및 PED2, IL17A 및 IL17F, CD3 및 CD19, CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD38 및 CD138; CD38 및 CD20; CD38 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-8 및 IL-6; CD20 및 BR3, TNF알파 및 TGF-베타, TNF알파 및 IL-1베타; TNF알파 및 IL-2, TNF알파 및 IL-3, TNF알파 및 IL-4, TNF알파 및 IL-5, TNF알파 및 IL6, TNF알파 및 IL8, TNF알파 및 IL-9, TNF알파 및 IL-10, TNF알파 및 IL-11, TNF알파 및 IL-12, TNF알파 및 IL-13, TNF알파 및 IL-14, TNF알파 및 IL-15, TNF알파 및 IL-16, TNF알파 및 IL-17, TNF알파 및 IL-18, TNF알파 및 IL-19, TNF알파 및 IL-20, TNF알파 및 IL-23, TNF알파 및 IFN알파, TNF알파 및 CD4, TNF알파 및 VEGF, TNF알파 및 MIF, TNF알파 및 ICAM-1, TNF알파 및 PGE4, TNF알파 및 PEG2, TNF알파 및 RANK 리간드, TNF알파 및 Te38; TNF알파 및 BAFF; TNF알파 및 CD22; TNF알파 및 CTLA-4; TNF알파 및 GP130; TNFα 및 IL-12p40; VEGF 및 HER2, VEGF-A 및 HER2, VEGF-A 및 PDGF, HER1 및 HER2, VEGF-A 및 VEGF-C, VEGF-C 및 VEGF-D, HER2 및 DR5, VEGF 및 IL-8, VEGF 및 MET, VEGFR 및 MET 수용체, VEGFR 및 EGFR, HER2 및 CD64, HER2 및 CD3, HER2 및 CD16, HER2 및 HER3; EGFR 및 HER2, EGFR 및 HER3, EGFR 및 HER4, IL-13 및 CD40L, IL4 및 CD40L, TNFR1 및 IL-1R, TNFR1 및 IL-6R, 및 TNFR1 및 IL-18R, EpCAM 및 CD3, MAPG 및 CD28, EGFR 및 CD64, CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTNO2; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; PDL-I 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 2의 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열 3의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 항체는 FcεR1 및 FcγR2b에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 4의 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 5의 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열 6의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 항체는 HER2에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 7의 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열 5의 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열 8의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 항체는 EGFR에 특이적으로 결합한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 서열 9의 서열을 포함하는 제1 경쇄 서열 및 제1 중쇄 서열, 및 서열 10의 서열을 포함하는 제2 경쇄 서열 및 제2 중쇄 서열을 포함하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 항체는 HER2 및 EGFR에 특이적으로 결합한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 서열 11의 서열을 포함하는 제1 경쇄 서열 및 제1 중쇄 서열, 및 서열 10의 서열을 포함하는 제2 경쇄 서열 및 제2 중쇄 서열을 포함하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 항체는 HER2 및 EGFR에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 치료 방법에서 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 항체의 사용을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 알레르기 또는 염증 반응 (예를 들어, 자가면역 질병)의 치료 방법에서 FcεR1 및 FcγR2b에 특이적으로 결합하는 항체의 사용을 특징으로 한다. 상기 방법은 대상체에서 알레르기 또는 염증 반응을 치료하기 위해 충분한 시간 동안 충분한 양으로 항체 또는 항체 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양의 치료 방법에서 HER2 또는 EGFR (또는 HER2 및 EGFR 모두)에 특이적으로 결합하는 항체의 사용을 특징으로 한다. 상기 방법은 대상체에서 종양을 치료하기 위해 충분한 시간 동안 충분한 양으로 항체 또는 항체 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 방법은 코일드 코일 및/또는 테더가 결핍된 항체 단편의 사용을 포함한다. 상기 실시양태에서, 코일드 코일 및/또는 테더 서열은 생산 후에 항체로부터 절단되고, 생성된 조작된 항체는 치료 투여를 위해 사용된다. 추가의 실시양태에서, 치료 방법은 대상체에게 유효량의 제2 약물을 투여하는 것을 포함한다. 제2 약물은 또 다른 항체 또는 항체 단편, 화학요법제, 세포독성제, 항-혈관신생제, 면역억제제, 전구약물, 시토킨, 시토킨 길항제, 세포독성 방사선 요법, 코르티코스테로이드, 항구토제, 암 백신, 진통제, 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 제2 약물은 제1 약물 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)의 투여 전에 또는 그 후에 투여할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제2 약물은 제1 약물과 동시에 투여된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 임의의 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 17-18, 26, 31-32 또는 35-36 또는 이들의 조합의 서열을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 임의의 하나의 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 17-18, 26, 31-32 또는 35-36 또는 이들의 조합의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 한 실시양태에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포)이다. 숙주 세포는 또한 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포일 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 임의의 하나의 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 17-18, 26, 31-32 또는 35-36 또는 이들의 조합의 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 특징으로 한다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 다음 상세한 설명, 도면 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 예시적인 코일드 코일 (CC) 구조 내의 아미노산들 사이의 이온성 및 소수성 상호작용을 보여주는 개략도이다. 제1 CC 내의 잔기는 X1 내지 X7로 표지하고, 제2 CC 내의 잔기는 X'1 내지 X'7로 표지한다. 제1 CC의 X5 잔기와 제2 CC의 X'7 잔기, 및 제1 CC의 X7 잔기와 제2 CC의 X'5 잔기 사이의 이온성 상호작용을 표시한다. 또한, X4와 X'4 및 X1 및 X'1 잔기 사이의 소수성 상호작용을 보여준다.
도 2a는 예시적인 ACID.p1 (서열 12) 및 BASE.p1 (서열 13) 코일드 코일 이종이량체화 도메인의 아미노산 서열, 및 그를 코딩하는 DNA 서열 (각각 서열 21 및 서열 22)을 보여준다.
도 2b는 예시적인 ACID.p1 및 BASE.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인과 각각 서열 21 및 서열 22의 DNA 서열 사이의 상호작용을 보여주는 개략도이다.
도 3은 공통적인 경쇄 (공통적인 LC), 이종이량체성 코일드 코일, 및 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하는 제1 및 제2 중쇄 (HC1 및 HC2)의 힌지 영역 내의 돌연변이 (K222A; 카바트 (Kabat) 넘버링 시스템)를 함유하는 예시적인 이중특이적 항체의 구조를 보여주는 개략도이다.
도 4a는 전장 중쇄 (HC1), VH 및 CH1 도메인이 결여된 부분적인 중쇄 (HC2), 경쇄 (공통적인 LC), 이종이량체성 코일드 코일, 및 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하는 HC1의 힌지 영역 내의 돌연변이 (K222A)를 함유하는 예시적인 1 아암형 항체의 구조를 보여주는 개략도이다.
도 4b는 2개의 전장 중쇄, 공통적인 경쇄, 코일드 코일, 및 중쇄 불변 영역 중 하나에 접합된 세포독성제를 함유하는 예시적인 접합된 항체의 구조를 보여주는 개략도이다. 세포독성제는 별표로 표시한다.
도 5는 예시적인 묶인 이중특이적 항체의 구조를 보여주는 개략도이다. 항체는 2개의 중쇄 (HC1 및 HC2) 및 2개의 경쇄 (LC1 및 LC2)를 함유한다. 테더는 HC1의 가변 중쇄의 N-말단을 LC1의 불변 경쇄의 C-말단과 연결하고, 제2 테더는 HC2의 가변 중쇄의 N-말단을 LC2의 불변 경쇄의 C-말단과 연결한다. 본 예에서, 테더는 글리신 글리신 세린 (GGS) 반복체를 포함한다. 본 도면에서, 경쇄 (LC1 및 LC2)는 상이하지만, 묶인 항체는 또한 공통적인 경쇄를 함유할 수 있다. 예시적인 묶인 항체는 이종이량체성 코일드 코일, 및 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하는 HC1 및 HC2의 힌지 영역 내의 돌연변이 (K222A)를 추가로 함유한다.
도 6은 예시적인 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC), 및 가변 중쇄의 N-말단을 불변 경쇄의 C-말단과 연결하는 예시적인 테더의 구조를 보여주는 개략도이다. 본 예에서, 테더에 의해 걸쳐지는 거리는 약 92Å, 또는 약 22개 아미노산의 길이이다. 20, 23, 및 26개 아미노산 길이의 테더를 시험하였다.
도 7a는 절단가능한 테더 및 이종이량체성 코일드 코일을 함유하는 예시적인 항체의 구조를 보여주는 개략도이다. 도면에 지시된 바와 같이, 예시적인 테더는 경쇄 (LC)의 C-말단을 중쇄 (HC)의 N-말단에 연결한다. 테더는 예를 들어, Lys-C 엔도펩티다제, 푸린 (PC1), 또는 NH2OH (히드록실아민)을 사용하여 절단 부위 (X)에서 항체로부터 절단될 수 있다. 예시적인 절단 부위는 테더의 N- 및 C-말단에 위치한다. 도 7a에 제시된 예시적인 항체는 또한 이종이량체성 코일드 코일을 함유하고, 이것은 예를 들어, Lys-C 엔도펩티다제, 푸린 (PC1), 또는 NH2OH를 사용하여 코일드 코일 도메인의 N-말단의 절단 부위 (X)에서 항체로부터 절단될 수 있다.
도 7b는 예시적인 절단가능한 테더를 보여주는 일련의 개략도이다. 상부 도면은 푸린에 의해 절단될 수 있고 경쇄 (LC)의 N-말단 및 중쇄 (HC)의 C-말단을 연결하는, 서열 31 내의 예시적인 26개 아미노산 테더 서열 (서열 17)을 보여준다. 푸린은 테더 서열을 테더의 N- 및 C-말단에서 이염기성 부위 (아르기닌-아르기닌)에서 절단할 수 있다. 하부 도면은 테더 서열의 N- 및 C-말단에서 리신 잔기에서 Lys-C 엔도펩티다제에 의해 절단될 수 있는 서열 32 내의 예시적인 26개 아미노산 테더 서열 (서열 18)을 보여준다.
도 8은 FcεR1 및 FcγR2b 모두에 결합하는 이중특이적 항체의 중쇄 (HC; 항-FcγR2b-BASE.p1 서열 및 항-FcεR1-ACID.p1 서열) 및 공통적인 경쇄 (4d5 LC)의 서열을 보여준다. 항-FcγR2b-BASE.p1 서열 (서열 1)은 BASE.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 서열 및 힌지 영역 내의 K222A 돌연변이를 갖는 항-인간 FcγR2b의 중쇄 서열을 함유한다. 항-FcεR1-ACID.p1 서열 (서열 2)는 ACID.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 서열 및 힌지 영역 내의 K222A 돌연변이를 갖는 항-인간 FcεR1의 중쇄 서열을 함유한다. 4d5 항체 경쇄 (서열 3)은 상기 이중특이적 항체의 FcγR2b 및 FcεR1 HC 모두에 공통적이다.
도 9a 및 9b는 예시적인 1 아암형 항체를 생성하기 위해 사용된 서열이다. 하나의 예시적인 1 아암형 항체는 HER2에 특이적으로 결합하고, 항-HER2 항체 1.ACID.p1 서열 (ACID.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 서열 및 K222A 돌연변이를 갖는 항-HER2 항체 1 HC; 서열 4), truncFC.BASE.p1 서열 (BASE.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 서열을 갖는, VH 및 CH1 도메인이 결여된 중쇄; 서열 5), 및 항-HER2 항체 1 LC 서열 (서열 6)을 함유한다. 또 다른 예시적인 1 아암형 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하고, 항-EGFR (D1.5).ACID.p1 서열 (ACID.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 서열 및 힌지 영역 내의 K222A 돌연변이를 갖는 항-EGFR (D1.5) HC; 서열 7), truncFC.BASE.p1 서열 (BASE.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 서열을 갖는, VH 및 CH1 도메인이 결여된 중쇄; 서열 5), 및 항-EGFR (D1.5) 항체 LC 서열 (서열 8)을 함유한다.
도 10은 HER2 및 EGFR/HER1 모두에 결합하는 이중특이적 항체의 묶인 HC 및 LC (항-HER2 (항체 1)26.ACID.p1 및 D1.5.26.BASE.p1)의 서열을 보여준다. 항-HER2 (항체 1) 26.ACID.p1 서열은 ACID.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 및 K222A 돌연변이를 갖는, 26개 아미노산 글리신 글리신 세린 (GGS) 테더에 의해 항-HER2 항체 1 HC 서열에 묶인 항-HER2 항체 1 LC 서열을 함유한다 (서열 9). D1.5.26.BASE.p1 서열은 BASE.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 및 K222A 돌연변이를 갖는, 26개 아미노산 GGS 테더에 의해 D1.5 항-EGFR 항체 HC 서열에 묶인 D1.5 항-EGFR 항체 LC 서열을 함유한다 (서열 10).
도 11은 HER2 및 EGFR/HER1 모두에 결합하는 또 다른 예시적인 항체의 묶인 HC 및 LC (항-HER2 (항체 2).26.ACID.p1 및 D1.5.26.BASE.p1)의 서열을 보여준다. 항-HER2 (항체 2).26.ACID.p1 서열은 ACID.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 및 K222A 돌연변이를 갖는, 26개 아미노산 GGS 테더에 의해 항-HER2 항체 2 HC 서열에 묶인 항-HER2 항체 2 LC 서열을 함유한다 (서열 11). D1.5.26.BASE.p1 서열은 BASE.p1 코일드 코일 이종이량체화 도메인 및 K222A 돌연변이를 갖는, 26개 아미노산 GGS 테더에 의해 D1.5 항-EGFR 항체 HC 서열에 묶인 D1.5 항-EGFR 항체 LC 서열을 함유한다 (서열 10).
도 12aa 및 12ab와 12ba, 12bb 및 12bc는 코일드 코일 이종이량체화 도메인 함유 항체를 제작하기 위해 사용된 항-HER2 항체 1의 부분적 HC (서열 15) 및 LC (서열 16) 아미노산 서열 및 DNA 서열 (각각 서열 23 및 서열 24)이다. 항-HER2 항체 1 HC 서열의 시작을 도 12A에 나타내고, 서열 내의 K222A 돌연변이의 위치도 나타낸다. 항-HER2 항체 1 가변 경쇄 (VL)의 시작, 항-HER2 항체 1 LC의 끝, 항-HER2 항체 1 가변 중쇄 (VH)의 시작, 항-HER2 항체 1 VH의 끝, 및 K에서 A로의 돌연변이의 위치를 도 12B에 나타낸다. 이들 서열을 함유하는 벡터를 제작하는데 유용한 ClaI/Bsp106, BamHI, 및 ApaI 제한 부위의 위치를 또한 도 12A 및 12B에 나타낸다.
도 13a 및 13b는 이종이량체성 코일드 코일이 Lys-C 엔도펩티다제를 사용하여 예시적인 α-FcεR1/α-FcγR2b 이중특이적 항체로부터 절단될 수 있음을 보여주는 질량 분광측정법 결과의 일련의 그래프 및 개략도이다. 코일드 코일가 있는 항체 (좌측 도면) 및 코일드 코일이 없는 항체 (우측 도면)의 이론적 질량을 나타내고, 이는 각각의 도면 상부의 질량 분광측정법 결과의 그래프에 나타낸 실험적으로 관찰된 질량의 오차의 범위 내에 있다, 이것은 코일드 코일이 항체로부터 절단되었음을 보여준다.
도 14a 및 14b는 Lys-C 엔도펩티다제 (우측 패널)가 예시적인 α-FcεR1/α-FcγR2b 이중특이적 항체의 LC 또는 HC 내를 절단하지 않고, 대신에 HC로부터 코일드 코일을 절단함을 보여주는 (좌측 2개의 하부 패널 및 우측 2개의 하부 패널의 비교) 질량 분광측정법 결과의 일련의 그래프 및 개략도이다. 경쇄 (MW=26263), 코일드 코일 도메인을 가진 중쇄 (MW=54917 또는 55164), 및 코일드 코일 도메인이 없는 중쇄 (MW=50528 및 50767)의 이론적 질량은 각각의 구성체에 대한 질량 분광측정법 결과의 그래프에 나타낸 실험적으로 관찰된 질량의 오차의 범위 내에 있다.
도 15는 예시적인 α-FcεR1/α-FcγR2b 이중특이적 항체가 그의 항원에 특이적으로 및 동시에 결합함을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 16은 예시적인 공통적인 LC α-FcεR1/α-FcγR2b 이중특이적 항체를 사용하는 히스타민 방출 분석에 대한 결과를 보여주는 그래프이다. 분석에 사용된 항체의 농도 (㎍/ml)는 x-축을 따라 나타내고, 히스타민 방출 내의 양 (ng/ml)은 y-축을 따라 나타낸다.
도 17a 및 17b는 코일드 코일이 Lys-C 엔도펩티다제를 사용하여 예시적인 1 아암형 α-EGFR 항체로부터 절단될 수 있음을 보여주는 질량 분광측정법 결과의 일련의 그래프 및 개략도이다. 코일드 코일을 갖는 1 아암형 항체 (MW=109112), 및 코일드 코일이 없는 1 아암형 항체 (MW=100419)의 이론적 질량은 각각의 구성체에 대한 질량 분광측정법 결과의 그래프에 나타낸 실험적으로 관찰된 질량의 오차의 범위 내에 있다.
도 18a, 18b, 및 18c는 Lys-C 엔도펩티다제가 예시적인 α-EGFR 항체의 LC (1 아암형 경쇄; 좌측 패널), 전장 HC (1 아암형 중쇄; 중간 패널), 또는 VH 및 CH1 도메인이 결여된 HC (1 아암형 Fc; 우측 패널)를 절단하지 않고, 대신에 HC, 및 VH 및 CH1 도메인이 결여된 HC로부터 코일드 코일 도메인을 절단함을 보여주는 질량 분광측정법 결과의 일련의 그래프 및 개략도이다. 각각의 구성체에 대한 이론적 분자 질량을 질량 분광측정법 결과를 보여주는 그래프 아래에 나타내고, 이는 각각의 경우에 실험적으로 관찰된 분자 질량의 오차의 범위 내에 있다.
도 19a 및 19b는 코일드 코일이 Lys-C 엔도펩티다제를 사용하여 예시적인 묶인 α-EGFR/α-HER2 이중특이적 항체로부터 절단될 수 있음을 보여주는 질량 분광측정법 결과 및 개략도의 일련의 그래프이다. 절단된 및 비절단된 항체의 이론적 분자 질량을 또한 도면에 나타내고, 이는 질량 분광측정법 결과에 나타낸 각각의 실험적으로 관찰된 분자 질량의 오차의 범위 내에 있다.
도 20a 및 20b는 코일드 코일이 Lys-C 엔도펩티다제를 사용하여 예시적인 묶인 α-EGFR/α-HER2 이중특이적 항체로부터 절단될 수 있음을 보여주는 질량 분광측정법 결과의 일련의 그래프 및 개략도이고, 여기서 항체를 먼저 Lys-C 엔도펩티다제로 처리하였고, 이어서 샘플을 질량 분광 분석으로 처리하였다. 절단된 및 비절단된 HC/LC 복합체의 이론적 분자 질량을 또한 도면에 나타내고, 각각의 구성체에 대한 이론적 분자 질량은 질량 분광측정법 결과에 제시된 실험적으로 관찰된 분자 질량의 오차의 범위 내에 있다.
도 21은 야생형 항-HER2 항체 1 및 야생형 α-EGFR 항체가 서로의 항원과 교차반응하지 않고 대신에 그들의 각각의 항원에 결합함을 나타내는 옥테트 (Octet) 분석으로부터의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 22는 1 아암형 항-HER2 항체 1 및 1 아암형 α-EGFR 항체가 서로의 항원과 교차반응하지 않고 대신에 그들의 각각의 항원에 결합함을 나타내는 옥테트 분석으로부터의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 23a는 예시적인 묶인 이중특이적 항-HER2 항체 1/α-EGFR 항체 (8323)가 HER2 및 EGFR 모두에 동시에 결합함을 나타내는 옥테트 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 상부 기록에서, 항체를 먼저 EGFR 세포외 도메인 (ECD)과 함께, 이어서 HER2 수용체 ECD와 함께 인큐베이팅하였고, 하부 기록에서, 항체를 먼저 HER2 수용체 ECD와 함께, 이어서 EGFR ECD와 함께 인큐베이팅하였다.
도 23b는 HER2 (상부) 및 EGFR1 (하부)에 대한 예시적인 이중특이적 항-HER2 항체 1/α-EGFR 항체의 결합 친화도를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 24는 예시적인 이중특이적 항-HER2 항체 1/α-EGFR (D1.5) 항체가 EGFR 발현 NR6 세포에서 전환 성장 인자 알파 (TGFα) 매개된 EGFR (표피 성장 인자 수용체) 인산화를 용량 의존 방식으로 억제함을 보여주는 면역블롯 (immunoblot)의 영상이다 (좌측). D1.5 항-EGFR 항체를 대조군으로서 사용한다 (우측). 인산화 수준은 항-포스포-티로신 (α-pTyr) 항체를 이용하여 결정하고, 항-튜불린 항체 (α-튜불린)를 로딩 대조군으로서 사용한다.
도 25는 이중특이적 항-HER2 항체 1/α-EGFR(D1.5) 항체가 EGFR을 발현하도록 안정하게 형질감염된 NR6 세포에서 3일 기간에 걸쳐 TGFα-유도된 성장을 억제함을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 26은 예시적인 이중특이적 항-HER2 항체 1/α-EGFR(D1.5) 항체가 항-HER2 항체 1 대조군에 유사한 방식으로 5-일 기간에 걸쳐 HER2 증폭된 BT474 세포의 성장을 억제함을 보여주는 그래프이다.
도 27은 SCID 베이지 (Beige) 마우스를 이용하여 D1.5 인간 IgG1 대조 항체 (항-EGFR)의 10-일 약동학적 (PK) 분석의 Fc-Fc 분석 및 Fc-Fc ELISA 분석 결과를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 28a 및 28b는 SCID 베이지 마우스를 이용하여 예시적인 이중특이적 항-HER2 항체 1/α-EGFR(D1.5) 항체의 10-일 PK 분석의 EGFR-HER2 ELISA 및 Fc-Fc ELISA 분석 결과를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 29는 마우스에서 대조군 D1.5 (항-EGFR) 및 대조군 (항-HER2 항체 2) 항체에 대한 예시적인 이중특이적 항-HER2 항체 1/α-EGFR(D1.5) 항체의 노출의 비교를 보여주는 그래프이다. 예시적인 이중특이적 항-HER2 항체 1/α-EGFR(D1.5) 항체는 시험된 시간 기간에 걸쳐 마우스에서 대조 항체에 유사한 노출을 가진다.
도 30aa 및 30ab, 30ba 및 30bb, 30ca, 30cb, 30cc, 30cd, 및 30ce, 30da, 30db, 및 30dc는 푸린을 동시발현하는 세포에 의해 푸린에 의한 절단 후의 항체의 중쇄 및 경쇄의 절단 생성물을 보여주는 질량 분광 그래프이다.
도 31은 푸린-절단가능한, 묶인 코일드-코일 항체를 푸린을 동시발현하는 CHO 세포 내에서 발현시키고 항체를 카르복시펩티다제 소화에 노출시킴으로써 제조된 이중특이적 항체를 보여주는 비-환원 질량 분광 그래프이다.
도 32 (A) 및 (B)는 푸린-절단가능한, 묶인 코일드-코일 항체를 푸린을 동시발현하는 CHO 세포 내에서 발현시키고 항체를 카르복시펩티다제 소화에 노출시킴으로써 제조된 이중특이적 항체를 보여주는 환원 질량 분광 그래프이다.
<상세한 설명>
이론에 매이지 않지만, 본 출원인은 본원에 기재된 코일드 코일 이량체화 도메인이 놀랍게도 면역글로불린의 Fc 영역의 존재 하에서도 높은 정도의 정확도 및 효율로 2개 이상의 분자의 결합을 유발하는 초기 촉발인자를 제공하고, 여기서 Fc 영역들이 또한 세포 배양 조건 하에 천연적으로 서로 끌어 당겨지는 것으로 생각한다.
중쇄의 동종이량체화를 감소시킴으로써, 본원에 기재된 코일드 코일 이종이량체화 도메인의 사용은 Fc CH 성분을 포함하는 단백질 복합체 (예를 들어, 다중특이적 또는 1 아암형 항체 등)의 균질한 집단을 생산하는 능력에서 돌파구를 제공한다. 다중특이적 복합체는 예를 들어 이들이 표적 (예를 들어, 종양 세포) 및 표적에 대해 작용하는 물질 (예를 들어, T 세포)을 함께 위치하도록 유도하거나 또는 조합 요법에 대한 필요성 및 2가지 이상의 치료제를 대상체에게 제공하는 것과 연관된 위험을 제거할 수 있기 때문에 치료 용도로 사용하기 위해 유리하다. 또한, 다중특이적 항체를 비롯한 항체의 제작을 용이하게 하기 위해, 본 발명에 따른 테더를 사용하여 항체의 경쇄 및 중쇄를 연결하고, 이에 의해 각각의 경쇄의 그의 동족 (cognate) 중쇄에 대한 적절한 회합을 도울 수 있다.
I. 정의
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 임의의 면역글로불린 (Ig) 분자, 및 목적하는 생물학적 활성 (예를 들어, 에피토프 결합 활성)을 보이는 그의 임의의 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 의미한다. 항체의 예는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 및 항체 단편을 포함한다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급할 때 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 색인 (index)"은 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 언급할 때 사용된다 (예를 들어, 카바트 등의 상기 문헌에 보고된 EU 색인 참조). "카바트에서와 같은 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않으면, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의해 넘버링된 잔기를 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않으면, 항체의 중쇄 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 다중에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 상기 다중특이적 항체는 VHVL 단위가 다중에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 단위가 상이한 에피토프에 결합하는 2 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디 (diabody), 이중특이적 디아바디 및 트리아바디 (triabody), 공유 또는 비공유 연결된 항체 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다. "다중에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다.
"단일특이적"은 하나의 에피토프에만 결합하는 능력을 의미한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각각의 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.
천연 생성되는 기본적인 4개 사슬의 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 이종사량체 당단백질이다 (IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 이종사량체 단위로 구성되고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 한편, 분비된 IgA 항체는 중합되어 J 사슬과 함께 2-5개의 기본적인 4개 사슬 단위를 포함하는 다가 회합체를 형성할 수 있다). IgG의 경우에, 4개 사슬 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 한편, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소형에 따라 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로에 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에서 가변 도메인 (VH), 이어서 각각의 α 및 γ 사슬에 대해 3개의 불변 도메인 (CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에서 가변 도메인 (VL), 이어서 그의 다른 말단부에 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다. VH 및 VL의 페어링은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대해서는 예를 들어, 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.
