CN115943158A - 抗细胞凋亡的细胞系 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及真核细胞系，其具有在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。还提供了生产此类细胞系的方法。本公开还涉及包含此类细胞系的组合物和细胞培养物，以及使用所述细胞、组合物和细胞培养物生产诸如重组多肽或病毒载体等产物的方法。

Description

抗细胞凋亡的细胞系
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月24日提交的美国临时申请号63/043,545和2021年6月15日提交的美国临时申请号63/210,640的优先权，这些临时申请的内容通过引用方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及在Bax基因和Bak基因中的每一者中具有稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变的真核细胞系。还提供了生产此类细胞系的方法。本公开还涉及包含所述细胞的组合物和细胞培养物，以及生产产物如重组多肽或病毒载体的方法，以及所述细胞、组合物和细胞培养物在生产目的产物的方法中的用途。
背景技术
单克隆抗体(mAb)和其他重组蛋白已被确定为许多疾病适应症的成功疗法，包括免疫学、肿瘤学、神经科学等(参见，例如，Reichert(2017)mAbs.9:167-181；Singh等人(2017)Curr.Clin.Pharmacol.13:85-99)。生物技术行业正在开发300多种mAb，预计到2020年mAb市场将扩大到70种mAb产物(Ecker等人(2015)mAbs.7:9-14)。随着行业的扩展和靶标变得更加复杂，需要更大规模的抗体发现活动来筛选多个mAb变体并确定具有所需特征的临床候选物。
真核细胞，例如哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，已被广泛用于生产用于临床应用的治疗性蛋白质，例如mAb，因为它们具有适当的蛋白质折叠、组装和转译后修饰的能力。然而，大量进行所需分子的细胞培养和生产具有挑战性。因此，需要提供改进的细胞和方法以进一步优化所需产物(例如治疗性蛋白质)的生产。
发明内容
仍然需要用于培养真核细胞系，例如哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞系)的最佳方法，以生产目的产物，例如重组多核苷酸或重组多肽。我们已经确定，当细胞系用于生产目的产物时，细胞表现出高生存力是有利的(例如提供更好的产物滴度)。因此，需要具有抗细胞凋亡的细胞系，包括哺乳动物细胞系(例如CHO细胞系)，以便在生物反应器中提供比其野生型对应物更高的生产率和更稳健的性能。
为了满足这些和其他需求，本文提供真核细胞系，例如哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞系)，其在Bax基因和Bak基因中的每一者中具有稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。因此，本公开涉及方法、细胞和包含细胞的组合物，用于使用本公开的细胞生产目的产物，例如重组多核苷酸和/或重组多肽。特别地，本文所述的方法、细胞和组合物包括表达目的产物的改良哺乳动物细胞，其中该细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)在Bax基因和Bak基因中的每一者中具有稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。细胞和细胞系中Bax基因和Bak基因的下调或缺失，减少了与不希望的细胞凋亡活性相关的不希望的影响，例如真核细胞的降低的生存力和生产率。
在一方面，本发明提供了分离的真核细胞系，其中该细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。
在某些实施例中，细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
在某些实施例中，细胞系包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的缺失。
在某些实施例中，细胞系是动物细胞系或真菌细胞系。细胞系可以是动物细胞系，例如哺乳动物细胞系。示例性哺乳动物细胞系包括杂交瘤细胞系、CHO细胞系、COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系(包括BHK-21细胞系)或它们的衍生物。细胞系可以是CHO细胞系，例如CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。细胞系可以是真菌细胞系，例如酵母细胞系。
在某些实施例中，细胞系进一步包含病毒基因组和编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
在某些实施例中，细胞系进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
可以将编码目的产物的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞系的细胞基因组中。可以将编码目的产物的多核苷酸随机整合在细胞系的细胞基因组中。编码目的产物的多核苷酸可以是染色体外多核苷酸。可以将编码目的产物的多核苷酸整合在细胞系的染色体中。
目的产物可以是或包含重组多肽。目的产物(例如重组多肽)可以是或包含抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。目的产物可以是或包含抗体。目的产物可以是或包含抗原。目的产物可以是或包含酶。目的产物可以是或包含疫苗。
抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。抗体可以包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。抗体可以包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。抗体可以包括单克隆抗体。
在某些实施例中，细胞系比相应的分离的真核细胞系具有更高的比生产率，该分离的真核细胞系包含野生型Bax基因和Bak基因中的每一者中的多核苷酸和功能性拷贝。
在某些实施例中，与包含Bax基因和Bak基因中的每一者的功能拷贝的对应的分离的真核细胞系相比，该细胞系对细胞凋亡更具抗性。
在某些实施例中，细胞系用于细胞培养过程，例如分批进料、灌流、强化过程灌流、半连续灌流或连续灌流。例如但不限于，细胞系可用于强化灌流过程。
在另一方面，本公开提供了组合物，该组合物包含本发明的真核细胞系，例如第一方面的细胞系。该组合物还可以包含细胞培养基。
在某些实施例中，组合物用于细胞培养过程，例如分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流。例如但不限于，细胞培养过程可以是强化灌流过程。
在另一方面，本公开提供了包含细胞培养基和多个真核细胞的细胞培养物，其中多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。
在某些实施例中，细胞培养物用于细胞培养过程，例如分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流。细胞培养过程可以是强化灌流过程。
在某些实施例中，每个细胞在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
在某些实施例中，多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的缺失。
在某些实施例中，细胞是动物细胞或真菌细胞。细胞可以是动物细胞，例如哺乳动物细胞。示例性哺乳动物细胞包括杂交瘤细胞、CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、Ml细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、BHK细胞(包括BHK-21细胞)或它们的衍生物。细胞可以是CHO细胞，例如CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、DG44细胞、DUKXB-11细胞、CHOK1S细胞或CHO K1M细胞，或它们的衍生物。细胞可以是真菌细胞，例如酵母细胞。
在某些实施例中，细胞进一步包含病毒基因组和编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
在某些实施例中，细胞培养物(例如多个细胞)进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
在某些实施例中，可以将编码目的产物的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞的细胞基因组中。在某些实施例中，可以将编码目的产物的多核苷酸随机整合在细胞的细胞基因组中。在某些实施例中，编码目的产物的多核苷酸可以是染色体外多核苷酸。在某些实施例中，可以将编码目的产物的多核苷酸整合在细胞的染色体中。
在某些实施例中，目的产物可以是或包含重组多肽。在某些实施例中，目的产物(例如重组多肽)可以是或包含抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。目的产物可以是或包含抗体。在某些实施例中，目的产物可以是或包含抗原。在某些实施例中，目的产物可以是或包含酶。在某些实施例中，目的产物可以是或包含疫苗。
在某些实施例中，抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。抗体可以包括单克隆抗体。
在某些实施例中，细胞中的每一个进一步包含重组多核苷酸。
在另一方面，本公开提供了降低真核细胞中的细胞凋亡活性的方法，包括对细胞施用基因工程系统。在某些实施例中，基因工程系统：(a)敲低或敲除Bax多肽同种型的表达；和(b)敲低或敲除Bak多肽同种型的表达。
在某些实施例中，该方法进一步包括将真核细胞用于分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流细胞培养过程中。真核细胞可用于强化细胞培养过程。
在某些实施例中，基因工程系统选自由以下各项组成的组：CRISPR/Cas系统(例如CRISPR/Cas9系统)、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统及它们的组合。基因工程系统可以是CRISPR/Cas系统。基因工程系统可以是ZFN系统。基因工程系统可以是TALEN系统。
在某些实施例中，基因工程系统为或包括CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9系统可以包含：(a)Cas9分子，(b)至少一个第一指导RNA(gRNA)，其包含与Bax基因中的靶序列互补的靶向序列，和(c)至少一个第二gRNA，其包含与Bak基因中的靶序列互补的靶向序列。靶序列中的至少一个可以是Bax基因的一部分。靶序列中的至少一个可以是Bak基因的一部分。靶序列中的至少一个可以是Bax基因的一部分，并且靶序列中的至少一个其他靶序列可以是Bak基因的一部分。
在某些实施例中，Bax多肽的表达或Bak多肽的表达被敲除，并且与参考细胞的细胞凋亡活性相比，该细胞的细胞凋亡活性是降低的。在一个实施例中，Bax多肽的表达和Bak多肽的表达被敲除，并且与参考细胞的细胞凋亡活性相比，该细胞的细胞凋亡活性是降低的。
在某些实施例中，Bax多肽的表达或Bak多肽的表达被敲低，并且与参考细胞的细胞凋亡活性相比，该细胞的细胞凋亡活性是降低的。在一个实施例中，Bax多肽的表达或Bak多肽的表达被敲低，并且与参考细胞的细胞凋亡活性相比，该细胞的细胞凋亡活性是降低的。
在某些实施例中，细胞凋亡活性小于参考细胞中的细胞凋亡活性(例如，细胞凋亡活性可以小于参考细胞中细胞凋亡活性的约80％、小于约50％或小于约30％)。例如，细胞凋亡活性可以小于参考细胞的约1％至小于约99％的细胞凋亡活性。细胞的细胞凋亡活性可以通过将在生产期期间确定的所述细胞的群体的生存力与所述参考细胞的群体的生存力进行比较而确定的。参考细胞可以是包含Bax基因和Bak基因的野生型等位基因的细胞，例如参考细胞可以是与细胞凋亡衰减型细胞仅实质性不同之处在于参考细胞包含Bax基因和Bak基因的野生型等位基因的细胞。在一个实施例中，较少的细胞凋亡与具有高生存力的细胞相关。
在实施例中，细胞是动物细胞或真菌细胞。细胞可以是动物细胞，例如哺乳动物细胞。示例性哺乳动物细胞包括杂交瘤细胞、CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、Ml细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、BHK细胞(包括BHK-21细胞)或它们的衍生物。细胞可以是CHO细胞，例如CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、DG44细胞、DUKXB-11细胞、CHOK1S细胞或CHO K1M细胞，或它们的衍生物。细胞可以是真菌细胞，例如酵母细胞。
在某些实施例中，细胞进一步包含病毒基因组和编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
在某些实施例中，细胞进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
在某些实施例中，可以将编码目的产物的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞的细胞基因组中。在某些实施例中，可以将编码目的产物的多核苷酸随机整合在细胞的细胞基因组中。在某些实施例中，编码目的产物的多核苷酸可以是染色体外多核苷酸。在某些实施例中，可以将编码目的产物的多核苷酸整合在细胞的染色体中。
在某些实施例中，目的产物可以是或包含重组多肽。目的产物(例如重组多肽)可以是或包含抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。在某些实施例中，目的产物可以是或包含抗体。在某些实施例中，目的产物可以是或包含抗原。在某些实施例中，目的产物可以是或包含酶。在某些实施例中，目的产物可以是或包含疫苗。
在某些实施例中，抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在某些实施例中，抗体可以包括单克隆抗体。
在某些实施例中，细胞中的每一个进一步包含重组多核苷酸。
在另一方面，本公开提供了生产重组多肽的方法。在某些实施例中，该方法包含在适合于生产多肽的条件下培养真核细胞系。在某些实施例中，细胞系包含(a)在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变，和(b)编码重组多肽的多核苷酸。
在某些实施例中，将编码多肽的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞系的细胞的细胞基因组中。在某些实施例中，将编码多肽的多核苷酸随机整合在细胞系的细胞的细胞基因组中。
在某些实施例中，编码多肽的多核苷酸是染色体外多核苷酸。在某些实施例中，将编码多肽的多核苷酸整合在细胞系的细胞的染色体中。
在某些实施例中，重组多肽可以是或包含抗体、抗原、酶或疫苗。在某些实施例中，重组多肽可以是或包含抗体。在某些实施例中，重组多肽可以是或包含抗体-融合蛋白。在某些实施例中，重组多肽可以是或包含抗原。在某些实施例中，重组多肽可以是或包含酶。重组多肽可以是或包括疫苗。
在某些实施例中，抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在某些实施例中，抗体可以包括单克隆抗体。
在某些实施例中，该方法进一步包含分离的重组多肽。分离通常包含从细胞系中分离重组多肽。
在某些实施例中，细胞系是动物细胞系或真菌细胞系。细胞系可以是动物细胞系，例如哺乳动物细胞系。示例性哺乳动物细胞系包括杂交瘤细胞系、CHO细胞系、COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系(包括BHK-21细胞系)或它们的衍生物。细胞系可以是CHO细胞系，例如CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。细胞系可以是真菌细胞系，例如酵母细胞系。
在某些实施例中，在细胞培养基中培养细胞系。细胞系可以在分批进料培养条件下或灌流培养条件下培养。细胞系可以在分批进料培养条件下培养。分批进料培养条件可以是强化分批进料培养条件。可以在灌流培养条件下培养细胞系。灌流培养条件可以是半连续灌流。灌流培养条件可以是连续灌流。
在某些实施例中，细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
在另一方面，本公开提供了生产病毒载体的方法。在某些实施例中，该方法包含在适合于生产病毒载体的条件下培养真核细胞系。在某些实施例中，在适合于生产病毒载体的条件下，细胞系包含(a)在Bax基因和Bak基因中的每一者中稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变、(b)病毒基因组，和(c)编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
在某些实施例中，该方法进一步包含分离的病毒载体。分离通常包含从细胞系中分离病毒载体。
在某些实施例中，细胞系是动物细胞系或真菌细胞系。细胞系可以是动物细胞系，例如哺乳动物细胞系。示例性哺乳动物细胞系包括杂交瘤细胞系、CHO细胞系、COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系(包括BHK-21细胞系)或它们的衍生物。细胞系可以是CHO细胞系，例如CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。细胞系可以是真菌细胞系，例如酵母细胞系。
在某些实施例中，在细胞培养基中培养细胞系。细胞系可以在分批进料培养条件下或灌流培养条件下培养。细胞系可以在分批进料培养条件下培养。分批进料培养条件可以是强化分批进料培养条件。可以在灌流培养条件下培养细胞系。灌流培养条件可以是半连续灌流。灌流培养条件可以是连续灌流。
在某些实施例中，细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
在另一方面，本公开提供了生产重组多肽的方法，包含根据第四方面降低细胞凋亡活性，然后根据第六方面的方法产生病毒载体的方法。
在另一方面，本公开提供了生产病毒载体的方法，包括根据第四方面降低细胞凋亡活性，然后根据第六方面的方法产生病毒载体的方法。
在另一方面，本公开提供了第一方面的分离的真核细胞系用于生产目的产物的用途，该细胞系包含编码目的产物的多核苷酸。该用途可以进一步包括分离目的产物。
在另一方面，本公开提供了第二方面的组合物用于生产目的产物的用途，其中所述组合物的细胞系包含编码目的产物的多核苷酸。该用途可以进一步包括分离目的产物。
在另一方面，本公开提供了第三方面的细胞培养物用于生产目的产物的用途，其中所述细胞培养物的多个真核细胞进一步包含编码目的产物的多核苷酸。该用途可以进一步包括分离目的产物。
在另一方面，本公开提供了第一方面的细胞系、第二方面的组合物或第三方面的细胞培养物在细胞培养过程中的用途。细胞培养过程可以是或包含分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流细胞培养过程。细胞培养过程可以包含强化灌流过程。
附图说明
图1提供了分别从野生型(WT)和两个不同的Bax/Bak双敲除(DKO)宿主生成的针对4到5个具有最高抗体滴度的克隆的第14天IVCC结果，分析了它们的活细胞浓度对14天期限的强化(高接种密度)抗体生产过程的积分(IVCC,1e8细胞-d/L)。Bax/Bak DKO克隆具有与WT克隆相当或更高的IVCC。
图2提供了强化生产过程期间WT和Bax/Bak DKO克隆的VCC。测量并绘制了来自WT宿主(A)或两个不同Bax/Bak DKO宿主(B&C)的指定克隆的活细胞计数(VCC，1e6细胞/mL)。Bax/Bak DKO克隆和WT克隆在前2天的生长速度相似。VCC在第3天后下降，因为细胞培养物每天都通过添加饲料和移除培养的细胞进行各种测定来稀释。
图3提供了WT和Bax/Bak DKO克隆在强化生产过程期间的生存力。测量并绘制了从WT宿主(A)或两个不同的Bax/Bak DKO宿主(B&C)产生的指定克隆的生存力(％)。WT克隆在第10天(A)后生存力下降，而Bax/Bak DKO克隆在过程结束前保持高生存力，表明了Bax基因和Bak基因的缺失显著防止了强化过程后期的细胞死亡。
图4提供了指定克隆在第14天的生存力(％)。Bax/Bak DKO克隆在第14天显示出比WT克隆高得多的生存力，证实了Bax基因和Bak基因的缺失显著减少了强化过程后期的细胞死亡。
图5提供了第14天细胞沉淀中裂解的半胱天冬酶-3的蛋白质印迹分析。通过针对裂解的半胱天冬酶-3(细胞凋亡标记蛋白)的水平的蛋白质印迹分析来分析指定克隆的第14天细胞沉淀。所有WT克隆均表达高水平的裂解半胱天冬酶-3，表明WT细胞在强化过程的后期经历细胞凋亡，并且凋亡细胞死亡是培养生存力下降的主要原因。所有Bax/Bak DKO克隆都具有低水平的裂解半胱天冬酶-3裂解，表明Bax基因和Bak基因的缺失足以阻止凋亡细胞死亡。
图6说明了在第3、7、10和14天获得的滴度。测量并绘制了针对指定克隆的在14天强化过程的第3、7、10和14天的抗体滴度(g/L)。请注意，Bax/Bak DKO克隆第7天的滴度平均与WT克隆相当，而第14天的滴度明显更高。更重要的是，对于大多数Bax/Bak DKO克隆，第14天的滴度高于第10天的滴度，表明细胞在生产培养的最后4天仍在产生抗体。然而，对于WT克隆，滴度从第10天到第14天没有增加，表明这些克隆在强化生产过程结束时失去了生产率。WT克隆的生产率损失可能是由于这些培养物中的凋亡细胞死亡。
图7表示平均比生产率。用第14天的滴度(g/L)除以第14天的IVCC(1e8细胞-d/L)计算细胞比生产率(Qp、pg/细胞-d)。Bax/Bak DKO克隆的Qp平均高于WT克隆的Qp。
图8显示了在整个14天过程中顶级克隆的校正平均比生产率。由稀释因子校正细胞特异性生产率(Qp、pg/细胞-d)。图8提供了WT宿主的顶级克隆和来自Bax/Bak DKO宿主的顶级2-3个克隆的结果。
图9提供了强化生产过程期间不同阶段的顶级克隆的校正比生产率。在强化过程期间的不同阶段提供了指定顶级克隆的校正比生产率(Qp、pg/细胞-d)。对于所有克隆，第0天到第3天是细胞生长阶段，此时Qp低于稳定阶段(第3天之后)。只有WT克隆在第10天到第14天之间显示Qp下降。由于仅针对活细胞计算Qp，所以该结果表明WT细胞在该过程的最后4天不仅生存力下降，而且生产率也下降。这种生产率的下降可能是由于细胞凋亡开始时Bax蛋白和Bak蛋白激活引起的线粒体膜损伤。在另一方面，Bax/Bak DKO克隆不仅具有延长的生存力，而且还具有延长的生产率。因此，认为这两个基因的缺失不仅阻止了细胞凋亡，而且还有助于维持线粒体的完整性和健康。
图10说明了顶级克隆的葡萄糖消耗率。将强化生产过程期间消耗的总葡萄糖(mg)与总细胞数在不同时间点的积分(1e6细胞-d)作图。斜率表示指定克隆的葡萄糖消耗率(mg/1e6细胞-d)。Bax/Bak DKO克隆和WT克隆之间的葡萄糖消耗率相当。
图11显示了强化生产过程期间顶级克隆的培养物乳酸浓度。每天测量指定克隆的收获细胞培养液(HCCF)中的乳酸浓度并作图。结果表明，WT和Bax/Bak DKO克隆的乳酸代谢在强化生产过程期间是相当的。
图12提供了第14天的HMWS(％)。对于指定克隆，第14天HCCF中聚集抗体的水平(％)在图14中给出。WT和Bax/Bak DKO克隆之间的％HMWS水平平均相当。
图13表示第14天的％主峰。这提供了指定克隆在第14天HCCF中的完整抗体和单体抗体的水平(％)的图示。WT和Bax/Bak DKO克隆之间的％主峰水平平均相当
图14提供了以％LMWS表示的抗体片段量的图示。描绘了指定克隆在第14天HCCF中的抗体片段水平。WT和Bax/Bak DKO克隆之间的％LMWS水平平均相当。
图15描绘了克隆的第14天HCCF中抗体酸性电荷变体的量(％)。WT和Bax/Bak DKO克隆之间的％酸性峰水平平均相当。
图16提供了主峰的结果，它表示克隆的第14天HCCF中抗体中性电荷变体的水平(％)。WT和Bax/Bak DKO克隆之间的％主峰水平平均相当。
图17描绘了克隆的第14天HCCF中抗体碱性电荷变体的量(％)。WT和Bax/Bak DKO克隆之间的％碱性峰水平平均相当比。
图18A-18C说明在强化生产过程中敲除Bax/Bak基因提高了表达标准mAb的CHO池的细胞生存力和滴度。已在摇瓶中的低接种密度平台-1过程(18A)、AMBR15生物反应器中的低接种密度平台-1过程(18B)和AMBR15生物反应器中的高接种密度平台-1过程(18C)中，测量了从指定宿主细胞系产生的表达mAb-A的细胞池的生存力、活细胞计数(VCC)、滴度和14天平均比生产率(Qp)。
图19A-B说明由Bax/Bak DKO宿主产生的单细胞克隆在强化生产过程中实现了标准mAb的延长生存力和更高滴度。已在(19A)摇瓶中的低接种密度过程和(19B)AMBR15生物反应器中的强化过程中测量了从指定宿主细胞系产生的表达mAb-A的顶级克隆的生存力、VCC、滴度和14天平均比生产率。误差条示出从指定宿主产生的4-5个顶级克隆的标准偏差。
图20说明从Bax/Bak DKO宿主产生的单细胞克隆在大规模的强化生产过程中实现了标准mAb的延长生存力和更高滴度。已经使用AMBR250生物反应器在强化过程中测量了从指定宿主细胞系产生的表达mAb-A的顶级克隆的生存力、VCC、滴度和14天平均比生产率。误差条显示同一WT顶级克隆的4个重复的标准偏差。
图21A-21C说明敲除Bax/Bak基因改善了CHO强化生产过程中的复合分子表达。在AMBR15生物反应器中的强化生产过程中，已经测量了由WT和两个DKO宿主细胞系产生的表达复合分子-B(21A)、双特异性抗体分子-C(21B)和复合分子-D(21C)的细胞池的生存力、VCC、滴度和14天平均比生产率。误差条显示来源于针对指定分子的同一宿主的2个重复池的标准差。
