TW202216756A

TW202216756A - 具細胞凋亡抗性之細胞株

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Publication number: TW202216756A
Application number: TW110122930A
Authority: TW
Inventors: 夏藍米沙海; 唐丹明; 艾咪申; 麥可萊德
Original assignee: 美商建南德克公司
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2022-05-01
Also published as: MX2022016453A; KR20230026491A; WO2021262783A1; CN115943158A; EP4172192A1; US20220041672A1; JP2023533217A; IL299161A; CA3184747A1

Abstract

本發明揭露涉及在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中具有穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變之真核細胞株。還提供產生此等細胞株之方法。本揭露亦涉及包含此等細胞株之組成物及細胞培養物，以及利用該等細胞、組成物及細胞培養物而產生產物之方法，該產物諸如為重組多肽或病毒載體。

Description

具細胞凋亡抗性之細胞株

本揭露涉及在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中具有穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變的真核細胞株。還提供產生此等細胞株之方法。本揭露亦涉及包含該等細胞之組成物及細胞培養物；以及產生諸如重組多肽或病毒載體等產物之方法；及該等細胞、組成物及細胞培養物在產生目標產物之方法中的用途。

已將單株抗體 (mAb) 及其他重組蛋白確立為用於許多疾病適應症 (包括免疫學適應症、腫瘤學適應症、神經科學適應症及其他者) 之成功治療劑 (例如參見 Reichert (2017) mAbs.9:167-181；Singh 等人 (2017) Curr. Clin. Pharmacol. 13:85-99)。隨著在生物技術產業中研發了超過 300 種 mAb，mAb 市場預計至 2020 年將擴展至 70 種 mAb 產物 (Ecker 等人 (2015) mAbs.7:9-14)。隨著產業擴展及目標變得更為複雜，需要更大規模之抗體研發活動來篩選多種 mAb 變異體及鑑別具有期望特性之臨床候選者。

真核細胞 (例如哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞) 已廣泛用於產生用於臨床應用之治療蛋白 (例如 mAb)，此乃因其能夠進行適當蛋白質摺疊、組裝及轉譯後修飾。然而，細胞培養及產生大量期望分子具有挑戰性。因此，期望提供用於進一步最佳化期望產物 (例如治療蛋白) 之產生之經改良的細胞及方法。

仍需要培養真核細胞株 (例如哺乳動物細胞株，例如 CHO 細胞株) 之最佳方法以產生目標產物 (例如重組多核苷酸或重組多肽)。已確定，在使用細胞株產生目標產物時，細胞展現高存活率較為有利 (例如提供較佳產物效價)。因此，需要細胞株 (包括哺乳動物細胞株，例如 CHO 細胞株) 具有抗細胞凋亡性以較其野生型對應體在生物反應器中提供較高生產力及較穩定性能。

為滿足該等及其他需求，本文提供在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中具有穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變的真核細胞株，例如哺乳動物細胞株 (例如 CHO 細胞株)。據此，本發明揭露涉及產生目標產物 (例如重組多核苷酸及/或重組多肽) 之方法、細胞及包含細胞之組成物，該等方法使用本發明揭露細胞。特定而言，本文所闡述之方法、細胞及組成物包括表現目標產物的經改良哺乳動物細胞，其中該等細胞 (例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞) 在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中具有穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。細胞及細胞株中之 Bax 及 Bak 基因下調或缺失減少了與不期望細胞凋亡活性有關之不期望效應，例如真核細胞之存活率及生產力降低。

在一方面，本發明揭露提供經分離真核細胞株，其中該細胞株在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。

在某些實施例中，細胞株在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型突變。

在某些實施例中，細胞株在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含缺失。

在某些實施例中，細胞株為動物細胞株或真菌細胞株。細胞株可為動物細胞株，例如哺乳動物細胞株。實例性哺乳動物細胞株包括雜交瘤細胞株、CHO 細胞株、COS 細胞株、VERO 細胞株、HeLa 細胞株、HEK 293 細胞株、PER-C6 細胞株、K562 細胞株、MOLT-4 細胞株、Ml 細胞株、NS-1 細胞株、COS-7 細胞株、MDBK 細胞株、MDCK 細胞株、MRC-5 細胞株、WI-38 細胞株、WEHI 細胞株、SP2/0 細胞株、BHK 細胞株 (包括 BHK-21 細胞株) 或其衍生物。細胞株可為 CHO 細胞株，例如 CHO K1 細胞株、CHO K1SV 細胞株、DG44 細胞株、DUKXB-11 細胞株、CHOK1S 細胞株或 CHO K1M 細胞株或其衍生物。細胞株可為真菌細胞株，例如酵母細胞株。

在某些實施例中，細胞株進一步包含病毒基因體及一個或多個編碼病毒衣殼之多核苷酸。

在某些實施例中，細胞株進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。

編碼目標產物之多核苷酸可在目標位置整合入細胞株的細胞基因體中。編碼目標產物之多核苷酸可隨機整合入細胞株的細胞基因體中。編碼目標產物之多核苷酸可為染色體外多核苷酸。編碼目標產物之多核苷酸可整合入細胞株之染色體中。

目標產物可為或可包含重組多肽。目標產物 (諸如重組多肽)可為或可包含抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。目標產物可為或可包含抗體。目標產物可為或可包含抗原。目標產物可為或可包含酵素。目標產物可為或可包含疫苗。

抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。抗體可由單一重鏈序列與單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。抗體可包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。抗體可包含單株抗體。

在某些實施例中，細胞株之比產率高於包含野生型 Bax 及 Bak 基因中之每一者之多核苷酸及功能性副本的相應經分離真核細胞株。

在某些實施例中，細胞株之抗細胞凋亡性大於包含 Bax 及 Bak 基因中之每一者之功能性副本的相應經分離真核細胞株。

在某些實施例中，將細胞株用於諸如饋料批式、灌流、程序強化灌流、半連續灌流或連續灌流等細胞培養程序中。舉例而言但不限於，細胞株可用於強化灌流程序中。

在另一方面，本發明揭露提供包含本發明之真核細胞株、例如第一方面之細胞株的組成物。組成物亦可包含細胞培養基。

在某些實施例中，將組成物用於諸如饋料批式、灌流、程序強化灌流、半連續灌流或連續灌流等細胞培養程序中。舉例而言但不限於，細胞培養程序可為強化灌流程序。

在另一方面，本發明揭露提供包含細胞培養基及複數個真核細胞之細胞培養物，其中複數個真核細胞中之每一細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。

在某些實施例中，將細胞培養物用於諸如饋料批式、灌流、程序強化灌流、半連續灌流或連續灌流等細胞培養程序。細胞培養程序可為強化灌流程序。

在某些實施例中，每一細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型突變。

在某些實施例中，複數個細胞中之每一細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含缺失。

在某些實施例中，細胞為動物細胞或真菌細胞。細胞可為動物細胞，例如哺乳動物細胞。實例性哺乳動物細胞包括雜交瘤細胞、CHO 細胞、COS 細胞、VERO 細胞、HeLa 細胞、HEK 293 細胞、PER-C6 細胞、K562 細胞、MOLT-4 細胞、Ml 細胞、NS-1 細胞、COS-7 細胞、MDBK 細胞、MDCK 細胞、MRC-5 細胞、WI-38 細胞、WEHI 細胞、SP2/0 細胞、BHK 細胞 (包括 BHK-21 細胞) 或其衍生物。細胞可為 CHO 細胞，例如 CHO K1 細胞、CHO K1SV 細胞、DG44 細胞、DUKXB-11 細胞、CHOK1S 細胞或 CHO K1M 細胞或其衍生物。細胞可為真菌細胞，例如酵母細胞。

在某些實施例中，細胞進一步包含病毒基因體及一個或多個編碼病毒衣殼之多核苷酸。

在某些實施例中，細胞培養物 (例如複數個細胞) 進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。

在某些實施例中，編碼目標產物之多核苷酸可在目標位置整合入細胞之細胞基因體中。在某些實施例中，編碼目標產物之多核苷酸可隨機整合入細胞之細胞基因體中。在某些實施例中，編碼目標產物之多核苷酸可為染色體外多核苷酸。在某些實施例中，編碼目標產物之多核苷酸可整合入細胞之染色體中。

在某些實施例中，目標產物可為或可包含重組多肽。在某些實施例中，目標產物 (諸如重組多肽)可為或可包含抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。目標產物可為或可包含抗體。在某些實施例中，目標產物可為或可包含抗原。在某些實施例中，目標產物可為或可包含酵素。在某些實施例中，目標產物可為或可包含疫苗。

在某些實施例中，抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體可由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。在某些實施例中，抗體可包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。抗體可包含單株抗體。

在某些實施例中，每一細胞皆進一步包含重組多核苷酸。

在另一方面，本揭露提供減小胞真核細胞中之細凋亡活性的方法，其包含向細胞投予基因工程系統。在某些實施例中，基因工程系統：(a) 敲落或剔除 Bax 多肽同功型之表現；且 (b) 敲落或剔除 Bak 多肽同功型之表現。

在某些實施例中，該方法進一步包含將真核細胞用於饋料批式、灌流、程序強化灌流、半連續灌流或連續灌流細胞培養程序中。真核細胞可用於強化細胞培養程序中。

在某些實施例中，基因工程系統係選自由以下所組成之群組：CRISPR/Cas 系統 (例如 CRISPR/Cas9 系統)、鋅指核酸酶 (ZFN) 系統、類轉錄活化因子核酸酶 (TALEN) 系統及其組合。基因工程系統可為 CRISPR/Cas 系統。基因工程系統可為 ZFN 系統。基因工程系統可為 TALEN 系統。

在某些實施例中，基因工程系統為或包含 CRISPR/Cas9 系統。CRISPR/Cas9 系統可包含：(a) Cas9 分子；(b) 至少一個第一導引 RNA (gRNA)，其包含與 Bax 基因中之目標序列互補的導向序列；及 (c) 至少一個第二 gRNA，其包含與 Bak 基因中之目標序列互補的導向序列。至少一個目標序列可為 Bax 基因之一部分。至少一個目標序列可為 Bak 基因之一部分。至少一個目標序列可為 Bax 基因之一部分，且至少另一目標序列可為 Bak 基因之一部分。

在某些實施例中，Bax 多肽之表現或 Bak 多肽之表現經剔除，且細胞之細胞凋亡活性相較於參考細胞之細胞凋亡活性係經降低。在一實施例中，Bax 多肽之表現及 Bak 多肽之表現經剔除，且細胞之細胞凋亡活性相較於參考細胞之細胞凋亡活性係經降低。

在某些實施例中，Bax 多肽之表現或 Bak 多肽之表現被敲落，且細胞之細胞凋亡活性相較於參考細胞之細胞凋亡活性係經降低。在一實施例中，Bax 多肽之表現或 Bak 多肽之表現被敲落，且細胞之細胞凋亡活性相較於參考細胞之細胞凋亡活性係經降低。

在某些實施例中，細胞凋亡活性小於參考細胞細胞中之凋亡活性 (舉例而言，細胞凋亡活性可小於參考細胞之細胞凋亡活性的約 80%、小於約 50% 或小於約 30%)。舉例而言，細胞凋亡活性可小於參考細胞之細胞凋亡活性的約 1% 至小於約 99%。可藉由比較在產生期期間所判定一群該等細胞之之存活率與一群該等參考細胞之之存活率來判定細胞的細胞凋亡活性。參考細胞可為包含 Bax 及 Bak 基因之野生型等位基因的細胞，舉例而言，參考細胞可為與細胞凋亡衰減性細胞之實質性區別僅在於參考細胞包含 Bax 及 Bak 基因之野生型等位基因的細胞。在一實施例中，較小細胞凋亡與細胞擁有高存活率相關。

在某些實施例中，細胞進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。

在某些實施例中，目標產物可為或可包含重組多肽。目標產物 (諸如重組多肽)可為或可包含抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。在某些實施例中，目標產物可為或可包含抗體。在某些實施例中，目標產物可為或可包含抗原。在某些實施例中，目標產物可為或可包含酵素。在某些實施例中，目標產物可為或可包含疫苗。

在某些實施例中，抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體可由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。在某些實施例中，抗體可包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。在某些實施例中，抗體可包含單株抗體。

在某些實施例中，每一細胞皆進一步包含重組多核苷酸。

在另一方面，本發明揭露提供產生重組多肽之方法。在某些實施例中，該方法包含在適於產生多肽之條件下培養真核細胞株。在某些實施例中，細胞株包含 (a) 在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中的穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變及 (b) 編碼重組多肽的多核苷酸。

在某些實施例中，編碼多肽之多核苷酸在目標位置整合入細胞株之細胞的細胞基因體中。在某些實施例中，編碼多肽之多核苷酸隨機整合入細胞株之細胞的細胞基因體中。

在某些實施例中，編碼多肽之多核苷酸係染色體外多核苷酸。在某些實施例中，編碼多肽之多核苷酸整合入細胞株之細胞的染色體中。

在某些實施例中，重組多肽可為或可包含抗體、抗原、酵素或疫苗。在某些實施例中，重組多肽可為或可包含抗體。在某些實施例中，重組多肽可為或可包含抗體融合蛋白。在某些實施例中，重組多肽可為或可包含抗原。在某些實施例中，重組多肽可為或可包含酵素。重組多肽可為或可包含疫苗。

在某些實施例中，該方法進一步包含分離重組多肽。分離通常包含自細胞株分離重組多肽。

在某些實施例中，在細胞培養基中培養細胞株。可在饋料批式培養條件或灌流培養條件下培養細胞株。可在饋料批式培養條件下培養細胞株。饋料批式培養條件可為強化饋料批式培養條件。可在灌流培養條件下培養細胞株。灌流培養條件可為半連續灌流。灌流培養條件可為連續灌流。

在另一方面，本發明揭露提供產生病毒載體之方法。在某些實施例中，該方法包含在適於產生病毒載體之條件下培養真核細胞株。在某些實施例中，在適於產生病毒載體之條件下，細胞株包含 (a) 在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中的穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變、(b) 病毒基因體及 (c) 一個或多個編碼病毒衣殼之多核苷酸。

在某些實施例中，該方法進一步包含分離病毒載體。分離通常包含自細胞株分離病毒載體。

在另一方面，本揭露提供產生重組多肽之方法，其包含根據第四方面之減小細胞凋亡活性的方法，隨後根據第五方面之方法產生重組多肽。

在另一方面，本揭露提供產生病毒載體之方法，其包含根據第四方面之減小細胞凋亡活性之方法，隨後根據第六方面之方法產生病毒載體。

在另一方面，本揭露提供第一方面之經分離真核細胞株用於產生目標產物的用途，該細胞株包含編碼目標產物之多核苷酸。該用途可進一步包含分離目標產物。

在另一方面，本揭露提供第二方面之組成物用於產生目標產物的用途，其中該組成物之細胞株包含編碼目標產物之多核苷酸。該用途可進一步包含分離目標產物。

在另一方面，本揭露提供第三方面之細胞培養物用於產生目標產物的用途，其中該細胞培養物之複數個真核細胞進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。該用途可進一步包含分離目標產物。

在另一方面，本揭露提供第一方面之細胞株、第二方面之組成物或第三方面之細胞培養物在細胞培養程序中的用途。細胞培養程序可為或可包含饋料批式、灌流、程序強化灌流、半連續灌流或連續灌流細胞培養程序。細胞培養程序可包含強化灌流程序。

相關申請之交叉引用

本申請案主張 2020 年 6 月 24 日所申請之美國臨時申請案第 63/043,545 號及 2021 年 6 月 15 日所申請之美國臨時申請案第 63/210,640 號之優先權，該等申請案之內容以全文引用方式併入本文中。

在本說明書的整個說明和申請專利範圍中，字詞「包含」和「含有」以及它們的變化型意指「包括但不限於」，且它們無意於（也不）排除其他部分、添加劑、組分、整體或步驟。在本說明書的整個說明和申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則單數包含複數的意思。特別是，如果使用不定冠詞，除非上下文另有要求，否則本說明書應被理解為涵蓋複數型以及單數型。

結合本發明之特定方面、實施例或實例闡述之特徵、整體、特性、化合物、化學部分或基團應理解為適用於本文所闡述之任何其他方面、實施例或實例，除非與之不相容。本說明書中所揭示之所有特徵（包括任何隨附申請專利範圍、摘要及圖式）及/或如此揭示之任何方法或程序之所有步驟可以任何組合形式組合，惟此類特徵及/或步驟中之至少一些相互排斥之組合除外。本發明不限於任何所揭示實施例之細節。本發明擴展至本說明書（包括任何隨附申請專利範圍、摘要及圖式）中所揭示之特徵之任何新穎特徵或任何新穎組合或擴展至如此揭示之任何方法或程序之步驟的任何新穎步驟或任何新穎組合。

應注意與本說明書同時或先前所呈送的與本申請案有關且與本說明書一起供公開檢閱的所有論文和文件，且所有這些論文和文件的內容，均以引用方式併入本文中。

本文所引用之所有參考文獻 (包括專利申請案、專利公開案、非專利文獻及 UniProtKB/Swiss-Prot 登錄號) 之全部內容皆以引用方式併入本文中，如同各個別參考文獻特定地且個別地指出以引用之方式併入一般。

為避免疑問，在此陳述，本說明書先前在標題「先前技術」下所揭示之資訊與本發明相關且應理解為本發明之揭示內容的一部分。

為清楚起見但並不加以限制，本發明所揭示標的物之詳細說明分成下列子部分： 5.1定義； 5.2調節 BAX 及 BAK 表現之方法 5.3細胞株； 5.4細胞培養物； 5.5產生方法；及 5.6產物。 5.1. 定義

以下對術語和方法的解釋是提供以更佳地描述本揭露，並指導所屬技術領域中具有通常知識者實施本揭露。

如本文中所使用，術語「約」或「大約」係指特定值處於如由熟習此項技術者所確定之特定值的可接受誤差範圍內，其部分地取決於如何測量或判定該值，亦即取決於測量系統的侷限性。舉例而言，根據業內之實踐，「約」可意指 3 倍或 3 倍以上的標準偏差。或者，「約」可意指給定值的至多 20%、最佳至多 10%、更佳至多 5% 且更佳至多 1% 的範圍。可替代地，特別是關於生物系統或過程，該術語意指數值的一個數量級內，最佳地在數值的 5 倍以內，並且更佳地在數值的 2 倍以內。

如本文中所使用，「多肽」及「蛋白質」可互換使用且通常係指具有約 10 個以上由肽鍵連接之共價附接之胺基酸的肽及蛋白質。術語蛋白質涵蓋經純化天然產物或可部分地或完全使用重組或合成技術產生之產物。術語肽及蛋白質可係指諸如二聚體或其他多聚體等蛋白質之聚集體、融合蛋白、蛋白質變異體或其衍生物。該術語亦包括蛋白質修飾，例如藉由醣基化、乙醯化、磷酸化、聚乙二醇化、泛素化等修飾之蛋白質。蛋白質可包含不由核酸密碼子編碼之胺基酸。蛋白質可具有足夠長以產生較高含量之三級及/或四級結構的胺基酸序列。本文之典型蛋白質可具有至少約 15-20 kD、較佳地至少約 20 kD 之分子量。涵蓋於本文定義內之蛋白質之實例包括所有哺乳動物蛋白 (尤其治療蛋白及診斷蛋白，例如治療抗體及診斷抗體) 及通常含有一個或多個二硫鍵的蛋白質 (包括含有一個或多個鏈間及/或鏈內二硫鍵之多鏈多肽)。

「蛋白質修飾」或「蛋白質突變」係指多肽序列中之胺基酸取代、插入及/或缺失或以化學方式連接至蛋白質之部分的改變。例如，修飾可為接附於蛋白質的改變的碳水化合物或 PEG 結構。本發明蛋白質可包括至少一個此類蛋白質修飾。

術語「經修飾蛋白」或「經突變蛋白」涵蓋具有至少一個胺基酸取代、插入及/或缺失之蛋白質。經修飾或突變蛋白可具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個或更多個胺基酸修飾 (選自取代、插入、缺失及其組合)。

本文所用之術語「抗體」涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體 (例如由單一重鏈序列及單一輕鏈序列組成之抗體，包括該等配對之多聚體)、多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可。

本文所用之術語「抗體片段」、抗體之「抗原結合部分」 (或簡稱為「抗體部分」) 或抗體之「抗原結合片段」係指除完整抗體外的分子，其包含完整抗體中結合完整抗體之結合抗原的部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；二價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 scFv 及 scFab)；單域抗體 (dAb)；及自抗體片段所形成的多特異性抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Holliger 及 Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。

術語「嵌合」抗體意指其中重鏈及/或輕鏈的一部分衍生自特定來源或物種而重鏈及/或輕鏈的其餘部分衍生自不同來源或物種的抗體。

術語「人類抗體」意指具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或衍生自利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體的胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。

術語「人源化抗體」意指包含來自非人類 CDR 之胺基酸殘基及來自人類 FR 之胺基酸殘基的嵌合抗體。在實例中，人源化抗體將包含實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 CDR 對應於非人類抗體之彼等，且所有或實質上所有 FR 對應對於人類抗體之彼等。人源化抗體視情況可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」是指已經歷人源化之抗體。

術語「單株抗體」意指自一群實質上同源抗體獲得之抗體，亦即群體中包含的個別抗體係相同的及/或結合相同表位，但不包含例如含有天然突變或產生於單株抗體製劑產生期間的可能的變異體抗體，該等變異體通常係以少量存在。與典型地包括針對不同決定子 (抗原決定基) 之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本發明所揭示標記物的單株抗體可藉由多種技術來製得，包括但不限於雜交瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體顯示方法及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物的方法，本文闡述該等方法及用於製備單株抗體之其他實例性方法。

術語「可變區」或「可變域)」意指參與抗體與抗原之結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性框架區 (FR) 及三個高度可變區 (HVR)。（參見例如，Kindt 等人，Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007)。）單一 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。另外，可使用 VH 或 VL 域自結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體以分別篩選互補 VL 或 VH 域的庫。例如參見 Portolano 等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson 等人，Nature 352:624-628 (1991)。

如本文所用，術語「高度可變區」或「HVR」是指抗體可變域中序列高度可變並決定抗原結合特異性的各個區，例如「互補決定區」(「CDR」)。通常，抗體包括六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，及三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2) 及 96-101 (H3) 處之超變環 (Chothia 及 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b) 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3) 處之 CDR (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991))；及 (c) 存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2) 及 93-101 (H3) 處之抗原觸點 (MacCallum 等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))。

根據 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1991) 來判定 CDR。亦可根據 Chothia 及 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)、MacCallum 等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) 或任何其他科學上公認之命名系統來判定 CDR 名稱。

與抗體相關之「種類」意指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且該等種類中之若干者可進一步分成子類 (同型)，例如 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 及 IgA2。抗體可為 IgG1同型。抗體可為 IgG2 同型。對應於不同種類之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 a、d、e、g 及 m。基於恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。

術語「核酸分子」或「多核苷酸」意指任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸係由鹼基、具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (亦即胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (亦即去氧核糖或核糖) 及磷酸基構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中所述鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常自 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋：脫氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 及基因體 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個該等分子的混合聚合物。核酸分子可為線性或環狀的。另外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然核苷酸的實例包括帶有衍生糖、磷酸鹽骨架鍵結或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子亦涵蓋適於在活體外及/或活體內、例如在宿主或患者中直接表現本揭露抗體的載體的 DNA 及 RNA 分子。此等 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可以是未修飾的或經過修飾的。舉例而言，mRNA 可經化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或編碼分子之表現，從而將 mRNA 注入個體中以在活體內生成抗體 (例如參見 Stadler 等人，Nature Medicine 2017，線上公開於 2017 年 6 月 12 日，doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1)。除非上下文另外需要，否則術語「載體」意指能夠轉運已連接之另一核酸之核酸分子。

術語意指生物組分 (例如核酸分子或蛋白質) 已自存在天然組分之生物體之細胞中之其他生物組分 (亦即其他染色體及染色體外 DNA 及 RNA 以及蛋白質) 實質上分離或純化。已「經分離」之核酸及蛋白質包括藉由標準純化方法純化的核酸及蛋白質。該術語亦涵蓋藉由重組表現於宿主細胞中來製得之核酸及蛋白質以及以化學方式合成的核酸、蛋白質及肽。

純化：術語純化無需絕對純度；而係，其意欲作為相對術語。因此，舉例而言，純化產物係其中產物 (例如多肽或蛋白質) 之富集程度大於產物在細胞內之其環境中的富集程度者，從而該產物與可伴隨其之細胞組分 (核酸、脂質、碳水化合物及 [其他] 多肽) 實質上分離。

在一實例中，在至少 50 重量 % 之樣品係由產物構成時、例如在至少 60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、98% 或 99% 或更多之樣品係由多肽構成時，本揭露之目標產物 (例如多肽，例如抗體) 係經純化的。可用於純化多肽之方法之實例包括但不限於揭示於以下文獻中的方法：Sambrook 等人 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, Ch. 17)。可藉由例如高壓液相層析或其他習用方法來判定蛋白質純度。

