KR20190005966A - 폴리펩타이드의 재조합 생산 동안 트리설파이드 결합을 감소시키기 위한 방법 - Google Patents

폴리펩타이드의 재조합 생산 동안 트리설파이드 결합을 감소시키기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한, 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 방법, 및 세포 배양 배지가 본원에 제공된다.

Description

폴리펩타이드의 재조합 생산 동안 트리설파이드 결합을 감소시키기 위한 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2016년 5월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/334,433에 대한 우선권 이점을 청구하며, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 상에서의 서열목록 제출
ASCII 텍스트 파일 상에서의 하기 제출된 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) (파일명: 146392036540SEQLIST.txt, 기록된 날짜: 2017년 5월 8일 월요일, 크기: 34.1 KB).
발명의 분야
본 개시내용은 세포 배양 배지 및 재조합으로 생산된 폴리펩타이드에서 트리설파이드 결합을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다.
트리설파이드 결합은 디설파이드 결합 속으로 추가의 황 원자가 삽입되어 생성되고, 이로 인해 3개의 연속적인 황 원자의 공유 결합을 유발한다. 트리설파이드 결합 형성은 재조합으로 생산된 치료적 폴리펩타이드에서 불균질성의 원인이다. 치료 제품이 광범위한 특성화를 경험하고 제품 품질 및 일관성을 보장하는 허용가능한 표준을 충족시켜야 하기 때문에, 이러한 불균질성은 바람직하지 않다.
이와 같이, 치료적 폴리펩타이드의 제조 동안 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법에 대한 요구가 존재한다. 또한, 당해 기술 분야에서 제조 동안 치료적 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준의 가변성을 최소화할 필요가 있다. 본 개시내용은 이러한 요구 및 기타 요구에 관한 것이다.
하기의 단계들을 포함하는 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 제공된다: (a) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 기본 배지와 접촉시키는 단계로서, 상기 기본 배지는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 접촉 단계: i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철, ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2), iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6), iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 엽산 (비타민 B9), v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12), vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및 vii) 약 0 내지 약 1.58 mM 메티오닌; (b) 상기 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하는 단계. 관련 양태에서, 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기를 포함한다: 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 기본 배지와 접촉시키는 단계로서, 상기 기본 배지는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 접촉 단계: 약 2 μM 내지 약 35μM 철, 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2), 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6), 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 엽산 (비타민 B9), 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12), 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및 약 0 내지 약 1.58 mM 메티오닌; (b) 상기 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하는 단계.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 성분의 농도가 단계 (a)에서 명시된 농도와 상이한 것 이외에는, 상기 수집된 폴리펩타이드가 동일한 조건하에 생산된 폴리펩타이드보다 낮은 트리설파이드 결합 수준을 갖는다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 기본 배지에는 시스틴이 부재하다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 기본 배지는 약 1.4 mM 내지 3 mM 시스테인 또는 시스틴을 포함한다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 기본 배지는 약 0 mM 내지 약 1.58 mM 메티오닌, 및 약 0 mM 내지 약 3 mM 시스테인을 포함한다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 기본 배지는 약 6mM 시스테인을 포함한다.
하기를 포함하는, 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 또한 제공된다: (a) 세포 배양 배지 내 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 접촉 단계: i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철, ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2), iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6), iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9), v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12), vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및 vii) 약 0 내지 약 4.5 mM 메티오닌; (b) 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하는 단계. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 내 성분 중 하나 이상의 농도는 접종 후 1회 이상의 첨가의 누적 농도이다.
CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체, 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 세포 배양 배지 내 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 접촉 단계: i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철, ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2), iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6), iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9), v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12), vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및 vii) 약 0 내지 약 4.5 mM 메티오닌; (b) 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하는 단계.
CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체, 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 세포 배양 배지 내 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 배양 단계: i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철, 및 ii) 약 0 및 약 4.5 mM 메티오닌; (b) 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하는 단계.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 공급물을 추가로 포함하며, 그리고 상기 공급 배지에는 하기 중 하나 이상이 부재하다: 철, 리보플라빈, 피리독신, 피리독살, 엽산, 및 시아노코발라민. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 그에 적용된 바와 같은) 일부 구현예 있어서, 공급물은 뱃치 공급물이다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 뱃치 공급 배지에는 시스틴이 부재하다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 뱃치 공급 배지에는 시스테인이 부재하다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 뱃치 공급 배지에는 메티오닌이 부재하다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 철은 제2철 철 (Fe3 +) 또는 제1철 철 (Fe2 +)이다.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함한다: (I) 수집 이전에 숙주 세포의 배양물에 킬레이트제 및 환원제를 보충하는 단계; (II) 상기 숙주 세포의 수집-전 세포 배양 유체 (PHCCF)에 킬레이트제 및 환원제를 보충하는 단계; 또는 (III) 수집 후 상기 숙주 세포의 수집된 세포 배양 유체 (HCCF)에 킬레이트제 및 환원제를 보충하는 단계.
하기를 포함하는, 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드 내 트리설파이드 결합의 수준을 감소시키기 위한 방법이 또한 제공된다: (i) 수집 이전에 숙주 세포의 배양물에 환원제 및 킬레이트제를 보충하는 단계; (ii) 상기 숙주 세포의 수집-전 세포 배양 유체 (PHCCF)에 킬레이트제 및 환원제를 보충하는 단계; 또는 (iii) 상기 숙주 세포의 수집된 세포 배양 유체 (HCCF)에 환원제 및 킬레이트제를 보충하는 단계.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 숙주 세포의 배양물, PHCCF, 또는 HCCF는, 환원제로 보충되기 이전에 킬레이트제로 보충된다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 숙주 세포의 PHCCF, 또는 HCCF는, 환원제로 보충된 시점으로부터 약 60분 내지 약 30분 이전에 킬레이트제로 보충된다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 킬레이트제 및 환원제는 약 30분 내지 약 4일 동안 상기 숙주 세포의 배양물, PHCCF, 또는 HCCF에서 유지된다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 숙주 세포의 배양물, PHCCF, 또는 HCCF는 약 15℃ 내지 37℃의 온도에서 유지된다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 숙주 세포의 배양물, PHCCF, 또는 HCCF는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH에서 유지된다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 숙주 세포의 배양물, PHCCF, 또는 HCCF 중 용존 산소 (DO)의 양은 적어도 약 15%이다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 숙주 세포의 배양물, PHCCF, 또는 HCCF는 약 15℃ 내지 37℃의 온도, 및 약 6.5 내지 약 7.5의 pH에서 유지되며, 그리고 상기 숙주 세포의 배양물, 또는 HCCF 중 용존 산소 (DO)의 양은 적어도 약 15%이다.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 환원제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 글루타티온 (GSH), L-글루타티온 (L-GSH), 시스테인, L-시스테인, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP), 2,3-tert-부틸-4-하이드록시아니솔, 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀, 3-아미노프로판-1-설폰산, 아데노실호모시스테인, 안세린, B-알라닌, B-카로텐, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 카르노신, 카르베딜롤, 커큐민, 시스테아민, 시스테아민 하이드로클로라이드, 덱사메타손, 디알릴디설파이드, DL-란티오닌, DL-티오르판, 에톡시퀸, 갈산, 겐티스산 나트륨 염 수화물, 글루타티온 디설파이드, 글루타티온 환원 에틸 에스테르, 글라이신, 하이드로코르티손, 하이포타우린, 이세티온산 암모늄 염, L-시스테인-글루타티온 디설파이드, L-시스테인설핀산 1수화물, 리포산, 환원된 리포산, 머캅토프로피오닐 글라이신, 메티오닌, 메틸렌비스(3-티오프로피온산), 옥살산, 쿠에르시트린 수화물, 레스베라트롤, 레티노산, S-카복시메틸-L-시스테인, 셀레늄, 셀레노메티오닌, 은 디에틸디티오카바메이트, 타우린, 티오락트산, 트리신, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B4, 비타민 B5, 비타민 B6, 및 비타민 B11. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 환원제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 시스테인 및 L-시스테인. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 환원제는 L-시스테인이며, 그리고 L-시스테인은 숙주 세포의 배양물 또는 HCCF에 첨가되어 약 3 mM 내지 약 6 mM의 최종 농도를 달성한다.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 킬레이트제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민-N,N'-디석신산 (EDDS), 시트레이트, 옥살레이트, 타르트레이트, 에틸렌-비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산 (EGTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 5-설포살리실산, N,N-디메틸도데실아민 N-옥사이드, 디티오옥사마이드, 에틸렌디아민, 살리실알독심, N-(2’-하이드록시에틸)이미노디아세트산 (HIMDA), 옥신 퀴놀린올, 및 설폭신. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 킬레이트제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민-N,N'-디석신산 (EDDS), 및 시트레이트. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 킬레이트제는 숙주 세포의 배양물 또는 HCCF에 첨가되어 20mM의 최종 농도를 달성한다.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 세포 배양 배지에 분비된다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 방법은 수집된 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 방법은 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 내의 평균 % 트리설파이드 결합이 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만이다.
상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체 또는 이의 단편이다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체 단편이며, 그리고 상기 항체 단편은 Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, (scFv)2, dAb, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합한다: BMPR1B, E16, STEAP1, 0772P, MPF, Napi3b, Sema 5b, PSCA hlg, ETBR, MSG783, STEAP2, TrpM4, C5, CRIPTO, CD21, CD79b, FcRH2, HER2, NCA, MDP, IL20Rα, 브레비칸, EphB2R, ASLG659, PSCA, GEDA, BAFF-R, CD22, CD79a, CXCR5, HLA-DOB, P2X5, CD72, LY64, FcRH1, IRTA2, TENB2, PMEL17, TMEFF1, GDNF-Ra1, Ly6E, TMEM46, Ly6G6D, LGR5, RET, LY6K, GPR19, GPR54, ASPHD1, 티로시나제, TMEM118, GPR172A, CD33, CLL-1, OX40, α4β7 및 αEβ7 인테그린 이종이량체, IL-13, CD-20, FGFR, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 아밀로이드 베타, HER3, 보체 인자 D, IL-22c, PD-L1, PD-L2, PD-1, VEGF, 안지오포이에틴 2, CD3, FAP, CEA, 및 IL-6. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체이며, 그리고 항체는 이중특이적 항체이다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 또는 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체이다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 면역사이토카인이다. 상기 구현예 중 어느 하나에 따르는 (또는 적용되는) 특정 구현예에서, 면역사이토카인은 CEA-IL2v 또는 FAP-IL2v이다.
또한, CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체, 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한, 세포 배양 배지 내 약 0 내지 약 4.5 μM 메티오닌의 사용이 제공된다.
본원에 기재된 다양한 구현예의 특징 중 하나, 일부 또는 모두는 조합되어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명의 이들 및 다른 양태는 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 이들의 전문이 참조로 인용된다.
도 1은 배지 1 + 시스테인 (Cys); 배지 1 + Cys + Fe (철); 배지 1 + 시스틴 (Cys-Cys); 배지 1 + Cys-Cys + Fe; 배지 2 + Cys; 배지 2 + Cys + Fe; 배지 2 + Cys-Cys; 또는 배지 1 + Cys-Cys + Fe을 함유하는 무세포 시스템에서 배양된 항-FluB 중의 % 트리설파이드 결합을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 2a는 하기 성분 중 하나 이상이 보충된 배지 1에서 배양된 항-FluB 중의 % 트리설파이드 결합을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다: (a) Cys-Cys, (b) Fe, 및 (c) B 비타민 (리보플라빈, 피리독신, 엽산 및 시아노코발라민).
도 2b는 하기 성분 중 하나 이상이 보충된 배지 1에서 배양된 항-OX40 항체 중의 % 트리설파이드 결합을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다: (a) Cys-Cys, (b) Fe, 및 (c) B 비타민 (리보플라빈, 피리독신, 엽산 및 시아노코발라민).
도 3은 CHO 세포 배양에 의해 생산된 항-OX40 항체의 트리설파이드 결합 수준에 대한 첨가된 Cys 또는 첨가된 Cys-Cys의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험 결과를 제공한다.
도 4a는 CHO 세포 배양에 의해 생산된 항-OX40 항체의 트리설파이드 결합 수준에 대한 기본 배지 내 상이한 농도들의 Cys의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험 결과를 제공한다.
도 4b는 도 4a에 도시된 각 세포 배양 구동에 의해 생산된 항-OX40 항체의 수율을 제공한다.
도 5a는 CHO 세포 배양에 의하여 생산된 항-OX40 항체 중 트리설파이드 결합 수준 상에서의, 뱃치 공급 배지 내 상이한 농도들의 비타민 B, 뿐만 아니라 기본 배지 내 상이한 농도들의 Cys 및 Fe 제공의 효과를 평가하기 위하여 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 5b는 도 5a에 도시된 각 세포 배양 구동에 의해 생산된 항-OX40 항체의 수율을 제공한다.
도 5c는 도 5a의 각 세포 배양 구동의 종료시 배지 중 시스틴 (Cys-Cys)의 잔류 농도를 도시한다.
도 6은 CHO 세포 배양에 의하여 생산된 항-OX40 항체 중 트리설파이드 결합 수준에 대한, 상이한 농도의 뱃치 공급 배지 내 비타민 B 및 기본 배지 내 Fe의 효과를 평가하기 위하여 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 7a는 항체의 트리설파이드 결합 수준에 대한, 항-OX40의 수집된 세포 배양 유체에 시스테인 또는 시스테인 + EDTA의 첨가 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 7b는 도 7a에서 시험된 각각의 조건하에 유지된 항-OX40 항체에서 디설파이드 결합 감소량을 평가하는, 도 7a에 기술된 실험의 CE-SDS 결과를 도시한다.
도 8a는 첨가 후 제0시간 내지 제5시간에서 항체 내 트리설파이드 결합 수준에 대한, 항-OX40 항체의 세포 배양 유체에 대한 시스테인, 시스테인 + EDTA, 시스테인 + NTA, 시스테인 + EDDS, 또는 시스테인 + 시트레이트의 첨가의 효과를 평가하기 위하여 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 8b는 첨가 후 제0시간 내지 제96시간에서 항체 내 트리설파이드 결합 수준에 대한, 항-OX40 항체의 세포 배양 유체에 대한 시스테인, 시스테인 + EDTA, 시스테인 + NTA, 시스테인 + EDDS, 또는 시스테인 + 시트레이트의 첨가의 효과를 평가하기 위하여 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 9는 세포 배양 동안 항-OX40 항체에서 트리설파이드 결합 형성에 대한 하이포타우린의 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 10은 트리설파이드 결합 감소에 대한 메티오닌 농도 감소의 상당한 영향을 보여주는 예측 프로파일을 제공한다
도 11은, CHO 세포 배양에 의하여 생산된 이중특이적 항체 중 트리설파이드 결합 수준에 대한, 상이한 농도의 기본 배지 내 시스테인 및 메티오닌의 제공의 효과를 평가하기 위하여 수행된 실험의 결과를 제공한다.
도 12는 CHO 세포 배양에 의해 생산된 항체의 트리설파이드 수준에 대한, 뱃치 공급 배지로부터 비타민 B를 생략하는 효과를 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 제공한다. 2회의 별도의 구동을 수행하였다.
본 발명은 세포 배양물에서 생산된 폴리펩타이드(예: 항체 및 이중특이적 항체)에서 트리설파이드 결합 수준을 예방, 제거 및/또는 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본원에 제공된 방법은 하기를 포함한다: 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 기본 배지와 접촉시키는 단계로서, 상기 기본 배지는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 접촉 단계: i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철, ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2), iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6), iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9), v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12), vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및 vii) 약 0 내지 약 1.58 mM 메티오닌; 상기 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하여, 이로써 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준이 감소하도록 하는 단계.
관련 양태에서, CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 세포 배양 배지 내 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지는 하기 중 하나 이상을 포함하는, 상기 배양 단계: i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철, ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2), iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6), iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9), v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12), vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및 vii) 약 0 및 약 1.58 mM 메티오닌; 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하여, 이로써 상기 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준이 감소되도록 하는 단계.
추가적으로 또는 대안적으로, 상기 방법은, 숙주 세포의 배양물 또는 세포 배양 유체, 숙주 세포의 수집-전 세포 배양 유체 (PHCCF), 또는 숙주 세포의 수집된 세포 배양 유체 (HCCF)에 킬레이트제 및 환원제를 보충하는 단계를 포함한다.
다음의 설명은 예시적인 방법, 파라미터 등을 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 개시내용의 범위의 제한으로서 의도되지 않고, 대신 예시적인 구현예의 설명으로서 제공되는 것으로 인식되어야 한다.
일반적인 기술
본원에 기술 또는 참조된 기술 및 절차는, 본 분야의 숙련가에 의하여 기존의 방법, 예컨대 예를 들어, 하기 기술된 널리 이용되는 방법들을 사용하여 잘 이해되고, 통상적으로 채용될 것이다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); 및 The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
A. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a," "an," 및 "the")는, 그 내용이 다르게 명확히 지시되지 않으면, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "분자"에 대한 지칭은 2개 또는 그 초과의 그와 같은 분자의 조합 등을 선택적으로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 본 기술 분야의 숙련가에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본원에서 "약(about)" 값 또는 파라미터에 대한 지칭은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 구현예를 포함한다 (그리고 기술한다).
본원에 기재된 발명의 양태 및 구현예는 "포함하는(comprising)", "구성되는(consisting) 및 "~로 본질적으로 구성되는"의 양태 및 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "배지" 및 "세포 배양 배지"는 세포의 성장 또는 유지에 사용되는 영양 공급원을 나타낸다. 당해기술의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 영양 공급원은 세포가 성장 및/또는 생존 및/또는 생성물 생성에 필요로 하는 성분을 함유할 수 있거나 세포 성장 및/또는 생존 및/또는 생성물 생성에 도움이 되는 성분을 함유할 수 있다. 비타민, 필수 또는 비-필수 아미노산, 미량 원소 및 계면활성제 (예를 들면, 폴록사머)가 배지 성분의 예이다.
예를 들어, "화학적으로 획정된 세포 배양 배지" 또는 "CDM"은 동물 혈청 및 펩톤과 같은 동물 유래 생성물이 없는 특정 조성을 갖는 배지를 의미한다. 상기 용어는 또한, 획정되지 않거나 부분적으로 획정된 성분, 예를 들어, 동물 혈청, 동물 펩톤 (가수분해물), 식물 펩톤 (가수분해물) 및 효모 펩톤 (가수분해물)이 없는 명시된 조성물을 갖는 배지를 포괄한다. 본 분야의 숙련가에 의하여 이해될 것과 같이, CDM은 폴리펩타이드 생산 공정에서 사용될 수 있으며, 여기서 세포는 CDM과 접촉하고, 이에 폴리펩타이드를 분비한다. 따라서, 조성물은 CDM 및 폴리펩타이드 생성물을 함유할 수 있고, 폴리펩타이드 생성물의 존재는 CDM으로 하여금 화학적으로 비획정되도록 하지 않는다.