图22A-22D说明了Bax/Bak DKO细胞系的产生以及在3个生产过程中在WT和DKO池中生产的mAb-A的产物质量属性。如下进行来自WT细胞系的Bax基因和Bak基因的顺序敲除。步骤1，将靶向Bax基因的RNA转染到WT细胞中，然后进行单细胞克隆以产生Bax KO克隆#40。步骤2，将靶向Bak基因的RNA转染到Bax KO克隆#40细胞中，然后进行单细胞克隆，以产生Bax/Bak DKO克隆1、2、3、7、8、21。(22B-22D)。在摇瓶中的生产平台-1中以低接种密度(SD)(22B)、在AMBR15中的生产平台-1中以低SD(22C)、在AMBR15中的生产平台-1中以高SD(22D)测量mAb-A表达池的高分子量物质(HMWS)/聚集体水平、不同聚糖物质水平和电荷变体水平。
图23A-23C描绘了在摇瓶和AMBR15生物反应器中从WT和DKO宿主产生的表达mAb-A的顶级克隆的产物质量属性。在(23A)摇瓶中的生产平台-1中以低SD和在(23B)的AMBR15强化生产平台-1中测量了表达mAb-A的克隆的不同聚糖物质水平、电荷变体水平和高分子量物质(HMWS)/聚集体水平。AMBR15强化生产平台-1(23C)中的第14天细胞中裂解的半胱天冬酶3水平的蛋白质印迹。
图24A-24C描绘了在AMBR15生物反应器中的强化过程中在CHO池中表达的复合分子和双特异性抗体的产物质量属性。对表达复合分子-B(24A)、双特异性分子-C(24B)和复合分子C(24C)的CHO池测量了电荷变体水平、高分子量物质(HMWS)/聚集体水平和不同聚糖物质水平。请注意，双特异性分子-C是去糖基化分子，因此没有该分子的糖基化数据可用。
图25A-25D说明敲除表达复合分子-E的转染CHO细胞池中的Bax/Bak基因提高了高接种密度生产过程中的细胞生存力。(25A)评估用复合分子-E表达构建体转染的CHO细胞池中的Bax/Bak基因敲除的策略概述。模拟或Bax/Bak gRNA转染后CHO细胞的复合分子-E表达池的滴度(25B)、细胞生存力(25C)和VCC(25D)。
具体实施方式
在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包括”和“包含”及其变体表示“包括但不限于”，并且它们不旨在排除(也不排除)其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。在本说明书的整个描述和权利要求书中，单数包括复数，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书将被理解为考虑复数以及单数。
结合本发明的特定方面、实施例或实例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施例或实例，除非与其不相容。本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的所有特征和/或由此公开的任何方法或过程的所有步骤可以任何组合进行组合，除了这些特征和/或步骤中的至少一些互相排斥的组合之外。本发明不限于任何公开的实施例的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的特征的任何新颖特征或任何新颖组合，或者扩展到由此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖步骤或任何新颖组合。
读者应注意与本说明书同时提交或在本说明书之前连同本申请一起提交并且与本说明书一起公开供公众查阅的所有文件和文档，并且所有这些文件和文档的内容通过引用并入本文。
本文所引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公开、非专利文献和UniProtKB/Swiss-Prot登录号通过引用其全部并入本文，如同各参考文献特定地和个别地指示为通过引用并入一样。
为避免疑义，特此声明，本说明书前面在“背景技术”标题下公开的信息与本发明相关，并应理解为本发明公开内容的一部分。
为清楚起见，但不作为限制，当前公开的主题的详细描述分为以下小节：
5.1定义；
5.2调节BAX和BAK表达的方法
5.3细胞系；
5.4细胞培养；
5.5生产方法；和
5.6产物。
5.1.定义
提供以下对术语和方法的解释以更好地描述本公开并指导本领域普通技术人员实施本公开。
如本文所用，术语“约”或“大致”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域中的实践，“约”可以意谓3个或多于3个标准偏差。另选地，“约”可以表示给定值的至多20％，优选地至多10％，更优选地至多5％，并且更优选地至多1％的范围。另选地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在某一值的某一数量级内，优选地在5倍以内，更优选地在2倍以内。
如本文所用，“多肽”和“蛋白质”可以互换使用并且通常指具有超过约10个通过肽基键连接的共价连接的氨基酸的肽和蛋白质。术语蛋白质涵盖纯化的天然产物，或可以使用重组或合成技术部分或全部生产的产物。术语肽和蛋白质可以指蛋白质的聚集体，例如二聚体或其他多聚体、融合蛋白、蛋白质变体或其衍生物。该术语还包括蛋白质的修饰，例如，通过糖基化、乙酰化、磷酸化、聚乙二醇化、泛素化等修饰的蛋白质。蛋白质可包括不由核酸密码子编码的氨基酸。蛋白质可具有长度足以产生更高水平的三级和/或四级结构的氨基酸序列。通常，本文的蛋白质可具有至少约15-20kD、优选至少约20kD的分子量。本文定义中涵盖的蛋白质的示例包括所有哺乳动物蛋白质，特别是治疗性蛋白质和诊断性蛋白质，诸如治疗性抗体和诊断性抗体，并且一般是含有一个或多个二硫键的蛋白质，包括包含一个或多个链间和/或链内二硫键的多链多肽。
通过“蛋白质修饰”或“蛋白质突变”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失，或与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以为连接至蛋白质的经改变的碳水化合物或PEG结构。本发明的蛋白质可以包括至少一种这样的蛋白质修饰。
术语“修饰的蛋白质”或“突变的蛋白质”涵盖具有至少一个氨基酸取代、插入和/或缺失的蛋白质。修饰或突变的蛋白质可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸修饰(选自取代、插入、缺失及其组合。
本文所用的术语“抗体”涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体(例如，包含单个重链序列和单个轻链序列的抗体，包括此类配对的多聚体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，“抗体片段”、抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)或抗体的“抗原结合片段”是指除完整抗体以外的分子，其包括与完整抗体结合的抗原结合的完整抗体的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136(2005)。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
术语“人抗体”是指这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“人源化抗体”是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在实例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包括该群体的各个抗体具有同一性和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据目前公开的主题所使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；以及
存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
CDR是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)决定的。CDR命名也可以根据Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987),MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，或任何其他科学上可接受的命名系统。
与抗体相关的术语“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。抗体可以是IgG1同型。抗体可以是IgG2同型。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，该两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”表示包括核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团构成。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包括这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本公开的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者中)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或所编码的分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者以在体内产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。除非上下文另有要求，术语“载体”是指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。
术语“分离的”是指生物组分(如核酸分子或蛋白质)，其与该组分天然存在的生物体的细胞中的其它生物组分(即其他染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)已基本上分离或纯化。已经“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸、蛋白质和肽。
纯化的：术语纯化的不需要绝对的纯度；相反，它是一个相对的术语。因此，例如，纯化的产物是指以下情况：相比产物(例如多肽或蛋白质)在其细胞内的环境中，产物在其中更加富集，使得该产物基本上与可能伴随它的细胞组分(核酸，脂质，碳水化合物和[其他]多肽)分离。
在一个实例中，当样品的按重量计至少50％由产物组成时，例如当样品的至少60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多由多肽组成时，纯化本公开的目的产物(例如多肽，如抗体)。可用于纯化多肽的方法的实例包括但不限于Sambrook等人公开的方法(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989,Ch.17)。蛋白质纯度可以通过例如高压液相色谱法或其他常规方法来确定。
术语“滴度”是指由细胞培养物产生的目的产物(例如重组多肽，例如抗体)的总量除以给定量的培养基体积。滴度通常以每毫升或每升培养基中的抗体毫克数为单位(mg/ml或mg/L)。在某些实施例中，滴度以每升培养基中的抗体克数(g/L)表示。滴度可以根据相对测量来表示或评估，例如与在不同培养条件下获得蛋白质产物相比，滴度增加的百分比。
术语“序列同一性”：两个或多个核酸序列、或两个或多个氨基酸序列之间的同一性，以序列之间的同一性或相似性来表示。序列同一性可以用百分比同一性来衡量；百分比越高，序列越相同。同一性百分比是在整个序列长度上计算的。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同系物或直系同源物具有相对高程度的序列同一性。当直系同源蛋白或cDNA来源于关系更密切的物种(例如，人类和小鼠序列)，与关系更远的物种(例如，人类和秀丽隐杆线虫序列)相比，这种同源性更为重要。
如本文所用的术语“细胞”包括指代真核细胞。除非上下文另有要求，否则指代细胞可以包括指代多个(细胞)。真核细胞可以是动物细胞(例如哺乳动物细胞)或真菌细胞(例如酵母细胞)。真核细胞可以是哺乳动物细胞，诸如杂交瘤细胞、CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、Ml细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、BHK细胞(包括BHK-21细胞)和它们的衍生物。CHO细胞可以是例如CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、DG44细胞、DUKXB-11细胞、CHOK1S细胞、CHO K1M细胞及其衍生物。
本文所用的术语“细胞系”包括对可重复繁殖的真核细胞培养物的提及。该细胞系的真核细胞可选自本文定义的任何细胞。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”在本文中可互换使用，以指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代不需要与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
本文所用的术语“哺乳动物宿主细胞”或“哺乳动物细胞”是指来源于哺乳动物的细胞系，当它们置于单层培养物中或含有适当营养物和生长因子的培养基中的悬浮培养物中时，能够生长和存活。特定细胞系的必需生长因子很容易凭经验确定而无需过度实验，例如Mammalian Cell Culture(Mather,J.P.编，Plenum Press,N.Y.1984)和Barnes与Sato,(1980)Cell,22:649中所述。通常，细胞能够表达并分泌大量特定蛋白质(例如糖蛋白)到培养基中。合适的哺乳动物宿主细胞的示例包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:42161980)；dp12.CHO细胞(EP 307,247，1989年3月15公开)；CHO-K1(ATCC，CCL-61)；通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59 1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-2511980)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68 1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(Hep G2)。哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:42161980)；dp12.CHO细胞(EP 307,247，1989年3月15日公开)。
术语“杂交瘤”是指通过将免疫来源的永生细胞系与抗体产生细胞融合而产生的杂交细胞系。该术语涵盖异种杂交骨髓瘤融合体的子代，其是与人细胞和随后与浆细胞融合的鼠类骨髓瘤细胞系融合的结果，俗称三源杂交瘤细胞系。此外，该术语意在包括产生抗体的任何经永生化杂交细胞系，诸如，举例而言，四源杂交瘤。参见，例如，Munson等人,Anal.Biochem.,537:3053(1983)。
如本文所用，术语“细胞培养基”是指用于培养细胞的营养溶液。“细胞培养饲料”和“细胞培养添加剂”表示可以添加到细胞培养基以改善培养基性能的营养补充剂。例如，细胞培养饲料和/或细胞培养添加剂可以在细胞的分批培养期间添加到细胞培养基。细胞培养基可以是化学成分确定的或可以包含未确定的组分。细胞培养基，例如用于哺乳动物细胞，通常包含来自以下种类中的一种或多种的至少一种组分：
1)能量来源，一般以碳水化合物(诸如葡萄糖)的形式存在；
2)所有必需氨基酸，且一般为二十种氨基酸加上半胱氨酸的基本组；
3)需求量在低浓度的维生素和/或其他有机化合物；
4)游离脂肪酸；和
5)微量元素，其中微量元素定义为无机化合物或天然存在的元素，其需求量通常在非常低的浓度，一般在微摩尔范围内。
营养液可以任选地补充有来自以下任何类别的一种或多种组分：细胞培养基和类似的营养液可以任选地补充选自任何以下种类的一种或多种组分:
1)激素和其他生长因子，例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；
2)盐和缓冲剂，例如钙、镁和磷酸盐；
3)核苷和碱基，例如腺苷、胸苷和次黄嘌呤；和
4)蛋白质和组织水解物。
如本文所用，“化学成分确定的”培养基是其中每种成分都是已知的培养基。化学成分确定的培养基与各自均含有未知组分的血清、胚胎提取物和水解物不同。本公开的细胞培养基可以是化学成分确定的培养基。本公开的细胞培养饲料可以是化学成分确定的。本公开的细胞培养添加剂可以是化学成分确定的。
如本文所用，“未确定的培养基”或“包含未确定组分的培养基”包括指代包含一种或多种未知成分的培养基。例如，血清、蛋白胨、水解产物(诸如酵母、植物或血清水解产物)和胚胎提取物可以提供未确定的组分。
术语“培养”是指在适合于细胞存活和/或生长和/或增殖的条件下使细胞与细胞培养基接触。
术语“分批培养”是指其中在培养过程开始时用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应至培养生物反应器的培养。
如本文所用，术语“供料分批细胞培养”是指这样的分批培养，其中首先将细胞和培养基供应至培养生物反应器，并且在培养过程中将另外的培养营养物连续或以不连续的增量供料至培养物，在终止培养之前进行或不进行定期的细胞和/或产物收获。
术语“灌流培养”有时称为连续培养，是通过例如过滤、封装、锚定至微载体等将细胞限制在培养物中的培养，并且连续地、逐步地或间歇地(或其任意组合)引入培养基并将其从培养生物反应器中去除。
细胞培养的术语“生长期”是指细胞通常快速分裂的指数细胞生长期(对数期)。例如，细胞维持在生长期的持续时间可以根据细胞类型、细胞生长速率和/或培养条件而变。在这期间，将细胞培养一段时间，例如1至4天，并且在使细胞生长最大化的条件下。宿主细胞的生长周期的确定可以针对所设想的特定宿主细胞确定，而无需过度实验。“细胞生长最大化的时间段和此类条件下”等是指对于特定细胞系被确定为最适合细胞生长和分裂的那些培养条件。在生长期对于某些细胞培养物，细胞在含有必需添加剂的营养培养基中培养，通常在约30℃至40℃在潮湿的受控气氛中培养，从而实现特定细胞系的最佳生长。细胞在生长期维持约一天与四天之间的时期，一般在二至三天之间。
细胞培养的术语“过渡期”指的是生产期的培养条件参与的时间段。在过渡期，诸如细胞培养温度、培养基渗透压等环境因素从生长条件转变为生产条件。
细胞培养物的术语“生产期”是指细胞生长达到/已达到稳定的时期。对数细胞生长通常在这一时期之前或期间减少，且蛋白质生产接管。在生产期，对数细胞生长已经结束，且产物(例如多肽)的生产是主要的。在此期间，通常补充培养基以支持持续的蛋白质生产并获得所需产物(可能是糖蛋白)的产物。分批进料和/或灌流细胞培养过程补充细胞培养基或在此期间提供新鲜培养基以实现和/或维持所需的细胞密度、生存力和/或重组蛋白产物滴度。生产期可以以大规模执行。
本文所用的术语“表达”是指在宿主细胞内发生的转录和翻译。宿主细胞中产物基因的表达水平可以基于细胞中存在的相对应mRNA的量或由细胞产生的由产物基因编码的蛋白质的量来确定。例如，从产物基因转录的mRNA可以通过northern杂交来定量。Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,pp.7.3-7.57(Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)。由产物基因编码的蛋白可以通过以下来定量：测定该蛋白质的生物活性或通过采用独立于这种活性的测定，例如使用能够与该蛋白质反应的抗体的蛋白质印迹或放射免疫测定。Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,pp.18.1-18.88(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
术语“细胞密度”是指给定体积培养基中的细胞数量。在某些实施例中，高细胞密度是合乎需要的，因为它可以导致更高的蛋白质生产力。可以通过本领域已知的任何技术监测细胞密度，包括但不限于从培养物中提取样品并在显微镜下分析细胞，使用可商购的细胞计数装置或通过使用可商购的合适的探针引入生物反应器本身(或进入一个循环，培养基和悬浮细胞通过该循环然后返回生物反应器)。
5.2.调节BAX和BAK表达的方法
本文提供了通过使用基因工程系统调节(即敲低或敲除)(a)Bax多肽同种型的表达和(b)Bak多肽同种型的表达来降低真核细胞凋亡活性的方法。这还提供了通过将突变引入任何真核宿主细胞，从而在Bax基因和Bak基因中的每一者中提供稳定整合的功能丧失突变或稳定的功能衰减突变，从而允许功能丧失突变和功能衰减突变能够稳定整合至真核宿主细胞。允许稳定整合的真核宿主细胞可以通过多种方法产生，包括靶整合(Ti)(例如，如WO 2019/126634中所述)、随机整合(RI)或转座酶介导的整合。本领域已知的各种基因工程系统可用于所述功能丧失或功能衰减工程。此类工程系统的非限制性示例包括CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统。本领域已知的任何CRISPR/Cas系统，包括传统的、增强的或修饰的Cas系统，以及其他基于细菌的基因组切除工具诸如Cpf-1，都可以与本文所公开的方法一起使用。
在某些实施例中，本公开的抗体表现出BAX的降低或消除的表达。在某些实施例中，如本文所用，BAX是指真核BAX细胞蛋白质，例如CHO BAX细胞蛋白质(Entrez Gene ID：100689032；GenBank ID:EF104643.1)，及其功能变体。在某些实施例中，如本文所用，BAX的功能变体涵盖与用于生产重组目的产物的经修饰细胞的野生型BAX序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的BAX序列。
在某些实施例中，本公开的抗体表现出BAK的降低或消除的表达。在某些实施例中，如本文所用的BAK是指真核BAK细胞蛋白质，例如CHO BAK细胞蛋白质(GenBank ID：EF104644.1)，及其功能变体。在某些实施例中，如本文所用，BAK的功能变体涵盖与用于生产重组目的产物的经修饰细胞的野生型BAK序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的BAK序列。
可以缺失Bax基因和/或Bak基因中的每一者的整个基因或一部分，以调节(例如，敲低或敲除)Bax多肽和/或Bak多肽的表达。可以缺失Bax基因的至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。可以缺失Bak基因的至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。可以缺失Bax基因和Bak基因中的每一者的至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。
可以缺失Bax基因的不超过约2％、不超过约5％、不超过约10％、不超过约15％、不超过约20％、不超过约25％、不超过约30％、不超过约35％、不超过约40％、不超过约45％、不超过约50％、不超过约55％、不超过约60％、不超过约65％、不超过约70％、不超过约75％、不超过约80％、不超过约85％或不超过约90％。可以缺失Bak基因的不超过约2％、不超过约5％、不超过约10％、不超过约15％、不超过约20％、不超过约25％、不超过约30％、不超过约35％、不超过约40％、不超过约45％、不超过约50％、不超过约55％、不超过约60％、不超过约65％、不超过约70％、不超过约75％、不超过约80％、不超过约85％或不超过约90％。可以缺失Bax基因和Bak基因中的每一者的不超过约2％、不超过约5％、不超过约10％、不超过约15％、不超过约20％、不超过约25％、不超过约30％、不超过约35％、不超过约40％、不超过约45％、不超过约50％、不超过约55％、不超过约60％、不超过约65％、不超过约70％、不超过约75％、不超过约80％、不超过约85％或不超过约90％。
在某些实例中，可以缺失Bax基因的约2％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约2％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约2％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约2％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约2％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约2％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约2％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约2％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％之间、约2％与约10％之间、约5％与约10％之间或约2％与约5％之间。在某些实例中，可以缺失Bak基因的约2％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约2％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约2％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约2％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约2％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约2％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约2％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约2％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％之间、约2％与约10％之间、约5％与约10％之间或约2％与约5％之间。在某些实施例中，可以缺失Bax基因和Bak基因中的每一者的约2％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约2％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约2％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约2％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约2％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约2％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约2％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约2％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％之间、约2％与约10％之间、约5％与约10％之间或约2％与约5％之间。