術語「效價」意指由細胞培養物所產生目標產物 (例如重組多肽，例如抗體) 之總量除以培養基體積的既定量。通常以毫克抗體/毫升或公升培養基 (mg/ml 或 mg/L) 之單位來表示效價。在某些實施例中，以克抗體/公升培養基 (g/L) 形式來表示效價。可以相對測量形式來表示或評價效價，例如與在不同培養條件下獲得蛋白質產物相比之效價增加百分比。

術語「序列同一性」：兩個或更多個核酸序列或兩個或更多個胺基酸序列之間之一致性係以該等序列之間的一致性或類似性形式來表示。可以一致性百分比形式來測量序列同一性；百分比愈高，則序列同一性愈高。一致性百分比係在整個序列長度中所計算。在使用標準方法比對時，核酸或胺基酸序列之同系物或直向同源物擁有相對較高之序列同一性程度。在直向同源蛋白質或 cDNA 係衍生自關係較近物種時 (例如人類序列及小鼠序列)，與關係較遠物種 (例如人類序列及 C線蟲 (C.elegan) 序列) 相比，此同源性更為顯著。

本文所用之術語「細胞」包括所提及之真核細胞。除非上下文另有要求，涉及一細胞可包括涉及複數個（細胞）。真核細胞可為動物細胞 (例如哺乳動物細胞) 或真菌細胞 (例如酵母細胞)。真核細胞可為哺乳動物細胞，如融合瘤細胞、CHO 細胞、COS 細胞、VERO 細胞、HeLa 細胞、HEK 293 細胞、PER-C6 細胞、K562 細胞、MOLT-4 細胞、Ml 細胞、NS-1 細胞、COS-7 細胞、MDBK 細胞、MDCK 細胞、MRC-5 細胞、WI-38 細胞、WEHI 細胞、SP2/0 細胞、BHK 細胞（包括 BHK-21 細胞）及其衍生物。CHO 細胞可為 (例如) CHO K1 細胞、CHO K1SV 細胞、DG44 細胞、DUKXB-11 細胞、CHOK1S 細胞、CHO K1M 細胞及其衍生物。

本文所用之術語「細胞株」包括所提及之可重複繁殖之真核細胞的培養物。該細胞株之真核細胞可選自如本文所定義之任何細胞。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可在本文中互換使用且係指已向其中引入外源核酸的細胞，其包括該等細胞的子代。宿主細胞包括「轉形體」和「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代之核酸含量未必與親代細胞完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉形細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。

本文所用之術語「哺乳動物宿主細胞」或「哺乳動物細胞」係指自哺乳動物的細胞及細胞株，該等細胞及細胞株以單層培養物或懸浮培養物形式置於含有適當營養素及生長因子的培養基中時能夠生長及存活。必要的某一特定細胞株的生長因子易於根據經驗判定，而無需進行過多的實驗，如例如在哺乳動物細胞培養中所闡述 (Mather, J.P.編輯，Plenum Press, N.Y.1984)；以及 Barnes 及 Sato, (1980) Cell, 22:649。通常，細胞能夠表現及分泌大量的特定所關注蛋白質 (例如醣蛋白) 至培養基中。適宜哺乳動物宿主細胞之實例包括中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO, Urlaub 及 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980)；dp12.CHO 細胞 (EP 307,247，公開於 1989 年 3 月 15 日)；CHO-K1 (ATCC, CCL-61)；藉由 SV40 轉變之猴腎 CV1 細胞株 (COS-7, ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎細胞株 (293 細胞或經亞克隆以在懸浮培養中生長之 293 細胞，Graham 等人，J. Gen Virol., 36:59 1977)；幼倉鼠腎細胞 (BHK, ATCC CCL 10)；小鼠支持細胞 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980)；猴腎細胞 (CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠色猴腎細胞 (VERO-76, ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2)；犬類腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34)；布法羅大鼠 (buffalo rat) 肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人類肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；人類肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；小鼠乳房腫瘤 (MMT 060562, ATCC CCL51)；TRI 細胞 (Mather 等人， Annals N.Y.Acad. Sci., 383:44-68 [1982])；MRC 5 細胞；FS4 細胞；及人肝癌細胞株 (Hep G2)。哺乳動物細胞可包括中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO, Urlaub及 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980)；dp12.CHO 細胞 (EP 307,247，公開於 1989 年 3 月 15 日)。

術語「雜交瘤」意指藉由融合免疫來源之永生細胞株及抗體產生細胞所產生的雜合細胞株。該術語涵蓋異源雜合骨髓瘤融合體之子代，該等融合體係融合人類細胞及鼠類骨髓瘤細胞株且隨後與漿細胞 (通常稱為三源雜交瘤細胞株) 融合之結果。另外，該術語意欲包括產生抗體之任何永生化雜合細胞株，例如四源雜交瘤。例如參見 Milstein 等人，Nature, 537:3053 (1983)。

本文所用之術語「細胞培養基」係指用於培養細胞的營養液。「細胞培養進料」和「細胞培養添加劑」代表可添加到細胞培養基中以改善培養基性能的營養補充劑。例如，在細胞的批量培養過程中，可將細胞培養進料和/或細胞培養添加劑添加到細胞培養基中。細胞培養基可以是化學性界定的，也可以包含未界定的組分。用於例如哺乳動物細胞之細胞培養基通常包含至少一種來自下列類別中之一者或多者的組分： 1) 能量源，通常呈碳水化合物形式，例如葡萄糖； 2) 所有必需胺基酸，且通常係 20 種胺基酸加上半胱胺酸的基本組； 3) 所需濃度較低之維他命及/或其他有機化合物； 4) 游離脂肪酸；及 5) 微量元素，其中微量元素定義為所需濃度通常極低且通常在微莫耳濃度範圍內之無機化合物或天然元素。

細胞培養基及類似營養素溶液可視情況補充有一種或多種來自下列類別中之任一者的組分： 1) 激素及其他生長因子，例如胰島素、轉鐵蛋白及表皮生長因子； 2) 鹽及緩衝劑，例如鈣、鎂及磷酸鹽； 3) 核苷及鹼基，例如腺苷、胸苷及次黃嘌呤；及 4) 蛋白質及組織水解產物。

如本文中所使用，「化學性界定」培養基是指其中每一種成分都是已知的培養基。化學性界定培養基有別於血清、胚胎萃取物、和水解物，其中每一者均含有未知組分。本揭露之細胞培養基可為化學性界定培養基。本揭露之細胞培養進料可為化學性界定的。本揭露之細胞培養添加劑可為化學性界定的。

如本文中所使用，「未界定培養基」或「包含未界定組分的培養基」包括指包含一種或多種未知成分的培養基。未界定組分可以由例如血清、蛋白腖、水解物（如酵母、植物或血清水解物）和胚胎萃取物提供。

術語「培養」係指使一種或多種細胞與細胞培養基在適於存活及/或生長及/或增殖細胞之條件下接觸。

術語「批式培養」係其中所有用於細胞培養的組分 (包括細胞及所有培養營養素) 皆在培養過程開始時供應至培養生物反應器中的培養。

本文所用之術語「饋料批式細胞培養」係指如下批式培養：首先將細胞及培養基供應至培養生物反應器中，且在培養過程期間連續或不連續地將額外的培養營養素供給至培養物中，在培養結束之前進行或不進行定期的細胞及/或產物收穫。

術語「灌流培養」有時稱為連續培養，其係如下培養：藉由例如過濾、囊封、錨定至微載體等將細胞限制於培養物中，且在培養生物反應器中連續、逐步或間歇性地引入 (或該等方式之任何組合) 及去除培養基。

術語細胞培養的「生長期」係指細胞通常迅速分裂的指數細胞生長時期 (對數期)。細胞維持於生長期之持續時間基於例如細胞類型、細胞生長速率及/或培養條件有所變化。在此時期期間，將細胞培養一段時間、例如 1-4 天，並在使細胞生長最大化的條件下進行。可以針對所設想的特定宿主細胞確定宿主細胞的生長週期，而無需進行過多的實驗。「時間段及在使細胞生長最大化的條件下」等係指對於特定細胞株而言判斷為對於細胞生長及分裂而言最佳的彼等培養條件。對於生長期期間之某些細胞培養 (例如關於哺乳動物細胞) 而言，在含有所需添加劑之營養素培養基中通常於約 30℃-40℃ 下在加濕、受控氣氛下培養細胞，從而達成特定細胞株之最佳生長。細胞可在生長期中維持約一天至四天之時段，通常介於兩天至三天之間。

術語細胞培養的「過渡期」係指產生期的培養條件所涉及的時間段。在過渡階段，環境因素諸如細胞培養物的溫度、介質滲透壓等，從生長條件轉移到生產條件。

術語細胞培養的「產生期」係指細胞生長穩定的時間段。對數細胞生長在此時期之前或期間通常有所降低且代之以蛋白質產生。在產生期期間，對數細胞生長已結束，且主要產生產物 (例如多肽)。在此時間段期間，通常補充培養基以支持持續的蛋白質產生並獲得期望產物 (其可為醣蛋白)。饋料批式及/或灌流細胞培養程序在此時期期間補充細胞培養基或提供新鮮培養基以達成及/或維持期望細胞密度、存活率及/或重組蛋產物效價。產生期可大規模實施。

本文所用之術語「表現 (expression 或 expresses)」係指發生於宿主細胞內的轉錄及轉譯。產物基因在宿主細胞中的表現程度可基於存在於細胞中的相應 mRNA 的量或由藉由該細胞產生之產物基因編碼的蛋白質的量來判定。舉例而言，可藉由北方雜交來量化自產物基因轉錄的 mRNA。Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。由產物基因編碼的蛋白質可藉由檢定蛋白質的生物活性或藉由採用獨立於該活性的檢定來量化，例如使用能夠與蛋白質反應的抗體進行西方墨點或放射免疫檢定。Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。

術語「細胞密度」係指既定體積之培養基中的細胞數量。在某些實施例中，期望高細胞密度，此乃因其可產生較高蛋白質生產力。可藉由業內已知之任何技術來監測細胞密度，包括但不限於自培養物提取樣品並在顯微鏡下分析細胞，使用市售細胞計數裝置，或藉由使用引入生物反應器本身中 (或引入培養基及懸浮細胞會通過且然後返回生物反應器之環中) 之市售適宜探針。 5.2. 調節 BAX 及 BAK 表現之方法

本文提供藉由採用基因工程系統來減小真核細胞中之細胞凋亡活性的方法，該基因工程系統調節 (亦即敲落或剔除) (a) Bax 多肽同功型之表現及 (b) Bak 多肽同功型之表現。此亦在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中提供穩定整合功能喪失型突變或穩定功能衰減型突變，其係藉由將突變引入容許將功能喪失型突變或功能衰減型突變穩定整合入真核宿主細胞中之任何真核宿主細胞中來達成。容許穩定整合入之真核宿主細胞可藉由各種方法生成，包括目標整合 (TI) (例如如 WO 2019/126634 中所闡述)、隨機整合 (RI) 或轉座酶調介性整合。業內已知之各種基因工程系統皆可用於該功能喪失型或功能衰減型改造。該等改造系統之非限制性實例包括 CRISPR/Cas 系統、鋅指核酸酶 (ZFN) 系統、類轉錄活化因子核酸酶 (TALEN) 系統。業內已知之任何 CRISPR/Cas 系統 (包括傳統、增強或改良 Cas 系統以及其他基於細菌之基因體切除工具 (例如 Cpf-1)) 皆可用於本文所揭示之方法中。

在某些實施例中，本發明揭露細胞可減小或消除 BAX 表現。在某些實施例中，本文所用之 BAX 係指真核 BAX 細胞蛋白，例如 CHO BAX 細胞蛋白 (Entrez 基因編號：100689032；基因庫編號：EF104643.1) 及其功能變異體。在某些實施例中，本文所用之 BAX 之功能變異體涵蓋與用於產生目標重組產物之經修飾細胞之野生型 BAX 序列具有 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 一致性的 BAX 序列變異體。

在某些實施例中，本發明揭露細胞可減小或消除 BAK 表現。在某些實施例中，本文所用之 BAK 係指真核 BAK 細胞蛋白，例如 CHO BAK 細胞蛋白 (基因庫編號：EF104644.1) 及其功能變異體。在某些實施例中，本文所用之 BAK 之功能變異體涵蓋與用於產生目標重組產物之經修飾細胞之野生型 BAK 序列具有 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 一致性的 BAK 序列變異體。

可缺失 Bax 基因及/或 Bak 基因中之每一者之整個基因或一部分以調節 (例如敲落或剔除) Bax 多肽及/或 Bak 多肽的表現。可缺失至少約 2%、至少約 5%、至少約 10%、至少約 15%、至少約 20%、至少約 25%、至少約 30%、至少約 35%、至少約 40%、至少約 45%、至少約 50%、至少約 55%、至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約 75%、至少約 80%、至少約 85% 或至少約 90% 之 Bax 基因。可缺失至少約 2%、至少約 5%、至少約 10%、至少約 15%、至少約 20%、至少約 25%、至少約 30%、至少約 35%、至少約 40%、至少約 45%、至少約 50%、至少約 55%、至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約 75%、至少約 80%、至少約 85% 或至少約 90% 之 Bak 基因。可缺失至少約 2%、至少約 5%、至少約 10%、至少約 15%、至少約 20%、至少約 25%、至少約 30%、至少約 35%、至少約 40%、至少約 45%、至少約 50%、至少約 55%、至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約 75%、至少約 80%、至少約 85% 或至少約 90% 之 Bax 基因及 Bak 基因中之每一者。

可缺失不超過約 2%、不超過約 5%、不超過約 10%、不超過約 15%、不超過約 20%、不超過約 25%、不超過約 30%、不超過約 35%、不超過約 40%、不超過約 45%、不超過約 50%、不超過約 55%、不超過約 60%、不超過約 65%、不超過約 70%、不超過約 75%、不超過約 80%、不超過約 85% 或不超過約 90% 之 Bax 基因。可缺失不超過約 2%、不超過約 5%、不超過約 10%、不超過約 15%、不超過約 20%、不超過約 25%、不超過約 30%、不超過約 35%、不超過約 40%、不超過約 45%、不超過約 50%、不超過約 55%、不超過約 60%、不超過約 65%、不超過約 70%、不超過約 75%、不超過約 80%、不超過約 85% 或不超過約 90% 之 Bak 基因。可缺失不超過約 2%、不超過約 5%、不超過約 10%、不超過約 15%、不超過約 20%、不超過約 25%、不超過約 30%、不超過約 35%、不超過約 40%、不超過約 45%、不超過約 50%、不超過約 55%、不超過約 60%、不超過約 65%、不超過約 70%、不超過約 75%、不超過約 80%、不超過約 85% 或不超過約 90% 之 Bax 基因及 Bak 基因中之每一者。

在某些實例中，可缺失介於約 2% 與約 90% 之間、介於約 10% 與約 90% 之間、介於約 20% 與約 90% 之間、介於約 25% 與約 90% 之間、介於約 30% 與約 90% 之間、介於約 40% 與約 90% 之間、介於約 50% 與約 90% 之間、介於約 60% 與約 90% 之間、介於約 70% 與約 90% 之間、介於約 80% 與約 90% 之間、介於約 85% 與約 90% 之間、介於約 2% 與約 80% 之間、介於約 10% 與約 80% 之間、介於約 20% 與約 80% 之間、介於約 30% 與約 80% 之間、介於約 40% 與約 80% 之間、介於約 50% 與約 80% 之間、介於約 60% 與約 80% 之間、介於約 70% 與約 80% 之間、介於約 75% 與約 80% 之間、介於約 2% 與約 70% 之間、介於約 10% 與約 70% 之間、介於約 20% 與約 70% 之間、介於約 30% 與約 70% 之間、介於約 40% 與約 70% 之間、介於約 50% 與約 70% 之間、介於約 60% 與約 70% 之間、介於約 65% 與約 70% 之間、介於約 2% 與約 60% 之間、介於約 10% 與約 60% 之間、介於約 20% 與約 60% 之間、介於約 30% 與約 60% 之間、介於約 40% 與約 60% 之間、介於約 50% 與約 60% 之間、介於約 55% 與約 60% 之間、介於約 2% 與約 50% 之間、介於約 10% 與約 50% 之間、介於約 20% 與約 50% 之間、介於約 30% 與約 50% 之間、介於約 40% 與約 50% 之間、介於約 45% 與約 50% 之間、介於約 2% 與約 40% 之間、介於約 10% 與約 40% 之間、介於約 20% 與約 40% 之間、介於約 30% 與約 40% 之間、介於約 35% 與約 40% 之間、介於約 2% 與約 30% 之間、介於約 10% 與約 30% 之間、介於約 20% 與約 30% 之間、介於約 25% 與約 30% 之間、介於約 2% 與約 20% 之間、介於約 5% 與約 20% 之間、介於約 10% 與約 20% 之間、介於約 15% 與約 20% 之間、介於約 2% 與約 10% 之間、介於約 5% 與約 10% 之間或介於約 2% 與約 5% 之間的 Bax 基因。在某些實例中，可缺失介於約 2% 與約 90% 之間、介於約 10% 與約 90% 之間、介於約 20% 與約 90% 之間、介於約 25% 與約 90% 之間、介於約 30% 與約 90% 之間、介於約 40% 與約 90% 之間、介於約 50% 與約 90% 之間、介於約 60% 與約 90% 之間、介於約 70% 與約 90% 之間、介於約 80% 與約 90% 之間、介於約 85% 與約 90% 之間、介於約 2% 與約 80% 之間、介於約 10% 與約 80% 之間、介於約 20% 與約 80% 之間、介於約 30% 與約 80% 之間、介於約 40% 與約 80% 之間、介於約 50% 與約 80% 之間、介於約 60% 與約 80% 之間、介於約 70% 與約 80% 之間、介於約 75% 與約 80% 之間、介於約 2% 與約 70% 之間、介於約 10% 與約 70% 之間、介於約 20% 與約 70% 之間、介於約 30% 與約 70% 之間、介於約 40% 與約 70% 之間、介於約 50% 與約 70% 之間、介於約 60% 與約 70% 之間、介於約 65% 與約 70% 之間、介於約 2% 與約 60% 之間、介於約 10% 與約 60% 之間、介於約 20% 與約 60% 之間、介於約 30% 與約 60% 之間、介於約 40% 與約 60% 之間、介於約 50% 與約 60% 之間、介於約 55% 與約 60% 之間、介於約 2% 與約 50% 之間、介於約 10% 與約 50% 之間、介於約 20% 與約 50% 之間、介於約 30% 與約 50% 之間、介於約 40% 與約 50% 之間、介於約 45% 與約 50% 之間、介於約 2% 與約 40% 之間、介於約 10% 與約 40% 之間、介於約 20% 與約 40% 之間、介於約 30% 與約 40% 之間、介於約 35% 與約 40% 之間、介於約 2% 與約 30% 之間、介於約 10% 與約 30% 之間、介於約 20% 與約 30% 之間、介於約 25% 與約 30% 之間、介於約 2% 與約 20% 之間、介於約 5% 與約 20% 之間、介於約 10% 與約 20% 之間、介於約 15% 與約 20% 之間、介於約 2% 與約 10% 之間、介於約 5% 與約 10% 之間或介於約 2% 與約 5% 之間的 Bak 基因。在某些實例中，可缺失介於約 2% 與約 90% 之間、介於之間約 10% 與約 90% 之間、介於之間約 20% 與約 90% 之間、介於之間約 25% 與約 90% 之間、介於之間約 30% 與約 90% 之間、介於之間約 40% 與約 90% 之間、介於之間約 50% 與約 90% 之間、介於之間約 60% 與約 90% 之間、介於之間約 70% 與約 90% 之間、介於之間約 80% 與約 90% 之間、介於之間約 85% 與約 90% 之間、介於之間約 2% 與約 80% 之間、介於之間約 10% 與約 80% 之間、介於之間約 20% 與約 80% 之間、介於之間約 30% 與約 80% 之間、介於之間約 40% 與約 80% 之間、介於之間約 50% 與約 80% 之間、介於之間約 60% 與約 80% 之間、介於之間約 70% 與約 80% 之間、介於之間約 75% 與約 80% 之間、介於之間約 2% 與約 70% 之間、介於之間約 10% 與約 70% 之間、介於之間約 20% 與約 70% 之間、介於之間約 30% 與約 70% 之間、介於之間約 40% 與約 70% 之間、介於之間約 50% 與約 70% 之間、介於之間約 60% 與約 70% 之間、介於之間約 65% 與約 70% 之間、介於之間約 2% 與約 60% 之間、介於之間約 10% 與約 60% 之間、介於之間約 20% 與約 60% 之間、介於之間約 30% 與約 60% 之間、介於之間約 40% 與約 60% 之間、介於之間約 50% 與約 60% 之間、介於之間約 55% 與約 60% 之間、介於之間約 2% 與約 50% 之間、介於之間約 10% 與約 50% 之間、介於之間約 20% 與約 50% 之間、介於之間約 30% 與約 50% 之間、介於之間約 40% 與約 50% 之間、介於之間約 45% 與約 50% 之間、介於之間約 2% 與約 40% 之間、介於之間約 10% 與約 40% 之間、介於之間約 20% 與約 40% 之間、介於之間約 30% 與約 40% 之間、介於之間約 35% 與約 40% 之間、介於之間約 2% 與約 30% 之間、介於之間約 10% 與約 30% 之間、介於之間約 20% 與約 30% 之間、介於之間約 25% 與約 30% 之間、介於之間約 2% 與約 20% 之間、介於之間約 5% 與約 20% 之間、介於之間約 10% 與約 20% 之間、介於之間約 15% 與約 20% 之間、介於之間約 2% 與約 10% 之間、介於之間約 5% 與約 10% 之間或介於約 2% 與約 5% 之間的 Bax 基因及 Bak 基因中之每一者。

可採用 CRISPR/Cas9 系統來調節 Bax 多肽及/或 Bak 多肽之表現。成簇規律間隔短回文重複 (CRISPR) 系統係發現於原核細胞中之一種基因體編輯工具。在用於基因體編輯時，該系統包括 Cas9 (能夠利用 crRNA 作為其嚮導來修飾 DNA 之一種蛋白質)、CRISPR RNA (crRNA，其含有用於 Cas9 以將其導引至宿主 DNA 之正確片段以及結合至 tracrRNA (通常呈髮夾迴紋式) 以形成含有 Cas9 之活性複合物之區域中的 RNA) 及反式活化 crRNA (tracrRNA，其結合至 crRNA 且與 Cas9 形成活性複合物)。術語「導引 RNA」及「gRNA」係指促進 RNA-導引核酸酶(例如 Cas9) 與目標序列 (例如細胞中之基因體或游離序列) 之特異性締合 (或「導向」) 的任何核酸。gRNA 可為單分子 (包含單一 RNA 分子，且替代地稱為嵌合)或模組 (包含一個以上及通常兩個通常例如藉由雙鏈化彼此締合之單獨 RNA 分子，例如 crRNA 及 tracrRNA)。CRISPR/Cas9策略可採用載體來轉染哺乳動物細胞。可為每一應用設計導引 RNA (gRNA)，此乃因此 Cas9 使用此序列來鑑別細胞中之目標 DNA 且直接結合。多個 crRNA 及 tracrRNA 可包裝至一起以形成單導引 RNA (sgRNA)。sgRNA 可與 Cas9 基因接合至一起且製成載體以轉染至細胞中。

用於調節一種或多種 Bax 多肽及/或 Bak 多肽之表現之CRISPR/Cas9 系統可包含 Cas9 分子及一個或多化 gRNA，該等 gRNA 包含與 Bax 基因及/或 Bak 基因之目標序列互補的導向域。目標基因可為 Bax 基因及/或 Bak 基因之區域。目標序列由此可為 Bax 基因內之任何外顯子或內含子區，舉例而言，其導向可消除或減小 Bax 多肽之表現。目標序列由此可為 Bak 基因內之任何外顯子或內含子區，舉例而言，其導向可消除或減小 Bak 多肽之表現。

可將 gRNA 以單一載體形式投予細胞中且可將 Cas9 分子以第二載體形式投予細胞中。可將 gRNA 及 Cas9 分子以單一載體形式投予細胞中。或者，可藉由單獨載體投予 gRNA 及 Cas9 分子中之每一者。在實例中，可以包含與一個或多個 gRNA 複合之 Cas9 蛋白之核糖核蛋白複合物 (RNP) 形式將 CRISPR/Cas9 系統遞送至細胞中，例如藉由電穿孔遞送 (關於將 RNP 遞送至細胞中之其他方法，參見例如 DeWitt 等人，Methods 121-122:9-15 (2017))。將 CRISPR/Cas9 系統投予細胞中通常會剔除或敲落之 Bax 及 Bak 多肽之表現。

