DE10227606B3

DE10227606B3 - Verwendung von Thrombopoietin zur Kultivierung von Hepatozyten

Info

Publication number: DE10227606B3
Application number: DE2002127606
Authority: DE
Inventors: Augustinus Bader; Eva Schmelzer
Original assignee: GENEDRUGS GmbH; Bionethos Holding GmbH
Current assignee: BADER, AUGUSTINUS, PROF. DR., 04668 PARTHENSTE, DE
Priority date: 2002-06-20
Filing date: 2002-06-20
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2022-06-21
Also published as: AU2003246568A8; WO2004001025A1; AU2003246568A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Thrombopoietin (TPO) zur Kultivierung von embryonalen Hepatozyten, wodurch eine deutliche Vermehrung der Zellzahl embryonaler Hepatozyten bewirkt und gleichzeitig eine Expression wesentlicher leberspezifischer Differenzierungsmerkmale, ähnlich denen adulter Hepatozyten erreicht wird, insbesondere wenn die embryonalen Hepatozyten mit Hilfe von Feeder-Zellen, vor allem 3T3-Feeder-Zellen, kultiviert werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Thrombopoietin (TPO) zur Kultivierung von embryonalen bzw. fötalen Hepatozyten.

Kulturen primärer embryonaler bzw. fötaler oder adulter Hepatozyten besitzen ein breites Spektrum an Anwendungen. So ermöglichen sie als in vitro Modell Fragen zum Einfluss spezifischer Faktoren auf die Zell- und Organentwicklung zu beantworten. Des weiteren kann ihr Einsatz als pharmakologisches Testsystem („drug screening") und im Leberbioreaktor („bioartificial liver Support system") als temporäres organunterstützendes/ersetzendes System im Falle von Leberversagen erfolgen.

Klinische bzw. pharmakologische Anwendungen, insbesondere jedoch der Einsatz einer bioartifiziellen Leber, verlangen eine maximale Zellzahl und metabolisch aktive, differenzierte Zellen mit einer in vivo entsprechenden metabolischen Kapazität.

Erste Kulturen adulter primärer Hepatozyten wurden zu Beginn der 50er Jahre angelegt. Bis zu einer Einführung einer optimierten Isolation der Hepatozyten durch Perfusion der Leber war es aber nicht möglich, Hepatozyten in vitro über einen längeren Zeitraum in Kultur ohne Verlust ihrer leberspezifischen Funktionen zu halten. Verbesserungen der Perfusionsmethode führten zur schonenderen Isolation der Hepatozyten und höheren Überlebensraten.

Neben Kulturen vereinzelter, adhärent wachsender Hepatozyten wurden auch Gewebekulturen aus dem Ganzorgan sowie Suspensionskulturen entwickelt. Gewebekulturen werden auch heute noch, vor allem in der pharmazeutischen Forschung, eingesetzt. Sie besitzen für kurze Zeit das gesamte Spektrum leberspezifischer metabolischer Aktivität; ihr Einsatz ist aber durch den raschen Verlust ihrer Kapazität auf etwa 24 h begrenzt. Ebenso weisen Suspensionskulturen einen raschen Verlust ihres leberspezifischen Metabolismus auf, speziell des Cytochrom P450 Systems.

Fortschritte in der adhärenten Kultur adulter vereinzelter Hepatozyten wurden durch die Verwendung von Matrizes als Kultursubstrat erzielt, wie z.B. Collagen I (siehe z.B. Nakajima und Shimbara (1996) Biochem. Biophys. Res. Com., 222, 664–668), Laminin (siehe z.B. Bissel et al. (1987) J. Clin. Invest., 79, 801–812), Matrigel (siehe z. B. Block et al. (1996) J. Cell. Biol., 132(6), 1133–1149), Einbettung von Hepatozyten in Matrizes (siehe z. B. Bader et al. (1994) Xenobiotica, 24, 623–633 oder Gomez-Lechon et al. (1998) J. Cell. Physiol., 177(4), 553–562) und zusätzlicher Kokultur mit feeder-Zellen (siehe z. B. Bader et al. (1996) Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 353(4), 461–473 oder Michalopoulos et al. (1999) Hepatology, 29(1), 90–100), sowie natürlich durch die Optimierung (d.h. Imitation der in vivo Situation) der Mediumzusammensetzung bzw. Supplementierung des Mediums mit Insulin, Glukagon, Glukokortikoiden u.a. erlangt.

Trotz der erreichten Optimierungen ist es bislang nicht gelungen, adulte Hepatozyten in vitro entsprechend zu vermehren, so dass größere Mengen Hepatozyten generiert werden, die leberspezifische Funktionen exprimieren. Bei dem erwünschten Einsatz humaner Hepatozyten für drug screening Modelle oder im artifiziellen leberunterstützenden Bioreaktor ist dies jedoch unabdingbare Vorraussetzung, da nicht auf eine unbegrenzte Anzahl humaner Hepatozyten zurückgegriffen werden kann.