"화학적으로 획정되지 않은 세포 배양 배지"는 화학적 조성이 규정될 수 없고 혈청 및 펩톤과 같은 하나 이상의 동물 유래 생성물을 함유할 수 있는 배지를 의미한다. 본 분야의 숙련가에 의하여 이해될 것과 같이, 화학적으로 비획정된 세포 배양 배지는 동물-유도된 산물을 영양 공급원으로서 함유할 수 있다. 상기 용어는 또한 획정되지 않거나 부분적으로 획정된 성분, 예를 들어, 동물 형철, 동물 펩톤 (가수분해물), 식물 펩톤 (가수분해물) 또는 효모 펩톤 (가수분해물)과 같은 성분을 포함하는 세포 배양 배지를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "기본 배지"는 배양 공정의 개시 시에 배양 용기에 공급된 세포 배양 영양소를 함유하는 세포 배양 배지를 의미한다. 기본 배지는 세포가 세포 배양 주기 전에 접종되는 배지일 수 있다. 기본 세포 배양 배지는 뱃치 또는 유가식(fed-batch) 세포 배양을 위한 세포 배양 주기 전에 공급될 수 있다. 기본 세포 배양 배지는 또한 배양 종결 전에 주기 세포 및/또는 생성물 수집의 유무로 배양 공정 동안 세포 배양물에 공급 배지로서 연속적으로 또는 신중한 증분으로 공급할 수 있다(즉, 유가식 세포 배양).
본원에 사용된 바와 같이, "공급 배지"는, 배양 (즉, 유가식 세포 배양) 종결 전에 주기 세포 및/또는 생성물 수집의 존재 또는 부재 하에서 배양 공정 동안 세포 배양물에 공급 배지로서 연속적으로 또는 신중한 증분으로 배양 용기에 공급되는 세포 배양 영양분을 함유하는 세포 배양 배지를 지칭한다
세포의 "배양"은 세포의 생존력 및/또는 성장 및/또는 증식에 적합한 조건 하에 세포를 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 나타낸다.
"뱃치 배양"은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양소 및 성분을 포함)이 배양 과정을 개시할 때 배양 용기에 공급되는 배양법을 나타낸다.
"관류 배양"은, 세포가, 예를 들면, 여과, 캡슐화, 마이크로캐리어로의 앵커링(anchoring) 등에 의해 배양물에 구속되고, 배양 배지는 배양 용기로부터 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고 제거되는 배양법이다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "유가식(fed batch) 세포 배양"은 세포 및 배양 배지가 배양 용기에 초기에 공급되고, 배양 종료 전에 주기적인 세포 및/또는 생성물 수집의 존재 또는 부재 하에 추가의 배양 영양소를 배양 공정 동안 연속적으로 또는 별개의 증분으로 배양물에 공급하는 뱃치 배양법을 나타낸다.
"배양 용기"는 세포를 배양하는데 사용되는 용기를 지칭한다. 배양 용기는 그것이 세포의 배양에 유용하기만 하다면 임의의 크기일 수 있다.
용어 "미량 금속"은 성장, 생존 및/또는 생성물 생성을 위해 세포가 소량으로 필요로 하는 금속을 의미한다. 본원의 정의에 포함되는 미량 금속의 예는 철 (제1철 (또한, Fe (II) 또는 Fe 2+로서 지칭됨) 및 제2철 (또한, Fe (III) 또는 Fe 3+로서 지칭됨), 마그네슘, 리튬, 규소, 아연, 구리, 크로뮴, 니켈, 코발트, 망간, 알루미늄, 바나듐, 셀레늄, 주석, 카드뮴, 몰리브덴 및 티타늄을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "산화방지제"는 다른 분자의 산화 속도를 늦추는 분자를 의미한다. 본원의 정의에 포함되는 산화방지제의 예는 2,3-tert-부틸-4-하이드록시아니솔, 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀, 3-아미노프로판-1-설폰산, 아데노실호모시스틴, 안세린, B-알라닌, B-카로텐, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 카르노신, 카르베딜올, 커큐민, 시스테아민, 시스테아민 하이드로클로라이드, 시스테인, 덱사메타손, 디알릴디설파이드, DL-란티오닌, DL-티오르판, 에톡시퀸, 갈산, 겐티스산 나트륨 염 수화물, 글루타티온 (GSH), 글루타티온 디설파이드, 글루타티온 환원된 에틸 에스테르, 글라이신, 하이드로코르티손, 하이포타우린, 이세티온산 암모늄 염, L-시스틴-글루타티온 디설파이드, L-시스테인설핀산 일수화물, 리포산, 환원된 리포산, 머캅토프로피오닐 글라이신, 메티오닌, 메틸렌비스(3-티오프로피온산), 옥살산, 쿠에르세트린 수화물, 레스베라트롤, 레티노산, S-카복시메틸-L-시스테인, 셀레늄, 셀레노메티오닌, 은 디에틸디티오카바메이트, 타우린, 티오락트산, 트리신, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B4, 비타민 B5, 비타민 B6, 및 비타민 B11을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 폴리머에 편입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 이전 또는 이후 부여될 수 있다.
"단리된 핵산"은 이의 통상적인 문맥 이외의 것 또는 이와 개별적인 비-천연 발생, 재조합, 또는 천연 발생 서열을 의미하고, 포괄한다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정 이외의 것이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 이것이 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나 단리된 핵산 분자에는, 예를 들면 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 있는, 단백질을 대개 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.
"단리된" 단백질 (예를 들어, 단리된 항체)는 이의 자연 환경의 성분으로부터 식별 및 분리되고/되거나 회수된 것이다. 그 천연 환경의 오염물질 성분은 단백질에 대한 연구, 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 단리된 단백질은 재조합 세포 내에서 동일계내로 단백질을 포함하는데, 이는 단백질의 자연 환경의 최소한 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나 일반적으로, 단리된 단백질은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"정제된" 단백질 (예컨대, 항체)는, 단백질의 순도가 증가되어, 이로써 이것이 천연 환경 및/또는 실험실 조건 하에서 초기 생산되고/되거나 합성되고/되거나 증폭될 경우에서 존재하는 것보다 더욱 순수한 형태로 존재한다는 것을 의미한다. 순도는 상대적인 용어이며, 절대적인 순도를 필연적으로 의미하지 않는다.
"오염물"은 목적하는 단백질 생성물과 상이한(예: 항체 생성물과 상이한) 물질을 의미한다. 불순물은 비제한적으로 하기를 포함할 수 있다: 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 핵산; 목적 단백질의 변이체, 단편, 응집물 또는 유도체; 또 다른 폴리펩타이드; 내독소; 바이러스 오염물질; 세포 배양 배지 성분, 등.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 나타내는데 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 이는 비-아미노산에 의하여 저해될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 처치(intervention); 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어, 표지화 성분을 사용한 콘주게이트에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 예를 들면, 아미노산 (예를 들면, 비천연 아미노산 등 포함)의 하나 이상의 유사체, 뿐만 아니라 당해기술에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩타이드가 또한 상기 정의내에 포함된다. 본원의 정의 내에서 포괄된 폴리펩타이드의 예는 포유동물 단백질, 예를 들면, 예컨대 하기를 포함한다: 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항-응고 인자 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화에 대해 조절된 일반적으로 T-세포 발현된 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관 억제 물질(Muellerian-inhibiting substance); 릴락신 A-사슬; 릴락신 B-사슬; 프로릴락신; 마우스 성선자극호르몬-관련된 펩타이드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련된 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양 인자 예컨대 골-유도된 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자 예컨대 NGF-b; 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는, 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 인터페론 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 과산화물제거효소; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들면, AIDS 봉입체의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 인테그린 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련된 항원, 예컨대 0772P (CA125, MUC16) (예를 들어, 난소암 항원) 또는 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 면역접합체; 및 임의의 상기-열거된 단백질의 단편 및/또는 변이체 뿐만 아니라, 예를 들면, 임의의 상기-열거된 단백질을 포함하는 단백질에 결합하는, 항체 단편을 포함하는 항체.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "역가"는 세포 배양에 의하여 생산된 발현된 단백질 생성물의 총량을 주어진 양의 배지 용적으로 나눈 수치를 나타낸다. 역가는 상이한 배양 조건 하에 단백질 생성물을 수득하는 것과 비교하여 역가에서의 증가율과 같이, 상대적 측정치의 측면에서 표현되거나 평가될 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로는 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 항체 단편을 포함한다. 항체는 인간, 인간화된 및/또는 친화성 성숙된(affinity matured) 항체일 수 있다.
본원에서 사용된 용어들 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 상호교환적으로 아래에서 정의된 바와 같이 항체 단편이 아닌 그 실질적으로 무손상 형태의 항체를 나타낸다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 그것의 항원 결합 영역 (용어 "항원-결합 단편"이 상호교환적으로 사용될 수 있다)을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2 개의 동일한 항원-결합 단편 및 그 명칭이 쉽게 결정화하는 그 능력을 반영하는 잔여 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편을 산출하는데, 이것은 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원을 여전히 가교결합할 수 있다. Fab 단편은 중쇄- 및 경쇄 가변 도메인을 함유하며, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 초과의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 첨가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab’-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올기를 갖는 Fab’에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 구현예에서, 2개의 사슬 Fv 종은 단단하게 비공유 결합된 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이합체로 구성된다. 단일-쇄 Fv(scFv) 종에서, 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 비슷한 "이량체" 구조로 결합할 수 있도록 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유 결합될 수 있다. 이 구조 내에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 부위를 정의한다. 총괄적으로, 6 개의 HVR은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위에 비해 더 낮은 친화도에서지만, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3 개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하며, 그것은 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 재고를 위해, 예를 들어, 하기를 참고한다:
Figure pct00001
, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994.
용어 "단클론성 항체"는 본원에서 사용된 바와 같이 실질적으로 균질한 항체 집단에서 수득된 항체를 지칭하며, 예컨대 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 가능한 돌연변이, 예를 들면 소량으로 존재할 수 있는 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 구별된 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 표지한다. 특정 구현예에서, 그와 같은 단클론성 항체에는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체가 포함되며, 여기서 상기 표적 결합 폴리펩타이드 서열은 복수의 폴리펩타이드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩타이드 서열의 선택이 포함되는 방법에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선택 방법은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파아지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터의 독특한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열이, 예를 들면 표적에 대한 친화도를 향상하기 위해, 표적 결합 서열을 인간화하기 위해, 세포 배양에서 그 생성을 향상하기 위해, 생체내 그 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이적 항체를 생성하기 위해 등등 추가 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 단클론성 항체라는 것이 이해되어야 한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체가 포함되는 다클론성 항체 제조물과는 대조적으로, 단클론성-항체 제조물의 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지향된다. 이들의 특이성에 부가하여, 단클론성-항체 제조물은 이들이 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 시사하며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는, 하기를 포함하는 다양한 기술에 의하여 작제될 수 있다: 예를 들면 하이브리도마 방법 (예컨대, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (참고: 예컨대, 미국 특허 번호 4,816,567); 파지-디스플레이 기술 (참고: 예컨대, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004), 및 인간 면역글로불린 유전자좌(locus) 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (참고: 예를 들면, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol . 7:33 (1993); 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol . 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol . 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13: 65-93 (1995)).
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체에 대응하고/하거나 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 이용해서 제조된 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용해서 생성될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581 (1991). 또한 인간 단클론성 항체의 제조를 위해 하기에 기재된 방법이 이용 가능하다: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991). 또한 하기를 참고한다: van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol ., 5: 368-74 (2001). 인간 항체는 항원 유발에 반응하여 상기 항체를 생성하기 위해 개질되었지만, 이의 내인성 유전자위가 불활성화된 형질전환(transgenic) 동물, 예를 들면 면역화된 제노마우스(예를 들면, 참고: XENOMOUSE™ 기술에 관한 미국 특허 6,075,181 및 6,150,584)에 항원을 투여함에 의하여 제조될 수 있다. 또한 예를 들어, 하기를 참고한다: Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 103:3557-3562 (2006) (인간 B-세포 혼성세포 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관함).
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 획정된 루프를 형성하는 항체-가변 도메인 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개 HVR의 가장 큰 다양성을 나타내며, H3은 특히 항체에 대해 미세한 특이성을 부여하는데 있어서 독특한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. 하기를 참고한다: 예를 들면, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003). 사실상, 중쇄만으로 구성된 천연 발생 낙타과(camelid) 항체는 경쇄의 부재 하에서 작용적이고 무변성이다. 하기를 참고한다: 예를 들면, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct . Biol . 3:733-736 (1996).
수많은 HVR 묘사가 사용되며, 본원에서 포괄된다. 카밧 상보성-결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기반하며, 가장 일반적으로 사용된다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 초티아는 대신에, 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카밧 CDR 및 초티아 구조적 루프 간 절충을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체-모델링 소프트웨어에 의해 이용된다. "접촉" HVR은 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기반한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기가 아래에 주지된다.
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HVR은 하기와 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) (VL 중) 및 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3) (VH 중). 초가변 도메인 잔기들은 이들 정의의 각각에 대해 문헌(Kabat et al., 상기)에 따라 넘버링한다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같이 HVR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.
용어 "카밧에서의 가변-도메인 잔기-넘버링" 또는 "카밧에서의 아미노산-위치 넘버링" 및 이들의 변형은 [Kabat et al.,상기]에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대하여 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 상기 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 대응하는 더 적거나 더 많은 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인에는 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들면, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)가 포함될 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 항체의 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
카밧 넘버링 시스템은 가변 도메인 내 잔기(대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)에 대해 언급할 때 일반적으로 사용된다(예를 들면, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수" 는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 경우 사용된다 (예컨대, 상기 Kabat et al. 에 보고된 EU 지수). "카밧으로의 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 피험체에 허용 불가능하게 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제조물을 나타낸다. 그러한 제형은 무균성일 수 있다.
"약제학적으로 허용가능한" 담체, 부형제, 또는 안정제는, 이용된 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성인 것이다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). 생리학적으로 허용가능한 담체는, 종종, 수성 pH 완충액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어, EDTA; 당 알콜, 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 Tween™, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 및 Pluronics™ 을 포함한다.
"멸균" 제형은 무균이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 없거나 본질적으로 없다.
용어 "수집 전 세포 배양 유체"은 세포 배양 말기, 세포 배양 후 또는 세포 수집 직전에 존재하는 유체를 의미한다. 수집-전 세포 배양 유체에는, 비제한적으로, 본 발명의 하나 이상의 제제가 선택적으로 첨가된 세포 배지가 포함된다. 수집 전 세포 배양 유체는 세포, 세포의 내용물 및/또는 세포 파편이 제거되지 않은 세포 배양 배지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 세포 배지 및/또는 수집-전 세포 배양 유체는 배양 중에 세포에 의해 배지 또는 용액에 방출되는(예를 들어, 분비되는) 단백질 또는 항체를 함유할 수 있다. 세포 배양 유체를 위한 조건은 세포 성장을 위해 최적화되는 반면, 수집 전 및 수집세포 배양 유체는 예비 처리되어 숙주 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드(예: 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체)의 세포 분리 및 정제를 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수집 전 단계는 온도를 낮추고, pH를 변화시키고(일반적으로, 약 5의 pH로 또는 약 7 미만의 pH로 낮춤) 및 응집에 의해 수집를 위한 배양물의 제조를 포함할 수 있다. 수집-전 단계는 세포 배양 유체가 배양되는 생물반응기에서 수집 단계를 위한 원심분리기 또는 여과기로 직접 펌프될 수 있기에, 선택적일 수 있다. 수집 전에 전처리가 적용되지 않는 경우, 수집 전 세포 배양 유체와 세포 배양 유체는 구별할 수 없다.
"수집된 세포 배양 유체"는 세포 분리 공정 중에, 그리고 원심분리 또는 여과와 같은 방법을 통해 세포 배양 배지에서 세포를 분리한 후 존재하는 유체를 가리킨다. 수집된 세포 배양 유체는 전형적으로 세포 배양 동안 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드(예: 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체)를 포함한다.
B.본 발명의 세포 배양 및 방법
폴리펩타이드에서 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법
트리설파이드 결합은 디설파이드 결합 속으로 추가의 황 원자의 삽입에 의해 생성되고, 그렇게 함으로써 3개 연속적인 황 원자의 공유 결합을 유발한다. 트리설파이드 결합은 폴리펩타이드 내 시스테인 잔기 사이에서 형성할 수 있고 그리고 분자내로 (즉, 동일한 폴리펩타이드 내 2개 시스테인 사이에서) 또는 분자간으로 (즉 독립한 폴리펩타이드 내 2개 시스테인 사이에서) 형성할 수 있다. 세포 배양 동안 폴리펩타이드에서 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 본원에 제공된다. 세포 배양 후 처리 동안 폴리펩타이드에서 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원의 방법은 유리하게는 제조 규모와 같은 폴리펩타이드(예: 항체)를 함유하는 디설파이드 결합의 대규모 생산에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는, 예를 들어, 세포 성장 및/또는 폴리펩타이드 생산을 촉진시키는 조건하에 본원에 기재된 임의의 세포 배양 배지(예: 기본 세포 배양 배지)와 조합된다(접촉된다). 특정 구현예에서, 용어 "접종물"은 기본 배지에 첨가하기 위한 종자 트레인으로부터의 숙주 세포의 용적을 의미한다. 특정 구현예에서, 접종물은 추가의 성분, 예를 들어, 시드 트레인 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 용어 "초기 세포 배양 배지"는, 접종물 및 기본 배지가 혼합된 후의, 세포 배양 배지를 지칭한다. 특정 구현예에서, 접종물 및 기본 배지는 대략 1:5, 1:4.5, 1:4, 1:3.5, 또는 1:3 (상기 사이의 임의의 비율을 포함) 중 어느 것의 비율로 혼합된다. 특정 구현예에서, 추가의 성분은 접종 후 일정 시간에 연속적으로 또는 하나 이상의 이산 간격으로 배양물에 제공되고, 기본 배지와 혼합한다. 특정 구현예에서, 용어 "누적(cumulative)"은 세포 배양 초기에 첨가된 성분 및 이어서 세포에 의한 소비 또는 생성을 고려하지 않고 첨가된 성분을 포함하여 세포 배양 동안 첨가된 특정 성분 또는 성분들의 총량을 의미한다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기를 포함한다: 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 기본 배지와 접촉시키는 단계로서, 상기 기본 배지가 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 접촉 단계:
i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철,
ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2),
iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6),
iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9),
v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12),
vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및
vii) 약 0 내지 약 1.58 mM 메티오닌;
상기 숙주 세포를 배양하여 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하여, 이로써 상기 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준이 감소되도록 하는 단계. 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드는, 하나 이상의 성분의 농도가 상기 명시된 농도와 다르다는 것을 제외하고, 동일한 조건 하에서 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준 미만인 트리설파이드 결합 수준을 갖는다. 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드 내 평균 트리설파이드 결합%는 하기 중 어느 것 미만이다: 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% (mol 트리설파이드/mol 폴리펩타이드). 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드 내 평균 트리설파이드는, 하나 이상의 성분의 농도가 상기 명시된 농도와 다르다는 것을 제외하고, 동일한 조건 하에서 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준과 비교하여, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과 중 어느 것만큼 감소된다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기를 포함한다: 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 기본 배지와 접촉시키는 단계로서, 상기 기본 배지가 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 접촉 단계:
i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철,
ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2),
iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6),
iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9),
v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12),
vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및
vii) 약 0 내지 약 1.58 mM 메티오닌;
상기 숙주 세포를 배양하여 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하여, 이로써 상기 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준이 감소되도록 하는 단계. 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드는, 하나 이상의 성분의 농도가 상기 명시된 농도와 다르다는 것을 제외하고, 동일한 조건 하에서 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준 미만인 트리설파이드 결합 수준을 갖는다. 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드 내 평균 트리설파이드%는 하기 중 어느 것 미만이다: 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% (mol 트리설파이드/mol 폴리펩타이드). 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드 내 평균 트리설파이드는, 하나 이상의 성분의 농도가 상기 명시된 농도와 다르다는 것을 제외하고, 동일한 조건 하에서 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준과 비교하여, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과 중 어느 것만큼 감소된다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 이는 하기를 포함한다: 세포 배양 배지 내 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 배양 단계:
i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철,
ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2),
iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6),
iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9),
v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12),
vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및
vii) 약 0 내지 약 4.5 mM 메티오닌;
상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하는 단계. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 내 성분 중 하나 이상의 농도는 접종 후 1회 이상의 첨가의 누적 농도이다.