CRISPR/Cas9系统可用于调节Bax多肽和/或Bak多肽的表达。成簇的规则间隔短回文重复(CRISPR)系统为在原核细胞中发现的基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该系统包括Cas9(一种能够利用crRNA作为其向导来修饰DNA的蛋白质)、CRISPR RNA(crRNA，其含有：RNA，该RNA由Cas9使用以将其引导到宿主DNA的正确片段；以及一个区，该区结合至tracrRNA(通常以发夹环形式)，与Cas9形成活性复合物)，和反式活化crRNA(tracrRNA，其结合至crRNA并与Cas9形成活性复合物)。术语“指导RNA”和“gRNA”是指促进RNA引导的核酸酶(诸如Cas9)与靶序列(例如细胞中的基因组或游离序列)特异性缔合(或“靶向”)的任何核酸。gRNA可以是单分子的(包含单个RNA分子，且替代性地称为嵌合的)或模块化的(包含一个以上，通常是两个独立的RNA分子，诸如crRNA和tracrRNA，它们通常彼此缔合，例如通过双工化)。CRISPR/Cas9策略可采用载体来转染哺乳动物细胞。指导RNA(gRNA)可以针对每种应用进行设计，因为这是Cas9用来鉴定并直接结合至细胞中靶DNA的序列。多个crRNA和该tracrRNA可以包装在一起以形成单指导RNA(sgRNA)。sgRNA可以与Cas9基因连接在一起并制成载体，以便转染到细胞中。
用于调节一种或多种Bax多肽和/或Bak多肽的表达的CRISPR/Cas9系统可包括Cas9分子和一种或多种gRNA，该一种或多种gRNA包含与Bax基因和/或Bak基因的靶序列互补的靶向结构域。靶基因可以是Bax基因和/或Bak基因的区域。因此，靶序列可以是Bax基因内的任何外显子或内含子区域，例如，其靶向消除或减少Bax多肽的表达。因此，靶序列可以是Bak基因内的任何外显子或内含子区域，例如，其靶向消除或减少Bak多肽的表达。
可以将gRNA在单个载体中施用于细胞，并且可以将Cas9分子在第二载体中施用于细胞。可以将gRNA和Cas9分子在单个载体中施用于细胞。替代性地，gRNA和Cas9分子中的每一者都可以通过独立的载体施用。在实例中，CRISPR/Cas9系统可以作为包括与一种或多种gRNA复合的Cas9蛋白质的核糖核蛋白复合物(RNP)递送至细胞，例如，通过电穿孔递送(参见，例如，DeWitt等人,Methods 121-122:9-15(2017)关于将RNP递送至细胞的其他方法)。将CRISPR/Cas9系统施用于细胞通常会导致Bax和Bak多肽表达的敲除或敲低。
用于调节Bax多肽和/或Bak多肽表达的基因工程系统可以是ZFN系统。ZFN可以用作限制性内切酶，它是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域结合而产生的。可以对锌指结构域进行工程改造以靶向特定的DNA序列，从而使锌指核酸酶靶向基因组内的所需序列。各个ZFN的DNA结合结构域通常包括多个单独的锌指重复序列，并且每个锌指重复序列都可以识别多个碱基对。生成新锌指结构域的最常用方法是组合已知特异性的较小锌指“模块”。ZFN中最常见的切割结构域是来自IIs型限制性核酸内切酶FokI的非特异性切割结构域。ZFN通过在靶DNA序列中产生双链断裂(DSB)来调节蛋白质的表达，在没有同源模板的情况下，双链断裂将会通过非同源末端连接(NHEJ)进行修复。这种修复可导致碱基对的缺失或插入，产生移码并阻止有害蛋白质的产生(Durai等人,Nucleic Acids Res.；33(18):5978–90(2005))。多对ZFN也可用于完全去除基因组序列的整个大片段(Lee等人,GenomeRes.；20(1):81–9(2010))。靶基因可以是Bax基因的一部分。靶基因可以是Bak基因的一部分。
用于调节Bax多肽和/或Bak多肽表达的基因工程系统可以是TALEN系统。TALEN为限制性内切酶，其可以通过工程改造来切割特定的DNA序列。TALEN系统的运行原理与ZFN相似。TALEN是通过将转录活化因子样效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域相结合而产生的。转录活化因子样效应子(TALE)由33至34个氨基酸重复基序组成，具有两个可变位置，对特定核苷酸具有很强的识别能力。通过组装这些TALE的阵列，可以对TALE DNA结合结构域进行工程改造以结合所需的DNA序列，从而引导核酸酶在基因组中的特定位置切割(Boch等人,Nature Biotechnology；29(2):135-6(2011The target gene may be part of theBax gene。靶基因可以是Bak基因的一部分。
可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体诸如γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体)将本文所公开的基因工程系统递送到哺乳动物细胞中。逆转录病毒载体和适当的包装线的组合是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人类细胞的功能。各种生产两性病毒的细胞系是已知的，包括但不限于PA12(Miller,等人(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437)；PA317(Miller,等人(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895-2902)；和CRIP(Danos,等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464)。非双嗜性颗粒也是合适的，例如，用VSVG、RD114或GALV包膜和本领域已知的任何其他颗粒假性化的颗粒。可能的转导方法还包括细胞与生产细胞的直接共培养，例如，通过Bregni等人(1992)Blood 80:1418-1422的方法，或用单独的病毒上清液或含有或不含有适当生长因子和聚阳离子的浓缩载体原种培养，例如，通过Xu等人(1994)Exp.Hemat.22:223-230和Hughes,等人(1992)J.Clin.Invest.89:1817的方法。
其他转导病毒载体可用于修饰本文所公开的哺乳动物细胞。在某些实施例中，所选择的载体表现出高效的感染以及稳定的整合和表达(参见，例如，Cayouette等人,HumanGene Therapy 8:423-430,1997；Kido等人,Current Eye Research 15:833-844,1996；Bloomer等人,Journal of Virology71:6641-6649,1997；Naldini等人,Science 272:263-267,1996；和Miyoshi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。可以使用的其他病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，诸如Epstein-Barr病毒(也参见，例如，Miller,Human Gene Therapy 15-14,1990；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis等人,BioTechniques 6:608-614,1988；Tolstoshev等人,Current Opinion in Biotechnology 1:55-61,1990；Sharp,The Lancet337:1277-1278,1991；Cornetta等人,Nucleic Acid Research and Molecular Biology36:311-322,1987；Anderson,Science 226:401-409,1984；Moen,Blood Cells 17:407-416,1991；Miller等人,Biotechnology 7:980-990,1989；LeGal La Salle等人,Science259:988-990,1993；和Johnson,Chest 107:77S-83S,1995的载体)。逆转录病毒载体尤其得到充分开发并已用于临床环境(Rosenberg等人,N.Engl.J.Med 323:370,1990；Anderson等人，美国专利号5,399,346)。
5.3细胞系
本公开涉及分离的细胞系，其中该细胞系在Bax和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。在一方面，分离的细胞系是真核细胞系。
在某些实施例中，细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
在某些实施例中，细胞系包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的缺失。
在某些实施例中，细胞系是动物细胞系或真菌细胞系。细胞系可以是动物细胞系，例如哺乳动物细胞系。示例性哺乳动物细胞系包括杂交瘤细胞系、CHO细胞系、COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系(包括BHK-21细胞系)或它们的衍生物。细胞系可以是CHO细胞系，例如CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。细胞系可以是真菌细胞系，例如酵母细胞系。
在某些实施例中，细胞系进一步包含病毒基因组和编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
在某些实施例中，细胞系进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
可以将编码目的产物的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞系的细胞基因组中。可以将编码目的产物的多核苷酸随机整合在细胞系的细胞基因组中。编码目的产物的多核苷酸可以是染色体外多核苷酸。可以将编码目的产物的多核苷酸整合在细胞系的染色体中。
在某些实施例中，可以将编码目的产物的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞系的细胞基因组中。此类靶向整合允许将外源核苷酸序列整合在宿主细胞基因组的一个或多个预定位点中。在某些实施例中，靶向整合由识别一个或多个重组识别序列(RRS)的重组酶介导。RRS可以选自由以下项组成的组：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、
Figure BDA0004012788070000321
attP序列和
Figure BDA0004012788070000322
attB序列。靶向整合可以通过同源重组介导。靶向整合可以由外源性位点特异性核酸酶介导，然后是同源定向修复(HDR)和/或非同源末端连接(NHEJ)。根据本公开的靶向整合可以如WO 2019/126634中进一步描述的那样(参见例如WO 2019/126634第5.1、5.2、5.3和5.4节，第42-55页；使用靶向整合制备细胞的方法进一步描述于第55-67页的第6.1和6.2节中)。
在采用靶向整合的某些实施例中，外源核苷酸序列整合在宿主细胞(“TI宿主细胞”)的基因组的特定基因座内的位点。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合于其中的基因座与以下序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源，这些序列选自Contig NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1。
在某些实施例中，紧邻整合的外源序列的5'端的核苷酸序列选自由以下项组成的组：NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054或NW_003615411.1的核苷酸82214-97705以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，紧邻整合的外源序列的5'端的核苷酸序列与以下核苷酸至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054或NW_003615411.1的核苷酸82214-97705。
在某些实施例中，紧邻整合的外源序列的3'端的核苷酸序列选自由以下项组成的组：NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768或NW_003615411.1的核苷酸97706-105117以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，紧邻整合的外源序列的3'端的核苷酸序列与以下核苷酸至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768或NW_003615411.1的核苷酸97706-105117。
在某些实施例中，整合的外源序列在5'端侧接有选自由以下项组成的组的核苷酸序列：NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054和NW_003615411.1的核苷酸82214-97705以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，整合的外源序列在3'端侧接有选自由以下项组成的组的核苷酸序列：NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768和NW_003615411.1的核苷酸97706-105117以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，侧接整合的外源核苷酸序列的5'端的核苷酸序列与以下核苷酸至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054和NW_003615411.1的核苷酸82214-97705。在某些实施例中，侧接整合的外源核苷酸序列的3'端的核苷酸序列与以下核苷酸至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768和NW_003615411.1的核苷酸97706-105117。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列可操作地连接至选自由以下组成的组的核苷酸序列：Contigs NW_006874047.1、NW_006884592.1,NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1,NW_006882936.1、和NW_003615411.1以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，可操作地连接至外源核苷酸序列的核苷酸序列与选自由以下组成的组的序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：Contig NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1。
在某些实施例中，可以使用基于转座酶的整合将编码目的产物的核酸整合在宿主细胞基因组中。例如，在Trubitsyna等人,Nucleic Acids Res.45(10):e89(2017)、Li等人,PNAS 110(25):E2279-E2287(2013)和WO 2004/009792中公开了基于转座酶的整合技术，这些文献通过引用以其整体并入本文。
目的产物可以是或包含重组多肽。目的产物(例如重组多肽)可以是或包含抗体、抗原、酶或疫苗。抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。抗体可以包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。抗体可以包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。目的产物可以是复合分子，例如，部分抗体和部分蛋白质，或非抗体复合蛋白质和此类衍生物。抗体可以包括单克隆抗体。
在某些实施例中，细胞系具有比相应的真核细胞系更高的比生产率，该真核细胞系包含野生型Bax基因和Bak基因中的每一者中的多核苷酸和功能性拷贝。例如，细胞系可具有比相应的真核细胞系的比生产率高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、或至少约60％的比生产率(Qp)％、包含每个野生型Bax和Bak基因的多核苷酸和功能性拷贝，该真核细胞系包括野生型Bax基因和Bak基因中的每一者中的多核苷酸和功能性拷贝。例如，细胞系可具有比相应的真核细胞系的滴度高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、或至少约60％的目的产物的滴度，该真核细胞系包含野生型Bax基因和Bak基因中的每一者中的多核苷酸和功能性拷贝。
在某些实施例中，与包含Bax基因和Bak基因中的每一者的功能拷贝的对应的分离的真核细胞系相比，该细胞系对细胞凋亡更具抗性。
5.4.细胞培养物
细胞培养物包含细胞培养基和至少一个(通常多个)细胞。例如，细胞培养基可包含细胞培养基和多个真核细胞，其中多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。
细胞培养基含有许多组分。细胞培养基提供了在受控、人工和体外环境中维持细胞和使细胞生长所必需的营养物。细胞培养基的特性和组成因特定的细胞需求而异。重要参数包括渗透压、pH和营养配方。
培养基含有氨基酸、葡萄糖、盐、维生素和其他营养物的混合物，且可以从商业供应商处以粉末或液体形式获得。这些组分的要求因细胞系而异。调节pH对于最佳培养条件至关重要，通常使用合适的缓冲体系来实现。虽然由于化学定义的培养基(CDM)在无菌条件下制备和使用时可提供可重复的无污染培养基，使CDM对于治疗和相关应用是优选的，但对于某些细胞类型，可能需要使用包含血清、蛋白质或其他生物提取物(诸如酵母提取物或植物或动物物质的酶消化物)的培养基。
一些基本上由维生素、氨基酸、有机和无机盐以及缓冲液组成的非常简单的限定培养基已用于细胞培养。然而，此类培养基(通常称为“基础培养基”)通常严重缺乏大多数动物细胞所需的营养成分。因此，这些培养基通常需要补充例如饲料或其他添加剂，以形成完整的培养基。此外，分批培养系统通常包括用浓缩饲料或添加剂定期补充培养基，以维持培养细胞的生存力和/或生物产物的产生，诸如多肽(例如抗体或抗体的生物功能片段)、蛋白质、肽、激素、病毒或病毒样颗粒、核酸或其片段。
基础培养基中可能存在的成分包括氨基酸(氮源)、维生素、无机盐、糖(碳源)、缓冲盐和脂质。用于某些哺乳动物细胞培养系统的基础培养基可能含有乙醇胺、D-葡萄糖、N-[2-羟乙基]-哌嗪-N′-[2-乙磺酸](HEPES)、亚油酸、硫辛酸、酚红、PLURONlC F68、腐胺、丙酮酸钠。
培养基中可能包含的氨基酸成分包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和它们的衍生物。这些氨基酸可以商购获得，例如从Sigma(Saint Louis,Missouri)。
培养基中可能包括的维生素成分包括生物素、氯化胆碱、D-Ca2+-泛酸盐、叶酸、异肌醇、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素和维生素B12。这些维生素商购获得，例如从Sigma(Saint Louis,Missouri)。
可用于培养基的无机盐成分包括一种或多种钙盐(例如CaCl2)、Fe(NO3)3、KCl、一种或多种镁盐(例如MgCl2和/或MgSO4)、一种或多种锰盐(例如MnCl2)、NaCl、NaHCO3、N2HPO4和痕量元素硒、钒、锌和铜的离子。这些痕量元素可以以多种形式提供，优选以盐的形式，诸如Na2SeO3、NH4VO3、ZnSO4和CuSO4。这些无机盐和痕量元素可以商购获得，例如从Sigma(Saint Louis,Missouri)。
可用于哺乳动物培养的示例性培养基包括市售培养基诸如Ham's F10(Sigma)、基本必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科改良伊格尔培养基((DMEM)，Sigma)，其适用于培养宿主细胞。此外，在Ham和Wallace(1979),Meth.in Enz.58:44；Barnes和Sato(1980),Anal.Biochem.102:255；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；美国专利号Re.30,985；或美国专利号5,122,469中描述的培养基中的任一者(所有这些的公开内容通过引用并入本文)可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GentamycinTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。也能以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件诸如温度、pH值等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，对于普通技术人员而言是显而易见的。示例性的培养条件提供于以下中：M.Takagi and K.Ueda,“Comparison of the optimal cultureconditions for cell growth and tissue plasminogen activator production byhuman embryo lung cells on microcarriers”,Biotechnology,(1994),41,565-570；H.J.Morton,“A survey of commercially available tissue culture media”,In Vitro(1970),6(2),89-108；J.Van der Valk等人,(2010),“Optimization of chemicallydefined cell culture media–replacing fetal bovine serum in mammalian in vitromethods,”Toxicology in vitro,24(4),1053-1063；R.J.Graham等人.,“Consequences oftrace metal variability and supplementation on Chinese hamster ovary(CHO)cellculture performance:A review of key mechanisms and considerations”,BIotechnol.Bioeng.(2019),116(12),3446-3456；S.Janoschek等人,A protocol totransfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode:The benefit ofautomated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-downmodel”,Biotechnol.Prog.,(2019),35(2),e2757；以及M.Kuiper等人,“Repurposing fed-batch media and feeds for highly productive CHO perfusion processes”,Biotechnology Progress,2019年4月15日,https://doi.org/10.1002/btpr.2821；所有这些都通过引用其整体并入本文。
用于培养CHO细胞的示例性培养基可以含有基础培养基组分，诸如基于DMEM/HAMF-12的配制物(对于DMEM和HAM F12培养基的组成，参见American Type CultureCollection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas，第六版，1988年，第346至349页中的培养基配制物)(如美国专利号5122469中所述的培养基配制物特别合适)，改变一些组分诸如氨基酸、盐、糖和维生素的浓度，并且任选地含有甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷；重组人胰岛素、水解蛋白胨，诸如Primatone HS或Primatone RL(英国谢菲尔德)或等效物；细胞保护剂，诸如Pluronic F68或等效的Pluronic多元醇；庆大霉素；和微量元素。