Hepatische Zelllinien, die seit den 60er Jahren etabliert wurden, sind in zweifacher Hinsicht kein geeigneter Ersatz für primäre Hepatozyten: im Bioreaktor oder in der Gentherapie sind sie bezüglich ihres onkogenen Potentials nicht geeignet und generell weisen sie nicht das volle Spektrum leberspezifischer Funktionen auf. So produziert z.B. die Ratten Hepatomzelllinie H4II-E-C3 etwa dreimal weniger Albumin und über zehnmal weniger Transferrin und Hämopexin als primäre Hepatozyten in Kultur. Die humane Hepatoblastomzelllinie HepG2 zeigt keine Reaktion auf die als Arzneimittel eingesetzten Hemmer der Cholesterinsynthese CI-981, Pravastatin, Fluvastatin und BMY-21950 im Gegensatz zu Ergebnissen in vivo und an primären Hepatozyten der Ratte in Kultur.

Eine sinnvolle Alternative zur Kultur adulter Hepatozyten kann die Expansion embryonaler Hepatozyten aufgrund ihres erhöhten Potentials zur Proliferation darstellen (siehe z. B. Hamamoto et al. (1999) Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(2), 395–401). So bestünde die Möglichkeit, größere Mengen primärer Hepatozyten zu gewinnen. Erste Isolationen wurden enzymatisch Anfang der 70er Jahre durchgeführt. Hepatozyten aus Lebern von E18 Embryonen (d.h. 18 Tage nach Befruchtung der Eizelle) der Ratte wurden durch Entfernung des Calciums mittels EDTA und anschließender enzymatischen Hydrolyse mit Lysozym gewonnen. Erste Kulturen embryonaler Hepatozyten im Monolayer erfolgten mit E19–21 Hepatozyten der Ratte, die durch Hydrolyse mit Collagenase gewonnen und in Plastikschalen kultiviert wurden.

Zusammenfassend kann folglich festgestellt werden, dass der Einsatz permanenter hepatischer Zelllinien (z.B. Hep-G2) zwar unproblematisch den Bedarf großer Zellmengen decken würde, doch die mangelnde komplexe metabolische Kapazität und die potentielle Gefahr einer Invasion der onkogenenen Zellen in den Blutkreislauf des Patienten bei Einsatz im Bioreaktor lassen diesen fragwürdig erscheinen. Primäre adulte Hepatozyten können unter geeigneten Kulturbedingungen mit nur geringem Verlust ihrer in vivo Eigenschaften mittlerweile über längere Zeiträume in Kultur gehalten werden. Speziell für den Einsatz im Leberbiore aktor wird jedoch eine maximale Anzahl von etwa 2,5 bis 5·10¹⁰ Hepatozyten benötigt, die bei dem Einsatz von autologen, also humanen Material, nicht zur Verfügung steht. Bei schon erfolgreich eingesetzten porcinen Hepatozyten im extrakorporalen Support besteht zudem die Gefahr viraler Übertragungen, z.B. porciner endogener Retroviren (PERV).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, für die Kultivierung von embryonalen bzw. fötalen Hepatozyten geeignete Kulturbedingungen zu finden.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass der Zusatz von TPO eine deutliche Vermehrung der Zellzahl embryonaler bzw. fötaler Hepatozyten bewirkt und gleichzeitig eine Expression wesentlicher leberspezifischer Differenzierungsmerkmale ähnlich denen adulter Hepatozyten erreicht wird, insbesondere wenn die embryonalen Hepatozyten mit Hilfe von Feeder-Zellen, vor allem 3T3-Feeder-Zellen, kultiviert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung von TPO zur Kultivierung von embryonalen Hepatozyten, vorzugsweise von embryonalen Hepatozyten früher Entwicklungsstadien, vor allem solcher embryonaler Hepatozyten, die sich im Stadium vor Beginn der Blutbildung befinden. Hierunter versteht man vor allem embryonale Hepatozyten in Entwicklungsstadien vor dem Entwicklungsstadium E14.

TPO, auch bekannt als c-Mpl-Ligand, mpl-Ligand, Megapoietin oder Megakariozyten-Wachstums- und Entwicklungsfaktor, wurde bislang nicht in der Kultur von Hepatozyten oder anderen primären Zellen eingesetzt, außer von Thrombozyten oder ihren Vorläufern. TPO ist essentiell notwendig für die Entwicklung und Proliferation von Megakariozyten und Thrombozyten und somit für die Bildung von Blutplättchen. TPO wird als 332 Aminosäure-langes Protein konstitutiv in der Leber und in den Nieren produziert.