특정 구현예에서, CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체, 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기를 포함한다: 세포 배양 배지 내 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 배양 단계:
i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철,
ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2),
iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6),
iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9),
v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12),
vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및
vii) 약 0 내지 약 4.5 mM 메티오닌;
상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하여, 이로써 상기 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준이 감소되도록 하는 단계. 특정 구현예에서, CEA-IL2v 면역사이토카인은 RG7813이다. 특정 구현예에서, FAP-IL2v 면역사이토카인은 RG7461이다. 특정 구현예에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 RG7802이다. 특정 구현예에서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체는 RG7716이다. 특정 구현예에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 RG7221이다. 특정 구현예에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 CAS 번호 1448221-05-3이다. 특정 구현예에서, 항-CD40 항체는 RG7876이다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지, 세포 배양 배지는 초기 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드는, 하나 이상의 성분의 농도가 상기 명시된 농도와 다르다는 것을 제외하고, 동일한 조건 하에서 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준 미만인 트리설파이드 결합 수준을 갖는다. 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드 내 평균 트리설파이드%는 하기 중 어느 것 미만이다: 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% (mol 트리설파이드/mol 폴리펩타이드). 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드 내 평균 트리설파이드는, 하나 이상의 성분의 농도가 상기 명시된 농도와 다르다는 것을 제외하고, 동일한 조건 하에서 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준과 비교하여, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과 중 어느 것만큼 감소된다.
특정 구현예에서, CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체, 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기를 포함한다: 세포 배양 배지 내 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 상기 배양 단계:
i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철, 및
ii) 약 0 내지 약 4.5 mM 메티오닌;
상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드를 수집하여, 이로써 상기 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준이 감소되도록 하는 단계. 특정 구현예에서, CEA-IL2v 면역사이토카인은 RG7813이다. 특정 구현예에서, FAP-IL2v 면역사이토카인은 RG7461이다. 특정 구현예에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 RG7802이다. 특정 구현예에서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체는 RG7716이다. 특정 구현예에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 RG7221이다. 특정 구현예에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 CAS 번호 1448221-05-3이다. 특정 구현예에서, 항-CD40 항체는 RG7876이다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지, 세포 배양 배지는 초기 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드는, 하나 이상의 성분의 농도가 상기 명시된 농도와 다르다는 것을 제외하고, 동일한 조건 하에서 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준 미만인 트리설파이드 결합 수준을 갖는다. 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드 내 평균 트리설파이드%는 하기 중 어느 것 미만이다: 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% (mol 트리설파이드/mol 폴리펩타이드). 특정 구현예에서, 수집된 폴리펩타이드 내 평균 트리설파이드는, 하나 이상의 성분의 농도가 상기 명시된 농도와 다르다는 것을 제외하고, 동일한 조건 하에서 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준과 비교하여, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 초과 중 어느 것만큼 감소된다.
특정 구현예에서, CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체, 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한, 세포 배양 배지 내 약 0 내지 약 4.5 μM 메티오닌의 용도가 제공된다. 특정 구현예에서, CEA-IL2v 면역사이토카인은 RG7813이다. 특정 구현예에서, FAP-IL2v 면역사이토카인은 RG7461이다. 특정 구현예에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 RG7802이다. 특정 구현예에서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체는 RG7716이다. 특정 구현예에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 RG7221이다. 특정 구현예에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 Cas 번호 1448221-05-3이다. 특정 구현예에서, 항-CD40 항체는 RG7876이다.
특정 구현예에서, 기본 배지는, 약 5μM 내지 약 30μM, 약 10 μM 내지 약 25μM, 또는 약 15μM 내지 약 20μM 철 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지는 약 2 μM, 4 μM, 6 μM, 10μM, 12 μM, 14 μM, 16 μM, 18 μM, 20 μM, 22 μM, 24 μM, 26 μM, 28 μM, 30 μM, 35μM 철 (상기 사이의 어느 값을 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지 내 철 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 황산철(II), 황산철(III), 철(II) 시트레이트, 철(III) 시트레이트, 황산암모늄철(II) 6수화물, 황산철(III) 수화물, 황산암모늄철(III) 12수화물, 황산철(II) 7수화물, 질산철(III) 9수화물, 암모늄 철(III) 시트레이트, 철(III) 타르트레이트, 철(II) 락테이트 수화물, 철(III) 옥살레이트 6수화물, 철(II) 옥살레이트 2수화물, 철(III) 트리플루오로아세틸아세토네이트, 철(II) 푸마레이트, 암모늄 철(III) 옥살레이트 3수화물, 철(II) 글루코네이트 수화물, 철(II) D-글루코네이트 2수화물, (+)-철(II) L-아스코르베이트.
특정 구현예에서, 세포 배양 배지는, 약 5μM 내지 약 30μM, 약 10 μM 내지 약 25μM, 또는 약 15μM 내지 약 20μM 철 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 2 μM, 4 μM, 6 μM, 10μM, 12 μM, 14 μM, 16 μM, 18 μM, 20 μM, 22 μM, 24 μM, 26 μM, 28 μM, 30 μM, 35μM 철 (상기 사이의 어느 값을 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 내 철 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 황산철(II), 황산철(III), 철(II) 시트레이트, 철(III) 시트레이트, 황산암모늄철(II) 6수화물, 황산철(III) 수화물, 황산암모늄철(III) 12수화물, 황산철(II) 7수화물, 질산철(III) 9수화물, 암모늄 철(III) 시트레이트, 철(III) 타르트레이트, 철(II) 락테이트 수화물, 철(III) 옥살레이트 6수화물, 철(II) 옥살레이트 2수화물, 철(III) 트리플루오로아세틸아세토네이트, 철(II) 푸마레이트, 암모늄 철(III) 옥살레이트 3수화물, 철(II) 글루코네이트 수화물, 철(II) D-글루코네이트 2수화물, (+)-철(II) L-아스코르베이트. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다.
특정 구현예에서, 기본 배지는, 약 0.15μM 내지 약 1.5μM, 약 0.3 μM 내지 약 1.0μM, 또는 약 0.3 μM 내지 약 0.75 μM 비타민 B2 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지는 약 0.11 μM, 0.2 μM, 0.4 μM, 0.6 μM, 0.8 μM, 1.0 μM, 1.2 μM, 1.4 μM, 1.6 μM, 1.8 μM, 또는 2μM 리보플라빈 (비타민 B2) (상기 사이의 어느 값을 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지 내 비타민 B2 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 리보플라빈 분말 (9, D-리비톨 6,7 디메틸 이소알록사진), 리보플라빈 5’-모노포스페이트, 또는 리보플라빈 5’-모노포스페이트의 나트륨 염 형태.
특정 구현예에서, 세포 배양 배지는, 약 0.15μM 내지 약 1.5μM, 약 0.3 μM 내지 약 1.0μM, 또는 약 0.3 μM 내지 약 0.75 μM 비타민 B2 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 0.11 μM, 0.2 μM, 0.4 μM, 0.6 μM, 0.8 μM, 1.0 μM, 1.2 μM, 1.4 μM, 1.6 μM, 1.8 μM, 또는 2μM 리보플라빈 (비타민 B2) (상기 사이의 어느 값을 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지 내 비타민 B2 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 리보플라빈 분말 (9, D-리비톨 6,7 디메틸 이소알록사진), 리보플라빈 5’-모노포스페이트, 또는 리보플라빈 5’-모노포스페이트의 나트륨 염 형태. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다.
특정 구현예에서, 기본 배지는, 약 1.5μM 내지 약 75μM, 약 5 μM 내지 약 50 μM, 또는 약 25 μM 내지 약 40 μM 비타민 B6 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지는 약 4.5 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 50μM, 55 μM, 60 μM, 65 μM, 70 μM, 75 μM 또는 80 μM 비타민 B6 (상기 사이의 어느 값을 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지 내 비타민 B6 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 피리독신, 피리독신 1수화염화물, 피리독살, 피리독살 1수화염화물, 피리독살 5’-포스페이트, 피리독사민, 피리독사민 2수화염화물, 피리독사민 5-포스페이트, 피리티놀, 4-피리독신산.
특정 구현예에서, 세포 배양 배지는, 약 1.5μM 내지 약 75μM, 약 5 μM 내지 약 50 μM, 또는 약 25 μM 내지 약 40 μM 비타민 B6 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 4.5 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 50μM, 55 μM, 60 μM, 65 μM, 70 μM, 75 μM 또는 80 μM 비타민 B6 (상기 사이의 어느 값을 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 내 비타민 B6 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 피리독신, 피리독신 1수화염화물, 피리독살, 피리독살 1수화염화물, 피리독살 5’-포스페이트, 피리독사민, 피리독사민 2수화염화물, 피리독사민 5-포스페이트, 피리티놀, 4-피리독신산. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다.
특정 구현예에서, 기본 배지는, 약 5μM 내지 약 20μM, 약 7 μM 내지 약 15 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 12 μM 비타민 B9 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지는, 약 3.4 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 20μM, 또는 23 μM 비타민 B9 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지 내 비타민 B9 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 엽산, 엽산 분말, 폴리닌산 칼슘 염, 테트라하이드로폴레이트, 또는 4-아미노벤조산 또는 파라-아미노벤조산 (PABA).
특정 구현예에서, 세포 배양 배지는, 약 5μM 내지 약 20μM, 약 7 μM 내지 약 15 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 12 μM 비타민 B9 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는, 약 3.4 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM, 20μM, 또는 23 μM 비타민 B9 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 내 비타민 B9 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 엽산, 폴리닌산 칼슘 염, 테트라하이드로폴레이트, 또는 4-아미노벤조산 또는 파라-아미노벤조산 (PABA). 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다.
특정 구현예에서, 기본 배지는, 약 0.5μM 내지 약 2.0μM, 약 1 μM 내지 약 1.7 μM, 또는 약 1.2 μM 내지 약 1.5 μM 비타민 B12 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지는 약 0.2 μM, 0.4 μM, 0.6 μM, 0.8 μM, 1.0 μM, 1.2 μM, 1.4 μM, 1.6 μM, 1.8 μM, 2.0μM, 2.2 μM, 2.4 μM, 및 2.5 μM 비타민 B12 (상기 사이의 어느 값을 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지 내 비타민 B12 공급원은, 시아노코발라민 및 하이드록소코발라민 중 어느 것 또는 조합물이다.
특정 구현예에서, 세포 배양 배지는, 약 0.5μM 내지 약 2.0μM, 약 1 μM 내지 약 1.7 μM, 또는 약 1.2 μM 내지 약 1.5 μM 비타민 B12 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 0.2 μM, 0.4 μM, 0.6 μM, 0.8 μM, 1.0 μM, 1.2 μM, 1.4 μM, 1.6 μM, 1.8 μM, 2.0μM, 2.2 μM, 2.4 μM, 및 2.5 μM 비타민 B12 (상기 사이의 어느 값을 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 내 비타민 B12 공급원은, 시아노코발라민 및 하이드록소코발라민 중 어느 것 또는 조합물이다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다.
특정 구현예에서, 기본 배지는 약 2.0 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 7 mM 내지 약 20 mM, 약 8 mM 내지 약 15 mM, 약 9.2 mM 내지 약 9.8 mM, 약 9.4 mM 내지 약 9.6 mM, 또는 약 9.5 mM 하이포타우린 (상기 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지는 약 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 9 mM, 9.2 mM, 9.4 mM, 9.6 mM, 9.8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 및 40 mM 하이포타우린 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지 중 하이포타우린 공급원은 하이포타우린 분말이다.
특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 2.0 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 7 mM 내지 약 20 mM, 약 8 mM 내지 약 15 mM, 약 9.2 mM 내지 약 9.8 mM, 약 9.4 mM 내지 약 9.6 mM, 또는 약 9.5 mM 하이포타우린 (상기 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 9 mM, 9.2 mM, 9.4 mM, 9.6 mM, 9.8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 및 40 mM 하이포타우린 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 중 하이포타우린 공급원은 하이포타우린 분말이다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다.
특정 구현예에서, 기본 배지는, 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.75 mM 내지 약 1.25 mM, 또는 약 1.0 mM 메티오닌 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지는 하기를 포함한다: 약 0 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM, 1.0 mM, 1.25 mM, 1.5 mM, 또는 1.58 mM 메티오닌 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것. 특정 구현예에서, 기본 배지 내 메티오닌 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 메티오닌 분말, L-메티오닌, DL-메티오닌,　L-메티오닌 하이드로클로라이드 용액,　N-아세틸-L-메티오닌,　N-아세틸-D,L-메티오닌,　L-메티오닌 메틸 에스테르 하이드로클로라이드,　S-(5′-아데노실)-L-메티오닌 클로라이드 2수화염화물,　및 S-(5′-아데노실)-L-메티오닌 아이오다이드.
특정 구현예에서, 세포 배양 배지는, 약 0.5 mM 내지 약 4.0 mM, 약 1.5 mM 내지 약 3 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 2.5 mM 메티오닌 (상기 값들 사이의 임의의 범위 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 0 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM, 1.0 mM, 1.25 mM, 1.5 mM, 1.75 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, 2.5 mM, 2.75 mM, 3.0 mM, 3.25 mM, 3.5 mM, 3.75 mM, 4.0 mM, 4.25 mM, 또는 4.5 mM 메티오닌 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 내 메티오닌 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: 메티오닌 분말, L-메티오닌, DL-메티오닌,　L-메티오닌 하이드로클로라이드 용액,　N-아세틸-L-메티오닌,　N-아세틸-D,L-메티오닌,　L-메티오닌 메틸 에스테르 하이드로클로라이드,　S-(5′-아데노실)-L-메티오닌 클로라이드 2수화염화물,　및 S-(5′-아데노실)-L-메티오닌 아이오다이드. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다.
특정 구현예에서, 기본 배지는 시스틴은 부재하다.
특정 구현예에서, 기본 배지는 하기를 함유한다: 약 1.4 mM 내지 약 3.0 mM 시스테인 또는 시스틴 (예컨대 약 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 또는 3.0 mM 시스테인 또는 시스틴 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것). 특정 구현예에서, 기본 배지 내 시스테인 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: L-시스테인 및 L-시스테인 1수화염화물 1수화물 분말. 특정 구현예에서, 기본 배지 내 시스틴 공급원은 시스틴 2나트륨 염 1수화물 분말이다.
특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 하기를 함유한다: 약 1.4 mM 내지 약 3.0 mM 시스테인 또는 시스틴 (예컨대 약 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 또는 3.0 mM 시스테인 또는 시스틴 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것). 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 내 시스테인 공급원은 하기 중 어느 것 또는 조합물이다: L-시스테인 및 L-시스테인 1수화염화물 1수화물 분말. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지 내 시스틴 공급원은 시스틴 2나트륨 염 1수화물 분말이다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다.
특정 구현예에서, 기본 배지는 하기를 포함한다: 약 0 mM 내지 약 1.58 mM 메티오닌 (예컨대 약 0 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM, 1 mM, 1.25 mM, 또는 1.58 mM 메티오닌 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것). 특정 구현예에서, 기본 배지는 약 0 mM 내지 약 3.0 mM 시스테인 (예컨대 약 0 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1.0 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 또는 3.0 mM 시스테인 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것)을 포함한다. 특정 구현예에서, 기본 배지는 하기를 포함한다: 약 0 mM 내지 약 1.58 mM 메티오닌 (예컨대 약 0 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM, 1 mM, 1.25 mM, 또는 1.58 mM 메티오닌 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것) 및 약 0 mM 내지 약 3.0 mM 시스테인 (예컨대 약 0 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1.0 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 또는 3.0 mM 시스테인 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것).
특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 하기를 포함한다: 약 0 mM 내지 약 1.58 mM 메티오닌 (예컨대 약 0 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM, 1 mM, 1.25 mM, 또는 1.58 mM 메티오닌 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것). 특정 구현예에서, 세포 배양물은 약 0 mM 내지 약 3.0 mM 시스테인 (예컨대 약 0 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1.0 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 또는 3.0 mM 시스테인 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것)을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 하기를 포함한다: 약 0 mM 내지 약 1.58 mM 메티오닌 (예컨대 약 0 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM, 1 mM, 1.25 mM, 또는 1.58 mM 메티오닌 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것) 및 약 0 mM 내지 약 3.0 mM 시스테인 (예컨대 약 0 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1.0 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 또는 3.0 mM 시스테인 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것). 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 공급 배지 (예컨대 뱃치 공급 배지)를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 농축된 영양소 혼합물("뱃치 공급물")을 하나 이상의 증분으로 숙주 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 뱃치 공급 배지에는 철 (Fe, 예컨대 Fe (II) 및/또는 Fe (III))이 부재하다. 특정 구현예에서, 뱃치 공급물에는 하기 중 하나 이상이 부재하다: 리보플라빈 (비타민 B2), 피리독신 (비타민 B6), 피리독살 (비타민 B6), 폴레이트/엽산 (비타민 B9) 및 시아노코발민 (비타민 B12). 특정 구현예에서, 뱃치 공급물에는 리보플라빈 리보플라빈 (비타민 B2), 피리독신 (비타민 B6), 피리독살 (비타민 B6), 엽산 (비타민 B9) 및 시아노코발민 (비타민 B120)이 부재하다. 특정 구현예에서, 뱃치 공급물에는 철 (Fe, 예컨대 Fe (II) 및/또는 Fe (III) 및 하기 중 하나 이상이 부재하다: 리보플라빈 리보플라빈 (비타민 B2), 피리독신 (비타민 B6), 피리독살 (비타민 B6), 엽산 (비타민 B9) 및 시아노코발민 (비타민 B12). 특정 구현예에서, 뱃치 공급물에는 철 (Fe, 예컨대 Fe (II) 및/또는 Fe (III) 리보플라빈 리보플라빈 (비타민 B2), 피리독신 (비타민 B6), 피리독살 (비타민 B6), 엽산 (비타민 B9) 및 시아노코발민 (비타민 B12)이 부재하다. 특정 구현예에서, 뱃치 공급 배지에는 시스틴이 부재하다. 특정 구현예에서, 뱃치 공급 배지에는 시스테인이 부재하다. 특정 구현예에서, 뱃치 공급 배지에는 메티오닌이 부재하다. 특정 구현예에서, 뱃치 공급 배지에는 시스테인 및 메티오닌이 부재하다. 특정 구현예에서, 뱃치 공급 배지에는 시스테인, 시스틴, 및 메티오닌이 부재하다.