细胞培养物可包含真核细胞，其在表达重组蛋白的Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。重组蛋白可以通过在多种细胞培养条件下培养表达目的产物的细胞来生产。例如，用于大规模或小规模蛋白质生产的细胞培养程序在本公开内容的范围内可能是有用的。在后两种系统中，可以使用包括但不限于流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养、摇瓶培养或搅拌罐生物反应器系统的程序，使用或不使用微载体，并且替代性地以分批、分批进料或连续模式操作。
本公开的细胞培养可以在搅拌罐生物反应器系统中进行并且采用分批进料培养程序。在分批进料培养中，最初将真核宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)和培养基补充至培养皿，并且在培养期间将另外的培养营养物连续或以不连续的增量进料至培养物，在终止培养之前进行或不进行定期的细胞和/或产物收获。供料分批培养可以包括例如半连续供料分批培养，其中周期性地去除全培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基代替。供料分批培养与简单分配培养的区别之处在于，在供料分批培养中，在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应至培养皿。分批进料培养可以进一步与灌流培养区别开来，因为在该过程中不从培养容器中除去上清液(在灌流培养中，细胞通过例如过滤、封装、锚定到微载体等而被限制在培养物中，并且培养基连续或间歇地引入并从培养容器中去除)。
培养的细胞可以根据适用于特定宿主细胞和预期的特定生产计划的任何方案或程序进行增殖。因此，本公开预期了单步或多步培养程序。在单步培养中，将宿主细胞接种到培养环境中，并且在细胞培养的单个生产期内采用本公开的过程。替代性地，设想了一种多阶段培养。在多阶段培养中，细胞可以在多个步骤或时期内培养。例如，细胞可以在第一步或生长期培养中生长，其中将可能从储存中取出的细胞接种到适合促进生长和高生存力的培养基中。通过向宿主细胞培养物中添加新鲜培养基，可以将细胞维持在生长期一段合适的时间。
通常设计分批进料或连续细胞培养条件以增强真核细胞(例如哺乳动物细胞)在细胞培养的生长期内的生长。在生长期，细胞在使生长最大化的条件下生长一段时间。培养条件，诸如温度、pH、溶解氧(dO2)等，是那些与特定宿主一起使用的条件，且对普通技术人员而言将会是显而易见的。通常，使用酸(例如CO2)或碱(例如Na2CO3或NaOH)将pH调节到约6.5与7.5之间的水平。用于培养哺乳动物细胞诸如CHO细胞的合适温度范围为约30℃至38℃，并且合适的dO2为空气饱和度的5％-90％之间。
在特定阶段，细胞可用于接种细胞培养的生产期或步骤。替代性地，如上所述，生产期或步骤可以与接种或生长期或步骤连续。
本公开中描述的培养方法可以进一步包括从细胞培养物例如从细胞培养物的生产期收获产物。在某些实施例中，通过本公开的细胞培养方法生产的产物可以从第三生物反应器例如生产生物反应器中收获。例如，但不限于，所公开的方法可以包括在细胞培养物的生产期完成时收获产物。替代性地或另外地，可以在生产期完成之前收获产物。在某些实施例中，一旦达到特定的细胞密度，就可以从细胞培养物中收获产物。例如，但不限于，细胞密度在收获前可以是约2.0x107个细胞/mL至约5.0x107个细胞/mL。
从细胞培养物中收获或分离产物可以包括离心、过滤、声波分离、絮凝和细胞去除技术中的一种或多种。
目的产物可以从宿主细胞分泌或者可以是膜结合蛋白、胞质蛋白或核蛋白。可溶形式的多肽可以从条件细胞培养基中纯化，并且膜结合形式的多肽可以通过从表达细胞制备总膜级分并用非离子洗涤剂诸如
Figure BDA0004012788070000391
X-100(EMD Biosciences,San Diego,Calif.)提取该膜来纯化。可以通过裂解宿主细胞(例如，通过机械力、超声处理和/或洗涤剂)、通过离心去除细胞膜级分并保留上清液来制备胞质蛋白或核蛋白。
在一个实施例中，本发明提供了组合物，其包含本文所公开的真核细胞系，其中该细胞系的细胞在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变，以及本文公开的细胞培养基。
另一个实施例提供了包括细胞培养基和多个真核细胞的细胞培养物，其中多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。电池可具有如本文所公开的进一步特征。细胞培养基可如本文所公开进一步定义。
5.5生产方法
在某些实施例中，本公开提供了用于生产重组多肽的方法。在某些实施了中，该方法包括在适合于生产多肽的条件下培养真核细胞系。在某些实施例中，细胞系包括：(a)Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变；(b)编码重组多肽的多核苷酸。
可以将编码多肽的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞系的细胞的细胞基因组中。此类靶向整合允许将外源核苷酸序列整合在宿主细胞基因组的一个或多个预定位点中。在某些实施例中，靶向整合由识别一个或多个重组识别序列(RRS)的重组酶介导。RRS可以选自由以下项组成的组：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、
Figure BDA0004012788070000401
attP序列和
Figure BDA0004012788070000402
attB序列。靶向整合可以通过同源重组介导。靶向整合可以由外源性位点特异性核酸酶介导，然后是同源定向修复(HDR)和/或非同源末端连接(NHEJ)。根据本公开的靶向整合可以如WO 2019/126634中进一步描述的那样(参见例如WO 2019/126634第5.1、5.2、5.3和5.4节，第42-55页；使用靶向整合制备细胞的方法进一步描述于第55-67页的第6.1和6.2节中)。
可以将编码多肽的多核苷酸随机整合在细胞系的细胞的细胞基因组中。编码多肽的多核苷酸可以是染色体外多核苷酸。可以将编码多肽的多核苷酸整合在细胞系的细胞的染色体中。
重组多肽可以是或包含抗体、抗原、酶或疫苗。重组多肽可以是或包含抗体。重组多肽可以是或包含抗原。重组多肽可以是或包含酶。重组多肽可以是或包括疫苗。抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。抗体可以包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。抗体可以包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。抗体可以包括单克隆抗体。
该方法还可包括分离重组多肽。这种分离通常包括从细胞系中分离重组多肽。分离重组多肽可包括离心、过滤、声波分离、絮凝和细胞去除技术中的一种或多种。可以纯化分离的重组多肽。
细胞系可以是动物细胞系或真菌细胞系。细胞系可以是动物细胞系，例如哺乳动物细胞系。示例性哺乳动物细胞系包括杂交瘤细胞系、CHO细胞系、COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系(包括BHK-21细胞系)或它们的衍生物。细胞系可以是CHO细胞系，例如CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系或CHOK1M细胞系，或它们的衍生物。细胞系可以是真菌细胞系，例如酵母细胞系。
细胞系可以在细胞培养基中培养。细胞培养基和/或细胞培养条件可以如上文标题“细胞培养物”中进一步描述的那样。细胞系可以在分批进料培养条件下或灌流培养条件下培养。可以在分批进料培养条件下培养细胞系。分批进料培养条件可以是强化分批进料培养条件。细胞系可以在灌流培养条件下培养。灌流培养条件可以是半连续灌流。灌流培养条件可以是连续灌流。
细胞系可以在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
在某些实施例中，本公开提供了生产病毒载体的方法。在某些实施例中，该方法包括在适合于生产病毒载体的条件下培养真核细胞系。在某些实施例中，在适合于生产病毒载体的条件下，细胞系包含(a)在Bax基因和Bak基因中的每一者中稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变、(b)病毒基因组，和(c)编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
在某些实施例中，该方法可包括分离病毒载体。在某些实施例中，分离通常包括从细胞系中分离病毒载体。分离病毒载体可包括离心、过滤、声波分离、絮凝和细胞去除技术中的一种或多种。可以纯化分离的病毒载体。
细胞系可以是动物细胞系或真菌细胞系。细胞系可以是动物细胞系，例如哺乳动物细胞系。示例性哺乳动物细胞系包括杂交瘤细胞系、CHO细胞系、COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系(包括BHK-21细胞系)或它们的衍生物。细胞系可以是CHO细胞系，例如CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系或CHOK1M细胞系，或它们的衍生物。细胞系可以是真菌细胞系，例如酵母细胞系。
细胞系可以在细胞培养基中培养。细胞培养基和/或细胞培养条件可以如上文标题“细胞培养物”中进一步描述的那样。细胞系可以在分批进料培养条件下或灌流培养条件下培养。细胞系可以在分批进料培养条件下培养。分批进料培养条件可以是强化分批进料培养条件。可以在灌流培养条件下培养细胞系。灌流培养条件可以是半连续灌流。灌流培养条件可以是连续灌流。
在某些实施例中，细胞系可以在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
在某些实施例中，本公开提供了生产重组多肽的方法，包括如本文所述降低细胞凋亡活性(例如在标题“调节Bax和Bak表达的方法”下)，然后根据本公开的方法生产重组多肽(例如，如上文所公开的)。
5.6产物
本公开的细胞和/或细胞系和/或方法可用于生产可由本文所公开的细胞表达的任何目的产物。本公开的细胞和/或细胞系和/或方法可用于生产多肽，例如，哺乳动物多肽。此类多肽的非限制性实例包括激素、受体、融合蛋白(包括抗体融合蛋白，例如抗体-细胞因子融合蛋白)、调节因子、生长因子、补体系统因子、酶、凝血因子、抗凝血因子、激酶、细胞因子、CD蛋白、白介素、治疗性蛋白质、诊断蛋白质和抗体。本公开的细胞和/或细胞系和/或方法对正在生产的分子(例如，抗体)通常不具有特异性。
本公开的方法可用于抗体的生产，包括治疗性和诊断性抗体或其抗原结合片段。通过本公开的细胞、细胞系和/或方法生产的抗体可以是但不限于单特异性抗体(例如，包含单个重链序列和单个轻链序列的抗体，包括此类配对的多聚体)、多特异性抗体及其抗原结合片段。例如，但不限于，多特异性抗体可以是双特异性抗体、双表位抗体、T细胞依赖性双特异性抗体(TDB)、双重作用FAb(DAF)或其抗原结合片段。
多特异性抗体
抗体可以是多特异性抗体，例如双特异性抗体。“多特异性抗体”为单克隆抗体，其对于至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位)具有结合特异性(即，双特异性的)或对于相同抗原上的不同表位具有结合特异性(即，双表位的)。多特异性抗体可具有三种或更多种结合特异性。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段，如本文所述。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，美国专利4676980，以及Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用用于避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他非限制性示例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双作用Fab”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中有结构域互换，即通过交换VH/VL结构域(参见例如，WO 2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如，WO2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。多特异性抗体可包括cross-Fab片段。术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)组成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO2016/172485。
多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol.Immunol.67(2015)95-106)。
本文还包括的一种特定类型的多特异性抗体是这样的双特异性抗体，该双特异性抗体设计用于同时结合靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的活化不变组分(诸如CD3)，以用于再靶向T细胞以杀伤靶细胞。
可用于此目标的双特异性抗体形式的其他非限制性示例包括但不限于所谓的“BiTE”(双特异性T细胞接合子)分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合(参见，例如，WO2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261和WO 2008/119567；Nagorsen和
Figure BDA0004012788070000441
Exp Cell Res 317,1255-1260(2011))；双体抗体(Holliger等人，Prot.Eng.9,299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双体抗体(“TandAb”；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41-56(1999))；“DART”(双重亲和力再靶向)分子，其基于双体抗体形式但特征是具有用于实现额外稳定化的C末端二硫桥(Johnson等人，J Mol Biol 399,436-449(2010))，以及所谓的三功能抗体(triomab)，其是全杂交小鼠/大鼠IgG分子(综述于Seimetz等人,CancerTreat.Rev.36,458-467(2010)中)。本文所包含的特定的T细胞双特异性抗体形式描述于以下文献中：WO 2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
抗体片段
由本文提供的细胞和/或细胞系和/或方法产生的抗体可以是抗体片段。例如，但不限于，抗体片段可以为Fab'、Fab'-SH或F(ab')2片段，特别是Fab片段。木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自包含重链可变结构域和轻链可变结构域(分别为VH和VL)以及轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，术语“Fab片段”是指包括VL结构域和CL结构域的轻链以及包括VH结构域和CH1结构域的重链片段的抗体片段。“Fab'片段”与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在CH1结构域的羧基端添加残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是Fab'片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。对于包括挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5869046。
抗体片段可以是双体抗体、三体抗体或四体抗体。“双体抗体”为具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。
抗体片段可以是单链Fab片段。“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中抗体结构域和接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL。特别地，所述接头可以是至少30个氨基酸，优选地在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab片段可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如，根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
抗体片段可以是单链可变片段(scFv)。“单链可变片段”或“scFv”是抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白，是通过接头连接的。特别地，接头可以为10个至25个氨基酸的短多肽，并且通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并且引入了接头，但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag,New York)，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。
抗体片段可以是单结构域抗体。“单结构域抗体”是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者抗体的全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。单结构域抗体可以是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6248516B1)。
在某些方面，通过本文所提供的细胞和方法产生的抗体融合蛋白为抗体-细胞因子融合蛋白。虽然此类抗体-细胞因子融合蛋白可包括全长抗体，但在某些实施例中，抗体-细胞因子融合蛋白的抗体是抗体片段，例如单链可变片段(scFv)、双抗体、aFab片段，或小免疫蛋白(SIP)。在某些实施例中，细胞因子可以融合到抗体的N末端或C末端。在某些实施例中，抗体-细胞因子融合蛋白的细胞因子包含多个亚基。在某些实施例中，细胞因子的亚基是相同的(同源的)。在某些实施例中，细胞因子的亚基是不同的(异源的)。在某些实施例中，细胞因子的亚基与同一抗体融合。在某些实施例中，细胞因子的亚基与不同的抗体融合。有关抗体-细胞因子融合蛋白的概述，参见例如，Murer等人，N Biotechnol.,52:42–53(2019)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化。
嵌合抗体和人源化抗体
由本文提供的细胞和/或细胞系和/或方法产生的抗体可以是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于，例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
嵌合抗体可以是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在某些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲合力。
人源化抗体及制备它们的方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重修”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述用于FR改组的“指导选择”方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
人抗体
由本文提供的细胞和/或细胞系和/或方法产生的抗体可以是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6075181和6150584；描述
Figure BDA0004012788070000481
技术的美国专利号5770429；描述K-M
Figure BDA0004012788070000482
技术的美国专利号7041870，以及描述
Figure BDA0004012788070000483
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。可以进一步修饰(例如通过与不同的人恒定区组合)来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
靶分子
可通过本文公开的细胞和方法生产的抗体靶向的分子的非限制性示例包括可溶性血清蛋白及其受体和其他膜结合蛋白(例如，粘附素)。在某些实施例中，通过本文所公开的细胞和方法生产的抗体能够结合至选自由以下项组成的组的一种、两种或更多种细胞因子、细胞因子相关蛋白和细胞因子受体：8MPI、8MP2、8MP38(GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF1 0、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1(EPSELON)、FEL1(ZETA)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL1 0、IL 11、IL 12A、IL 12B、IL 13、IL 14、IL 15、IL 16、IL 17、IL17B、IL 18、IL 19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN和THPO。
通过本文所公开的细胞和方法生产的抗体可以结合至选自由以下项组成的组的细胞因子、细胞因子受体或细胞因子相关蛋白：CCLI(1-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Iα)、CCL4(MIP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL 13(MCP-4)、CCL 15(MIP-Iδ)、CCL 16(HCC-4)、CCL 17(TARC)、CCL 18(PARC)、CCL 19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL 10(IP 10)、CXCL 11(1-TAC)、CXCL 12(SDFI)、CXCL 13、CXCL 14、CXCL 16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL 1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Iβ)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCRI(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRB IRA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Rα)、IL8RB(IL8Rβ)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