임의의 척추동물종에서 유래한 L 사슬은 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 및 람다로 불리는 2개의 분명하게 구분되는 종류 중 하나로 지정될 수 있다. 그들의 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스 또는 이소형으로 지정될 수 있다. 5개 클래스의 면역글로불린, 즉, 각각 α, δ, γ, ε 및 μ로 명명된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재한다. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능의 비교적 작은 차이를 기초로 하여 하위클래스로 추가로 나누어질 수 있다. 예를 들어, 인간은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2의 하위클래스를 발현한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체들 사이에서 서열이 크게 상이함을 나타낸다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9-12개 아미노산 길이의 "초가변 영역"으로 불리는 고가변성의 보다 짧은 영역에 의해 이격된, 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 비교적 비가변적 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는, 주로 베타-시트 입체 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포성 세포 독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 보인다.
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 본원에서 사용될 때 서열에서 초가변이고/이거나 구조상 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; 즉, VH 내에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3이 6개의 HVR의 대부분의 다양성을 제시하고, H3은 특히 항체에 대한 양호한 특이성을 부여할 때 특유한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)];. [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 구성된 천연 생성 카멜리드 (camelid) 항체가 기능성이고, 경쇄 부재 하에 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
많은 HVR 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 변동성에 기초하고, 가장 흔히 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 코티아 (Chothia)는 그 대신 구조 루프의 위치를 나타낸다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라 (Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다. 각각의 상기 HVR의 잔기를 아래에 나타낸다.
Figure pct00007
HVR은 다음과 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65, 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 확인된 4개의 FR을 갖는다. CDR이 카바트에 따라 규정될 경우, 경쇄 FR 잔기는 대략 잔기 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), 및 98-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기에 대략 잔기 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), 및 103-113 (HCFR4)에 위치한다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함할 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄에 대략 잔기 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), 및 97-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기에 잔기 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), 및 102-113 (HCFR4)에 위치한다. 일부 예에서, CDR이 카바트에 의해 규정된 CDR 및 초가변 루프의 CDR 모두로부터의 아미노산을 포함할 때, FR 잔기는 그에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함할 때, 중쇄 FR1 잔기는 위치 1-25에 존재하고, FR2 잔기는 위치 36-49에 존재한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔하게 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 카바트에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL에 대해서, 하위군은 카바트에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH에 대해서, 하위군은 카바트에서와 같은 하위군 III이다.
"무손상" 항체의 일례는 항원 결합 부위 및 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (Db); 탠덤 (tandem) 디아바디 (taDb); 선형 항체 (미국 특허 5,641,870의 실시예 2; [Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]] 참조); 1 아암형 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디 (minibody), 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3 및 (scFV)4-Fc를 포함하고 이로 제한되지 않음)를 포함한다.
표현 "단일 도메인 항체" (sdAb) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 의미한다. 즉, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과의 상호작용을 필요로 하지 않는다. 단일 도메인 항체의 예는 카멜리드 (라마 및 낙타) 및 연골어류 (예를 들어, 얼룩상어)로부터 유래된 것 및 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법으로 유래된 것을 포함한다 ([Nature (1989) 341:544-546]; [Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56]; [Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235]; [Trends Biotechnol (2003):21:484-490]; WO 2005/035572; WO 03/035694; [Febs Lett (1994) 339:285-290]; WO00/29004; WO 02/051870).
표현 "선형 항체"는 일반적으로 문헌 [Zapata et al., Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 의미한다. 간단히 설명하면, 상기 항체는 상보적인 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)를 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적 항체일 수 있다.
본원에서 언급되는 용어 "놉-인투-홀 (knob-into-hole)" 또는 "KnH" 기술은 돌출부 (놉)를 하나의 폴리펩티드 내로 및 공동 (홀)을 다른 폴리펩티드 내로 이들이 상호작용하는 계면에서 도입함으로써 시험관 내에서 또는 생체 내에서 함께 2개의 폴리펩티드의 페어링을 유도하는 기술을 의미한다. 예를 들어, KnH는 항체의 Fc:Fc 결합 계면, CL:CH1 계면 또는 VH/VL 계면에서 도입되었다 (예를 들어, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431 및 [Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788]). 이것은 특히 다중특이적 항체의 제조 동안 함께 2개의 상이한 중쇄의 페어링을 유도할 때 유용하다. 예를 들어, 그의 Fc 영역에 KnH를 갖는 다중특이적 항체는 각각의 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있거나, 또는 유사하거나 상이한 경쇄 가변 도메인과 페어링하는 상이한 중쇄 가변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. KnH 기술은 또한 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인을 함께 또는 상이한 표적 인식 서열 (예를 들어, 아피바디, 펩티바디 및 다른 Fc 융합체 포함)을 포함하는 임의의 다른 폴리펩티드 서열을 페어링하기 위해 사용될 수 있다. 항체를 파파인으로 분해하면, "Fab" 단편으로 언급되는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 잔여 "Fc" 단편이 생성되고, 이 명칭은 그의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한다. Fab 단편은 전체 L 사슬과 H 사슬의 가변 영역 도메인 (VH), 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)으로 구성된다. 항체를 펩신으로 처리하면, 2가 항원 결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편에 대략적으로 대응하고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 하나의 큰 F(ab')2 단편이 생성된다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기가 추가된다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 한쌍의 Fab' 단편으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 유지되는 두 H 사슬의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 이 영역은 또한 특정 종류의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식된다.
"Fv"는 강한 비공유 회합 상태의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들의 폴딩으로부터, 두 도메인은 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프 (각각 H 및 L 사슬로부터 3개의 루프)를 생성시킨다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)이라도 전체 결합 부위보다 낮은 친화도이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 연결된다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하게 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. sFv에 대해서는, 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; [Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 V 도메인의 사슬 내가 아니라 사슬간 페어링이 달성되어 2가 단편, 즉, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편을 생성하도록, VH 및 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10개 잔기)를 사용하여 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 구성함으로써 제조된 작은 항체 단편을 나타낸다. 이중특이적 디아바디는 2개의 "교차 (crossover)" sFv 단편의 이종이량체이고, 여기서 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인은 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 존재한다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 설명되어 있다.
용어 "1 아암형 항체" 또는 "1 아암형 항체"는 (1) CH2 도메인, CH3 도메인 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 펩티드 결합에 의해 연결된 가변 도메인 및 (2) 제2 CH2, CH3 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 항체를 나타내고, 여기서 가변 도메인은 제2 CH2, CH3 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 펩티드 결합에 의해 연결되지 않는다. 한 실시양태에서, 1 아암형 항체는 3개의 폴리펩티드, 즉 (1) 가변 도메인 (예를 들어, VH), CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드, (2) 가변 도메인 (예를 들어, VL) 및 CL 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및 (3) CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 제3 폴리펩티드는 가변 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 1 아암형 항체는 불변 중쇄를 연결하는 디술피드 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 부분적인 힌지 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 1 아암형 항체의 가변 도메인은 항원 결합 영역을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 1 아암형 항체의 가변 도메인은 단일 가변 도메인이고, 여기서 각각의 단일 가변 도메인은 항원 결합 영역이다.
본 발명의 항체는 본 발명의 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라 (chimeric)" 항체 및 상기 항체의 단편일 수 있다 (미국 특허 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 본원에서 관심있는 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예, 구세계 원숭이, 유인원 등)에서 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화 (primatized)" 항체를 포함한다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 보다 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 "복합체" 또는 "복합체화된"은 펩티드 결합이 아닌 결합 및/또는 힘 (예를 들어, 반 데어 발스, 소수성, 친수성 힘)을 통해 서로 상호작용하는 2개 이상의 분자의 회합을 의미한다. 한 실시양태에서, 복합체는 이종다량체이다. 본원에서 사용되는 용어 "단백질 복합체" 또는 "폴리펩티드 복합체"는 단백질 복합체 내의 단백질에 접합된 비-단백질 물질 (예를 들어, 화학적 분자, 예를 들어 독소 또는 검출 물질을 포함하고 이로 제한되지 않음)을 갖는 복합체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "이종다량체" 또는 "이종다량체성"은 비-펩티드성, 공유 결합 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 비공유 상호작용 (예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 판 데어 발스력, 및 소수성 상호작용)에 의해 서로 상호작용하는 2 이상의 폴리펩티드를 설명하고, 여기서 적어도 2개의 분자는 서로 상이한 서열을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신")의 "결합 특이성"을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능과 조합한 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역어드헤신은 아미노산 서열이 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 서열인 (즉, 항체의 불변 영역에 비해 "이종성"인) 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열 (예를 들어, IgG의 CH2 및/또는 CH3 서열)의 융합체를 포함한다. 예시적인 면역어드헤신 서열은 관심있는 단백질에 결합하는 수용체 또는 리간드의 일부를 포함하는 인접하는 아미노산 서열을 포함한다. 어드헤신 서열은 또한 관심있는 단백질에 결합하는 서열일 수 있지만, 수용체 또는 리간드 서열이 아니다 (예를 들어, 펩티바디 내의 어드헤신 서열). 상기 폴리펩티드 서열은 파지 디스플레이 기술 및 고효율 (high throughput) 분류 방법을 포함하는 다양한 방법에 의해 선택 및 확인될 수 있다. 면역어드헤신 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻을 수 있다.
관심있는 항원에 "결합하는" 본 발명의 항체는 항체가 단백질 또는 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화할 때 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하고, 다른 단백질과 유의하게 교차반응하지 않는 것이다. 그러한 실시양태에서, "비-표적" 단백질에 대한 항체의 결합의 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사 면역 침전법 (RIA) 또는 ELISA에 의해 결정할 때 그의 특정 표적 단백질에 대한 항체 결합의 약 10% 미만일 것이다. 표적 분자에 대한 항체의 결합에 대해서, 용어 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다 (예를 들어, 비-특이적 상호작용은 소 혈청 알부민 또는 카제인에 대한 결합일 수 있다). 특이적인 결합은 예를 들어 일반적으로 대조 분자의 결합에 비해 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적인 결합은 표적, 예를 들어 과량의 비-표지된 표적에 유사한 대조 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 특이적인 결합은 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제될 경우에 표시된다. 본원에서 사용될 때, 용어 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"은 예를 들어 표적에 대한 Kd가 적어도 약 200 nM, 별법으로 적어도 약 150 nM, 별법으로 적어도 약 100 nM, 별법으로 적어도 약 60 nM, 별법으로 적어도 약 50 nM, 별법으로 적어도 약 40 nM, 별법으로 적어도 약 30 nM, 별법으로 적어도 약 20 nM, 별법으로 적어도 약 10 nM, 별법으로 적어도 약 8 nM, 별법으로 적어도 약 6 nM, 별법으로 적어도 약 4 nM, 별법으로 적어도 약 2 nM, 별법으로 적어도 약 1 nM, 또는 이보다 큰 분자에 의해 제시될 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적인 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 의미한다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용될 때 "결합 친화도"는 결합쌍의 멤버 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 예를 들어, Kd는 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 이보다 우수할 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 빠르게 결합하고 보다 오래 결합된 상태로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 10 이하의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (비아코아, 인크. (BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이))을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용함으로써 측정한다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코아, 인크.)을 제조사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/ml (~0.2 μM)으로 희석한 후, 커플링된 단백질의 약 10 반응 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후에, 미반응기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 운동학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램 (sensorgram)을 동시 피팅 (fitting)함으로써 단순 일대일 랭그뮈어 (Langmuir) 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로서 계산한다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol 293:865-881 (1999)] 참조). 온-레이트 (on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M-1S-1을 초과하면, 온-레이트는 분광계, 예를 들어 정지 유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠 (Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (써모스펙트로닉 (ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 (quenching) 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "해리 속도" 또는 "해리율" 또는 "kon"은 또한 10 이하의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (비아코아, 인크., 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 상기한 바와 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용함으로써 결정할 수 있다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코아, 인크.)을 제조사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/ml (~0.2 μM)으로 희석한 후, 커플링된 단백질의 약 10 반응 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후에, 미반응기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 운동학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램을 동시 피팅함으로써 단순 일대일 랭그뮈어 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로서 계산한다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol 293:865-881 (1999)] 참조). 그러나, 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M-1S-1을 초과하면, 온-레이트는 바람직하게는 분광계, 예를 들어 정지 유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (써모스펙트로닉)에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 항체, 그의 단편, 또는 유도체에 대해 "생물학상 활성인" 및 "생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 다르게 특정된 경우를 제외하고 생물학적 분자에 결합하는 능력을 갖는다는 것을 의미한다.
"펩티바디" 또는 "펩티바디들"은 무작위로 생성된 펩티드와 Fc 도메인의 융합체를 의미한다 (2003년 12월 9일 등록된 미국 특허 6,660,843 (Feige et al.) (그 전부가 참고로 포함됨). 이는 N-말단, C-말단, 아미노산 측쇄, 또는 1 초과의 상기 부위에 연결된 하나 이상의 펩티드 포함한다. 펩티바디 기술을 사용함으로써 하나 이상의 리간드 또는 수용체, 종양-귀소 (homing) 펩티드, 막 수송 펩티드 등을 표적화하는 펩티드를 포함하는 치료제의 설계할 수 있다. 펩티바디 기술은 선형 및 디술피드-제한된 (constrained) 펩티드, "탠덤 펩티드 다량체" (즉, Fc 도메인의 단일 사슬 상의 1 초과의 펩티드)를 포함하는 많은 상기 분자의 설계에 유용한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 6,660,843; 2003년 10월 16일 공개된 미국 특허 출원 공개 2003/0195156 (2002년 11월 21일 공개된 WO 02/092620에 대응함); 2003년 9월 18일 공개된 미국 특허 출원 공개 2003/0176352 (2003년 4월 17일 공개된 WO 03/031589에 대응함); 1999년 10월 22일 출원된 미국 특허 출원 09/422,838 (2000년 5월 4일 공개된 WO 00/24770에 대응함); 2003년 12월 11일 공개된 미국 특허 출원 공개 2003/0229023; 2003년 7월 17일 공개된 WO 03/057134; 2003년 12월 25일 공개된 미국 특허 출원 2003/0236193 (2004년 4월 8일 출원된 PCT/US04/010989에 대응함); 2003년 9월 18일 공개된 미국 특허 출원 10/666,480 (2004년 4월 1일 공개된 WO 04/026329에 대응함)을 참조한다.
"아피바디들" 또는 "아피바디"는 Fc 영역에 펩티드 결합에 의해 연결된 단백질의 용도를 나타내고, 여기서 단백질은 표적 분자에 대한 결합 표면을 제공하는 스캐폴드로서 사용된다. 단백질은 종종 천연 생성 단백질, 예를 들어 스태필로코커스 (staphylococcal) 단백질 A 또는 IgG-결합 B 도메인, 또는 그로부터 유래된 Z 단백질 ([Nilsson et al. (1987), Prot Eng 1, 107-133], 및 미국 특허 5, 143,844 참조) 또는 그의 단편 또는 유도체이다. 예를 들어, 아피바디는 표적 분자(들)에 대한 변경된 결합 친화도를 갖는 Z 단백질 변이체로부터 생성될 수 있고, Z 단백질의 세그먼트는 표적 분자에 결합할 수 있는 변이체의 라이브러리를 생성하기 위해 무작위 돌연변이 유발에 의해 돌연변이된다. 아피바디의 예는 미국 특허 6,534,628, 문헌 [Nord et al., Prot Eng 8:601-608 (1995)] 및 [Nord K et al., Nat Biotech 15:772-777 (1997)], [Biotechnol Appl Biochem. 2008 Jun;50(Pt 2):97-112]의 것을 포함한다.
"단리된" 이종다량체 또는 복합체는 그의 천연 세포 배양 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 이종다량체 또는 복합체를 의미한다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 이종다량체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 단백질의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다.
본 발명의 이종다량체는 일반적으로 실질적인 균질성으로 정제된다. 문구 "실질적으로 균질한", "실질적으로 균질한 형태" 및 "실질적인 균질성"은 생성물에 목적하지 않는 폴리펩티드 조합으로부터 유래하는 부산물 (예를 들어 동종다량체)이 실질적으로 결여됨을 나타내기 위해 사용된다.
순도 측면에서 표현하면, 실질적인 균질성은 부산물의 양이 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 4%, 3%, 2% 또는 1 중량%를 초과하지 않거나 1 중량% 미만인 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 부산물은 5% 미만이다.
"생물학적 분자"는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 및 이들의 조합을 의미한다. 한 실시양태에서, 생물학적 분자는 자연에 존재한다.
본원에 개시된 다양한 항체를 설명하기 위해 사용될 때, "단리된"은 발현되는 세포 또는 세포 배양액으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 일반적으로 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비-환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 폴리펩티드의 천연 환경의 적어도 하나의 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용되는 "연결된" 또는 "연결"은 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이의 직접적인 펩티드 결합 연결 또는 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열에 및 이들 사이에 결합된 펩티드인 제3 아미노산 서열을 포함하는 연결을 의미한다. 예를 들어, 링커 펩티드가 하나의 아미노산 서열의 C-말단 말단부 및 다른 아미노산 서열의 N-말단 말단부에 결합된다.
본원에서 사용되는 "링커"는 길이가 2 이상의 아미노산인 아미노산 서열을 의미한다. 링커는 중성 극성 또는 비극성 아미노산으로 구성될 수 있다. 링커의 길이는 예를 들어 2 내지 100개의 아미노산, 예를 들어 2 내지 50개의 아미노산, 예를 들어, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 아미노산일 수 있다. 링커는 예를 들어 자가-절단, 또는 효소에 의한 또는 화학적 절단에 의해 "절단가능"할 수 있다. 아미노산 서열 내의 절단 부위 및 상기 부위에서 절단하는 효소 및 화학물질은 당업계에 공지되어 있고, 또한 본원에서 설명된다.
본원에서 사용되는 "테더"는 2개의 다른 아미노산 서열을 연결하는 아미노산 링커를 의미한다. 본원에서 사용되는 테더는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인의 N-말단을 면역글로불린 경쇄 불변 도메인의 C-말단과 연결할 수 있다. 특정 실시양태에서, 테더의 길이는 약 15 내지 50개의 아미노산, 예를 들어 20 내지 26개의 아미노산 (예를 들어, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개의 아미노산)이다. 테더는 예를 들어 당업계의 표준 방법 및 시약을 사용하여 자가-절단, 또는 효소에 의한 또는 화학적 절단에 의해 "절단가능"할 수 있다.
"링커" 또는 "테더"의 효소에 의한 절단은 엔도펩티다제, 예를 들어, Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, 키모트립신, 트립신, 펩신, 파파인, 트롬빈, 게네나제, 인자 Xa, TEV (담배 식각 바이러스 시스테인 프로테아제), 엔테로키나제, HRV C3 (인간 리노바이러스 C3 프로테아제), 키니노게나제, 및 섭틸리신-유사 전구단백질 전환효소 (예를 들어, 푸린 (PC1), PC2, 또는 PC3) 또는 N-아르기닌 이염기성 전환효소의 사용을 수반할 수 있다. 화학적 절단은 예를 들어 히드록실아민, N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드, 또는 브롬화시안의 사용을 수반할 수 있다.
본원에서 사용되는 "Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위"는 Lys-C 엔도펩티다제에 의해 C-말단 측면에서 절단될 수 있는 아미노산 서열 내의 리신 잔기이다. Lys-C 엔도펩티다제는 리신 잔기의 C-말단 측면에서 절단한다.
본원에서 사용되는 "7개체 반복체"는 아미노산 서열 내에서 적어도 1회 반복되는 7개의 연속적인 아미노산의 서열을 의미한다. 7개체 반복체는 제1 반복체의 C-말단이 제2 반복체의 N-말단에 바로 인접하면서 아미노산 서열 내에 연속적으로 배열될 수 있다. 한 실시양태에서, 7개체 반복체는 본원에서 규정되는 화학식 I 또는 화학식 II의 서열을 갖는다.
본원에서 사용되는 "코일드 코일 도메인", "코일드 코일 이종이량체화 도메인", "코일", 또는 "코일 이종이량체화 도메인"은 제2 알파-나선 구조 (제2 "코일드 코일 도메인")와 상호작용하여 "코일드 코일" 또는 "이종이량체성 코일드 코일"을 형성할 수 있는 알파-나선 구조를 형성하는 아미노산 서열을 의미한다. 알파 나선 구조는 우선성 알파 나선 (right-handed alpha helix)일 수 있다. 한 실시양태에서, 알파 나선 구조는 7개체 반복체로 이루어진다. 하나의 특정 예에서, 코일 코일 도메인은 도 1에 제시된 구조를 갖고, 여기서 1 및 제2 알파 나선 구조의 "X1" 및 "X1" 위치의 잔기는 서로 소수성 상호작용을 형성하고, 1 및 제2 알파 나선 구조의 "X4" 및 "X4" 위치의 잔기는 서로 소수성 상호작용을 형성하고, 제1 알파 나선 구조의 "X5" 위치의 잔기는 제2 알파 나선 구조의 "X7" 위치의 잔기와 이온성 상호작용을 형성하고, 제1 알파 나선 구조의 "X7" 위치의 잔기는 제2 알파 나선 구조의 "X5" 위치의 잔기와 이온성 상호작용을 형성한다. 코일드 코일 도메인은 본원에서 규정되는 화학식 I 또는 화학식 II의 2 이상의 7개체 반복체로 이루어질 수 있다.
"소수성 잔기"는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린, 또는 메티오닌을 의미한다. 특정 실시양태에서, 소수성 잔기는 프롤린이 아니다.
"하전된 잔기"는 산성 또는 염기성 아미노산을 의미한다. 리신, 아르기닌, 및 히스티딘은 염기성 아미노산이고, 아스파르트산 및 글루탐산은 산성 아미노산이다.
"무질서유발제"는 분자내 상호작용 (예를 들어, 수소 결합, 판 데어 발스력, 또는 소수성 효과)의 안정화를 방해함으로써 단백질 (예를 들어, 항체)의 3차원 구조를 붕괴시키는 수용성 물질을 의미한다. 예시적인 무질서유발제는 우레아, 구아니딘-HCl, 과염소산리튬, 히스티딘, 및 아르기닌을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"연성 세제"는 분자내 상호작용 (예를 들어, 수소 결합, 판 데어 발스력, 또는 소수성 효과)의 안정화를 방해함으로써 단백질 (예를 들어, 항체)의 3차원 구조를 붕괴시키지만 단백질 구조를 영구적으로 붕괴시켜 생물학적 활성의 상실을 야기하지는 않는 (즉, 단백질을 변성시키지 않는) 수용성 물질을 의미한다. 예시적인 연성 세제는 트윈 (예를 들어, 트윈-20), 트리톤 (예를 들어, 트리톤 X-100), NP-40 (노닐 페녹실폴리에톡실에탄올), 노니데트 (Nonidet) P-40 (옥틸 페녹실폴리에톡실에탄올), 및 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"힌지 영역"은 인간 IgG1의 약 Glu216으로부터 약 Pro230까지 이어지는 것으로서 일반적으로 규정된다 (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 제1 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 배치함으로써 IgG1 서열과 정렬시킬 수 있다.
Fc 영역의 "보다 낮은 힌지 영역"은 통상 힌지 영역에 대해 바로 C-말단인 잔기의 스트레치, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239로서 정의된다. 본 발명 전에, FcγR 결합은 일반적으로 IgG Fc 영역의 보다 낮은 힌지 영역 내의 아미노산 잔기에 따른 것이었다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 대체로 대략 IgG의 아미노산 231로부터 아미노산 340까지 이어진다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 페어링되지 않는다는 점에서 특유한 것이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 사슬이 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 탄수화물이 도메인-도메인 페어링에 대한 대안을 제공하고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있는 것으로 추정되었다 (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)).
"CH3 도메인"은 Fc 영역 내의 CH2 도메인의 C-말단에 위치하는 잔기의 스트레치 (즉, IgG의 대략 아미노산 잔기 341 내지 아미노산 잔기 447)를 포함한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하여, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위하여 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226, 또는 위치 Pro230의 아미노산 잔기로부터 그의 카르복실-말단으로 확장되도록 규정된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합할 것을 필요로 하고, 예를 들어 본원의 정의란에 개시된 바와 같은 다양한 분석법을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이인자형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 및 그의 천연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)에 의해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교시에, 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역에서 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게, 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 바람직하게는 적어도 약 80%의 서열 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 상동성을 가질 것이다.
본원에서 사용되는 "Fc 복합체"는 함께 상호작용하는 Fc 영역의 2개의 CH2 도메인 및/또는 함께 상호작용하는 Fc 영역의 2개의 CH3 도메인을 의미하고, 여기서 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인은 펩티드 결합이 아닌 결합 및/또는 힘 (예를 들어, 판 데어 발스, 소수성, 친수성 힘)을 통해 상호작용한다.
본원에서 사용되는 "Fc 성분"은 Fc 영역의 힌지 영역, CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 의미한다.
본원에서 사용되는 "Fc CH 성분" 또는 "FcCH"는 Fc 영역의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 의미하고, 항체 이소형에 따라 상이하다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성의 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비형 Ig가, 상기 세포독성의 효과기 세포가 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 표적 세포를 세포독성제로 사멸시키도록 만드는 세포독성의 한 형태를 의미한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장시키고", 상기 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 바람직한 FcR은, IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고 상기 수용체의 대립유전자 변이체 및 선택적 스플라이싱된 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-492 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에 개시되어 있다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])을 담당하는 신생아의 수용체인 FcRn을 포함한다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적 세포의 용해를 의미한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 그의 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위클래스의)에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.
용어 "치료 유효량"은 대상체에서 질병 또는 질환의 치료를 위한 항체, 항체 단편, 또는 유도체의 양을 의미한다. 종양 (예를 들어, 암성 종양)의 경우, 치료 유효량의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 다중특이적 항체 또는 항체 단편)은 암 세포수의 감소, 원발성 종양 크기의 감소, 주변 장기로의 암 세포 침투의 억제 (즉, 어느 정도의 감소, 바람직하게는 중지); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도의 감소, 바람직하게는 중지); 어느 정도 종양 성장의 억제 및/또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감을 달성할 수 있다. 항체 또는 항체 단편이 존재하는 암 세포의 성장을 방지하고(하거나) 암 세포를 괴사시킬 정도로, 이들은 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 치료를 위해, 생체 내 효능은 예를 들어 생존 기간, 질병 진행시까지의 시간 (TTP), 반응 속도 (RR), 반응 기간 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정할 수 있다.
"감소시키거나 억제하다"는 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 총 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 감소시키거나 억제하다는 치료되는 질환의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 원발성 종양의 크기, 또는 혈관신생 질환에서 혈관의 크기 또는 수를 지칭할 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 상기 정의에는 양성 및 악성 암이 포함된다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 구체적인 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포암종, 복막의 암, 간세포성 암, 위장 또는 위암, 예를 들어 위장관 암, 췌장 암, 아교모세포종, 신경아교종, 자궁경부암, 난소 암, 간암, 방광암, 간암종, 유방암, 결장암, 결직장암암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 암 (예를 들어, 신세포 암종), 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 및 다양한 종류의 두경부암을 포함한다. "조기 암"은 암이 침습성 또는 전이성이 아니거나 또는 0, I, 또는 II기 암으로서 분류되는 암을 의미한다. 용어 "전암성"은 전형적으로 암에 선행하거나 암으로 발전하는 병태 또는 성장을 지칭한다. "비-전이성"은 양성이거나 또는 원발성 부위에 유지되고 림프계 또는 혈관계 내로 또는 원발성 부위 이외의 다른 조직 투과하지 않은 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 0, I, 또는 II기 암, 및 때때로 III기 암인 임의의 암이다.