특정 구현예에서, 상기 방법은, 숙주 세포의 배양물 또는 세포 배양 유체, 숙주 세포의 수집-전 세포 배양 유체 (PHCCF), 또는 숙주 세포의 수집된 세포 배양 유체 (HCCF)에 킬레이트제 및 환원제를 보충하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드 내 트리설파이드 결합의 수준을 감소시키기 위한 방법이 본원에 제공되며, 이는 상기 숙주 세포의 배양물 또는 세포 배양 유체, 상기 숙주 세포의 수집-전 세포 배양 유체 (PHCCF), 또는 상기 숙주 세포의 수집된 세포 배양 유체 (HCCF)에 킬레이트제 및 환원제를 보충하여, 이로써 폴리펩타이드 내 트리설파이드 결합의 수준이 감소되도록 하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 킬레이트제 및 환원제는, 수집으로부터 약 4.5 시간, 4.0 시간, 3.5 시간, 3.0 시간, 2.5 시간, 2.0 시간, 1.5 시간, 1.0 시간 이전 또는 0.5 시간 이전 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것에서 배양물에 첨가된다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 및 환원제를 수집 시 배양물에 첨가한다.
특정 구현예에서, 킬레이트제는 환원제에 앞서 상기 숙주 세포의 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF, 또는 HCCF에 첨가한다. 특정 구현예에서, 킬레이트제는, 킬레이트제 첨가로부터 약 60분, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 또는 30분 이전 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것에서 숙주 세포의 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF, 또는 HCCF에 첨가된다.
특정 구현예에서, 환원제는 킬레이트제에 앞서 상기 숙주 세포의 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF, 또는 HCCF에 첨가한다.
특정 구현예에서, 킬레이트제 및 환원제는 상기 숙주 세포의 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF, 또는 HCCF에 동시에 첨가된다.
특정 구현예에서, 킬레이트제 및 환원제는 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF 또는 HCCF에 첨가되며, 그리고 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF 또는 HCCF는 약 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 또는 37℃ (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 온도에서 유지된다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 및 환원제는 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF 또는 HCCF에 첨가되며, 그리고 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF 또는 HCCF는 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 pH에서 유지된다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 및 환원제는 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF 또는 HCCF에 첨가되며, 그리고 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF 또는 HCCF는 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 또는 30% (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 DO (용존 산소)%에서 유지된다. 특정 구현예에서, HCCF는 약 31%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것을 포함하는, 약 30% 이상의 % DO(용해된 산소)로 유지시킨다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 및 환원제는 배양물, 세포 배양 유체 또는 PHCCF에 첨가하고, 배양물, 세포 배양 유체 또는 PHCCF는 약 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃ 또는 37℃ (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 온도에서, 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 pH에서, 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% 또는 30% (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 % DO(용해된 산소)에서 유지시킨다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 및 환원제를 HCCF에 첨가하였고, 그리고 HCCF를 약 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃ 또는 37℃ (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 온도에서, 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5 (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 pH에서, 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 및 100% (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 % DO(용해된 산소)에서 유지시켰다.
특정 구현예에서, 킬레이트제는 다음 중의 어느 것 또는 조합물이다: 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민-N,N'-디석신산 (EDDS), 시트레이트, 옥살레이트, 타르트레이트, 에틸렌-비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산 (EGTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 5-설포살리실산, N,N-디메틸도데실아민 N-옥사이드, 디티오옥사마이드, 에틸렌디아민, 살리실알독심, N-(2’-하이드록시에틸)이미노디아세트산(HIMDA), 옥신 퀴놀린올 및 설폭신. 특정 구현예에서, 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민-N,N'-디석신산 (EDDS), 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민-N,N'-디석신산 (EDDS), 또는 시트레이트는, 숙주 세포의 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF, 또는 HCCF에 첨가되어 20 mM의 최종 농도를 달성하도록 한다.
특정 구현예에서, 환원제는 다음 중의 어느 것 또는 조합물이다: 글루타티온 (GSH), L-글루타티온 (L-GSH), 시스테인, L-시스테인, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP), 2,3-tert-부틸-4-하이드록시아니솔, 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀, 3-아미노프로판-1-설폰산, 아데노실호모시스테인, 안세린, B-알라닌, B-카로텐, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 카르노신, 카르베딜롤, 커큐민, 시스테아민, 시스테아민 하이드로클로라이드, 덱사메타손, 디알릴디설파이드, DL-란티오닌, DL-티오르판, 에톡시퀸, 갈산, 겐티스산 나트륨 염 수화물, 글루타티온 디설파이드, 글루타티온 환원 에틸 에스테르, 글라이신, 하이드로코르티손, 하이포타우린, 이세티온산 암모늄 염, L-시스테인-글루타티온 디설파이드, L-시스테인설핀산 1수화물, 리포산, 환원된 리포산, 머캅토프로피오닐 글라이신, 메티오닌, 메틸렌비스(3-티오프로피온산), 옥살산, 쿠에르시트린 수화물, 레스베라트롤, 레티노산, S-카복시메틸-L-시스테인, 셀레늄, 셀레노메티오닌, 은 디에틸디티오카바메이트, 타우린, 티오락트산, 트리신, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B4, 비타민 B5, 비타민 B6, 및 비타민 B11. 특정 구현예에서, 환원제는 시스테인 및 L-시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 시스테인 또는 L-시스테인은 숙주 세포의 배양물, 세포 배양 유체, PHCCF, 또는 HCCF에 첨가되어 약 3.0 mM, 3.5mM, 4.0 mM, 4.5 mM, 5.0 mM, 5.5 mM, 또는 6 mM (상기 사이의 어느 값 포함) 중 어느 것의 최종 농도를 달성하도록 한다.
원하는 유형의 세포 및/또는 폴리펩타이드 생성물을 위해 적합한, 당해기술에 공지된 임의의 세포 배양 배지가 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포 배양 배지는 화학적으로 획정된 배지이다. 기타 구현예에서, 상기 세포 배양 배지는 화학적으로 획정되지 않은 배지이다.
예를 들어, 햄의 F10 (Sigma), 최소 필수 배지([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코 변형된 이글 배지([DMEM], Sigma)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 시판되는 배지가 사용될 수 있고, 임의의 이들 배지는 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 또한, 임의의 배지가 하기에 기술되며: Ham and Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), Vijayasankaran et al., Biomacromolecules., 6:605:611 (2005), Patkar et al., J Biotechnology, 93:217-229 (2002), 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 또는 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; 미국 특허 번호 Re. 30,985; 또는 미국 특허 번호 5,122,469 (이들 모두의 개시내용은 그 전체가 참고로써 본원에 통합되어 있음), 본원에 상세화된 바와 같이 변형될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 배지는 또한 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 이온 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오사이드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 및 글루코스 또는 상응하는 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 세포 배양 배지는 화학적으로 획정된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 세포 배양 배지는 화학적으로 비획정된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 세포 배양 배지는 식물 또는 동물로부터 유도된 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 세포 배양 배지에는 식물 또는 동물로부터 유도된 단백질이 부재하다. 임의의 다른 필요한 보충제가 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적절한 농도로 또한 포함될 수 있다.
당해 분야에 공지된 임의의 세포 배양 기술은 본원에 기재된 바와 같은 방법과 함께 사용될 수 있다. 세포 배양 기술의 예는 단일 세포 배양 계대배양, 연장된 세포 배양 계대배양, 종자 또는 접종물 트레인, 농축된 공급물 보충, 세포 은행 생성, 관류 배양 및 유가식 배양을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 세포 배양 배지에 분비된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 세포 배양 배지 유래의 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 폴리펩타이드에서 트리설파이드 결합의수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 트리설파이드 결합의 존재는 실시예에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법을포함하여 임의의 다수의 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 트리설파이드 결합은 펩타이드 맵핑을 사용하여 검출될 수 있고, 여분의 황 원자로 인한 무손상 단백질의 질량 증가 (32Da)에 기초하여 검출될 수 있다. 특정 구현예에서, 트리설파이드 결합은 질량 스펙트럼을 사용하거나, 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석법(LC-MS 시스템을 사용하는 펩타이드 맵핑)에 의해 검출될 수 있다. 특정 구현예에서, 트리설파이드 결합은 펩타이드 맵핑을 통해 검출될 수 있고, 여기서 설파이드 결합을 함유하는 것들을 포함하여 무손상 분자로부터 유래된 선택 펩타이드는 LC-MS에 의해 분석된다. 특정 구현예에서, 트리설파이드 결합은 또한 간접적으로, 예를 들어, 분자 폴딩 또는 열 안정성을 평가함으로써 검출될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 중 트리설파이드 결합의 존재는, 예를 들어, 비환원 전기영동에 대한 샘플 제조 후 증가된 단편화 수준에 예증되는 바와 같이 열 처리에 대한 증가된 감수성의 결과로서 검출되거나 식별될 수 있다(참조: 예를 들어, US 2012/0264916). 특정 구현예에서, 트리설파이드 결합은 하기에 기재된 방법에 따라 하전된 에어로졸 검출과 조합된 소수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC-CAD)를 통해 검출될 수 있다: Zhang et al. (2010) Journal of Chromatography A. 1217, 5776-5784. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법 중 어느 것 또는 조합물에 따라 생산된 폴리펩타이드 내 평균 트리설파이드 결합 수준은 하기 중 어느 것 미만이다: 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% (mol 트리설파이드/mol 폴리펩타이드).
관련된 양태에서, 본원의 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드가 제공된다. 상기 폴리펩타이드는 이하에 보다 상세하게 설명된다.
폴리펩타이드의 생산 및 정제 방법
본원에 제공된 방법은 재조합 동물 세포와 같은 임의의 유형의 동물 세포에서, 예를 들어, 항체 및 이중특이적 항체를 포함하는 폴리펩타이드를 생성시키는 데 사용될 수 있다. 용어 "동물 세포"는 무척추동물, 비포유동물 척추동물(예: 조류, 파충류 및 양서류) 및 포유동물 세포를 포함한다. 무척추동물 세포의 예는 하기 곤충 세포를 포함한다: 스포도프테라 프루지페르다 (유충), 아에데스 아에집티 (모기), 아에데스 알보픽투스 (모기), 드로소필라 멜라노가스테르 (초파리), 및 봄빅스 모리 (참조: 예를 들어, Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow, J. K. et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; 및 Maeda et al., Nature, 315:592- 594 (1985)).
특정 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유 동물 세포주는 당업계에 공지되어 있고, 미국 유형 배양 수집물(American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 입수할 수 있는 불멸화된 세포주 및 당업계에 공지된 발현 시스템에서 사용되는 임의의 세포주들이 본원에 제공된 방법에 따라 폴리펩타이드 (예컨대 항체 또는 이중특이적 항체)를 제조하는데 사용될 수 있다. 포유동물 세포의 예시는 하기를 포함한다: 인간 망막아세포 (PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands); SV40에 의하여 변형된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651(Gluzman et al., 1981, Cell 23:175)); 인간 배아 신장 세포주 (현탁제 배양물 내 성장을 위하여 하위-클로닝된 293, 293 EBNA, MSR 293, 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)) 마우스 L 세포; 3T3 세포 (ATCC CCL 163); 원숭이 신장 세포 (CVI ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 인간 간세포암 세포주 (Hep G2); 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 다른 형질변환된 영장류 세포주, 정상적인 이배체 세포, 일차 조직, 일차 이식물, HL-60, U937, HaK 또는 주카트 세포의 시험관 배양으로부터 유도된 세포 균주. 선택적으로, 포유동물 세포주, 이를테면 HepG2/3B, KB, NIH 3T3 또는 S49는 다양한 신호전달 또는 리포터 분석에서 폴리펩타이드를 이용할 때, 이 폴리펩타이드의 발현을 위하여 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 포유동물 세포는 무혈청 배지에서 성장하는 베지(Veggie) CHO 및 관련 세포주와 같은 CHO 세포 또는 이의 유도체이다(Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31).
본 발명은 또한 하이브리도마 세포에 적용 가능하다. 용어 "하이브리도마"는 면역원성 기원의 불멸 세포주 및 항체 생산 세포의 융합에 의해 생산된 혼성 세포주를 의미한다. 상기 용어는 이종혼성 골수종 융합의 자손을 포함하고, 이는 인간 세포와의 융합 결과이며, 이어서 뮤린 골수성 세포주는 통상적으로 트리오마 세포주로서 공지된 형질 세포와 융합된다. 더욱이, 상기 용어는, 예를 들어, 쿼드로마(quadroma)와 같은 항체를 생성하는 임의의 불멸 혼성 세포주를 포함하는 것으로 의미된다(참고: 예컨대, Milstein et al., Nature, 537:3053 (1983)). 혼성 세포주는 인간 및 마우스를 포함하는 임의의 종의 것일 수 있다.
특정 구현예에서, 포유동물 세포는 특히 바람직한 구현예에서 항체(예: 이중특이적 항체)를 암호화하는 핵산, 항체 단편, 예를 들어, 리간드 결합 단편, 및 키메라 항체를 포함하여, 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 외인성 단리된 핵산으로 형질전환된 비하이브리도마 포유동물 세포이다. "외인성 핵산" 또는 "이종성 핵산"은 세포에 외래적이거나 세포에 상동성이지만 핵산이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있는 핵산 서열을 의미한다.
단리된 핵산은 이것이 폴리펩타이드 핵산의 천연 공급원에서 대개 연관되는 적어도 하나의 오염물질 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정 이외의 것이다. 단리된 핵산은 바람직하게는, 즉 자연적으로 존재하는 염색체 환경으로부터 단리된 비-염색체 핵산이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 이것이 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나 단리된 핵산 분자에는, 예를 들면 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 있는, 폴리펩타이드를 대개 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.
관심 폴리펩타이드는, 분비 신호 없이 직접 발현될 때 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수도 있지만, 바람직하게는 분비된 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수된다. 제1 단계로서, 배양 배지 또는 용해물을 원심분리하여 미립자 세포 파편을 제거한다. 이후, 폴리펩타이드는 오염물 가용성 단백질 및 폴리펩타이드로부터 정제되며, 다음 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 면역친화성 또는 이온 교환 컬럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어, DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 및 IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼. 프로테아제 억제제, 예를 들어, 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)는 또한 정제 동안 단백질분해 열화를 억제하는 데 유용할 수 있다. 당업자는 관심 폴리펩타이드에 적합한 정제 방법이 재조합 세포 배양에서 발현시 폴리펩타이드의 특성의 변화를 설명하기 위한 변형을 필요로 할 수 있음을 이해할 것이다.
예시적 폴리펩타이드
다양한 폴리펩타이드는 본원에 제공된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예시는 비제한적으로 하기를 포함한다: 예를 들어, 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항-응고 인자 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화에 대해 조절된 일반적으로 T-세포 발현되고 분비됨); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관 억제 물질(Muellerian-inhibiting substance); 릴락신 A-쇄; 릴락신 B-쇄; 프로릴락신; 마우스 성선자극호르몬-관련된 펩타이드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련된 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양 인자 예컨대 골-유도된 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자 예컨대 NGF-~; 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4 또는 TGF-베타5를 포함하는, 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(l-3)-IGF-1 (뇌 IGF-1), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8. CD19, CD20, CD34, 및 CD40; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어, 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-17; 과산화물제거효소; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어, AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소성 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예를 들어, CD 11a, CD 11b, CD 11c, CD 18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예를 들어, HER2, HER3 또는 HERA 수용체; 및 임의의 상기 열거된 폴리펩타이드의 단편.
항체 생산 및 정제
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 항체는 인간화된 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 라이브러리-유도된(library-derived) 항체 또는 다중특이적 항체 (예컨대 이중특이적 항체)이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 항체 단편은 Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, (scFv)2, dAb, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체이다.
항체는, 예를 들면, 포유동물 세포 (예컨대, CHO 세포)를 사용하는 항체의 생산에서 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 암호화하는 DNA는 쉽게 단리되고 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 종래의 절차를 사용하여 서열분석될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로, 비제한적으로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종료 서열.
항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩타이드와 함께 융합 폴리펩타이드로서 재조합으로 생산될 수 있으며, 상기 이종 펩타이드는 바람직하게 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드이다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (예를 들면, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비성 리더(viral secretory leaders), 예를 들면, 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다.
항체는 세포내로 생성되거나 또는 배지에 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 특정한 파편은, 예를 들면, 원심분리 또는 초미세여과에 의해 제거된다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 초미세여과 유닛을 사용하여 먼저 농축시킬 수 있다. 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF가 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 전술된 단계에 포함될 수 있고, 항생제가 우발적인 오염물질의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.
당해 분야에 공지된 표준 단백질 정제 방법은 실질적으로 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 항체의 균질한 제제를 수득하는데 사용될 수 있다. 하기 절차는 적절한 정제 절차에 대한 예시이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 또는 실리카 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 적정 및 예를 들어, 세파덱스(Sephadex) G-75를 사용한 겔 여과.
추가적으로 또는 대안적으로, 항체는, 예를 들면, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피(hydroxylapatite chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화도 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중 하나이다. 특정 양태에서, 상기 기술된 세포 배양 배지로부터 유래된 제조물을 단백질 A 고정화된 고체 상에 적용하여 단백질 A로의 관심 다중특이적 항원-결합 단백질의 특이적 결합이 가능하도록 하였다. 이러한 고체 상을 이후 세정하여 고체 상과 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거하였다. 다중특이적 항원 결합 단백질(예: 이중특이적 항체)은 무질서유발제(chaotropic agent) 및 중성 세제를 함유하는 용액 내로의 용출에 의해 고상으로부터 회수된다. 예시적 무질서유발제 및 중성 세제는, 비제한적으로, 구아니딘-HCl, 우레아, 리튬 퍼클로레이트, 아르기닌, 히스티딘, SDS (나트륨 도데실 설페이트), Tween, 트리톤, 및 NP-40을 포함하고, 이들 모두는 상업적으로 입수가능하다.