TPO ist käuflich zu erwerben, z.B. von der Fa. CellSystems GmbH, St. Katharinen. Für die Kultivierung von humanen Hepatozyten wird die Verwendung von humanem TPO bevorzugt. Des weiteren ist die Herstellung und Charakterisierung von TPO und dessen Varianten beispielsweise in EP 1 201 246 , WO95/21919 , WO95/21920 und WO95/26746 beschrieben.

Als Varianten von TPO eignen sich beispielsweise die in der WO95/21919 beschriebenen TPO-Derivate oder die in WO95/21920 beschriebenen allelischen Varianten oder Spezieshomologe oder das in WO95/26746 und EP 1 201 246 beschriebene pegylierte TPO, ohne sie darauf zu beschränken. Als pegyliertes TPO wird im Sinne der vorliegenden Erfindung TPO-Derivate verstanden, die an ein organisches Polymer, wie z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylen, gebunden sind. Als weitere Varianten von TPO werden auch Derivate von TPO verstanden, die eine Sequenzidentität von weniger als 100% besitzen und dennoch die Aktivität von TPO, wie vorzugsweise in EP 1 201 246 beschrieben, besitzen. Üblicherweise besitzen TPO-Derivate eine Sequenzidentität von mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, insbesondere mindestens 80% und vor allem mindestens 85% im Vergleich zu humanem TPO einschließlich derer Fragmente mit TPO-Aktivität. Eine besonders bevorzugte TPO-Aktivität im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Beschleunigung der Proliferation, Differenzierung und/oder Reifung von Megakaryozyten oder Megakaryozyten-Vorläufer in Plättchen-produzierende Formen dieser Zellen durch TPO oder dessen Varianten. Beispielsweise gehört auch Erythropoietin als embryonale Form des TPO mit den in dieser Erfindung beschriebenen Eigenschaften zu den TPO-Varianten.

Üblicherweise wachsen die embryonalen Hepatozyten auf einer Matrix, vorzugsweise auf einer die Proliferation unterstützenden Matrix, insbesondere auf einer Laminin- und/oder Collagen IV-Matrix, oder auf Feeder-Zellen, vorzugsweise auf zur Differenzierung führenden Feeder-Zellen, insbesondere auf Collagen I-, 3T3- und/oder MRC-5-Feeder-Zellen. Bevorzugt werden die embryonalen Hepatozyten gemäß der vorliegenden Erfindung auf Feeder-Zellen, vorzugsweise auf 3T3-Feeder-Zellen, kultiviert, da sie durch Zusatz von TPO im allgemeinen stärker proliferieren als auf Matrizes. So führte die Kultivierung auf 3T3-Feeder-Zellen mit Zusatz von TPO zu einer starken Vermehrung der Zellzahl (z.B. eine 30fache Zellvermehrung nach 12 Tagen in Kultur), wobei die kultivierten embryonalen Hepatozyten nach 5 DIV ("days in vitro") ein den adulten Lebern sehr ähnelndes Expressionsprofil aufwiesen, was überraschend war. Somit führt die Verwendung von TPO zu einer Kultur, welche als ein äquivalentes Modell einer adulten Leber angesehen werden kann. Im Vergleich dazu ergab eine Kultivierung auf Collagen IV von allen benutzten Proteinmatrizes die höchste Zellvermehrung (z.B. 7fach) mit Zusatz von TPO und HGF. Somit konnte erstmalig ein proliferativer Effekt von TPO auf embryonalen Hepatozyten in Kultur gezeigt werden.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TPO zusammen mit weiteren Wachstumsfaktoren, vorzugsweise Hepatozyten-Wachstumsfaktor ("hepatocyte growth factor", HGF), epidermaler Wachstumsfaktor ("epidermal growth factor", EGF) und/oder transformierender Wachstumsfaktor ("transforming growth factor", TGF) alpha, insbesondere HGF eingesetzt. Interessanterweise führte die Kultivierung mit den Wachstumsfaktor TPO und vorzugsweise zusammen mit HGF im wesentlichen nur zu einer Hochregulation der Akutphaseproteine und nicht auch der Protooncogene, vor allem c-met, welches den Rezeptor für HGF kodiert, was wiederum überraschend war.

Die einzelnen Wachstumsfaktoren TPO, Varianten von TPO und/oder weitere Wachstumsfaktoren, insbesondere die oben genannten, vor allem HGF, werden üblicherweise in einer Konzentration von ca. 1 bis ca. 100 ng/ml Kultur, vorzugsweise von ca. 10 bis ca. 20 ng/ml, insbesondere von ca. 20 ng/ml eingesetzt.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beschreibung der Figuren

1 zeigt die Zellzahlbestimmung embryonaler Hepatozyten in Kultur auf Laminin nach 2, 5 und 12 Tagen in Kultur mit Medienansätzen 1–12 mit Wachstumsfaktoren. Mittelwerte aus 3 Präparationen mit je 4 Wiederholungen ± SEM.