用於調節 Bax 多肽及/或 Bak 多肽之表現的基因工程系統可為 ZFN 系統。ZFN 可用作限制酵素，其係藉由組合鋅指 DNA 結合域與 DNA-裂解域所生成。鋅指域可經改造以導向特定 DNA 序列，從而容許鋅指核酸酶導向基因體內之期望序列。個別 ZFN 之 DNA 結合域通常含有複數個個別鋅指重複且可各自識別複數個鹼基對。生成新鋅指域之最常用方法係組合具有已知特異性的較小鋅指「模組」。ZFN 中之最常見裂解域係 II 型限制性內核酸酶 FokI 的非特異性裂解域。ZFN 藉由在目標 DNA 序列中產生雙鏈斷裂 (DSB) 來調節蛋白質表現，該等雙鏈斷裂在不存在同源模板下將藉由非同源末端接合 (NHEJ) 來予以修復。該修復可缺失或插入鹼基對，從而產生框移且防止產生有害蛋白質 (Durai 等人，Nucleic Acids Res.；33 (18): 5978–90 (2005))。亦可使用多對 ZFN 來完全去除基因體序列之整個較大片段(Lee 等人，Genome Res.；20 (1): 81–9 (2010))。目標基因可為 Bax 基因之一部分。目標基因可為 Bak 基因之一部分。

用於調節 Bax 多肽及/或 Bak 多肽之表現的基因工程系統可為 TALEN 系統。TALEN 係可經改造以切割特定 DNA 序列之限制酵素。TALEN 系統以類似於 ZFN 之原理發揮作用。TALEN 係藉由組合轉錄活化因子樣效應物 DNA 結合域與DNA 裂解域所生成。轉錄活化因子樣效應物 (TALE) 係由 33-34 個胺基酸重複基序構成，該等基序具有兩個可強烈識別特定核苷酸之可變位置。藉由組裝該等 TALE 之陣列，TALE DNA 結合域可經改造以結合期望 DNA 序列，且由此導引核酸酶切割基因體中之特定位置 (Boch 等人，Nature Biotechnology；29(2):135-6 (2011))。目標基因可為 Bax 基因之一部分。目標基因可為 Bak 基因之一部分。

可使用病毒載體 (例如反轉錄病毒載體 (例如 γ反轉錄病毒載體) 及慢病毒載體) 將本文所揭示之基因工程系統遞送至哺乳動物細胞中。反轉錄病毒載體及適當包裝細胞株之組合較為適宜，其中衣殼蛋白質將用於感染人類細胞。已知各種雙嗜性病毒產生細胞株，包括但不限於 PA12 (Miller 等人 (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437)；PA317 (Miller 等人 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902)；及 CRIP (Danos 等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464)。非雙嗜性顆粒亦適宜，例如經 VSVG、RD114 或 GALV 套膜假型化之顆粒及業內已知之任何其他者。可能之轉導方法亦包括直接共培養細胞與產生細胞 (例如藉由 Bregni 等人 (1992) Blood 80:1418-1422 中之方法) 或使用單獨病毒上清液或含有或不含適當生長因子及多陽離子之濃縮載體原液進行培養(例如藉由以下文獻中之方法：Xu 等人 (1994) Exp. Hemat.22:223-230；及 Hughes 等人 (1992) J. Clin. Invest. 89:1817)。

可使用其他轉導病毒載體來修飾本文所揭示之哺乳動物細胞。在某些實施例中，所選載體展現高感染效率以及穩定整合及表現 (例如參見 Cayouette 等人，Human Gene Therapy 8:423-430, 1997；Kido 等人，Current Eye Research 15:833-844, 1996；Bloomer 等人，Journal of Virology 71:6641-6649, 1997；Naldini 等人，Science 272:263-267, 1996；及 Miyoshi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.94:10319，1997)。可使用之其他病毒載體包括例如腺病毒、慢病毒及腺相關病毒載體、牛痘病毒、牛類乳頭瘤病毒或皰疹病毒 (例如艾司坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr Virus)) (亦例如參見以下文獻中之載體：Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990；Friedman, Science 244:1275-1281, 1989；Eglitis 等人，BioTechniques 6:608-614, 1988；Tolstoshev 等人，Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990；Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991；Cornetta 等人，Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987；Anderson, Science 226:401-409, 1984；Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991；Miller 等人，Biotechnology 7:980-990, 1989；LeGal La Salle 等人，Science 259:988-990, 1993；及 Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995)。反轉錄病毒載體尤其得到充分研發且已用於臨床環境中 (Rosenberg 等人，N. Engl. J. Med 323:370, 1990；Anderson 等人，美國專利第 5,399,346 號)。 5.3 細胞株

本揭露涉及經分離細胞株，其中該細胞株在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。在一方面，經分離細胞株係真核細胞株。

在某些實施例中，編碼目標產物之多核苷酸可在目標位置整合入細胞株的細胞基因體中。該等定點整合可將外源核苷酸序列整合入宿主細胞基因體的一個或多個預定位點中。在某些實施例中，定點整合由識別一個或多個重組識別序列(RRS) 的重組酶調介。一個或多個 RRS 可選自由以下所組成之群組：LoxP 序列、LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox511 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5171 序列、Loxm2 序列、Lox71 序列、Lox66 序列、FRT 序列、Bxb1 attP 序列、Bxb1 attB 序列、φC31 attP 序列及 φC31 attB 序列。定點整合可藉由同源重組調介。可藉由外源位點特異性核酸酶調介定點整合，隨後進行同源性定向修復 (HDR) 及/或非同源末端接合 (NHEJ)。本揭露之定點整合可進一步闡述於 WO 2019/126634 中 (例如參見 WO 2019/126634 之第 42-55 頁的章節 5.1、5.2、5.3 及 5.4；使用定點整合製備細胞之方法進一步闡述於第 55-67 頁之章節 6.1 及 6.2 中)。

在採用定點整合之某些實施例中，外源核苷酸序列整合入在宿主細胞 (TI 宿主細胞) 的基因體的特定基因座內的位點處。在某些實施例中，外源核苷酸整合到其中的基因座與選自以下序列的至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 同源：Contigs NW_006874047.1、NW_ 006884592.1、NW_ 006881296.1、NW_ 003616412.1、NW_ 003615063.1、NW_ 006882936.1、及 NW_ 003615411.1。

在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 5’ 端的核苷酸序列選自由以下各者所組成之群組：NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054、或 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 5’ 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054、或 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705 具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性。

在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 3’ 端的核苷酸序列選自由以下各者所組成之群組：NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768、或 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 3’ 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768、或 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117 具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性。

在某些實施例中，整合入外源序列在 5’ 端側接有選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054 及 NW_003615411.1. 的核苷酸 82214-97705 以及與其至少 50% 同源的序列。在某些實施例中，整合入外源序列在 3’ 端側接有選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768 及 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117 以及與其至少 50% 同源的序列。在某些實施例中，側接於整合入外源核苷酸序列的 5’ 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054 及 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705 至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99% 或至少約 99.9% 同源。在某些實施例中，側接於整合入外源核苷酸序列的 3’ 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768 及 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117 至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99% 或至少約 99.9% 同源。

在某些實施例中，整合入外源核苷酸序列可操作地連接至選自由以下所組成之群組的核苷酸序列片段重疊群 NW_006874047.1、NW_ 006884592.1、NW_ 006881296.1、NW_ 003616412.1、NW_ 003615063.1、NW_ 006882936.1 及 NW_ 003615411.1 以及與其至少 50% 同源的序列。在某些實施例中，可操作地連接至外源核苷酸序列之核苷酸序列與選自片段重疊群 NW_006874047.1、NW_ 006884592.1、NW_ 006881296.1、NW_ 003616412.1、NW_ 003615063.1、NW_ 006882936.1 及 NW_ 003615411.1 的序列至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99% 或至少約 99.9% 同源。

在某些實施例中，可使用基於轉座酶之整合將編碼目標產物之核酸整合入宿主細胞基因體中。基於轉座酶之整合技術揭示於例如以下文獻中：Trubitsyna 等人，Nucleic Acids Res. 45(10):e89 (2017)；Li 等人，PNAS 110(25):E2279-E2287 (2013)；及 WO 2004/009792，其全部內容以引用方式併入本文中。

目標產物可為或可包含重組多肽。目標產物 (諸如重組多肽) 可為或可包含抗體、抗原、酵素或疫苗。抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。抗體可由單一重鏈序列與單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。抗體可包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。目標產物可為複合分子，例如部分抗體及部分蛋白質或非抗體複合蛋白及其衍生物。抗體可包含單株抗體。

在某些實施例中，細胞株之比產率高於包含野生型 Bax 及 Bak 基因中之每一者之多核苷酸及功能性副本的相應真核細胞株。舉例而言，細胞株之比產率 (Qp) 可高於包含野生型 Bax 及 Bak 基因中之每一者之多核苷酸及功能性副本之相應真核細胞株的比產率至少約 5%、至少約 10%、至少約 15%、至少約 20%、至少約 25%、至少約 30%、至少約 35%、至少約 40%、至少約 45%、至少約 50%、至少約 55% 或至少約 60%。舉例而言，細胞株之目標產物效價可高於包含野生型 Bax 及 Bak 基因中之每一者之多核苷酸及功能性副本之相應真核細胞株的效價至少約 5%、至少約 10%、至少約 15%、至少約 20%、至少約 25%、至少約 30%、至少約 35%、至少約 40%、至少約 45%、至少約 50%、至少約 55% 或至少約 60%。

在某些實施例中，細胞株之抗細胞凋亡性大於包含 Bax 及 Bak 基因中之每一者之功能性副本的相應經分離真核細胞株。 5.4. 細胞培養物

細胞培養物包含細胞培養基及至少一個 (通常複數個)細胞。舉例而言，細胞培養基可包含細胞培養基及複數個真核細胞，其中該複數個真核細胞中之每一細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。

細胞培養基含有許多組分。細胞培養基提供在受控、人工及活體外環境中維持及生長細胞所需的營養素。細胞培養基的特點和組成取決於特定的細胞要求而變化。重要的參數包括滲透壓、pH、和營養素配方。

培養基含有胺基酸、葡萄糖、鹽、維生素、和其他營養素的混合物，且可從商業供應商獲得粉末或液體形式。不同的細胞株對這些組分的要求不同。pH 的調節對最佳培養條件至關重要，且一般使用合適的緩衝系統來實現。儘管化學成分確定之培養基 (CDM) 係治療應用及相關應用的較佳者 (因 CDM 在無菌條件下製備及使用時提供可重複的無污染培養基)，但對於一些細胞類型而言，可能需要使用包含血清、蛋白質或其他生物提取物 (例如酵母提取物或植物或動物物質的酵素消化物) 的培養基。

一些極簡單的界定培養基，其基本上由維生素、胺基酸、有機鹽和無機鹽以及緩衝劑組成，且已經被用於細胞培養。然而，這種培養基（通常稱為「基礎培養基」）通常嚴重缺乏大多數動物細胞所需的營養成分。因此，這些培養基往往需要補充、例如用進料或其他添加劑，以形成完全培養基。此外，批式培養系統通常包括用濃縮進料或添加劑定期補充培養基，以保持培養細胞的存活性和/或生物產品的生產，如多肽（例如抗體，或抗體的生物功能片段）、蛋白質、胜肽、激素、病毒或類病毒顆粒、核酸或其片段。

基礎培養基中可能存在的成分包括胺基酸（氮源）、維生素、無機鹽、糖類（碳源）、緩衝鹽和脂質。用於某些哺乳動物細胞培養系統的基礎培養基可含有乙醇胺、D-葡萄糖、N-[2-羥乙基]-哌口井-Nʹ-[2-乙磺酸] (HEPES)、亞麻油酸、類脂酸、酚紅、PLURONlC F68、腐胺、丙酮酸鈉。

可包括於培養基中的胺基酸成分包括 L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-半胱胺酸、L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、及其衍生物。這些胺基酸可自商業途徑獲得，例如從 Sigma (Saint Louis, Missouri)。

可包括於培養基中的維他命成分包括生物素、氯化膽鹼、D-Ca2+-泛酸鹽、葉酸、i-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、噻胺及維他命 B12。這些維生素可自商業途徑獲得，例如從 Sigma (Saint Louis, Missouri)。

可用於培養基中的無機鹽成分包括一種或多種鈣鹽 (例如 CaCl2)、Fe(NO3)3、KCl、一種或多種鎂鹽 (例如 MgCl2 及/或 MgSO4)、一種或多種錳鹽 (例如 MnCl2)、NaCl、NaHCO3、N2HPO4 及微量元素硒、釩、鋅及銅的離子。該等微量元素可以各種形式提供，較佳的是以鹽形式，例如 Na2SeO3、NH4VO3、ZnSO4 及 CuSO4。這些無機鹽和痕量元素商業上可獲得，例如從 Sigma (Saint Louis, Missouri)。

可用於哺乳動物細胞培養物中的實例性培養基包括市售培養基，舉例而言，Ham's F10 (Sigma)、最新必需培養基 ((MEM), Sigma)、RPMI-1640 (Sigma) 及達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((DMEM, Sigma) 皆適於培養宿主細胞。此外，任何描述於 Ham and Wallace (1979), Meth. in Enz. 58:44；Barnes and Sato (1980), Anal. Biochem. 102:255；美國專利號 4,767,704；4,657,866；4,927,762；或 4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；美國專利號 Re.30,985；或美國專利號 5,122,469（所有這些揭露均以引用方式全部併入本文中）的培養基，可用以作為宿主細胞的培養基。該等培養基中的任一者皆可根據需要補充激素及/或其他生長因子 (例如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽 (例如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑 (例如 HEPES)、核苷 (例如腺苷及胸苷)、抗生素 (例如 Gentamycin ^TM藥物)、微量元素 (定義為最終濃度通常在微莫耳濃度範圍內存在的無機化合物) 及葡萄糖或同等能量來源。任何其他必要的補充劑也可以熟習本領域技術者已知的適當濃度包含。培養條件，如溫度、pH 等，是先前用於選擇表現的宿主細胞的條件，對熟習本領域技術者來說是清楚明顯的。實例性培養條件提供於以下文獻中：M. Takagi 及 K. Ueda, 「Comparison of the optimal culture conditions for cell growth and tissue plasminogen activator production by human embryo lung cells on microcarriers」, Biotechnology, (1994), 41, 565-570；H.J. Morton, 「A survey of commercially available tissue culture media」, In Vitro (1970), 6(2), 89-108；J. Van der Valk 等人 (2010), 「Optimization of chemically defined cell culture media–replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods,」 Toxicology in vitro, 24(4), 1053-1063；R.J.Graham 等人，「Consequences of trace metal variability and supplementation on Chinese hamster ovary (CHO) cell culture performance: A review of key mechanisms and considerations」, BIotechnol.Bioeng. (2019), 116(12), 3446-3456；S. Janoschek 等人，「 A protocol to transfer a fed‐batch platform process into semi‐perfusion mode: The benefit of automated small‐scale bioreactors compared to shake flasks as scale‐down model」, Biotechnol. Prog., (2019), 35(2), e2757；及 M. Kuiper 等人，「Repurposing fed‐batch media and feeds for highly productive CHO perfusion processes」, Biotechnology Progress，2019 年 4 月 15 日，https://doi.org/10.1002/ btpr.2821；其全部內容皆以引用方式併入本文中。

可用於產生 CHO 細胞之實例性培養基可含有基礎培養基組分 (例如基於 DMEM/HAM F-12 之調配物 (關於 DMEM 及 HAM F12 培養基之組成，參見 American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas，第 6 版，1988，第 346-349 頁中之培養基調配物) (如美國專利第 5,122,469 號中所闡述之培養基調配物尤其適合)) 以及修改濃度之一些組分 (例如胺基酸、鹽、糖及維他命)，且視情況含有甘胺酸、次黃嘌呤及胸苷、重組人類胰島素、水解蛋白腖 (例如 Primatone HS 或 Primatone RL (Sheffield, England) 或等效物)、細胞保護劑 (例如普羅尼克 (Pluronic) F68 或等效普羅尼克多元醇)、慶大黴素 (gentamycin) 及微量元素。

細胞培養物可包含真核細胞，該等真核細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變且表現重組蛋白。可藉由在各種細胞培養條件下生長表現目標產物之細胞來產生重組蛋白。舉例而言，用於大規模或小規模產生蛋白質的細胞培養程序在本揭露背景內潛在有用。可用程序包括但不限於流化床生物反應器、空心纖維生物反應器、滾瓶培養、搖瓶培養或攪拌槽生物反應器系統，在後兩種系統中，使用或不使用微載體且以分批、饋料批式或連續模式交替操作。

本揭露之細胞培養可在攪拌槽生物反應器系統中執行，並採用饋料批式培養程序。在饋料批式培養中，首先將真核宿主細胞 (例如哺乳動物宿主細胞) 及培養基供應至培養容器中，且在培養期間連續或不連續地將額外的培養營養素供給至培養物中，在培養結束之前進行或不進行定期的細胞及/或產物收穫。分批補料培養可以包括例如半連續的分批補料培養，其中定期將整個培養物（包括細胞和培養基）移出並由新鮮培養基替代。分批補料培養有別於簡單的批式培養，其中所有用於細胞培養的組分（包括細胞和所有培養營養素）都在培養過程開始時供應至培養容器。就上清液在培養過程中不被移出培養容器而言，饋料批式培養可進一步區別於灌流培養 (在灌流培養中，細胞藉由例如過濾、囊封、錨定至微載體上等而限制在培養物中，且培養基被連續或間歇地在培養容器中引入及去除)。

培養物的細胞可根據任何適用於特定宿主細胞及所考慮特定產生計劃的方案或常規來繁殖。因此，本揭露考慮了單步培養程序或多步培養程序。在單步培養中，將宿主細胞接種至培養環境中且在細胞培養的單一產生期期間採用本揭露程序。替代地，設想了多階段的培養。在多階段培養中，細胞可於許多步驟或階段中培養。舉例而言，細胞可在第一步驟或生長期培養物中生長，其中可自儲存取出的細胞被接種至適於促進生長及高存活率的培養基中。藉由向宿主細胞培養物中添加新鮮培養基，可將細胞維持在生長期適宜時間段。

通常設計饋料批式或連續細胞培養條件以增強真核細胞 (例如哺乳動物細胞) 在細胞培養的生長期中的生長。在生長期，細胞是在最大限度促進生長的條件和時間段下生長的。培養條件 (例如溫度、pH、溶氧 (dO2) 及諸如此類) 係用於特定宿主者，且對於熟習此項技術者而言係清楚易見的。通常，使用酸 (例如 CO2) 或鹼 (例如 Na2CO3 或 NaOH) 將 pH 調節至介於約 6.5 與 7.5 之間的值。用於培養哺乳動物細胞 (例如 CHO 細胞) 之適宜溫度範圍介於大約 30℃ 至 38℃ 之間，且適宜 dO2 係介於 5-90% 之間的空氣飽和度。

在特定階段，細胞可用於接種細胞培養的產生期或步驟。或者，如上所述，產生期或步驟可與接種或生長期或步驟連續進行。

本揭露中所闡述之培養方法可進一步包括自細胞培養物 (例如自細胞培養之產生期) 收穫產物。在某些實施例中，可自第三生物反應器 (例如產生生物反應器) 收穫藉由本揭露之細胞培養方法產生的產物。舉例而言但並不加以限制，所揭示方法可包括在完成細胞培養之產生期時收穫產物。替代地或另外，可在完成產生期之前收穫產物。在某些實施例中，可在已達成特定細胞密度後自細胞培養物收穫產物。舉例而言但並不加以限制，收穫前之細胞密度可為約 2.0 × 10 ⁷個細胞/mL 至約 5.0 × 10 ⁷個細胞/mL。

自細胞培養物收穫或分離產物可包括離心、過濾、聲波分離、絮凝及細胞去除技術中之一者或多者。

目標產物可自宿主細胞分泌或可為膜結合蛋白、胞質蛋白或核蛋白。可自條件化細胞培養基純化可溶性形式之多肽，且可藉由自表現細胞製備總膜部分並使用非離子型洗滌劑 (例如 TRITON® X-100 (EMD Biosciences, San Diego, Calif.)) 提取膜來純化膜結合形式之多肽。可藉由以下方式來製備胞質蛋白或核蛋白：溶解宿主細胞 (例如藉由機械力、超音波處理及/或洗滌劑)，藉由離心去除細胞膜部分並保留上清液。

在一實施例中，本發明提供一種組成物，其包含如本文所揭示之真核細胞株，其中該細胞株之細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變；及如本文所揭示之細胞培養基。

另一實施例提供包含細胞培養基及複數個真核細胞之細胞培養物，其中該複數個真核細胞中之每一細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。該等細胞可具有如本文所揭示之其他特徵。細胞培養基可進一步具有如本文所揭示之定義。 5.5 產生方法

在某些實施例中，本揭露提供產生重組多肽之方法。在某些實施例中，該等方法包含在適於產生多肽之條件下培養真核細胞株。在某些實施例中，細胞株包含：(a) Bax 及 Bak 基因中之每一者中的穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變；及 (b) 編碼重組多肽之多核苷酸。

編碼多肽之多核苷酸可在目標位置整合入細胞株之細胞的細胞基因體中。該等定點整合可將外源核苷酸序列整合入宿主細胞基因體的一個或多個預定位點中。在某些實施例中，定點整合由識別一個或多個重組識別序列(RRS) 的重組酶調介。一個或多個 RRS 可選自由以下所組成之群組：LoxP 序列、LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox511 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5171 序列、Loxm2 序列、Lox71 序列、Lox66 序列、FRT 序列、Bxb1 attP 序列、Bxb1 attB 序列、φC31 attP 序列及 φC31 attB 序列。定點整合可藉由同源重組調介。可藉由外源位點特異性核酸酶調介定點整合，隨後進行同源性定向修復 (HDR) 及/或非同源末端接合 (NHEJ)。本揭露之定點整合可進一步闡述於 WO 2019/126634 中 (例如參見 WO 2019/126634 之第 42-55 頁的章節 5.1、5.2、5.3 及 5.4；使用定點整合製備細胞之方法進一步闡述於第 55-67 頁之章節 6.1 及 6.2 中)。

編碼多肽之多核苷酸可隨機整合入細胞株之細胞的細胞基因體中。編碼多肽之多核苷酸可為染色體外多核苷酸。編碼多肽之多核苷酸可整合入細胞株之染色體的細胞中。

重組多肽可為或可包含抗體、抗原、酵素或疫苗。重組多肽可為或可包含抗體。重組多肽可為或可包含抗原。重組多肽可為或可包含酵素。重組多肽可為或可包含疫苗。抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。抗體可為多特異性抗體或其抗原結合片段。抗體可由單一重鏈序列與單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。抗體可包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。抗體可包含單株抗體。

該方法可進一步包含分離重組多肽。該分離通常包含自細胞株分離重組多肽。重組多肽之分離可包括離心、過濾、聲波分離、絮凝及細胞去除技術中之一者或多者。經分離重組多肽可為經純化的。

細胞株可為動物細胞株或真菌細胞株。細胞株可為動物細胞株，例如哺乳動物細胞株。實例性哺乳動物細胞株包括雜交瘤細胞株、CHO 細胞株、COS 細胞株、VERO 細胞株、HeLa 細胞株、HEK 293 細胞株、PER-C6 細胞株、K562 細胞株、MOLT-4 細胞株、Ml 細胞株、NS-1 細胞株、COS-7 細胞株、MDBK 細胞株、MDCK 細胞株、MRC-5 細胞株、WI-38 細胞株、WEHI 細胞株、SP2/0 細胞株、BHK 細胞株 (包括 BHK-21 細胞株) 或其衍生物。細胞株可為 CHO 細胞株，例如 CHO K1 細胞株、CHO K1SV 細胞株、DG44 細胞株、DUKXB-11 細胞株、CHOK1S 細胞株或 CHO K1M 細胞株或其衍生物。細胞株可為真菌細胞株，例如酵母細胞株。

可在細胞培養基中培養細胞株。細胞培養基及/或細胞培養條件可如上文在標題「細胞培養物」下進一步所闡述。可在饋料批式培養條件或灌流培養條件下培養細胞株。可在饋料批式培養條件下培養細胞株。饋料批式培養條件可為強化饋料批式培養條件。可在灌流培養條件下培養細胞株。灌流培養條件可為半連續灌流。灌流培養條件可為連續灌流。

細胞株可在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型突變。

在某些實施例中，本揭露提供產生病毒載體之方法。在某些實施例中，該等方法包含在適於產生病毒載體之條件下培養真核細胞株。在某些實施例中，在適於產生病毒載體之條件下，細胞株包含 (a) 在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中的穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變、(b) 病毒基因體及 (c) 一個或多個編碼病毒衣殼之多核苷酸。