친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존적이다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기반하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 매우 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 가공 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함한 경우, Bakerbond ABXTM 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술 예컨대 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전법이 또한 회수되는 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 항체 (예컨대 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 항체) 및 오염물을 포함하는 혼합물은 바람직하게는 낮은 염 농도(예를 들면, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는, 약 2.5-4.5 pH에서 용출 완충제를 이용하여 낮은 pH의 소수성 상호작용 크로마토그래피로 처리될 수 있다. 항체의 생산은 대안적으로 또는 추가로 (임의의 전술한 특정한 방법에) 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 용액의 투석을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 이의 항원-결합 단편이다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. Fab 단편은 중쇄- 및 경쇄 가변 도메인을 함유하며, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 초과의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다. "Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하며, 그것은 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 재고를 위해, 예를 들어, 하기를 참고한다:
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, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315. 상기 기재된 항체를 정제하는 다수의 방법은 항원-결합 항체 단편을 정제하기 위해 적절하게 조정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 세포 배양 배지에서 배양된 세포는 이중특이적 항체를 생산하기 위하여 사용된다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 아암에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 오직 1/2 내의 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 용이한 방법을 제공하므로, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 발견되었다 (참고: WO 94/04690). 이중특이적 항체 생성의 추가적인 세부사항에 대해서는, 예를 들어, 하기를 참조한다: Suresh et al., Methods in Enzymology , 121:210 (1986). 또 다른 접근에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체 백분율을 최대화하기 위해 가공될 수 있다 (참고: W096/27011). 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 것(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체하여 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "공동"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 산물에 비해 이종이량체 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다. 이중특이적 항체에는 가교결합되거나, "이종콘주게이트" 항체가 포함된다. 이중특이적 항체에는 가교결합되거나, "이종콘주게이트" 항체가 포함된다. 상기 항체는, 예를 들어, 원치 않는 세포에 대하여 (참고: US 4,676,980), 그리고 HIV 감염의 치료를 위하여 (참고: WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089), 면역계 세포를 표적화하기 위하여 제안되었다. 이종콘주게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합 제제 및 기술은 당해기술에서 잘 알려지고, 그리고 U.S. 4,676,980에 기재된다 (다수의 가교결합 기술과 함께). 2 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다(참조: Tutt et al. J. Immunol . 147: 60 (1991)).
표적 분자
본원에 제공된 방법에 따라 생산된 항체 (또는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체)에 의해 표적화될 수 있는 분자의 예는 가용성 혈청 단백질 및 이들의 수용체 및 다른 막 결합 단백질 [예: 어드헤신(adhesin)]을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 다중특이적 항원 결합 단백질은 8MPI, 8MP2, 8MP38 (GDFIO), 8MP4, 8MP6, 8MP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (αFGF), FGF2 (βFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFN81, IFNG, IFNWI, FEL1, FEL1 (EPSELON), FEL1 (ZETA), IL 1A, IL 1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL 11, IL 12A, IL 12B, IL 13, IL 14, IL 15, IL 16, IL 17, IL 17B, IL 18, IL 19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBb3, LTA (TNF-β), LTB, TNF (TNF-α), TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1 BB 리간드), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL 11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (렙틴), PTN, 및 THPO로 이루어진 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 그 이상의 사이토카인, 사이토카인 관련 단백질 및 사이토카인 수용체에 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 CCLI (1-309), CCL2 (MCP -1/MCAF), CCL3 (MIP-Iα), CCL4 (MIP-Iβ), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (에오탁신), CCL 13 (MCP-4), CCL 15 (MIP-Iδ), CCL 16 (HCC-4), CCL 17 (TARC), CCL 18 (PARC), CCL 19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3α), CCL21 (SLC/엑소더스-2), CCL22 (MDC/ STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 /에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL 10 (IP 10), CXCL 11 (1-TAC), CXCL 12 (SDFI), CXCL 13, CXCL 14, CXCL 16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL 1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (림포탁틴), XCL2 (SCM-Iβ), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61 ), CCRI (CKRI/HM145), CCR2 (mcp-IRB IRA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6), CCR7 (CKR7/EBII), CCR8 (CMKBR8/ TER1/CKR- L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Rα), IL8RB (IL8Rβ), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HDF1, HDF1α, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL로 이루어진 군으로부터 선택된 케모카인, 케모카인 수용체, 또는 케모카인 관련 단백질에 대한 항체 (또는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체)를 생산하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 항체 또는 이중특이적 항체는 하기로부터 선택된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다: 0772P (CA125, MUC16) (즉, 난소암 항원), ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그레칸(Aggrecan); AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; 아밀로이드 베타; ANGPTL; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; ASLG659; ASPHD1 (1;LOC253982을 함유하는 아스파르테이트 베타-하이드록실라제 도메인); AZGP1 (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-유형 IB); BMPR2; BPAG1 (플렉틴); BRCA1; 브레비칸; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6/JAB61); CCL1 (1-309); CCL11 (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP1δ); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3β); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3α); CCL21 (MTP-2); SLC; 엑소더스-2; CCL22 (MDC/STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2/에오탁신-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신-3); CCL27 (CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Iα); CCL4 (MDP-Iβ); CCL5(RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKRI/HM145); CCR2 (mcp-IRβ/RA);CCR3 (CKR/ CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5/ChemR13); CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6); CCR7 (CKBR7/EBI1); CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 동형체); CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A (CD79α, 면역글로불린 관련 알파, B 세포 특이적 단백질); CD79B; CDS; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21/WAF1/Cip1); CDKN1B (p27/Kip1); CDKN1C; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (클라우딘-7); CLL-1 (CLEC12A, MICL, 및 DCAL2); CLN3; CLU (클러스테린); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL 18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; 보체 인자 D; CR2; CRP; CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자); CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNB1 (b-카테닌); CTSB (카텝신 B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC/IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, G 단백질-커플링된 수용체); CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLI; DPP4; E16 (LAT1, SLC7A5); E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EphB2R; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; ETBR (엔도텔린 유형 B 수용체); F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1); FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 앵커 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C); FGF; FGF1 (αFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELl (EPSILON); FILl (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (피브로넥틴); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GDNF-Ra1 (GDNF 계열 수용체 알파 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-알파1; GFR-알파-1); GEDA; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCR10); GPR19 (G 단백질 커플링된 수용체 19; Mm.4787); GPR31; GPR44; GPR54 (KISS1 수용체; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12); GPR81 (FKSG80); GPR172A (G 단백질 커플링된 수용체 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e);GRCCIO (C10); GRP; GSN (겔솔린); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HOP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DOB (MHC 부류 II 분자 (Ia 항원)의 베타 하위단위); HLA-DRA; HM74; HMOXI ; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; DFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-l; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; ILIF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20Rα; IL21 R; IL22; IL-22c; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); 인플루엔자 A; 인플루엔자 B; EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRTA2 (면역글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전좌 관련 2); ERAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b4 인테그린); α4β7 및 αEβ7 인테그린 이종이량체; JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KHTHB6 (모발-특이적 유형 H 케라틴); LAMAS; LEP (렙틴); LGR5 (류신-풍부 반복체 함유 G 단백질 커플링된 수용체 5; GPR49, GPR67); Lingo-p75; Lingo-트로이; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복체 (LRR) 계열의 유형 I 막 단백질); Ly6E (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1); Ly6G6D (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 G6D; Ly6-D, MEGT1); LY6K (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226); MACMARCKS; MAG 또는 OMgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MDP; MIB1; 미드카인; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 강화 인자, 메소텔린); MS4A1; MSG783 (RNF124, 가상의 단백질 FLJ20315); MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴-111); MTSS1; MUC1 (뮤신); MYC; MY088; Napi3b (NaPi2b로도 공지됨) (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 계열 34(인산나트륨), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 수송체 3b); NCA; NCK2; 뉴로칸; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR- Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-트로이; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR112; NR113; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRD1; OX40; P2RX7; P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-관문 이온 체널 5); PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PD-L1; PD-L2; PD-1; POGFA; POGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PMEL17 (은 동족체; SILV; D12S53E; PMEL17; SI; SIL); PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자); PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RET (ret 원종양유전자; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1); RGSI; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈2); SCGB2A2 (맘마글로빈 1); SCYEI (내피 단핵구-활성화 사이토카인); SDF2; Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, sema 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복체 (유형 1 및 유형 1-유사), 막관통 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B); SERPINA1; SERPINA3; SERP1NB5 (마스핀); SERPINE1(PAI-1); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRR1B (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP (전립선의 6개 막관통 상피성 항원); STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 관련 유전자 1, 전립선암 관련 단백질 1, 전립선의 6개 막관통 상피성 항원 2, 6개의 막관통 전립선 단백질); TB4R2; TBX21; TCPIO; TOGFI; TEK; TENB2 (추정 막관통 프로테오글리칸); TGFA; TGFBI; TGFB1II; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1 ); TMP3; 조직 인자; TLR1; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TLR10; TMEFF1 (EGF-유사 및 2개의 폴리스타틴-유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질; 토모레굴린-1); TMEM46 (쉬마 동족체 2); TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSFS (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1 BB 리간드); TOLLIP; Toll-유사 수용체; TOP2A (토포아이소머라제 Ea); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TMEM118 (환 핑거 단백질, 막관통 2; RNFT2; FLJ14627); TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일과성 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4); TRPC6; TSLP; TWEAK; 티로시나제 (TYR; OCAIA; OCA1A; 티로시나제; SHEP3);VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1 (림포탁틴); XCL2 (SCM-1b); XCRI(GPR5/ CCXCRI); YY1; 및 ZFPM2.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 항체 (또는 이중특이적 항체)의 표적 분자는 CD 단백질, 예를 들어, CD3, CD4, CDS, CD16, CD19, CD20, CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡슈타인 바르 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792); CD33; CD34; CD64; CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2); CD79b (CD79B, CD79β, IGb (면역글로불린 관련 베타), B29); ErbB 수용체 계열, 예를 들어, EGF 수용체, HER2, HER3, 또는 HER4 수용체의 CD200 구성원; 세포 유착 분자, 예를 들어, LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 알파v/베타3 인테그린(이의 알파 또는 베타 하위단위 포함)(예: 항-CD11a, 항-CD18, 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예를 들어, VEGF-A, VEGF-C; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (알파IFN); TNF알파, 인터류킨, 예를 들어, IL-1 베타, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL 17 AF, IL-1S, IL-13R 알파1, IL13R 알파2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; 혈액 그룹 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; RANKL, RANK, RSV F 단백질, 단백질 C 등을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 보체 단백질 C5 (예: 인간 C5에 특이적으로 결합하는 항-C5 효능제 항체)에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체)를 생산하는데 사용될 수 있다.　일부 구현예에서, 항-C5 항체는 하기로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: SSYYMA (서열 번호:1); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: AIFTGSGAEYKAEWAKG (서열 번호:26); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DAGYDYPTHAMHY (서열 번호: 27); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASQGISSSLA (서열 번호: 28); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GASETES (서열 번호: 29); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QNTKVGSSYGNT (서열 번호: 30).　 예를 들어, 일부 구현예에서, 항-C5 항체는 하기를 포함한다: 하기로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: SSYYMA (서열 번호: 1); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: AIFTGSGAEYKAEWAKG (서열 번호: 26); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DAGYDYPTHAMHY (서열 번호: 27); 및/또는 하기로부터 선택된 1, 2, 또는 3개 HVR을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열: (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASQGISSSLA (서열 번호: 28); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GASETES (서열 번호: 29); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QNTKVGSSYGNT (서열 번호: 30). 상기 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 서열은 서열 번호: 117, 서열 번호: 118, 서열 번호: 121, 서열 번호: 122, 서열 번호: 123 및 서열 번호: 125, 각각으로서 US 2016/0176954에서 개시된다. (참고: US 2016/0176954에서의 표 7 및 8).
특정 구현예에서, 항-C5 항체는 하기에서의 VH 및 VL 서열을 각각 포함한다 (상기 서열의 번역 후 변형을 포함함):
Figure pct00004
상기 VH 및 VL 서열은 서열 번호: 106 및 서열 번호: 111, 각각으로서 US 2016/0176954에서 개시된다. (참고: US 2016/0176954에서의 표 7 및 8). 일부 구현예에서, 항-C5 항체는 305L015이다 (참고: US 2016/0176954).
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 OX40 (예: 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항-OX40 효능제 항체)에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체)를 생산하는데 사용될 수 있다.　 일부 구현예에서, 항-OX40 항체는 하기로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSYMS (서열 번호: 2); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: DMYPDNGDSSYNQKFRE (서열 번호: 3); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: APRWYFSV (서열 번호: 4); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASQDISNYLN (서열 번호: 5); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: YTSRLRS (서열 번호: 6); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQGHTLPPT (서열 번호: 7).　 예를 들어, 일부 구현예에서, 항-OX40 항체는 하기로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSYMS (서열 번호: 2); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: DMYPDNGDSSYNQKFRE (서열 번호: 3); 및 (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: APRWYFSV (서열 번호: 4) 및/또는 하기로부터 선택된 1, 2, 또는 3개 HVR을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASQDISNYLN (서열 번호: 5); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: YTSRLRS (서열 번호: 6); 및 (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQGHTLPPT (서열 번호: 7).　특정 구현예에서, 항-OX40 항체는 하기에서의 VH 및 VL 서열을 각각 포함한다 (상기 서열의 번역 후 변형을 포함함):
Figure pct00005
일부 구현예에서, 항-OX40 항체는 하기로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: NYLIE (서열 번호: 10); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: VINPGSGDTYYSEKFKG (서열 번호: 11; (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DRLDY (서열 번호: 12); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: HASQDISSYIV (서열 번호: 13); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: HGTNLED (서열 번호: 14); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: VHYAQFPYT (서열 번호: 15).　예를 들어, 일부 구현예에서, 항-OX40 항체는 하기를 포함한다: 하기로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: NYLIE (서열 번호: 10); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: VINPGSGDTYYSEKFKG (서열 번호: 11); 및 (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DRLDY (서열 번호: 12) 및/또는 하기로부터 선택된 1, 2, 또는 3개 HVR을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: HASQDISSYIV (서열 번호: 13); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: HGTNLED (서열 번호: 14); 및 (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: VHYAQFPYT (서열 번호: 15).　특정 구현예에서, 항-OX40 항체는 하기에서의 VH 및 VL 서열을 각각 포함한다 (상기 서열의 번역 후 변형을 포함함):
Figure pct00006
항-OX40 항체에 관한 추가의 상세내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 WO 2015/153513에 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 인플루엔자 바이러스 B 혈구응집소, 즉, "fluB"에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체) (예컨대, 시험관내 및/또는 생체내로, 인플루엔자 B 바이러스의 야가마타(Yamagata) 계통 유래의 혈구응집소에 결합하거나, 인플루엔자 B 바이러스의 빅토리아(Victoria) 계통 유래의 혈구응집소에 결합하거나, 인플루엔자 B 바이러스의 선조 계통 유래의 혈구응집소에 결합하거나, 또는 인플루엔자 B 바이러스의 야가마타(Yamagata) 계통, 빅토리아(Victoria) 계통, 및 선조 계통 유래의 혈구응집소에 결합하는 항체)를 생산하는데 사용될 수 있다. 항-FluB 항체에 관한 추가의 상세내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 WO 2015/148806에 기술된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 항체 (또는 이중특이적 항체)는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 (LRP)-1 또는 LRP-8 또는 트랜스페린 수용체, 및 베타-세크레타제 (BACE1 또는 BACE2), 알파-세크레타제, 감마-세크레타제, tau-세크레타제, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 베타 펩타이드, 알파-시누클레인, Parkin, 헌팅틴, p75 NTR, CD40 및 카스파제-6로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 표적에 결합한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 항체는 CD40에 대한 인간 IgG2 항체이다. 특정 구현예에서, 항-CD40 항체는 RG7876이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드는 표적화된 면역사이토카인이다. 특정 구현예에서, 표적화된 면역사이토카인은 CEA-IL2v 면역사이토카인이다. 특정 구현예에서, CEA-IL2v 면역사이토카인은 RG7813이다. 특정 구현예에서, 표적화된 면역사이토카인은 FAP-IL2v 면역사이토카인이다. 특정 구현예에서, FAP-IL2v 면역사이토카인은 RG7461이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체)는 CEA 및 적어도 하나의 추가의 표적 분자를 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체)는 종양 표적화된 사이토카인 및 적어도 하나의 추가의 표적 분자를 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체)는 IL2v (즉, 인터류킨 2 변이체)에 융합되며, 그리고 IL1-기반 면역사이토카인 및 적어도 하나의 추가 표적 분자에 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 다중특이적 항체 (예: 이중특이적 항체)는 T-세포 이중특이적 항체 (즉, 이중특이적 T-세포 연관체 또는 BiTE)이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체)는 하기로부터 선택된 적어도 2개의 표적 분자에 결합한다: IL-1 알파 및 IL- 1 베타, IL-12 및 IL-1S; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1베타; IL-13 및 IL- 25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF-~; IL-13 및 LHR 효능제; IL-12 및 TWEAK, IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAMS, IL-13 및 PED2, IL17A 및 IL17F, CEA 및 CD3, CD3 및 CD19, CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD3S 및 CD13S; CD3S 및 CD20; CD3S 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-S 및 IL-6; CD20 및 BR3, TNF 알파 및 TGF-베타, TNF 알파 및 IL-1 베타; TNF 알파 및 IL-2, TNF 알파 및 IL-3, TNF 알파 및 IL-4, TNF 알파 및 IL-5, TNF 알파 및 IL6, TNF 알파 및 IL8, TNF 알파 및 IL-9, TNF 알파 및 IL-10, TNF 알파 및 IL-11, TNF 알파 및 IL-12, TNF 알파 및 IL-13, TNF 알파 및 IL-14, TNF 알파 및 IL-15, TNF 알파 및 IL-16, TNF 알파 및 IL-17, TNF 알파 및 IL-18, TNF 알파 및 IL-19, TNF 알파 및 IL-20, TNF 알파 및 IL-23, TNF 알파 및 IFN 알파, TNF 알파 및 CD4, TNF 알파 및 VEGF, TNF 알파 및 MIF, TNF 알파 및 ICAM-1, TNF 알파 및 PGE4, TNF 알파 및 PEG2, TNF 알파 및 RANK 리간드, TNF 알파 및 Te38, TNF 알파 및 BAFF,TNF 알파 및 CD22, TNF 알파 및 CTLA-4, TNF 알파 및 GP130, TNF a 및 IL-12p40, VEGF 및 안지오포이에틴, VEGF 및 HER2, VEGF-A 및 HER2, VEGF-A 및 PDGF, HER1 및 HER2, VEGFA 및 ANG2,VEGF-A 및 VEGF-C, VEGF-C 및 VEGF-D, HER2 및 DR5,VEGF 및 IL-8, VEGF 및 MET, VEGFR 및 MET 수용체, EGFR 및 MET, VEGFR 및 EGFR, HER2 및 CD64, HER2 및 CD3, HER2 및 CD16, HER2 및 HER3; EGFR (HER1) 및 HER2, EGFR 및 HER3, EGFR 및 HER4, IL-14 및 IL-13, IL-13 및 CD40L, IL4 및 CD40L, TNFR1 및 IL-1 R, TNFR1 및 IL-6R 및 TNFR1 및 IL-18R, EpCAM 및 CD3, MAPG 및 CD28, EGFR 및 CD64, CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTN02; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; POL-l 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B.