"HER2의 비정상적인 활성화를 수반하는 비-악성 질병 또는 질환"은 HER2의 비정상적인 활성화가 그 질병 또는 질환을 갖거나 소인이 있는 대상체의 세포 또는 조직에서 발생하는, 암을 수반하지 않는 병태이다. 상기 질병 또는 질환의 예는 자가면역 질병 (예를 들어, 건선) (하기 정의 참조); 자궁내막증; 공피증; 재협착증; 폴립, 예를 들어 결장 폴립, 비내 폴립 또는 위장관 폴립; 섬유선종; 호흡기 질병 (예를 들어, 만성 기관지염, 천식, 예를 들어 급성 천식 및 알레르기성 천식, 낭성 섬유증, 기관지확장증, 알레르기성 또는 다른 비염 또는 부비강염, α1-항-트립신 결핍증, 기침, 폐기종, 폐섬유증 또는 과민반응성 기도, 만성 폐쇄성 폐 질병, 및 만성 폐쇄성 폐 질환); 담낭염; 신경섬유종증; 다낭성 신장 질병; 염증성 질병; 피부 질환, 예를 들어 건선 및 피부염; 혈관 질병; 혈관 상피 세포의 비정상적인 증식을 수반하는 병태; 위장관 궤양; 메네트리에 (Menetrier) 병, 분비성 선종 또는 단백질 상실 증후군; 신장 질환; 혈관신생 질환; 눈 질병, 예를 들어 노인성 황반 변성, 추정 눈 히스토플라스마증 증후군, 증식성 당뇨성 망막병증으로 인한 망막 혈관신생, 망막 혈관형성, 당뇨성 망막병증, 또는 노인성 황반 변성; 골 관련 병상, 예를 들어 골관절염, 구루병 및 골다공증; 뇌 허혈 사건 후의 손상; 화상, 외상, 방사선 조사, 뇌졸중, 저산소증 또는 허혈 후의 섬유성 또는 부종 질병, 예를 들어 간경화, 폐섬유증, 카르코이도시스 (carcoidosis), 갑상선염, 전신성 고점도 증후군, 오슬러-웨버-렌두 (Osler-Weber-Rendu) 병, 만성 폐쇄성 폐 질병, 또는 부종; 피부의 과민성 반응; 당뇨성 망막병증 및 당뇨성 신병증; 길랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군; 이식편 대 숙주 질병 또는 이식 거부; 파제트 (Paget) 병; 뼈 또는 관절 염증; 광노화 (예를 들어, 인간 피부UV 방사선 조사에 의해 유발되는); 양성 전립선 비대; 특정 미생물 감염, 예를 들어 아데노바이러스, 한타바이러스, 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 예르시니아 종 (Yersinia spp .) 및 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis)로부터 선택되는 미생물 병원체; 혈소판 응집에 의해 야기되는 혈전; 생식기 병태, 예를 들어 자궁내막증, 난소 과다자극 증후군, 자간전증, 기능부전성 자궁 출혈, 또는 불규칙 과다월경; 윤활막염; 죽종; 급성 및 만성 신장병증 (증식성 사구체신염 및 당뇨병-유도 신장 질병 포함); 습진; 비후성 반흔 형성; 내독성 쇼크 및 진균 감염; 가족성 선종증 폴립증; 신경변성 질병 (예를 들어, 알쯔하이머 (Alzheimer) 병, AIDS-과련 치매, 파킨슨 (Parkinson) 병, 근위축성 측삭 경화증, 색소성 망막염, 척수근 위축증 및 소뇌 변성); 골수 이형성 증후군; 재생불량 빈혈; 허혈성 손상; 펴, 신장 또는 간의 섬유증; T-세포 매개 과민성 질병; 영아 비후성 유문부 협착증; 요로 폐쇄 증후군; 건선성 관절염; 및 하시모또 (Hashimoto) 갑상선염을 포함한다.
본원에서 "알레르기성 또는 염증성 질환"은 개체의 면역계의 과다활성화에 의해 발생하는 질병 또는 질환이다. 예시적인 알레르기성 또는 염증성 질환은 천식, 건선, 류마티스성 관절염, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 습진, 장기 이식, 노인성 황반 변성, 크론 (Crohn) 병, 궤양성 결장염, 호산구성 식도염, 및 염증과 연관된 자가면역 질병을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 "자가면역 질병"은 개체 자신의 조직 또는 동시 분리계 (co-segregate)에 대해 발생하는 질병 또는 질환 또는 그의 증상 또는 그로부터 발생하는 병태이다. 자가면역 질병 또는 질환의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 관절염 (류마티스성 관절염, 예를 들어 급성 관절염, 만성 류마티스성 관절염, 통풍 관절염, 급성 통풍 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 (Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염, 및 연소성 발병 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형 관절염, 만성 원발성 다발관절염, 반응성 관절염, 및 강직 척추염), 염증성 과다증식성 피부병, 건선, 예를 들어 반상 건선, 물방울 모양 (gutatte) 건선, 농포성 건선, 및 손톱 건선, 피부염, 예를 들어 접촉 피부염, 만성 접촉 피부염, 알레르기 피부염, 알레르기 접촉 피부염, 포진피부염, 및 아토피 피부염, x-연결 과다 IgM 증후군, 두드러기, 예를 들어 만성 알레르기 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역 두드러기, 다발근육염/피부근염, 연소성 피부근염, 독성 표피괴사, 공피증 (전신성 공피증 포함), 경화증, 예를 들어 전신성 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예를 들어 척수-눈 MS, 원발성 진행성 MS (PPMS), 및 재발 완화형 MS (RRMS), 진행성 전신성 경화증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 범발성 경화증, 및 실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론병, 자가면역-매개 위장관 질병, 결장염, 예를 들어 궤양성 결장염, 궤양 결장염, 현미경적 결장염, 교원질성 결장염, 용종 결장염, 괴사 소장결장염, 및 경벽성 결장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 괴저농피증, 결절홍반, 원발성 경화 쓸개관염, 상공막염), 호흡 곤란 증후군, 예를 들어 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액학적 질환, 류마티스 척추염, 급성 난청, IgE-매개 질환, 예를 들어 과민증 및 알레르기 및 아토피 비염, 뇌염, 예를 들어 랏무센 (Rasmussen) 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예를 들어 앞포도막염, 급성 앞포도막염, 육아종성 포도막염, 비육아종성 포도막염, 수정체항원성 (phacoantigenic) 포도막염, 뒤포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신 증후군이 있거나 없는 사구체신염 (GN), 예를 들어 만성 또는 급성 사구체신염, 예를 들어 원발성 GN, 면역 매개 GN, 막 GN (막 신병증), 특발성 막 GN 또는 특발성 막 신병증, 막성- 또는 막 증식성 GN (MPGN), 예를 들어 타입 I 및 타입 II, 및 급속 진행성 GN, 알레르기 질환, 알레르기 반응, 습진, 예를 들어 알레르기 또는 아토피 습진, 천식, 예를 들어 기관지성 천식 (asthma bronchiale), 기관지 천식, 및 자가면역 천식, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 병태 및 만성 염증 반응, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 전신성 홍반 루푸스, 예를 들어 피부 SLE, 아급성 피부 홍반 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 파종상 홍반성 루푸스, 루푸스 (예를 들어 신장염, 뇌염, 소아, 비-신장, 신장외, 원반상 탈모증), 연소성 발병 (타입 I) 당뇨병, 예를 들어 소아 인슐린-의존형 당뇨병 (IDDM), 성인 발병 당뇨병 (타입 II 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 시토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 사코이드증, 육아종증, 예를 들어 림프종모양 육아종증, 베게너 (Wegener) 육아종증, 무과립구증, 혈관염, 예를 들어 맥관염 (예를 들어 대혈관 맥관염 (예를 들어 류마티스성 다발성 근육통 및 거대세포 (다까야스 (Takayasu)) 동맥염), 중형 혈관 맥관염 (예를 들어 가와사키 (Kawasaki) 병 및 다발성 결절 동맥염), 현미경적 다발 동맥염, CNS 맥관염, 괴사, 피부, 또는 과민성 맥관염, 전신성 괴사 맥관염, 및 ANCA-관련 맥관염, 예를 들어 처크-스트라우스 (Churg-Strauss) 맥관염 또는 증후군 (CSS)), 일시적 동맥염, 재생불량 빈혈, 자가면역 재생불량 빈혈, 쿰즈 (Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 (Diamond Blackfan) 빈혈, 용혈 빈혈 또는 면역 용혈 빈혈, 예를 들어 자가면역 용혈 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈 (anemia perniciosa), 애디슨 (Addison)병, 진정 적혈구계 빈혈 또는 무형성 (PRCA), 팩터 VIII 결핍증, A형 혈우병, 자가면역 호중구 감소증, 범혈구감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 혈구 누출을 수분하는 질병, CNS 염증성 질환, 다발성 장기 손상 증후군, 예를 들어 패혈증, 외상 또는 출혈에 2차적인 질환, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기 신경염, 베체트 (Behcet) 병, 캐슬만 (Castleman) 증후군, 굿패스쳐 (Goodpasture) 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 (Stevens-Johnson) 증후군, 천포창, 예를 들어 낙엽상 천포창 및 피부 유천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 점막 유천포창 및 홍반 천포창 포함), 자가면역 다발성 내분비 장애, 라이터 (Reiter) 병 또는 증후군, 면역 복합체 신장염, 항체-매개 신장염, 시신경 척수염, 다발성 신경병증, 만성 신경병증, 예를 들어 IgM 다발 신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 저혈소판증 (예를 들어 심근경색 환자에 의해 발생), 예를 들어 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 및 자가면역 또는 면역-매개 저혈소판증, 예를 들어 특발성 혈소판 감소성 자반병 (ITP), 예를 들어 만성 또는 급성 ITP, 정소 및 난소의 자가면역 질병, 예를 들어 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선 기능 저하증, 부갑상선 기능 저하증, 자가면역 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염, 예를 들어 자가면역 갑상선염, 하시모또병, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선 기능 저하증, 그레이브 (Grave) 병, 다분비선 증후군, 예를 들어 자가면역 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 부신생물 증후군, 예를 들어 신경학적 부신생물 증후군, 예를 들어 램버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력증 증후군 또는 이튼-램버트 증후군, 근강직 증후군, 뇌척수염, 예를 들어 알레르기 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근육 무력증, 예를 들어 흉선종 연관 중증 근육 무력증, 소뇌변성, 신경근강직증, 안진전 또는 안진전 근경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다초점성 운동 신경병증, 쉬한 (Sheehan) 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 림프양 간질 폐렴, 폐쇄세기관지염 (비-이식) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군, 버거 (Berger) 병 (IgA 신병증), 특발성 IgA 신병증, 선상 IgA 피부병, 원발성 담관 경화증, 폐경화, 자가면역 장병증 증후군, 만성 소화장애증, 복강 질환, 비열대스프루 (글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축 측삭 경화증 (ALS; 루게릭 (Lou Gehrig) 병), 관상동맥 질환, 자가면역 귀 질병, 예를 들어 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 청력 상실, 안진전 근경련 증후군 (OMS), 다발연골염, 예를 들어 불응성 또는 재발된 다발연골염, 폐포단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 유의성 비결정 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS))을 포함하는 원발성 림프구증가증, 말초 신경병증, 부신생물 증후군, 채널병증, 예를 들어 간질, 편두통, 부정맥, 근육 질환, 난청, 실명, 주기적 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근염, 국소 분절 사구체 경화증 (FSGS), 내분비 눈병증, 포도망막염, 맥락망막염, 자가면역 간질환, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전, 슈미트 (Schmidt) 증후군, 부신염, 위 위축, 초로 치매, 탈수초성 질환, 예를 들어 자가면역 탈수초성 질환, 당뇨성 신병증, 드레슬러 (Dressler) 증후군, 원형탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노드 (Raynaud) 현상, 식도 운동이상, 손발가락경화증, 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 혼합결합조직병, 샤가스 (Chagas) 병, 류마티스열, 습관성 유산, 농부폐, 다형 홍반, 심장절개술후 증후군, 쿠싱 (Cushing) 증후군, 새 사육가 폐, 알레르기 육아종 혈관염, 양성 림프구 혈관염, 알포트 (Alport) 증후군, 폐포염, 예를 들어 알레르기 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증, 파동편모충증, 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘터 (Sampter) 증후군, 카플란 (Caplan) 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막 심근섬유증, 미만성 간질성 폐섬유증, 간질 폐 섬유증, 특발성 폐섬유증, 낭성 섬유증, 안구내염, 장기 융기성 홍반, 태아적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 (Shulman) 증후군, 펠티 (Felty) 증후군, 사상충증, 섬모체염, 예를 들어 만성 섬모체염, 이시성 섬모체염, 홍채섬모체염, 또는 푸크 (Fuch) 섬모체염, 헤노호-쉔라인 (Henoch-Schonlein) 자색반, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알쯔하이머병, 파보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신처리후 증후군, 선천 풍진 감염, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스 감염, 볼거리, 에반 (Evan) 증후군, 자가면역 생식선 부전, 시덴함 (Sydenham) 무도병, 연쇄상구균 감염후 신장염, 폐쇄성 혈전혈관염 (thromboangitis ubiterans), 갑상선 기능 항진증, 척수매독, 맥락막염, 거대세포 다발근육통증, 내분비 눈병증, 만성 과민성 폐렴, 건조 각막결막염, 유행성 각막결막염, 특발성 신장염 증후군, 미소 병변 신병증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 규폐증, 아프타, 아프타 구내염, 동맥경화성 질환, 아스퍼미오게네스 (aspermiogenese), 자가면역 용혈, 뵈크 (Boeck) 병, 한랭글로불린혈증, 뒤피트렌 (Dupuytren) 구축, 수정체 과민 안내염 (endophthalmia phacoanaphylactica), 알레르기성 장염, 나병결절홍반, 특발성 안면마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열, 함만-리치 (Hamman-Rich) 병, 감각신경성 난청, 발작성 혈색소뇨증, 성선 기능저하증, 국한성 회장염, 백혈구 감소증, 전염 단핵구증, 횡단척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신장증, 교감성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발 신경근염, 괴저농피증, 쿼베인 (Quervain) 갑상선염, 후천성 비장 위축, 항정자 항체에 의한 불임, 비-악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡스타인-바 바이러스-연관 질환, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 기생충 질환, 예를 들어 리슈만편모충, 독성 쇼크 증후군, 식중독, T 세포 침윤, 백혈구-부착 결핍, 시토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련된 면역 반응을 수반하는 병태, 백혈구 혈구 누출을 수반하는 질병, 다발성 장기 손상 증후군, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 알레르기 신경염, 자가면역 다발성 내분비 장애, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역 위축 위염, 교감성 안염, 류마티스병, 혼합결합조직 질병, 신 증후군, 췌도염, 다발성 내분비 부전, 말초 신경병증, 자가면역 다분비선 증후군 타입 I, 성인 발병 특발성 부갑상선 기능 저하증 (AOIH), 전체탈모증, 확장 심근병증, 후천적 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소침착증, 심근염, 신 증후군, 원발성 경화쓸개관염, 화농성 또는 비화농성 부비강염, 급성 또는 만성 부비강염, 사골, 전두, 상악, 또는 접형 부비강염, 호산구-관련 질환, 예를 들어 호산구 증가증, 폐 침윤 호산구 증가증, 호산구 증가증-근육통 증후군, 로플러 (Loffler) 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구 증가증, 기관지폐렴성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구를 포함하는 육아종, 과민증, 음성혈청 척추관절염, 다발성 내분비 자가면역 질병, 경화쓸개관염, 공막, 상공막, 만성 점막 피부 칸디다증, 브루톤 (Bruton) 증후군, 유아의 일과성 감마글로불린저혈증, 위스코트-올드리히 (Wiskott-Aldrich) 증후군, 운동실조 모세혈관확장증, 교원병과 연관된 자가면역 질환, 류마티스, 신경학적 질환, 허혈 재관류 질환, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능이상, 혈관확장증, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 뇌 허혈 및 혈관신생을 수반하는 질환, 알레르기 과민성 질환, 사구체신염, 재관류 손상, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성 염증성 성분을 갖는 피부병, 급성 화농성 수막염 또는 다른 중추신경계 염증성 질환, 눈 및 안와 염증성 질환, 과립구 수혈-연관 증후군, 시토킨 유발 독성, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경화, 당뇨성 망막병증, 당뇨성 대동맥 질환, 말단동맥 과다증식 (endarterial hyperplasia), 소화 궤양, 판막염 및 자궁내막증.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 제한하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제 (intercalating agent), 효소 및 그의 단편, 예를 들어 뉴클레오티드 분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 및 그의 단편 및/또는 변이체, 및 아래에 개시된 다양한 항종양제, 항암제 및 화학요법제를 포함하고자 의도된다. 다른 세포독성제는 아래에 기재된다. 살종양제는 종양 세포를 파괴한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로스포스파미드 (싸이톡산 (CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마트놀 (MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴 (HYCAMTIN)® 포함), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르 (CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레틸아민 옥시드 염산염, 멜파란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디와인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1 (예를 들어, [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신 (ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사체, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (제이에이치에스 내처럴 프로덕츠 (JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유진 소재)); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리콜테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신 (ELDISINE)®, 필데신 (FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔 (TAXOL)®, 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스톤)), 및 아브락산 (ABRAXANE)™ (파클리탁셀의 크레모포르-부재, 알부민-처리된 나노입자 제제, 아메리칸 파마슈티칼스 파트너스 (American Pharmaceutical Partners, 미국 일리노이주 샤움버그 소재)), 및 독세탁셀 (탁소테레 (TAXOTERE)®, 롱-쁘랑 로러 (Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니)); 클로람부실; 겜시타빈 (젬자 (GEMZAR)®); 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반 (VELBAN)®); 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈 (ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈 (NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 카페시타빈 (젤로다 (XELODA)®) 및 상기 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 2개 이상의 상기 물질의 조합물, 예를 들어 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 플레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합한 옥살리플라틴 (엘록사틴 (ELOXATIN)™)을 사용한 치료의 약어)를 포함한다.
또한 상기 정의에는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제가 포함되고, 종종 전신성, 또는 전신 치료 형태이다. 이들은 호르몬 자체일 수 있다. 그 예는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스 (NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 에비스타 (EVISTA)® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤 (FARESTON)® 토레미펜; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절물질 (ERD); 난소를 억제하거나 차단하는 기능을 하는 물질, 예를 들어 황체화 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효현제, 예를 들어 루프론 (LUPRON)® 및 엘리가드 (ELIGARD)® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세 (MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신 (AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르 (RIVISOR)® 보로졸, 페마라 (FEMARA)® 레트로졸 및 아리미덱스 (ARIMIDEX)® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 상기 화학요법제의 정의는 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스 (BONEFOS)® 또는 오스탁 (OSTAC)®), 디드로칼 (DIDROCAL)® 에티드로네이트, NE-58095, 조메타 (ZOMETA)® 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사맥스 (FOSAMAX)® 알렌드로네이트, 아레디아 (AREDIA)® 파미드로네이트, 스켈리드 (SKELID)® 틸루드로네이트, 또는 악토넬 (ACTONEL)® 리세드로네이트; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, 및 H-Ras; 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 테라포페 (THERATOPE)® 백신 및 유전자 치료 백신, 예를 들어 알로벡틴 (ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴 (LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드 (VAXID)® 백신; 루르토테칸 (LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스 (ABARELIX)® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016으로도 알려진 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
본원에서 사용될 때 "성장 억제제"는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 세포의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 (S기 이외의 다른 시기에) 세포 주기 진행을 차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), 예를 들어, p. 13]에서 볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 모두 주목 나무로부터 유도된 항암 약물이다. 서양 주목에서 유도된 도세탁셀 (탁소테레(등록상표), 롱-프랑 로러)은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스퀴브)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세관의 조립을 촉진하고, 탈중합을 억제함으로써 미세관을 안정화시키고, 이에 의해 세포의 유사분열을 억제한다.
본원에서 사용되는 "항암 요법"은 대상체에서 암을 감소시키거나 억제하는 치료를 의미한다. 항암 요법의 예는 세포독성 방사선 요법 및 치료 유효량의 세포독성제, 화학요법제, 성장 억제제, 암 백신, 혈관신생 억제제, 전구약물, 시토킨, 시토킨 길항제, 코르티코스테로이드, 면역억제제, 항구토제, 항체 또는 항체 단편, 또는 진통제의 대상체에 대한 투여를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "전구약물"은 모 약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 작을 수 있고 효소에 의해 활성화되거나 보다 활성의 모 형태로 전환될 수 있는, 제약 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)] 참조). 본 발명의 전구약물은 보다 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, 베타-락탐-함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세타미드-함유 전구약물, 또는 임의 치환된 페닐아세타미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기한 화학요법제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
용어 "시토킨"은 세포간 매개자로서 또 다른 세포에 대해 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 총칭이다. 상기 시토킨의 예는 림포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 (HGH), N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 전구인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 형성 호르몬 (LH); 표피 성장 인자 (EGF); 간 성장인자; 섬유모세포 성장인자 (FGF); 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-회합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장인자, 예를 들어 NGF-α; 혈소판-성장인자; 전환 성장인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-18; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 시토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양액으로부터의 단백질 및 천연 서열 시토킨의 생물학적 활성 균등물을 포함한다.
"시토킨 길항제"는 적어도 하나의 시토킨의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 분자를 의미한다. 예를 들어, 시토킨 길항제는 시토킨 발현 및/또는 분비를 억제함으로써, 또는 시토킨 또는 시토킨 수용체에 결합함으로써 시토킨 활성을 억제할 수 있다. 시토킨 길항제는 시토킨 또는 시토킨 수용체에 결합하는 항체, 합성 또는 천연-서열 펩티드, 면역어드헤신, 및 소분자 길항제를 포함한다. 시토킨 길항제는 세포독성제에 임의로 접합되거나 융합된다. 예시적인 TNF 길항제는 에타네르셉트 (엔브렐 (ENBREL)®), 인플릭시맙 (레미케이트 (REMICADE)®), 및 아달리무맙 (후미라 (HUMIRA)™)이다.
본원에서 사용되는 "면역억제제"는 치료되는 대상체의 면역계를 억제하거나 차단하는 작용을 하는 물질을 의미한다. 상기 억제제는 시토킨 생산을 억제하거나, 자가항원 발현을 하향조절하거나 또는 억제하거나 또는 MHC 항원을 차단하는 물질을 포함한다. 면역억제제의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환 피리미딘 (미국 특허 4,665,077) 참조; 미코페놀레이트 모페틸, 예를 들어 셀셉트 (CELLCEPT)®; 아자티온프린 (이뮤란 (IMURAN)®, 아자산 (AZASAN)®/6-머캅토퓨린; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드 (미국 특허 4,120,649에 기재된 바와 같이 MHC 항원을 차단함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-개별특이형 항체; 시클로스포린 A; 스테로이드, 예를 들어 코르티코스테로이드 및 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어, 프레드니손, 프레드니솔론, 예를 들어 페디아프레드 (PEDIAPRED)® (프레드니솔론 인산나트륨) 또는 오라프레드 (ORAPRED)® (프레드니솔론 인산나트륨 경구 용액), 메틸프레드니솔론, 및 덱사메타손; 메토트렉세이트 (경구 또는 피하) (류마트렉스 (RHEUMATREX)®, 트렉살 (TREXALL)™); 히드록시클로로퀸/클로로퀸; 술파살라진; 레플루노마이드; 시토킨 또는 시토킨 수용체 길항제, 예를 들어 항-인터페론-γ, -β, 또는 -α 항체, 항-종양 괴사 인자-α 항체 (인플릭시맙 또는 아달리무맙), 항-TNFα 면역어드헤신 (엔브렐®, 에타네르셉트), 항-종양 괴사 인자-β 항체, 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-LFA-1 항체, 예를 들어 항-CD11a 및 항-CD18 항체; 항-L3T4 항체; 이종성 항-림프구 글로불린; 폴리클로날 또는 pan-T 항체, 또는 모노클로날 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인 함유 가용형 펩티드 (WO 90/08187); 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; 숙주의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (미국 특허 5,114,721 (Cohen et al.)); T-세포 수용체 단편 ([Offner et al. Science 251: 430-432 (1991)]; WO 90/11294; [Ianeway, Nature 341:482 (1989)]; 및 WO 91/01133); T 세포 수용체 항체 (EP 340,109), 예를 들어 T10B9; 시클로포스파미드 (싸이톡산®); 답손; 페니실라민 (쿠프리민 (CUPRIMINE)®); 혈장 교환; 또는 정맥내 면역글로불린 (IVIG)을 포함한다. 이들은 단독으로 또는 서로 조합되어 사용될 수 있고, 특히 스테로이드 및 또 다른 면역억제제의 조합물이 사용될 수 있거나 또는 상기 조합 후에 스테로이드 필요성을 감소시키기 위해 비-스테로이드제의 유지 용량이 투여될 수 있다.
"진통제"는 대상체에서 통증을 억제 또는 억압하는 작용을 하는 약물을 나타낸다. 예시적인 진통제는 비-스테로이드성 소염제 (NSAID), 예를 들어 이부프로펜 (모트린 (MOTRIN)®), 나프록센 (나프로신 (NAPROSYN)®), 아세틸살리실산, 인도메타신, 술린닥, 및 톨메틴 (그의 염 및 유도체 포함), 및 발생할 수 있는 심한 통증을 감소시키기 위해 사용되는 다양한 다른 의약, 예를 들어 항경련제 (가바펜틴, 페닐로인, 카마제핀) 또는 삼환계 항우울제를 포함한다. 구체적인 예는 아세트아미노펜, 아스피린, 아미트립틸린 (에트라빌 (ELAVIL)®), 카마제핀 (테그레톨 (TEGRETOL)®), 페닐토인 (딜란틴 (DILANTIN)®), 가바펜틴 (뉴론틴 (NEURONTIN)®), (E)-N-바닐릴-8-메틸-6-노네아미드 (캡사이신 (CAPSAICIN)®), 또는 신경 차단제를 포함한다.
"코르티코스테로이드"는 천연 생성 코르티코스테로이드의 효과를 모방하거나 증대시키는 스테로이드의 일반적인 화학 구조를 갖는 여러 합성 또는 천연 생성 물질 중의 임의의 하나를 의미한다. 합성 코르티코스테로이드의 예는 프레드니손, 프레드니솔론 (메틸프레드니솔론 포함), 덱사메타손, 트리암시놀론, 및 베타메타손을 포함한다.
본원에서 사용되는 "암 백신"은 암에 대한 대상체의 면역 반응을 자극하는 조성물이다. 암 백신은 전형적으로 항원에 대한 면역 반응을 추가로 자극하고 부스팅하기 위한 다른 성분 (예를 들어, 항원보강제)과 함께 자가 (자신으로부터의) 또는 대상체에 대해 동종이형 (다른 개체로부터의)일 수 있는 암-연관 물질 또는 세포 (항원)의 공급원으로 구성된다. 암 백신은 1 또는 수개의 특이적 항원에 대한 항체를 생산하고/하거나 항원을 갖는 암세포를 공격하는 킬러 T 세포를 생산하기 위해 대상체의 면역계를 자극할 수 있다.