在某些實施例中，該等方法可包含分離病毒載體。在某些實施例中，分離通常包含自細胞株分離病毒載體。病毒載體之分離可包括離心、過濾、聲波分離、絮凝及細胞去除技術中之一者或多者。經分離病毒載體可為經純化的。

在某些實施例中，細胞株可包含穩定整合功能喪失型突變在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中。

在某些實施例中，本發明揭露提供產生重組多肽之方法，其包含如本文所闡述 (例如在標題「調節 Bax 及 Bak 表現之方法」) 下減小細胞凋亡活性，隨後根據本揭露方法 (例如如上文所揭示) 產生重組多肽。 5.6 產物

可使用本揭露之細胞及/或細胞株及/或方法來產生可由本文所揭示細胞表現的任何目標產物。可使用本揭露之細胞及/或細胞株及/或方法來產生多肽 (例如哺乳動物多肽)。該等多肽之非限制性實例包括激素、受體、融合蛋白 (包括抗體融合蛋白，例如抗體-細胞介素容融合蛋白)、調控因子、生長因子、補體系統因子、酵素、凝血因子、抗凝血因子、激酶、細胞介素、CD 蛋白、介白素、治療蛋白、診斷蛋白及抗體。本發明揭露之細胞及/或細胞株及/或方法通常對所產生分子 (例如抗體) 並無特異性。

本發明揭露方法可用於產生抗體，包括治療抗體及診斷抗體或其抗原結合片段。藉由本揭露之細胞、細胞株及/或方法產生之抗體可為但不限於單特異性抗體 (例如由單一重鏈序列及單一輕鏈序列組成之抗體，包括該等配對之多聚體)、多特異性抗體及其抗原結合片段。舉例而言但並不加以限制，多特異性抗體可為雙特異性抗體、雙表位性抗體、T 細胞依賴性雙特異性抗體 (TDB)、雙重作用性 FAb (DAF) 或其抗原結合片段。 多特異性抗體

抗體可為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。「多特異性抗體」為對至少兩個不同位點 (亦即不同抗原上之不同表位 (亦即雙特異性) 或同一抗原上之不同表位 (雙表位性)) 具有結合特異性的單株抗體。多特異性抗體可具有三種或更多種結合特異性。多特異性抗體可製成如本文所闡述之全長抗體或抗體片段。

用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對 (參見 Milstein 和 Cuello，Nature 305: 537 (1983)) 和「杵進入臼」(knob-in-hole) 工程 (參見例如美國專利號 5,731,168，及 Atwell 等人 J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體亦可藉由以下方法進行製備：用於製備抗體 Fc-異源二聚體分子的工程靜電轉向效應 (例如參見 WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (例如參見美國專利第 4,676,980 號；及 Brennan 等人，Science，229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (例如參見 Kostelny 等人，J. Immunol.，148(5):1547-1553 (1992)；及 WO 2011/034605)；使用常用輕鏈技術規避輕鏈錯誤配對問題 (例如參見 WO 98/50431)；使用「二價抗體」技術製備雙特異性抗體片段 (例如參見 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (例如參見 Gruber 等人，J. Immunol，152:5368 (1994))；以及按照例如 Tutt 等人，J. Immunol. 147: 60 (1991) 所闡述之方法製備三特異性抗體。

本文還包括具有三個或更多個抗原結合位點之工程化抗體，包括例如「章魚抗體」(Octopus antibodies) 或 DVD-Ig (參見例如 WO 2001/77342 及 WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體的其他非限制性實例可參見 WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792 及 WO 2013/026831。雙特異性抗體或其抗原結合片段亦包括「雙重作用性 FAb」或「DAF」 (例如參見 US 2008/0069820 及 WO 2015/095539。

多特異性抗體亦可提供為不對稱形式，其包含在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉的域，亦即藉由交換 VH/VL 域 (例如參見 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447)、CH1/CL 域 (例如參見 WO 2009/080253) 或完整的 Fab 臂 (例如參見 WO 2009/080251、WO 2016/016299，亦參見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20) 達成。多特異性抗體可包含交叉-Fab 片段。術語「cross-Fab 片段」或「xFab 片段」或「交叉 Fab 片段」是指其中重鏈和輕鏈之變異區或恆定區發生交換的 Fab 片段。cross-Fab 片段包含由輕鏈變異區 (VL) 和重鏈恆定區 1 (CH1) 構成之多肽鏈以及由重鏈變異區 (VH) 和輕鏈恆定區 (CL) 構成之多肽鏈。還可透過將帶電荷或不帶電荷之胺基酸突變引入域界面引導正確 Fab 配對，從而設計不對稱之 Fab 臂。例如參見 WO 2016/172485。

用於多特異性抗體之各種其他分子形式為業內所已知且包括在本文中 (例如參見 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。

還包括於本文中的特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，該雙特異性抗體被設計為同時結合至標靶細胞 (例如腫瘤細胞) 上之表面抗原以及 T 細胞受體 (TCR) 之活化不變組分 (例如 CD3) 複合物，用於重定向 T 細胞以殺死標靶細胞。

可用於此目的之雙特異性抗體形式的其他非限制性實例包括但不限於所謂的「BiTE」(雙特異性 T 細胞銜接體) 分子，其中兩個 scFv 分子藉由柔性連接體融合 (例如參見 WO 2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261 及 WO 2008/119567；Nagorsen 及 Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011))；二價抗體 (Holliger 等人，Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 及其衍生物，例如串聯二價抗體 (「TandAb」；Kipriyanov 等人，J Mol Biol 293, 41-56 (1999))；「DART」(雙親和性重定位) 分子，其基於二價抗體形式，但具有 C-末端雙硫鍵以供額外穩定 (Johnson 等人，J Mol Biol 399, 436-449 (2010))，及所謂的三功能單抗，其係完整的小鼠/大鼠 IgG 雜合分子 (參見 Seimetz 等人的以下綜述：Cancer Treat.Rev. 36, 458-467 (2010))。本文所包括之特定 T 細胞雙特異性抗體形式描述於 WO 2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；及 Bacac 等人 Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498. 抗體片段

藉由本文所提供之細胞及/或細胞株及/或方法產生的抗體可為抗體片段。舉例而言但並不加以限制，抗體片段可為 Fab、Fab’、Fab’-SH或 F(ab’)2 片段，尤其係 Fab 片段。木瓜酶對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈和輕鏈可變域 (分別為 VH 和 VL) 及輕鏈之恆定域 (CL) 和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，術語「Fab 片段」係指包含輕鏈 (包含 VL 域和 CL 域) 及重鏈片段 (包含 VH 域和 CH1 域) 之抗體片段。「Fab’ 片段」與 Fab 片段的區別在於在 CH1 域的羧基末端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH 是 Fab’ 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab')2 片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。關於包含補救受體結合表位殘基且具有增加的活體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見美國專利第 5,869,046 號。

抗體片段可為二價抗體、三價抗體或四價抗體。「二價抗體」為具有兩個抗原結合位點 (其可為二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。

抗體片段可為單鏈 Fab 片段。「單鏈 Fab 片段」或「scFab」由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體重鏈恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及接頭組成，其中所述抗體域及所述接頭在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CH1-接頭-VL-CL、b) VL-CL-接頭-VH-CH1、c) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 d) VL-CH1-接頭-VH-CL。特定而言，該連接體可為具有至少 30 個胺基酸且較佳地 32 至 50 個胺基酸之多肽。所述單鏈 Fab 片段通過 CL 域與 CH1 域之間的天然二硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈 Fab 片段可通過插入半胱胺酸殘基產生鏈間二硫鍵而得到進一步穩定 (例如，根據 Kabat 編號，在變異重鏈之位置 44 和變異輕鏈之位置 100 處插入)。

抗體片段可為單鏈可變片段 (scFv)。「單鏈可變片段」或「scFv」為抗體之重鏈 (VH) 和輕鏈 (VL) 的可變域之融合蛋白，其通過接頭連接。特定而言，連接體可為具有 10 個至 25 個胺基酸之短多肽，且通常富含甘胺酸以提高柔韌性，並含有絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解性，並且可將 VH 之 N-末端與 VL 之 C-末端連結，或反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接基，但是該蛋白仍保留了原始抗體的特異性。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編輯，Springer-Verlag，New York，第 269 頁至第 315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。

抗體片段可為單域抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。單域抗體可為人類單域抗體 (Domantis, Inc., Waltham, MA；例如參見美國專利第 6,248,516 B1 號)。

在某些方面，藉由本文所提供之細胞及方法產生之抗體融合蛋白為抗體-細胞介素融合蛋白。儘管該抗體-細胞介素融合蛋白可包含全長抗體，但抗體-細胞介素融合蛋白之抗體在某些實施例中為抗體片段，例如單鏈可變片段 (scFv)、二價抗體、Fab 片段或小免疫蛋白 (SIP)。在某些實施例中，細胞介素可融合至抗體之 N-末端或 C-末端。在某些實施例中，抗體-細胞介素融合蛋白之細胞介素係由多個次單元組成。在某些實施例中，細胞介素之次單元相同 (同源)。在某些實施例中，細胞介素之次單元不同 (異源)。在某些實施例中，細胞介素之次單元融合至同一抗體。在某些實施例中，細胞介素之次單元融合至不同抗體。關於抗體-細胞介素融合蛋白之綜述，例如參見 Murer等人，N Biotechnol., 52: 42–53 (2019)。

抗體片段可藉由各種技術製得，包括但不限於完整抗體之蛋白水解消解。 嵌合和人源化抗體

藉由本文所提供之細胞及/或細胞株及/或方法產生的抗體可為嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於例如美國專利第 4,816,567 號；及 Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81:6851-6855，(1984)) 中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人可變區（例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物如猴的可變區）及人恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類或亞型相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。

嵌合抗體可為人源化抗體。通常，非人抗體被人源化以降低對人類的免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中 CDR (或其部分) 來源於非人抗體，並且 FR (或其部分) 來源於人抗體序列。人源化抗體視情況將也包含人恆定區之至少一部分。在某些實施例中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人類抗體 (例如衍生 HVR 殘基之抗體) 之相應殘基取代以例如恢復或改良抗體特異性或親和力。

人源化抗體及其製備方法綜述於例如 Almagro 和 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 中，且進一步闡述於例如以下文獻中：Riechmann 等人，Nature 332:323-329 (1988)；Queen 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第 5, 821,337 號、第 7,527,791 號、第 6,982,321 號及第 7,087,409 號；Kashmiri 等人，Methods 36:25-34 (2005) (闡述特異性決定區 (SDR) 接枝)；Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (闡述「表面重塑」)；Dall’Acqua 等人，Methods 36:43-60 (2005) (闡述「FR 改組」)；及 Osbourn 等人，Methods 36:61-68 (2005)；以及 Klimka 等人，Br. J. Cancer，83:252-260 (2000) (闡述 FR 改組的「導向選擇」法)。

可用於人源化的人類框架區包括但不限於：使用「最佳匹配」方法選擇的框架區 (例如參見 Sims 等人，J. Immunol. 151:2296 (1993))；衍生自輕鏈或重鏈可變區的特定子群的人類抗體的共有序列的框架區 (例如參見：Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89: 4285 (1992)；及 Presta 等人，J. Immunol.，151: 2623 (1993))；人類成熟 (體細胞突變) 框架區或人類種系框架區 (例如參見 Almagro 及 Fransson，Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008))；以及衍生自篩選 FR 庫的框架區 (例如參見：Baca 等人，J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997)；及 Rosok 等人，J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996))。 人類抗體

藉由本文所提供之細胞及/或細胞株及/或方法產生的抗體可為人類抗體。可使用此領域中所公知的各種技術生產人抗體。人類抗體概述於 van Dijk 及 van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及 Lonberg，Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) 中。

可透過對轉基因動物給予免疫原來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以響應於抗原攻擊而產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。關於自轉基因動物獲得人類抗體的方法的綜述，參見 Lonberg，Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。亦參見例如美國專利第 6,075,181 號及第 6,150,584 號 (闡述 XENOMOUSE ^TM技術)；美國專利第 5,770,429 號 (闡述 HUMAB® 技術)；美國專利第 7,041,870 號 (闡述 K-M MOUSE® 技術)；及美國專利申請公開案第 US 2007/0061900 號 (闡述 VELOCIMOUSE® 技術)。由該等動物生成的來自完整抗體的人類可變區可進一步經修飾，例如藉由與不同的人類恆定區組合來進行修飾。

人類抗體亦可藉由基於雜交瘤的方法進行製備。用於生產人單株抗體的人骨髓瘤及小鼠-人异源骨髓瘤細胞株已有描述。(參見例如 Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及 Boerner 等人，J. Immunol., 147: 86 (1991)。) 經由人類 B 細胞雜交瘤技術生成的人類抗體亦闡述於 Li 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) 中。其他方法包括彼等闡述於例如美國專利第 7,189,826 號 (闡述由雜交瘤細胞株產生單株人類 IgM 抗體) 及 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (闡述人類-人類雜交瘤) 中者。人類雜交瘤技術 (三源雜交瘤技術) 亦闡述於 Vollmers 及Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及 Vollmers 及Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005) 中。 目標分子

可由藉由本文所揭示之細胞及方法所產生抗體標定之分子的非限制性實例包括可溶性血清蛋白及其受體以及其他膜結合蛋白 (例如黏附素)。在某些實例中，藉由本文所揭示之細胞及方法產生之抗體能夠結合至一種、兩種或更多種選自由以下所組成之群組的細胞介素、細胞介素相關蛋白及細胞介素受體：8MPI、8MP2、8MP38 (GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI (M-CSF)、CSF2 (GM-CSF)、CSF3 (G-CSF)、EPO、FGF1 (αFGF)、FGF2 (βFGF)、FGF3 (int-2)、FGF4 (HST)、FGF5、FGF6 (HST-2)、FGF7 (KGF)、FGF9、FGF1 0、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1 (ε)、FEL1 (ζ)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL1 0、IL 11、IL 12A、IL 12B、IL 13、IL 14、IL 15、IL 16、IL 17、IL 17B、IL 18、IL 19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA (TNF-β)、LTB、TNF (TNF-α)、TNFSF4 (OX40 配體)、TNFSF5 (CD40 配體)、TNFSF6 (FasL)、TNFSF7 (CD27 配體)、TNFSF8 (CD30 配體)、TNFSF9 (4-1 BB 配體)、TNFSF10 (TRAIL)、TNFSF11 (TRANCE)、TNFSF12 (APO3L)、TNFSF13 (April)、TNFSF13B、TNFSF14 (HVEM-L)、TNFSF15 (VEGI)、TNFSF18、HGF (VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP (瘦素)、PTN 及 THPO。

藉由本文所揭示之細胞及方法產生之抗體可能能夠結合至選自由以下所組成之群組的趨化介素、趨化介素受體或趨化介素相關蛋白：CCLI (1-309)、CCL2 (MCP -1/MCAF)、CCL3 (MIP-Iα)、CCL4 (MIP-Iβ)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP-3)、CCL8 (mcp-2)、CCL11 (嗜酸性粒細胞趨化因子)、CCL 13 (MCP-4)、CCL 15 (MIP-Iδ)、CCL 16 (HCC-4)、CCL 17 (TARC)、CCL 18 (PARC)、CCL 19 (MDP-3b)、CCL20 (MIP-3α)、CCL21 (SLC/艾克杜斯 (exodus)-2)、CCL22 (MDC/ STC-1)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2 /嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25 (TECK)、CCL26 (嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、CCL27 (CTACK / ILC)、CCL28、CXCLI (GROI)、CXCL2 (GR02)、CXCL3 (GR03)、CXCL5 (ENA-78)、CXCL6 (GCP-2)、CXCL9 (MIG)、CXCL 10 (IP 10)、CXCL 11 (1-TAC)、CXCL 12 (SDFI)、CXCL 13、CXCL 14、CXCL 16、PF4 (CXCL4)、PPBP (CXCL7)、CX3CL 1 (SCYDI)、SCYEI、XCLI (淋巴細胞趨化蛋白)、XCL2 (SCM-Iβ)、BLRI (MDR15)、CCBP2 (D6/JAB61 )、CCRI (CKRI/HM145)、CCR2 (mcp-IRB IRA)、CCR3 (CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5 (CMKBR5/ChemR13)、CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7 (CKR7/EBII)、CCR8 (CMKBR8/ TER1/CKR- L1)、CCR9 (GPR-9-6)、CCRL1 (VSHK1)、CCRL2 (L-CCR)、XCR1 (GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1 (RDC1)、CX3CR1 (V28)、CXCR4、GPR2 (CCR10)、GPR31、GPR81 (FKSG80)、CXCR3 (GPR9/CKR-L2)、CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA (IL8Rα)、IL8RB (IL8Rβ)、LTB4R (GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10 (C10)、EPO、FY (DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2 及 VHL。

在某些實例中，藉由本文所揭示方法產生之抗體 (例如多特異性抗體，例如雙特異性抗體) 能夠結合至一種或多種選自下列各項的目標分子：0772P (CA125, MUC16) (亦即卵巢癌抗原)、ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚糖 (Aggrecan)；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；類澱粉 β；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；ASLG659；ASPHD1 (含有天門冬胺酸 β-羥化酶域之蛋白質 1；LOC253982)；AZGP1 (鋅-a-醣蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF-R (B 細胞活化因子受體、BLyS 受體 3、BR3；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI (MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B (GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B (骨形態發生蛋白受體類型 IB)；BMPR2；BPAG1 (網蛋白)；BRCA1；短蛋白聚醣 (Brevican)；C19orf10 (IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2 (D6/JAB61)；CCL1 (1-309)；CCL11 (嗜酸性粒細胞趨化因子)；CCL13 (MCP-4)；CCL15 (MIP1δ)；CCL16 (HCC-4)；CCL17 (TARC)；CCL18 (PARC)；CCL19 (MIP-3β)；CCL2 (MCP-1)；MCAF；CCL20 (MIP-3α)；CCL21 (MTP-2)；SLC；艾克杜斯-2；CCL22 (MDC/STC-1)；CCL23 (MPIF-1)；CCL24 (MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)；CCL25 (TECK)；CCL26 (嗜酸性粒細胞趨化因子-3)；CCL27 (CTACK/ILC)；CCL28；CCL3 (MTP-Iα)；CCL4 (MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7 (MCP-3)；CCL8 (mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1 (CKRI / HM145)；CCR2 (mcp-IRβ/RA)；CCR3 (CKR/ CMKBR3)；CCR4；CCR5 (CMKBR5/ChemR13)；CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6)；CCR7 (CKBR7/EBI1)；CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9 (GPR-9-6)；CCRL1 (VSHK1)；CCRL2 (L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22 (B 細胞受體 CD22-B 同功型)；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A (CD79α，免疫球蛋白相關 α，B 細胞特異性蛋白)；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1 (E-鈣黏蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A (p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B (p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A (P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；幾丁質酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3;CLDN7 (密連蛋白-7)；CLL-1 (CLEC12A、MICL 及 DCAL2)；CLN3；CLU (叢生蛋白 clusterin)；CMKLR1；CMKOR1 (RDC1)；CNR1；COL 18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；補體因子 D；CR2；CRP；CRIPTO (CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸形癌源生長因子)；CSFI (M-CSF)；CSF2 (GM-CSF)；CSF3 (GCSF)；CTLA4；CTNNB1 (b-連環蛋白)；CTSB (組織蛋白酶 B)；CX3CL1 (SCYDI)；CX3CR1 (V28)；CXCL1 (GRO1)；CXCL10 (IP-10)；CXCL11 (I-TAC/IP-9)；CXCL12 (SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2 (GRO2)；CXCL3 (GRO3)；CXCL5 (ENA-78/LIX)；CXCL6 (GCP-2)；CXCL9 (MIG)；CXCR3 (GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR5 (伯基特氏淋巴瘤 (Burkitt's lymphoma) 受體 1，一種 G 蛋白偶合受體)；CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E16 (LAT1, SLC7A5)；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EphB2R；EPO；ERBB2 (Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；ETBR (內皮素類型 B 受體)；F3 (TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FcRH1 (Fc 受體樣蛋白 1)；FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (含有 SH2 域之磷酸酶錨定蛋白 1a), SPAP1B, SPAP1C)；FGF；FGF1 (αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2 (bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3 (int-2)；FGF4 (HST)；FGF5；FGF6 (HST-2)；FGF7 (KGF)；FGF8；FGF9；FGFR；FGFR3；FIGF (VEGFD)；FELl (EPSILON)；FILl (ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI (纖連蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1 (FRA-1)；FY (DARC)；GABRP (GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GDNF-Ra1 (GDNF 家族受體 α 1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；GEDA；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2 (CCR10)；GPR19 (G 蛋白偶合受體 19；Mm.4787)；GPR31；GPR44；GPR54 (KISS1 受體；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；GPR81 (FKSG80)；GPR172A (G 蛋白偶合受體 172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GRCCIO (C10)；GRP；GSN (凝溶膠蛋白 (Gelsolin))；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；組胺及組胺受體；HLA-A；HLA-DOB (MHC 種類 II 分子 (Ia 抗原) 之 β 次單元；HLA-DRA；HM74；HMOXI；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2, ILIRN；IL2；IL20；IL20Rα；IL21 R；IL22；IL-22c；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST (醣蛋白 130)；流行性感冒 A 蛋白；流行性感冒 B 蛋白；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRTA2 (免疫球蛋白超家族受體易位相關蛋白 2)；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6 (a6 整聯蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4 (b4 整聯蛋白)；α4β7 及 αEβ7 整聯蛋白異源二聚體；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5 (GC Box BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19 (角蛋白 19)；KRT2A；KHTHB6 (毛髮特異性類型 H 角蛋白)；LAMAS；LEP (瘦素)；LGR5 (含有富白胺酸重複之 G 蛋白偶合受體 5；GPR49, GPR67)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA (TNF-b)；LTB；LTB4R (GPR16)；LTB4R2；LTBR；LY64 (淋巴球抗原 64 (RP105)、富白胺酸重複 (LRR) 家族之 I 型膜蛋白)；Ly6E (淋巴球抗原 6 複合物，基因座 E；Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1)；Ly6G6D (淋巴球抗原 6 複合物，基因座 G6D；Ly6-D, MEGT1)；LY6K (淋巴球抗原 6 複合物，基因座 K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；MACMARCKS；MAG 或 OMgp；MAP2K7 (c-Jun)；MDK；MDP；MIB1；肝素結合細胞因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MPF (MPF、MSLN、SMR、巨核細胞強化因子、間皮素)；MS4A1；MSG783 (RNF124、假設蛋白 FLJ20315)；MSMB；MT3 (金屬硫蛋白-111)；MTSS1；MUC1 (黏蛋白)；MYC；MY088；Napi3b (亦稱為 NaPi2b) (NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質載體家族 34 (磷酸鈉) 成員 2、II 型鈉依賴性磷酸鹽轉運蛋白 3b)；NCA；NCK2；神經蛋白聚糖；NFKB1；NFKB2；NGFB (NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66 (Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1 (NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；OX40；P2RX7；P2X5 (嘌呤受體 P2X 配體門控性離子通道 5)；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-L1；PD-L2；PD-1；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4 (CXCL4)；PGF；PGR；磷酸聚糖；PIAS2；PIK3CG；PLAU (uPA)；PLG；PLXDC1；PMEL17 (銀同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；PPBP (CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 基因)；PTAFR；PTEN；PTGS2 (COX-2)；PTN；RAC2 (p21 Rac2)；RARB；RET (ret 原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110 (ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2 (親脂蛋白 B)；SCGB2A1 (乳腺珠蛋白 2)；SCGB2A2 (乳腺珠蛋白 1)；SCYEI (內皮單核球活化細胞介素)；SDF2；Sema 5b (FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、軸突導向蛋白 (Semaphorin) 5b Hlog、sema 域、七凝血酶敏感蛋白重複 (類型 1 及類型 1 樣)、跨膜域 (TM) 及短細胞質域、(軸突導向蛋白) 5B)；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5 (乳腺絲抑蛋白 maspin)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B (Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP (前列腺六次跨膜上皮抗原)；STEAP2 (HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關基因 1、前列腺癌相關蛋白 1、前列腺六次跨膜上皮抗原 2、六次跨膜前列腺蛋白)；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；10B2 (假定跨膜蛋白多糖)；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI (凝血酶敏感蛋白-1 )；THBS2；THBS4；THPO；TIE (Tie-1 )；TMP3；組織因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TMEFF1 (具有 EGF 樣域及兩個濾泡抑素樣域之跨膜蛋白 1；陀蘑菇林 (Tomoregulin)-1)；TMEM46 (shisa 同系物 2)；TNF；TNF-a；TNFAEP2 (B94 )；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6 (Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10 (TRAIL)；TNFSF11 (TRANCE)；TNFSF12 (AP03L)；TNFSF13 (April)；TNFSF13B；TNFSF14 (HVEM-L)；TNFSF15 (VEGI)；TNFSF18；TNFSF4 (OX40 配體)；TNFSF5 (CD40 配體)；TNFSF6 (FasL)；TNFSF7 (CD27 配體)；TNFSFS (CD30 配體)；TNFSF9 (4-1 BB 配體)；TOLLIP；類鐸受體；TOP2A (拓撲異構酶 Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TMEM118 (環指蛋白，跨膜蛋白 2；RNFT2；FLJ14627)；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TrpM4 (BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時受體潛在陽離子通道蛋白子家族 M 成員 4)；TRPC6；TSLP；TWEAK；酪胺酸酶 (TYR；OCAIA；OCA1A；酪胺酸酶；SHEP3)；VEGF；VEGFB；VEGFC；多能蛋白聚糖；VHL C5；VLA-4；XCL1 (淋巴細胞趨化蛋白)；XCL2 (SCM-1b)；XCRI(GPR5/ CCXCRI)；YY1；及 ZFPM2。