在某些实例中，通过本文所公开的方法生产的抗体(例如，多特异性抗体诸如双特异性抗体)能够结合至选自以下的一种或多种靶分子：0772P(CA125，MUC16)(即卵巢癌抗原)，ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；β淀粉样蛋白；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；ASLG659；ASPHD1(含有1的天冬氨酸β-羟化酶结构域；LOC253982)；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI(MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型)；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；短蛋白聚糖；C19或f10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(1-309)；CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP1δ)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3β)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3α)；CCL21(MTP-2)；SLC；exodus-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子-2)；CCL25((TECK)；CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MTP-Iα)；CCL4(MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKRI/HM145)；CCR2(mcp-IRβ/RA)；CCR3(CKR/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKBR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A(CD79α，免疫球蛋白相关α，B细胞特异性蛋白)；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(E-钙粘蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B(p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(密封蛋白-7)；CLL-1(CLEC12A、MICL和DCAL2)；CLN3；CLU(丛生蛋白)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL 18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；补体因子D；CR2；CRP；CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎瘤衍生生长因子)；CSFI(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYDI)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，G蛋白偶联受体)；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E16(LAT1，SLC7A5)；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EphB2R；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；ETBR(内皮素B型受体)；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FcRH1(Fc受体样蛋白1)；FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含磷酸酶锚蛋白1a的SH2结构域)、SPAP1B、SPAP1C)；FGF；FGF1(αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FELl(EPSILON)；FILl(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABAP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；GEDA；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2(CCR10)；GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；GPR31；GPR44；GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；GPR81(FKSG80)；GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GRCCIO(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DOB(MHC II类分子(Ia抗原)的β亚基)；HLA-DRA；HM74；HMOXI；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-α；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-1；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2，ILIRN；IL2；IL20；IL20Rα；IL21 R；IL22；IL-22c；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；甲型流感；乙型流感；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整合素)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整合素)；α4β7和αEβ7整合素异二聚体；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GC方框BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6(头发特异性H型角蛋白)；LAMAS(瘦素)；LGR5(富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49，GPR67)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，位点E；Ly67，RIG-E，SCA-2，TSA-1)；Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，位点G6D；Ly6-D，MEGT1)；LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，位点K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；MACMARCKS；MAG或OMgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MDP；MIB1；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素)；MS4A1；MSG783(RNF124，假设蛋白FLJ20315)；MSMB；MT3(金属硫蛋白-111)；MTSS1；MUC1(粘蛋白)；MYC；MY088；Napi3b(也称为NaPi2b)(NAPI-3B、NPTIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)、成员2、II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；NCA；NCK2；神经蛋白聚糖；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；OX40；P2RX7；P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-L1；PD-L2；PD-1；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸酶蛋白聚糖；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；PPBP(CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA hlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA 2700050C12，RIKENcDNA2700050C12基因)；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21-Rac2)；RARB；RET(RET原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂素B)；SCGB2A1(乳房珠蛋白2)；SCGB2A2(乳房珠蛋白1)；SCYEI(内皮单核细胞激活细胞因子)；SDF2；Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG、脑信号蛋白5b Hlog、sema结构域、七个血小板反应蛋白重复序列(1型和1型样)、跨膜结构域(TM)和短胞质结构域(脑信号蛋白)5B)；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5(丝抑蛋白)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B(Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP(前列腺六段跨膜上皮抗原)；STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关性蛋白1、前列腺的六段跨膜上皮抗原2、六段跨膜前列腺蛋白)；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TENB2(假定跨膜蛋白聚糖)；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI(血小板反应蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TMP3；组织因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TMEFF1(具有EGF样和两个卵泡抑制素样结构域1的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；TMEM46(shisa同系物2)；TNF；TNF-a；TNFAEP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(AP03L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSFS(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；Toll样受体；TOP2A(拓扑异构酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道、亚家族M、成员4)；TRPC6；TSLP；TWEAK；酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；VEGF；VEGFB；VEGFC；多功能蛋白聚糖；VHL C5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCRI(GPR5/CCXCRI)；YY1；和ZFPM2。
在某些实例中，通过本文所公开的方法产生的抗体能够与CD蛋白质结合，诸如CD3、CD4、CD5、CD16、CD19、CD20、CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/爱泼斯坦巴尔病毒受体)或Hs.73792)；CD33；CD34；CD64；CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)；CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关β)、B29)；ErbB受体家族的CD200成员，诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整合素和αv/β3整合素，包括其α亚基或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，诸如VEGF-A、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰素(αIFN)；TNFα、白介素，诸如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL 17AF、IL-1S、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F蛋白、蛋白C等。
在某些实例中，本文所提供的细胞系和方法可用于生产抗体(或多特异性抗体，诸如双特异性抗体)，该抗体特异性地结合至补体蛋白C5(例如，特异性地结合至人C5的抗C5激动剂抗体)。抗C5抗体可以包含1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含SSYYMA(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含AIFTGSGAEYKAEWAKG(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含DAGYDYPTHAMHY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含RASQGISSSLA(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含GASETES(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含QNTKVGSSYGNT(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列。例如，抗C5抗体可以包含重链可变结构域(VH)序列，该序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含SSYYMA(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含AIFTGSGAEYKAEWAKG(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含DAGYDYPTHAMHY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(d)轻链可变区CDR1，其包含RASQGISSSLA(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含GASETES(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含QNTKVGSSYGNT(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列。上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的序列在US 2016/0176954中分别公开为SEQ ID NO:117、SEQID NO:118、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:125。(参见US2016/0176954中的表7和表8。)
在某些实例中，抗C5抗体包含分别为以下的VH和VL序列QVQLVESGGG LVQPGRSLRLSCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPVDTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSS(SEQ ID NO:31)和DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCRASQGIS SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQNTKVGSSYGNT FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:32)，包括这些序列的翻译后修饰。上述VH和VL序列在US 2016/0176954中分别公开为SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:111。(参见US 2016/0176954中的表7和表8。)抗C5抗体可以是305L015(参见US 2016/0176954)。
在某些实例中，通过本文所公开的方法生产的抗体能够结合至OX40(例如，特异性地结合至人OX40的抗OX40激动剂抗体)。抗OX40抗体可以包含1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含DSYMS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含DMYPDNGDSSYNQKFRE(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含APRWYFSV(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含RASQDISNYLN(SEQ IDNO:5)的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含YTSRLRS(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含QQGHTLPPT(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。例如，抗OX40抗体可以包含重链可变结构域(VH)序列，该序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含DSYMS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含DMYPDNGDSSYNQKFRE(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；和(c)重链可变区CDR3，其包含APRWYFSV(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)轻链可变区CDR1，其包含RASQDISNYLN(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；(b)轻链可变区CDR2，其包含YTSRLRS(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列；和(c)轻链可变区CDR3，其包含QQGHTLPPT(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。抗OX40抗体可以分别包括以下VH和VL序列EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DSYMSWVRQA PGQGLEWIGD MYPDNGDSSYNQKFRERVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCVLAP RWYFSVWGQG TLVTVSS(SEQ ID NO:8)和DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQ GHTLPPTFGQ GTKVEIK(SEQ ID NO:9)，包括这些序列的翻译后修饰。
在某些实例中，抗OX40抗体包含1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含NYLIE(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含VINPGSGDTYYSEKFKG(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含DRLDY(SEQID NO:12)的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含HASQDISSYIV(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含HGTNLED(SEQ ID NO:14)；的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含VHYAQFPYT(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。例如，抗OX40抗体可以包含重链可变结构域(VH)序列，该序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含NYLIE(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含VINPGSGDTYYSEKFKG(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列；和(c)重链可变区CDR3，其包含DRLDY(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)轻链可变区CDR1，其包含HASQDISSYIV(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(b)轻链可变区CDR2，其包含HGTNLED(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；和(c)轻链可变区CDR3，其包含VHYAQFPYT(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。抗OX40抗体可以分别包括以下VH和VL序列EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYAFT NYLIEWVRQA PGQGLEWIGV INPGSGDTYYSEKFKGRVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARDR LDYWGQGTLV TVSS(SEQ ID NO:16)和DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCHASQDIS SYIVWYQQKP GKAPKLLIYH GTNLEDGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCVH YAQFPYTFGQ GTKVEIK(SEQ ID NO:17)，包括这些序列的翻译后修饰。
WO 2015/153513中提供了有关抗OX40抗体的进一步细节，其全文以引用方式并入本文。
在某些实例中，通过本文所提供的细胞和方法生产的抗体能够结合至乙型流感病毒血凝素，即“fluB”(例如，在体外和/或体内结合来自Yamagata谱系的乙型流感病毒的血凝素、结合来自Victoria谱系的乙型流感病毒的血凝素或结合来自Yamagata谱系、Victoria谱系和祖先谱系的乙型流感病毒的血凝素的抗体)。WO 2015/148806中描述了有关抗FluB抗体的进一步细节，其全文以引用方式并入本文。
在某些实例中，通过本文所提供的细胞和方法生产的抗体能够结合至低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1或LRP-8或转铁蛋白受体，以及选自由以下项组成的组的至少一种靶标：β-分泌酶(BACE1或BACE2)、α-分泌酶、γ-分泌酶、τ-分泌酶、淀粉样前体蛋白(APP)、死亡受体6(DR6)、淀粉样蛋白β肽、α-突触核蛋白、帕金蛋白、亨廷顿蛋白、p75 NTR、CD40和半胱天冬酶-6。
在某些实例中，通过本文所提供的细胞和方法生产的抗体为抗CD40的人IgG2抗体。在某些实例中，抗CD40抗体为RG7876。
在某些实例中，本公开的细胞、细胞系和/或方法可用于生产多肽。该多肽可以是靶向的免疫细胞因子。靶向的免疫细胞因子可以是CEA-IL2v免疫细胞因子，例如CEA-IL2v免疫细胞因子RG7813。靶向的免疫细胞因子可以是FAP-IL2v免疫细胞因子，例如FAP-IL2v免疫细胞因子是RG7461。
在某些实例中，通过本文所提供的细胞、细胞系和/或方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)能够结合至CEA和至少一种额外的靶分子。根据本文所提供的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)能够结合至肿瘤靶向的细胞因子和至少一种额外的靶分子。根据本文所提供的方法产生的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)可以融合至IL2v(即，白介素2变体)并且结合基于IL1的免疫细胞因子和至少一种额外的靶分子。在实例中，根据本文所提供的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为T细胞双特异性抗体(即，双特异性T细胞接合子或BiTE)。
在某些实例中，根据本文所提供的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)能够结合至选自以下的至少两种靶分子：IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-1S；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-1β；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-～；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK、IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAMS、IL-13和PED2、IL17A和IL17F、CEA和CD3、CD3和CD19、CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3S和CD13S；CD3S和CD20；CD3S和CD40；CD40和CD20；CD-S和IL-6；CD20和BR3、TNFα和TGF-β、TNFα和IL-1β；TNFα和IL-2、TNFα和IL-3、TNFα和IL-4、TNFα和IL-5、TNFα和IL6、TNFα和IL8、TNFα和IL-9、TNFα和IL-10、TNFα和IL-11、TNFα和IL-12、TNFα和IL-13、TNFα和IL-14、TNFα和IL-15、TNFα和IL-16、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-19、TNFα和IL-20、TNFα和IL-23、TNFα和IFNα、TNFα和CD4、TNFα和VEGF、TNFα和MIF、TNFα和ICAM-1、TNFα和PGE4、TNFα和PEG2、TNFα和RANK配体、TNFα和Te38、TNFα和BAFF、TNFα和CD22、TNFα和CTLA-4、TNFα和GP130、TNF a和IL-12p40、VEGF和血管生成素、VEGF和HER2、VEGF-A和HER2、VEGF-A和PDGF、HER1和HER2、VEGFA和ANG2、VEGF-A和VEGF-C、VEGF-C和VEGF-D、HER2和DR5、VEGF和IL-8、VEGF和MET、VEGFR和MET受体、EGFR和MET、VEGFR和EGFR、HER2和CD64、HER2和CD3、HER2和CD16、HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2、EGFR和HER3、EGFR和HER4、IL-14和IL-13、IL-13和CD40L、IL4和CD40L、TNFR1和IL-1R、TNFR1和IL-6R和TNFR1和IL-18R、EpCAM和CD3、MAPG和CD28、EGFR和CD64、CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTN02；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGMA；POL-l和CTLA-4；以及RGM A和RGM B。