본원에서 사용되는 "세포독성 방사선 요법"은 세포의 기능을 억제하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 방사선 요법을 나타낸다. 방사선 요법은 예를 들어 외부 빔 방사선 조사 또는 방사성 표지 물질, 예를 들어 항체를 사용한 요법을 포함할 수 있다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32 및 Lu의 방사성 동위원소)의 사용을 포함하는 것으로 의도된다.
"표적 분자"는 본 발명의 단백질 복합체에 (바람직하게는 스캐차드 (scatchard) 분석에 따라 1 μM Kd보다 큰 친화도로) 결합할 수 있는 분자를 나타낸다. 표적 분자의 예는 혈청 가용성 단백질 및 그들의 수용체, 예를 들어 시토킨 및 시토킨 수용체, 어드헤신, 성장 인자 및 그들의 수용체, 호르몬, 바이러스 입자 (예를 들어, RSV F 단백질, CMV, StaphA, 인플루엔자, C형 간염 바이러스), 미생물 (예를 들어, 세균 세포 단백질, 진균 세포), 어드헤신, CD 단백질 및 이들의 수용체를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"항구토제"는 대상체에서 구토를 감소시키거나 억제하는 화합물이다. 항구토 화합물은 예를 들어 뉴로키닌-1 수용체 길항제, 5HT3 수용체 길항제 (예를 들어 온단세트론, 그라니세트론, 트로피세트론, 및 자티세트론), GABAB 수용체 효현제, 예를 들어 바클로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들어 덱사메타손, 케날로그 (KENALOG)®, 아리스토코르트 (ARISTOCORT)®, 또는 나살리드 (NASALIDE)®, 항도파민성, 페노티아진 (예를 들어 프로클로르페라진, 플루페나진, 티오리다진 및 메소리다진), 드로나비놀, 메트로클로프라미드, 돔페리돈, 할로페리돌, 시클리진, 로라제팜, 프로클로르페라진, 및 레보메프로마진을 포함한다.
"대상체"는 척추동물, 예를 들어 포유동물, 예를 들어, 인간이다. 포유동물은 농장 동물 (예를 들어 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예를 들어 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스, 및 래트를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
실시예에 언급된 상업상 이용가능한 시약은 달리 나타내지 않으면 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예에서 및 명세서 전체에 걸쳐서 ATCC 기탁 번호에 의해 확인되는 세포의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 매나서스)이다. 달리 나타내지 않으면, 본 발명은 재조합 DNA 기술의 표준 절차, 예를 들어 본원에 상기 및 다음과 같은 교재에 기재된 것을 사용한다: [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989)]; [Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., NY, 1990)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988)]; [Gait, 올리고뉴클레오티드 Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984)]; [Freshney, Animal Cell Culture, 1987]; [Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991].
본원 명세서 및 청구의 범위 전체에 걸쳐서, 용어 "포함하다", 또는 그의 변형 표현, 예를 들어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하지 않음이 이해될 것이다.
II . 코일드 코일 함유 및 묶인 항체의 제작
본원에 기재된 단백질 복합체는 이종이량체화 도메인 (예를 들어, 코일드 코일 도메인) 및/또는 테더를 사용하여 제작할 수 있다.
이종이량체 도메인을 사용함으로써 단일 항체 내에 상이한 중쇄를 갖는 항체의 비교적 순수한 집단을 제작할 수 있다. 특히, 상기한 바와 같이, 항체는 전형적으로 동일한 경쇄와 각각 페어링되는 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 본 발명의 코일드 코일 이종이량체화 도메인 기술을 사용하면, 상이한 항체 중쇄가 단일 항체의 형성시에 서로 우선적으로 이량체화될 수 있다. 이렇게 생성되는 항체는 2개의 상이한 중쇄를 포함하고, 이들은 각각 전형적으로 (그러나, 그럴 필요는 없다) 동일한 경쇄와 페어링된다. 그러한 항체 내의 중쇄 및 경쇄의 각각의 쌍은 상이한 중쇄의 존재 때문에 상이한 결합 특이성을 갖고, 따라서 항체는 다중특이적 항체로서 간주될 수 있다. 테더는 또한 단독으로 코일드 코일 기술과 조합하여 본 발명의 항체를 조작하기 위해 이용될 수 있다. 테더는 불변 경쇄의 C-말단을 가변 중쇄의 N-말단에 연결할 수 있고, 따라서 경쇄 및 중쇄의 적절한 회합, 및 단일 항체-코딩 플라스미드를 사용한 재조합 항체 생산이 가능할 수 있다. 코일드 코일 및/또는 테더를 포함하는 항체는 아래에서 추가로 설명된다.
A. 코일드 코일 도메인
본원에 기재된 단백질 복합체를 생성하기 위해 사용되는 이종이량체 도메인은 반대로 하전된 잔기를 함유하는 제2 알파 나선과 회합시에 코일드 코일을 형성할 수 있는 알파 나선 (예를 들어, 우선성 알파 나선)일 수 있다. 이종이량체성 분자의 균질한 또는 거의 균질한 집단을 생성하기 위해, 이종이량체화 도메인은 동종이량체보다 이종이량체를 보다 우선적으로 형성하여야 한다. 이와 관련하여, 본원에 기재된 이종이량체화 도메인은 Jun이 쉽게 동종이량체를 형성하기 때문에 Fos/Jun 류신 지퍼 도메인에 비해 유의한 잇점을 제공한다. 예시적인 알파-나선 이종이량체화 도메인은 도 1, 2a, 및 2b에 예시된다. 특정 실시양태에서, 제1 코일드 코일 도메인은 하기 화학식 I의 7개체 반복체를 함유하고, 제2 코일드 코일 도메인은 하기 화학식 II의 7개체 반복체를 함유한다:
<화학식 I>
Figure pct00008
(여기서, X1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
X2, X3, 및 X6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
X4는 소수성 아미노산 잔기이고,
X5 및 X7은 각각 하전된 아미노산 잔기임)
<화학식 II>
Figure pct00009
(여기서, X'1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
X'2, X'3, 및 X'6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
X'4는 소수성 아미노산 잔기이고,
X'5 및 X'7은 각각 하전된 아미노산 잔기임).
화학식 I 및 화학식 II 모두에서, n은 2 이상 (예를 들어, 3 또는 4 이상), 및 100 이하이다. 한 실시양태에서, n은 2 내지 20이다.
제1 코일드 코일 도메인의 X5 및 X7 잔기 및 제2 코일드 코일 도메인의 X'5 및 X'7 잔기는 그럴 필요는 없지만, 동일한 전하를 가질 수 있다. 따라서, 하나의 예에서, 제1 코일드 코일 도메인의 X5 및 X7 잔기는 잔기이고, 제2 코일드 코일 도메인의 X'5 및 X'7 잔기는 산성 잔기이다. 또 다른 예에서, 제1 코일드 코일 도메인 내의 X5는 염기성 잔기이고, 제1 코일드 코일 도메인 내의 X7은 산성 잔기이다. 이 예에서, 제2 코일드 코일 도메인은 X'5 위치에 염기성 잔기, 및 X'7 위치에 산성 잔기를 갖는다. 도 1에 도시된 바와 같이, 이온성 상호작용은 제1 코일드 코일 도메인의 X5 잔기와 제2 코일드 코일 도메인의 X'7 잔기 사이에서, 및 제1 코일드 코일 도메인의 X7 잔기와 제2 코일드 코일 도메인의 X'5 잔기 사이에서 발생한다. 관련 예에서, 제1 코일드 코일 도메인의 X5는 산성 잔기이고 제1 코일드 코일 도메인의 X7은 염기성 잔기이고, 제2 코일드 코일 도메인의 X'5는 산성 잔기이고, 제2 코일드 코일 도메인의 X'7은 염기성 잔기이다. 또한, 제1 및 제2 코일드 코일 도메인 모두의 X1/X'1 위치에 아스파라긴이 존재하는 적어도 하나의 7개체 반복체를 사용하여 제1 및 제2 코일드 코일 도메인의 평행 배향을 확인할 수 있다.
7개체 반복체 내의 소수성 잔기는 바람직하게는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 트립토판, 페닐알라닌, 및 메티오닌으로부터 선택된다. 아미노산 서열 내의 프롤린의 존재는 알파 나선 구조를 형성하는 그의 능력을 제한하기 때문에, 프롤린은 소수성이지만, 한 실시양태에서 화학식 I 또는 화학식 II의 코일드 코일 도메인에 포함되지 않는다. 또한, 다른 실시양태에서, 화학식 I 또는 화학식 II의 코일드 코일 도메인은 글리신이 입체형태적 가요성 때문에 제한된 알파 나선 구조를 쉽게 채용하지 않기 때문에 글리신 잔기를 함유하지 않는다.
화학식 I 또는 화학식 II의 코일드 코일 도메인에 포함될 수 있는 하전된 잔기는 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 및 글루탐산을 포함하고, 여기서 리신, 아르기닌, 및 히스티딘은 염기성 잔기이고, 아스파르트산 및 글루탐산은 산성 잔기이다.
본원에 기재된 항체의 제작은 화학식 I의 코일드 코일 도메인 및 화학식 II의 코일드 코일 도메인 (제1 및 제2 코일드 코일 도메인)을 사용할 수 있고, 여기서 제1 코일드 코일 도메인은 항체의 제1 불변 도메인 (예를 들어, 제1 중쇄의 CH3)에 연결되고, 제2 코일드 코일 도메인은 항체의 제2 불변 도메인 (예를 들어, 제2 중쇄의 CH3)에 연결된다. 연결은 펩티드 결합에 의한 직접적인 연결일 수 있거나 또는 링커 서열을 통해 이루어질 수 있다. 링커는 한 아미노산 서열 (예를 들어, 불변 영역)의 C-말단 말단부에 및 다른 아미노산 서열 (예를 들어, 코일드 코일 도메인)의 N-말단 말단부에 펩티드 결합될 수 있다. 링커는 본원에 다른 곳에서 추가로 설명되는 바와 같이 항체 불변 영역의 코일드 코일 도메인의 절단을 허용할 정도로 충분히 길 수 있지만, 2개의 항체 불변 영역 (예를 들어, 2개의 중쇄 불변 영역)의 이종이량체성 회합을 제시할 정도로 충분히 짧을 수 있다. 따라서, 링커는 2 내지 100개 아미노산 길이의 아미노산 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 2 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이이다. 링커는 예를 들어 중성 극성 또는 비극성 아미노산으로 구성될 수 있다.
B. 다중특이적 항체
상기 항체의 가변 도메인은 여러 방법으로 유도될 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 가변 도메인은 당업계에 공지된 기존의 항체와 동일할 수 있다.
코일드 코일 도메인은 다중특이적 항체 (적어도 2개의 항원 또는 동일한 항원 상의 적어도 2개의 에피토프에 결합하는 항체)를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 예에서 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 전형적으로, 천연 생성 IgG 항체에서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 각각의 쌍의 가변 영역은 동일하다. 본 발명에 따른 코일드 코일 도메인을 사용함으로써 항체 내의 2개의 중쇄를 상이하게 만들어, 상이한 결합 특이성을 갖는 항원 결합 도메인을 갖는 항체를 생성시킬 수 있다. 특히, 각각의 중쇄 (예를 들어, CH3의 C-말단) 상의 코일드 코일 이종이량체화 도메인은 상이한 중쇄 사이의 결합을 촉진한다. 임의로, 코일드 코일 도메인은 조립 후에 코일드 코일이 항체로부터 제거될 수 있도록 절단될 수 있는 링커에 의해 중쇄 불변 영역에 연결된다.
2개의 상이한 중쇄 (HC1 및 HC2) 및 2개의 동일한 또는 공통적인 경쇄를 포함하는 예시적인 이중특이적 항체의 모식도가 도 3에 제시된다. 도 3에서 예시적인 이중특이적 항체는 또한 이종이량체성 코일드 코일을 함유한다. 항체는 또한 항체가 조립된 후 항체로부터 코일드 코일의 제거를 허용하는, 각각의 코일드 코일 이종이량체화 도메인의 N-말단에 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 함유할 수 있다. 상기 예시적인 이중특이적 항체 내의 2개의 중쇄는 또한 Lys-C 엔도펩티다제 처리가 코일드 코일의 제거만을 야기하고 중쇄 불변 영역 내의 절단은 야기하지 않도록 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하기 위해 힌지 영역 내에 K222A 돌연변이를 함유한다.
예시적인 항체는 힌지 영역 내에 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하는 돌연변이를 함유하지만, Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위의 위치는 사용되는 항체 서열에 따라 상이할 수 있다. 당업자는 코일드 코일 또는 테더 서열의 제거시에 항체 자체의 절단을 방지하기 위해 제거될 필요가 있는, 중쇄 또는 경쇄 서열 내에 임의의 절단 부위 (예를 들어, Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위)가 존재하는지를 결정하기 위해 항체의 서열을 쉽게 스캐닝할 수 있다.
또한, 중쇄에 CH1 도메인이 결여되고 (VH는 힌지-CH2 도메인에 직접 연결됨) 대응하는 경쇄에는 CL 도메인이 결여된 다중특이적 항체가 본원에 기재된 방법을 사용하여 제작될 수 있다. 상기 항체는 상이한 항원에 접촉하거나 또는 B 및 T 세포를 회합시키기 위해 사용될 수 있다.
C. 1 아암형 항체
이종이량체화 코일드 코일 도메인은 또한 1 아암형 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 1 아암형 항체의 예를 보여주는 개략도가 도 4a에 도시되어 있다. 도 4a에 도시된 예시적인 항체는 경쇄 (LC), 및 하나의 전장 중쇄 (HC1)를 포함하고, 제2 중쇄 (HC2)에는 VH 및 CH1 도메인 및 힌지 영역의 일부가 결여된다. HC1 및 HC2 둘 모두는 C-말단에 코일드 코일 이종이량체화 도메인을 포함한다. 상기 예에서 HC1 서열은 Lys-C 절단이 코일드 코일만을 제거하고 중쇄 내의 절단은 야기하지 않도록 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하기 위해 힌지 영역 내에 K222A 돌연변이를 함유한다.
D. 접합된 단백질 복합체
코일드 코일 이종이량체화 도메인은 또한 불변 영역이 세포독성제에 대한 접합에 의해 변형된 단백질 복합체, 예를 들어 항체 (예를 들어, 단일특이적, 이중특이적, 다중특이적, 1 아암형, 또는 묶인 항체)를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 코일드 코일 이종이량체화 도메인은 중쇄 불변 영역 중 하나 (HC1 또는 HC2)가 세포독성제에 대한 접합을 허용하는 변형을 함유하고 다른 중쇄 불변 영역은 그렇지 않은 항체의 제작을 가능하게 한다. 하나의 예에서, HC1은 세포독성제에 접합되지만, HC2는 그렇지 않다. 접합된 항체의 예를 보여주는 개략도가 도 4b에 제시된다. 예시적인 항체는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄 (공통적인 경쇄), 및 코일드 코일을 포함한다. 별로 표시된 바와 같이, 중쇄의 하나는 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 접합된다. 유사하게, 다른 항체 구성체에서, 경쇄 불변 영역의 하나는 세포독성제에 접합될 수 있고, 다른 경쇄 불변 영역은 그렇지 않다 (예를 들어, LC1은 세포독성제에 접합되고, LC2는 그렇지 않다).
한 특정 예에서, 항체의 불변 영역은 세포독성제를 항체에 접합하기 위해 사용되는 링커 시약 상의 또는 세포독성제 자체 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하기 위해 변형될 수 있다. 글리코실화된 항체의 당은 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화되어, 링커 시약 또는 세포독성제의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 (Schiff) 염기기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어 보로히드라이드 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 연결을 형성할 수 있다. 세포독성제 상의 친핵기는 (i) 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; 및 (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실, 및 말레이미드기를 포함하는 항체 영역 및 링커 시약 상의 친전자기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
E. 묶인 단백질 복합체
본 발명은 또한 테더를 사용하여 제작된 단백질 복합체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 불변 경쇄의 C-말단을 가변 중쇄의 N-말단에 연결하는 테더를 가질 수 있다. 테더는 경쇄 및 중쇄의 적절한 회합 (즉, 경쇄와, 경쇄가 묶이는 중쇄와의 회합)을 돕는다. 상기 묶인 항체는 상기 설명한 바와 같은 이종이량체화 도메인을 사용하거나 사용하지 않으면서 제작될 수 있다. 코일드 코일을 함유한 예시적인 묶인 항체의 개략도는 도 5에 제시된다. 도 5에 제시된 예시적인 항체는 2개의 상이한 중쇄 (HC1 및 HC2), 및 2개의 상이한 경쇄 (LC1 및 LC2)를 함유한다. 묶인 항체는 또한 공통적인 경쇄 및/또는 공통적인 중쇄를 함유하도록 제작될 수 있다. 예시적인 항체에서, HC1 및 HC2는 상기한 바와 같이 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하기 위해 힌지 영역에 K222A 돌연변이 및 그의 C-말단에 코일드 코일 이종이량체화 도메인을 함유한다.
묶인 항체에 이종이량체화 도메인을 첨가하는 것은 중쇄/경쇄 복합체가 함께 접촉하도록 하여 상기 복합체의 동종이량체화를 감소시키거나 제거하는 것을 돕는다. 특정 실시양태에서, 테더는 적절한 경쇄/중쇄 회합을 허용하도록 조립된 항체에서 가변 중쇄의 N-말단과 불변 경쇄의 C-말단 사이의 거리에 걸치도록 충분히 길지만 (도 6), 사슬간 회합 (즉, 경쇄가 묶이지 않는 중쇄와 경쇄의 회합)을 방지하도록 충분히 짧다. 도 6에 도시된 예에서, 가변 중쇄의 N-말단과 불변 경쇄의 C-말단 사이의 거리는 약 92Å이다. 펩티드 결합의 거리는 약 4.3Å이다. 상기 예에서, 테더는 가변 중쇄의 N-말단과 불변 경쇄의 C-말단 사이의 거리에 걸치기 위해 약 22개 아미노산의 길이이어야 한다. 불변 경쇄의 C-말단과 가변 중쇄의 N-말단 사이의 거리는 항체 사이에서 상이할 수 있고, 따라서 테더의 길이도 항체 사이에서 상이할 수 있다. 20, 23, 및 26개 아미노산 길이의 테더를 시험하였고, 일반적으로, 15-50개 아미노산의 테더가 효과적이다. 테더는 가요성을 유지하고 2차 구조를 형성하지 않을 수 있고, 이를 위해 글리신 (G) 및 세린 (S) 잔기를 함유하는 테더가 사용될 수 있다. 테더는 G 및 S 잔기로만 이루어질 수 있지만, 테더가 항체의 경쇄 및 중쇄의 조립을 허용하도록 가요성을 유지한다면 다른 잔기도 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 테더는 GGS 반복체를 함유한다 (도 5). 길이가 15-30개 아미노산인 테더에 대해, 한 실시양태에서 테더는 적어도 5개의 GGS 반복체를 함유한다. 본원에 기재된 서열 14의 서열을 갖는 예시적인 테더는 8개의 GGS 반복체를 함유하고, N- 및 C-말단 모두에 추가의 글리신 잔기를 함유한다. 다른 예시적인 테더 서열은 도 7b에 도시되고, 그의 N- 및 C-말단에 푸린 또는 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 함유한다.
F. 테더 및 링커 서열의 절단
일단 단백질 복합체가 조립되면, 테더는 더 이상 필요하지 않을 수 있고, 원하는 경우에 항체로부터 절단될 수 있다. 테더에서 발견되지만 항체 서열에서는 발견되지 않는 절단 부위가 테더를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 이와 유사하게, 코일드 코일도 항체가 조립되면 더 이상 필요하지 않고, 또한 원하는 경우에 항체로부터 절단될 수 있다.
도 7a는 테더 내의 예시적인 절단 부위의 위치 및 코일드 코일을 항체에 연결하는 링커 서열의 위치를 보여준다. 일반적으로, 테더 내의 절단 부위는 테더 서열의 C- 및 N-말단에 또는 이 말단에 근접하여 위치하거나 또는 항체 및 테더가 연결되는 부위에 또는 이 부위에 근접하여 항체 서열 내에 위치한다. 링커에 대한 절단 부위는 일반적으로 링커 서열 (또는 코일드 코일)의 N-말단에 위치하거나 또는 항체 및 링커 (또는 코일드 코일)가 연결되는 부위에 또는 이 부위에 근접하여 항체 서열 내에 위치한다. 링커가 Lys-C 엔도펩티다제를 사용하여 절단될 경우 (예를 들어, 불변 중쇄의 C-말단의 리신 잔기에서), 항체의 서열은 Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하기 위해 변형될 필요가 있을 수 있다. 상기 변형의 예는 힌지 영역 내의 리신의 알라닌으로의 돌연변이 (예를 들어, 본원에 기재된 예시적인 항체에서 K222A, 카바트 넘버링 시스템; K222A, EU 넘버링 시스템)이다.
상이한 절단제가 본 발명에서 사용하기 위해 선택될 때 다른 절단 부위의 변형이 필요하고 이루어질 수 있다.
특정 부위에서 아미노산 서열의 절단은 당업계의 표준이고, 효소에 의한 절단, 화학적 절단, 또는 자가 처리 (auto-processing)을 수반할 수 있다. 예를 들어, 테더 또는 링커는 엔도펩티다제를 사용하여 단백질로부터 절단될 수 있다. 예시적인 엔도펩티다제는 Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, 트롬빈, 게네나제 (섭틸리신 BPN' 프로테아제의 변이체), 인자 Xa, TEV (담배 식각 바이러스 시스테인 프로테아제), 엔테로키나제, HRV C3 (인간 리노바이러스 C3 프로테아제), 키니노게나제, 키모트립신, 트립신, 펩신, 및 파파인을 포함하고 이로 제한되지 않고, 이들은 모두 상업상 이용가능하다 (예를 들어, 뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim), 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific), 또는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)). Lys-C는 리신 잔기의 카르복실 측면에서 절단하고, V8 및 Glu-C는 글루타메이트 잔기의 카르복실 측면에서 절단하고, Arg-C는 아르기닌 잔기의 카르복실 측면에서 절단하고, Asp-N은 아스파르테이트 잔기의 아미노 측면에서 절단하고, 키모트립신은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 및 류신 잔기의 카르복실 측면에서 절단하고, 트립신은 아르기닌 및 리신 잔기의 카르복실 측면에서 절단한다. TEV는 아미노산 서열
Figure pct00010
을 "Gln"과 "Gly" 잔기 사이에서 절단한다. 그러한 효소의 용도는 당업계의 표준이고, 프로토콜은 제조자로부터 이용가능하다.
별법으로 테더 또는 링커는 화학물질, 예를 들어 히드록실아민을 사용하여 단백질로부터 절단될 수 있다. 히드록실아민은 아스파라긴-글리신 펩티드 결합을 절단한다. 히드록실아민이 단백질로부터 테더 및 링커를 절단하기 위해 사용될 경우, 단백질의 단편화를 방지하기 위해 단백질 내의 몇 개의 글리신 또는 아스파라긴 잔기가 돌연변이될 필요가 있을 수 있다.
펩티드 결합을 절단하는 많은 다른 화학물질이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, N-클로로숙신이미드는 트립토판 잔기의 C-말단 측면을 절단한다 (Shechter et al., Biochemistry 15:5071-5075 (1976)). N-브로모숙신이미드 및 브롬화시안은 또한 트립토판 잔기의 C-말단 측면을 절단한다. 또한, 2-니트로티오시아노벤조산 또는 유기포스핀은 단백질을 시스테인 잔기의 N-말단 측면에서 절단하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, EP 0339217 참조).
링커 또는 테더는 또한 이염기성 부위 (예를 들어, 아르기닌-아르기닌, 리신-아르기닌, 또는 리신-리신 부위)에서 절단될 수 있다. 이염기성 부위에서 절단하는 효소는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 N-아르기닌 이염기성 전환효소 (Chow et al., JBC 275: 19545-19551 (2000)) 및 섭틸리신-유사 전구단백질 전환효소, 예를 들어 푸린 (PC1), PC2, 및 PC3 ([Steiner (1991) in Peptide Biosynthesis and Processing (Fricker ed.) pp. 1-16, CRC Press, Boca Raton, FL]; [Muller et al., JBC 275:39213-39222, (2000)])를 포함한다.
단백질은 또한 자가 처리되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 헤지호그 (Hedgehog) 단백질은 단백질 내의 단백질 분해 활성에 의해
Figure pct00011
에서 처리된다. 또한, 자가단백질 분해 절단 부위가 링커 또는 테더 서열에 포함될 수 있다.
G. 다른 단백질 특징
본 발명에 따른 단백질은 인간 또는 쥐 공급원, 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 공급원으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 단백질의 특정 부분의 서열 (예를 들어, 초가변 영역)은 또한 인공 서열, 예를 들어 무작위 서열을 포함하는 라이브러리 (예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝함으로써 확인되는 서열일 수 있다.
상이한 공급원으로부터의 서열을 포함하는 항체의 경우에, 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래하거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편일 수 있다 (미국 특허 4,816,567; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 상기 키메라 항체는 예를 들어 쥐 가변 영역 (또는 그의 일부) 및 인간 불변 영역을 포함할 수 있다.
키메라 항체는 또한 임의로 비-인간 항체에서 유래한 최소 서열을 함유하는 "인간화" 항체일 수 있다. 인간화 항체는 전형적으로 수여체의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역의 잔기로 교체된 인간 항체 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 대응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 대개 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 대개 인간 면역글로불린의 Fc를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]을 참조한다.
보다 상세하게 설명하면, 인간화 항체는 그 내부에 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입 (import)" 잔기로서 종종 언급되고, 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간 종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소를 위해 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서, 설치류와 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체의 인간 프레임워크 (FR)로서 허용된다 ([Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수 개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 ([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]).
항체가 항원에 대한 높은 결합 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 상기 목표를 달성하기 위해서, 예시적인 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석의 과정에 의해 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 그리고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이를 조사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.