특정 구현예에서, 다중특이적 항체 (예컨대 이중특이적 항체)는 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체이다. 특정 구현예에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 RG7802이다. 특정 구현예에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 이하 제공된 서열 번호 18 내지 21에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00007
Figure pct00008
항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체에 관한 추가의 상세함은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 WO 2014/121712에 제공된다.
특정 구현예에서, 다중특이적 항체 (예컨대 이중특이적 항체)는 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체이다. 특정 구현예에서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체 이중특이적 항체는 크로스맙(Crossmab)이다. 특정 구현예에서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체는 RG7716이다. 특정 구현예에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체는 이하 제공된 서열 번호 22 내지 25에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00009
Figure pct00010
특정 구현예에서, 다중특이적 항체 (예컨대 이중특이적 항체)는 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체이다. 특정 구현예에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 RG7221이다. 특정 구현예에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체는 CAS 번호 1448221-05-3이다.
다른 분자에 선택적으로 콘주게이트된, 가용성 항원 또는 이의 단편은 항체 생성용 면역원으로서 사용될 수 있다. 막투과성 분자, 예컨대 수용체에 대하여, 이들의 단편 (예를 들면 수용체의 세포외 도메인)은 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 막투과성 분자를 발현한 세포는 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기 세포는 천연 공급원 (예를 들면 암 세포주)으로부터 유도될 수 있거나 또는 막투과성 분자를 발현시키기 위해 재조합 기술로 변형된 세포일 수 있다. 항체 제조에 유용한 다른 항원 및 이의 형태는 당해 기술의 숙련가에 명백할 것이다.
특정 구현예에서, 본원에서 생산된 폴리펩타이드(예: 항체)는 화학적 분자, 예를 들어, 염료 또는 세포독성제, 예를 들어, 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소(예: 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원, 또는 이의 단편의 효소 활성 독소), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사콘주게이트)에 추가로 콘주게이트시킬 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 생산된 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 면역콘주게이트는 단 하나의 중쇄의 또는 단 하나의 경쇄의 불변 영역에 콘주게이트된 세포독성제를 함유할 수 있다.
C. 약제학적 조성물 및 제형
본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드 (예컨대, 항체 또는 이중특이적 항체)는 적합한 담체 또는 부형제와 함께 제형화되어 이들이 투여에 적합하도록 할 수 있다. 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드(예: 항체 또는 이중특이적 항체)의 적합한 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩타이드(예: 항체 또는 이중특이적 항체)와 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합함으로써 수득된다 (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) (동결건조된 제형 또는 수용액 형태로). 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수령체에 비독성이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 주기로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 짝이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 예시적인 항체 제형은 본원에 참고로 명확히 편입된 W098/56418에 기재된다. 피하 투여를 위해 채택된 동결건조된 제형은, W097 /04801에서 기재된다. 상기 동결건조된 제형은 높은 단백질 농도까지 적합한 희석제로 재구성될 수 있고 재구성된 제형은 본원에서 치료되는 포유동물에 피하로 투여될 수 있다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정 명시를 위해 필요한 것으로서 둘 이상의 활성 화합물(바람직하게는 서로에게 부작용을 일으키지 않는 보완적 활성을 갖는 것)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항신생물성 제제, 성장 억제제, 세포독성제, 또는 화학치료제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같은 분자는 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합하여 적절하게 존재한다. 상기 기타 제제의 유효량은 제형 중에 존재하는 폴리펩타이드 (예컨대, 항체 또는 이중특이적 항체)의 양, 질환 또는 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 기타 인자들에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에 기술된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나 또는 지금까지 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다. 또한, 활성 성분을 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로구형체, 마이크로에멀젼, 나노- 입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼 내의 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐 내에 포집할 수 있다. 상기 기술은 하기에서 개시되어 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). 서방형 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적당한 예에는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스가 포함되며, 이 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 하기를 포함한다: 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산.
선택적으로, 그러나 바람직하게는, 제형은 약제학적으로 허용가능한 염, 바람직하게는 염화나트륨을, 바람직하게는 약 생리적 농도로 함유한다. 선택적으로, 제형은 약제학적으로 허용가능한 보존제를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서 보존제 농도는, 전형적으로 v/v로 0.1 내지 2.0% 범위이다. 적합한 보존제는 약제학적 기술에 공지된 것을 포함한다. 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 및 프로필파라벤은 바람직한 보존제이다. 선택적으로, 제형은, 0.005 내지 0.02%의 농도로 약제학적으로 허용가능한 계면활성제를 포함할 수 있다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드(예: 항체 또는 이중특이적 항체)를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 형상화된 물품, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다. 지속-방출 매트릭스의 예는 하기를 포함한다: 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 코폴리머 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글라이콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성되는 주사가능한 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정 하이드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 캡슐화된 폴리펩타이드(들)(예: 항체 또는 이중특이적 항체)가 장시간 신체에 잔류하는 경우, 그들은 37℃에서 수분에 노출 결과로서 변성되거나 응집되어 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화를 유발할 수 있다. 이상적인 전략은 관여된 기전에 의존한 안정화를 위해 창안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적당한 첨가제를 사용하고, 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함에 의해 성취될 수 있다.
본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드 (예컨대, 항체 또는 이중특이적 항체)는, 공지된 방법에 따라, 예컨대 볼러스로서 정맥내 투여 또는, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해, 일정 기간에 걸쳐 연속 주입으로, 인간 피험체에 투여될 수 있다. 광범위한 부작용 또는 독성이 단백질에 의해 기술적으로 인식된 표적 분자에 대한 길항작용과 관련되면 국부 투여는 특히 요망될 수 있다. 생체외 전략은 치료적 적용에 또한 사용될 수 있다. 생체외 전략은 본원에 제공된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 이용한, 상기 피험체로부터 수득된 형질감염된 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 형질감염된 또는 형질도입된 세포는 그 다음 상기 피험체에게 되돌려진다. 세포는, 비제한적으로, 조혈 세포 (예를 들면, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, T 세포, 또는 B 세포), 섬유아세포, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 또는 근육 세포를 포함한 임의의 광범위한 유형일 수 있다.
일 예시에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드 (예컨대, 항체 또는 이중특이적 항체)는, 장애 또는 종양의 위치가 허용하는 경우, 국소적으로, 예컨대, 직접 주입에 의하여 투여되며, 그리고 주입은 주기적으로 반복될 수 있다. 폴리펩타이드 (예컨대, 항체 또는 이중특이적 항체)는, 국부 재발 또는 전이를 예방 또는 감소시키기 위해, 상기 피험체에 전신으로 또는 종양 세포, 예를 들면, 종양 또는 종양의 외과 절개후 종양층에 직접적으로 또한 전달될 수 있다.
D. 제조물품 및 키트
본원에 제공된 방법에 따라 생산된 하나 이상의 폴리펩타이드(예: 항체 또는 이중특이적 항체)를 함유하는 제조 물품 및 장애(예: 자가면역 질환 또는 암)의 치료 또는 진단용으로 유용한 재료가 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 제조 물품은 용기 및 그 용기에 또는 연관된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적절한 용기에는 예로서, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 상기 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 증상의 치료에 효과적인 조성물을 보유하며 멸균 액세스 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드(예: 항체 또는 이중특이적 항체)이다. 표지 또는 패키지 삽입물은, 상기 조성물이 특정한 병태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 표지 또는 패키지 삽입물은 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드(예: 항체 또는 이중특이적 항체)를 포함하는 조성물을 피험체에게 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 본원에 기재된 조합 요법을 포함하는 제조 물품 및 키트가 또한 고려된다.
"패키지 삽입물"은 이러한 치료 제품의 사용에 관한 징후, 용법, 투여량, 투여, 사용금지사유 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료 제품의 상업적 패키지에 관례상 포함된 설명서를 지칭한다. 특정 구현예에서, 패키지 삽입물은 조성물이 유방암, 결장직장암, 폐암, 신장 세포암종, 신경아교종 또는 난소암 치료용으로 사용된다는 것을 나타낸다.
부가적으로, 제조 물품은 제약학적으로 허용되는 완충액, 예를 들면, 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 용기를 더욱 포함할 수도 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함한, 상용 및 사용자 관점으로부터 고려된 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 목적, 예를 들어, 세포로부터 2개 이상의 표적 항원의 정제 또는 면역침전용으로 유용한 키트가 또한 제공된다. 2개 이상의 표적 항원의 단리 및 정제용으로, 키트는 비드(예: 세파로스 비드)에 커플링된 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드(예: 항체 또는 이중특이적 항체)를 함유할 수 있다. 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 시험관내에서 항원의 검출 및 정량화용으로 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 폴리펩타이드(예: 항체 또는 이중특이적 항체)를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조 물품을 사용하므로, 키트는 용기 및 용기 상에 또는 이와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 용기는 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 적어도 하나의 폴리펩타이드(예: 항체 또는 이중특이적 항체)를 포함하는 조성물을 유지시킨다. 예를 들면, 희석제 및 완충제 또는 대조군 항체를 함유하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물의 설명 뿐만 아니라, 의도된 시험관내, 진단 용도를 위한 설명서도 제공할 수 있다.
실시예
본 개시내용은 다음의 실시예를 참고로 하여 더 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 그들은 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기술된 실시예 및 구현예는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이들의 견지에서 다양한 변형 또는 변화가 당해기술의 숙련가에게 제시될 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 그리고 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함될 것임이 이해된다.
실시예 1: 무세포 시스템에서 재조합 폴리펩타이드 내 트리설파이드 형성에 대한, 시스테인, 시스틴, 철(Fe) 및 비타민 B의 효과
첫번째 일련의 실험은 무세포 시스템으로 수행하여 세포외로 분비된 재조합 폴리펩타이드에서 트리설파이드 형성에 기여하는 세포 배양 배지 중의 성분을 식별하였다. 특히, 실험은 이러한 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준에 대한 시스테인, 시스틴, 미량 원소, 예를 들어, 철 및 비타민 B의 효과를 조사했다.
A. 시스테인, 시스틴 및 철의 비-세포 효과
간단히, 11% 트리설파이드를 함유하는 예시적인 폴리펩타이드인 항-FluB는 (a) 6 mM L-시스테인 (Cys), (b) 3 mM 시스틴 (Cys-Cys), (c) 6 mM L-시스테인 (Cys) 및 35 μM Fe (철), 또는 (d) 3 mM 시스틴 (Cys-Cys) 및 35 μM Fe (철)이 보충된 배지 1에서 배양했다. 상기한 바와 같이 보충된 배양은 배지 2, 즉 배지 1과 상이한 조성을 갖는 배지에서 반복했다. 항-FluB에 관한 추가의 상세내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 WO 2015/148806에 기술된다.
배지 1 및 배지 2는 그들이 함유하는 영양소 및 성분의 수, 유형 및 농도가 상이하다. 구체적으로, 배지 1의 비타민 B2 및 비타민 B6의 농도는 배지 2의 비타민 B2 및 비타민 B6의 농도와 상이하다.
배지 중 항-FluB의 최종 농도는 1.5 g/L였다. 배양은 37℃의 온도 설정점, 5%의 CO2 설정점으로 배양기에서 수행했다. 배양 혼합물을 캡핑된 튜브 스핀 생물반응기에 유지시키고, 225 rpm에서 교반시켰다. 복제물의 절반은 통기 캡을 갖는 튜브 스핀에 유지시키고, 복제물의 나머지 절반은 비통기 캡을 갖는 튜브 스핀에 유지시켰다. 교반된 튜브 스핀 반응기의 온도, CO2, 및 교반은 CHO 항체 생산 배양물 중 항체의 농도 및 CHO (또는 다른 포유동물) 세포 배양에 사용된 온도의 관련 범위 내였다.
8개 배양 각각의 샘플은 0시간, 6시간, 24시간, 및 72시간에 취하고, 각 시점에 항-FluB 중 % 트리설파이드는 하기에 기재된 방법에 따라 하전된 에어로졸 검출과 조합된 소수성 상호작용 액체 크로마토그래피 (HILIC-CAD)를 통해 계측했다: Zhang et al. (2010) Journal of Chromatography A. 1217, 5776-5784 및 Cornell et al. (in press).
도 1에 나타난 바와 같이, 배지 1 + Cys 또는 배지 2 + Cys에서 항-FluB의 배양은 트리설파이드 결합 수준을 11%에서 거의 0%로 신속하게 감소시키고, 이러한 효과는 72시간 동안 지속되었다. 항-FluB의 트리설파이드 결합 수준은 배지 1 + Cys-Cys 또는 배지 2 + Cys-Cys에서 72시간 배양 동안 상당히 영향을 미치지 않았다. 트리설파이드 결합 수준은 항-FluB이 배지 1 + Cys + Fe 또는 배지 2 + Cys + Fe에서 배양된 경우 신속하게 감소되었고, 이러한 효과는 약 6시간 동안 지속되었다. 그러나, 6시간 후, 항-FluB 중 트리설파이드 결합 수준은 약 15%로, 즉 초기 트리설파이드 결합 수준보다 약간 높게 증가되었다. 이 관찰은 조성물이 Cys-Cys 및 Fe (이하 참조)를 함유하는 것으로 작용하는 시점에 Fe가 존재하는 무세포 시스템에서 Cys를 Cys-Cys로 전환시키는데 필요한 시간의 양과 일치한다. 배지 1 + Cys-Cys + Fe 또는 배지 2 + Cys-Cys + Fe에서 항-FluB의 배양은 72시간 배양 동안 트리설파이드 결합 수준을 약 40%로 상당히 증가시켰다. 유사한 결과는 45% 트리설파이드를 함유하는 항-FluB로 관찰되었다(데이터는 도시되지 않음). 가스 교환은 트리설파이드 형성에 어떠한 영향도 미치지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
총괄적으로, 도 1에서의 결과는 하기를 예증한다: 1) 트리설파이드 결합 수준은 Cys가 존재하는 경우 감소되지만, 그 트리설파이드 결합 수준은 Cys가 Cys-Cys로 전환되는 것이 허용되는 경우 증가할 수 있고; 2) Fe는 세포외 항체 풀에서 트리설파이드 형성에 필요하고, 그 트리설파이드 형성은 Fe 및 시스틴 (Cys-Cys) 둘 모두의 존재하에 상당히 증가하고; 3) 트리설파이드 형성에 대한 Fe 및 시스틴 (Cys-Cys)의 효과는 배지 1 및 배지 2 모두에서 관찰된 결과에서 유사성을 고려하여 세포 배양 배지에 의존하지 않는 것으로 보인다.
도 1에 도시된 결과는 또한 시스틴 (Cys-Cys)과 같은 폴리설파이드가 항체에서 트리설파이드 결합을 생성하기 위한 황 풀(sulfur pool)로서 작용할 수 있다는 것을 예증한다. H2S는 항-FluB가 Fe가 없는 배지 1 + Cys 또는 배지 1 + Cys + Fe에서 배양될 때 상부공간에서 검출가능했다(데이터는 도시되지 않음). 보다 높은 수준의 H2S는, 항-FluB가 배지 1 + Cys + Fe에서 배양될 경우 검출되었다 (데이터 비도시됨). H2S(g)는 항-FluB가 Fe가 없는 배지 1 + Cys-Cys + Fe 또는 배지 1 + Cys-Cys에서 배양될 때 상부공간에서 검출가능하지 않았다 (데이터는 도시되지 않음). 하나의 특정 이론에 결부시키지 않고, 이러한 결과는 Cys 또는 Cys + Fe의 존재가 H2S (g)의 형성을 유도하지 않아 상부공간에서 H2S (g) 수준이 검출가능하지 않을 때에도 트리설파이드 형성에 기여한다는 것을 시사한다.
B. 철 및 비타민 B의 비-세포 효과
추가의 실험 세트에서, 항-FluB는 하기 성분 중 하나 이상으로 보충된 배지 1에서 72시간 동안 배양시켰다: (a) 3 mM 시스틴 (Cys-Cys), (b) 35 μM Fe, 및 (c) 비타민 B (1.84 μM 리보플라빈(비타민 B2), 24.9 μM 피리독신 (비타민 B6), 22.5 μM 엽산 (비타민 B9), 및 2.25 μM 시아노코발라민 (비타민 B12)). 도 2a에 나타난 바와 같이, 트리설파이드 결합 수준은 항-FluB가 Cys-Cys 또는 Cys-Cys + 비타민 B로 보충된 배지 1에서 배양될 경우, 상당히 영향을 미치지 않았다. 항-FluB가 Fe + Cys-Cys 또는 Fe + Cys-Cys + 비타민 B로 보충된 배지에서 배양될 경우, 트리설파이드 결합 수준은 유의미하게, 즉, 11% 내지 약 40%로 증가하였으며, 한편 트리설파이드 결합 수준은, 무세포 시스템에서의 경우, 비타민 B의 존재 또는 부재 하에서 대략 상동하였다.
상기한 실험은 항-OX40 항체, 즉, 1% 트리설파이드를 함유하는 예시적인 폴리펩타이드를 사용하여 반복했다. 본 실시예에서 사용된 항-OX40 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 8에서 명시된 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 9에서 명시된 경쇄 가변 도메인. 서열 번호: 8 및 9가 하기에 제공된다. 항-OX40 항체에 관한 추가의 상세내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 WO 2015/153513에 제공된다.
Figure pct00011
Cys-Cys, Fe, 및 비타민 B가 부재한 배지 1에서 항-OX40 Ab의 배양은 트리설파이드 결합 수준에 어떠한 효과도 갖지 않았다. 도 2b를 참고한다. 트리설파이드 결합 수준은 또한 항-OX40 Ab가 Fe + 비타민 B를 함유하는 배지 1에서 배양될 경우 변하지 않고 유지되었다. 트리설파이드 결합 수준은 항-OX40 Ab가 Cys-Cys로 또는 Cys-Cys 및 비타민 B 둘 다로 보충된 배지 1에서 배양될 경우 1%에서 약 10 내지 15%로 증가되었다. 트리설파이드 결합 수준은 항-OX40 Ab가 Fe + Cys-Cys 또는 Fe + Cys-Cys + 비타민 B로 보충된 배지 1에서 배양될 경우 유의미하게, 즉, 1%에서 약 75%로 증가되었다. 다시, 비타민 B의 존재는 트리설파이드 결합 수준에 상당히 영향을 미치지 않았다.
종합하면, 도 1 및 2a 및 2b의 결과는 하기를 예증한다: 1) 배지에서 Fe 및 시스틴 (Cys-Cys)의 존재는 무세포 시스템에서 폴리펩타이드 내 트리설파이드 결합의 형성에 기여하고, 2) 비타민 B (B2, B6, B9, 및 B12)는 항체가 무세포 시스템에서 배양될 경우(이하 언급되는 세포 배양 시스템에서 관찰된 효과와 대조적으로) 트리설파이드 결합 수준에 상당히 영향을 미치지 않는다.
실시예 2: 포유동물 세포에 의해 생산된 폴리펩타이드에서 트리설파이드 형성에 영향을 미치는 세포 배양 배지 성분
또 다른 일련의 실험은 트리설파이드 결합 수준에 대한 시스테인 (Cys), 시스틴 (Cys-Cys), 철 및 비타민 B의 효과를 평가하기 위해 수행했지만, 무세포 공정보다는 세포 배양 공정에서 이 시간은 이러한 화합물이 세포 배양 환경에 어떤 영향을 미치는지를 다루는 것이다.