在某些实例中，根据本文所提供的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为抗CEA/抗CD3双特异性抗体。抗CEA/抗CD3双特异性抗体为RG7802。在某些实施例中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含以下提供的SEQ ID NO:18至21中列出的氨基酸序列：
Figure BDA0004012788070000611
Figure BDA0004012788070000621
WO 2014/121712中提供了有关抗CEA/抗CD3双特异性抗体的进一步细节，其全文以引用方式并入本文。
在某些实例中，通过本文所公开的细胞和方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体。在某些实例中，抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体为Crossmab。在某些实例中，抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体为RG7716。在某些实例中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包括以下提供的SEQ ID NO:22-25中列出的氨基酸序列：
Figure BDA0004012788070000622
Figure BDA0004012788070000631
在某些实例中，通过本文所公开的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体。抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体可以为RG7221。抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体可以具有CAS编号1448221-05-3。
任选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段可以用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体、其片段(例如，受体的细胞外结构域)可以用作免疫原。替代地，可以将表达跨膜分子的细胞用作免疫原。这样的细胞可以来源于天然来源(例如癌细胞系)或者可以是已经通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。可用于制备抗体的其他抗原及其形式对于本领域技术人员将是显而易见的。
在某些实例中，通过本文所公开的细胞、细胞系和/或方法生产的多肽(例如，抗体)能够结合至、可以进一步缀合至化学分子诸如染料或细胞毒性剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。包括使用本文所述方法生产的抗体或双特异性抗体的免疫缀合物可含有缀合至重链中仅一条或轻链中仅一条的恒定区的细胞毒性剂。
抗体变体
考虑了本文提供的抗体的变体。例如，可能期望改变抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
取代、插入和删除性变体
例如，提供了具有一或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的感兴趣的位点包括CDR和FR。保守性取代的实例在表1中的“优选取代”标题下示出。更多实质性改变的实例在表1的“示例性取代”标题下提供，并且在下文参考氨基酸侧链类别中进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并筛选所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)的产物。
表1：氨基酸取代
Figure BDA0004012788070000641
Figure BDA0004012788070000651
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；和
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代通常需要将这些类别中的一类的成员取代另一类别的成员。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高可变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲合力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些的基于噬菌体展示的亲合力成熟技术方便地产生。简要地说，对一个或多个CDR残基进行突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可在CDR中作出改变(例如，取代)，例如，以改善抗体亲合力。此类改变可以发生于CDR“热点”中，即由体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或与抗原接触的残基(检测所得变体VH或VL的结合亲合力)。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的某些方面，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任何一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定向方法，其中将若干CDR残基(例如，每次4至6个残基)随机化。参与抗原结合的CDR残基可以例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴定。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲合力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。这样的改变可以例如在CDR中的抗原接触残基的外部。在上文提供的某些变体VH和VL序列中，每个CDR要么保持不变，要么包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。替代性地或另外地，可以使用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。。此类接触残基和邻近残基可作为替代候选物被靶向或消除。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT(抗体定向酶前药治疗))或多肽融合。
糖基化变体
在某些实例中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，与其相连的寡糖可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的、双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键结连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实例中，可对本公开的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一些实例中，提供了具有非岩藻糖基化的寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)连接在Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这样的非岩藻糖基化的寡糖(也称为“去岩藻糖基化”的寡糖)特别是N-连接的寡糖，其缺少在双触角寡糖结构的茎中连接第一GlcNAc的岩藻糖残基。在实例中，提供了与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比，如例如WO 2006/082515中所述，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，是缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量，相对于与Asn 297连接的所有寡糖(例如复合、杂合和高甘露糖结构)之和。Asn297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于位置297上游或下游大约±3个氨基酸，即在位置294与300之间。在Fc区中具有非岩藻糖基化寡糖比例增加的此类抗体可具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108和US 2004/0093621。
能够产生岩藻糖基化减少的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实例11中)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)，或具有降低或取消的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白的活性的细胞(参见，例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在进一步的实例中，抗体变体提供了二等分的寡糖，例如，其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。如上所述，这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如Umana等人,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540,WO 2003/011878。
还提供了在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
Fc区变体
在某些实例中，一个或多个氨基酸修饰可以引入本文提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包括人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包括氨基酸修饰(例如取代)。
本公开考虑具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使其成为其中抗体的体内半衰期很重要而某些效应子功能(诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))不必要或有害的应用的理想候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet，《免疫学年评》(Annu.Rev.Immunol.)9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性示例描述于美国专利号5500362(参见，例如，Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。替代性地，可使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0004012788070000691
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地，或另外地，可例如在诸如在Clynes等人Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目标分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人.,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929 A1)。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸位置中的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实例中，抗体变体包括具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的298、333和/或334位处的取代(残基的EU编号)。
在某些实例中，抗体变体包含具有一个或多个减少FcγR结合的氨基酸取代的Fc区，例如Fc区的234位和235位的取代(残基的EU编号)。一方面，取代是L234A和L235A(LALA)。抗体变体可以进一步包括在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中的D265A和/或P329G。在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和P329G(LALA-PG)。(参见例如WO 2012/130831)。在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和D265A(LALA-DA)。
在一些实例中，例如，如美国专利号6194551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述，在Fc区中进行改变，导致改变(即，改善或减少)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
具有延长的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合(其负责将母体IgG转移至胎儿)(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117:587(1976)，以及Kim,J.K.等人,J.Immunol.24:249(1994))的抗体描述于US2005/0014934(Hinton等人)中。那些抗体包含这样的Fc区，所述Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(参见，例如美国专利号7371826；Dall'Acqua,W.F.等人.J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。
通过定点诱变已经鉴定了对小鼠Fc-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc区残基(参见例如Dall’Acqua,W.F.等人.J.Immunol 169(2002)5171-5180)。相互作用涉及残基I253、H310、H433、N434和H435(EU索引编号)(Medesan,C.等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533；Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993；Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.24(1994)542)。发现残基I253、H310和H435对于人Fc与鼠FcRn的相互作用至关重要(Kim,J.K.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819)。对人Fc-人FcRn复合物的研究已表明，残基I253、S254、H435和Y436对于该相互作用至关重要(Firan,M.等人，Int.Immunol.13(2001)993；Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung,Y.A.等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中已经报道并且检查了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。
在某些实例中，抗体变体包括具有一个或多个减少FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的253、和/或310和/或435位的取代(残基的EU编号)。在某些实例中，抗体变体包括在位置253、310和435处具有氨基酸取代的Fc区。在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代可以是I253A、H310A和H435A。参见，例如Grevys,A.等人,J.Immunol.194(2015)5497-5508。
在某些实例中，抗体变体包括具有一个或多个减少FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的位置310、和/或433和/或436处的取代(残基的EU编号)。在某些实例中，抗体变体包括在位置310、433和436处具有氨基酸取代的Fc区。在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代可以是H310A、H433A和Y436A。(参见例如WO 2014/177460 A1)。
在某些实例中，抗体变体包含具有一个或多个增加FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的位置252、和/或254和/或256处的取代(残基的EU编号)。在某些实例中，抗体变体包括在位置252、254和256处具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是M252Y、S254T和T256E。也参见Duncan&Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351关于Fc区变体的其它实例。
如本文报道的抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的实例中，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含包括C末端CH3结构域的重链的抗体，包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，氨基酸位置的EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个方面中，如本文所指定的包含包括C末端CH3结构域的重链的抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，氨基酸位置的EU索引编号)。
半胱氨酸工程抗体变体
在某些实例中，可能需要产生半胱氨酸工程化改造的抗体，例如THIOMABTM抗体，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体实例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点处。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可及位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。半胱氨酸工程化改造的抗体可以如例如在美国专利号7521541、830930、7855275、9000130或WO 2016040856中所述产生。
抗体衍生物
在某些实例中，本文提供的抗体可以经进一步修饰以包括本领域已知且容易得到的额外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了超过一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
免疫缀合物
本公开还提供了包括本文所公开的抗体的免疫缀合物，该抗体与一种或多种治疗剂如细胞毒性剂、化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素缀合(化学键合)。
在一些实例中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至上述一种或多种治疗剂。通常使用接头将抗体连接至一种或多种治疗剂。Pharmacol Review 68:3-19(2016)中列出了ADC技术的概述，其包括治疗剂、药物和接头的实例。
在另一种情况下，免疫缀合物包括与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-次黄嘌呤、油桐蛋白、石竹蛋白(dianthin protein)、美洲商陆蛋白(Phytolaca americana protein)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、明胶、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
在其他实例中，免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包括用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，《科学》(Science)238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO 94/11026。接头可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可以使用对酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、对光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人,CancerRes.52:127-131(1992)；美国专利号5208020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
5.7示例性非限制性实施例
A.在某些实施例中，本公开内容涉及分离的真核细胞系，其中该细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。
A1.在某些实施例中，本公开内容涉及A所述的的细胞系，其中该细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
A2.在某些实施例中，本发明涉及A或A1所述的的细胞系，其中该细胞系是动物细胞系或真菌细胞系。
A3.在某些实施例中，本公开内容涉及A2所述的的细胞系，其中动物细胞系是哺乳动物细胞系。
A4.在某些实施例中，本公开涉及A3所述的细胞系，其中哺乳动物细胞系是COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系或CHO细胞系，或它们的衍生物。
A5.在某些实施例中，本公开涉及A4所述的细胞系，其中CHO细胞系是CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系，或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。
A6.在某些实施例中，本公开内容涉及A-A5中任一项所述的细胞系，其中该细胞系包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的缺失。
A7.在某些实施例中，本公开涉及A-A6中任一项所述的细胞系，其中该细胞系进一步包括病毒基因组和编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
A8.在某些实施例中，本公开内容涉及A-A7所述的细胞系，其中该细胞系进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
A9.在某些实施例中，本公开内容涉及A8所述的细胞系，其中将编码目的产物的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞系的细胞基因组中。
A10.在某些实施例中，本公开内容涉及A8所述的细胞系，其中将编码目的产物的多核苷酸随机整合在细胞系的细胞基因组中。
A11.在某些实施例中，本公开内容涉及A8-A10中任一项所述的细胞系，其中编码目的产物的多核苷酸是染色体外多核苷酸。
A12.在某些实施例中，本公开内容涉及A8-A10中任一项所述的细胞系，其中将编码目的产物的多核苷酸整合在细胞系的染色体中。
A13.在某些实施例中，本公开内容涉及A8-A10中任一项所述的细胞系，其中目的产物包括重组多肽。
A14.在某些实施例中，本公开内容涉及A8-A13中任一项所述的细胞系，其中目的产物包括抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。
A15.在某些实施例中，本公开内容涉及A14所述的细胞系，其中抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。
A16.在某些实施例中，本发明涉及A14或A15所述的细胞系，其中抗体包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。
A17.在某些实施例中，本发明涉及A14-A16任一项所述的细胞系，其中抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
A18.在某些实施例中，本公开内容涉及A14-A17中任一项所述的细胞系，其中抗体包括单克隆抗体。
A19.在某些实施例中，本公开涉及A6-A18中任一项所述的细胞系，其中该细胞系具有比相应的分离的真核细胞系更高的比生产率，该真核细胞系包括野生型Bax基因和Bak基因中的每一者中的多核苷酸和功能性拷贝。
A20.在某些实施例中，本公开内容涉及A-A19中任一项所述的细胞系，其中与包含Bax基因和Bak基因中的每一者的功能拷贝的对应的分离的真核细胞系相比，该细胞系对细胞凋亡更具抗性。
A21.在某些实施例中，本公开内容涉及A-A20中任一项所述的细胞系，其中该细胞系用于细胞培养过程，例如分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流。