III . 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해, 그를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 쉽게 단리되고 서열결정된다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써). 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용할 숙주 세포에 따라 결정된다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 (일반적으로 포유동물, 및 또한 진균 (예를 들어, 효모), 곤충, 식물, 및 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포) 기원의 것이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함한 임의의 이소형의 불변 영역을 상기 목적에 사용할 수 있고, 그러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물종으로부터 얻을 수 있음이 이해될 것이다.
a. 원핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성
i. 벡터 구성
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생산 세포, 예를 들어 하이브리도마 세포로부터 단리하고 서열결정할 수 있다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 얻은 후에, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 원핵생물 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 입수가능하고 당업계에 공지된 많은 벡터를 본 발명의 목적을 위해 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터 내로 삽입되는 핵산의 크기, 및 벡터로 형질전환시킬 특정 숙주 세포에 따라 결정될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종성 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 벡터가 존재하게 되는 특정 숙주 세포와의 상용성에 따라, 다양한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보좀 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종성 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 이들 숙주에 대해 사용한다. 벡터는 복제 부위, 및 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 (marking) 서열을 포함한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 함유하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체 의해 이용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 미국 특허 5,648,237 (Carter et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 이들 숙주에 관하여 형질전환 벡터로서 숙주 미생물과 상용성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용할 수 있는 재조합 벡터를 제조하기 위해, 예를 들어 λGEM.TM.-11을 사용할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 그의 발현을 조정하는 시스트론에 대해 상류 (5')에 위치하는 비번역되는 제어 서열이다. 원핵생물 프로모터는 대개 2개의 클래스, 즉, 유도가능 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도가능 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 그의 제어 하에 시스트론의 증가된 수준의 전사를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 매우 많은 프로모터가 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고, 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하기 위해 천연 프로모터 서열 및 많은 이종성 프로모터를 모두 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하므로, 이종성 프로모터가 이용된다.
원핵생물 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, 베타-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균에서 기능성인 다른 프로모터 (예를 들어, 다른 공지의 세균 또는 파지 프로모터)도 적합하다. 그의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 따라서 숙련된 당업자는 임의의 요구되는 제한 부위를 제공하기 위해 링커 또는 어댑터를 사용하여 이들 서열을 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 라이게이팅할 수 있다 (Siebenlist et al., (1980) Cell 20:269).
본 발명의 한 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 막을 가로지른 발현된 폴리펩티드의 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 성분일 수 있거나, 벡터 내로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종성 폴리펩티드에 천연적인 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵생물 숙주 세포에 대해, 신호 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어지는 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열에 의해 치환된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 발현 시스템의 두 시스트론 모두에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고, 따라서 각각의 시스트론 내에 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 접히고, 조립되어 세포질 내에서 기능적 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB- 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 서브유닛의 적합한 폴딩 및 조립을 허용한다 (Proba and Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)).
본 발명의 항체 발현에 적합한 원핵생물 숙주 세포는 원시세균 (Archaebacteria) 및 진정세균 (Eubacteria), 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 예는 에셔리키아 (Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이), 바실러스 (Bacilli) (예를 들어, 비. 섭틸리스 (B. subtilis)), 장내세균, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 (예를 들어, 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 쉬겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코커스 (Paracoccus)를 포함한다. 한 실시양태에서, 그람 음성 세포가 사용된다. 한 실시양태에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명을 위한 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예는 유전형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 33D3 (미국 특허 5,639,635)를 포함하는 균주 W3110 ([Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 그의 유도체를 포함한다. 다른 균주 및 그의 유도체, 예를 들어 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 비, 이. 콜라이 λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)도 적합하다. 이들 예는 제한의 의미가 아니라 예시를 위한 것이다. 규정된 유전형을 갖는 임의의 상기 언급된 세균의 유도체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 일반적으로 세균 세포 내에서 레플리콘의 복제성을 고려하여 적절한 세균을 선택하는 것이 필요하다. 예를 들어, 공지의 플라스미드, 예를 들어 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410이 레플리콘을 공급하기 위해 사용될 때, 이. 콜라이, 세라티아, 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적절하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비하여야 하고, 추가의 프로테아제 억제제가 세포 배양액에 포함되는 것이 바람직할 수 있다.
ii . 항체 생산
숙주 세포는 상기한 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 목적하는 유전자를 코딩하는 서열을 증폭시키기 위해 적절한 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성 요소에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵생물 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기술을 사용하여 수행한다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 일반적으로 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 세균 세포에 사용된다. 형질전환을 위한 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용되는 원핵 세포는 당업계에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장한다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물을 첨가한 루리아 브로쓰 (Luria broth) 육즙 (LB)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 구조를 기초로 하여 선택된 선택제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위한 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이 또한, 단독으로 또는 복합 질소원과 같은 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵생물 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. 이. 콜라이의 성장을 위해, 예를 들어 바람직한 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 30℃ 범위이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이에 대해, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 더욱 바람직하게는 약 7.0이다.
유도가능 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우에, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에 유도된다. 본 발명의 한 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사를 제어하기 위해 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도용의 포스페이트-제한 배지 내에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이 사용된 벡터 구성체에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 주변세포질 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 단백질 회수는 대개, 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 일단 세포가 분쇄되면, 세포 파편 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어, 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질을 배양 배지 내로 옮기고, 그 안에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과하고 농축하여 생산된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를 추가로 단리하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 (fed-batch) 발효 절차가 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양물, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지원)를 분배하기 위해 교반기 추진기 (impeller)를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 부피 용량으로 대략 100 리터 이하인 발효기에서 발효를 나타내고, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 대개 세포를 적합한 조건 하에 목적하는 밀도, 예를 들어 약 180-220의 OD550으로 성장시킨 후에 개시되고, 이 단계에서 세포는 초기 정지상이다. 당업계에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 구성체에 따라 다양한 유도제를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 대체로 약 12-50시간 동안 유도시키지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비형 항체 폴리펩티드의 적합한 조립 및 폴딩을 개선하기 위해, 섀퍼론 (chaperone) 단백질, 예를 들어 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (섀퍼론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)를 과다발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시에 형질전환시킬 수 있다. 섀퍼론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종성 단백질의 적합한 폴딩 및 가용성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다 ([Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 미국 특허 6,083,715 (Georgiou et al.); 미국 특허 6,027,888 (Georgiou et al.); [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; [Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210]).
발현된 이종성 단백질 (특히, 단백질 분해에 감수성인 단백질)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 공지의 세균 프로테아제, 예를 들어 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합을 코딩하는 유전자 내에서 유전자 돌연변이(들)를 수행하도록 변형될 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하고, 예를 들어 문헌 [Joly et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2773-2777]; 미국 특허 5,264,365 (Georgiou et al.); 미국 특허 5,508,192 (Georgiou et al.); [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)])에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 단백질 분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 섀퍼론 단백질을 과다발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
iii . 항체 정제
당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법을 사용할 수 있다. 다음 절차가 예시적인 적합한 정제 절차이다: 면역친화도 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들어 DEAE 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 세파덱스 (Sephadex) G-75를 사용한 겔 여과.
한 측면에서, 고상에 고정된 단백질 A가 본 발명의 전장 항체 생성물의 면역친화도 정제를 위해 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고친화도로 결합하는 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다 (Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13). 단백질 A가 고정되는 고상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼, 보다 바람직하게는 세공 제어된 유리 칼럼 또는 규산 칼럼이다. 일부 용도에서, 오염물의 비특이적 부착을 방지하기 위해 칼럼을 시약, 예를 들어 글리세롤로 코팅하였다.
정제의 제1 단계로서, 관심있는 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하도록 상기한 세포 배양액으로부터 유래된 제제를 단백질 A 고정된 고상에 적용한다. 이어서, 고체상을 세척하여 고체상에 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 관심있는 항체는 무질서유발제 또는 연성 세제를 함유하는 용액 내로 용리시킴으로써 고상으로부터 회수할 수 있다. 예시적인 무질서유발제 및 연성 세제는 구아니딘-HCl, 우레아, 과염소산리튬, 아르기닌, 히스티딘, SDS (나트륨 도데실 술페이트), 트윈, 트리톤, 및 NP-40을 포함하고 이로 제한되지 않고, 이들은 모두 상업상 이용가능하다. 칼럼 (예를 들어, mAbSure 칼럼)으로부터 용리 후에 항체를 무질서유발제 또는 연성 세제를 함유하는 용액 내로 희석하는 것은 용리 후 항체의 안정성을 유지하고, Lys-C 엔도펩티다제에 의한 코일드 코일의 효율적인 제거를 가능하게 한다.
b. 진핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성
벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
i. 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에서 사용하기 위한 벡터는 또한 신호 서열, 또는 관심있는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 선택되는 이종성 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다. 그러한 전구체 영역에 대한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 판독 프레임 내에 라이게이팅된다.
ii . 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점은 단지 조기 프로모터를 포함하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다
iii . 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택가능 마커로도 불리는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 관련될 경우, 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩한다.
선택 방식의 한 예에서는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선택 요법에서 생존한다. 그러한 우성 선택의 예에서는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 또 다른 예는 항체 핵산을 흡수하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR이 사용될 때 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
별법으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택가능 마커, 예를 들어 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418을 함유하는 배지 내에서 세포 성장에 의해 선택할 수 있다 (미국 특허 4,965,199 참조).
iv . 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 대체로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 폴리펩티드 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 진핵생물에 대해 알려져 있다. 실질적으로 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 첨가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 서열은 모두 진핵생물 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 항체 폴리펩티드 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성이라면, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 및 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 제어된다.
SV40 바이러스의 조기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형이 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
v. 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 또한, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 수 있다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 향상시키기 위한 요소에 대해서는 또한 문헌 [Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 향상이 달성된다면 항체 폴리펩티드 코딩 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
vi . 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터도 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 그러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다 (WO94/11026과 여기에 개시된 발현 벡터 참조).
vii . 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여 본원에 기재된 고등 진핵 세포를 포함한다. 배양액 (조직 배양액)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (293 세포 또는 현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포 [Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1997)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항체 생산을 위한 상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양한다.
viii . 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 (Dulbecco) 개질 이글 (Eagle) 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기 위해 적합하다. 또한, 문헌 ([Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)]), 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 겐타마이신 (GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (대체로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등 에너지원으로 보충할 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물을 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
ix . 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 초여과 (ultrafiltration)에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에, 그러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 초여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의해 좌우된다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 세공 제어된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, Bakerbond ABX™ 수지 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker, 미국 뉴저지주 필립스버그))가 정제를 위해 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 (SEPHAROSE)™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 회수할 항체에 따라 이용가능하다.
한 실시양태에서, 관심있는 항체는 무질서유발제 또는 연성 세제를 함유하는 용액 내로 용리에 의해 칼럼의 고상으로부터 회수된다. 예시적인 무질서유발제 및 연성 세제는 구아니딘-HCl, 우레아, 과염소산리튬, 아르기닌, 히스티딘, SDS (나트륨 도데실 술페이트), 트윈, 트리톤, 및 NP-40을 포함하고 이로 제한되지 않고, 이들은 모두 상업상 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심있는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 pH가 약 2.5-4.5인 용리 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
x. 바큘로바이러스를 사용한 항체 생산
재조합 바큘로바이러스는 리포펙틴 (GIBCO-BRL로부터 상업적으로 이용가능함)을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 플라스미드 및 BaculoGold™ 바이러스 DNA (파밍겐 (Pharmingen))을 곤충 세포, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 세포 (예를 들어, Sf9 세포; ATCC CRL 1711) 또는 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) S2 세포 내로 동시-형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 특정 예에서, 항체 서열은 바큘로바이러스 발현 벡터 내에 함유된 에피토프 태그의 상류에 융합된다. 상기 에피토프 태그는 폴리-His 태그를 포함한다. 상업상 이용가능한 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (노바겐 (Novagen)) 또는 pAcGP67B (파밍겐)으로부터 유래된 플라스미드를 비롯하여 다양한 플라스미드가 사용될 수 있다. 간단히 설명하면, 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 서열은 5' 및 3' 영역에 상보성인 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 5' 프라이머는 측면에 접하는 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 소화시키고, 발현 벡터 내로 서브클로닝시킨다.
발현 벡터로 형질감염시킨 후, 숙주 세포 (예를 들어, Sf9 세포)를 28℃에서 4-5일 동안 인큐베이팅하고, 방출된 바이러스를 회수하고 추가의 증폭을 위해 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 예를 들어 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors; A Laboratory Manual Oxford: Oxford University Press (1994)]에 설명된 바와 같이 수행할 수 있다.
이어서, 발현된 폴리-His 태깅된 항체를, 예를 들어 다음과 같이 Ni2 +-킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 문헌 [Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993)]에 설명된 바와 같이 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 추출물을 제조할 수 있다. 간단히 설명하면, Sf9 세포를 세척하고, 초음파분해 완충제 (25 mL HEPES pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl) 내에 재현탁하고, 얼음 상에서 20초 동안 2회 초음파분해한다. 초음파분해물을 원심분리에 의해 청정화하고, 상등액을 로딩 완충제 (50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8) 내에 50배 희석하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과한다. Ni2+-NTA 아가로스 칼럼 (퀴아겐 (Qiagen)으로부터 상업적으로 이용가능함)을 5 mL의 층 부피로 제조하고, 25 mL의 물로 세척하고, 25 mL의 로딩 완충제로 평형화시킨다. 여과된 세포 추출물 칼럼 상으로 0.5 mL/분으로 로딩한다. 칼럼을 로딩 완충제를 사용하여 기준선 A280으로 세척하고, 이 시점에서 분획 수집을 시작한다. 이어서, 칼럼을 비특이적으로 결합된 단백질을 용리시키는 2차 세척 완충제 (50 mM 포스페이트; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)로 세척한다. A280 기준선에 다시 도달한 후, 칼럼을 2차 세척 완충제 중의 0 내지 500 mM 이미다졸 구배로 발색시킨다. 1 mL 분획을 수집하고, SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리성 포스파타제 (퀴아겐)에 접합된 Ni2 +-NTA를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 용리된 His10-태깅된 항체를 함유하는 분획을 모으고 로딩 완충제에 대해 투석한다.
별법으로, 항체의 정제는 공지의 크로마토그래피 기술, 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다. 관심있는 항체는 무질서유발제 또는 연성 세제를 함유하는 용액 내로 용리에 의해 칼럼의 고상으로부터 회수할 수 있다. 예시적인 무질서유발제 및 연성 세제는 구아니딘-HCl, 우레아, 과염소산리튬, 아르기닌, 히스티딘, SDS (나트륨 도데실 술페이트), 트윈, 트리톤, 및 NP-40을 포함하고 이로 제한되지 않고, 이들은 모두 상업상 이용가능하다.
c. 최적화 정제 기술
코일드 코일 함유 항체에 대해 사용될 수 있는 하나의 특정 정제 방법을 아래에 제시한다.
코일드 코일 함유 항체를 단백질 A (예를 들어, mAbSure) 칼럼에 4℃에서 로딩한다 →
칼럼을 KPO4로, 이어서 PBS + 0.1% 트리톤 X114로 세척한다 →
샘플을 Tris pH 8.0 (200mM) + 아르기닌 (100 mM) 내로 용리시킨다 →
샘플의 pH를 8.0으로 조정하고, 1 hr 동안 37℃에서, 1:500 wt:wt LysC로 절단한다 →
샘플을 1 ml mAbSure 수지/10 mg 단백질을 사용하여 농축하고, Tris/Arg 완충제 내로 용리시킨다 →
샘플을 PBS + 0.3M NaCl + 100 mM Arg 내의 S200 겔 여과 칼럼에 로딩한다 →
분획을 수거하고, 한데 모아 PBS 내로 투석한다.
아르기닌에 추가로, 초기 단백질 A 칼럼 단계 후에 상기 정제 프로토콜에서 사용할 수 있는 다른 무질서유발제 또는 연성 세제는 구아니딘-HCl, 우레아, 과염소산리튬, 히스티딘, SDS (나트륨 도데실 술페이트), 트윈, 트리톤, 및 NP-40을 포함하고 이로 제한되지 않고, 이들은 모두 상업상 이용가능하다. 초기 단백질 A 함유 칼럼 (예를 들어, mAbSure 칼럼)으로부터 용리한 후 항체를 무질서유발제 또는 연성 세제 함유 용액 내에 희석하는 것은 용리 후 항체의 안정성을 유지하고, Lys-C 엔도펩티다제에 의한 코일드 코일의 효율적인 제거를 가능하게 한다.
IV . 접합된 단백질
본 발명은 또한 경쇄 또는 중쇄의 불변 영역의 하나가 화학적 분자, 예를 들어 염료 또는 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 접합체)에 접합된 본원에 기재된 임의의 항체 (예를 들어, 코일드 코일 함유 항체, 묶인 항체, 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 항체)를 포함하는 접합된 단백질, 예를 들어 접합된 항체 또는 면역접합체 (예를 들어, "항체-약물 접합체", 또는 "ADC"로서 언급됨)를 제공한다. 특히, 본원에 기재된 바와 같이, 코일드 코일 도메인을 사용하면 2개의 상이한 중쇄 (HC1 및 HC2) 및 2개의 상이한 경쇄 (LC1 및 LC2)를 함유하는 항체를 제작할 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 제작된 면역접합체는 단지 중쇄 중 하나 (HC1 또는 HC2) 또는 경쇄 중 하나 (LC1 또는 LC2)의 불변 영역에 접합된 세포독성제를 함유할 수 있다. 또한, 면역접합체는 단지 하나의 중쇄 또는 경쇄에만 부착된 세포독성제를 가질 수 있기 때문에, 대상체에게 투여되는 세포독성제의 양은 두 중쇄 또는 경쇄 모두에 부착된 세포독성제를 갖는 항체의 투여에 비해 감소된다. 대상체에게 투여되는 세포독성제의 양의 감소는 세포독성제와 연관된 유해 부작용을 제한한다.
세포독성 또는 세포증식 억제제, 암의 치료에서 종양 세포를 치사시키거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 접합체의 사용 ([Syrigos and Epenetos Anticancer Research 19:605-614 (1999)]; [Niculescu-Duvaz and Springer Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172 (1997)]; 미국 특허 4,975,278)은 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 그 내부의 세포내 축적을 허용하고, 여기서 이들 비접합된 약물 물질의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 ([Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986):603-605 (1986)]; [Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506]). 따라서, 최소 독성을 보이면서 최대 효능을 갖는 접합체가 탐색되고 있다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 모두가 상기 전략에 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland et al. Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87 (1986)). 이들 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., (1986), 상기 문헌]). 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 세균 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 겔다나마이신 ([Mandler et al., Jour, of Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581 (2000)]; [Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028 (2000)]; [Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]), 및 칼리케아미신 ([Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998)]; [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)])을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 메카니즘에 의해 세포독성 및 세포 증식 억제에 영향을 줄 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 불활성이거나 활성이 작은 경향이 있다.
면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 본원에 기재되어 있다 (예를 들어, 상기 참조). 사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232를 참조한다. 방사성 접합된 항체의 생산을 위해 다양한 방사성 핵종이 이용가능하다. 그 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2기능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science. 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합하기 위한 예시적인 킬레이팅제이다. 예를 들어, WO 94/11026을 참조한다.
항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 돌라스타틴, 오로스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 본원에서 고려된다.
i. 메이탄신 및 메이탄시노이드
몇몇 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 본 발명의 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 3,896,111). 뒤이어, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 미국 특허 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는, 이들이 (i) 발효 또는 발효 생성물의 화학적 변형 또는 유도체화에 의해 제조하기 위해 비교적 이용가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법 및 그의 치료 용도가 예를 들어 미국 특허 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있고, 이들의 개시내용은 본원에 분명하게 참고로 포함된다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 접합체는 배양된 결장암세포에 대해 높은 세포독성을 갖는 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 보였다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 쥐 항체 A7에, 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 또 다른 쥐 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체가 기재되어 있다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은 세포당 3 x 105 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물과 유사한 세포독성 정도를 달성하였고, 이는 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신성 세포독성을 보였다.
항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결함으로써 제조된다 (예를 들어, 그 개시 내용이 본원에 분명하게 참고로 포함되는 미국 특허 5,208,020 참조). 항체 분자당 접합된 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 나쁜 영향을 주지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 향상시킬 때 효능을 보였지만, 1분자의 독소/항체도 항체 단독 사용시보다 세포독성을 향상시킬 것으로 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있고, 공지된 기술에 의해 합성하거나 천연 공급원으로부터 단리할 수 있다. 적합한 메이탄시노이드가 예를 들어 미국 특허 5,208,020, 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
예를 들어 그 개시 내용이 본원에 분명하게 참고로 포함되는 미국 특허 5,208,020 또는 유럽 특허 0 425 235 B1; 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 및 미국 특허 출원 공개 2005/0169933에 개시된 것을 포함한, 항체-메이탄시노이드 접합체의 제조를 위한 많은 연결기가 당업계에 공지되어 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 미국 특허 출원 공개 2005/0169933에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 연결기는 상기 확인된 특허에 개시된 바와 같은 디술피드기, 티오에테르기, 산 불안정성 기, 광 불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기, 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하고, 디술피드 및 티오에테르기가 바람직하다. 추가의 연결기를 본원에 기재하고 예시한다.
항체 및 메이탄시노이드의 접합체는 다양한 2기능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 특히 바람직한 커플링제는 디술피드 연결을 제공하기 위한 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.
링커는 연결 종류에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와 반응시킴으로써 형성할 수 있다. 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
ii . 오리스타틴 및 돌라스타틴
일부 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 예를 들어 오리스타틴 (미국 특허 5,635,483; 및 5,780,588)에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 돌라스타틴 및 오리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 [Woyke et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584 (2001)], 항암 (미국 특허 5,663,149) 및 항진균 활성 [Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965 (1998)]을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 오리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N- (아미노) 말단 또는 C- (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 오리스타틴 실시양태는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 2005/0238649 ("Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands")에 개시된, N-말단 연결된 모노메틸오리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.
전형적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 2 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 상기 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 공지된 액체상 합성 방법 ([E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다. 오리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 미국 특허 5,635,483 및 미국 특허 5,780,588; 문헌 [Pettit et al., J. Nat. Prod. 44:482-485 (1981)]; [Pettit et al., Anti-Cancer Drug Design 13:47-66 (1998)]; [Poncet, Curr. Pharm. Des. 5: 139-162 (1999)]; 및 [Pettit, Fortschr. Chem. Org. Naturst. 70: 1-79 (1997)]의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 문헌 [Doronina, Nat. Biotechnol. 21(7):778-784 (2003)]; 및 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 2005/0238649 ["Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"] (예를 들어, 링커 및 링커에 접합된 모노메틸발린 화합물, 예를 들어 MMAE 및 MMAF의 제조 방법을 개시함)를 참조한다.
iii . 칼리케아미신
다른 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA 절단을 만들 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조에 대해서는, 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니 (American Cyanamid Company))을 참조한다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1을 포함하고 이로 제한되지 않는다 ([Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]; 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드의 미국 특허). 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘 모두 세포내 작용 부위를 갖고, 형질막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 항체-매개 내재화를 통한 이들 물질의 세포 내 흡수는 그들의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
iv . 다른 세포독성제
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710에 기재된, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 물질의 패밀리, 및 에스페라미신 (미국 특허 5,877,296)을 포함한다.
사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다 (예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232 참조).
본 발명은 항체와 뉴클레오티드 분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.
종양의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 접합된 항체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체가 검출을 위해 사용되는 경우에 섬광조영 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 Tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 (spin) 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 접합체 내에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 또는 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. Tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지가 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 요오도겐 (IODOGEN) 방법 (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978))을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2기능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2기능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science. 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이팅제이다 (WO94/11026 참조). 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광 불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 ([Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 상업적으로 이용가능한 (예를 들어 피어스 바이오테크놀로지, 인크. (Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록포드)로부터) 다음 가교결합제 시약을 사용하여 제조된 ADC를 명백히 고려하고 이로 제한되지 않는다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) [2003-2004 Applications Handbook and Catalog]의 페이지 467-498 참조).
v. 접합된 항체의 제조
본 발명의 접합된 항체에서, 항체는 임의로 링커를 통해 하나 이상의 모이어티 (예를 들어, 약물 모이어티), 예를 들어 항체당 약 1 내지 약 20개의 모이어티에 접합된다. 접합된 항체는 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여 다음 경로를 포함하는 몇몇 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 항체의 친핵기를 공유 결합을 통해 2가 링커 시약과 반응시킨 후, 관심있는 모이어티와 반응시키는 방법; 및 (2) 모이어티의 친핵기를 공유 결합을 통해 2가 링커 시약과 반응시킨 후, 이를 항체의 친핵기와 반응시키는 방법. 접합된 항체의 제조를 위한 추가의 방법이 본원에서 설명된다.
링커 시약은 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB")를 포함한다. 추가의 링커 성분은 당업계에 공지되어 있고, 일부를 본원에서 설명한다. 또한, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 2005/0238649 ["Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"]를 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분은 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 및 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 이루는 아미노산 잔기는 천연 생성 아미노산 잔기 및 소수 아미노산 및 비-천연 생성 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린을 포함할 수 있다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-연관 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 그들의 선택성 측면에서 설계되고 최적화될 수 있다.
항체 상의 친핵기는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체는 글리코실화된다)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 사슬간 디술피드, 즉 시스테인 다리를 갖는다. 항체는 환원제, 예를 들어 DTT (디티오트레이톨)로 처리함으로써 링커 시약과의 접합을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 다리는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵기를 리신과 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut) 시약)을 반응시켜 아민을 티올로 전환시켜 항체 내로 도입할 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3, 4개 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입할 수 있다.
본 발명의 접합된 항체는 또한 링커 시약 또는 약물 또는 다른 모이어티 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하기 위해 항체의 변형에 의해 생산될 수 있다. 글리코실화된 항체의 당은 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화되어, 링커 시약 또는 약물 또는 다른 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 염기기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어 보로히드라이드 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 연결을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 또는 다른 모이어티 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 단백질 내에 생성될 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또 다른 실시태양에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신에 알데히드를 생성할 수 있다 ([Geoghegan and Stroh, Bioconjugate Chem. 3: 138-146 (1992)]; 미국 특허 5,362,852). 그러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
마찬가지로, 모이어티 (예를 들어 약물 모이어티) 상의 친핵기는 (i) 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; 및 (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실, 및 말레이미드기를 포함하는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
별법으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. DNA 길이는 서로 인접하거나 또는 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되는 접합체의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비표적화에 이용하기 위해 "수용체" (예를 들어 스트렙타비딘)에 접합할 수 있고, 여기서 항체-수용체 접합체를 개체에게 투여하고, 이어서 소실제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거한 후, 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
V. 치료 용도
단백질 복합체, 예를 들어 본원에 기재된 항체 및 항체 단편 (예를 들어, 코일드 코일 함유 항체, 묶인 항체, 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 항체)은 치료 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 및 항체 단편은 전암성, 비-전이성, 전이성, 및 암성 종양 (예를 들어, 조기 암)을 비롯한 종양의 치료, 알레르기성 또는 염증성 질환의 치료, 또는 자가면역 질병의 치료, 또는 암 (예를 들어, 유방암, 결직장암, 폐암, 신세포 암종, 신경아교종, 또는 난소 암), 알레르기성 또는 염증성 질환, 또는 자가면역 질병이 발생할 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있다.