2 zeigt die Zellzahlbestimmung embryonaler Hepatozyten in Kultur auf Collagen IV nach 2, 5 und 12 Tagen in Kultur mit Medienansätzen 1–12 mit Wachstumsfaktoren. Mittelwerte aus 3 Präparationen mit je 4 Wiederholungen ± SEM.

3 zeigt die Zellzahlbestimmung embryonaler Hepatozyten in Kultur auf Collagen I nach 2, 5 und 12 Tagen in Kultur mit Medienansätzen 1–12 mit Wachstumsfaktoren. Mittelwerte aus 3 Präparationen mit je 4 Wiederholungen ± SEM.

4 zeigt die Zellzahlbestimmung embryonaler Hepatozyten in Kultur auf Matrigel nach 2, 5 und 12 Tagen in Kultur mit Medienansätzen 1–12 mit Wachstumsfaktoren. Mittelwerte aus 2 Präparationen mit je 4 Wiederholungen ± SEM.

5 zeigt die Zellzahlbestimmung embryonaler Hepatozyten in Kultur auf 3T3 feeder-Zellen nach 2, 5 und 12 Tagen in Kultur mit Medienansätzen 1–12 mit Wachstumsfaktoren. Mittelwerte aus 2 Präparationen mit je 4 Wiederholungen ± SEM.

6 zeigt die Zellzahlbestimmung embryonaler Hepatozyten in Kultur auf MRC-5 Feeder-Zellen nach 2, 5 und 12 Tagen in Kultur mit Medienansätzen 1–12 mit Wachstumsfaktoren. Mittelwerte aus 3 Präparationen mit je 4 Wiederholungen ± SEM.

7 zeigt die Zellzahlbestimmung embryonaler Hepatozyten in Kultur auf primären Fibroblasten nach 2, 5 und 12 Tagen in Kultur mit Medienansätzen 1–12 mit Wachstumsfaktoren. Mittelwerte aus 3 Präparationen mit je 4 Wiederholungen ± SEM.

Beispiele
Die Konzentrationsangaben "mM" beziehen sich auf mMol/l.
1. Isolierung embryonaler Lebern
Embryonale Rattenhepatozyten wurden aus Lebern von Embryonen im Embryonalentwicklungsstadium (E) 12 bis 14 Tage post coitum isoliert. Dazu wurden trächtige Ratten (Rattus norvegicus, Sprague Dawley) in Ätheratmosphäre betäubt. Betäubte Ratten wurden mit 200 μl Ketanest und 150 μl Rompun pro Ratte durch intraperitoneale Injektion narkotisiert und relaxiert. Nach alkoholischer Desinfektion der Bauchseite wurde der Bauchraum eröffnet und der Uterus steril entnommen. In einer mit gekühlter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gefüllten Petrischale wurden die Embryonen aus dem Uterus präpariert. Embryonen wurden in eiskaltem Minimal Essential Medium Hanks (MEM), 25 mM HEPES gesammelt. Mit Hilfe eines Binokulars wurden die Lebern aus den Embryonen präpariert.
2. Mechanische Isolierung embryonaler Hepatozyten
Die präparierten Lebern wurden in eiskaltem MEM, 25 mM Hepes, Glutamax aufbewahrt und in einem Eppendorfgefäß mit 1 ml MEM, 25 mM HEPES, Glutamax, 0,05% DNase gesammelt. Die Lebern wurden mittels einer angeschmolzenen 1 ml Kunststoffpipettenspitze ca. fünfmal trituiert. Die grob zerklei nerten Lebern inkubierten 15 min bei 37°C im Wasserbad, danach erfolgte ca. zehnmaliges Trituieren mit einer angeschmolzenen 100 μl Kunststoffpipettenspitze. Nach erneuter Inkubation für 15 min bei 37°C im Wasserbad bzw. direkt nach einmaliger Inkubation für 15 min wurde nochmals ca. zehnmal mit einer angeschmolzenen 100 μl Kunststoffpipettenspitze bis zur Homogenität trituiert. Die Suspension der Hepatozyten wurde 5 min bei 243 g, RT, zentrifugiert. Der Mediumüberstand wurde abgesaugt, 1 ml MEM, 25 mM HEPES, 0,05% DNase hinzugefügt und das Pellet durch ca. fünfmaliges Trituieren mit einer angeschmolzenen 100 μl Kunststoffpipettenspitze resuspendiert. Es erfolgte eine Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblaufärbung in einer Neubauer Zählkammer und anschließend die Aussaat der Hepatozyten.
3. Aussaat und Kultur der Hepatozyten
Isolierte Hepatozyten wurden in 37°C temperiertes William`s Medium E (WE) aufgenommen. Dieses wurde supplementiert mit 5% FCS, Glukagon 0,1 μg/ml, Insulin 10 μg/ml, Dexamethason 0,7 μg/ml und Gentamycin 50 μg/ml. Alle Aussaaten und Versuche wurden mit Hepatozyten durchgeführt, die 2 × 15 min mechanisch isoliert wurden. Die Aussaat erfolgte mit einer Zelldichte von 20.000 Zellen/cm². Je nach Versuch wurde in unterschiedlichen wells bzw. Flaschen [Falcon, bzw. 4 well Platte Nunc] ausgesät. Dabei wurde folgendes Volumen an Medium verwendet:

96 well Platte	50 μl/well
48 well Platte	300 μl/well
4 well Platte	300 μl/well
24 well Platte	500 μl/well
75 cm² Flasche	20 ml
175 cm² Flasche	50 ml

Ausgesäte Hepatozyten wurden in einem Inkubator der Firma Heraeus [Cytoperm 2, Kendro, Hamburg] bei 37°C, 95% Luftfeuchte, 20% Sauerstoffgehalt und 5% Kohlendioxidgehalt kultiviert.
4. Beschichtungen und Feeder-Zellen
Die Aussaat der Hepatozyten erfolgte in wells oder Flaschen [Falcon] mit unterschiedlichen Beschichtungen bzw. auf konfluent gewachsenen feeder-Zellen. Die Beschichtung wurde direkt auf der Kunststoffoberfläche angelegt.
Collagen I
Collagen I [Becton Dickinson] wurde mit steriler 0,02 N Essigsäure verdünnt, so dass eine Konzentration von 10 μg/cm² erreicht wurde. Nach dem Ausplattieren der Lösung wurde mindestens 1 h bei RT inkubiert. Danach wurden Lösungsüberstände abgesaugt und die Oberfläche einmal mit sterilem demineralisiertem H₂O zur Säurebeseitigung gewaschen. Geöffnete Platten wurden unter der Sterilbank getrocknet. Getrocknete Platten wurden bis zur Verwendung (1 bis 2 Tage) im Kühlschrank aufbewahrt.
Laminin
Tiefgefrorenes Laminin [Becton Dickinson] wurde bei 4°C aufgetaut. Alle Pipettiervorgänge wurden mit gekühlten Spitzen ausgeführt. Mit kalter steriler PBS wurde das Laminin auf eine Konzentration von 10 μg/cm² verdünnt. Die Lösung wurde auf Glasslides oder Wells auftragen und mindestens 1 h bei RT inkubiert. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt und einmal mit sterilem deminineralisiertem H₂O gewaschen. Geöffnete Platten wurden unter der Sterilbank getrocknet. Getrocknete Platten wurden bis zur Verwendung (1 bis 2 Tage) im Kühlschrank aufbewahrt.
Collagen IV
Tiefgefrorenes Collagen IV [Becton Dickinson] wurde langsam bei 4°C aufgetaut und kurz und kräftig durchmischt. Mit steriler 0,05 N HCl wurde das Collagen auf eine Konzentration von 10 μg/cm² verdünnt. Die Lösung wurde auf Glasslides oder Wells aufgetragen und mindestens 1 h bei RT inkubiert. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt und einmal mit sterilem demineralisiertem H₂O gewaschen. Geöffnete Platten wurden unter der Sterilbank getrocknet. Getrocknete Platten wurden bis zur Verwendung (1 bis 2 Tage) im Kühlschrank aufbewahrt.
Matrigel
Tiefgefrorenes Matrigel [Wachstumsfaktor reduziert, Becton Dickinson] wurde auf Eis langsam aufgetaut. Alle Pipettiervorgänge wurden mit gekühlten Spitzen ausgeführt. Mit eiskaltem, serumfreien Medium wurde das Matrigel auf eine Konzentration von 10 μg/cm² verdünnt. Die Lösung wurde auf Glasslides oder Wells auftragen und mindestens 1 h bei RT inkubiert. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt und einmal mit serumfreien Medium gewaschen. Die beschichteten Platten wurden direkt für die Zellkultur verwendet.
Feeder-Zellen
Als Feeder-Zellen wurden 3T3 (swiss Albino Maus embryonale Fibroblasten Linie; ACC 173, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig), MRC-5 (humane fötale Lungenfibroblasten Linie; CCL-171, American Type Culture Collection, Manassas, U.S.A.) sowie primäre Fibroblasten (embryonale primäre Fibroblasten aus der Kopfhaut der Ratte) benutzt. Die Kultur der Zellen bis zum Zeitpunkt der Überschichtung mit embryonalen Hepatozyten erfolgte mit folgenden Medien:
3T3:
DMEM [mit L-Glutamin; 4,5 g/l Glukose] + 5% FCS + Gentamycin 50 μg/ml
MRC-5:
MEM [Earle's mit L-Glutamin] + 10% FCS + 1 mM Na-Pyruvat + Nichtessentielle Aminosäuren + Gentamycin 50 μg/ml
Primäre Fibroblasten:
DMEM/HamsF12 + 5% FCS + 15 mM HEPES + Gentamycin 50 μg/ml
Alle Zellen wurden kurz vor dem Erreichen der Konfluenz passagiert durch zweimaliges Waschen mit calcium- und magnesiumfreier PBS und anschließendem Ablösen mit 0,25% Trypsin. Nach Bestimmung der Gesamt- und Lebendzellzahl mittels Trypanblaufärbung in einer Neubauer Zählkammer wurden die Zellen mit einer Dichte von
3T3: 7.000 Zellen pro cm²
MRC-5: 10.000 Zellen pro cm²
Prim. Fibroblasten: 10.000 Zellen pro cm²
ausgesät.
Für den Einsatz als Feederlayer wurden die Zellen 5 Tage vor der Besiedelung mit Hepatozyten im Feeder-spezifischen Medium ausgesät. Die Aussaat von Hepatozyten erfolgte im supplementierten WE 5% FCS, nachdem das Feeder-spezifische Medium abgesaugt worden war.
5. Medien
Sofort nach der Isolation wurden die embryonalen Hepatozyten in William's Medium E (WE; Williams et al. (1971) Exptl. Cell Res., 69, 106) Medium aufgenommen und ausgesät. Das WE war supplementiert mit 5% FCS, Glucagon 0,1 μg/ml, Insulin 10 μg/ml, Dexamethason 0,7 μg/ml und 50 μg/ml Gentamycin. Nach einem Tag in Kultur erfolgte der erste Mediumwechsel, danach am zweiten Tag in Kultur und darauffolgend alle 2–4 Tage. Ab dem zweiten Tag in Kultur wurde je nach Versuchsansatz teilweise in Hybridomed DIF 1000 (DIF; Jäger et al. (1988) Cytotechnology, 1, 319) oder WE kultiviert. Hybridomed DIF 1000 wurde supplementiert mit Glucagon 0,1 μg/ml, Dexamethason 0,7 μg/ml und 50 μg/ml Gentamycin, WE-Medium wurde supplementiert mit 5% FCS oder serumfrei, Glucagon 0,1 μg/ml, Insulin 10 μg/ml, Dexamethason 0,7 μg/ml und 50 μg/ml Gentamycin Die Kulturen wurden in zwölf Ansätze aufgeteilt:
24 h WE 5% FCS → DIF 0% FCS mit Zusatz von