A22.在某些实施例中，本公开内容涉及A21所述的细胞系，其中该细胞系用于强化灌流过程。
A23.在某些实施例中，本公开内容涉及包括根据A-A22中任一项所述的真核细胞系的组合物。
A24.在某些实施例中，本公开内容涉及A23所述的组合物，其进一步包括细胞培养基。
B.在某些实施例中，本公开涉及包括细胞培养基和多个真核细胞的细胞培养物，其中多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。
B1.在某些实施例中，本公开内容涉及B所述的细胞培养物，其中每个细胞在Bax基因和Bak基因中的每一者中包括稳定整合的功能丧失突变。
B2.在某些实施例中，本公开内容涉及B或B1所述的细胞培养物，其中多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的缺失。
B3.在某些实施例中，本公开内容涉及B-B2中任一项所述的细胞培养物，其中该细胞是动物细胞或真菌细胞。
B4.在某些实施例中，本公开内容涉及B3所述的细胞培养物，其中动物细胞是哺乳动物细胞。
B5.在某些实施例中，本发明涉及B4所述的细胞培养物，其中哺乳动物细胞为COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、Ml细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、BHK细胞或CHO细胞，或它们的衍生物。
B6.在某些实施例中，本公开涉及B5所述的细胞培养物，其中CHO细胞是CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、DG44细胞、DUKXB-11细胞、CHOK1S细胞或CHO K1M细胞，或它们的衍生物。
B7.在某些实施例中，本公开内容涉及B-B6中任一项所述的细胞培养物，其中该细胞培养物进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
B8.在某些实施例中，本公开内容涉及B7所述的细胞培养物，其中将编码目的产物的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞的细胞基因组中。
B9.在某些实施例中，本公开内容涉及B7所述的细胞培养物，其中将编码目的产物的多核苷酸随机整合在细胞的细胞基因组中。
B10.在某些实施例中，本公开内容涉及B7-B9中任一项所述的细胞培养物，其中编码目的产物的多核苷酸是染色体外多核苷酸。
B11.在某些实施例中，本公开内容涉及B7-B9中任一项所述的细胞培养物，其中将编码目的产物的多核苷酸整合在细胞的染色体中。
B12.在某些实施例中，本公开内容涉及B7-B11中任一项所述的细胞培养物，其中目的产物包括重组多肽。
B13.在某些实施例中，本公开涉及B7-B12中任一项所述的细胞培养物，其中目的产物是抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。
B14.在某些实施例中，本公开内容涉及B13所述的细胞培养物，其中抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。
B15.在某些实施例中，本公开内容涉及B13或B14所述的细胞培养物，其中抗体包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。
B16.在某些实施例中，本发明涉及B13-B15中任一项所述的细胞培养物，其中抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
B17.在某些实施例中，本公开内容涉及B13-B16中任一项所述的细胞培养物，其中抗体包括单克隆抗体。
B18.在某些实施例中，本公开内容涉及B-B17中任一项所述的细胞培养物，其中细胞中的每一个进一步包含重组多核苷酸。
B19.在某些实施例中，本公开内容涉及B-B18的细胞培养物，其中细胞用于细胞培养过程，例如分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流。
B20.在某些实施例中，本公开内容涉及B19所述的细胞培养物，其中细胞用于强化灌流过程。
C.在某些实施例中，本公开涉及降低真核细胞凋亡活性的方法，该方法包括向细胞施用基因工程系统，其中基因工程系统：a)敲低或敲除Bax多肽同种型的表达；和b)敲低或敲除Bak多肽同种型的表达。
C1.在某些实施例中，本公开涉及C所述的方法，其中该方法进一步包括将真核细胞用于分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流细胞培养过程中。
C2.在某些实施例中，本公开涉及C1所述的方法，其中真核细胞用于强化细胞培养过程。
C3.在某些实施例中，本公开涉及C-C2所述的方法，其中基因工程系统选自由以下项组成的组：CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统及它们的组合。
C4.在某些实施例中，本公开涉及C-C3中任一项所述的方法，其中基因工程系统为或包括CRISPR/Cas9系统。
C5.在某些实施例中，本公开内容涉及C4所述的方法，其中CRISPR/Cas9系统包含：a)Cas9分子，b)至少一个第一指导RNA(gRNA)，其包含与Bax基因中的靶序列互补的靶向序列，和c)至少一个第二gRNA，其包含与Bak基因中的靶序列互补的靶向序列。
C6.在某些实施例中，本公开涉及C5所述的方法，其中靶序列中的至少一个为Bax基因的一部分，且/或其中靶序列中的至少一个为Bak基因的一部分。
C7.在某些实施例中，本发明涉及C-C6中任一项所述的方法，其中Bax多肽的表达和/或Bak多肽的表达被敲除，并且与参考细胞的细胞凋亡活性相比，该细胞的细胞凋亡活性是降低的。
C8.在某些实施例中，本发明涉及C-C6中任一项所述的方法，其中Bax多肽的表达和/或Bak多肽的表达被敲低，并且与参考细胞的细胞凋亡活性相比，该细胞的细胞凋亡活性是降低的。
C9.在某些实施例中，本公开内容涉及C7或C8所述的方法，其中细胞的细胞凋亡活性是通过将在生产期的第14天确定的所述细胞的群体的生存力与所述参考细胞的群体的生存力进行比较而确定的。
C10.在某些实施例中，本公开涉及C7-C9中任一项所述的方法，其中参考细胞是包含Bax基因和Bak基因的野生型等位基因的细胞。
C11.在某些实施例中，本公开涉及C-C10中任一项所述的方法，其中基因工程系统为或包括锌指核酸酶(ZFN)系统或转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统。
C12.在某些实施例中，本公开涉及C-C11中任一项所述的方法，其中细胞系开发系统包括靶向整合、随机整合或转座酶系统。
C13.在某些实施例中，本公开内容涉及C-C12中任一项所述的方法，其中细胞是动物细胞或真菌细胞。
C14.在某些实施例中，本公开涉及C13所述的方法，其中动物细胞是哺乳动物细胞。
C15.在某些实施例中，本公开涉及C14所述的方法，其中哺乳动物细胞是COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、Ml细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞系、BHK细胞或CHO细胞系，或它们的衍生物。
C16.在某些实施例中，本公开涉及C15所述的方法，其中CHO细胞是CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、DG44细胞、DUKXB-11细胞、CHOK1S细胞或CHO K1M细胞，或它们的衍生物。
C17.在某些实施例中，本公开内容涉及C-C16中任一项的方法，其中该细胞进一步包括编码目的产物的多核苷酸。
C18.在某些实施例中，本公开涉及C17所述的方法，其中将编码目的产物的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞的细胞基因组中。
C19.在某些实施例中，本公开涉及C17所述的方法，其中将编码目的产物的多核苷酸随机整合在细胞的细胞基因组中。
C20.在某些实施例中，本公开涉及C17-C19中任一项所述的方法，其中编码目的产物的多核苷酸是染色体外多核苷酸。
C21.在某些实施例中，本公开涉及C17-C19中任一项所述的方法，其中将编码目的产物的多核苷酸整合在细胞的染色体中。
C22.在某些实施例中，本公开内容涉及C17-C21中任一项所述的方法，其中目的产物包括重组多肽。
C23.在某些实施例中，本公开涉及C17-C22中任一项所述的方法，其中目的产物是抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。
C24.在某些实施例中，本公开涉及C23所述的方法，其中抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。
C25.在某些实施例中，本公开涉及C23或C24所述的方法，其中抗体包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。
C26.在某些实施例中，本公开内容涉及C23-C25中任一项所述的方法，其中抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
C27.在某些实施例中，本公开涉及C23-C26中任一项所述的方法，其中抗体包括单克隆抗体。
C28.在某些实施例中，本发明涉及C23-C27中任一项所述的方法，其中细胞中的每一个进一步包含重组多核苷酸。
D.在某些实施例中，本公开涉及生产重组多肽的方法，该方法包括：培养真核细胞系，该细胞系包含：(a)Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变，和(b)在适合于生产多肽的条件下编码重组多肽的多核苷酸。
D1.在某些实施例中，本公开涉及D所述的方法，其中将编码多肽的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞系的细胞的细胞基因组中。
D2.在某些实施例中，本公开涉及D所述的方法，其中将编码多肽的多核苷酸随机整合在细胞系的细胞的细胞基因组中。
D3.在某些实施例中，本公开涉及D-D2中任一项所述的方法，其中编码多肽的多核苷酸是染色体外多核苷酸。
D4.在某些实施例中，本公开涉及D-D3中任一项所述的方法，其中将编码多肽的多核苷酸整合在细胞系的细胞的染色体中。
D5.在某些实施例中，本公开涉及D-D4中任一项所述的方法，其中重组多肽是抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。
D6.在某些实施例中，本公开涉及D5所述的方法，其中抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。
D7.在某些实施例中，本公开涉及D5或D6所述的方法，其中抗体包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。
D8.在某些实施例中，本公开内容涉及D5-D7中任一项所述的方法，其中抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
D9.在某些实施例中，本公开涉及D5-D8中任一项所述的方法，其中抗体包括单克隆抗体。
D10.在某些实施例中，本公开涉及D-D9中任一项所述的方法，其进一步包括分离重组多肽。
E.在某些实施例中，本公开涉及生产病毒载体的方法，其包括在适合于生产病毒载体的条件下培养真核细胞系，该细胞系包含(a)在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变，(b)病毒基因组，和(c)编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
E1.在某些实施例中，本公开内容涉及E所述的方法，其进一步包括分离病毒载体。
E2.在某些实施例中，本公开涉及E-E1中任一项所述的方法，其中细胞系是动物细胞系或真菌细胞系。
E3.在某些实施例中，本公开涉及E2所述的方法，其中动物细胞系是哺乳动物细胞系。
E4.在某些实施例中，本公开涉及E3所述的方法，其中哺乳动物细胞系是COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系或CHO细胞系，或它们的衍生物。
E5.在某些实施例中，本公开涉及E4所述的方法，其中CHO细胞系是CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系，或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。
E6.在某些实施例中，本公开涉及E-E5中任一项所述的方法，其中在细胞培养基中培养细胞系。
E7.在某些实施例中，本公开涉及E-E6中任一项所述的方法，其中在分批进料培养条件或灌流培养条件下培养细胞系。
E8.在某些实施例中，本公开涉及E7所述的方法，其中在分批进料培养条件下培养细胞系，任选地其中分批进料培养条件为强化分批进料培养条件。
E9.在某些实施例中，本公开涉及E-E8中任一项所述的方法，其中在灌流培养条件下培养细胞系，任选地其中灌流培养条件为半连续灌流或连续灌流。
E10.在某些实施例中，本公开涉及E-E9中任一项所述的方法，其中细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
6.实例
参考以下实例将更详细地理解本公开。但是，它们不应被解释为限制本公开的范围。应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且其各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和界限内以及本发明所附权利要求的范围内。
实例1：抗细胞凋亡细胞的产生和检测
此实例描述了在14天的强化过程中对从抗凋亡宿主产生的细胞系的评估。在该实验中，将标准分子(抗体A)作为模型分子进行测试。表达抗体A的稳定细胞系的产生遵循标准细胞系开发(CLD)协议。使用14天的强化过程，在ambr15微型生物反应器中的CHO生产培养基中，评估从野生型(WT)靶向整合(TI)CHO宿主或两个Bax基因和Bak基因均被敲除的工程化宿主(Bax/Bak DKO)产生的顶级克隆。在该过程的前7天，WT克隆和Bax/Bak DKO克隆显示相似的滴度、细胞生长、生存力和Qp。然而，在第7天和第14天之间，WT克隆的生存力和Qp下降，而Bax/Bak DKO克隆的生存力仍然很高。在这个14天的延长强化过程中，与顶级WT克隆相比，顶级Bax/Bak DKO克隆显示出50％的滴度增加。这表明通过敲除Bax基因和Bak基因来阻断细胞凋亡可提高强化过程中的产量。此外，这应该能够在强化过程中延长生产期，从而实现更高的滴度。这降低了制造过程的成本以及获得给定数量的所需产物所需的制造运行次数。
方法
Bax/Bak DKO宿主产生
野生型TI宿主细胞与Cas9蛋白和靶向Bax基因和Bak基因的gRNA共转染。使用Cytena的单细胞打印机，将转染的细胞以1个细胞/孔的速度单细胞打印在成像质量384孔板(康宁#7311)中，该板预填充了40μL含有选择试剂的专有种子序列培养基，并立即使用Celigo成像仪在白光和荧光模式下成像。将板在37℃、5％CO2的加湿环境中孵育2周，然后根据汇合度挑选48个克隆衍生的克隆。克隆在宿主种子培养培养基中扩增，并通过蛋白质印迹分析评估Bax/Bak DKO效率。将确认用于Bax/Bak DKO的克隆放大以产生抗体A表达克隆。
抗体A表达细胞的单细胞克隆
野生型TI宿主细胞系和Bax/Bak DKO宿主细胞系用于产生表达抗体A的靶向整合单细胞克隆。根据标准细胞系开发方案进行转染和单细胞克隆。
细胞在384孔板中以1个细胞/孔进行单细胞印刷，该板预填充了40μL含有选择试剂的单细胞克隆(SCC)培养基，从每个宿主中挑取88个克隆并转移到96孔板中。在三轮HTRF滴度筛选测定后，每个宿主选择5个克隆衍生的单细胞克隆用于ambr15中的分批进料生产测定评估。
克隆评估
克隆评估在ambr15强化过程中使用CHO生产培养基(专有)进行14天。将所有克隆在摇瓶中放大用于N-1传代。培养4天后，离心浓缩细胞，并在生产第0天以高接种密度接种
在整个生产评估期间，培养温度保持在35℃。在第1、3、5、12天和第7天或第9天(如果渗透压低)添加15％(工作体积)和2.6％(工作体积)的适当补料。在第14天收获克隆。表2提供了检测类型及其各自的样品采集日期的概述。
表2：取样和化验
Figure BDA0004012788070000841
结果
生存力和细胞生长
在整个14天的过程中，所有Bax/Bak DKO克隆的活细胞计数(VCC)与WT克隆相当或更高(图1和2)。VCC是按每单位体积确定的，因此由于添加进料而导致的稀释导致生产期间所有克隆中的VCC有所减少。这在计算生存力(％)时已得到纠正。WT克隆在第10天后显示生存力下降，而Bax/Bak DKO克隆的生存力在过程结束前一直保持高水平(图3)。在第14天，所有WT克隆的生存力都低于70％，而Bax/Bak DKO克隆的生存力超过80％(图4)。裂解半胱天冬酶3的蛋白质印迹分析表明，所有WT克隆在运行结束时都经历了细胞凋亡，而Bax/BakDKO克隆则没有(图5)。
滴度和比生产率
第3、7、10和14天的滴度和第14天的比生产率分别如图6和7所示。WT和Bax/BakDKO克隆的第7天滴度相当。然而，在第14天，从Bax/Bak DKO宿主产生的顶级克隆显示出比WT克隆更高的滴度。更重要的是，WT克隆的生产率在第10天后显着下降，而Bax/Bak DKO克隆仍然产生抗体。请注意，该实验中的喂养策略并未优化，多个Bax/Bak DKO克隆在第7天和第10天耗尽了必需氨基酸。随着喂养策略的进一步优化，这些Bax/Bak DKO克隆的滴度有望更高。
由于细胞培养物在此过程中每天都被稀释，通过去除细胞培养物进行取样或体积减少并添加饲料，图7中显示的特定生产率将被低估。为了计算14天过程中不同时期的特定生产率，稀释因子用于校正滴度和VCC读数。在整个14天的过程中(图8)以及在过程的不同阶段(图9)，分析了从WT TI宿主WT-4产生的顶端克隆，以及从两个Bax/Bak DKO宿主产生的顶端克隆的比生产率。如图9所示，WT-4克隆的比生产率在第10天和第14天之间显着下降，而所有Bax/Bak DKO克隆的比生产率在第10天后仍然很高。
代谢物
如果葡萄糖读数低于或预期低于培养物中的最佳水平，则在开始时执行葡萄糖补料策略，进一步添加葡萄糖。在第2天，所有克隆都耗尽了葡萄糖，但它们只喂食了标准量的葡萄糖。从第4天到结束，计算每日培养葡萄糖消耗量，并添加额外的葡萄糖以确保第二天葡萄糖读数不会低于2g/L的所需阈值。图10提供了顶级克隆的葡萄糖消耗摘要。图11提供了顶级克隆的乳酸摘要。
产物质量
来自第14天PQA分析的产物质量数据表明，从Bax/Bak DKO克隆产生的产物具有与WT克隆相当的产物质量。
尺寸变体(％)：HMWS、主峰、LMWS。图12、13和14示出了WT和Bax/Bak DKO克隆的分子大小数据。聚合数据在WT和Bax/Bak DKO克隆之间具有可比性。
电荷变体(％):酸性，主峰，碱性。图15、16和17分别说明了酸性物质、主要物质和碱性物质的百分比。电荷变体数据在WT和Bax/Bak DKO克隆之间具有可比性。
HILIC聚糖分析(％)。第14天收获的细胞培养液(HCCF)被提交给AO进行聚糖测定。表3提供了所分析的主要聚糖物质的概述。WT和Bax/Bak DKO克隆之间的聚糖物质水平总体上具有可比性。从图12-17和表3获得的结果表明，从Bax/Bak DKO宿主产生的抗体与从WT宿主产生的抗体具有相当的产物质量。
表3：第14天主要聚糖物质。
Figure BDA0004012788070000851
Figure BDA0004012788070000861
结论
更高滴度的工艺不仅可以降低成本，还可以使制造网络更加灵活。然而，延长生产培养持续时间、增加细胞密度或使用HDAC抑制剂提高Qp等策略会因诱导细胞凋亡并因此降低VCC而受到阻碍。使用抗细胞凋亡宿主细胞系可以减少这些策略中的这种不良影响。在这个实例中，Bax/Bak DKO抗细胞凋亡宿主在扩展强化过程中进行了测试。从Bax/Bak DKO宿主产生的抗体A生产克隆不仅表现出相对于WT细胞系改善的生存力，而且在14天强化过程的后期也提高了生产率。不希望受任何理论的束缚，Bax/Bak DKO克隆的生产率提高可能是由于：1)敲除Bax基因和Bak基因有助于在生产后期保持线粒体的完整性和健康，以及2)还可以防止/延迟培养中的细胞凋亡。在此过程中，顶级Bax/Bak DKO克隆产生的抗体比顶级WT克隆多50％。通过进一步修改进料策略，可以进一步提高滴度。Bax/Bak DKO和WT克隆的产物质量相当。Bax/Bak DKO克隆也具有与WT克隆相似的代谢
实例2：抗细胞凋亡细胞的产生和检测
为了进一步定义Bax/Bak缺陷在治疗性分子制造中的益处，本实例评估了标准单克隆抗体分子和Bax/Bak DKO遗传背景下的几种复合分子在常规或强化过程中以及在不同规模下的生产。
材料和方法
细胞培养
在125mL摇瓶容器中，在150rpm以及37℃和5％CO2条件下，在基于DMEM/F12的专有培养基中培养CHO细胞。每3-4天以4x105个细胞/ml的接种密度对细胞进行传代。
抗体表达细胞系开发
如Misaghi等人，Biotechnol Prog 2013,29,727中所述产生稳定表达mAb分子的细胞池。通过MaxCyte STX电穿孔(MaxCyte,Gaithersburg,MD)将表达质粒转染到WT或Bax/Bak DKO CHO细胞中。然后选择转染的细胞并通过人IgG染色通过FACS确认mAb的表达。
分批进料生产试验
在摇瓶、AMBR15或AMBR250容器(TAP Biosystems)中，使用专有的化学定义的生产培养基进行分批进料生产培养。对于标准或低接种密度工艺，细胞在生产(N)期的第0天以2×106个细胞/ml接种。在第3、7和10天，向培养物中添加专有的进料基质。对于强化过程，细胞在生产的第0天(N)以3×107个细胞/mL接种在AMBR15或AMBR250容器中。培养物每2-4天接受专有的进料培养基。AMBR15系统中的生产在37℃、DO30％、pH 7.2和1400rpm的搅拌速率的设定点下运行。AMBR250系统中的生产在35℃、DO 30％、pH 7.2和477rpm的搅拌速率的设定点下运行。
Bax基因和Bak基因敲除
为了敲除CHO细胞中的Bax基因和Bak基因，将来自
Figure BDA0004012788070000871
DNATechnologies,Inc.的
Figure BDA0004012788070000872
靶向Alt-R crRNA和非特异性Alt-R tracrRNA在100M的无核酸μ酶双链缓冲液中重构，并以1:1混合比例，然后在95℃下孵育5分钟，然后冷却至室温以允许退火。然后通过将3μL(150pmol)退火的gRNA与1μL Cas9蛋白(IDT，10mg/mL)混合，然后在室温下孵育10分钟，制备指导RNA-Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物。使用Neon电穿孔系统(Thermo Fisher Scientific)将5μL gRNA-Cas9 RNP转染到Genentech CHO-K1宿主细胞系的100万个细胞中，依次靶向Bax和Bak基因，然后进行单细胞克隆以分离单个Bax/Bak DKO宿主细胞系。这些DKO宿主细胞系中Bax基因和Bak基因的完全敲除通过蛋白质印迹法得到证实。
gRNA寡核苷酸的序列：
Bax gRNA:GGGTCGGGGGAGCAGCTCGG
Bak gRNA-1:TCATCACAGTCCTGCCTAGG
Bak gRNA-2:ATGGCGTCTGGACAAGGACC。
离线样品分析
每隔一天对上清液样品进行活细胞计数(VCC)并使用Vi-Cell XR(BeckmanCoulter)检测生存力，并使用Bioprofile 400(Nova Biomedical)检测pO2、pH、pCO2、Na+、葡萄糖和乳酸。来自AMBR生物反应器的所有样品在取样后几分钟内在BioProfile 400上进行分析，以最大限度地减少排气。相同的Vi-Cell XR、BioProfile 400和渗透压计(型号2020，Advanced Instruments)用于所有样品，以消除仪器间的差异。通过柱前衍生化和反相高效液相色谱法测量上清液中的氨基酸浓度。所有氨基酸都用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)衍生化，以产生高荧光的衍生物。使用具有蛋白A柱的高压液相色谱法(HPLC)测量抗体滴度。使用通过PhyTip蛋白A柱纯化的细胞培养上清液样品进行抗体产物质量测定。通过具有荧光检测的毛细管电泳(CE)分析抗体聚糖分布，同时通过尺寸排阻色谱(SEC)分析分子大小分布。使用成像毛细管等电聚焦(icIEF)测量蛋白质电荷异质性；所有电荷异质性样品都用羧肽酶B进行了预处理。所有蛋白质产物质量测定都是在内部开发的，并且已经发表了详细的方案，例如，Hopp等人，Biotechnol Prog 2009,25,1427。
结果
从Bax/Bak双敲除宿主产生的池可使标准mAb的生存力提高和滴度提高
通过用核糖核蛋白(RNP)转染在Genentech CHO-K1宿主细胞系(Misaghi等人，Biotechnol Prog 2013，29，727)中依次靶向Bax基因和Bak基因，我们能够产生几种不同的单细胞克隆Bax/Bak DKO宿主细胞系，其Bax/Bak缺陷已通过蛋白质印迹证实(补充图1A)。为了测试这些DKO宿主细胞系是否比亲本WT宿主细胞系具有更好的生存力和重组蛋白表达，我们转染了每个DKO以及WT宿主细胞系以产生表达单克隆抗体(mAb-A)的稳定池。这些池首先在摇瓶中的14天低接种密度生产平台(平台-1)(图1A)以及AMBR15生物反应器中评估这些池的细胞培养性能和mAb-A生产率，其中温度、pH和氧水平得到持续监测和严格控制(图1B)。在摇瓶中，在开始时具有更好细胞生长的几个池(WT、DKO2、DKO8)在过程结束时表现出降低的生存力，这可能是由于缺乏过程控制，例如pH控制或充气。相比之下，在AMBR15生物反应器中，所有池在整个过程中都显示出良好的生存力，只有WT池在培养过程结束时的生存力略有下降。在摇瓶和AMBR15过程中，平均而言，源自DKO宿主的池相对于WT池实现了略好或相当的滴度和比生产率(图1A和1B)。