용어 암은 전암성 성장, 양성 종양, 및 악성 종양을 포함하고 이로 제한되지 않는 일군의 증식성 질환을 포함한다. 양성 종양은 발생 부위에 유지되고, 먼 부위로 침윤, 침습 또는 전이되는 능력을 갖지 않는다. 악성 종양은 그 주위의 다른 조직을 침습하여 손상시킬 것이다. 이 종양은 또한 대체로 혈류 또는 림프절이 위치하는 림프계를 통해 그가 발생한 부위로부터 신체의 다른 부분으로 퍼지는 능력 (전이)을 획득할 수 있다. 원발성 종양은 종양이 발생하는 조직의 종류에 의해 분류되고; 전이성 종양은 그로부터 암세포가 유래되는 조직 종류에 의해 분류된다. 시간이 경과함에 따라, 악성 종양의 세포는 보다 비정상적으로 되고, 보다 정상적인 세포가 아닌 것으로 보인다. 이러한 암세포의 외형의 변화는 종양 등급으로 언급되고, 고도 분화, 중등 분화, 저분화, 또는 미분화로 설명된다. 고도 분화 세포는 매우 정상적인 외형을 갖고, 세포가 그로부터 기원되는 정상 세포와 유사하다. 미분화 세포는 더이상 세포의 기원을 결정할 수 없을 정도로 비정상적으로 된 세포이다.
종양은 고형 종양 또는 비-고형 또는 연조직 종양일 수 있다. 연조직 종양의 예는 백혈병 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성숙 B-세포 급성 림프모세포성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 다발림프구성 백혈병, 또는 모발상 세포 백혈병), 또는 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 (Hodgkin) 림프종, 피부 T-세포 림프종, 또는 호지킨병)을 포함한다. 고형 종양은 혈액, 골수, 또는 림프계 이외의 다른 체조직의 임의의 암을 포함한다. 고형 종양은 상피 세포 기원의 종양 및 비-상피 세포 기원의 종양으로 추가로 분류될 수 있다. 상피 세포 고형 종양의 예는 위장관, 결장, 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소, 두경부, 구강, 위, 십이지장, 소장, 대장, 항문, 담낭, 음순, 비인두, 피부, 자궁, 남성 생식 기관, 비뇨기관, 방광, 및 피부의 종양을 포함한다. 비-상피 기관의 고형 종양은 육종, 뇌종양, 및 뼈 종양을 포함한다.
상피 암은 일반적으로 양성 종양으로부터 침습전 단계 (예를 들어, 상피내 암종 (carcinoma in situ))로, 기저막을 통과하여 상피하 간질을 침습하는 악성 암으로 발달한다.
다중특이적 단백질 복합체는 또한 이들 치료 용도에 사용될 수 있고, HER2에 결합하는 항체는 특히 유방암, 결직장암, 폐암, 신세포 암종, 신경아교종, 또는 난소암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 투여할 후보인 다른 대상체는 다음과 같은 질병이 존재하거나 발생할 위험이 있다: 섬유혈관성 조직의 비정상적 증식, 장미 여드름, 후천성 면역결핍 증후군, 동맥폐색증, 아토피성 각막염, 세균성 궤양, 베체트병, 혈액계 종양, 경동맥 폐쇄성 질환, 맥락막 신생혈관형성, 만성 염증, 만성 망막 박리, 만성 포도막염, 만성 유리체염, 콘택트렌즈 과착용증후군, 각막 이식편 거부반응, 각막 신생혈관형성, 각막 이식편 신생혈관형성, 크론병, 일스 (Eales) 병, 유행성 각결막염, 진균성 궤양, 단순 포진 감염, 대상 포진 감염, 고점도 증후군, 카포시 (Kaposi) 육종, 백혈병, 지방 변성증, 라임 (Lyme) 병, 주변 각질융해, 무렌 (Mooren) 궤양, 나병 이외의 항산균 감염, 근시, 안구 신생혈관병, 시신경 소와, 오슬러-웨버 증후군 (오슬러-웨버-렌두), 골관절염, 파제트병, 주변 포도막염, 유사천포창, 소수포증, 다발 동맥염, 레이저 치료후 합병증, 원충 감염증, 탄성섬유가황색종, 건성 익상편 각막염, 방사상 각막절개, 망막 신생혈관형성, 미숙아 망막병증, 수정체뒤 섬유증식, 사르코이드, 공막염, 겸상 적혈구성 빈혈, 쇼그렌 증후군, 고형 종양, 스타가르츠 (Stargart's) 질환, 스티븐 존슨 (Steven's Johnson) 질환, 상윤부 각막염, 매독, 전신성 루푸스, 테리엔 (Terrien) 변연 각막변성, 톡소포자충증, 유잉 (Ewing) 육종의 종양, 신경모세포종의 종양, 골육종의 종양, 망막모세포종의 종양, 횡문근육종의 종양, 궤양성 결장염, 정맥 폐쇄증, 비타민 A 결핍증 및 베게너 (Wegener) 사코이드증, 당뇨와 연관된 바람직하지 않은 혈관신생, 기생충 질환, 비정상적 상처 치유, 수술, 상해 또는 외상 (예를 들어, 급성 폐 손상/ARDS) 이후 비대증, 모발 성장의 억제, 자궁에서 배란 및 황체 형성의 억제, 착상의 억제 및 배아 발달의 억제.
코일드 코일 함유 항체, 묶인 항체, 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 항체를 사용하여 치료될 수 있는 알레르기성 또는 염증성 질환 또는 자가면역 질병 또는 질환의 예는 다음 질병을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 관절염 (류마티스성 관절염, 예를 들어 급성 관절염, 만성 류마티스성 관절염, 통풍 관절염, 급성 통풍 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염, 및 연소성 발병 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형 관절염, 만성 원발성 다발관절염, 반응성 관절염, 및 강직 척추염), 염증성 과다증식성 피부병, 건선, 예를 들어 반상 건선, 물방울 모양 건선, 농포성 건선, 및 손톱 건선, 피부염, 예를 들어 접촉 피부염, 만성 접촉 피부염, 알레르기 피부염, 알레르기 접촉 피부염, 포진피부염, 및 아토피 피부염, x-연결 과다 IgM 증후군, 두드러기, 예를 들어 만성 알레르기 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들어 만성 자가면역 두드러기, 다발근육염/피부근염, 연소성 피부근염, 독성 표피괴사, 공피증 (전신성 공피증 포함), 경화증, 예를 들어 전신성 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예를 들어 척수-눈 MS, 원발성 진행성 MS (PPMS), 및 재발 완화형 MS (RRMS), 진행성 전신성 경화증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 범발성 경화증, 및 실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론병, 자가면역-매개 위장관 질병, 결장염, 예를 들어 궤양성 결장염, 궤양 결장염, 현미경적 결장염, 교원질성 결장염, 용종 결장염, 괴사 소장결장염, 및 경벽성 결장염, 및 자가면역 염증성 장 질환), 괴저농피증, 결절홍반, 원발성 경화 쓸개관염, 상공막염), 호흡 곤란 증후군, 예를 들어 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액학적 질환, 류마티스 척추염, 급성 난청, IgE-매개 질환, 예를 들어 과민증 및 알레르기 및 아토피 비염, 뇌염, 예를 들어 랏무센 뇌염 및 변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예를 들어 앞포도막염, 급성 앞포도막염, 육아종성 포도막염, 비육아종성 포도막염, 수정체항원성 포도막염, 뒤포도막염, 또는 자가면역 포도막염, 신 증후군이 있거나 없는 사구체신염 (GN), 예를 들어 만성 또는 급성 사구체신염, 예를 들어 원발성 GN, 면역 매개 GN, 막 GN (막 신병증), 특발성 막 GN 또는 특발성 막 신병증, 막성- 또는 막 증식성 GN (MPGN), 예를 들어 타입 I 및 타입 II, 및 급속 진행성 GN, 알레르기 질환, 알레르기 반응, 습진, 예를 들어 알레르기 또는 아토피 습진, 천식, 예를 들어 기관지성 천식, 기관지 천식, 및 자가면역 천식, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 병태 및 만성 염증 반응, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 전신성 홍반 루푸스, 예를 들어 피부 SLE, 아급성 피부 홍반 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 파종상 홍반성 루푸스, 루푸스 (예를 들어 신장염, 뇌염, 소아, 비-신장, 신장외, 원반상 탈모증), 연소성 발병 (타입 I) 당뇨병, 예를 들어 소아 인슐린-의존형 당뇨병 (IDDM), 성인 발병 당뇨병 (타입 II 당뇨병), 자가면역 당뇨병, 특발성 요붕증, 시토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 사코이드증, 육아종증, 예를 들어 림프종모양 육아종증, 베게너 육아종증, 무과립구증, 혈관염, 예를 들어 맥관염 (예를 들어 대혈관 맥관염 (예를 들어 류마티스성 다발성 근육통 및 거대세포 (다까야스) 동맥염), 중형 혈관 맥관염 (예를 들어 가와사키병 및 다발성 결절 동맥염), 현미경적 다발 동맥염, CNS 맥관염, 괴사, 피부, 또는 과민성 맥관염, 전신성 괴사 맥관염, 및 ANCA-관련 맥관염, 예를 들어 처크-스트라우스 맥관염 또는 증후군 (CSS)), 일시적 동맥염, 재생불량 빈혈, 자가면역 재생불량 빈혈, 쿰즈 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 용혈 빈혈 또는 면역 용혈 빈혈, 예를 들어 자가면역 용혈 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈, 애디슨병, 진정 적혈구계 빈혈 또는 무형성 (PRCA), 팩터 VIII 결핍증, A형 혈우병, 자가면역 호중구 감소증, 범혈구감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 혈구 누출을 수분하는 질병, CNS 염증성 질환, 다발성 장기 손상 증후군, 예를 들어 패혈증, 외상 또는 출혈에 2차적인 질환, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기 신경염, 베체트병, 캐슬만 증후군, 굿패스쳐 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 천포창, 예를 들어 낙엽상 천포창 및 피부 유천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 점막 유천포창 및 홍반 천포창 포함), 자가면역 다발성 내분비 장애, 라이터 병 또는 증후군, 면역 복합체 신장염, 항체-매개 신장염, 시신경 척수염, 다발성 신경병증, 만성 신경병증, 예를 들어 IgM 다발 신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 저혈소판증 (예를 들어 심근경색 환자에 의해 발생), 예를 들어 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP) 및 자가면역 또는 면역-매개 저혈소판증, 예를 들어 특발성 혈소판 감소성 자반병 (ITP), 예를 들어 만성 또는 급성 ITP, 정소 및 난소의 자가면역 질병, 예를 들어 자가면역 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선 기능 저하증, 부갑상선 기능 저하증, 자가면역 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염, 예를 들어 자가면역 갑상선염, 하시모또병, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선 기능 저하증, 그레이브 (Grave) 병, 다분비선 증후군, 예를 들어 자가면역 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 부신생물 증후군, 예를 들어 신경학적 부신생물 증후군, 예를 들어 램버트-이튼 근무력증 증후군 또는 이튼-램버트 증후군, 근강직 증후군, 뇌척수염, 예를 들어 알레르기 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근육 무력증, 예를 들어 흉선종 연관 중증 근육 무력증, 소뇌변성, 신경근강직증, 안진전 또는 안진전 근경련 증후군 (OMS), 및 감각 신경병증, 다초점성 운동 신경병증, 쉬한 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 거대세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 림프양 간질 폐렴, 폐쇄세기관지염 (비-이식) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군, 버거 병 (IgA 신병증), 특발성 IgA 신병증, 선상 IgA 피부병, 원발성 담관 경화증, 폐경화, 자가면역 장병증 증후군, 만성 소화장애증, 복강 질환, 비열대스프루 (글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축 측삭 경화증 (ALS; 루게릭병), 관상동맥 질환, 자가면역 귀 질병, 예를 들어 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 청력 상실, 안진전 근경련 증후군 (OMS), 다발연골염, 예를 들어 불응성 또는 재발된 다발연골염, 폐포단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 유의성 비결정 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS))을 포함하는 원발성 림프구증가증, 말초 신경병증, 부신생물 증후군, 채널병증, 예를 들어 간질, 편두통, 부정맥, 근육 질환, 난청, 실명, 주기적 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근염, 국소 분절 사구체 경화증 (FSGS), 내분비 눈병증, 포도망막염, 맥락망막염, 자가면역 간질환, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전, 슈미트 증후군, 부신염, 위 위축, 초로 치매, 탈수초성 질환, 예를 들어 자가면역 탈수초성 질환, 당뇨성 신병증, 드레슬러 증후군, 원형탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노드 현상, 식도 운동이상, 손발가락경화증, 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 혼합결합조직병, 샤가스 병, 류마티스열, 습관성 유산, 농부폐, 다형 홍반, 심장절개술후 증후군, 쿠싱 증후군, 새 사육가 폐, 알레르기 육아종 혈관염, 양성 림프구 혈관염, 알포트 증후군, 폐포염, 예를 들어 알레르기 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증, 파동편모충증, 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘터 증후군, 카플란 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막 심근섬유증, 미만성 간질성 폐섬유증, 간질 폐 섬유증, 특발성 폐섬유증, 낭성 섬유증, 안구내염, 장기 융기성 홍반, 태아적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 사상충증, 섬모체염, 예를 들어 만성 섬모체염, 이시성 섬모체염, 홍채섬모체염, 또는 푸크 섬모체염, 헤노호-쉔라인 자색반, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알쯔하이머병, 파보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신처리후 증후군, 선천 풍진 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 볼거리, 에반 증후군, 자가면역 생식선 부전, 시덴함 무도병, 연쇄상구균 감염후 신장염, 폐쇄성 혈전혈관염, 갑상선 기능 항진증, 척수매독, 맥락막염, 거대세포 다발근육통증, 내분비 눈병증, 만성 과민성 폐렴, 건조 각막결막염, 유행성 각막결막염, 특발성 신장염 증후군, 미소 병변 신병증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 규폐증, 아프타, 아프타 구내염, 동맥경화성 질환, 아스퍼미오게네스, 자가면역 용혈, 뵈크 병, 한랭글로불린혈증, 뒤피트렌 구축, 수정체 과민 안내염, 알레르기성 장염, 나병결절홍반, 특발성 안면마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열, 함만-리치 병, 감각신경성 난청, 발작성 혈색소뇨증, 성선 기능저하증, 국한성 회장염, 백혈구 감소증, 전염 단핵구증, 횡단척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신장증, 교감성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발 신경근염, 괴저농피증, 쿼베인 갑상선염, 후천성 비장 위축, 항정자 항체에 의한 불임, 비-악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡스타인-바 바이러스-연관 질환, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 기생충 질환, 예를 들어 리슈만편모충, 독성 쇼크 증후군, 식중독, T 세포 침윤, 백혈구-부착 결핍, 시토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련된 면역 반응을 수반하는 병태, 백혈구 혈구 누출을 수반하는 질병, 다발성 장기 손상 증후군, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항사구체 기저막 질환, 알레르기 신경염, 자가면역 다발성 내분비 장애, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역 위축 위염, 교감성 안염, 류마티스병, 혼합결합조직 질병, 신 증후군, 췌도염, 다발성 내분비 부전, 말초 신경병증, 자가면역 다분비선 증후군 타입 I, 성인 발병 특발성 부갑상선 기능 저하증 (AOIH), 전체탈모증, 확장 심근병증, 후천적 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소침착증, 심근염, 신 증후군, 원발성 경화쓸개관염, 화농성 또는 비화농성 부비강염, 급성 또는 만성 부비강염, 사골, 전두, 상악, 또는 접형 부비강염, 호산구-관련 질환, 예를 들어 호산구 증가증, 폐 침윤 호산구 증가증, 호산구 증가증-근육통 증후군, 로플러 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구 증가증, 기관지폐렴성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구를 포함하는 육아종, 과민증, 음성혈청 척추관절염, 다발성 내분비 자가면역 질병, 경화쓸개관염, 공막, 상공막, 만성 점막 피부 칸디다증, 브루톤 증후군, 유아의 일과성 감마글로불린저혈증, 위스코트-올드리히 증후군, 운동실조 모세혈관확장증, 교원병과 연관된 자가면역 질환, 류마티스, 신경학적 질환, 허혈 재관류 질환, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능이상, 혈관확장증, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 뇌 허혈 및 혈관신생을 수반하는 질환, 알레르기 과민성 질환, 사구체신염, 재관류 손상, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성 염증성 성분을 갖는 피부병, 급성 화농성 수막염 또는 다른 중추신경계 염증성 질환, 눈 및 안와 염증성 질환, 과립구 수혈-연관 증후군, 시토킨 유발 독성, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경화, 당뇨성 망막병증, 당뇨성 대동맥 질환, 말단동맥 과다증식, 소화 궤양, 판막염 및 자궁내막증.
치료 용도에 추가로, 본 발명의 항체는 진단 방법, 예를 들어 본원에 기재된 질병 및 병태의 진단 방법을 포함하는 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.
VI . 투여량, 제형 및 기간
본 발명의 단백질은 우수한 의료 실무에 일치하는 방식으로 제형화되고, 투여 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려되는 인자는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 대상체의 임상 병태, 질환의 원인, 물질의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 임상의에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 투여되는 단백질의 "치료 유효량"은 상기 고려사항에 의해 결정될 것이고, 특정 질환 (예를 들어, 암, 알레르기성 또는 염증성 질환, 또는 자가면역 질환)의 예방, 개선 또는 치료를 위해 필요한 최소량이다. 단백질은 그럴 필요는 없지만, 질환의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 물질과 임의로 제형화된다. 상기 다른 물질의 유효량은 제형에 존재하는 단백질의 양, 질환 또는 치료의 종류, 및 상기 논의된 다른 요인에 따라 결정된다. 이들은 일반적으로 상기 사용된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나, 이전에 사용된 투여량의 약 1 내지 99%의 양으로 사용된다. 일반적으로, 암의 완화 또는 치료는 암과 연관된 하나 이상의 증상 또는 의학적 문제의 경감을 수반한다. 약물의 치료 유효량은 다음 중의 하나 또는 조합을 달성할 수 있다: 암세포의 수를 (적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상) 감소시키고/시키거나; 종양 크기 또는 종양 부하를 감소 또는 억제하고/하거나; 말초 장기로의 암세포 침윤을 억제 (즉, 어느 정도의 감소 및/또는 정지)하고/하거나; 선종의 경우 호르몬 분비를 감소시키고/시키거나; 혈관 밀도를 감소시키고/시키거나; 종양 전이를 억제시키고/시키거나; 종양 성장을 감소시키고/시키거나; 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킨다. 몇몇 실시양태에서, 단백질은 대상체에서 암 또는 자가면역 질환의 발생 또는 재발을 예방하기 위해 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 암 또는 자가면역 질환에 감수성이거나 이 질환으로 진단된 인간 대상체의 생존 기간을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 생존 기간은 약물의 최초 투여시부터 사망시까지의 시간으로 규정된다. 생존 기간은 또한 치료 동안 대상체의 치료 위험을 나타내는 치료군 대 대조군의 층화 (stratified) 위험비 (HR)에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 치료는 다양한 항암 요법으로 치료되는, 암에 감수성이거나 암으로 진단된 인간 대상체의 군에서 반응률을 유의하게 증가시킨다. 반응률은 치료에 반응한 치료된 대상체의 백분율로서 규정된다. 한 측면에서, 본 발명의 단백질 및 수술, 방사선 조사 요법, 또는 하나 이상의 화학요법제를 사용한 본 발명의 조합 치료는 수술, 방사선 조사 요법, 또는 화학요법 단독으로 치료된 군에 비해 상기 조합 치료군에서 반응률을 유의하게 증가시키고, 증가는 0.005 미만의 카이-제곱 (Chi-square) p-값을 갖는다. 암 치료에서 치료 효능에 대한 추가의 척도는 미국 특허 출원 공개 20050186208에 기재되어 있다.
치료 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분을 선택적인 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). 허용되는 담체는 염수 또는 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 PEG를 포함한다.
임의로, 그러나 바람직하게는, 제형은 제약상 허용되는 염, 바람직하게는 염화나트륨을, 바람직하게는 대략 생리학적 농도로 함유한다. 임의로, 본 발명의 제형은 제약상 허용되는 보존제를 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 보존제 농도는 0.1 내지 2.0% (전형적으로 v/v)이다. 적합한 보존제는 제약업계에 공지된 것을 포함한다. 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 및 프로필파라벤이 바람직한 보존제이다. 임의로, 본 발명의 제형은 제약상 허용되는 계면활성제를 0.005 내지 0.02%의 농도로 포함할 수 있다.
본원에서 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 1 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 상기 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 봉입된 항체가 장기간 동안 체내에 남아있을 때, 이들은 37℃에서 습기에 노출된 결과로서 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 가능하게는 면역원성의 변화가 일어날 수 있다. 관련된 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성할 수 있다.
본원에 기재된 단백질 (예를 들어, 코일드 코일 함유 항체, 묶인 항체, 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 항체)은 공지된 방법에 따라, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들어 볼러스 (bolus)로서 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 경막내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 인간 대상체에게 투여된다. 심한 부작용 또는 독성이 단백질에 의해 인식되는 표적 분자에 대한 길항작용과 연관될 경우 국소 투여가 특히 바람직할 수 있다. 생체외 전략이 또한 치료 용도로 사용될 수 있다. 생체외 전략은 대상체로부터 얻은 세포를 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키거나 형질도입시키는 것을 수반한다. 이어서, 형질감염된 또는 형질유도된 세포를 대상체에게 다시 이식한다. 세포는 조혈 세포 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, T 세포, 또는 B 세포), 섬유모세포, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 또는 근육 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는 광범위한 임의의 종류의 세포일 수 있다.
하나의 예에서 단백질 복합체 (예를 들어, 코일드 코일 함유 항체, 묶인 항체, 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 항체)는 예를 들어 질환 또는 종양의 위치가 허용할 때 직접적인 주사에 의해 국소 투여되고, 주사는 주기적으로 반복될 수 있다. 또한, 단백질 복합체는 국소 재발 또는 전이를 예방하거나 감소시키기 위해, 대상체에게 전신 전달되거나 또는 종양 세포에, 예를 들어 종양 또는 종양의 수술에 의해 절제 후에 종양층에 직접 전달될 수 있다.
VII . 제품
본 발명의 또 다른 실시양태는 본원에 기재된 하나 이상의 단백질 복합체, 및 질환 (예를 들어, 자가면역 질병 또는 암)의 치료 또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이다. 제품은 용기, 및 용기 위에 있거나 용기에 부속된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 병태의 치료에 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체 또는 항체 단편이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 특정 병태의 치료를 위해 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 대상체에게 항체 조성물을 투여하기 위한 사용설명서를 추가로 포함할 것이다. 본원에 기재된 조합 요법제를 포함하는 제품 및 키트도 고려된다.
포장 삽입물은 적응증, 사용, 투여량, 투여에 대한 정보, 금기사항 및/또는 치료 제품 사용에 대한 경고를 포함하는, 치료 제품의 상업적 포장에 통상적으로 포함되는 사용설명서를 지칭한다. 특정 실시양태에서 포장 삽입물은 조성물이 유방암, 결직장암, 폐암, 신세포 암종, 신경아교종, 또는 난소 암의 치료를 위해 사용됨을 나타낸다.
추가로, 제품은 제약상 허용되는 완충제, 예를 들어 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트 완충 염수, 링거 (Ringer)액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
다양한 목적, 예를 들어 세포로부터 항원 (예를 들어, HER2 또는 EGFR)의 정제 또는 면역침전을 위해 유용한 키트도 제공된다. 항원 (예를 들어, HER2 또는 EGFR)의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 항체 (예를 들어, EGFR/HER2 항체)를 포함할 수 있다. 시험관 내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 항원의 검출 및 정량을 위한 항체를 포함하는 키트를 제공할 수 있다. 제품에서와 같이, 키트는 용기, 및 용기 위에 있거나 용기에 부속된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명의 적어도 하나의 다중특이적 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들어, 희석제 및 완충제, 대조 항체를 함유하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물에 대한 설명 및 의도하는 시험관 내 또는 진단 용도에 대한 사용설명서를 제공할 수 있다.
상기 설명은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기 위해 충분한 것으로 간주된다. 하기 실시예는 단지 예시의 목적을 위해 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하고자 의도되지 않는다. 실제로, 본원에 제시되고 설명된 것에 추가로 본 발명의 각종 변형은 상기한 설명으로부터 당업자에게 자명해질 것이고, 첨부되는 청구의 범위 내에 포함된다.
VII . 표적 분자
본 발명의 복합체에 의해 표적화될 수 있는 분자의 예는 가용성 혈청 단백질 및 그들의 수용체 및 다른 막 결합 단백질 (예를 들어, 어드헤신)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 그 초과의 시토킨, 시토킨-관련 단백질, 및 시토킨 수용체에 결합할 수 있다: BMP1, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNG, IFNW1, FEL1, FEL1 (EPSELON), FEL1 (ZETA), IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (OX40 리간드), TFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1BB 리간드), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, LL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (렙틴), PTN, 및 THPO.
또 다른 실시양태에서, 표적 분자는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 케모킨, 케모킨 수용체, 또는 케모킨-관련 단백질이다: CCL1 (I-309), CCL2 (MCP-1 / MCAF), CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIP-Ib), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCLH (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC / 엑소더스 (exodus)-2), CCL22 (MDC / STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCL1 (GRO1), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL1O (IP 10), CXCL11 (I-TAC), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYD1), SCYE1, XCL1 (림포탁틴), XCL2 (SCM-Ib), BLR1 (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61), CCR1 (CKR1 / HM145), CCR2 (mcp-1RB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBI1), CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5 / CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR1O), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / 본조 (Bonzo)), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IR8Rb), LTB4R (GPR16), TCP1O, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HDF1A, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다: ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; AD0RA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; ATF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; AZGP1 (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLR1 (MDR15); BMP1; BMP2; BMP3B (GDF1O); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B; BMPR2; BPAG1 (플렉틴); BRCA1; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6 / JAB61); CCL1 (1-309); CCLI1 (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-Id); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MTP-2); SLC; 엑소더스-2; CCL22 (MDC / STC-I); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신-3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Ia); CCL4 (MDP-Ib); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKR1 / HM145); CCR2 (mcp-1RB / RA); CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBI1); CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21Wapl/Cipl); CDKN1B (p27Kip1); CDKN1C; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (클라우딘-7); CLN3; CLU (클러스테린); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSF1 (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNB1 (b-카테닌); CTSB (카텝신 B); CX3CL1 (SCYD1); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCLI1 (I-TAC / IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GR02); CXCL3 (GR03); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / 본조); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; EN02; EN03; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1 (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF 17; FGF 18; FGF 19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FEL1 (EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRT1 (피브로넥틴); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRH1; GPR2 (CCR10); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCC10 (C10); GRP; GSN (겔솔린); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HDP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; DFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, IL1RN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b4 인테그린); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KHTHB6 (털-특이적 타입 H 케라틴); LAMAS; LEP (렙틴); 링고-p75; 링고-트로이; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIB1; 미드킨; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴-III); MTSS1; MUC1 (뮤신); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-링고; NgR-Nogo66 (노고); NgR-p75; NgR-트로이; NME1 (NM23A); N0X5; NPPB; NROB1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PPBP (CXCL7); PPED; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21Rac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNFI10 (ZNF144); ROB02; S100A2; SCGB1D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (마마글로빈2); SCGB2A2 (마마글로빈 1); SCYE1 (내피 단핵구-활성화 시토킨); SDF2; SERPINA1; SERPENA3; SERP1NB5 (마스핀); SERPINE1 (PAI-I); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPP1; SPRR1B (Spr1); ST6GAL1; STAB1; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCP10; TDGF1; TEK; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1 (트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; 조직 인자; TLR10; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFI1A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSF8 (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1BB 리간드); TOLLIP; 톨 (Toll)-유사 수용체; TOP2A (토포이소머라제 Ea); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1 (림포탁틴); XCL2 (SCM-Ib); XCR1(GPR5 / CCXCR1); YY1; 및 ZFPM2.