1 Kontrolle ohne Zusätze
2 HGF (20 ng/ml)
3 EGF (20 ng/ml)
4 TGFα (20 ng/ml)
5 TPO (10 ng/ml)
6 TPO (20 ng/ml)
7 HGF (20 ng/ml), EGF (20 ng/ml)
8 HGF (20 ng/ml), EGF (20 ng/ml), TPO (10 ng/ml)
9 HGF (20 ng/ml), EGF (20 ng/ml), TPO (20 ng/ml)
10 HGF (20 ng/ml), EGF (20 ng/ml), TGFα (20 ng/ml)
11 TPO (20 ng/ml), TGFα (20 ng/ml)
12 TPO (20 ng/ml), HGF (20 ng/ml)

Die Wachstumsfaktoren wurden bei –20°C gelagert und bei jedem Mediumwechsel frisch dazugegeben.
Medien der Feeder-Zellen:
3T3: DMEM mit L-Glutamin, 4,5 g/l Glukose
MRC-5: MEM Earle's mit L-Glutamin, 1,0 g/l Glukose
Primäre Fibroblasten: DMEM/Ham's F-12 mit L-Glutamin, 3,151 g/l Glukose
6. Zellzahlbestimmung
Hepatozyten in Kultur wurden nach Aussaat in 96er-well Platten nach 2, 5 und 12 Tagen in Kultur gezählt. Dazu wurde jedes well zweimal mit 100 μl calcium- und magnesiumfreier PBS gewaschen, danach wurde pro well 50 μl Trypsin 1,25% aufgegeben. Nach 20 min enzymatischer Aktivität bei 37°C wurde mit jeweils 50 μl FCS-haltigem Medium pro well die Trypsinaktivität abgestoppt und die Zellzahl mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Auf den Matrixproteinen Laminin, Collagen IV, Collagen I, Matrigel und Fibronektin sowie den fee der-Zellen 3T3, MRC-5 und primären Fibroblasten kultivierte Hepatozyten wurden mit Medienansätzen und mit Wachstumsfaktoren wie folgt kultiviert:
WE 5 % FCS 24 h → DIF 0% FCS und Zusatz von