在某些實例中，藉由本文所揭示之細胞及方法產生之抗體能夠結合至 CD 蛋白，例如 CD3、CD4、CD5、CD16、CD19、CD20、CD21 (CR2 (補體受體 2) 或 C3DR (C3d/愛潑斯坦巴爾病毒 (Epstein Barr virus) 受體)或 Hs.73792)、CD33、CD34、CD64、CD72 (B 細胞分化抗原 CD72、Lyb-2)、CD79b (CD79B、CD79β、IGb (免疫球蛋白相關蛋白 β)、B29)、ErbB 受體家族 (例如 EGF受體、HER2、HER3 或 HER4 受體) 之 CD200 成員；細胞黏附分子，例如 LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7 整聯蛋白及 αv/β3 整聯蛋白 (包括其 α 或 β 次單元，例如抗 CD11a、抗 CD18 或抗 CD11b 抗體)；生長因子，例如 VEGF-A、VEGF-C及；組織因子 (TF)；α 干擾素 (αIFN)；TNFα；介白素，例如 IL-1 β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL 17 AF、IL-1S、IL-13R α1、IL13R α2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3 受體；肥胖症 (OB) 受體；mpl 受體；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F 蛋白、蛋白質 C 等。

在某些實例中，本文所提供之細胞、細胞株及方法可用於產生特異性結合至補體蛋白 C5 之抗體 (或多特異性抗體，例如雙特異性抗體) (例如特異性結合至人類 C5 之抗 C5 激動劑抗體)。抗 C5 抗體可包含 1、2、3、4、5 或 6 個選自以下各項之 CDR：(a) 重鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 SSYYMA (SEQ ID NO:1)；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 AIFTGSGAEYKAEWAKG (SEQ ID NO:26)；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 DAGYDYPTHAMHY (SEQ ID NO: 27)；(d) 輕鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 RASQGISSSLA (SEQ ID NO: 28)；(e) 輕鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 GASETES (SEQ ID NO: 29)；及 (f) 輕鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 QNTKVGSSYGNT (SEQ ID NO: 30)。舉例而言，抗 C5 抗體可包含重鏈可變域 (VH) 序列，其包含一個、兩個或三個選自以下各項之 CDR：(a) 重鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 (SSYYMA (SEQ ID NO: 1)；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 AIFTGSGAEYKAEWAKG (SEQ ID NO: 26)；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 DAGYDYPTHAMHY (SEQ ID NO: 27)；及/或輕鏈可變域 (VL) 序列，其包含一個、兩個或三個選自以下各項之 CDR：(d) 輕鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 RASQGISSSLA (SEQ ID NO: 28)；(e) 輕鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 GASETES (SEQ ID NO: 29)；及 (f) 輕鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 QNTKVGSSYGNT (SEQ ID NO: 30)。上文中重鏈可變區之 CDR1、CDR2 及 CDR3 及輕鏈可變區之 CDR1、CDR2 及 CDR3 的序列在 US 2016/0176954 中分別揭示為 SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123 及 SEQ ID NO: 125。(參見 US 2016/0176954 中之表 7 及表 8。)

在某些實例中，抗 C5 抗體分別包含 VH 及 VL 序列 QVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 31) 及 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN TKVGSSYGNT FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 32)，且包括該等序列之轉譯後修飾。上文之 VH 及 VL 序列在 US 2016/0176954 中分別揭示為 SEQ ID NO: 106 及 SEQ ID NO: 111。(參見 US 2016/0176954 中之表 7 及表 8。) 抗 C5 抗體可為 305L015 (參見 US 2016/0176954)。

在某些實例中，藉由本文所揭示方法產生之抗體能夠結合至 OX40 (例如特異性結合至人類 OX40 之抗 OX40 激動劑抗體)。抗 OX40 抗體可包含 1、2、3、4、5 或 6 個選自以下各項之 CDR：(a) 重鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 DSYMS (SEQ ID NO: 2)；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 DMYPDNGDSSYNQKFRE (SEQ ID NO: 3)；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 APRWYFSV (SEQ ID NO: 4)；(d) 輕鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5)；(e) 輕鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 YTSRLRS (SEQ ID NO: 6)；及 (f) 輕鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 QQGHTLPPT (SEQ ID NO: 7)。舉例而言，抗 OX40 抗體可包含重鏈可變域 (VH) 序列，其包含一個、兩個或三個選自以下各項之 CDR：(a) 重鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 DSYMS (SEQ ID NO: 2)；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 DMYPDNGDSSYNQKFRE (SEQ ID NO: 3)；及 (c) 重鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 APRWYFSV (SEQ ID NO: 4)；及/或輕鏈可變域 (VL) 序列，其包含一個、兩個或三個選自以下各項之 CDR：(a) 輕鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5)；(b) 輕鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 YTSRLRS (SEQ ID NO: 6)；及 (c) 輕鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 QQGHTLPPT (SEQ ID NO: 7)。抗 OX40 抗體可分別包含 VH 及 VL 序列 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DSYMSWVRQA PGQGLEWIGD MYPDNGDSSY NQKFRERVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCVLAP RWYFSVWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 8) 及 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GHTLPPTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO: 9)，且包括該等序列之轉譯後修飾。

在某些實例中，抗 OX40 抗體包含 1、2、3、4、5 或 6 個選自以下各項之 CDR：(a) 重鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 NYLIE (SEQ ID NO: 10)；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 VINPGSGDTYYSEKFKG (SEQ ID NO: 11)；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 DRLDY (SEQ ID NO: 12)；(d) 輕鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 HASQDISSYIV (SEQ ID NO: 13)；(e) 輕鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 HGTNLED (SEQ ID NO: 14)；及 (f) 輕鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 VHYAQFPYT (SEQ ID NO: 15)。舉例而言，抗 OX40 抗體可包含重鏈可變域 (VH) 序列，其包含一個、兩個或三個選自以下各項之 CDR：(a) 重鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 NYLIE (SEQ ID NO: 10)；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 VINPGSGDTYYSEKFKG (SEQ ID NO: 11)；及 (c) 重鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 DRLDY (SEQ ID NO: 12)；及/或輕鏈可變域 (VL) 序列，其包含一個、兩個或三個選自以下各項之 CDR：(a) 輕鏈可變區 CDR1，其包含胺基酸序列 HASQDISSYIV (SEQ ID NO: 13)；(b) 輕鏈可變區 CDR2，其包含胺基酸序列 HGTNLED (SEQ ID NO: 14)；及 (c) 輕鏈可變區 CDR3，其包含胺基酸序列 VHYAQFPYT (SEQ ID NO: 15)。抗 OX40 抗體可分別包含 VH 及 VL 序列 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYAFT NYLIEWVRQA PGQGLEWIGV INPGSGDTYY SEKFKGRVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARDR LDYWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 16) 及 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCHASQDIS SYIVWYQQKP GKAPKLLIYH GTNLEDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVH YAQFPYTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO: 17)，且包括該等序列之轉譯後修飾。

關於抗 OX40 抗體之其他細節提供於 WO 2015/153513 中，其全部內容以引用方式併入本文中。

在某些實例中，藉由本文所揭示之細胞及方法產生的抗體能夠結合至流行性感冒病毒 B 血球凝集素 (亦即「fluB」) (例如在活體外及/或在活體內結合來自流行性感冒 B 病毒之山形 (Yamagata) 譜系的血球凝集素、結合來自流行性感冒 B 病毒之維多利亞 (Victoria) 譜系的血球凝集素、結合來自流行性感冒 B 病毒之祖先譜系的血球凝集素或結合來自流行性感冒 B 病毒之山形譜系、維多利亞譜系及祖先譜系的血球凝集素的抗體)。關於抗 FluB 抗體之其他細節闡述於 WO 2015/148806 中，其全部內容以引用方式併入本文中。

在某些實例中，藉由本文所揭示之細胞及方法產生的抗體能夠結合至低密度脂蛋白受體相關蛋白 (LRP)-1 或 LRP-8 或轉鐵蛋白受體及至少一種選自由以下所組成之群組的目標蛋白：β-分泌酶 (BACE1 或 BACE2)、α-分泌酶、γ-分泌酶、tau-分泌酶、類澱粉前驅蛋白質 (APP)、死亡受體 6 (DR6)、類澱粉 β 肽、α-突觸核蛋白、帕金森蛋白 (Parkin)、杭丁頓蛋白 (Huntingtin)、p75 NTR、CD40 及半胱天冬酶-6。

在某些實例中，藉由本文所揭示之細胞及方法產生之抗體係抵抗 CD40 之人類 IgG2 抗體。在某些實施例中，抗 CD40 抗體為 RG7876。

在某些實例中，本發明揭露之細胞、細胞株及/或方法可用於產生多肽。多肽可為標定免疫細胞介素。標定免疫細胞介素可為 CEA-IL2v 免疫細胞介素，例如 CEA-IL2v 免疫細胞介素 RG7813。標定免疫細胞介素可為 FAP-IL2v 免疫細胞介素，例如 FAP-IL2v 免疫細胞介素 RG7461。

在實例中，藉由本文所提供之細胞、細胞株及/或或方法產生的多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 能夠結合至 CEA 及至少一種其他目標分子。根據本文所提供之方法產生的多特異性抗體 (例如雙特異性抗體)可能能夠結合至腫瘤標定細胞介素及至少一種其他目標分子。根據本文所提供之方法產生的多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 可融合至 IL2v (亦即介白素 2 變異體) 且結合基於 IL1 之免疫細胞介素及至少一種其他目標分子。在實例中，根據本文所提供之方法產生的多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 係 T 細胞雙特異性抗體 (亦即雙特異性 T 細胞銜接體或 BiTE。

在某些實例中，根據本文所提供之方法產生的多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 能夠結合至選自以下各項之至少兩種目標分子：IL-1 α 及 IL- 1 β、IL-12 及 IL-1S；IL-13 及 IL-9；IL-13 及 IL-4；IL-13 及 IL-5；IL-5 及 IL-4；IL-13 及 IL-1β；IL-13 及 IL- 25；IL-13 及 TARC；IL-13 及 MDC；IL-13 及 MEF；IL-13 及 TGF-~；IL-13 及 LHR 激動劑；IL-12 及 TWEAK、IL-13 及 CL25；IL-13 及 SPRR2a；IL-13 及 SPRR2b；IL-13 及 ADAMS、IL-13 及 PED2、IL17A 及 IL17F、CEA 及 CD3、CD3 及 CD19、CD138 及 CD20；CD138 及 CD40；CD19 及 CD20；CD20 及 CD3；CD3S 及 CD13S；CD3S 及 CD20；CD3S 及 CD40；CD40 及 CD20；CD-S 及 IL-6；CD20 及 BR3、TNF α 及 TGF-β、TNF α 及 IL-1 β；TNF α 及 IL-2、TNF α 及 IL-3、TNF α 及 IL-4、TNF α 及 IL-5、TNF α 及 IL6、TNF α 及 IL8、TNF α 及 IL-9、TNF α 及 IL-10、TNF α 及 IL-11、TNF α 及 IL-12、TNF α 及 IL-13、TNF α 及 IL-14、TNF α 及 IL-15、TNF α 及 IL-16、TNF α 及 IL-17、TNF α 及 IL-18、TNF α 及 IL-19、TNF α 及 IL-20、TNF α 及 IL-23、TNF α 及 IFN α、TNF α 及 CD4、TNF α 及 VEGF、TNF α 及 MIF、TNF α 及 ICAM-1、TNF α 及 PGE4、TNF α 及 PEG2、TNF α 及 RANK 配體、TNF α 及 Te38、TNF α 及 BAFF、TNF α 及 CD22、TNF α 及 CTLA-4、TNF α 及 GP130、TNF A 及 IL-12p40、VEGF 及血管生成素、VEGF 及 HER2、VEGF-A 及 HER2、VEGF-A 及 PDGF、HER1 及 HER2、VEGFA 及 ANG2、VEGF-A 及 VEGF-C、VEGF-C 及 VEGF-D、HER2 及 DR5、VEGF 及 IL-8、VEGF 及 MET、VEGFR 及 MET 受體、EGFR 及 MET、VEGFR 及 EGFR、HER2 及 CD64、HER2 及 CD3、HER2 及 CD16、HER2 及 HER3；EGFR (HER1) 及 HER2、EGFR 及 HER3、EGFR 及 HER4、IL-14 及 IL-13、IL-13 及 CD40L、IL4 及 CD40L、TNFR1 及 IL-1 R、TNFR1 及 IL-6R 及 TNFR1 及 IL-18R、EpCAM 及 CD3、MAPG 及 CD28、EGFR 及 CD64、CSPGS 及 RGM A；CTLA-4 及 BTN02；IGF1 及 IGF2；IGF1/2 及 Erb2B；MAG 及 RGM A；NgR 及 RGM A；NogoA 及 RGM A；OMGp 及 RGM A；POL-l 及 CTLA-4；以及 RGM A 及 RGM B。

在某些實例中，根據本文所提供之方法產生的多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 為抗 CEA/抗 CD3 雙特異性抗體。抗 CEA/抗 CD3 雙特異性抗體為 RG7802。在某些實施例中，抗 CEA/抗 CD3 雙特異性抗體包含陳述於下文所提供 SEQ ID NO: 18-21 中之胺基酸序列： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASAAVG TYVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRKRGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCHQ YYTYPLFTFG QGTKLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO: 18) QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCGSSTGAVT TSNYANWVQE KPGQAFRGLI GGTNKRAPGT PARFSGSLLG GKAALTLSGA QPEDEAEYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSC (SEQ ID NO: 19) QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EFGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTKTGEATY VEEFKGRVTF TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARWD FAYYVEAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDGGGGS GGGGSEVQLL ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVSRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNTLYLQM NSLRAEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGECDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALGAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP CRDELTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 20) QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EFGMNWVRQA PGQGLEWMG WINTKTGEATY VEEFKGRVTF TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARWD FAYYVEAMD YWGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTS GVHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHT CPPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVH NAKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALGAPIEKTI SKAKGQPRE PQVCTLPPSRD ELTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFF LVSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K (SEQ ID NO: 21)

關於抗 CEA/抗 CD3 雙特異性抗體之其他細節提供於 WO 2014/121712 中，該案件之全部內容以引用方式併入本文中。

在某些實例中，藉由本文所揭示之細胞及方法產生的多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 為抗 VEGF/抗血管生成素雙特異性抗體。在某些實例中，抗 VEGF/抗血管生成素雙特異性抗體雙特異性抗體為 Crossmab。在某些實例中，抗 VEGF/抗血管生成素雙特異性抗體為 RG7716。在某些實例中，抗 CEA/抗 CD3 雙特異性抗體包含陳述於下文所提供 SEQ ID NO: 22-25 中之胺基酸序列： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMAS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLAQDWL NGKEYKCKVS NKALGAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC RDELTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 22) QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYYMHWVRQA PGQGLEWMGW INPNSGGTNY AQKFQGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARSP NPYYYDSSGY YYPGAFDIWG QGTMVTVSSA SVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGECDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMAS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLAQDWL NGKEYKCKVS NKALGAPIEK TISKAKGQPR EPQVCTLPPS RDELTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 23) DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC (SEQ ID NO: 24) SYVLTQPPSV SVAPGQTARI TCGGNNIGSK SVHWYQQKPG QAPVLVVYDD SDRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRVEAG DEADYYCQVW DSSSDHWVFG GGTKLTVLSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC (SEQ ID NO: 25)

在某些實例中，藉由本文所揭示之方法產生的多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 為抗 Ang2/抗 VEGF 雙特異性抗體。抗 Ang2/抗 VEGF 雙特異性抗體可為 RG7221。抗 Ang2/抗 VEGF 雙特異性抗體可基於 CAS 號 1448221-05-3。

可使用視情況結合至其他分子之可溶性抗原或其片段作為用於生成抗體的免疫原。對於跨膜分子 (例如受體) 而言，可使用該等分子之片段(例如受體之細胞外域) 作為免疫原。或者，可使用表現跨膜分子之細胞作為免疫原。該等細胞可衍生自天然來源 (例如癌細胞株) 或可為已藉由重組技術轉變以表現跨膜分子之細胞。可用於製備抗體之其他抗原及其形式為熟習此項技術者所明瞭。

在某些實例中，藉由本文所揭示之細胞、細胞株及/或方法產生的多肽 (例如抗體) 能夠結合至/可進一步結合至化學分子 (例如染料或細胞毒性劑 (例如化學治療劑))、藥物、生長抑制劑、毒素 (例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段) 或放射性同位素 (亦即放射性結合物)。包含使用本文所闡述方法產生之抗體或雙特異性抗體之免疫結合物可含有細胞毒性劑，該細胞毒性劑結合至僅一條重鏈或僅一條輕鏈之恆定區。 抗體變異體

考慮本文所提供抗體之變異體。舉例而言，可期望改變抗體的結合親和力及/或其他生物性質。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如，抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。 取代、插入及缺失變異體

舉例而言，提供具有一個或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代誘變的目標位點包括 CDR 和 FR。保守取代之實例展示於表 1 之「較佳取代」標題下。表 1 中之「實例性取代」標題下提供了更多實質性變化的實例，且下文將參照胺基酸側鏈種類進行進一步闡述。可將胺基酸取代引入目標抗體中，並篩選具有期望活性之產物，該期望活性係例如保留/改良抗原結合、降低免疫原性或改良 ADCC 或 CDC。表 1：胺基酸取代

原始殘基	例示性取代	優選取代
Ala (A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg (R)	Lys；Gln；Asn	Lys
Asn (N)	Gln；His；Asp；Lys；Arg	Gln
Asp (D)	Glu；Asn	Glu
Cys (C)	Ser；Ala	Ser
Gln (Q)	Asn；Glu	Asn
Glu (E)	Asp；Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸	Leu
Leu (L)	正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys (K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met (M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe (F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val；Ser	Ser
Trp (W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸	Leu

胺基酸可根據常見的側鏈性質進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly, Pro；及 (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。

非保守取代通常需要將該等種類中之一個種類的成員交換為另一種類的成員。

一種類型的取代變體涉及取代一個或多個親代抗體 (例如，人源化或人抗體) 之超變異區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變異體將相對於親代抗體在某些生物學特性（例如，提高親和性、降低免疫原性）上具有修飾（例如，改善）及/或基本上保留親代抗體之某些生物學特性。實例性取代變異體係親和力成熟的抗體，其可以方便地生成，例如使用基於噬菌體顯示的親和力成熟技術，例如本文所闡述的彼等。簡而言之，取代一個或多個。CDR 殘基發生突變，並且變體抗體在噬菌體上展示並篩選出特定的生物學活性 (例如，結合親和性)。

可在 CDR 中進行改變 (例如取代) 以改良抗體親和力。該等改變可在 CDR 「熱點」中進行，亦即在體細胞成熟過程中發生高頻突變之由密碼子編碼的殘基 (例如參見 Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 及/或與抗原接觸的殘基，並測試所得變異體 VH 或 VL 之結合親和力。藉由構築並自二級庫中重新選擇來達成親和力成熟已闡述於例如 Hoogenboom 等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 等人編輯，Human Press，Totowa，NJ，(2001)) 中。在親和性成熟之某些方面，通過多種方法 (例如，易錯 PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變) 將多樣性引入選擇用於成熟的變異基因中。然後創建第二庫。然後篩選該庫，以識別具有所需之親和力的任何抗體變異體。引入多樣性的另一種方法是 CDR 定向方法，其中將若干 CDR 殘基 (例如，每次 4-6 個殘基) 隨機化。可例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特異性鑑別參與抗原結合的 CDR 殘基。特別地，CDR-H3 和 CDR-L3 經常成為靶點。

在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要該等改變不顯著降低抗體抗原結合的能力即可。舉例而言，可在 CDR 中實施並不實質上降低結合親和力的保守改變 (例如本文所提供之保守取代)。舉例而言，該等改變可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之某些 VH 和 VL 序列變體中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。

如 Cunningham 及 Wells (1989) Science，244: 1081-1085 中所闡述，用於鑑別可能標定誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在該方法中，識別殘基或目標殘基組（例如，帶電荷的殘基，如 Arg、Asp、His、Lys 和 Glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸（例如，丙胺酸或聚丙胺酸）取代以確定抗體與抗原之交互作用是否受到影響。可在胺基酸位置處引入其他取代以表明對初始取代的功能敏感性。替代地或另外，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。該等接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物經標定或消除。可篩選變異體以判定其是否含有期望性質。

胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之序列，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 (例如，對於 ADEPT (針對抗體之酶前藥治療)) 或提高抗體血清半衰期之多肽。 醣基化變異體

在某些實例中，改變本文所提供的抗體以增加或降低抗體發生醣基化之程度。在抗體中添加或缺失醣基化位點可藉由改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地達成。

在抗體包含 Fc 區時，可改變與其附接的寡醣。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡糖，其通常藉由 N 鍵結連接至 Fc 區域 CH2 域之 Asn297。例如參見 Wright 等人，TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺 (GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中附接至 GlcNAc 的岩藻糖。在一些實例中，可對本揭露抗體中的寡醣進行修飾以產生具有某些改良性質的抗體變異體。

在一些實例中，提供具有非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體，亦即缺少 (直接或間接地) 附接至 Fc 區的岩藻糖的寡醣結構。此等非岩藻糖基化寡糖 (也稱為「去岩藻糖基化」寡糖) 特定而言在雙天線型寡糖結構的莖中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻糖殘基的 N-連接寡糖。在實例中，提供與天然或親代抗體相比在 Fc 區中具有增加比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體。舉例而言，非岩藻醣基化寡醣的比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (亦即不存在岩藻醣基化寡醣)。非岩藻醣基化寡醣之百分比係缺少岩藻糖殘基之寡醣相對於附接至 Asn 297 (例如復合物、雜合及高甘露糖結構) 的所有寡醣的總和之 (平均) 量，該百分比藉由 MALDI-TOF 質譜測得，如 WO 2006/082515 中所闡述。Asn 297 係指位於 Fc 區位置 297 附近之天門冬醯胺酸殘基 (Fc 區殘基的 EU 編號)；然而，Asn 297 亦可位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，亦即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 與 300 之間。該等在 Fc 區中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體可具有改良的 FcγRIIIa 受體結合及/或改良的效應功能，尤其係改良的 ADCC 功能。參見例如 US 2003/0157108；US 2004/0093621。

能夠產生具有減少的岩藻醣基化之抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其在實例 11 中)；及剔除細胞株，例如剔除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因 FUT8 的 CHO 細胞 (例如參見 Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004)；Kanda, Y.等人，Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107)；或 GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞 (例如參見 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。

在其他實例中，抗體變異體提供有二等分之寡醣，例如其中附接至抗體之 Fc 區的雙天線型寡醣由 GlcNAc 平分。該等抗體變異體可具有如上文所闡述之減少的岩藻醣基化及/或改良的 ADCC 功能。此等抗體變體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。

還提供了在寡糖上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。該等抗體變異體可具有改良的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。 Fc 區域變異體

在某些實例中，可在本文所提供之抗體的 Fc 區中引入一個或多個胺基酸修飾，由此生成 Fc 區變異體。Fc 區變異體可包含人類 Fc 區序列(例如人類 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區)，其在一個或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾 (例如取代)。

本揭露考慮了一種具有一部分但非全部效應功能的抗體變異體，其成為以下應用中之期望候選物：其中抗體活體內半衰期較為重要，但某些效應功能 (例如補體依賴性細胞毒性 (CDC) 及抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)) 係不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性檢定以證實 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。舉例而言，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合檢定以確保抗體缺乏 Fc R 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。介導 ADCC 的主要細胞 NK 細胞僅表現 Fc RIII，而單核球表現 Fc RI、Fc RII 及 Fc RIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 及 Kinet 的論文 (Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之 ADCC 活性的活體外檢定的非限制性實例闡述於美國專利第 5,500,362 號 (例如參見，Hellstrom, I. 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 及 Hellstrom, I 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)) 中。或者，可採用非放射性檢定 (例如參見用於流式細胞術的 ACTI™ 非放射性細胞毒性檢定 (CellTechnology，Inc. Mountain View，CA)；及 CytoTox 96® 非放射性細胞毒性檢定 (Promega，Madison，WI))。用於此等分析的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。替代地或另外，可在例如 Clynes 等人在 Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998) 中揭示的動物模型中在活體內評價目標分子之 ADCC 活性。亦可實施 C1q 結合檢定以證實該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。例如參見 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 及 C3c 結合 ELISA。為評價補體活化，可執行 CDC 檢定 (例如參見 Gazzano-Santoro 等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg 等人，Blood 101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 與 M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合及活體內清除率/半衰期判定亦可使用業內已知方法執行 (例如參見 Petkova, S.B. 等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929 A1)。

效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此類 Fc 突變體包括在胺基酸位置 265、269、270、297 和 327 中的兩個或更多個取代的 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 和 297 被丙胺酸所取代 (美國專利號 7,332,581)。

其中描述了某些與 FcR 的結合能力得到改善或減弱的抗體變異體。(例如參見美國專利第 6,737,056 號；WO 2004/056312 及 Shields 等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。)

在某些實例中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該等取代改良了 ADCC，例如 Fc 區的位置 298、333 及/或 334 (殘基的 EU 編號) 處之取代。

在某些實例中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該等取代減弱了 FcγR 結合，例如 Fc 區的位置 234 及 235 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在一個方面，取代為 L234A 和 L235A (LALA)。抗體變異體可進一步在衍生自人類 IgG1 Fc 區之 Fc 區中包含 D265A 及/或 P329G。取代可為衍生自人類 IgG1 Fc 區之 Fc 區中的 L234A、L235A 及 P329G (LALA-PG)。參見例如 WO 2012/130831。取代可為衍生自人類 IgG1 Fc 區之 Fc 區中的 L234A、L235A 及 D265A (LALA-DA)。

在一些實例中，在 Fc 區中進行改變，從而改變 (亦即改良或減少) C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如如美國專利第 6,194,551 號、WO 99/51642 及 Idusogie 等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) 中所闡述。

具有更長半衰期並改良了與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，參見 Guyer 等人，J. Immunol. 117:587 (1976) 及 Kim 等人，J. Immunol. 24:249 (1994)) 之結合的抗體闡述於 US2005/0014934 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此等 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變異體：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如 Fc 區殘基 434 之取代 (例如參見美國專利第 7,371,826 號；Dall'Acqua, W.F. 等人，J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)。

通過定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 相互作用至關重要之 Fc 區域殘基 (參見例如，Dall’Acqua, W.F. 等人 J. Immunol 169 (2002) 5171-5180)。殘基 I253、H310、H433、N434 和 H435 (EU 指數編號) 參與相互作用 (Medesan, C. 等人，Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542)。已發現殘基 I253、H310 和 H435 對於人 Fc 與小鼠 FcRn 之相互作用至關重要 (Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819)。對人 Fc-人 FcRn 複合物的研究表明，殘基 I253、S254、H435 和 Y436 對於相互作用至關重要 (Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。在 Yeung, Y.A. 等人 (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 中，已經報導並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 的各種突變體。

在某些實例中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該等取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 253 及/或 310 及/或 435 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些實例中，抗體變異體包含 Fc 區，該 Fc 區具有在位置 253、310 及 435 處之胺基酸取代。取代可為衍生自人類 IgG1 Fc 區之 Fc 區中之 I253A、H310A 及 H435A。參見例如 Grevys, A 等人，J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。

在某些實例中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該等取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 310 及/或 433 及/或 436 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些實例中，抗體變異體包含 Fc 區，該 Fc 區具有在位置 310、433 及 436 處之胺基酸取代。取代可為衍生自人類 IgG1 Fc 區之 Fc 區中之 H310A、H433A 及 Y436A。(例如參見 WO 2014/177460 A1)。

在某些實例中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，該等取代增加 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 252 及/或 254 及/或 256 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些實例中，抗體變異體包含 Fc 區，該 Fc 區具有在位置 252、254 及 256 處之胺基酸取代。在一個方面，取代為 Fc 區域中之 M252Y、S254T 和 T256E，其來源於人 IgG1 Fc 區域。亦參見 Duncan & Winter，Nature 322: 738-40 (1988)；美國專利第 5,648,260 號；美國專利第 5,624,821 號；及 WO 94/29351，其中涉及 Fc 區變異體之其他實例。

如本文所報導之抗體的重鏈的 C 端可以是以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一較佳實例中，重鏈之 C-末端為縮短的 C-末端結尾 PG。在本文所報告的所有方面中之一方面，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，胺基酸位置的 EU 指數編號)。在本文所報告的所有方面中之一方面，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，胺基酸位置的 EU 指數編號)。 半胱胺酸工程化抗體變異體

在某些實例中，可期望產生半胱胺酸工程化抗體，例如THIOMAB ^TM抗體，其中抗體之一個或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實例中，將取代殘基出現在抗體之可進入的位點。藉由使用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接體-藥物部分) 結合以形成免疫結合物，如本文進一步所闡述。半胱胺酸工程化抗體可如例如美國專利第 7,521,541 號、第8,30,930 號、第 7,855,275 號、第 9,000,130 號或 WO 2016040856 中所闡述的方法生成。 抗體衍生物

在某些實例中，可進一步修飾本文所提供之抗體以含有業內已知且容易獲得的其他非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三㗁𠮿、乙烯/順丁烯二酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物) 以及葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或無支鏈。附接至抗體的聚合物之數量可有所變化，且若附接的聚合物超過一，則其可為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量和/或類型可基於以下考慮因素來確定，這些考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。 免疫結合物

本揭露亦提供包含本文所揭示之抗體的免疫結合物，該抗體結合 (化學鍵結) 至一種或多種治療劑，例如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素 (例如來源於細菌、真菌、植物或動物之蛋白毒素、酶活性毒素或其片段) 或放射性同位素。

在一些實例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物 (ADC)，其中抗體與上述一種或多種治療劑結合。通常使用連接子將抗體連接至一種或多種治療劑。ADC 技術概述 (包括治療劑及藥物以及連接體之實例) 陳述於 Pharmacol Review 68:3-19 (2016) 中。

在其他實例中，免疫結合物包含結合至酶活性毒素或其片段的本文所闡述之抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉 A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素 A 鏈 (來源於銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白 A 鏈、相思子毒素 A 鏈、莫迪素 A 鏈、α-帚麴菌素、油桐 (Aleurites fordii) 蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陸 (Phytolaca americana) 蛋白 (PAPI、PAPII 及 PAP-S)、苦瓜抑制劑、痲瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、米托菌素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及單端孢黴烯族毒素。

在其他實例中，免疫結合物包含結合至放射性原子以形成放射性結合物的如本文所闡述之抗體。在另一個實施例中，多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212 及 Lu 放射性同位素。在放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍掃描研究之放射性原子，例如 tc99m 或 I123；或用於核磁共振 (NMR) 成像 (亦稱為磁共振成像，mri) 之自旋標記，例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。

抗體和細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白耦聯劑進行製備，該雙功能蛋白偶合劑例如，N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯 (SMCC)、亞胺基硫烷 (IT)、亞胺基酸酯的雙功能衍生物（例如，己二酸二甲酯鹽酸鹽，HCl)、活性酯（例如，雙琥珀醯亞胺辛二酸)、醛（例如，戊二醛)、雙疊氮化合物（例如，雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物（例如，雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯（例如，甲苯 2,6-二異氰酸酯）和雙活性氟化合物（例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。舉例而言，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按照 Vitetta 等人 (Science 238:1098 (1987)) 所闡述的方法進行製備。用於將放射性核苷酸共軛至抗體的一種示例性螯合劑為碳-14 標記的 1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)。參見 WO 94/11026。連接子可以為促進細胞中細胞毒性藥物釋放的「可切割連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定之連接體、對肽酶敏感之連接體、光不穩定之連接體、二甲基連接體或含二硫鍵之連接體 (Chari 等人，Cancer Res. 52:127-131 (1992)；美國專利第 5,208,020 號)。

本文之免疫結合物或 ADC 明確考慮但不限於該等使用交聯劑製得之結合物，該交聯劑包括但不限於市面有售 (例如購自 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A)) 之 BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC 及磺基-SMPB 以及 SVSB (琥珀醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)。 5.7 實例性非限制性實施例

A. 在某些實施例中，本發明揭露涉及一種經分離真核細胞株，其中該細胞株在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。

A1、在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A 之細胞株，其中該細胞株在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型突變。

A2. 在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A 或 A1之細胞株，其中該細胞株為動物細胞株或真菌細胞株。

A3.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A2 之細胞株，其中該動物細胞株為哺乳動物細胞株。

A4.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A3 之細胞株，其中該哺乳動物細胞株為 COS 細胞株、VERO 細胞株、HeLa 細胞株、HEK 293 細胞株、PER-C6 細胞株、K562 細胞株、MOLT-4 細胞株、Ml 細胞株、NS-1 細胞株、COS-7 細胞株、MDBK 細胞株、MDCK 細胞株、MRC-5 細胞株、WI-38 細胞株、WEHI 細胞株、SP2/0 細胞株、BHK 細胞株或 CHO 細胞株或其衍生物。

A5.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A4 之細胞株，其中該 CHO 細胞株為 CHO K1 細胞株、CHO K1SV 細胞株、a DG44 細胞株、DUKXB-11 細胞株、CHOK1S 細胞株或 CHO K1M 細胞株或其衍生物。

A6.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A 至 A5 中任一者之細胞株，其中該細胞株在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含缺失。

A7.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A 至 A6 中任一者之細胞株，其中該細胞株進一步包含病毒基因體及一個或多個編碼病毒衣殼之多核苷酸。

A8.在某些實施例中，本發明揭露涉及如A 至 A7 之細胞株，其中該細胞株進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。

A9.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A8 之細胞株，其中該編碼目標產物之多核苷酸在目標位置整合入該細胞株的細胞基因體中。

A10.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A8 之細胞株，其中該編碼目標產物之多核苷酸隨機整合入該細胞株的細胞基因體中。

A11.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A8 至 A10 中任一者之細胞株，其中該編碼目標產物之多核苷酸為染色體外多核苷酸。

A12.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A8 至 A10 中任一者之細胞株，其中該編碼目標產物之多核苷酸整合入該株細胞之染色體中。

A13.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A8 至 A10 中任一者之細胞株，其中目標產物包含重組多肽。

A14.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A8 至 A13 中任一者之細胞株，其中該目標產物包含抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。

A15.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A14 之細胞株，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。

A16.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A14 或 A15 之細胞株，其中該抗體係由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。

A17.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A14 至 A16 中任一者之細胞株，其中該抗體包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。

A18.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A14 至 A17 中任一者之細胞株，其中該抗體包含單株抗體。

A19.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A6 至 A18 中任一者之細胞株，其中該細胞株之比產率高於包含野生型 Bax 及 Bak 基因中之每一者之多核苷酸及功能性副本的相應經分離真核細胞株。

A20.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A 至 A19 中任一者之細胞株，其中該細胞株之抗細胞凋亡性大於包含 Bax 及 Bak 基因中之每一者之功能性副本的相應經分離真核細胞株。

A21.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A 至 A20 中任一者之細胞株，其中將該細胞株用於諸如饋料批式、灌流、程序強化灌流、半連續灌流或連續灌流等細胞培養程序中。

A22.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A21 之細胞株，其中該細胞株係用於強化灌流程序中。

A23.在某些實施例中，本發明揭露涉及一種組成物，其包含如 A 至 A22中任一者之真核細胞株。

A24.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 A23 之組成物，其進一步包含細胞培養基。

B. 在某些實施例中，本發明揭露涉及包含細胞培養基及複數個真核細胞之細胞培養物，其中該複數個真核細胞中之每一細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。

B1.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B 之細胞培養物，其中每一細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型突變。

B2.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B 或 B1 之細胞培養物，其中該複數個真核細胞中之每一細胞在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含缺失。

B3.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B 至 B2 中任一者之細胞培養物，其中該等細胞為動物細胞或真菌細胞。

B4.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B3 之細胞培養物，其中該等動物細胞為哺乳動物細胞。

B5.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B4 之細胞培養物，其中該等哺乳動物細胞為 COS 細胞、VERO 細胞、HeLa 細胞、HEK 293 細胞、PER-C6 細胞、K562 細胞、MOLT-4 細胞、Ml 細胞、NS-1 細胞、COS-7 細胞、MDBK 細胞、MDCK 細胞、MRC-5 細胞、WI-38 細胞、WEHI 細胞、SP2/0 細胞、BHK 細胞或 CHO 細胞或其衍生物。

B6.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B5 之細胞培養物，其中該等 CHO 細胞為 CHO K1 細胞、CHO K1SV 細胞、DG44 細胞、DUKXB-11 細胞、CHOK1S 細胞或 CHO K1M 細胞或其衍生物。

B7.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B 至 B6 中任一者之細胞培養物，其中該細胞培養物進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。

B8.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B7 之細胞培養物，其中該編碼目標產物之多核苷酸在目標位置整合入該等細胞之細胞基因體中。

B9.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B7 之細胞培養物，其中該編碼目標產物之多核苷酸隨機整合入該等細胞之細胞基因體中。

B10.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B7 至 B9 中任一者之細胞培養物，其中該編碼目標產物之多核苷酸為染色體外多核苷酸。

B11.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B7 至 B9 中任一者之細胞培養物，其中該編碼目標產物之多核苷酸整合入該等細胞之染色體中。

B12.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B7 至 B11 中任一者之細胞培養物，其中該目標產物包含重組多肽。

B13.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B7 至 B12 中任一者之細胞培養物，其中該目標產物為抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。

B14.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B13 之細胞培養物，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。

B15.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B13 或 B14 之細胞培養物，其中該抗體係由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。

B16.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B13 至 B15 中任一者之細胞培養物，其中該抗體包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。

B17.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B13 至 B16 中任一者之細胞培養物，其中該抗體包含單株抗體。

B18.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B 至 B17 中任一者之細胞培養物，其中該等細胞中之每一者進一步包含重組多核苷酸。

B19.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 B 至 B18 之細胞培養物，其中將該等細胞用於諸如饋料批式、灌流、程序強化灌流、半連續灌流或連續灌流等細胞培養程序中。

B20.在某些實施例中，本揭發明露涉及如 B19 之細胞培養物，其中該等細胞係用於強化灌流程序中。

C. 在某些實施例中，本發明揭露涉及減小真核細胞中之細胞凋亡活性的方法，其包含向該細胞投予基因工程系統，其中該基因工程系統：a) 敲落或剔除 Bax 多肽同功型之表現；及 b) 敲落或剔除 Bak 多肽同功型之表現。

C1.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C 之方法，其中該方法進一步包含在饋料批式、灌流、程序強化灌流、半連續灌流或連續灌流細胞培養程序中採用真核細胞。

C2.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C1 之方法，其中該等真核細胞係用於強化細胞培養程序中。

C3.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C 至 C2 中任一者之方法，其中該基因工程系統係選自由以下所組成之群組：CRISPR/Cas 系統、鋅指核酸酶 (ZFN) 系統、類轉錄活化因子核酸酶 (TALEN) 系統及其組合。

C4.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C 至 C3 中任一者之方法，其中該基因工程系統為或包含 CRISPR/Cas9 系統。

C5.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C4 之方法，其中該 CRISPR/Cas9 系統包含：a) Cas9 分子；b) 至少一個第一導引 RNA (gRNA)，其包含與 Bax 基因中之目標序列互補的導向序列；及 c) 至少一個第二 gRNA，其包含與 Bak 基因中之目標序列互補的導向序列。

C6.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C5 之方法，其中該等目標序列中之至少一者係該 Bax 基因的一部分，且/或其中該等目標序列中之至少一者係該 Bak 基因的一部分。

C7.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C 至 C6 中任一者之方法，其中該 Bax 多肽之表現及/或該 Bak 多肽之表現經剔除，且該細胞之細胞凋亡活性相較於參考細胞之細胞凋亡活性係經降低。

C8.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C 至 C6 中任一者之方法，其中該 Bax 多肽之表現及/或該 Bak 多肽之表現被敲落，且該細胞之細胞凋亡活性相較於參考細胞之細胞凋亡活性係經降低。

C9.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C7 或 C8 之方法，其中該細胞之細胞凋亡活性係藉由比較在產生期之第 14 天所判定一群該等細胞之存活率與一群該等參考細胞之存活率所判定。

C10.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C7 至 C9 中任一者之方法，其中該參考細胞係包含該等 Bax 及 Bak 基因之野生型等位基因的細胞。

C11.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C 至 C10 中任一者之方法，其中該基因工程系統為或包含鋅指核酸酶 (ZFN) 系統或類轉錄活化因子核酸酶 (TALEN) 系統。

C12.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C 至 C11 中任一者之方法，其中該細胞株研發系統包含定點整合、隨機整合或轉座酶系統。

C13.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C 至 C12 中任一者之方法，其中該細胞為動物細胞或真菌細胞。

C14.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C13 之方法，其中該動物細胞為哺乳動物細胞。

C15.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C14 之方法，其中該哺乳動物細胞為 COS 細胞、VERO 細胞、HeLa 細胞、HEK 293 細胞、PER-C6 細胞、K562 細胞、MOLT-4 細胞、Ml 細胞、NS-1 細胞、COS-7 細胞、MDBK 細胞、MDCK 細胞、MRC-5 細胞、WI-38 細胞、WEHI 細胞、SP2/0 細胞株、BHK 細胞或 CHO 細胞株或其衍生物。

C16.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C15 之方法，其中該 CHO 細胞為 CHO K1 細胞、CHO K1SV 細胞、DG44 細胞、DUKXB-11 細胞、CHOK1S 細胞或 CHO K1M 細胞或其衍生物。

C17.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C 至 C16 中任一者之方法，其中該細胞進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。

C18.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C17 之方法，其中該編碼目標產物之多核苷酸在目標位置整合入該細胞之細胞基因體中。

C19.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C17 之方法，其中該編碼目標產物之多核苷酸隨機整合入該細胞之細胞基因體中。

C20.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C17 至 C19 中任一者之方法，其中該編碼目標產物之多核苷酸為染色體外多核苷酸。

C21.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C17 至 C19 中任一者之方法，其中該編碼目標產物之多核苷酸整合入該細胞之染色體中。

C22.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C17 至 C21 中任一者之方法，其中該目標產物包含重組多肽。

C23.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C17 至 C22 中任一者之方法，其中該目標產物為抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。

C24.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C23 之方法，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。

C25.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C23 或 C24 之方法，其中該抗體係由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。

C26.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C23 至 C25 中任一者之方法，其中該抗體包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。

C27.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C23 至 C26 中任一者之方法，其中該抗體包含單株抗體。

C28.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 C23 至 C27 中任一者之方法，其中該等細胞中之每一者進一步包含重組多核苷酸。

D. 在某些實施例中，本發明揭露涉及產生重組多肽之方法，其包含：在適於產生該多肽之條件下培養包含以下各項的真核細胞株：(a) Bax 及 Bak 基因中之每一者中的穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變；及 (b) 編碼該重組多肽之多核苷酸。 D1.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D 之方法，其中編碼該多肽之該多核苷酸在目標位置整合入該細胞株之細胞的細胞基因體中。

D2.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D 之方法，其中編碼該多肽之該多核苷酸隨機整合入該細胞株之細胞的細胞基因體中。

D3.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D 至 D2 中任一者之方法，其中編碼該多肽之該多核苷酸為染色體外多核苷酸。

D4.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D 至 D3 中任一者之方法，其中編碼該多肽之該多核苷酸整合入該細胞株之細胞的染色體中。

D5.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D 至 D4 中任一者之方法，其中該重組多肽為抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。

D6.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D5 之方法，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。

D7.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D5 或 D6 之方法，其中該抗體係由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。

D8.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D5 至 D7 中任一者之方法，其中該抗體包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。

D9.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D5 至 D8 中任一者之方法，其中該抗體包含單株抗體。

D10.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 D 至 D9 中任一者之方法，其進一步包含分離該重組多肽。

E. 在某些實施例中，本發明揭露涉及產生病毒載體之方法，其包含：在適於產生該病毒載體之條件下培養真核細胞株，該真核細胞株包含 (a) Bax 及 Bak 基因中之每一者中的穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變、(b) 病毒基因體及 (c) 一個或多個編碼病毒衣殼之多核苷酸。

E1.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E 之方法，其進一步包含分離該病毒載體。

E2.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E 至 E1 中任一者之方法，其中該細胞株為動物細胞株或真菌細胞株。

E3.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E2 之方法，其中該動物細胞株為哺乳動物細胞株。

E4.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E3 之方法，其中該哺乳動物細胞株為 COS 細胞株、VERO 細胞株、HeLa 細胞株、HEK 293 細胞株、PER-C6 細胞株、K562 細胞株、MOLT-4 細胞株、Ml 細胞株、NS-1 細胞株、COS-7 細胞株、MDBK 細胞株、MDCK 細胞株、MRC-5 細胞株、WI-38 細胞株、WEHI 細胞株、SP2/0 細胞株、BHK 細胞株或 CHO 細胞株或其衍生物。

E5.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E4 之方法，其中該 CHO 細胞株為 CHO K1 細胞株、CHO K1SV 細胞株、DG44 細胞株、DUKXB-11 細胞株、CHOK1S 細胞株或 CHO K1M 細胞株或其衍生物。

E6.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E 至 E5 中任一者之方法，其中在細胞培養基中培養該細胞株。

E7.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E 至 E6 中任一者之方法，其中在饋料批式培養條件或灌流培養條件下培養該細胞株。

E8.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E7 之方法，其中在饋料批式培養條件下培養該細胞株，視情況其中該等饋料批式培養條件為強化饋料批式培養條件。

E9.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E 至 E8 中任一者之方法，其中在灌流培養條件下培養該細胞株，視情況其中該等灌流培養條件為半連續灌流或連續灌流。

E10.在某些實施例中，本發明揭露涉及如 E 至 E9 任一者之方法，其中該細胞株在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型突變。 6. 實例

藉由參照下列實例來更完全地理解本揭露。然而，其不應解釋為限制本揭露之範圍。應理解，本文所闡述之實例及實施例僅用於闡釋目的，且鑒於其之各種修改或改變將由熟習此項技術者想到，且將包括在本申請案之精神及範圍以及隨附申請專利範圍之範圍內。實例 1 ：細胞凋亡抗性細胞之生成及測試

此實例闡述自細胞凋亡抗性宿主生成之細胞株在 14-天強化程序中的評估。在此實驗中，將標準分子 (抗體 A) 測試為模型分子。遵循標準細胞株研發 (CLD) 方案來生成表現抗體 A 之穩定細胞株。在 ambr15 微型生物反應器中於 CHO 產生培養基中使用 14-天強化程序來評估自野生型 (WT) 定點整合 (TI) CHO 宿主或兩種經改造宿主 (具有 Bax及 Bak基因敲落 (Bax/Bak DKO)) 生成的前幾名純系。在該程序之前 7 天，WT 純系及 Bax/Bak DKO 純系展示類似之效價、細胞生長、存活率及 Qp。然而，在第 7 天與第 14 天之間，WT 純系展示下降之存活率及 Qp，而 Bax/Bak DKO 純系之存活率則保持較高。在此 14-天延長強化程序中，前幾名 Bax/Bak DKO 純系所展示之效價高於前幾名 WT 純系 50%。此指示，藉由剔除 Bax及 Bak基因來阻斷細胞凋亡可改良強化程序中之產生。另外，此應使得能夠延長強化程序中之產生期，從而達成較高效價。此減小了製造程序之成本以及獲得既定量期望產物所需之製造運行數。方法 Bax/Bak DKO 宿主生成

將野生型 TI 宿主細胞與 Cas9 蛋白及標定 Bax 及 Bak 基因之 gRNA 一起共轉染。使用 Cytena 之單細胞印記機將經轉染細胞以 1 個細胞/孔單細胞印記於預填充 40 μL 含有選擇試劑之專屬晶種訓練培養基的成像品質 384 孔板 (Corning 第 7311 號) 中，且使用 Celigo 成像儀以白光及螢光模式立即成像。將板在 37℃、5% CO ₂下於加濕環境中培育 2 週，然後基於匯流挑選 48 個選殖源純系。在宿主種子訓練培養基中擴增純系並藉由西方墨點分析評估 Bax/Bak DKO 效率。按比例放大證實 Bax/Bak DKO 之純系以生成抗體 A 表現純系。抗體 A 表現細胞之單細胞選殖