A. 세포 배양에서 시스테인 및 시스틴의 효과
한 세트의 세포 배양 실험은 배양 동안 트리설파이드 형성에 대한 첨가된 시스테인 (Cys) 또는 첨가된 시스틴 (Cys-Cys)의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 간략하게, CHO 세포 생산 항-OX40 Ab를 하기 표 1에 도시된 4개 프로토콜 중 하나에 따라 14일 구동에 걸쳐 2 리터 생물반응기에서 배양하였다:
[표 1]
Figure pct00012
생산 세포 배양 유체의 성장 단계를 개시하기 위해, CHO 세포를 1L의 기본 배지를 함유하는 2-L 교반 생물반응기 (Applikon, Foster City, CA)에서 약 1.0 x 106 세포/mL로 접종했다. 세포를, 제3, 6, 및 9일 (즉, 프로토콜 3 및 4에 대하여) 세포 배양 유체를 리터당 100 mL로의; 또는 제3일에서 (즉, 프로토콜 1 및 2에 대하여) 세포 배양 유체를 리터당 200 mL로의 뱃치 공급 배지 첨가를 갖는 유가식 방식으로 배양하였다. 뱃치 공급 배지는 Cys 또는 Cys-Cys를 함유하지 않았다. 표 1에서 언급된 바와 같이, Cys 또는 Cys-Cys는 뱃치 공급 배지가 공급된 동일한 날에 모액으로부터 보충 (즉, 10 ml의 450 mM Cys 또는 10 ml의 225 mM Cys-Cys)을 통해 기본 배지의 생산 배양물에 공급되었다. 시스테인 또는 시스틴은 모든 생산 구동에 대한 총 시스테인 단량체 잠재력이 1 x 20% 뱃치 공급 전략 또는 3 x 10% 뱃치 공급 전략에 대해 대등하게 유지되도록 (즉, 2x 시스테인 (Cys) 농도 대 1x 시스틴 (Cys-Cys) 하는 양으로 공급했다.
글루코스 농도를 매일 분석하고, 글루코스 농도가 3 g/L 이하로 떨어지면, 글루코스 고갈의 예방을 위해 글루코스의 500 g/L 모액으로 보충했다. 반응기에는 보정된 용해된 산소, pH, 및 온도 프로브가 장착되었다. 용해된 산소는 공기 및/또는 산소로의 살포를 통해 온-라인 제어했다. pH를 CO2 또는 Na2CO3 의 첨가를 통하여 조절하고, 항포말제를 필요시 배양물에 첨가하였다. 세포 배양물을 제1일 내지 제3일에서 pH 7.0, 그리고 37℃의 온도에서, 그리고 이후 제3일 이후 33℃에서 유지시켰다. 세포 배양 유체는 275 rpm에서 교반시키고, 용해된 산소 수준은 공기 포화도의 30%였다. 샘플은 오프라인 측정을 위해 매일 취했다. 오프라인 삼투압, pH, 및 대사산물, 생존 세포 밀도 (VCC), 세포 생존력은 BioProfile FLEX 분석기 (Nova Biomedical, Waltham, MA)를 사용하여 매일 측정하고, ~700 x g에서 10분 동안 세포 현탁액의 원심분리 후 충전된 세포 용적 (PCV)도 또한 측정했다. 또한, 상청액 샘플은 6일 내지 14일에 매일 취하여 단백질 A 기반 HPLC 방법을 사용하여 생성물 농도를 계측했다. 상청액 샘플을 0일, 3일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 및 14일째에 취하여 아미노산 유도체화 방법에 이어 RP-HPLC 방법을 사용하여 세포외 아미노산 농도를 계측했다.
샘플을 각 배양물로부터 7일, 10일 및 14일째에 취하고, 각 시점에 항-OX40 Ab 중의 % 트리설파이드는 상기한 바와 같이 HILIC-CAD를 통해 계측했다. 도 3에 나타난 바와 같이, % 트리설파이드는 프로토콜 2 및 4에 따라 배양된 세포에 의해 생산된 항-OX40 Ab에서 가장 높았다. 프로토콜 1에 따라 배양된 세포에 의하여 생산된 항-OX40 Ab 내 트리설파이드%가 제7일 내지 제10일에서 꾸준하게 증가하였고, 그리고 후속하여 제14일에서 수집 시에 약 15%까지 감소하였다. 프로토콜 3에 따라 배양된 세포에 의하여 생산된 항-OX40 Ab 내 트리설파이드%가 제7일 내지 제10일에서 낮게 유지되었고, 그리고 제14일에서 수집 시에 약 17.5%까지 증가하였다. 일 특정한 이론에 구속되고자 하는 의도 없이, 도 3에 도시된 결과는 세포 배양에서 Cys 형태를 사용하는 생산 공정이 Cys가 첨가될 때(비-세포 기전) 보다 낮은 트리설파이드 결합 수준을 유도한다는 것을 시사한다. 배양 말기에 트리설파이드 결합 수준의 상승은 트리설파이드를 감소시키는 환원된 형태의 시스테인이 없기 때문일 가능성이 있고, 그 결과 비-세포 기전은 Cys 공급 후 구동에서 늦은 트리설파이드 형성을 향한 공정을 구동한다. 이와 같이, 결과는 세포 배양 구동에서 초기에 시스테인을 제공하면 수집된 폴리펩타이드에서 더 낮은 트리설파이드 결합 수준을 유도할 수 있음을 시사한다.
B. 트리설파이드를 제어하기 위한 시스테인/시스틴 공급의 최적화
추가 실험은 트리설파이드 형성에 대한 생산 세포 배양 구동의 기본 배지에만 공급될 때 시스테인 농도의 영향을 평가하기 위해 수행했다. 항-OX40 Ab를 생산하는 CHO 세포를 14일 생산 세포 배양 구동에 대해 2리터 생물반응기에서 배양했다. 기본 배지는 (a) 6 mM 시스테인, (b) 4.5 mM 시스테인, 또는 (c) 3 mM 시스테인으로 보충되었다. 이러한 실험에서, 세포 배양물은 시스테인이 부재한 뱃치 공급 배지가 공급되었다. 샘플을 각 배양물로부터 제 7, 10, 12, 및 14일에 취하고, 각 시점에 항-OX40 Ab 중의 트리설파이드(%)는 상기한 바와 같이 HILIC-CAD를 통해 계측했다. 도 4a는 항-OX40 Ab의 트리설파이드 결합 수준은 생산 배양 초기에 시스테인의 초기 농도와 상관 관계가 있음을 예증한다. 3 mM 시스테인을 함유하는 기본 배지에서 배양된 세포에 의해 생산된 항-OX40 Ab의 트리설파이드(%)는 제7일로부터 제14일까지 꾸준히 감소하였고, 14일째에 수집 시 0% 트리설파이드였다. 도 4a를 참고한다. 각 배양물로부터의 항-OX40 Ab 수율은 비교가능하였다. 도 4b를 참고한다. 종합하면, 도 4a 및 4b의 결과는 기본 배지에서 시스테인 농도를 최적화하여 폴리펩타이드 수율에 영향을 미치지 않고 폴리펩타이드 내의 트리설파이드(%)가 상당히 감소되는 (또는 심지어 제거되는) 수집 시의 조건을 달성할 수 있음을 나타낸다. 하나의 특정 이론에 구속되지 않고, 이러한 결과는, 시스테인이 세포 배양 구동에서 초기에 낮은 농도로 제공될 때 세포에 의해 소비됨으로써 분비된 폴리펩타이드에서 트리설파이드 결합 형성을 유도하는 세포외 시스틴의 형성을 방지함을 시사한다.
C. 철 및 비타민 B 수준은 트리설파이드 결합 수준에 대해 영향을 미친다.
추가의 실험을 수행하여 배양 동안 폴리펩타이드 내 트리설파이드 형성에 대한 Fe 농도 및/또는 비타민 B (예: 리보플라빈, 피리독신, 엽산 및 시아노코발라민) 농도의 효과를 평가했다. CHO 세포 생산 항-OX40 Ab를 하기 표 2에 도시된 4개 프로토콜 중 하나에 따라 14일 생산 세포 배양 구동에 걸쳐 2 리터 생물반응기에서 배양하였다:
[표 2]
Figure pct00013
생산 세포 배양 유체의 성장 단계를 개시하기 위해, CHO 세포를 1L의 기본 배지를 함유하는 2-L 교반 생물반응기 (Applikon, Foster City, CA)에서 약 1.0 × 106 세포/mL로 접종했다. 용해된 산소, pH, 온도, 교반 조건은 상기한 바와 동일했다. 이후, 글루코스 농도, 삼투압, pH, 대사산물 농도, 생존 세포 밀도 (VCC), 세포 생존력 및 충전된 세포 용적을 상기한 바와 같이 측정했다. 또한, 상청액 샘플은 제6일 내지 14일에 매일 취하여 단백질 A 기반 HPLC 방법을 사용하여 생성물 농도를 계측했다. 상청액 샘플을 제0일, 3일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 및 14일에 취하여 아미노산 유도체화 방법에 이어 RP-HPLC 방법을 사용하여 세포외 아미노산 농도를 계측했다.
샘플을 각 배양물로부터 제 7, 10, 12, 및 14일에 취하고, 각 시점에 항-OX40 Ab 중의 트리설파이드(%)는 상기한 바와 같이 HILIC-CAD를 통해 계측했다. 도 5a에 나타난 바와 같이, 트리설파이드(%)는 프로토콜 A에 따라 배양된 세포에 의하여 생산된 항-OX40 Ab에서 가장 높았다. 프로토콜 C에 따라 배양된 세포에 의하여 생산된 항-OX40 Ab에서의 트리설파이드(%)는 제7일 내지 제14일에서 꾸준히 감소하였고, 제14일에서 수집 시에 트리설파이드 0%였다. 현저히, 프로토콜 B에 따라 배양된 세포에 의해 생산된 항-OX40 Ab의 트리설파이드 결합 수준은 제7일에 약 10%에서 제14일에 약 5%로 감소했다. 각 배양물로부터의 항-OX40 Ab 수율은 비교가능하였다. 도 5b를 참고한다.
도 5c는 다음의 각 세포 배양 구동의 종료시 배지 중 시스틴 (Cys-Cys)의 잔류 농도를 도시한다. 제14일에, 프로토콜 A 및 B의 배지에서 높은 수준의 Cys-Cys가 측정된 반면, 프로토콜 C의 배지에서는 Cys-Cys가 검출되지 않았다. 이러한 결과는 프로토콜 C에 사용된 기본 배지에서 저농도의 Cys가 배양 동안 세포에 의해 완전히 소비되었고, 프로토콜 A 및 B의 기본 배지에 제공된 고농도의 Cys는 배양 동안 세포에 의해 완전히 소비되지 않아서 잔류하는 Cys의 Cys-Cys로의 산화를 유도한다는 사실과 일치한다. 현저히, 프로토콜 B에서 14일째에 높은 잔류성 Cys-Cys는 항-OX40 Ab에서 증가된 트리설파이드 형성을 유도하지 않았다. 집합적으로, 이들 결과는 비타민 B 및 Fe 농도를 조절함으로써, Cys가 Cys-Cys로 전환될 때 경시적으로 높은 트리설파이드 결합 수준을 유도할 수 있는 조건인 높은 수준의 Cys의 존재하에서조차 트리설파이드 결합 수준이 감소될 수 있음을 예증한다. 비타민 B 및 Fe 농도를 조절함으로써, 트리설파이드 결합 수준은 Cys-Cys로 전환될 최소한의 잔류성 Cys가 존재하도록 기본 배지에서 Cys 농도를 최적화함으로써 수득된 것들과 유사한 수준으로 감소될 수 있다.
D. 세포 배양에서의 비타민 B 및 철의 상대적 효과
트리설파이드 형성 상에서의 비타민 B의 상대적 기여도를 계측하기 위하여, 항-OX40 Ab를 생산하는 CHO 세포를 하기 표 3에 도시된 4개 프로토콜 중 하나에 따른 구동, 상기 기술된 조건 하에서의 14일 생산 세포 배양에 걸쳐 1리터의 기본 배지를 함유하는 2 리터 생물반응기에서 배양하였다:
[표 3]
Figure pct00014
항-OX40 Ab의 샘플을 제10, 12일에서, 그리고 제14일에서 수집 시에 취하였고, 그리고 각 샘플에 대한 항-OX40 Ab 내 트리설파이드%를 상기 기술된 바와 같이 HILIC-CAD를 통하여 계측하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 트리설파이드%는, 프로토콜 D (즉, 낮은 Fe, 낮은 비타민 B) 및 F (즉, 높은 Fe 및 낮은 비타민 B)에 따라 배양된 세포에 의하여 생산된 수집된 항-OX40 Ab에서 최저치였다. 프로토콜 D에 따라 생산된 항-OX40 Ab는 약 17 내지 20% 트리설파이드를 가졌고, 프로토콜 F에 따라 생산된 항-OX40 Ab는 약 17 내지 25% 트리설파이드를 가졌다. 프로토콜 G (즉, 높은 Fe, 높은 비타민 B)에 따라 배양된 세포에 의하여 생산된 항-OX40 Ab에서의 트리설파이드%는 약 45%-55%였다. 도 2a 및 2b에 제시된 결과와 대조적으로, 프로토콜 E (즉, 낮은 Fe, 높은 비타민 B)에 따라 배양된 세포에 의하여 생산된 항-OX40 Ab에서의 트리설파이드 (%)는 약 35%-50%였다. 유사한 결과는 10일째 및 12일째에 취한 샘플에서 나타났다(데이터는 도시되지 않음). 비타민 B가 비-세포 효과를 갖지 않음을 도시하는, 도 2a 및 2b에 도시된 결과와 함께, 도 6에 도시된 결과는 비타민 B가 트리설파이드 결합 형성에 상당한 기여를 하고, 세포 관련 기전을 통해 그렇게 한다는 것을 보여준다.
실시예 3: 폴리펩타이드의 트리설파이드 형성에 대한, 환원제 및 킬레이트제를 갖는 재조합 발현된 폴리펩타이드의 수집 전 및 수집 후 세포 배양 유체의 배양 효과
추가 실험을 수행하여 수집된 폴리펩타이드에서 트리설파이드 결합 형성을 완화시키기 위한 전략을 식별했다. 항-OX40 Ab의 수집된 세포 배양 유체 (HCCF)을 하기 표 4에 개요된 조건들 중 하나의 조건 하에 배양했다. 각 조건은 온도, pH, 및 용해된 산소 (DO)에 대해 조절했다. 조건 2 및 3 하에, HCCF를 시스테인(즉, 예시적인 환원제)을 첨가하기 전에 EDTA (즉, 예시적인 금속 킬레이트제)와 30분 동안 배양했다. 혼합물을 각각 4.5시간 동안 유지시켜 전형적인 세포 배양 수집 지속 기간을 시뮬레이션했다. 샘플을 15℃ 수욕으로 옮기고, 4일 (96시간) 동안 유지시켜 다운스트림 정제 전에 냉각 유지 시간을 시뮬레이션했다.
[표 4]
Figure pct00015
도 7a에 나타난 바와 같이, 조건 1에서 HCCF에 시스테인 (Cys)을 첨가하면 항-OX40 Ab의 % 트리설파이드는 Cys 첨가 시간에 대해 측정된 배양 초기 30분 이내에 24%로부터 2%로 감소했다. 이어서, 트리설파이드 결합 수준은 33℃에서 4.5시간 후 약 11%로 증가했으며, 4일 동안 15℃에서 유지시킨 후 약 21%로 꾸준히 증가했다. 조건 2 하에서, EDTA로 배양된 HCCF에 대한 Cys의 첨가는 33℃에서 첫 배양 30분 이내에 항-OX40 Ab에서의 트리설파이드%를 24%에서 1% 미만(<)으로 감소시켰다. 트리설파이드 결합 수준은 4일 유지 기간 말기에 약 5%로 증가했다. 조건 3 하에서, EDTA로 배양된 HCCF에 대한 Cys의 첨가는 또한 20℃에서 첫 배양 30분 이내에 항-OX40 Ab에서의 트리설파이드%를 24%에서 1% 미만(<)으로 감소시켰다. 트리설파이드 결합 수준은 20℃에서 4.5시간 후 약 2%로 증가했으며, 15℃에서 4일 유지 후 약 4%로 추가로 증가했다. HCCF에 Cys 및 EDTA를 첨가하면 CE-SDS에 의해 주요 피크가 약간 감소되어 잠재적으로 환원제를 첨가하여 소량의 단백질 환원을 나타냈다. 도 7b를 참고한다.
유사한 연구를 또한 수집 전에 세포 배양 유체 (CCF)으로 수행했다. 표 5에서 개괄된 바에 같이, 온도, pH, 및 용존 산소 (DO)에 대하여 조절된 조건 하에서, CCF를 약 45분 동안 킬레이터 존재 또는 부재 하에서 배양하고, 이후 환원제의 존재 또는 부재 하에서 보충하였다. 이 혼합물을 4.5시간 동안 유지한 다음, 원심분리하고 여과하여 세포를 제거했다. 세포 제거 후, 샘플을 15℃에서 최대 4일(96시간) 동안 유지시켰다.
[표 5]
Figure pct00016
도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이, 환원제 또는 킬레이트제가 보충되지 않은 CCF(즉, 조건 A)에서 트리설파이드 결합 수준은 높게(약 35%) 유지되었다. CCF에 Cys만을 첨가하면(즉, 조건 B) 항-OX40 Ab에서 % 트리설파이드는 배양 초기 30분 이내에 37%로부터 6%로 감소했다. 트리설파이드 결합 수준은 33℃에서 4.5시간 후 약 4%로 증가했으며, 15℃에서 4일 유지한 후 수집-후 약 13%까지 꾸준히 증가하였다. CCF (즉, 조건 C, D, E, 및 F)에 대한 Cys 및 EDTA, NTS, EDDS, 또는 시트레이트 중 어느 것의 첨가는 또한, 항-OX40 Ab에서의 트리설파이드(%)를 첫 배양 30분 이내에 약 30-40%에서 3% 이하로 감소시켰다. 이어서, 트리설파이드 결합 수준은 33℃에서 4.5시간 배양을 통해 및 15℃에서 수집 후 4일 유지시킨 후 낮게, 즉 5% 이하로 유지되었다. 이와 함께, 도 7 및 8에 도시된 결과는 환원제의 첨가가 HCCF 또는 CCF에서 폴리펩타이드의 트리설파이드(%)를 감소시키고, 킬레이트제의 첨가가 트리설파이드 결합 수준을 낮게 유지하기 위해 필요함을 예증한다. 또한, 트리설파이드 결합 수준의 감소는 상당한 단백질 감소를 동반하지 않는다.