为了确定Bax/Bak DKO细胞是否在强化过程中实现了更好的生存力和生产率，然后在AMBR15生物反应器中以高接种密度过程对池进行测试(图1C)。在高接种密度过程中，WT池从第3天开始显示生存力下降，并且在过程结束时只有67％的活细胞，而所有DKO池在整个过程中保持超过90％的生存力。在强化过程中，所有DKO池都比WT池获得更高的滴度，这主要是因为更好的生存力和更高的活细胞计数(VCC)。这些结果表明，Bax/Bak DKO基因修饰可防止强化过程中的细胞死亡，从而导致更高的滴度。
在摇瓶和AMBR15生产过程中，未观察到WT和DKO池之间产物质量属性的显着差异(补充图1B-D)。在强化过程中，在DKO池产生的产物中观察到更高百分比的高分子量物质(HMWS)或蛋白质聚集体(补充图1D)，这通常与更高的滴度相关。所有这些细胞系在其他产物质量属性(例如电荷变体或糖基化水平)方面都具有可比性(补充图1B-D)。
从Bax/Bak双敲除宿主产生的单细胞克隆通过提高细胞培养生存力实现过程延长，从而在强化过程中产生更高滴度的标准mAb
为了确定在单细胞克隆后是否可以维持在Bax/Bak DKO池中观察到的实现更好的生存力和mAb-A滴度的益处，我们单细胞克隆了WT池以及两个Bax/Bak DKO池并在两轮板内滴度测定后从每个臂中挑选出顶级4-5个克隆。单细胞克隆(SCC)首先在摇瓶中的低细胞接种密度分批进料生产过程中进行分析(图2A)。与池结果类似，与WT克隆相比，DKO克隆的细胞培养生存力有所改善，滴度略有增加。WT克隆和DKO克隆之间的所有产物质量属性都具有可比性(补充图2A)。
测试了Bax/Bak DKO克隆在强化过程中是否会达到更高的滴度。在延长(14天)的强化平台-1分批进料生产过程中，在AMBR15生物反应器中以目标30×106个细胞/mL起始细胞接种密度测试了来自WT和两个DKO臂的顶级克隆(图2B)。与在该过程的后期生存力下降的WT克隆不同，DKO克隆在14天过程结束之前保持高生存力(图2B)。在第14天，在WT而非DKO克隆中细胞凋亡标记蛋白(裂解半胱天冬酶3)的水平升高，表明WT细胞在强化生产过程的后期正在经历细胞凋亡，同时敲除Bax/Bak基因阻止了凋亡(补充图2C)。此外，WT克隆的滴度在第10天左右趋于稳±定，在第14天达到4.7±0.7g/L，而DKO克隆的滴度持续增加，±在第14天达到7.1±0.8g/L。请注意，WT克隆从第10天到第14天的滴度下降和DKO克隆的滴度增加较慢是由于通过从培养物中去除样品并将进料和葡萄糖添加回培养物来稀释生产培养物。在该过程的最后4天，WT克隆的mAb-A生产率降低不仅是由于生存力和VCC的损失，而且还因为比生产率(Qp)的降低。平均而言，WT克隆在整个14天的过程中(图2B，最低面板，第0-14天)的总体Qp低于前10天(图2B，最低面板，第0-10天)，表明WT克隆在最后4天内的Qp降低。在该过程的最后阶段，WT克隆与DKO克隆相比较低的Qp可能是由于仍然存活的细胞中Bax/Bak激活引起的线粒体膜损伤。这些结果表明，Bax/Bak DKO细胞能够延长细胞培养生存力，从而在强化过程中延长生产过程，在最佳情况下与WT克隆相比，导致滴度增加44％。相对于WT细胞，在DKO细胞(补充图2B)中未观察到明显的产物质量变化。
为了评估生产规模是否影响DKO细胞的性能，在同一强化过程中测试了AMBR250容器中每个宿主的顶部克隆。在这个更大的规模上，DKO克隆比WT克隆(5.5±0.4g/L，来自同一克隆的4个重复)获得更好的生存力、Qp和滴度(8.2g/L)(图3)，类似于AMBR15过程。
Bax/Bak双敲除还通过在强化过程中提高生存力来提高复合抗体的产生
与标准mAb分子相比，双特异性或复合抗体的生产由于其非标准形式更具挑战性，这可能会带来额外的生产问题，例如产物不稳定、不需要的副产物种类、更高的产物片段或聚集水平以及低表达水平。双特异性抗体或复合分子的非天然形式增加了分子错误折叠和二硫键错配的机会，导致细胞内更高水平的细胞内活性氧(ROS)积累和氧化应激，最终导致VCD、生存力和生产率降低。测试了Bax/Bak DKO细胞系是否有助于缓解这些问题。
比较了WT宿主或DKO宿主中两种复合分子(B和D)和一种双特异性分子(C)的产生(图4)。对于复合分子-B和双特异性分子-C，产生了来自每个宿主的两个稳定表达池，而对于复合分子-D，产生了来自每个宿主的一个稳定表达池。这些池在AMBR15生物反应器中的延长(14天)强化生产过程进行测试。对于所有三种分子，从DKO宿主产生的池在整个过程中保持高生存力，而WT池在生产后期显示生存力下降(图4)。更好的生存力也导致DKO池的VCC更高，导致DKO1宿主中分子B和分子C的产量(分别为7.9±0.5和7.8±1.0g/L)比WT(分别为6.0±0.5g/L和6.2±0.8g/L)高约30％(图4B和4C)。对于分子-D，DKO池相对于WT池仅实现了高5％的滴度，这主要是由于DKO池在生产后期的比生产率降低，这可能是由培养物中必需氨基酸(如半胱氨酸)的耗尽引起的(图4C)。所有三种分子的WT和DKO池之间的所有产物质量属性都具有可比性(补充图3)。总体而言，表达双特异性或复合分子的Bax/Bak DKO细胞系在14天的强化生产过程中保持了高生存力，从而在不影响产物质量的情况下提高了产物滴度。
从已建立的表达治疗性蛋白的细胞系中敲除Bax/Bak也显示出一些有益的特性，即使在池阶段也是如此。如补充图4所示，我们将模拟或Bax/Bak gRNA转染到预先用抗体-细胞因子(复合分子-E)表达构建体转染的细胞池中。在AMBR250生物反应器的强化生产过程中比较了对照和Bax/Bak DKO池的细胞培养性能和滴度。与之前的结果类似，Bax/Bak基因的缺失提高了生产后期的培养物生存力，然而，由于Bax基因和Bak基因的敲除效率低于50％(数据未显示)，在DKO池中观察到VCC和滴度的改善很小。我们相信，通过优化和提高基因敲除效率，将Bax/Bak gRNA转染到已建立的细胞系或最近转染的细胞池中，然后进行SCC，也可以分离具有完整Bax/Bak DKO表型的单细胞克隆，其能够在强化生产过程中实现高生存力和滴度。
讨论
在本实例中，产生了Bax/Bak DKO抗细胞凋亡宿主细胞系，并在强化生产过程中以不同规模表达标准单克隆抗体和几种复合分子，如池和单细胞克隆。从Bax/Bak DKO宿主产生的治疗性蛋白质表达池或克隆表现出扩大的生存力和生产率，而在使用WT宿主的强化生产过程的后期，生存力和生产率都降低了。同时，Bax/Bak DKO和WT细胞系之间的的产物质量属性具有可比性。总体而言，数据表明抗细胞凋亡宿主细胞系的使用显著改善了过程强化策略，在不改变产物质量的情况下产生更高的体积生产率，从而延长了生产过程。在所有情况下，敲除Bax基因和Bak基因有助于在整个14天的生产过程中保持高生存力。甚至通过将Bax/Bak gRNA转染到先前用表达复合分子的构建体转染的细胞系中，从而产生异源池(补充图4)，也有助于提高生存力。高培养生存力本身对制造过程非常有益，因为它允许更好地控制产物质量。除了生存力提高外，在大多数强化生产过程中，培养滴度提高了30-80％。
相对于强化过程，在常规或较低的接种密度(图1A和2A)下观察到滴度改善较少，这主要是因为对照培养物中的细胞死亡较少。当细胞密度高时，细胞凋亡在强化生产过程期间更频繁地发生，这可能是由于缺氧、剪切应力、营养缺乏的风险增加以及细胞产生的有毒代谢副产物(包括抑制性代谢物(例如异戊酸和甲酸)和活性氧(ROS)的更快积累。灌流技术可用于通过减少细胞内ROS积累和从细胞培养物中去除抑制性代谢物，同时不断为培养物提供氧气和营养来减少这些细胞应激。然而，由于过程控制复杂且需要大量培养基，灌流细胞培养通常不太理想。在本研究中使用抗细胞凋亡Bax/Bak DKO细胞系提供了替代方法，该方法在强化分批进料培养中增加培养细胞密度并提高滴度。另一种减轻分批进料强化生产过程中大量的培养物生存力下降的方法是缩短分批进料培养时间，并在生存力开始下降之前收获培养物。然而，由于建立生产培养物需要大量材料和劳动力成本，缩短的培养时间降低了经济效益并提高了生产网络的灵活性。因此，在保持培养物生产率的同时延长培养时间对于实现所需的效益成本比和提高生产灵活性非常重要。如本实例所示，通过使用Bax/Bak DKO细胞系，与WT细胞的7-10天相比，生产培养时间可延长至至少14天，并允许两种标准抗体和复合分子的滴度增加30-50％，这将大大降低单位产物的生产成本。总之，Bax/Bak抗凋亡CHO细胞允许具有高细胞密度和延长的培养时间的高生存力/高产量强化生产过程。

Claims (97)

1.一种分离的真核细胞系，其中所述细胞系包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其中所述细胞系包含在所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的细胞系，其中所述细胞系为动物细胞系或真菌细胞系。
4.根据权利要求3所述的细胞系，其中所述动物细胞系为哺乳动物细胞系。
5.根据权利要求4所述的细胞系，其中所述哺乳动物细胞系为COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系或CHO细胞系，或它们的衍生物。
6.根据权利要求5所述的细胞系，其中所述CHO细胞系为CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。
7.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中所述细胞系包含在所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者中的缺失。
8.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中所述细胞系进一步包含病毒基因组和编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
9.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中所述细胞系进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
10.根据权利要求9所述的细胞系，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸在靶向位置处整合在所述细胞系的细胞基因组中。
11.根据权利要求9所述的细胞系，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸随机整合在所述细胞系的细胞基因组中。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的细胞系，其中编码所述目的产物的所述多核苷酸为染色体外多核苷酸。
13.根据权利要求9至11中任一项所述的细胞系，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸整合在所述细胞系的染色体中。
14.根据权利要求9至11中任一项所述的细胞系，其中目的产物包括重组多肽。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的细胞系，其中所述目的产物包括抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。
16.根据权利要求15所述的细胞系，其中所述抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的细胞系，其中所述抗体包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的细胞系，其中所述抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的细胞系，其中所述抗体包括单克隆抗体。
20.根据权利要求7至19中任一项所述的细胞系，其中与包含所述多核苷酸以及野生型Bax基因和Bak基因中的每一者的功能拷贝的对应的分离的真核细胞系相比，所述细胞系具有更高的比生产率。
21.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中与包含所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者的功能拷贝的对应的分离的真核细胞系相比，所述细胞系对细胞凋亡更具抗性。
22.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中所述细胞系被用于细胞培养过程，诸如分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流。
23.根据权利要求22所述的细胞系，其中所述细胞系被用于强化灌流过程。
24.一种组合物，其包含根据任一前述权利要求所述的真核细胞系。
25.根据权利要求24所述的组合物，其进一步包含细胞培养基。
26.一种细胞培养物，其包含细胞培养基和多个真核细胞，其中所述多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。
27.根据权利要求26所述的细胞培养物，其中每个细胞包含在所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的细胞培养物，其中所述多个中的每个细胞包含在所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者中的缺失。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞为动物细胞或真菌细胞。
30.根据权利要求29所述的细胞培养物，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
31.根据权利要求30所述的细胞培养物，其中所述哺乳动物细胞为COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、Ml细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、BHK细胞或CHO细胞，或它们的衍生物。
32.根据权利要求31所述的细胞培养物，其中所述CHO细胞为CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、DG44细胞、DUKXB-11细胞、CHOK1S细胞或CHO K1M细胞，或它们的衍生物。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
34.根据权利要求33所述的细胞培养物，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸在靶向位置处整合在所述细胞的细胞基因组中。
35.根据权利要求33所述的细胞培养物，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸随机整合在所述细胞的细胞基因组中。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的细胞培养物，其中编码所述目的产物的所述多核苷酸为染色体外多核苷酸。
37.根据权利要求33至35中任一项所述的细胞培养物，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸整合在所述细胞的染色体中。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的细胞培养物，其中所述目的产物包括重组多肽。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的细胞培养物，其中所述目的产物为抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。
40.根据权利要求39所述的细胞培养物，其中所述抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的细胞培养物，其中所述抗体包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的细胞培养物，其中所述抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的细胞培养物，其中所述抗体包括单克隆抗体。
44.根据权利要求26至43中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞中的每一个进一步包含重组多核苷酸。
45.根据权利要求26至44所述的细胞培养物，其中所述细胞被用于细胞培养过程，诸如分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流。
46.根据权利要求45所述的细胞培养物，其中所述细胞被用于强化灌流过程。
47.一种降低真核细胞中的细胞凋亡活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统：
a.敲低或敲除Bax多肽同种型的表达；以及
b.敲低或敲除Bak多肽同种型的表达。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述真核细胞用于分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流细胞培养过程中。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述真核细胞被用于强化细胞培养过程。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述基因工程系统选自由以下项组成的组：CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统及它们的组合。
51.根据权利要求47至50中任一项所述的方法，其中所述基因工程系统为或包括CRISPR/Cas9系统。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述CRISPR/Cas9系统包含：
a.Cas9分子，
b.至少一个第一指导RNA(gRNA)，所述至少一个第一gRNA包含与Bax基因中的靶序列互补的靶向序列，和
c.至少一个第二gRNA，所述至少一个第二gRNA包含与Bak基因中的靶序列互补的靶向序列。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述靶序列中的至少一个为所述Bax基因的一部分，且/或其中所述靶序列中的至少一个为所述Bak基因的一部分。
54.根据权利要求47至53中任一项所述的方法，其中Bax多肽的表达和/或Bak多肽的表达被敲除，并且所述细胞的细胞凋亡活性与参考细胞的细胞凋亡活性相比是降低的。
55.根据权利要求47至53中任一项所述的方法，其中所述Bax多肽的表达和/或所述Bak多肽的表达被敲低，并且所述细胞的细胞凋亡活性与参考细胞的细胞凋亡活性相比是降低的。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的方法，其中所述细胞的细胞凋亡活性是通过将在生产期的第14天确定的所述细胞的群体的生存力与所述参考细胞的群体的生存力进行比较而确定的。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述参考细胞为包含所述Bax基因和所述Bak基因的野生型等位基因的细胞。
58.根据权利要求47至57中任一项所述的方法，其中所述基因工程系统为或包括锌指核酸酶(ZFN)系统或转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统。
59.根据权利要求47至58中任一项所述的方法，其中细胞系开发系统包含靶向整合、随机整合或转座酶系统。
60.根据权利要求47至59中任一项所述的方法，其中所述细胞为动物细胞或真菌细胞。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、Ml细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞系、BHK细胞或CHO细胞系，或它们的衍生物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述CHO细胞为CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、DG44细胞、DUKXB-11细胞、CHOK1S细胞或CHO K1M细胞，或它们的衍生物。
64.根据权利要求47至63中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
65.根据权利要求64所述的方法，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸在靶向位置处整合在所述细胞的细胞基因组中。
66.根据权利要求64所述的方法，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸随机整合在所述细胞的细胞基因组中。
67.根据权利要求64至66中任一项所述的方法，其中编码所述目的产物的所述多核苷酸为染色体外多核苷酸。
68.根据权利要求64至66中任一项所述的方法，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸整合在所述细胞的染色体中。
69.根据权利要求64至68中任一项所述的方法，其中所述目的产物包括重组多肽。
70.根据权利要求64至69中任一项所述的方法，其中所述目的产物为抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。
72.根据权利要求70或权利要求71所述的方法，其中所述抗体包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中所述抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述抗体包括单克隆抗体。
75.根据权利要求70至74中任一项所述的方法，其中所述细胞中的每一个进一步包含重组多核苷酸。
76.一种生产重组多肽的方法，其包括：
在适合于生产所述多肽的条件下培养真核细胞系，所述真核细胞系包含：
(a)在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变，和
(b)编码所述重组多肽的多核苷酸。
77.根据权利要求76所述的方法，其中将编码所述多肽的所述多核苷酸在靶向位置处整合在所述细胞系的细胞的细胞基因组中。
78.根据权利要求76所述的方法，其中将编码所述多肽的所述多核苷酸随机整合在所述细胞系的细胞的细胞基因组中。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的方法，其中编码所述多肽的所述多核苷酸为染色体外多核苷酸。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的方法，其中将编码所述多肽的所述多核苷酸整合在所述细胞系的细胞的染色体中。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的方法，其中所述重组多肽为抗体、抗体-融合蛋白、抗原、酶或疫苗。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。
83.根据权利要求81或权利要求82所述的方法，其中所述抗体包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。
84.根据权利要求81至83中任一项所述的方法，其中所述抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
85.根据权利要求81至84中任一项所述的方法，其中所述抗体包括单克隆抗体。
86.根据权利要求76至85中任一项所述的方法，其进一步包括分离所述重组多肽。
87.一种生产病毒载体的方法，其包括：
在适合于生产所述病毒载体的条件下培养真核细胞系，所述真核细胞系包含(a)在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变，(b)病毒基因组，和(c)编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
88.根据权利要求87所述的方法，其进一步包括分离所述病毒载体。
89.根据权利要求87至88中任一项所述的方法，其中所述细胞系为动物细胞系或真菌细胞系。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述动物细胞系为哺乳动物细胞系。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述哺乳动物细胞系为COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER-C6细胞系、K562细胞系、MOLT-4细胞系、Ml细胞系、NS-1细胞系、COS-7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC-5细胞系、WI-38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系或CHO细胞系，或它们的衍生物。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述CHO细胞系为CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB-11细胞系、CHOK1S细胞系或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。
93.根据权利要求87至92中任一项所述的方法，其中在细胞培养基中培养所述细胞系。
94.根据权利要求87至93中任一项所述的方法，其中在分批进料培养条件或灌流培养条件下培养所述细胞系。
95.根据权利要求94所述的方法，其中在分批进料培养条件下培养所述细胞系，任选地其中所述分批进料培养条件为强化分批进料培养条件。
96.根据权利要求87至95中任一项所述的方法，其中在灌流培养条件下培养所述细胞系，任选地其中所述灌流培养条件为半连续灌流或连续灌流。
97.根据权利要求87至96中任一项所述的方法，其中所述细胞系包含在所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变。
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