使用野生型 TI 宿主細胞株及 Bax/Bak DKO 宿主細胞株來生成表現抗體 A 之定點整合單細胞純系。根據標準細胞株研發方案來執行轉染及單細胞選殖。

將細胞以 1 個細胞/孔單細胞印記於預填充 40 μL 含有選擇試劑之單細胞選殖 (SCC)培養基之 384 孔板中，自每一宿主挑選 88 個純系並轉移至 96 孔板中。在三輪 HTRF 效價篩選檢定之後，每一宿主選擇 5 個選殖源單細胞純系在 ambr15 中進行饋料批式產生檢定評估。 純系評估

在 ambr15 強化程序中使用 CHO 產生培養基 (專屬) 執行純系評估 14 天。將所有純系之第 N-1 代在搖瓶中按比例放大。在培養 4 天之後，藉由離心濃縮細胞並在產生之第 0 天以高接種密度進行接種。

在產生評估之持續時間中，將培養溫度維持於 35℃。在第 1、3、5、12 天及在第 7 或 9 天 (若滲透性較低) 添加 15% (相對於工作體積) 及 2.6% (相對於工作體積) 之適當進料。在第 14 天收穫純系。表 2 提供檢定類型及其各別樣品收集日之概述。表 2 ：採樣及檢定

樣品類型	樣品收集日
NOVA FLEX2 (存活率、活細胞計數、乳酸鹽、葡萄糖、pH)	所有日期
(效價)	第 3、7、10、14 天
(電荷變異體)	第 14 天
聚集體)	第 14 天
(HILIC 聚醣檢定)	第 14 天
胺基酸濃度)	第 3、7、10、14 天

結果 存活率及細胞生長

在整個 14-天程序中，所有 Bax/ BakDKO 純系之活細胞計數 (VCC) 皆與 WT 純系相當或更高 (圖 1 及 2)。VCC 係根據單位體積所判定，故源於進料添加之稀釋可在一定程度上減小所有純系在產生期的 VCC。在計算存活率 (%) 時，校正此參數。WT 純系展示在第 10 天之後存活率有所下降，而 Bax/Bak DKO 純系之存活率保持較高直至程序結束 (圖 3)。在第 14 天，所有 WT 純系皆具有低於 70% 之存活率，而 Bax/ BakDKO 純系則具有超過 80% 之存活率 (圖 4)。經裂解半胱天冬酶 3 之西方墨點分析指示，所有 WT 純系在試驗結束時皆發生細胞凋亡，而 Bax/Bak DKO 純系則不發生 (圖 5)。 效價及比產率

第 3、7、10 及 14 天效價及第 14 天比產率分別展示於圖 6 及 7中。WT 及 Bax/Bak DKO 純系之第 7 天效價相當。然而，在第 14 天，自 Bax/Bak DKO 宿主生成之前幾名純系展示高於 WT 純系的效價。更重要的是，WT 純系之生產力在第 10 天之後顯著下降，而 Bax/Bak DKO 純系則仍產生抗體。應注意，此實驗中之供給策略並未最佳化，若干 Bax/Bak DKO 純系在第 7 天及第 10 天用盡必需胺基酸。藉由進一步最佳化供給策略，該等 Bax/Bak DKO 純系之效價預計會較高。

因在該程序期間每天藉由取出細胞培養以供採樣或體積減小且添加進料來稀釋細胞培養物，故圖 7 中所展示之比產率代表低估值。為計算在 14-天程序期間之不同階段的比產率，使用稀釋因子來校正效價及 VCC 讀數。分析自 WT TI 宿主 WT-4 生成之前幾名純系以及自兩個 Bax/Bak DKO 宿主生成之前幾名純系在整個 14-天程序中 (圖 8) 及在該程序期間之不同階段 (圖 9) 的比產率。如圖 9 所圖解說明，WT-4 純系之比產率在第 10 天與第 14 天之間顯著降低，而所有 Bax/Bak DKO 純系之比產率在第 10 天之後皆保持較高。 代謝物

執行初始葡萄糖供給策略，若葡萄糖讀數低於或預計低於培養物中之最佳值，則進一步添加葡萄糖。在第 2 天，所有純系皆用盡葡萄糖，但僅向其供給標準量之葡萄糖。自第 4 天直至結束，計算日培養物葡萄糖消耗量，且添加額外葡萄糖以確保第二天之葡萄糖讀數不低於 2 g/L 的期望臨限值。圖 10 提供前幾名純系之葡萄糖消耗匯總。圖 11 提供前幾名純系之乳酸鹽匯總。 產物品質

第 14 天 PQA 分析之產物品質資料表明，自 Bax/Bak DKO 純系生成之產物與 WT 純系具有相當的產物品質。

大小變異體 (%) ： HMWS 、主峰、 LMWS 。圖 12、13 及 14 展示 WT 及 Bax/Bak DKO 純系之分子大小資料。WT 與 Bax/Bak DKO 純系之間的聚集資料相當。

電荷變異體 (%) ：酸性峰、主峰、鹼性峰。圖 15、16 及 17 分別圖解說明酸性峰、主峰及鹼性峰之百分比。WT 與 Bax/Bak DKO 純系之間的電荷變異體資料相當。

HILIC 聚醣檢定 (%) 。將第 14 天所收穫細胞培養液 (HCCF) 提交至 AO 以供聚醣檢定。表 3 提供所分析主要聚醣物質之概述。WT 與 Bax/BakDKO 純系之間的聚醣物質含量整體而言相當。自圖 12-17 及表 3 獲得之結果表明，自 Bax/BakDKO 宿主產生之抗體與自 WT 宿主產生者具有相當的產物品質。表 3 ：第 14 天主要聚醣物質 .

	% Afu	% G0F-N	% G0	% G0F	% M5	% G1F	% G2F
WT-1	4.8	0.9	1.1	56.9	2.7	26.6	5.7
WT-2	7.7	2.0	1.7	57.7	4.4	23.0	4.7
WT-3	2.5	0.9	0.7	44.0	1.1	35.7	9.9
WT-4	3.6	1.2	0.8	64.4	2.0	23.2	4.1
DKO-1-2	6.1	2.3	1.3	67.1	3.7	17.7	3.0
DKO-1-3	5.0	1.9	1.1	69.1	2.7	17.6	2.8
DKO-1-4	4.6	2.0	1.1	76.7	2.6	12.4	1.5
DKO-1-5	4.6	1.6	1.0	67.0	2.6	19.5	3.7
DKO-2-1	5.5	1.9	1.3	62.6	3.1	21.6	4.1
DKO-2-2	6.9	2.0	1.4	63.0	4.3	20.1	4.0
DKO-2-3	6.5	2.0	1.9	54.2	2.3	27.7	5.5
DKO-2-4	4.4	1.8	0.9	70.7	2.8	17.0	3.1
DKO-2-5	6.2	2.1	1.8	66.8	3.2	18.3	3.4

結論

較高效價程序不僅減小成本，且亦使得能夠製造網路更為靈活。然而，諸如延長產生培養持續時間、增加細胞密度或使用 HDAC 抑制劑改良 Qp 等策略受阻於細胞中之細胞凋亡誘導及由此的 VCC 減小。使用細胞凋亡抗性宿主細胞株可減弱該等策略中之此不期望效應。在此實例中，在延長強化程序中測試 Bax/Bak DKO 細胞凋亡抗性宿主。自 Bax/Bak DKO 宿主生成之抗體 A 產生純系展現不僅可相對於 WT 細胞株改良存活率，且亦增加 14-天強化程序之後期的生產力。不期望受限於任何理論，Bax/Bak DKO 純系之增加的生產力可源於：1) 剔除 Bax 及 Bak 基因有助於維持產生後期之線粒體完整性及健康，且 2) 亦防止/延遲培養物中之細胞凋亡。在此程序中，前幾名 Bax/Bak DKO 純系所生成之抗體高於前幾名 WT 純系 50%。藉由進一步修改供給策略，可進一步增加效價。Bax/Bak DKO 與 WT 純系之間的產物品質相當。Bax/Bak DKO 純系亦與 WT 純系具有類似代謝。實例 2 ：細胞凋亡抗性細胞之生成及測試

為進一步陳述 Bax/Bak 缺陷在治療分子製造中之益處，本發明實例評估在規則或強化程序中及在不同規模下於 Bax/Bak DKO 基因背景中標準單株抗體分子及若干複合分子的產生。 材料及方法 細胞培養基

在 125 mL 搖瓶容器中於基於 DMEM/F12 之專屬培養基中在 150 rpm、37℃ 及 5% CO2 下培養 CHO 細胞。每 3–4天以 4 × 10 ⁵個細胞/mL 之密度使細胞傳代。 抗體表現細胞株之研發

如 Misaghi 等人，Biotechnol Prog 2013, 29, 727 中所闡述來生成穩定表現 mAb 分子之細胞池。藉由 MaxCyte STX 電穿孔 (MaxCyte, Gaithersburg, MD) 將表現質體轉染至 WT 或 Bax/Bak DKO CHO 細胞中。然後選擇經轉染細胞且藉由 FACS 經由人類 IgG 染色來證實mAb 表現。 饋料批式產生檢定

在搖瓶、AMBR15 或 AMBR250 生物反應器 (TAP Biosystems) 中使用專屬化學成分確定之產生培養基來執行饋料批式產生培養。對於標準或低接種密度程序而言，在產生 (N) 階段之第 0 天以 2 × 10 ⁶個細胞/ml 接種細胞。使培養物在第 3、7 及 10 天接受專屬進料培養基。對於強化程序而言，在產生 (N) 之第 0 天於 AMBR15或 AMBR250 容器中以 3 × 10 ⁷個細胞/mL 接種細胞。每 2-4 天使培養物接受專屬進料培養基。AMBR15 系統中之產生係在 37℃、DO 30%、pH 7.2 及 1400 rpm 之攪動速率的設定點下操作。AMBR250 系統中之產生係在 35℃、DO 30%、pH 7.2 及 477 rpm 之攪動速率的設定點下操作。 Bax 及 Bak 基因剔除

為剔除 CHO 細胞中之 Bax 及 Bak 基因，在無核酸酶雙鏈體緩衝液中以 100 ® M 重構來自Integrated DNA Technologies, Inc. 的基因導向性 Alt-R® crRNA 及非特異性 Alt-RμtracrRNA 並以 1:1 比率混合，隨後在95 ^oC下培育 5 min 並冷卻至室溫以進行退火。然後藉由混合 3 μL (150 pmol) 經退火 gRNA 與 1 μL Cas9 蛋白 (IDT, 10 mg/mL) 來製備導引 RNA-Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 複合物，隨後在室溫下培育 10 min。藉由使用 Neon 電穿孔系統 (Thermo Fisher Scientific) 將5 μL gRNA-Cas9 RNP 轉染至建南德克公司 CHO-K1 宿主細胞株的 100 萬個細胞中來依序標定Bax 及 Bak 基因，隨後實施單細胞選殖以分離個別 Bax/Bak DKO 宿主細胞株。藉由西方印漬證實該等 DKO 宿主細胞株中之 Bax 及 Bak 基因的完全剔除。

gRNA 寡核苷酸之序列： Bax gRNA: GGGTCGGGGGAGCAGCTCGG Bak gRNA-1: TCATCACAGTCCTGCCTAGG Bak gRNA-2: ATGGCGTCTGGACAAGGACC. 離線樣品分析

每隔一天檢定上清液樣品之活細胞計數 (VCC)，且使用 Vi-Cell XR (Beckman Coulter) 檢定存活率，並使用 Bioprofile 400 (Nova Biomedical) 檢定 pO ₂、pH、pCO ₂、Na ⁺、葡萄糖及乳酸鹽。在 BioProfile 400 上於採樣後幾分鐘內分析來自 AMBR 生物反應器之所有樣品以最小化排氣。針對所有樣品使用相同之 Vi-Cell XR、BioProfile 400 及滲透計(模型 2020, Advanced Instruments) 以消除儀器間可變性。藉由柱前衍生化及逆相高效液相層析法測量上清液中之胺基酸濃度。使用胺基甲酸 6-胺基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞胺基酯 (AQC) 衍生所有胺基酸以產生高螢光衍生物。使用高壓液相層析 (HPLC) 利用蛋白質 A 管柱測量抗體效價。使用藉由 PhyTip 蛋白質 A 管柱純化之細胞培養上清液樣品實施抗體產物品質檢定。藉由毛細管電泳 (CE) 使用螢光偵測來分析抗體聚醣分佈，而藉由粒徑篩析層析 (SEC) 分析分子大小分佈。使用成像毛細管等電聚焦電泳 (icIEF) 測量蛋白質電荷異質性；使用羧肽酶 B 預處理所有電荷異質性樣品。內部研發所有蛋白質產物品質檢定，且已公開詳細方案，例如 Hopp 等人，Biotechnol Prog 2009, 25, 1427。結果自 Bax/Bak 雙重剔除宿主生成之池可產生改良存活率及較高標準 mAb 效價。

藉由使用核糖核蛋白 (RNP) 轉染依序標定建南德克公司 CHO-K1 宿主細胞株中之 Bax 及 Bak 基因 (Misaghi 等人，Biotechnol Prog 2013, 29, 727)，能夠生成若干藉由西方墨點證實 Bax/Bak 缺陷之不同單細胞選殖性 Bax/Bak DKO 宿主細胞株 (補充圖 1A)。為測試該等 DKO 宿主細胞株是否達成優於親代 WT 宿主細胞株之存活率及重組蛋白表現，轉染每一 DKO 以及 WT 宿主細胞株以生成表現單株抗體 (mAb-A) 之穩定池。首先使用 14-天低接種密度產生平臺 (平臺-1) 在搖瓶中 (圖 1A)以及在 AMBR15 生物反應器中 (其中連續監測溫度、pH及氧含量且嚴格控制) (圖 1B) 評估該等池之細胞培養性能及 mAb-A 生產力。在搖瓶中，若干在開始時具有較佳細胞生長之池 (WT、DKO2、DKO8) 在程序結束時展現減小的存活率，此可能係由於缺乏程序控制 (例如 pH 控制或充氣)。與之相比，在 AMBR15 生物反應器中，所有池在整個程序中皆展示良好存活率，其中僅 WT 池在培養程序結束時展示存活率略有降低。在搖瓶及 AMBR15 程序中，平均而言，衍生自 DKO 宿主之池相對於 WT 池達成略較佳或相當的效價及比產率 (圖 1A 及 1B)。

為判定 Bax/Bak DKO 細胞是否在強化程序中達成較佳之存活率及生產力，然後在 AMBR15 生物反應器中使用高接種密度程序測試該等池 (圖 1C)。在高接種密度程序中，WT 池展示自第 3 天開始存活率有所下降且在程序結束時僅具有 67% 之活細胞，而所有 DKO 池在整個程序中皆維持超過 90% 之存活率。所有 DKO 池皆在強化程序中達成高於 WT 池之效價，此主要係由於較佳存活率及較高活細胞計數 (VCC)。該等結果表明，Bax/Bak DKO 基因修飾可在強化程序中防止細胞死亡且由此產生較高效價。

在搖瓶及 AMBR15 產生程序中，在 WT 池與 DKO 池之間並未觀察到產物品質屬性的顯著差異 (補充圖 1B-D)。在強化程序中，在自 DKO 池生成之產物中觀察到較高百分比的高分子量物質 (HMWS) 或蛋白質聚集物 (補充圖 1D)，其通常與較高效價有關。所有該等細胞株在其他產物品質屬性 (例如電荷變異體或醣基化程度) 方面皆相當 (補充圖 1B-D)。自 Bax/Bak 雙重剔除宿主生成之單細胞純系使得能夠延長程序，此乃因可改良細胞培養物存活率以在強化程序中產生較高標準 mAb 效價。

為判定達成在 Bax/Bak DKO 池中觀察之較佳存活率及 mAb-A 效價之益處是否可在單細胞選殖之後維持，單細胞選殖 WT 池以及兩種 Bax/Bak DKO 池且在兩輪板效價檢定之後自每一組挑選前 4-5 名純系。首先使用搖瓶在低細胞接種密度饋料批式產生程序中分析單細胞純系 (SCC) (圖 2A)。類似於池結果，與 WT 純系相比，DKO 純系中之細胞培養物存活率有所改良且效價略有增加。WT 純系與 DKO 純系之間的所有產物品質屬性皆相當 (補充圖 2A)。

測試 Bax/Bak DKO 純系是否在強化程序中達成較高效價。使用 AMBR15 生物反應器在延長 (14 天) 強化平臺-1 饋料批式產生程序中利用標定 30 × 10 ⁶個細胞/mL 之起始細胞接種密度來測試來自 WT 及兩個 DKO 組的前幾名純系 (圖 2B)。不同於在程序後期存活率有所降低之 WT 純系，DKO 純系維持高存活率直至 14-天程序結束 (圖 2B)。在第 14 天，WT 中之細胞凋亡標記物蛋白 (經裂解半胱天冬酶 3) 之含量有所升高，但 DKO 純系並非如此，從而指示 WT 細胞在強化產生程序之後期發生細胞凋亡，而剔除 Bax/Bak 基因可防止該現象 (補充圖 2C)。另外，WT 純系之效價在大約第 10 天達到穩定且在第 14 天達到 4.7 ± 0.7 g/L，而 DKO 純系之效價繼續增加且在第 14 天達到 7.1 ± 0.8 g/L。應注意，WT 純系在第 10 至 14 天之效價降低及 DKO 純系之較慢效價增加係因為產生培養物的稀釋，該稀釋係藉由自培養物取出樣品並將進料及葡萄糖添加回培養物中來達成。WT 純系在程序後 4 天之 mAb-A 生產力減小不僅因為損失存活率及 VCC，且亦因為比產率 (Qp) 減小。平均而言，WT 純系在程序之全部 14 天中之整體 Qp (圖 2B，下圖，第 0-14 天) 低於前 10 天中者 (圖 2B，下圖，第 0-10 天)，從而指示 WT 純系在後 4 天 Qp 有所減小。在程序之最終階段 WT 純系之 Qp 低於 DKO 純系可能因為仍存活細胞中之來自 Bax/Bak 活化的粒線體膜損害。該等結果指示，Bax/Bak DKO 細胞使得能夠增加細胞培養物存活率且由此延長強化程序中之產生過程，從而在最佳情形下使得效價高於 WT 純系 44%。相對於 WT 細胞，在 DKO 細胞中未觀察到顯著產物品質變化 (補充圖 2B)。

為評估產生規模是否影響 DKO 細胞之性能，測試在同一強化程序中來自 AMBR250 容器中之每一宿主的前幾名純系。在此較大規模下，類似於 AMBR15 程序，DKO 純系所達成之存活率、Qp 及效價 (8.2 g/L) 優於 WT 純系 (5.5 ± 0.4 g/L，來自同一純系之 4 個複製品) (圖 3)。 Bax/Bak 雙重剔除亦藉由改良強化程序中之存活率來改良複合抗體產生。

與標準 mAb 分子相比，雙特異性或複合抗體之產生較具挑戰性，此乃因該等抗體具有非標準形式，此可引起其他製造問題，例如產物不穩定性、不期望副產物物質、較高產物片段或聚集物含量及低表現程度。非天然形式之雙特異性抗體或複合分子增加了分子錯誤摺疊及二硫鍵錯誤配對的機會，從而導致在細胞內部發生較高程度之細胞內反應性氧物質 (ROS) 累積及氧化應力，此最終會產生較低之 VCD、存活率及生產力。測試 Bax/Bak DKO 細胞株是否可有助於減輕該等問題。

對 WT 宿主或 DKO 宿主中之兩種複合分子 (B 及 D) 及一種雙特異性分子 (C) 的產生進行比較 (圖 4)。對於複合分子-B 及雙特異性分子-C而言，自每一宿主生成兩個穩定表現池，而對於複合分子-D 而言，自每一宿主生成一個穩定表現池。使用 AMBR15 生物反應器在延長 (14-天) 強化產生程序中測試該等池。對於所有三種分子而言，自 DKO 宿主生成之池在整個程序中保持高存活率，而 WT 池則在產生後期展示降低之存活率 (圖 4)。較佳存活率亦在 DKO 池中產生較高 VCC，從而 DKO1 宿主中之分子-B 及分子-C (分別為 7.9 ± 0.5 及 7.8 ± 1.0 g/L) 的產率高於 WT (分別為 6.0 ± 0.5 g/L 及 6.2 ± 0.8 g/L) 約 30% (圖 4B 及 4C)。對於分子-D 而言，DKO 池之效價僅高於 WT 池5%，此主要係因為在產生後期 DKO 池之比產率有所降低，該比產率降低可能係藉由培養物中之必需胺基酸 (例如半胱胺酸) 的耗竭所引起 (圖 4C)。對於所有三種分子而言，WT 與 DKO 池之間的所有產物品質屬性皆相當 (補充圖 3)。總而言之，表現雙特異性或複合分子之 Bax/Bak DKO 細胞株在 14-天強化產生程序中維持高存活率，從而產生較高產物效價而不影響產物品質。

自確立治療蛋白表現細胞株剔除 Bax/Bak 即使在池階段亦展示一些有益特質。如補充圖 4 中所展示，將模擬或 Bax/Bak gRNA 轉染至預先經抗體-細胞介素 (複合分子-E) 表現構築體轉染之細胞池中。使用 AMBR250 生物反應器在強化產生程序中比較對照及 Bax/Bak DKO 池的細胞培養性能及效價。類似於先前結果，缺失 Bax/Bak 基因可改良產生後期之培養物存活率，然而，因 Bax 及 Bak 基因之剔除效率小於 50% (資料未展示)，故在 DKO 池中觀察到 VCC 及效價具有較小改良。據信，藉由最佳化及改良基因剔除效率，將 Bax/Bak gRNA 轉染至確立細胞株或最新轉染之細胞池中且隨後實施 SCC 亦可使得能夠分離具有能夠在強化產生程序中達成高存活率及效價之完整 Bax/Bak DKO 表型的單細胞純系。討論

在此實例中，生成 Bax/Bak DKO 細胞凋亡抗性宿主細胞株且在強化產生程序中針對池及單細胞純系且以不同規模表現標準單株抗體及若干複合分子。自 Bax/Bak DKO 宿主生成之表現治療蛋白之池或純系展現增加的存活率及生產力，而在採用 WT 宿主時強化產生程序後期之存活率及生產力有所減小。同時，Bax/Bak DKO 與 WT 細胞株之間的產物品質屬性相當。總而言之，資料指示，利用細胞凋亡抗性宿主細胞株可顯著改良程序強化策略，從而產生較高體積生產力而不改變產物品質，且由此使得能夠延長產生過程。在所有情形下，剔除 Bax 及 Bak 基因皆有助於在整個 14-天產生程序中維持高存活率。即使藉由將 Bax/Bak gRNA 轉染至預先經表現複合分子之構築體轉染之細胞株中以由此生成異源池 (補充圖 4) 亦可有助於改良存活率。高培養物存活率本身極其有益於製造程序，此乃因其可較佳地控制產物品質。除存活率改良外，在大部分強化產生程序中，培養效價增加 30-80%。

在規則或較低接種密度下觀察之效價改良 (圖 1A 及 2A) 小於強化程序，此主要係因為對照培養物中之細胞死亡較低。細胞凋亡更通常發生於細胞密度較高之強化產生程序期間，此可能係因為低氧、剪切應力、營養素剝奪及由細胞產生的毒性代謝副產物 (包括抑制性代謝物 (例如異戊酸鹽及甲酸) 及活性氧物質 (ROS)) 較迅速累積的風險較高。可使用灌流技術來減小該等細胞應力，此係藉由減少細胞內 ROS 累積並自細胞培養物去除抑制性代謝物且同時向培養物連續提供氧及營養素來達成。然而，因程序控制較為複雜及所需培養基體積較大，故灌流細胞培養通常不甚理想。在此研究中利用細胞凋亡抗性 Bax/Bak DKO 細胞株提供了在強化饋料批式培養中增加培養細胞密度及改良效價的替代方式。減小饋料批式強化產生程序期間之延長培養存活率下降的另一方式為縮短饋料批式培養時間且在存活率開始下降之前收穫培養物。然而，縮短培養時間可減小經濟效應及改良之製造網路靈活性，此乃因需要巨額材料及勞動力成本來設定產生培養。因此，延長培養時間而維持培養生產力對於達成期望收益-成本比且增加製造靈活性較為重要。如此實例中所展示，藉由使用 Bax/Bak DKO 細胞株，產生培養時間可較使用 WT 細胞時之 7-10 天延長至至少 14 天且使得標準抗體及複合分子之效價增加 30-50%，此將顯著減小每單位產物之產生成本。總而言之，Bax/BAK 細胞凋亡抗性 CHO 細胞容許在高細胞密度及延長培養時間下進行高存活率/高產率強化產生程序。