본 발명에 의해 포함되는 항체의 바람직한 표적 분자는 다음을 포함한다: CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD34; CD64, ErbB 수용체 패밀리의 CD200 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 알파v/베타3 인테그린, 예를 들어 그의 알파 또는 베타 서브유닛 (예를 들어 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예를 들어 VEGF-A, VEGF-C; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (알파IFN); TNF알파, 인터루킨, 예를 들어 IL-1베타, IL-3, IL-4, IL-5, IL-8, IL-9, IL-13, IL17A/F, IL-18, IL-13R알파1, IL13R알파2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mp1 수용체; CTLA-4; RANKL, RANK, RSV F 단백질, 단백질 C 등.
한 실시양태에서, 본 발명의 이종다량체성 복합체는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 표적 분자에 결합한다: IL-1알파 및 IL-1베타, IL-12 및 IL-18; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1베타; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF-β; IL-13 및 LHR 효현제; IL-12 및 TWEAK, IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAM8, IL-13 및 PED2, IL17A 및 IL17F, CD3 및 CD19, CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD38 및 CD138; CD38 및 CD20; CD38 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-8 및 IL-6; CD20 및 BR3, TNF알파 및 TGF-베타, TNF알파 및 IL-1베타; TNF알파 및 IL-2, TNF 알파 및 IL-3, TNF알파 및 IL-4, TNF알파 및 IL-5, TNF알파 및 IL6, TNF알파 및 IL8, TNF알파 및 IL-9, TNF알파 및 IL-10, TNF알파 및 IL-11, TNF알파 및 IL-12, TNF알파 및 IL-13, TNF알파 및 IL-14, TNF알파 및 IL-15, TNF알파 및 IL-16, TNF알파 및 IL-17, TNF알파 및 IL-18, TNF알파 및 IL-19, TNF알파 및 IL-20, TNF알파 및 IL-23, TNF알파 및 IFN알파, TNF알파 및 CD4, TNF알파 및 VEGF, TNF알파 및 MIF, TNF알파 및 ICAM-1, TNF알파 및 PGE4, TNF알파 및 PEG2, TNF알파 및 RANK 리간드, TNF알파 및 Te38; TNF알파 및 BAFF; TNF알파 및 CD22; TNF알파 및 CTLA-4; TNF알파 및 GP130; TNFa 및 IL-12p40; VEGF 및 HER2, VEGF-A 및 HER2, VEGF-A 및 PDGF, HER1 및 HER2, VEGF-A 및 VEGF-C, VEGF-C 및 VEGF-D, HER2 및 DR5, VEGF 및 IL-8, VEGF 및 MET, VEGFR 및 MET 수용체, VEGFR 및 EGFR, HER2 및 CD64, HER2 및 CD3, HER2 및 CD16, HER2 및 HER3; EGFR (HER1) 및 HER2, EGFR 및 HER3, EGFR 및 HER4, IL-13 및 CD40L, IL4 및 CD40L, TNFR1 및 IL-1R, TNFR1 및 IL-6R 및 TNFR1 및 IL-18R, EpCAM 및 CD3, MAPG 및 CD28, EGFR 및 CD64, CSPG 및 RGM A; CTLA-4 및 BTN02; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; PDL-I 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B.
다른 분자에 임의로 접합된 가용형 항원 또는 그의 단편이 항체를 생성하기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다. 막횡단 (transmembrane) 분자, 예를 들어 수용체의 경우, 그의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로서 사용될 수 있다. 별법으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다. 그러한 세포는 천연 공급원 (예를 들어, 암세포주)로부터 유래할 수 있거나 또는 막횡단 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태는 당업자에게 자명할 것이다.
본원 명세서에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 특허 출원 공개, 및 다른 간행물은 각각의 독립적인 특허, 특허 출원, 특허 출원 공개 또는 간행물이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함된다고 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 상기 특허 출원은 본원에서 우선권을 주장하고, 각각 2009년 9월 16일 및 2009년 12월 4일 출원된 미국 특허 가출원 61/243,105 및 61/266,992를 포함한다.
실시예 1. 코일드 코일 함유 항체의 발현을 위한 벡터의 제작
본원에 기재된 코일드 코일 이종이량체화 도메인은 임의의 항체의 불변 사슬 (예를 들어, HC의 C-말단)에 연결될 수 있다. 코일드 코일 함유 항체를 제작하기 위해 사용될 수 있는 많은 항체 서열은 당업계에 공지되어 있고, DNA 서열의 조작에 필요한 기술도 당업계에 공지되어 있다. 코일드 코일 함유 항체를 제작하기 위한 예시적인 방법을 아래에서 설명한다.
코일드 코일 함유 항체의 생성을 위한 HC 백본은 다음과 같이 제작하였다. 5' AscI 및 3' XbaI 오버행 (overhang)이 있는
Figure pct00012
코일드 코일 도메인 서열을 코딩하기 위해 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계하고 합성하였다. 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 인산화시키고, 소화되고 탈인산화된 pRK 플라스미드 (제넨테크 인크. (Genentech Inc.); [Eaton et al., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)])에 라이게이팅하였다. hIgG1의 CH1 내지 CH3 도메인은 5' 다중 클로닝 부위 (MCS) (ClaI-BamHI-KpnI-ApaI) 및 3' AscI 부위를 포함하도록 PCR (중합효소 연쇄 반응)을 사용하여 제조하고, 미리 제조한 pRK-ACID.p1 또는 pRK-BASE.p1 벡터 내로 클로닝하였다. 마지막으로, 위치 H222 (카바트 넘버링 방식)의 리신 잔기를, Lys-C 절단 동안 Fab 방출을 억제하기 위해 스트라타젠 (Stratagene)의 퀵체인지 (Quikchange) II XL 부위 지정 돌연변이 유발 키트를 사용하여 알라닌 잔기로 돌연변이시켰다.
코일드 코일 도메인을 함유하는 항체를 다음과 같이 제작하였다. 공통적인 LC 및 1 아암형 항체의 경우, 목적하는 항체의 VH 도메인을 5' ClaI 및 3' ApaI 제한 부위를 포함하도록 PCR을 사용하여 제조하였다. PCR 단편을 소화하고, 유사하게 제조된 백본 벡터 내로 클로닝하였다. 이들 항체에 대해 이미 이용가능한 LC 구성체에 대해 어떠한 변경도 이루어지지 않아야 하였다.
묶인 항체에 대해, 목적하는 항체의 VH 도메인 (신호 서열 미함유)을 먼저 PCR을 사용하여 제조하였고, 여기서 5' 프라이머는 GGS 테더의 3' 절반을 함유하고 5' BamHI 부위에서 끝나고, 3' 프라이머는 3' ApaI 부위에서 끝났다. 단편을 소화시키고, 유사하게 제조된 백본 벡터 내로 클로닝하였다. 이어서, 목적하는 항체의 동족 LC를 PCR을 사용하여 제조하였고, 여기서 5' 프라이머는 5' ClaI 부위에서 끝나고, 3' 프라이머는 GGS 테더의 5' 부분을 함유하고 3' BamHI에서 끝났다. LC 단편은 단편을 ClaI 및 BamHI을 사용하여 VH의 앞에 클로닝함으로써 그의 동족 HC (이제 백본 벡터 내의)에 연결하였다. LC를 VH에 연결하는 완전한 테더 서열은
Figure pct00013
였다. 표준 형질감염 기술을 사용하여 벡터로 포유동물 세포 (CHO 또는 293 세포)를 형질감염시켰다.
FcεR1 및 FcγR2b 모두에 특이적으로 결합하고 공통적인 LC를 갖는 이중특이적 항체를 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다. 상기 항체는 BASE.p1 코일드 코일 도메인 서열 및 K222A 돌연변이를 갖는 항-인간 FcγR2b HC 서열을 함유하는 "BASE.p1" 서열 (서열 1), ACID.p1 코일드 코일 도메인 서열 및 K222A 돌연변이를 갖는 항-인간 FcεR1 HC 서열을 함유하는 "ACID.p1" 서열 (서열 2), 및 공통적인 LC 서열 (서열 3)을 갖는다 (도 8).
HER2 또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 1 아암형 항체도 제조하였다. HER2에 특이적으로 결합하는 항체는 ACID.p1 코일드 코일 도메인 서열 및 K222A 돌연변이를 갖는 항-HER2 항체 1 HC 서열 (서열 4), BASE.p1 코일드 코일 도메인 서열을 갖는, VH 및 CH1 도메인이 결여된 HC 영역 (서열 5), 및 항-b-HER2 항체 1 LC 서열 (서열 6)을 함유한다. EGFR에 특이적으로 결합하는 항체는 ACID.p1 코일드 코일 도메인 서열 및 K222A 돌연변이를 갖는 항-EGFR HC 서열 (서열 7), BASE.p1 코일드 코일 도메인 서열을 갖는, VH 및 CH1 도메인이 결여된 HC 영역 (서열 5), 및 항-EGFR (D1.5) LC 서열 (서열 8)을 함유한다 (도 9a 및 9b).
HER2 및 EGFR/HER1에 특이적으로 결합하는 묶인 항체를 또한 제조하였다 (도 10 및 11). HER2 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 하나의 항체는 (1) 26개 아미노산 GGS 테더, ACID.p1 코일드 코일 도메인 서열, 및 K222A 돌연변이에 의해 항-HER2 항체 1 HC 서열에 묶인 항-HER2 항체 1 LC 서열 (서열 9) 및 (2) 26개 아미노산 GGS 테더, BASE.p1 코일드 코일 도메인 서열, 및 K222A 돌연변이에 의해 항-EGFR 항체 HC 서열에 묶인 항-EGFR 항체 LC 서열 (서열 10)을 함유한다 (도 10). HER2 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 제2 항체는 (1) 26개 아미노산 GGS 테더, ACID.p1 코일드 코일 도메인 서열, 및 K222A 돌연변이에 의해 항-HER2 항체 2 HC 서열에 묶인 항-HER2 항체 2 LC 서열 (서열 11) 및 (2) 26개 아미노산 GGS 테더, BASE.p1 코일드 코일 도메인 서열, 및 K222A 돌연변이에 의해 항-EGFR 항체 HC 서열에 묶인 항-EGFR 항체 LC 서열 (서열 10)을 함유한다 (도 11). 코일드 코일 함유 항체의 제작에 사용된 항-HER2 항체 1 LC 및 HC 서열을 도 12A 및 12B (서열 15 및 16)에 제시한다. 이들 항체를 코딩하는 벡터의 제작에 사용된 다양한 제한 부위의 위치를 또한 도 12ba-c에 제시한다.
실시예 2. 코일드 코일 함유 항체의 정제
코일드 코일 함유 항체에 대해 사용될 수 있는 예시적인 방식을 아래에 제시한다.
코일드 코일 함유 항체를 단백질 A (예를 들어, mAbSure) 칼럼에 4℃에서 로딩한다 →
칼럼을 KPO4로, 이어서 PBS + 0.1% 트리톤 X114로 세척한다 →
샘플을 Tris pH 8.0 (200mM) + 아르기닌 (100 mM) 내로 용리시킨다 →
샘플의 pH를 8.0으로 조정하고, 1 hr 동안 37℃에서, 1:500 wt:wt LysC로 절단한다 →
샘플을 1 ml mAbSure 수지/10 mg 단백질을 사용하여 농축하고, Tris/Arg 완충제 내로 용리시킨다 →
샘플을 PBS + 0.3M NaCl + 100 mM Arg 내의 S200 겔 여과 칼럼에 로딩한다 →
분획을 수거하고, 한데 모아 PBS 내로 투석한다.
특히, 항체를 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare, 스웨덴)의 mAbSure Select 수지를 사용하여 조건화 배지로부터 4℃에서 철야 정제하였다. 칼럼을 2 칼럼 부피 (CV)의 PBS (포스페이트 완충 염수), 이어서, 10 CV의 PBS + 0.1% 트리톤 X 114 세제, 이어서 10 CV 인산칼륨 완충제로 세척하였다. 칼럼을 10 mM 아세트산 (pH 2.9)으로 용리하고, 아르기닌 (100 mM 최종 농도) 및 Tris (200 mM 최종 농도) (pH 8.0)로 즉시 희석하였다. 코일드 코일은 37℃에서 1-5시간 동안 1:500 (중량:중량) 비의 Lys-C 엔도펩티다제 (와코 퓨어 케미칼 래보래토리즈 (Wako Pure Chemical Laboratories))로 처리시에 항체로부터 제거되었다. 절단된 코일드-코일을 항체로부터 분리하기 위해 절단된 샘플을 mAbSure 수지 칼럼에 다시 로딩하고, 상기한 바와 같이 용리하였다. 항체 농도를 PBS, 150 mM NaCl, 100 mM 아르기닌, 및 1 mM NaN3에서 이동하는 세파크릴 (Sephacryl) S200 칼럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 통한 분리 전에 10 mg/ml로 조정하였다. 피크 분획을 모으고, 종류 및 순도를 보장하기 위해 질량 분광 분석 전에 PBS에 대해 철야 투석하였다.
아르기닌에 추가로, 초기 mAbSure 수지 칼럼 단계 후에 상기 정제 프로토콜에서 사용할 수 있는 다른 무질서유발제 또는 연성 세제는 구아니딘-HCl, 우레아, 과염소산리튬, 히스티딘, SDS (나트륨 도데실 술페이트), 트윈, 트리톤, 및 NP-40을 포함하고 이로 제한되지 않으며, 이들은 모두 상업상 이용가능하다. 초기 단백질 A 함유 칼럼 (예를 들어, mAbSure 칼럼)으로부터 용리한 후 항체를 무질서유발제 또는 연성 세제 함유 용액 내에 희석하는 것은 용리 후 항체의 안정성을 유지하고, Lys-C 엔도펩티다제에 의한 코일드 코일의 효율적인 제거를 가능하게 한다.
표 1은 항-HER2 항체 1/α-EGFR (D1.5) 항체에 대한 정제 결과의 요약을 보여준다.
Figure pct00014
코일드 코일은 정제 과정 동안 Lys-C 엔도펩티다제에 의해 항체로부터 제거되었다.
코일드 코일 이종이량체화 도메인을 사용하여 제작되지만 코일드 코일을 더이상 함유하지 않는 항체는 하기 실시예에서 "조작된 항체"로서 언급된다.
실시예 3. 코일드 코일 함유 항체의 절단
코일드 코일 (및 존재할 경우 테더)이 항체 서열을 무손상 상태로 유지하면서 항체 서열로부터 절단될 수 있는지 보여주기 위해 다양한 코일드 코일 함유 항체에 대해 절단 실험을 수행하였다. 특히, 도 13a 및 b는 코일드 코일이 Lys-C 엔도펩티다제를 사용하여 예시적인 α-FcεR1/α-FcγR2b 항체로부터 절단되었고 항체가 무손상 상태로 유지됨을 보여준다. 코일드 코일을 갖는 항체의 이론적 질량은 질량 분광측정법에 의해 실험적으로 관찰된 질량의 오차의 범위 내에 있다. 이와 유사하게, 코일드 코일이 없는 조작된 항체의 이론적 질량은 Lys-C가 코일드 코일을 항체로부터 절단함을 보여주는 질량 분광측정법에 의해 실험적으로 관찰된 질량의 오차의 범위 내에 있다.
질량 분광측정법은 또한 Lys-C 엔도펩티다제가 예시적인 α-FcεR1/α-FcγR2b 항체의 LC 또는 HC를 절단하지 않음을 보여주었다 (도 14a 및 b). 특히, 분자 질량은 질량 분광측정법을 사용하여 LC (상부 2개의 패널) 및 α-FcεR1 및 α-FcγR2b HC (하부 4개의 패널)에 대해 Lys-C 엔도펩티다제 처리 전에 (좌측 패널) 및 Lys-C 엔도펩티다제 처리 후에 (우측 패널) 결정하였다. 실험적으로 관찰된 분자 질량은 다양한 구성체의 이론적 질량의 오차의 범위 내에 있고, 이것은 Lys-C 엔도펩티다제가 HC로부터 코일드 코일을 절단하지만 LC 또는 HC 자체는 절단하지 않음을 보여준다.
이와 유사하게, 질량 분광측정법 결과는 코일드 코일이 Lys-C 엔도펩티다제를 사용하여 예시적인 1 아암형 α-EGFR 항체로부터 절단되었음을 보여주었다 (도 17a 및 b). 특히, 실험적으로 관찰된 분자 질량은 코일드 코일이 있는 1 아암형 항체 및 코일드 코일이 없는 1 아암형 항체 모두에 대해 이론적 질량의 오차의 범위 내에 있었다. 도 18a-c에 도시된 바와 같이, 이론적 분자 질량은 각각의 구성체에 대해 실험적으로 관찰된 분자 질량의 오차의 범위 내에 있었고, 이것은 Lys-C 엔도펩티다제가 예시적인 α-EGFR 항체의 LC, HC, 또는 VH 및 CH1 도메인이 결여된 HC (1 아암형 Fc)를 절단하지 않지만, HC 및 VH 및 CH1 도메인이 결여된 HC로부터 코일드 코일 도메인을 절단함을 나타낸다.
또한, 질량 분광측정법 결과는 코일드 코일이 Lys-C 엔도펩티다제를 사용하여 예시적인 묶인 α-HER2/α-EGFR 항체로부터 절단되었음을 보여주었다 (도 19a 및 b). 도 19b에 도시된 바와 같이, 이론적 및 실험적으로 관찰된 분자 질량은 각각의 구성체에 대해 오차의 범위 내에 있다. 코일드 코일은 또한 항체를 먼저 Lys-C 엔도펩티다제로 처리한 후, 샘플을 질량 분광 분석에 적용한 경우, Lys-C 엔도펩티다제를 사용할 때 예시적인 묶인 α-HER2/α-EGFR 항체로부터 절단되었다 (도 20a-b). 각각의 구성체에 대한 이론적 분자 질량은 실험적으로 관찰된 분자 질량의 오차의 범위 내에 있고, 이것은 코일드 코일이 실제로 항체 서열로부터 절단되고 항체 서열 자체는 절단되지 않음을 나타낸다. 예시적인 코일드 코일 함유 항체에 대한 분자 질량 (MS)을 포함하는 질량 분광측정법 결과를 표 2에 요약한다.
Figure pct00015
실시예 4. 조작된 항체의 특성결정
코일드 코일 이종이량체화 도메인을 사용하여 제작된 예시적인 조작된 항체가, 그 서열이 유래되는 항체의 결합 특성을 보유하는지를 결정하기 위해 결합 분석을 수행하였다. 이들 결합 분석은 ForteBio 옥테트 시스템에서 동역학 위저드 (kinetics wizard) 프로그램을 사용하여 실시하였다. 시험된 모든 샘플의 농도는 25 ㎍/ml이었고, 이 농도는 반복 실험에서 및 여러 샘플에서 항-인간 IgG 프로브의 포화를 나타낸다. 프로브를 제1 샘플에 15분 동안 로딩하고, 30초 동안 PBS 내에서 세척하였다. 제2 및 제3 샘플에 대한 모든 회합은 회합 사이에 30초 동안 PBS로 세척하면서 10분 동안 수행하였다.
특히, 프로브를 25 ㎍/ml의 항체와 15분 동안 인큐베이팅함으로써 공통적인 LC 항-FcεR1/항-FcγR2b 이중특이적 조작된 항체를 항-인간 IgG 프로브 (옥테트) 상에 로딩한 후, PBS 세척 단계를 수행하였다. 결합을 평가하기 위해서, 로딩된 프로브를 25 ㎍/ml의 FcεR1, 이어서 25 ㎍/ml의 FcγR2b와 함께 인큐베이팅하였다. 두 결합 인큐베이팅 사이에 PBS 세척 단계를 수행하였다. 도 15에 제시된 데이타는 이중특이적 조작된 항체가 그의 두 항원 모두에 동시에 결합함을 보여준다.
조작된 항체의 기능성을 시험하기 위해, 인간 FcεR1a 및 인간 Fcγ2b1를 발현하기 위해 생성된 래트 호염기구성 백혈병 (RBL) 세포주를 완전 성장 배지 (얼 (Earle) 염 (깁코 (Gibco) Cat# 11090), 1 mM 글루타민 (제넨테크 인크.), 1 mM 피루브산나트륨 (깁코 Cat# 11360-070), 0.1 mM 비필수 아미노산 (깁코 Cat# 11140-050), 1.5 g/L 중탄산나트륨 (깁코 Cat# 25080-094), 15% 태소 혈청 (Hyclone (하이클론) Cat# SH30071.03) 함유 MEM) 내에서 1 ㎍/ml NP-특이적 인간 IgE (JW8.5.13)와 함께 72시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포를 트립신으로 처리하고, 1 ㎍/ml NP-특이적 인간 IgE를 함유하는 200 ㎕의 완전 성장 배지 내의 3.5 x 105 세포/ml로 96-웰 평저 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅하고, 2시간 동안 부착시켰다. 이어서, 세포를 미결합된 NP-특이적 인간 IgE를 제거하기 위해 신선한 배지로 3회 세척하였다. 세포를 0-10 ㎍/ml의 이중특이적 항체로 처리하고, 항원으로 활성화하기 전에 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 45분 동안 37℃에서 0.1 ㎍/ml NP-접합된 난알부민 (바이오리써치 테크놀로지스, 인크. (Biosearch Technologies, Inc.) Cat. N-5051-10)과 함께 인큐베이팅함으로써 세포를 활성화하였다. 인큐베이팅 후에, 세포 상등액 (세포 배양 배지) 내의 히스타민 수준을 히스타민 ELISA 키트 (KMI 다이어그노스틱스 (KMI Diagnostics, 미국 미네소타주 미네아폴리스))를 사용하여 ELISA (효소 연결 면역흡착 분석)에 의해 측정하였다. 배경 히스타민 수준은 활성화하지 않은 상태에서 NP-특이적 인간 IgE만으로 처리한 세포로부터 얻었다 (도 16).
또한, 예시적인 1 아암형 항체 및 묶인 조작된 항체에 대해 옥테트 결합 연구를 수행하였다. 대조군으로서, 야생형 항-HER2 항체 1 및 야생형 α-EGFR 항체가 서로의 항원과 교차반응하지 않지만 그들 각각의 항원에는 결합함을 보여주기 위해 옥테트 분석을 수행하였다 (도 21). 예시적인 코일드 코일 함유 항체를 시험하기 위해, 1 아암형 항-HER2 항체 1을 15분 동안 항-인간 IgG 항체 프로브 상에 25 ㎍/ml로 로딩하고, 프로브를 후속적으로 PBS로 30초 동안 세척하였다. 이어서, 로딩된 프로브를 25 ㎍/ml로 EGFR ECD (세포외 도메인)와 함께 인큐베이팅하였고, 이때 결합 신호가 보이지 않았다. 이어서, 프로브를 30초 동안 PBS 내에서 세척하고, 25 ㎍/ml로 HER2 수용체 ECD와 함께 인큐베이팅하였고, 이때 강한 결합 신호가 나타났다 (도 22; 상부 기록).
1 아암형 EGFR 조작된 항체를 25 ㎍/ml로 항-인간 IgG 항체 프로브 상에 15분 동안 로딩한 후, PBS로 30초 동안 세척하였다. 이어서, 프로브를 25 ㎍/ml로 HER2 ECD와 함께 인큐베이팅하였고, 이때 결합 신호가 보이지 않았다. 프로브를 30초 동안 PBS 내에서 세척하고, 25 ㎍/ml로 EGFR ECD와 함께 인큐베이팅하였고, 이때 강한 결합 신호가 나타났다 (도 22; 하부 기록).
묶인 이중특이적 항-EGFR(D1.5)/항-HER2 조작된 항체를 25 ㎍/ml로 항-인간 IgG 항체 프로브와 함께 15분 동안 인큐베이팅한 후, PBS로 30초 동안 세척하였다. 상기 인큐베이팅에 의해 프로브에 이중특이적 항체가 로딩되었다. 이어서, 프로브를 25 ㎍/ml로 EGFR ECD와 함께 3분 동안 인큐베이팅한 후, 30초 동안 PBS로 세척하고, 이어서 25 ㎍/ml로 HER2 수용체 ECD와 함께 3분 동안 인큐베이팅하였다 (도 23a; 상부 기록). 도 23a의 하부 기록에 제시된 결과에 대해, 이중특이적 로딩된 프로브를 먼저 HER2 수용체 ECD와, 이어서 EGFR ECD와 함께 인큐베이팅하였다. 데이타는 이중특이적 조작된 항체가 EGF 및 HER2 수용체 모두에 동시에 결합함을 보여준다. 도 23b에 도시된 바와 같이, 이중특이적 항-EGFR (D1.5)/항-HER2 항체는 약 0.06 nM의 Kd로 HER2에 결합하고, 약 0.660 nM의 Kd로 EGF 수용체에 결합하였다.
조작된 항체의 결합 특징을 추가로 분석하기 위해, 세포 기반 분석을 2가지 세포주, 즉, EGFR 또는 HER2를 발현하는 NR6, 또는 EGFR과 HER2 모두를 동시발현하는 HCA7 세포에 대해 수행하였다. 결합 분석을 수행하기 전에, 세포를 수거하고 결합 완충제 (1% 태소 혈청 (FBS), 10 mM HEPES, 및 0.2% NaN3을 함유하는 RPMI 배지) 내에서 30분 동안 얼음 상에서 냉각시켰다. 표지되지 않은 항체는 목적하는 출발 농도로 제조하고, 다중 데이타 점을 제공하기 위해 결합 완충제로 1:1 희석하였다. 표지된 항체는 전체 분석 내내 사용되는 하나의 농도로 제조하였다. 다양한 농도의 표지되지 않은 항체와 경쟁하는 방사성 표지된 항체를 사용하여 평형 결합 연구를 수행하였다. 표지되지 않은 항체를 96-웰 플레이트에 넣은 후, 표지된 물질을 넣고, 이어서, 세포를 혼합물에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후에, 세포로부터 용액을 분리하기 위해 밀리포어 (Millipore) 막 다중-스크린 플레이트를 사용하여 플레이트를 수거하였다. 이어서, 세포-결합된 방사성 표지된 항체를 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) 감마 계수기로 계수하고, 데이타는 뉴 리간드 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 1 아암형 및 묶인 조작된 항체 구성체에 대한 친화도 결합 연구의 결과를 표 3에 요약한다.