실시예 4: 폴리펩타이드 생산 동안 트리설파이드 형성에 대한, 하이포타우린의 효과
생산 동안 재조합 폴리펩타이드에서 트리설파이드 형성에 대한 하이포타우린의 효과를 시험하기 위해, 항체 생성물을 생산하는 CHO 세포 배양물은 높은 트리설파이드 결합 수준(즉, 25% 내지 45% 트리설파이드)을 갖는 폴리펩타이드를 생성하기 위한 공지된 공정으로 실행했다. 세포는 단일 접종물 트레인으로부터 공급되었고, 4개의 복제물 생산 배양물을 접종하는 데 사용되었다. 3개의 배양물을 하이포타우린이 없는 대조 조건하에 수행했다. 잔류하는 배양물은 기본 배지에 1g/L 하이포타우린을 포함했다. 모든 다른 배지/용액 첨가 및 공정 파라미터는 4개 배양물 모두와 동일했다. 세포 성장은 상당한 영향을 받지 않았지만, 생존력은 하이포타우린을 포함하는 조건에 대한 배양 말기에 더 잘 유지되었다(데이터는 도시되지 않음). 최종 수집된 생성물 중 트리설파이드 결합 수준은 하이포타우린을 포함하는 배양물의 경우 상당히 낮았다:
대조군 조건의 경우, 2.2% 대 39.9 ± 2.7%. 도 9를 참고한다.
실시예 5: 폴리펩타이드 생산 동안 트리설파이드 형성에 대한, 황 대사에서의 주요 역할을 하는 아미노산의 효과
생산 동안 재조합 폴리펩타이드에서 트리설파이드 형성에 대한 메티오닌 및 시스테인의 효과를 평가하기 위해, BsAb1을 생산하는 CHO 세포를 이하 표 6에 제시된 프로토콜 중 하나에 따르는 14일 생산 세포 배양 구동 동안 37℃ 및 7% CO2 (접종물 = 6 x 106 생존가능 세포/ml)에서 교반된 24 깊이-웰 플레이트에서 자동화된 로봇 세포 배양 시스템을 통해 배양하였다 (RTE = 미량 원소 용액, Cys 양은 첫 번째: 배지 및 두 번째: 공급물이다). 배양물은 10% 배양 용적으로 3일, 6일 및 9일째에 10mM 메티오닌을 공급했다. 총 36개 조건이 시험되었다.
[표 6*]
Figure pct00017
Figure pct00018
로봇에 의한 결과에 기초하는 트리설파이드 결합 수준 감소에 대한 메티오닌 및 세린의 영향에 대한 분류된 파라미터 추정치는 소프트웨어 JMP로 산출했다. 도 10은 트리설파이드 감소에 대한 메티오닌 농도 감소의 상당한 영향을 보여주는 예측 프로파일을 제공한다. (로봇에 의한 데이터에 기초하는 산출). 세린 농도는 BsAb1에서 트리설파이드 감소의 효과를 갖는 것으로 밝혀지지 않았다.
다음으로, BsAb1을 생산하는 CHO 세포를 하기 표 7에 도시된 2개 프로토콜 중 하나에 따라 상기 기술된 조건 하에서 2 리터 생물반응기에서 배양하였다:
[표 7]
Figure pct00019
pH 조절을 위해, 배지 내의 카보네이트 완충 시스템, CO2 가스발생 및 1M NaHCO3 용액을 사용했다. pO2는 3단계 통기 속도, 교반기 속도 및 산소 가스발생 캐스케이드를 사용하여 조절되었다.
프로토콜 I에서, 황 함유 아미노산 시스테인 및 메티오닌은 기본 배지에서 생략되었고, 시스테인은 공급 배지에서 생략되었고, 세린 농도는 시스테인의 결핍을 보충하기 위해 증가되었다. 도 11에 나타난 바와 같이, 황 함유 아미노산을 생략하면 수집 시 BsAb1에서 노브-앤드-홀(knob-and-hole) 영역에서 트리설파이드의 수준을 96% 감소시켰다(즉, 12.5%에서 0.5%로). 이러한 결과는 자동화 세포 배양 시스템 모두에서 관찰된 것들과 일치했다.
다음으로, BsAb1을 발현하는 CHO 세포는 이하 표 8에 제공된 두 프로토콜 중 하나에 따라 상기한 바와 같이 배양했다:
[표 8*]
Figure pct00020
도 10에 나타난 바와 같이, 기본 배지에서 메티오닌 농도를 감소시키면 수집 시 BsAb1에서 노브-앤드-홀 영역에서 트리설파이드의 수준을 17.4% 감소시켰다(즉, 4.6%에서 3.8%로). 이러한 결과는 자동화 세포 배양 시스템에서 관찰된 것들과 일치했다.
실시예 6: 포유동물 세포에 의해 생산된 폴리펩타이드의 트리설파이드 형성에 대한, 비타민 B 수준의 상대적 효과
제2 포유동물 세포주에 의하여 생산된 폴리펩타이드 상에서의 트리설파이드 형성에서의 비타민 B의 상대적 기여도를 평가하기 위하여, 항체를 생산하는 CHO 세포를 하기 표 9에 도시된 2개 프로토콜 중 하나에 따라 14 일 생산 세포 배양물 구동에 걸쳐 1.2 리터의 기본 배지를 함유하는 2 리터 생물반응기에서 배양하였다:
[표 9‡]
Figure pct00021
생산 세포 배양 유체의 성장 단계를 개시하기 위해, CHO 세포를 1.2L의 기본 배지를 함유하는 2-L 교반 생물반응기 (Sartorius, Goettingen, Germany)에서 약 1.0 x 106 세포/mL로 접종했다. 세포를 3일, 6일 및 9일에 세포 배양 유체 1리터당 100ml의 뱃치 공급 배지 첨가로 유가식 방식으로 배양하였다. 뱃치 공급 배지는 Cys 또는 Cys-Cys를 함유하지 않았다. 6mM Cys를 기본 배지 중 생산 배양물에 공급했다.
글루코스 농도를 매일 분석하고, 글루코스 농도가 3 g/L 이하로 떨어지면, 글루코스 고갈의 예방을 위해 글루코스의 500 g/L 모액으로 보충했다. 반응기에는 보정된 용해된 산소, pH, 및 온도 프로브가 장착되었다. 용해된 산소는 공기 및/또는 산소로의 살포를 통해 온-라인 제어했다. pH를 CO2 또는 Na2CO3의 첨가를 통하여 조절하였다. 세포 배양물을 pH 7.0 및 37℃의 온도에서 유지시켰다. 세포 배양물을 233 rpm에서 교반시켰고, 그리고 용존 산소 수준은 산소 포화도 30%였다. 샘플은 14일로부터 취하였고, 항체 중 % 트리설파이드를 계측했다
도 12에 나타난 바와 같이, 뱃치 공급 배지에서 비타민 B를 생략함으로써 배양물 중 비타민 B 농도를 감소시키면 트리설파이드 농도를 87.5%까지 상당히 감소시킨다(즉, 26.79%에서 3.34%로). 결과는 각 설정에 의한 2회 구동(생물학적 중복)에 대해 일관성이 있다.
선행 실시예는 단지 설명하기 위하여 제공되고, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한할 의도는 아니다. 본원에 도시되고 설명된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형들이 상기 설명으로부터 당업계의 숙련자들에게 명백하고, 첨부된 청구항의 범위 내에 속할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> GAWLITZEK, Martin MARKERT, Sven POPP, Oliver SHIRATORI, Masaru Ken TROEBS, Thomas WUU, Jessica <120> METHODS OF DECREASING TRISULFIDE BONDS DURING RECOMBINANT PRODUCTION OF POLYPEPTIDES <130> 146392036540 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/334,433 <151> 2016-05-10 <160> 32 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Ser Ser Tyr Tyr Met Ala 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Asp Ser Tyr Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Glu <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Arg Ala 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Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His 225 230 235 240 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 25 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 115 120 125 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 180 185 190 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 195 200 205 Glu Pro Lys Ser Cys 210 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser 1 5 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Thr 1 5 10 <210> 31 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser 20 25 30 Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser 85 90 95 Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (49)

  1. 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법으로서,
    (a) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 기본 배지와 접촉시키는 단계로서, 상기 기본 배지가 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 단계:
    i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철,
    ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2),
    iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6),
    iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 엽산 (비타민 B9),
    v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12),
    vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및
    vii) 약 0 내지 약 1.58 mM 메티오닌;
    (b) 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 숙주 세포에 의해 생산된 상기 폴리펩타이드를 수집하는 단계;를 포함하는, 방법.
  2. 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법으로서,
    (a) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 기본 배지와 접촉시키는 단계로서, 상기 기본 배지가 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 단계:
    i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철,
    ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2),
    iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6),
    iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 엽산 (비타민 B9),
    v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12),
    vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및
    vii) 약 0 내지 약 1.58 mM 메티오닌;
    (b) 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 숙주 세포에 의해 생산된 상기 폴리펩타이드를 수집하는 단계;를 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 하나 이상의 성분의 농도가 단계 (a)에서 명시된 농도와 상이한 것 이외에는, 상기 수집된 폴리펩타이드가 동일한 조건 하에서 생산된 폴리펩타이드보다 낮은 트리설파이드 결합 수준을 갖는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기본 배지에 시스틴이 부재한, 방법.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기본 배지는 약 1.4 mM 내지 3 mM 시스테인 또는 시스틴을 포함하는, 방법.
  6. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기본 배지는 약 0 mM 내지 약 1.58 mM 메티오닌, 및 약 0 mM 내지 약 3 mM 시스테인을 포함하는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기본 배지는 약 6mM 시스테인을 포함하는, 방법.
  8. 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법으로서,
    (a) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지가 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 단계:
    i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철,
    ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2),
    iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6),
    iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9),
    v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12),
    vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및
    vii) 약 0 내지 약 4.5 mM 메티오닌;
    (b) 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계;
    (c) 그리고 상기 숙주 세포에 의해 생산된 상기 폴리펩타이드를 수집하는 단계;를 포함하는, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 세포 배양 배지 내 상기 성분 중 하나 이상의 농도는 접종 후 1회 이상의 첨가의 누적 농도인, 방법.
  10. CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체, 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법으로서,
    (a) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지가 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 단계:
    i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철,
    ii) 약 0.11 μM 내지 약 2μM 리보플라빈 (비타민 B2),
    iii) 약 4.5 μM 내지 약 80 μM 피리독신 또는 피리독살 (비타민 B6),
    iv) 약 3.4 μM 내지 약 23 μM 폴레이트/엽산 (비타민 B9),
    v) 약 0.2 μM 내지 약 2.5 μM 시아노코발라민 (비타민 B12),
    vi) 약 9 mM 내지 약 10 mM 하이포타우린; 및
    vii) 약 0 내지 약 4.5 mM 메티오닌;
    (b) 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계;
    (c) 그리고 상기 숙주 세포에 의해 생산된 상기 폴리펩타이드를 수집하는 단계;를 포함하는, 방법.
  11. CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체, 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한 방법으로서,
    (a) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지가 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 단계:
    i) 약 2 μM 내지 약 35μM 철, 및
    ii) 약 0 내지 약 4.5 mM 메티오닌;
    (b) 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 숙주 세포에 의해 생산된 상기 폴리펩타이드를 수집하는 단계;를 포함하는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 공급물을 추가로 포함하며, 그리고 상기 공급 배지에는 철, 리보플라빈, 피리독신, 피리독살, 엽산, 및 시아노코발라민 중 하나 이상이 부재한, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 공급물은 뱃치 공급물인, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 뱃치 공급 배지에는 시스틴이 부재한, 방법.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서, 상기 뱃치 공급 배지에는 시스테인이 부재한, 방법.
  16. 청구항 13 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뱃치 공급 배지에는 메티오닌이 부재한, 방법.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 철이 제2철(Fe3+) 또는 제1철(Fe2+)인, 방법.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 단계들을 추가로 포함하는, 방법:
    (I) 상기 숙주 세포의 상기 배양물을, 수집 전에 킬레이트제 및 환원제로 보충하는 단계;
    (II) 상기 숙주 세포의 수집-전 세포 배양 유체(PHCCF)에, 킬레이트제 및 환원제를 보충하는 단계; 또는
    (III) 상기 숙주 세포의 수집된 세포 배양 유체(HCCF)에, 수집 후 킬레이트제 및 환원제를 보충하는 단계.
  19. 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩타이드 내 트리설파이드 결합의 수준을 감소시키기 위한 방법으로서,
    (i) 상기 숙주 세포의 배양물을, 수집 전에 환원제 및 킬레이트제로 보충하는 단계;
    (ii) 상기 숙주 세포의 수집-전 세포 배양 유체(PHCCF)에, 킬레이트제 및 환원제를 보충하는 단계; 또는
    (iii) 상기 숙주 세포의 수집된 세포 배양 유체(HCCF)에, 환원제 및 킬레이트제를 보충하는 단계;를 포함하는, 방법.
  20. 청구항 15 또는 16에 있어서, 상기 숙주 세포의 상기 배양물, 상기 PHCCF, 또는 상기 HCCF는, 상기 환원제가 보충되기 이전에 상기 킬레이트제로 보충되는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 숙주 세포의 상기 배양물, 상기 PHCCF, 또는 상기 HCCF는, 상기 환원제가 보충된 시점으로부터 약 60분 내지 약 30분 이전에 상기 킬레이트제로 보충되는, 방법.
  22. 청구항 18 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제 및 환원제는 약 30 분 내지 약 4 일 동안 상기 숙주 세포의 배양물, PHCCF, 또는 HCCF 중에서 유지되는, 방법.
  23. 청구항 18 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포의 상기 배양물, 상기 PHCCF, 또는 상기 HCCF가 약 15℃ 내지 약 37℃의 온도에서 유지되는, 방법.
  24. 청구항 18 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포의 상기 배양물, 상기 PHCCF, 또는 상기 HCCF가 약 6.5 내지 약 7.5의 pH에서 유지되는, 방법.
  25. 청구항 18 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포의 상기 배양물, 상기 PHCCF, 또는 상기 HCCF 중 용존 산소 (DO)의 양은 적어도 약 15%인, 방법.
  26. 청구항 18 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포의 상기 배양물, 상기 PHCCF, 또는 상기 HCCF는 약 15℃ 내지 37℃의 온도 및 약 6.5 내지 약 7.5의 pH에서 유지되며, 그리고 상기 숙주 세포의 상기 배양물, 또는 상기 HCCF 중 용존 산소 (DO)의 양은 적어도 약 15%인, 방법.
  27. 청구항 18 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: 글루타티온 (GSH), L-글루타티온 (L-GSH), 시스테인, L-시스테인, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP), 2,3-tert-부틸-4-하이드록시아니솔, 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀, 3-아미노프로판-1-설폰산, 아데노실호모시스테인, 안세린, B-알라닌, B-카로텐, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 카르노신, 카르베딜롤, 커큐민, 시스테아민, 시스테아민 하이드로클로라이드, 덱사메타손, 디알릴디설파이드, DL-란티오닌, DL-티오르판, 에톡시퀸, 갈산, 겐티스산 나트륨 염 수화물, 글루타티온 디설파이드, 글루타티온 환원 에틸 에스테르, 글라이신, 하이드로코르티손, 하이포타우린, 이세티온산 암모늄 염, L-시스테인-글루타티온 디설파이드, L-시스테인설핀산 1수화물, 리포산, 환원된 리포산, 머캅토프로피오닐 글라이신, 메티오닌, 메틸렌비스(3-티오프로피온산), 옥살산, 쿠에르시트린 수화물, 레스베라트롤, 레티노산, S-카복시메틸-L-시스테인, 셀레늄, 셀레노메티오닌, 은 디에틸디티오카바메이트, 타우린, 티오락트산, 트리신, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B4, 비타민 B5, 비타민 B6, 및 비타민 B11.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 환원제는 시스테인 및 L-시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 환원제는 L-시스테인이며, 그리고 상기 L-시스테인은 상기 숙주 세포의 상기 배양물 또는 상기 HCCF에 첨가되어 약 3 mM 내지 약 6 mM의 최종 농도를 달성하는, 방법.
  30. 청구항 18 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 킬레이트제가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민-N,N'-디석신산 (EDDS), 시트레이트, 옥살레이트, 타르트레이트, 에틸렌-비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산 (EGTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 5-설포살리실산, N,N-디메틸도데실아민 N-옥사이드, 디티오옥사마이드, 에틸렌디아민, 살리실알독심, N-(2’-하이드록시에틸)이미노디아세트산(HIMDA), 옥신 퀴놀린올, 및 설폭신.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민-N,N'-디석신산 (EDDS), 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 킬레이트제가 상기 숙주 세포의 상기 배양물 또는 상기 HCCF에 첨가되어 최종 농도 20mM를 달성하는, 방법.
  33. 청구항 1 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 상기 세포 배양 배지로 분비되는, 방법.
  34. 청구항 1 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수집된 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 재조합 숙주 세포인, 방법.
  36. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포인, 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 포유동물 세포가 CHO 세포인, 방법.
  38. 청구항 1 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 평균 % 트리설파이드 결합이 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만인, 방법.
  40. 청구항 1 내지 9 및 12 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항체 또는 이의 단편인, 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항체 단편이며, 그리고 상기 항체 단편은 Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, (scFv)2, dAb, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  42. 청구항 40에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는, 방법: BMPR1B, E16, STEAP1, 0772P, MPF, Napi3b, Sema 5b, PSCA hlg, ETBR, MSG783, STEAP2, TrpM4, CRIPTO, CD21, CD79b, FcRH2, HER2, NCA, MDP, IL20Rα, 브레비칸, EphB2R, ASLG659, PSCA, GEDA, BAFF-R, CD22, CD79a, CXCR5, HLA-DOB, P2X5, CD72, LY64, FcRH1, IRTA2, TENB2, PMEL17, TMEFF1, GDNF-Ra1, Ly6E, TMEM46, Ly6G6D, LGR5, RET, LY6K, GPR19, GPR54, ASPHD1, 티로시나제, TMEM118, GPR172A, CD33, CLL-1, C5, OX40, α4β7 및 αEβ7 인테그린 이종이량체, IL-13, CD-20, FGFR, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 아밀로이드 베타, HER3, 보체 인자 D, IL-22c, PD-L1, PD-L2, PD-1, VEGF, 안지오포이에틴 2, CD3, FAP, CEA, 및 IL-6.
  43. 청구항 40에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 항체이고, 그리고 상기 항체가 이중특이적 항체인, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 또는 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체인, 방법.
  45. 청구항 1 내지 9 및 12 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 면역사이토카인인, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 면역사이토카인이 CEA-IL2v 또는 FAP-IL2v인, 방법.
  47. CEA-IL2v 면역사이토카인, FAP-IL2v 면역사이토카인, 항-CEA/항-CD3 이중특이적 항체, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이적 항체, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이적 항체, 항-C5 항체, 및 항-CD40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 트리설파이드 결합 수준을 감소시키기 위한, 세포 배양 배지 내 약 0 내지 약 4.5 μM 메티오닌의 용도.
  48. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 따라서 생산된, 폴리펩타이드.
  49. 청구항 48에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 평균 % 트리설파이드가 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만인, 폴리펩타이드.

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