圖 1 提供具有最高抗體效價之 4 至 5 種純系的第 14 天 IVCC 結果，該等純系係分別自野生型 (WT) 及兩種不同 Bax/Bak 雙重剔除 (DKO) 宿主所生成，且在 14 天強化 (高接種密度) 抗體產生程序時段內分析其活細胞濃度積分 (IVCC, 1e8 個細胞-d/L)。Bax/Bak DKO 純系與 WT 純系具有相當或更高之 IVCC。圖 2 提供在強化產生程序期間 WT 及 Bax/Bak DKO 純系之 VCC。測量來自 WT 宿主 (A) 或兩種不同 Bax/Bak DKO 宿主 (B&C) 之指示純系的活細胞計數 (VCC, 1e6 個細胞/mL) 並繪圖。Bax/Bak DKO 純系及 WT 純系在前 2 天具有類似生長速率。VCC 在第 3 天之後有所下降，此乃因每天藉由添加進料且取出培養細胞以供各種檢定來稀釋細胞培養物。圖 3 提供在強化產生程序期間 WT 及 Bax/Bak DKO 純系之存活率。測量自 WT 宿主 (A) 或兩種不同 Bax/Bak DKO 宿主 (B&C) 生成之指示純系的存活率 (%) 並繪圖。WT 純系在第 10 天之後之存活率有所下降 (A)，而 Bax/Bak DKO 純系則維持高存活率直至程序結束，從而表明缺失 Bax 及 Bak 基因會顯著防止強化程序之後期中的細胞死亡。圖 4 提供指示純系之第 14 天存活率 (%)。Bax/Bak DKO 純系在第 14 天展示遠高於 WT 純系之存活率，從而證實缺失 Bax 及 Bak 基因會顯著減少強化程序之後期中的細胞死亡。圖 5 提供第 14 天細胞團塊中之經裂解半胱天冬酶 (Caspase)-3 的西方墨點分析。藉由西方墨點分析指示純系之第 14 天細胞團塊中之經裂解半胱天冬酶-3 (一種細胞凋亡標記物蛋白) 的含量。所有 WT 純系皆表現高含量之經裂解半胱天冬酶-3，從而指示 WT 細胞在強化程序之後期發生細胞凋亡，且細胞凋亡性細胞死亡係培養物存活率下降之主要促成因素。所有 Bax/Bak DKO 純系皆具有低含量之經裂解半胱天冬酶-3，從而表明缺失 Bax 及 Bak 基因足以阻斷細胞凋亡性細胞死亡。圖 6 圖解說明在第 3、7、10 及 14 天獲得之效價。測量指示純系在 14-天強化程序中之第 3、7、10 及 14 天的抗體效價 (g/L) 並繪圖。應注意，Bax/Bak DKO 純系之第 7 天效價平均而言與 WT 純系相當，而其第 14 天效價顯著較高。更重要的是，對於大部分 Bax/Bak DKO 純系而言，第 14 天效價高於第 10 天效價，從而指示細胞在產生培養之後 4 天仍產生抗體。然而，對於 WT 純系而言，效價自第 10 天至第 14 天不再增加，從而表明該等純系在強化產生程序結束時損失生產力。WT 純系中之生產力損失可能係由該等培養物中之細胞凋亡性細胞死亡所致。圖 7 指示平均比產率。藉由使第 14 天效價 (g/L) 除以第 14 天 IVCC (1e8 個細胞-d/L) 來計算細胞比產率 (Qp, pg/細胞-d)。Bax/Bak DKO 純系之 Qp 平均而言高於 WT 純系的 Qp。圖 8 指示在整個 14-天程序中前幾名之純系的經校正平均比產率。藉由稀釋因子來校正細胞比產率 (Qp, pg/細胞-d)。在圖 8 中提供 WT 宿主之第一名純系及 Bax/Bak DKO 宿主之前 2-3 名純系的結果。圖 9 提供在強化產生程序期間之不同階段前幾名純系的經校正比產率。提供在強化程序期間之不同階段所指示前幾名純系的經校正比產率 (Qp, pg/細胞-d)。對於所有純系而言，第 0 至 3 天係細胞生長階段，此時之 Qp 低於在穩定階段期間 (在第 3 天之後) 者。僅 WT 純系在第 10 至 14 天之間展示 Qp 下降。因 Qp 僅係針對活細胞所計算，故此結果表明，在該程序之後 4 天中，不僅 WT 細胞之存活率有所下降，且亦其生產力有所下降。此生產力下降可能係由於在細胞凋亡開始時 Bax 及 Bak 蛋白活化會損害粒線體膜。另一方面，Bax/Bak DKO 純系不僅具有增加之存活率，且亦具有增加之生產力。據此可認為，缺失該兩種基因不僅防止細胞凋亡，且亦有助於維持粒線體完整性及健康。圖 10 圖解說明前幾名純系之葡萄糖消耗速率。將在強化產生程序期間消耗之總葡萄糖 (mg) 針對不同時間點下的總細胞數積分 (1e6 個細胞-d) 進行繪圖。斜率代表指示純系之葡萄糖消耗速率 (mg/1e6 個細胞-d)。Bax/Bak DKO 純系與 WT 純系之間的葡萄糖消耗速率相當。圖 11 指示在強化產生程序期間前幾名純系之培養物乳酸鹽濃度。每天測量指示純系之所收穫細胞培養液(HCCF) 中的乳酸鹽濃度並繪圖。結果表明，在強化產生程序期間，WT 及 Bax/Bak DKO 純系之乳酸鹽代謝相當。圖 12 提供第 14 天 HMWS (%)。在圖 14 中給出指示純系之第 14 天 HCCF 中的聚集抗體含量 (%)。WT 與 Bax/Bak DKO 純系之間的 HMWS 含量 % 平均而言係相當的。圖 13 指示第 14 天主峰 %。此圖圖解說明指示純系之第 14 天 HCCF 中的完整及單體抗體含量 (%)。WT 與 Bax/Bak DKO 純系之間的主峰含量 % 平均而言係相當的。圖 14 以 LMWS% 形式圖解說明抗體片段之量。繪示指示純系之第 14 天 HCCF 中之抗體片段的含量。WT 與 Bax/Bak DKO 純系之間的 LMWS 含量 % 平均而言係相當的。圖 15 繪示第 14 天純系 HCCF 中之抗體酸性電荷變異體的量 (%)。WT 與 Bax/Bak DKO 純系之間的酸性峰含量 % 平均而言係相當的。圖 16 提供主峰結果，該等結果指示第 14 天純系 HCCF 中之抗體中性電荷變異體的含量 (%)。WT 與 Bax/Bak DKO 純系之間的主峰含量 % 平均而言係相當的。圖 17 繪示第 14 天純系 HCCF 中之抗體鹼性電荷變異體的量 (%)。WT 與 Bax/Bak DKO 純系之間的鹼性峰含量 % 平均而言係相當的。圖 18A-18C 圖解說明，剔除 Bax/Bak 基因可改良強化產生程序中之標準 mAb 表現性 CHO 池的細胞存活率及效價。在以下情形下測量自指示宿主細胞株所生成表現 mAb-A 之細胞之池的存活率、活細胞計數 (VCC)、效價及 14 -天平均比產率 (Qp)：使用搖瓶在低接種密度平臺-1 程序中 (18A)、使用 AMBR15 生物反應器於低接種密度平臺-1 程序中 (18B) 及使用 AMBR15 生物反應器於高接種密度平臺-1 程序中 (18C)。圖 19A-B 圖解說明，自 Bax/Bak DKO 宿主生成之單細胞純系在強化產生程序中達成增加之存活率及較高標準 mAb 效價。在以下情形下測量自指示宿主細胞株所生成表現 mAb-A 之前幾名純系的存活率、VCC、效價及 14 -天平均比產率：(19A) 使用搖瓶在低接種密度程序中，及 (19B) 使用 AMBR15 生物反應器在強化程序中。誤差槓展示自指示宿主生成之前 4-5 名純系的標準偏差。圖 20 圖解說明，自 Bax/Bak DKO 宿主生成之單細胞純系在放大強化產生程序中達成增加之存活率及較高標準 mAb 效價。使用 AMBR250 生物反應器在強化程序中測量自指示宿主細胞株所生成表現 mAb-A 之前幾名純系的存活率、VCC、效價及 14-天平均比產率。誤差槓展示同一 WT 第一名純系之 4 個複製品的標準偏差。圖 21A-21C 圖解說明，剔除 Bax/Bak 基因可改良 CHO 強化產生程序中之複分子表現。使用 AMBR15 生物反應器在強化產生程序中測量自 WT 及兩種 DKO 宿主細胞株所生成表現複分子-B (21A)、雙特異性抗體分子-C (21B) 及複分子-D (21C) 之細胞之池的存活率、VCC、效價及 14-天平均比產率。誤差槓展示衍生自相同宿主之指示分子之 2 個重複池的標準偏差。圖 22A-22D 圖解說明 Bax/Bak DKO 細胞株之生成及在 3 種產生程序中自 WT 及 DKO 池產生之 mAb-A 的產物品質屬性。如下所述自 WT 細胞株依序剔除 Bax 及 Bak 基因。步驟 1：將導向 Bax 基因之 RNA 轉染至 WT 細胞中，隨後實施單細胞選殖以生成 Bax KO 純系 #40。步驟 2：將導向 Bak 基因之 RNA 轉染至 Bax KO 純系 #40 細胞中，隨後實施單細胞選殖以生成 Bax/Bak DKO 純系 1、2、3、7、8、21。22B-22D)。在以下情形下測量 mAb-A 表現池的高分子量物質 (HMWS)/聚集物含量、不同聚醣物質含量及電荷變異體含量：使用搖瓶及低接種密度 (SD) 之產生平臺-1 (22B)、使用 AMBR15 及低 SD 之產生平臺-1 (22C) 及使用 AMBR15 及高 SD 之產生平臺-1 (22D)。圖 23A-23C 繪示在搖瓶及 AMBR15 生物反應器中自 WT 及 DKO 宿主所生成表現 mAb-A 之前幾名純系的產物品質屬性。在一些情形下測量 mAb-A 表現純系之不同聚醣物質含量、電荷變異體含量及高分子量物質 (HMWS)/聚集物含量：(23A) 使用搖瓶及低 SD 之產生平臺-1，及 (23B) AMBR15 強化產生平臺-1。AMBR15 強化產生平臺-1 之第 14 天細胞中之經裂解半胱天冬酶 3 含量的西方墨點 (23C)。圖 24A-24C 繪示在 AMBR15 生物反應器中強化程序之 CHO 池中所表現之複分子及雙特異性抗體的產物品質屬性。測量表現複分子-B (24A)、雙特異性分子-C (24B) 及複分子 C (24C) 之 CHO 池的電荷變異體含量、高分子量物質 (HMWS)/聚集物含量及不同聚醣物質含量。應注意，雙特異性分子-C 係無醣基化分子，由此並無可利用之此分子的醣基化資料。圖 25A-25D 圖解說明，在高接種密度產生程序中，剔除表現複分子-E 之經轉染 CHO 細胞之池中的 Bax/Bak 基因可改良細胞存活率。(25A) 概述用以評估經複分子-E 表現構築體轉染之 CHO 細胞之池中之 Bax/Bak 基因剔除的策略。在模擬或 Bax/Bak gRNA 轉染之後表現複分子-E 之 CHO 細胞池的效價 (25B)、細胞存活率 (25C) 及 VCC (25D)。

Claims

一種經分離真核細胞株，其中該細胞株在 Bax及 Bak基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。
如請求項 1 之細胞株，其中該細胞株在該 Bax及 Bak基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型突變。
如請求項 1 或請求項 2 之細胞株，其中該細胞株為動物細胞株或真菌細胞株。
如請求項 3 之細胞株，其中該動物細胞株為哺乳動物細胞株。
如請求項 4 之細胞株，其中該哺乳動物細胞株為 COS 細胞株、VERO 細胞株、HeLa 細胞株、HEK 293 細胞株、PER-C6 細胞株、K562 細胞株、MOLT-4 細胞株、Ml 細胞株、NS-1 細胞株、COS-7 細胞株、MDBK 細胞株、MDCK 細胞株、MRC-5 細胞株、WI-38 細胞株、WEHI 細胞株、SP2/0 細胞株、BHK 細胞株或 CHO 細胞株，或其衍生物。
如請求項 5 之細胞株，其中該 CHO 細胞株為 CHO K1 細胞株、CHO K1SV 細胞株、DG44 細胞株、DUKXB-11 細胞株、CHOK1S 細胞株或 CHO K1M 細胞株，或其衍生物。
如前述請求項中任一項之細胞株，其中該細胞株在該 Bax及 Bak基因中之每一者中包含缺失。
如前述請求項中任一項之細胞株，其中該細胞株進一步包含病毒基因體及一個或多個編碼病毒衣殼之多核苷酸。
如前述請求項中任一項之細胞株，其中該細胞株進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。
如請求項 9 之細胞株，其中編碼該目標產物之該多核苷酸係在目標位置整合入該細胞株之細胞基因體中。
如請求項 9 之細胞株，其中編碼該目標產物之該多核苷酸係隨機整合入該細胞株之細胞基因體中。
如請求項 9 至 11 中任一項之細胞株，其中編碼該目標產物之該多核苷酸為染色體外多核苷酸。
如請求項 9 至 11 中任一項之細胞株，其中編碼該目標產物之該多核苷酸係整合入該細胞株之染色體中。
如請求項 9 至 11 中任一項之細胞株，其中該目標產物包含重組多肽。
如請求項 9 至 14 中任一項之細胞株，其中該目標產物包含抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。
如請求項 15 之細胞株，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。
如請求項 15 或請求項 16 之細胞株，其中該抗體由單一重鏈序列與單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。
如請求項 15 至 17 中任一項之細胞株，其中該抗體包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。
如請求項 15 至 18 中任一項之細胞株，其中該抗體包含單株抗體。
如請求項 7 至 19 中任一項之細胞株，其中該細胞株與包含該多核苷酸及野生型 Bax及 Bak基因中之每一者的功能性副本之對應經分離真核細胞株相比，具有較高的比產率。
如前述請求項中任一項之細胞株，其中該細胞株與包含該 Bax及 Bak基因中之每一者的功能性副本之對應經分離真核細胞株相比，更具細胞凋亡抗性。
如前述請求項中任一項之細胞株，其中該細胞株係用於諸如饋料批式、灌流、程序強化、半連續灌流或連續灌流的細胞培養程序中。
如請求項 22 之細胞株，其中該細胞株係用於強化灌流程序中。
一種包含如前述請求項中任一項之真核細胞株之組成物。
如請求項 24 之組成物，其進一步包含細胞培養基。
一種包含細胞培養基及複數個真核細胞之細胞培養物，其中該等複數個細胞中之每個細胞在該 Bax及 Bak基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變。
如請求項 26 之細胞培養物，其中每個細胞在該 Bax及 Bak基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型突變。
如請求項 26 或請求項 27 之細胞培養物，其中該複數個細胞中之每個細胞在該 Bax及 Bak基因中之每一者中包含缺失。
如請求項 26 至 28 中任一項之細胞培養物，其中該等細胞為動物細胞或真菌細胞。
如請求項 29 之細胞培養物，其中該等動物細胞為哺乳動物細胞。
如請求項 30 之細胞培養物，其中該等哺乳動物細胞為 COS 細胞、VERO 細胞、HeLa 細胞、HEK 293 細胞、PER-C6 細胞、K562 細胞、MOLT-4 細胞、Ml 細胞、NS-1 細胞、COS-7 細胞、MDBK 細胞、MDCK 細胞、MRC-5 細胞、WI-38 細胞、WEHI 細胞、SP2/0 細胞、BHK 細胞或 CHO 細胞，或其衍生物。
如請求項 31 之細胞培養物，其中該等 CHO 細胞為 CHO K1 細胞、CHO K1SV 細胞、DG44 細胞、DUKXB-11 細胞、CHOK1S 細胞或 CHO K1M 細胞，或其衍生物。
如請求項 26 至 32 中任一項之細胞培養物，其中該細胞培養物進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。
如請求項 33 之細胞培養物，其中編碼該目標產物之該多核苷酸係在目標位置整合入該等細胞之細胞基因體中。
如請求項 33 之細胞培養物，其中編碼該目標產物之該多核苷酸係隨機整合入該等細胞之細胞基因體中。
如請求項 33 至 35 中任一項之細胞培養物，其中編碼該目標產物之該多核苷酸為染色體外多核苷酸。
如請求項 33 至 35 中任一項之細胞培養物，其中編碼該目標產物之該多核苷酸係整合入該等細胞之染色體中。
如請求項 33 至 37 中任一項之細胞培養物，其中該目標產物包含重組多肽。
如請求項 33 至 38 中任一項之細胞培養物，其中該目標產物為抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。
如請求項 39 之細胞培養物，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。
如請求項 39 或請求項 40 之細胞培養物，其中該抗體由單一重鏈序列與單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。
如請求項 39 至 41 中任一項之細胞培養物，其中該抗體包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。
如請求項 39 至 42 中任一項之細胞培養物，其中該抗體包含單株抗體。
如請求項 26 至 43 中任一項之細胞培養物，其中該等細胞中之每一者進一步包含重組多核苷酸。
如請求項 26 至 44 中任一項之細胞培養物，其中該等細胞係用於諸如饋料批式、灌流、程序強化、半連續灌流或連續灌流的細胞培養程序中。
如請求項 45 之細胞培養物，其中該等細胞係用於強化灌流程序中。
一種降低真核細胞中細胞凋亡活性之方法，其包含對該細胞施以基因工程系統，其中該基因工程系統： a. 敲落或剔除 Bax多肽同功型之表現；及 b. 敲落或剔除 Bak多肽同功型之表現。
如請求項 47 之方法，其中該方法進一步包含在饋料批式、灌流、程序強化、半連續灌流或連續灌流細胞培養程序中使用該真核細胞。
如請求項 48 之方法，其中該真核細胞係用於強化細胞培養程序中。
如請求項 47 至 49 中任一項之方法，其中該基因工程系統係選自由以下所組成之群組：CRISPR/Cas 系統、鋅指核酸酶 (ZFN) 系統、類轉錄活化因子核酸酶 (TALEN) 系統及其組合。
如請求項 47 至 50 中任一項之方法，其中該基因工程系統係為或係包含 CRISPR/Cas9 系統。
如請求項 51 之方法，其中該 CRISPR/Cas9 系統包含： a. Cas9 分子， b. 至少一個第一導引 RNA (gRNA)，其包含與 Bax基因中之目標序列互補之導向序列，及 c. 至少一個第二 gRNA，其包含與 Bak基因中之目標序列互補之導向序列。
如請求項 52 之方法，其中該等目標序列中之至少一者為該 Bax基因之一部分，及/或其中該等目標序列中之至少一者為該 Bak基因之一部分。
如請求項 47 至 53 中任一項之方法，其中該 Bax多肽之表現及/或該 Bak多肽之表現經剔除，且該細胞之細胞凋亡活性相較於參考細胞之細胞凋亡活性係經降低。
如請求項 47 至 53 中任一項之方法，其中該 Bax多肽之表現及/或該 Bak多肽之表現經敲落，且該細胞之細胞凋亡活性相較於參考細胞之細胞凋亡活性係經降低。
如請求項 54 或請求項 55 之方法，其中該細胞之細胞凋亡活性係於生產階段之第 14 天時將一群該等細胞之存活率與一群該等參考細胞之存活率相較而判定。
如請求項 54 至 56 中任一項之方法，其中該參考細胞為包含該 Bax及 Bak基因之野生型等位基因之細胞。
如請求項 47 至 57 中任一項之方法，其中該基因工程系統係為或係包含鋅指核酸酶 (ZFN) 系統或類轉錄活化因子核酸酶 (TALEN) 系統。
如請求項 47 至 58 中任一項之方法，其中該細胞株發育系統包含定點整合、隨機整合或轉座酶系統。
如請求項 47 至 59 中任一項之方法，其中該細胞為動物細胞或真菌細胞。
如請求項 60 之方法，其中該動物細胞為哺乳動物細胞。
如請求項 61 之方法，其中該哺乳動物細胞為 COS 細胞、VERO 細胞、HeLa 細胞、HEK 293 細胞、PER-C6 細胞、K562 細胞、MOLT-4 細胞、Ml 細胞、NS-1 細胞、COS-7 細胞、MDBK 細胞、MDCK 細胞、MRC-5 細胞、WI-38 細胞、WEHI 細胞、SP2/0 細胞株、BHK 細胞或 CHO 細胞株，或其衍生物。
如請求項 62 之方法，其中該 CHO 細胞為 CHO K1 細胞、CHO K1SV 細胞、DG44 細胞、DUKXB-11 細胞、CHOK1S 細胞或 CHO K1M 細胞，或其衍生物。
如請求項 47 至 63 中任一項之方法，其中該細胞進一步包含編碼目標產物之多核苷酸。
如請求項 64 之方法，其中編碼該目標產物之該多核苷酸係在目標位置整合入該細胞之細胞基因體中。
如請求項 64 之方法，其中編碼該目標產物之該多核苷酸係隨機整合入該細胞之細胞基因體中。
如請求項 64 至 66 中任一項之方法，其中編碼該目標產物之該多核苷酸為染色體外多核苷酸。
如請求項 64 至 66 中任一項之方法，其中編碼該目標產物之該多核苷酸係整合入該細胞之染色體中。
如請求項 64 至 68 中任一項之方法，其中該目標產物包含重組多肽。
如請求項 64 至 69 中任一項之方法，其中該目標產物為抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。
如請求項 70 之方法，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。
如請求項 70 或請求項 71 之方法，其中該抗體由單一重鏈序列與單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。
如請求項 70 至 72 中任一項之方法，其中該抗體包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。
如請求項 70 至 73 中任一項之方法，其中該抗體包含單株抗體。
如請求項 70 至 74 中任一項之方法，其中該等細胞中之每一者進一步包含重組多核苷酸。
一種生產重組多肽之方法，其包含：培養真核細胞株，該真核細胞株： a. 在 Bax及 Bak基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變，及 b. 包含編碼該重組多肽之多核苷酸，該培養係在適合於生產該多肽之條件下進行。
如請求項 76 之方法，其中編碼該多肽之該多核苷酸係在目標位置整合入該細胞株之該等細胞之細胞基因體中。
如請求項 76 之方法，其中編碼該多肽之該多核苷酸係隨機整合入該細胞株之該等細胞之細胞基因體中。
如請求項 76 至 78 中任一項之方法，其中編碼該多肽之該多核苷酸為染色體外多核苷酸。
如請求項 76 至 79 中任一項之方法，其中編碼該多肽之該多核苷酸係整合入該細胞株之該等細胞之染色體中。
如請求項 76 至 80 中任一項之方法，其中該重組多肽為抗體、抗體融合蛋白、抗原、酵素或疫苗。
如請求項 81 之方法，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。
如請求項 81 或請求項 82 之方法，其中該抗體由單一重鏈序列與單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。
如請求項 81 至 83 中任一項之方法，其中該抗體包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。
如請求項 81 至 84 中任一項之方法，其中該抗體包含單株抗體。
如請求項 76 至 85 中任一項之方法，其進一步包含分離該重組多肽。
一種生產病毒載體之方法，其包含：培養真核細胞株，其 (a) 在 Bax 及 Bak 基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型或功能衰減型突變、(b) 包含病毒基因體，及 (c) 包含一個或多個編碼病毒衣殼之多核苷酸，其中該培養係在適合於生產該病毒載體之條件下進行。
如請求項 87 之方法，其進一步包含分離該病毒載體。
如請求項 87 至 88 中任一項之方法，其中該細胞株為動物細胞株或真菌細胞株。
如請求項 89 之方法，其中該動物細胞株為哺乳動物細胞株。
如請求項 90 之方法，其中該哺乳動物細胞株為 COS 細胞株、VERO 細胞株、HeLa 細胞株、HEK 293 細胞株、PER-C6 細胞株、K562 細胞株、MOLT-4 細胞株、Ml 細胞株、NS-1 細胞株、COS-7 細胞株、MDBK 細胞株、MDCK 細胞株、MRC-5 細胞株、WI-38 細胞株、WEHI 細胞株、SP2/0 細胞株、BHK 細胞株或 CHO 細胞株，或其衍生物。
如請求項 91 之方法，其中該 CHO 細胞株為 CHO K1 細胞株、CHO K1SV 細胞株、DG44 細胞株、DUKXB-11 細胞株、CHOK1S 細胞株或 CHO K1M 細胞株，或其衍生物。
如請求項 87 至 92 中任一項之方法，其中該細胞株係在細胞培養基中培養。
如請求項 87 至 93 中任一項之方法，其中該細胞株係在饋料批式培養條件或灌流培養條件下培養。
如請求項 94 之方法，其中該細胞株係在饋料批式培養條件下培養，視情況其中該饋料批式培養條件為強化饋料批式培養條件。
如請求項 87 至 95 中任一項之方法，其中該細胞株係在灌流培養條件下培養，視情況其中該灌流培養條件為半連續灌流或連續灌流。
如請求項 87 至 96 中任一項之方法，其中該細胞株在該 Bax及 Bak基因中之每一者中包含穩定整合功能喪失型突變。