Figure pct00016
예시적인 조작된 항체의 기능적 적절성을 또한 생화학적으로 결정하였다. EGFR-발현 NR6 세포를 12-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 혈청 제한 (starvation) 세포를 다양한 농도의 항체와 함께 2시간 동안 37℃에서 미리 인큐베이팅하였다. 후속적으로, 세포를 TGFα로 12분 동안 자극하였다. 전체 세포 용해물에 대해 SDS-PAGE 분석을 수행하고, 면역블롯을 항-포스포티로신, 항-포스포Akt, 또는 로딩 대조군으로서의 항-튜불린으로 프로빙하였다 (도 24). 이들 결과는 D1.5 IgG1 대조 항체처럼 예시적인 α-EGFR(D1.5)/항-HER2 (항체 1) 조작된 항체가 EGFR-발현 NR6 세포에서 TGFα-유도 인산화를 용량-의존 방식으로 억제함을 보여준다.
세포 증식 분석을 위해, 세포를 96-웰 플레이트 (EGFR-NR6: 2,000 세포/웰) (BT474: 10,000 세포/웰)에 플레이팅하고, 37℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 세포를 1% 혈청 함유 배지에서 처리하였다. α-EGFR(D1.5)/항-HER2 (항체 1) 조작된 항체의 세포 성장에 대한 효과를 EGFR-NR6 세포에 대한 D1.5 항체와 비교하기 위해, 3 nM TGFα를 배지에 첨가하고, 세포를 다양한 농도의 항체로 처리하였다. 3일 후에, 알라마르블루 (AlamarBlue)를 웰에 첨가하고, 96-웰 형광계 (530 nm 여기 및 590 nm 방출)를 사용하여 형광을 판독하였다. 결과는 상대 형광 단위 (RFU)로 표현한다 (도 25). α-EGFR(D1.5)/항-HER2 (항체 1) 조작된 항체의 세포 성장에 대한 효과를 항-HER2 항체 1과 비교하기 위해, BT474 세포를 다양한 농도의 항체를 갖는 1% 혈청 함유 배지로 처리하였다 (도 26). 5일 후에, 알라마르블루 분석을 상기한 바와 같이 수행하였다. 이들 결과는 D1.5 IgG1 대조 항체처럼 예시적인 α-EGFR(D1.5)/항-HER2 (항체 1) 조작된 항체가 EGFR-발현 NR6 세포에서 TGFα-유도 인산화를 용량-의존 방식으로 억제하고, 항-HER2 항체 1처럼 BT474 세포의 성장을 억제함을 보여준다.
실시예 5. 조작된 항체의 약동학적 분석
이중특이적 조작된 항체의 약동학 (PK)을 전형적인 인간 IgG (hIgG) 항체의 약동학과 비교하고 효능 실험을 위한 용량을 결정하기 위해 약동학적 연구를 수행하였다. D1.5 hIgG1 대조 항체처럼, HER1/HER2 (D1.5/항-HER2 항체 1) 조작된 항체도 마우스와 교차반응성을 보였다. 항-HER2 항체 2 hIgG1 대조 항체는 마우스와 교차반응성을 보이지 않았다.
D1.5 hIgG1 양성 대조 항체의 PK는 SCID 베이지 마우스를 이용하여 10일에 걸쳐 결정하였다. 특히, 시간에 따른 항체의 혈청 농도는 다양한 용량 (0.5 mg/kg, 5 mg/kg, 및 50 mg/kg)의 항체 투여 후에 Fc-Fc 분석을 이용하여 결정하였다. 또한, 용량에 대한 혈청 농도를 Fc-Fc ELISA 분석을 사용하여 10일 동안 모니터링하였다 (도 27). 용량에 의해 정규화된 곡선 하 면적 (AUC)도 결정하고, 표 4에 요약하였다. D1.5 hIgG1 항체는 시험된 용량 범위에서 마우스에서 비선형 PK를 보였다.
Figure pct00017
또한, 항-HER2 항체 2 hIgG1 양성 대조 항체의 PK도 SCID 베이지 마우스를 이용하여 10일에 걸쳐 결정하였다. 시간에 따른 항체의 혈청 농도를 10 mg/kg의 항체의 투여 후에 Fc-Fc ELISA 또는 HER2-ECD (세포외 도메인) ELISA를 이용하여 결정하였다. 또한, 용량에 의해 정규화된 AUC도 결정하고, 표 5에 요약하였다.
Figure pct00018
이와 유사하게, HER 1 (EGFR)/HER2 (D1.5/항-HER2 항체 1) 조작된 항체의 PK는 SCID 베이지 마우스를 이용하여 10일에 걸쳐 결정하였다. 시간에 따른 항체의 혈청 농도는 다양한 용량 (0.5 mg/kg, 5 mg/kg, 및 20 mg/kg)의 항체 투여 후에 Fc-Fc ELISA 또는 EGFR-HER2 ELISA를 이용하여 결정하였다. 또한, 용량에 대한 혈청 농도를 Fc-Fc ELISA 또는 EGFR-HER2 ELISA를 사용하여 10일 동안 모니터링하였다 (도 28). 용량에 의해 정규화된 AUC도 결정하고, 표 6에 요약하였다. HER1 (EGFR)/HER2 (D1.5/항-HER2 항체 1) 조작된 항체는 시험된 용량 범위에서 마우스에서 비선형 PK를 보였다.
Figure pct00019
PK 분석 결과를 기초로 하여, HER1 (EGFR)/HER2 (D1.5/항-HER2 항체 1) 조작된 항체는 D1.5 hIgG1 대조 항체에 비해 시험된 기간 (제10일까지)에 걸쳐 마우스에서 유사한 또는 보다 우수한 노출 (exposure)을 갖는 것으로 결정되었다 (도 29).
실시예 6 - 테더를 절단하는 효소를 발현하도록 조작된 포유동물 세포주에서 묶인 항체의 생산
26AA 푸린 절단가능한 묶인 코일드 코일 항체 (도 30A)의 제작을 위해, 목적하는 항체의 VH 도메인 (신호 서열 미함유)을 먼저 PCR을 사용하여 제조하였고, 여기서 5' 프라이머는 GGS-푸린 테더의 3' 절반을 함유하고 5' BamHI 부위에서 끝나고, 3' 프라이머는 3' ApaI 부위에서 끝났다. 단편을 소화시키고, 유사하게 제조된 항체-코일드 코일 백본 벡터 내로 클로닝하였다. 이어서, 목적하는 항체의 동족 LC를 PCR을 사용하여 제조하였고, 여기서 5' 프라이머는 5' ClaI 부위에서 끝나고, 3' 프라이머는 푸린-GGS 테더의 5' 부분을 함유하고 3' BamHI에서 끝났다. LC 단편은 단편을 ClaI 및 BamHI을 통해 VH의 앞에 클로닝함으로써 그의 동족 HC (이제 항체 코일드 코일 백본 내의)에 연결하였다. CL을 VH에 연결하는 완전한 테더 서열은
Figure pct00020
였다. 26AA 푸린-절단가능한 테더 (-C) (도 30B)의 제작을 위해, 2개의 돌연변이를 상기 구성체 내로 도입하였다. LC의 C-말단 Cys 잔기는 스트라타젠의 퀵체인지 II XL 부위 지정 돌연변이 유발 키트를 사용하여 Ala 잔기로 돌연변이되었다. 카바트 넘버링 시스템에 따르면, CL 내의 Cys 말단 잔기는 위치 214에 존재한다. 또한, HC의 C220은 상기 새로 비-디술피드 결합된 Cys에 의해 잘못 폴딩될 가능성을 제거하기 위해 A로 돌연변이되었다.
32AA 푸린 절단가능한 테더 (도 30C)의 제작에 사용된 방법은 최종 테더 서열이
Figure pct00021
인 것을 제외하고는 26AA 푸린 절단가능한 테더의 제작과 동일하였다. 푸린 과다-발현을 위해, 인간 또는 쥐 푸린을 pRK 벡터 시스템 내로 클로닝하고, 항체 사슬 플라스미드와 함께 동시에 형질감염시켰다.
카르복시펩티다제 B 소화 (도 30D)는 1:20 wt:wt의 CpB를 사용하여 37℃에서 1 hr 동안 50 mM 붕산나트륨 (pH 8.0)에서 수행하였다.
도 30A 1-2는 26개 아미노산 푸린 절단가능한 테더에 대한 도식 및 환원 질량 분광측정법 (MS) 결과이다. 중쇄 MS 기록 또는 그래프는 전체 천연 N- 및 C-말단을 갖는 중쇄 (1) 및 보다 소량의 "전장 항체" (즉, 이들 연구를 위해 푸린 부위에서 절단되지 않음 (FL))를 보여준다. 경쇄 MS 기록은 LC + 테더의 전체 길이에 대응하는 피크 (1) 및 아마도 CHO 배지 내의 카르복시펩티다제 B 활성 때문에 테더의 3' 말단의 손상 (erosion)에 대응하는 3개의 다른 피크 (2-4)를 보여준다. 자줏빛 타원형으로 표시되는 하부 기록의 영역 내의 MS 피크의 결여에 의해 입증되는 바와 같이, N-말단 푸린 부위에 절단이 존재하지 않는다. 비-천연 잔기 (밑줄친 "R") 및 LC의 C-말단에 계속 부착된 23-26개 아미노산 테더를 보여주는 생성되는 항체의 그림이 제시된다.
도 30B 1-2는 26개 아미노산 푸린 절단가능한 테더 ("-C")에 대한 도식 및 환원 질량 분광측정법 (MS) 결과이다. 이 구성체에서, C 잔기는 제거되고 교체되었다. 중쇄 MS 기록은 전체 천연 N- 및 C-말단을 갖는 중쇄 (1)을 보여주고, 여기서 "전장 항체" (FL)은 나타나지 않는다. 경쇄 MS 기록은 LC + 2개의 추가의 R 잔기 (피크 2) + 1개의 추가의 R 잔기 (피크 3)에 대응하는 피크 및 아마도 CHO 배지 내의 카르복시펩티다제 B 활성에 의한 그의 천연 C-말단 (피크 4)을 보여준다. 비-천연 잔기 (황색) 및 LC의 C-말단에 계속 부착된 0, 1 또는 2개의 R 잔기를 보여주는 생성되는 항체의 그림이 제시된다.
도 30C 1-5는 32개 아미노산 푸린 절단가능한 테더에 대한 도식 및 환원 질량 분광측정법 (MS) 결과이다. 도 30cc는 전체 천연 N- 및 C-말단을 갖는 중쇄 (피크 1) 및 푸린 부위에서 절단되지 않은 보다 소량의 "전장 항체" (FL)를 보여준다. 도 30cb 및 30cc는 천연 수준의 푸린을 발현하는 CHO 세포로부터 얻은 생성되는 물질을 보여주고, 도 30cd 및 30ce는 푸린을 과다발현하는 CHO 세포로부터 얻은 생성되는 물질을 보여준다. 도 30cb는 LC + 테더의 전체 길이에 대응하는 피크 (1) 및 테더의 3' 말단의 손상에 대응하는 5개의 다른 피크 (2-6) 및 푸린 인식 서열만이 계속 부착된 LC를 보여주는 추가의 피크 (피크 7) 및 아마도 CHO 배지 내의 카르복시펩티다제 B 활성에 의한 C-말단 염기성 잔기의 손상에 대응하는 5개의 추가의 피크 (피크 8-12)를 보여준다. 도 30ce는 전체 천연 N- 및 C-말단을 갖는 중쇄 (1)을 보여주고, 여기서 전장 항체 (FL)는 나타나지 않고, 도 30cd는 N-말단 푸린 부위에서 이제 완전히 절단된 LC (7) 및 C-말단 염기성 잔기의 손상에 대응하는 4개의 추가의 피크 (8-11)를 보여준다.
도 30db는 도 30cd와 동일하다. 1:20 wt:wt의 CpB와 함께 37℃에서 1 hr 인큐베이팅한 후에, 잔류하는 잔기 (피크 7-11에 대응함)는 완전히 제거되어, 천연 C-말단을 갖는 LC를 생성하였다 (도 30dc). 각각의 HC 내의 K222A 돌연변이인 유일한 비-천연 잔기 및 그 이외에는 완전히 천연 상태인 (모 항체에 비해) 이중특이적 항체를 보여주는 그림이 제시된다.
실시예 7 - 진핵 세포에서 효소-절단가능한 묶인 코일드 -코일 다중특이적 항체의 발현 및 테더 또는 코일드 코일이 없는 다중특이적 항체의 생산
각각의 아암이 상이한 표적을 인식하는 2개의 상이한 VH 및 VL을 포함하는 묶인, 코일드 코일 이중특이적 항체가 상기한 바와 같은 인간 푸린을 과다발현하는 CHO 세포에서 생산되었다. 또한 K222A 돌연변이를 함유하는 항체를, 코일드 코일의 제거를 위해 Lys-C 엔도펩티다제 및 카르복시펩티다제 B로 처리하였다. 최종 생성물을 달성하기 위해 항체를 힌지 및 불변 영역에서 임의의 돌연변이를 추가로 발생시킬 필요는 없었다. 도 31은 최종 생성물의 비-환원 질량 분광측정법 기록을 보여준다. 소량의 동종이량체가 비-환원 MS에서 관찰될 수 있지만, 이것은 2개의 Ab 사슬의 발현 수준의 불균형 때문에 의한 것이고, 그들의 상대적인 발현 수준을 조정함으로써 쉽게 보정된다. 도 32는 최종 생성물의 환원 질량 분광측정법 기록을 보여준다. LC 및 HC의 관찰된 질량을 통해, Ab 사슬 모두가 천연 N- 및 C-말단을 갖는다는 것이 확인되었다.
이들 결과는 상기 플랫폼이 포유동물 세포에서 몇몇 종류의 1 아암형 및 이중특이적 항체의 생산을 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 본 발명에서, 본 발명자들은 단지 각각의 HC의 힌지 영역 내의 단일 Lys-Ala 돌연변이에 의해서만 그의 모 wt Ab와 상이한 성숙 이중특이적 항체를 생성시킬 수 있었다. 이들 항체는 그 특이성을 보유하고, 이중특이적 변이체는 두 항원에 동시에 결합할 수 있다. 이들 항체는 높은 친화도로 그의 항원에 결합한다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> COILED COIL AND/OR TETHER CONTAINING PROTEIN COMPLEXES AND USES THEREOF <130> 50474/019WO3 <140> PCT/US2010/002546 <141> 2010-09-16 <150> 61/266,992 <151> 2009-12-04 <150> 61/243,105 <151> 2009-09-16 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 490 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Ile Thr Pro Asp Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Asp Leu Gly Ser Arg Glu Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 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Leu Val Thr 125 130 135 gtc tcc tcg gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc 484 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 140 145 150 tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 532 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 155 160 165 aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 580 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 170 175 180 ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga 628 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 185 190 195 200 ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg act gtg ccc tct agc agc ttg ggc 676 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 205 210 215 acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 724 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 220 225 230 gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac gca act cac aca tgc 772 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 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aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag 532 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 155 160 165 gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag 580 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 170 175 180 cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg 628 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 185 190 195 200 agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc 676 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 205 210 215 cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag 724 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 220 225 230 tgt gga gga ggt tca gga ggt tct ggt ggt tcg gga gga tcc gga gga 772 Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 235 240 245 tct gga ggt tca gga ggt tct ggt ggg tca gga gaa gtt cag ctg gtg 820 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val 250 255 260 gag tct ggc ggt ggc ctg gtg cag cca ggg ggc tca ctc cgt ttg tcc 868 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 265 270 275 280 tgt gca gct tct ggc ttc aac att aaa gac acc tat ata cac tgg gtg 916 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 285 290 295 cgt cag gcc ccg ggt aag ggc ctg gaa tgg gtt gca agg att tat cct 964 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 300 305 310 acg aat ggt tat act aga tat gcc gat agc gtc aag ggc cgt ttc act 1012 Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 315 320 325 ata agc gca gac aca tcc aaa aac aca gcc tac ctg cag atg aac agc 1060 Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 330 335 340 ctg cgt gct gag gac act gcc gtc tat tat tgt tct aga tgg gga ggg 1108 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly 345 350 355 360 gac ggc ttc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc ctg gtc acc 1156 Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 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<222> (4)..(4) <223> Any hydrophobic amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any charged amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Any charged amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Any hydrophobic amino acid residue or Asparagine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(10) <223> Any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any hydrophobic amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Any charged amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Any charged amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> This sequence consists of 2 heptad repeats; see specification as filed for detailed description of preferred embodiments <400> 29 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any hydrophobic amino acid residue or Asparagine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(3) <223> Any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any hydrophobic amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any charged amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Any charged amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Any hydrophobic amino acid residue or Asparagine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(10) <223> Any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any hydrophobic amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Any charged amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Any charged amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> This sequence consists of 2 heptad repeats; see specification as filed for detailed description of preferred embodiments <400> 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 31 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Arg Gly Arg Cys Arg Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Arg Ser Arg Lys Arg Arg Glu Val 20 25 30 Gln <210> 32 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Arg Gly Glu Cys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Glu Val 20 25 30 Gln <210> 33 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Gly Gly Ser Ala Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu 1 5 10 15 Asn Ala Gln Leu Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala 20 25 30 Gln Gly Ala Thr 35 <210> 34 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Gly Gly Ser Ala Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys 1 5 10 15 Asn Ala Gln Leu Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala 20 25 30 Gln Gly Ala Thr 35 <210> 35 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Arg Cys Arg Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Arg Ser Arg Lys Arg Arg 20 25 <210> 36 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Arg Lys Arg Lys Arg Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Arg Ser Arg Lys Arg Arg 20 25 30 <210> 37 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Arg Gly Arg Ala Arg Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Arg Ser Arg Lys Arg Arg Glu Val 20 25 30 Gln <210> 38 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Arg Gly Glu Cys Arg Lys Arg Lys Arg Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Arg Ser Arg Lys 20 25 30 Arg Arg Glu Val Gln 35 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Arg Gly Glu Cys Arg Lys Arg Lys Arg Arg 1 5 10

Claims (55)

  1. (a) VH 도메인 및 하기 화학식 I의 7개체 반복체를 포함하는 제1 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제1 폴리펩티드
    <화학식 I>
    Figure pct00022

    (여기서, X1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
    X2, X3, 및 X6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
    X4는 소수성 아미노산 잔기이고,
    X5 및 X7은 각각 하전된 아미노산 잔기임); 및
    (b) VH 도메인 및 하기 화학식 II의 7개체 반복체를 포함하는 제2 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제2 폴리펩티드
    <화학식 II>
    Figure pct00023

    (여기서, X'1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
    X'2, X'3, 및 X'6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
    X'4는 소수성 아미노산 잔기이고,
    X'5 및 X'7은 각각 하전된 아미노산 잔기임)
    를 포함하며, 화학식 I 및 II에서 n은 2보다 크거나 같고; 각각의 7개체 반복체에서, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'7 잔기와 반대 전하의 X5 잔기를 포함하고, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'5 잔기와 반대 전하의 X7 잔기를 포함하는 것인 항체.
  2. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드가 각각 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 것인 항체.
  3. 제2항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드가 각각 힌지 도메인을 추가로 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 각각 CH2 및 CH3 도메인을 추가로 포함하는 것인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드가 각각 서로에 대해 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1-힌지-CH2-CH3으로 위치하는 VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 제3 및 제4 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 상기 제3 폴리펩티드는 제1 VL 도메인을 포함하고, 상기 제4 폴리펩티드는 제2 VL 도메인을 포함하는 것인 항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 VH 도메인이 테더에 의해 제3 폴리펩티드의 VL 도메인에 연결되고, 제2 폴리펩티드의 VH 도메인이 테더에 의해 제4 폴리펩티드의 VL 도메인에 연결되는 것인 항체.
  8. 제6항에 있어서, 제3 폴리펩티드가 제1 CL 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1 VL 및 CL 도메인이 제3 폴리펩티드 내에서 N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL로 서로에 대해 위치하고, 제4 폴리펩티드가 제2 CL 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제2 VL 및 CL 도메인이 제4 폴리펩티드 내에서 N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL로 서로에 대해 위치하는 것인 항체.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 상기 제2 VL 도메인의 서열이 동일한 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 상기 제2 폴리펩티드 중 적어도 하나의 VH의 N-말단이 테더를 사용하여 CL의 C-말단에 연결되는 것인 항체.
  11. (a) VH 도메인 및 하기 화학식 I의 7개체 반복체를 포함하는 제1 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제1 폴리펩티드
    <화학식 I>
    Figure pct00024

    (여기서, X1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
    X2, X3, 및 X6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
    X4는 소수성 아미노산 잔기이고,
    X5 및 X7은 각각 하전된 아미노산 잔기임); 및
    (b) CH2 및 CH3 도메인 및 하기 화학식 II의 7개체 반복체를 포함하는 제2 코일드 코일 도메인 (CC)을 포함하는 제2 폴리펩티드
    <화학식 II>
    Figure pct00025

    (여기서, X'1은 소수성 아미노산 잔기 또는 아스파라긴이고,
    X'2, X'3, 및 X'6은 각각 임의의 아미노산 잔기이고,
    X'4는 소수성 아미노산 잔기이고,
    X'5 및 X'7은 각각 하전된 아미노산 잔기임)
    를 포함하며, 화학식 I 및 II에서 n은 2보다 크거나 같고; 각각의 7개체 반복체에서, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'7 잔기와 반대 전하의 X5 잔기를 포함하고, 제1 CC는 제2 CC 내의 X'5 잔기와 반대 전하의 X7 잔기를 포함하는 것인 항체.
  12. 제11항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 것인 항체.
  13. 제12항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 힌지 도메인을 추가로 포함하는 것인 항체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 CH2 및 CH3 도메인을 추가로 포함하는 것인 항체.
  15. 제11항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 서로에 대해 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1-힌지-CH2-CH3으로 위치하는 VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 항체.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제3 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 제3 폴리펩티드가 VL 도메인을 포함하는 것인 항체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제3 폴리펩티드가 CL 도메인을 추가로 포함하고, VL 및 CL 도메인이 N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL로 서로에 대해 위치하는 것인 항체.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드의 VH의 N-말단이 테더를 사용하여 CL의 C-말단에 연결되는 것인 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 X1, X'1, X4, 및 X'4에서 상기 소수성 아미노산 잔기가 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 트립토판, 페닐알라닌, 및 메티오닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 X5, X'5, X7, 및 X'7에서 상기 하전된 아미노산 잔기가 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 및 글루탐산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 CC의 적어도 하나의 7개체 반복체에서 X1이 아스파라긴이고, 상기 제2 CC의 적어도 하나의 7개체 반복체에서 각각의 X'1이 아스파라긴인 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 제1 CC가 7개체 반복체를 포함하고,
    여기서 X1이 류신 또는 아스파라긴이고,
    X2가 알라닌 또는 글루타민이고,
    X3이 알라닌 또는 글루타민이고,
    X4가 류신이고,
    X5가 글루탐산이고,
    X6이 리신 또는 트립토판이고,
    X7이 글루탐산이고;
    (b) 제2 CC가 7개체 반복체를 포함하고,
    여기서 X'1이 류신 또는 아스파라긴이고,
    X'2가 알라닌 또는 글루타민이고,
    X'3이 알라닌 또는 글루타민이고,
    X'4가 류신이고,
    X'5가 리신이고,
    X'6이 리신 또는 트립토판이고,
    X'7이 리신인 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, n이 3보다 크거나 같은 항체.
  24. 제23항에 있어서, n이 4보다 크거나 같은 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 상기 제2 CC 중 적어도 하나가 항체의 불변 도메인의 C-말단에 연결되는 것인 항체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 불변 도메인이 CH3 도메인이고, 제1 CC가 제1 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되고, 제2 CC가 제2 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 것인 항체.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 연결이 절단가능한 링커 서열에 의한 것인 항체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위가 상기 제1 또는 상기 제2 CC 중 적어도 하나의 N-말단에 위치하는 것인 항체.
  29. N-말단에서 C-말단 방향으로
    Figure pct00026
    (화학식 III)으로 서로에 대해 위치하는 VL, CL, 테더, VH, CH1, CH2, 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 항체.
  30. 제29항에 있어서, 화학식 III의 제2 폴리펩티드를 추가로 포함하는 항체.
  31. 제1항 내지 제9항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체인 항체.
  32. 제31항에 있어서, 적어도 2개의 항원에 결합할 수 있는 항체.
  33. 제31항에 있어서, 동일한 항원 상의 적어도 2개의 에피토프에 결합할 수 있는 항체.
  34. 제1항 내지 제9항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인 항체.
  35. 제7항, 제10항, 제18항, 제29항, 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테더가 글리신 (G) 및 세린 (S) 잔기를 포함하는 것인 항체.
  36. 제7항, 제10항, 제18항, 제29항, 제30항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테더의 길이가 15 내지 50개 아미노산인 항체.
  37. 제36항에 있어서, 상기 테더의 길이가 20 내지 26개 아미노산인 항체.
  38. 제7항, 제10항, 제18항, 제29항, 제30항 및 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테더가 GGS 반복체를 포함하는 것인 항체.
  39. 제7항, 제10항, 제18항, 제29항, 제30항 및 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테더가 절단가능한 것인 항체.
  40. 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하는 돌연변이를 포함하는 항체.
  41. 제40항에 있어서, Lys-C 엔도펩티다제 절단 부위를 제거하는 상기 돌연변이가 힌지 도메인 내에 있는 것인 항체.
  42. 제41항에 있어서, K222A 치환 (EU 넘버링 시스템)을 갖는 항체.
  43. 제27항 또는 제39항에 있어서, 상기 테더 또는 상기 링커가 하기 엔도펩티다제: 푸린 (furin), 트롬빈, 게네나제, Lys-C, Arg-C, Asp-N, Glu-C, 인자 Xa, 담배 식각 바이러스 프로테아제 (TEV), 엔테로키나제, 인간 리노바이러스 C3 프로테아제 (HRV C3), 및 키니노게나제 중 하나 이상에 의해 절단가능한 것인 항체.
  44. 제27항 또는 제39항에 있어서, 상기 테더 또는 상기 링커가 아스파라긴-글리신 펩티드 결합을 포함하는 것인 항체.
  45. 제44항에 있어서, 상기 아스파라긴-글리신 펩티드 결합이 히드록실아민에 의해 절단가능한 것인 항체.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제에 접합된 불변 영역을 포함하는 항체.
  47. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포에 의해 발현되는 항체.
  48. 제47항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 CHO 세포인 항체.
  49. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 원핵 세포에 의해 발현되는 항체.
  50. 제49항에 있어서, 상기 원핵 세포가 이. 콜라이 세포인 항체.
  51. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 벡터를 포함하는 세포를 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 세포 또는 상기 배양 배지로부터 상기 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    (a) 상기 항체를 단백질 A를 포함하는 칼럼 상에 포획하고,
    (b) 상기 칼럼으로부터 상기 항체를 용리시키고,
    (c) 상기 용리된 항체를 무질서유발제 또는 연성 세제를 함유하는 용액 내로 희석하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  54. 항체를 무질서유발제 또는 연성 세제의 존재 하에 유지하는 것을 포함하는, 코일드 코일 함유 항체를 용액으로 유지시키는 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 무질서유발제 또는 연성 세제가 아르기닌, 구아니딘-HCl, 우레아, 과염소산리튬, 히스티딘, 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 트윈 (Tween), 트리톤 (Triton), 또는 NP-40인 방법.
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