1 Kontrolle ohne Wachstumsfaktoren
2 HGF (20 ng·ml^–1)
3 EGF (20 ng·ml^–1)
4 TGFα (20 ng·ml^–1)
5 TPO (10 ng·ml^–1)
6 TPO (20 ng·ml^–1)
7 HGF (20 ng·ml^–1), EGF (20 ng·ml^–1)
8 HGF (20 ng·ml^–1), EGF (20 ng·ml^–1), TPO (10 ng·ml^–1)
9 HGF (20 ng·ml^–1), EGF (20 ng·ml^–1), TPO (20 ng·ml^–1)
10 HGF (20 ng·ml^–1), EGF (20 ng·ml^–1), TGFa (20 ng·ml^–1)
11 TPO (20 ng·ml^–1), TGFα (20 ng·ml^–1)
12 TPO (20 ng·ml^–1), HGF (20 ng·ml^–1)

Durch den Zusatz von Wachstumsfaktoren einzeln oder in Kombination konnten die Zellzahlen der Hepatozyten im Vergleich zu entsprechenden Ansätzen ohne Wachstumsfaktoren deutlich erhöht werden (1–7). Im Vergleich der einzelnen Medienansätze mit Wachstumsfaktoren zeigte sich, dass Kulturen auf Laminin, Collagen IV und Matrigel maximale Zellzahlen durch den Zusatz von Thrombopoietin (TPO) und Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) in Konzentrationen von jeweils 20 ng·ml^–1 aufwiesen, Kulturen auf den Feeder-Zellen 3T3, MRC-5, primären Fibroblasten und Collagen I dagegen durch den Zusatz von TPO (20 ng·ml^–1) allein.
Generell wurden maximalste Zellzahlen in Kultur auf 3T3 Feeder-Zellen erreicht, Zusatz von TPO führte zu einer über 30fach höheren (616.406 Zellen·cm ^–2) Zellzahl nach 12 DIV als zu Beginn der Kultur. In Kultur auf Feeder-Zellen war im Gegensatz zu der auf Matrixproteinen die Zellzahl nach 2 DIV deutlich höher, ebenso führte der Zusatz von Wachstumsfaktoren auf Feeder-Zellkultur zu einer weitaus geringeren Steigerung der Zellzahl in Bezug auf Kontrollansätze (Ansatz 1) ohne Wachstumsfaktoren als dies im Kultur auf Matrixproteinen der Fall ist.
7. Analyse der Genexpression
Die Genexpression wurde in embryonalen Hepatozyten in Kultur sowie in frisch isolierten embryonalen und adulten Hepatozyten untersucht. Mit Hilfe der DNA-Microanay Technologie kann Genexpression im Hochdurchsatz parallel analysiert werden. Durch den Vergleich der leberspezifischen Expressionsprofile von adulten Hepatozyten in vivo mit denen der embryonalen Hepatozyten unter optimierten Kulturbedingungen können folgende Aussagen zum Status dieser Zellen getroffen werden:
– in wieweit kultivierte embryonale Zellen den adulten Hepatozyten gleichen und somit einen äquivalenten Ersatz, z.B. für den Einsatz im Bioreaktor oder als pharmakologisches Testsystem darstellen
– welchen Einfluß Wachstumsfaktoren, Matrizes und Feeder-Zellen auf das Expressionsprofil haben
– ob Ergebnisse von in vitro Tests spezifischer Leberfunktionen (Albuminproduktion, Cytochrom-P450-Aktivität, immuncytochemische Detektion verschiedener Proteine) sich im Expressionsprofil widerspiegeln
Ein DNA-Microanay ist ein beschichteter Glasobjektträger („Chip"), an dem kurze, synthetische DNA-Fragmente (Oligodeoxynukleotide) kovalent gebunden sind, welche die zu untersuchenden (hier zumeist leberspezifische) Gene repräsentieren. Das bedeutet hier, dass 72 leberrelevante Gene ermittelt und ein aus je 50 Nukleotiden bestehendes genspezifisches DNA-Fragment an den Chip gebunden wurde. Aus adulten Lebergewebe und embryonalen Hepatozyten (unter verschiedenen Kulturbedingungen) wurde die mRNA isoliert und in cDNA umge schrieben. Dabei wurden Fluorescein markierte Nukleotide verwendet. Die mit Fluorescein inkorporierte cDNA wurde fluoreszenzmarkiert, dabei wurden die Fluorescein markierten Nukleotide mit Cy3 (Cyanine-3-Tyramide) konjugiert. Die so hergestellte und markierte cDNA ist komplementär zu den DNA Sequenzen auf dem Chip. Mittels eines Laserscanners konnten die fluoreszierenden Emissionen quantifiziert werden. Durch vergleichende Auswertung zweier Proben, also z.B. embryonale und adulte Hepatozyten oder kultivierte embryonale Hepatozyten ohne Wachstumsfaktoren und mit Wachstumsfaktoren, können Aussagen zum veränderten Expressionsprofil getroffen werden.
Für die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Microarrays wurde RNA von Hepatozyten aus adulten und embryonalen (E12) Lebern, sowie unter verschiedenen Bedingungen 5 Tage kultivierten embryonale Hepatozyten (E12) benutzt. Je Microarray wurde dabei exakt 2 μg Gesamt-RNA eingesetzt. Der Einsatz einer konstanten RNA-Menge gewährleistet zum einen eine quantitative vergleichende Analyse der Messwerte aus verschiedenen Kulturansätzen bzw. Lebern aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien miteinander Zum anderen werden bei einem Einsatz konstanter RNA-Mengen Fehlerquellen aufgrund schwankender cDNA-Syntheseraten ausgeschlossen. Isolierte RNA aus Hepatozyten in Kultur auf Feeder-Zellen wurde ebenfalls in einer Menge von 2 μg eingesetzt, obwohl diese sowohl feeder-Zell- als auch Hepatozyten-RNA enthielt. Es wurde daher das Verhältnis von Hepatozyten- zu Gesamt-RNA berechnet. Entsprechend wurde dies als Faktor, in die Messwerte (für die Kulturen auf 3T3 Feeder-Zellen) der relativen Intensität der Genexpression multipliziert. Alle Arbeiten wurden bis zur cDNA Synthese mit RNAse freien Chemikalien und Materialien durchgeführt.
7.1 Zellgewinnung
Embryonale Hepatozyten in Kultur
Zellen wurden nach der Isolierung in 175 bzw. 75 cm² Zellkulturflaschen [Falcon] ausgesät. Nach fünf Tagen in Kultur auf verschiedenen Matrizes mit und ohne Wachstumsfaktoren erfolgte die Ernte der Zellen. Dafür wurden die Flaschen zweimal mit calcium- und magnesiumfreier PBS gewaschen und die Hepatozyten mit 1,25%iger Trypsinlösung (20 min Verdau bei 37°C) abgelöst. Mit serumhaltigem Medium (2 × 10 ml) wurden die Zellen gesammelt, zentrifugiert (243 g, 5 min, RT) und der Überstand abgesaugt. Die Hepatozyten wurden in einem definierten Volumen von serumfreiem Medium aufgenommen und die Zellzahl in einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Nach erneuter Zentrifugation (243 g, 5 min, RT) wurde der Überstand abgesaugt. Die Isolation der RNA erfolgte direkt nach der Zellgewinnung oder nach Aufbewahrung der Zellen bei –20°C.
Embryonale Hepatozyten
Hepatozyten wurden direkt nach der Isolation (siehe 0) gezählt, zentrifugiert (243 g, 5 min, RT) und das Pellet bei –20°C bis zur Isolation der RNA aufbewahrt bzw. ganze embryonale Lebern gesammelt und bei –20°C eingefroren.
Adulte Hepatozyten
Die RNA adulter Hepatozyten wurde aus adulten Lebern nicht trächtiger weiblicher Ratten gewonnen, die direkt nach der Präparation aus dem Bauchraum in kleinere Stücke geschnitten und in 45 ml RLT-Puffer (QIAGEN-Kit) + 450 μl β-Mercaptoethanol gegeben wurden. In einem 50 ml Falcon blue cap wurden die Leberstücke im Ultra Turrax für 45 s bei 24.000 rpm (Stufe 6) homogenisiert. Die weitere Behandlung zur RNA-Aufreinigung erfolgte wie unten beschrieben.
Folgende Ansätze wurden untersucht:

– Embryonale Hepatozyten nach 5 Tagen in Kultur (mit Mediumansatz 24 h WE 5% FCS, danach DIF 0% FCS mit bzw. ohne WF) auf:
– Collagen IV + WF (je 20 ng/ml HGF und TPO)
– Collagen IV – WF
– Collagen I + WF (20 ng/ml TPO)
– Collagen I – WF
– 3T3 + WF (20 ng/ml TPO)
– 3T3 – WF
– adulte Leber
– embryonale Leber (E12)

7.2 Spotten der DNA-Microarrays
Microarrays der Firma Telechem mit einer silanylisierten Oberfächenbeschichtung (CSS-100 silylated slides) wurden mit dem GMS 417 Arrayer [GeneticMicroSystems] gespottet. Dazu wurden je 15 μl Oligonukleotid (100 μM) [MWG] mit 15 μl Array It Micro Spotting Plus Puffer 2 × [Telechem] in der Vertiefung einer 96er Platte [Lafontain] vermischt. Alle 75 Oligonukleotide wurden in einem Arbeitsgang von dem Arrayer auf die Slides aufgetragen.
Folgende, aus 50 Nukleotiden bestehende Sequenzen, wurden als dreifache Wiederholung auf einen Chip gespottet (Tabelle 1). Bei den vierfach vorliegenden Oligonukleotiden der mitochondrialen Cytochrom Oxidase (Nr. 14–17) erfolgte dies, um eine maximale Abdeckung des Gens zu gewährleisten. Die Nukleotidsequenz des Albumins liegt hier in seiner um 24 Basen verlängerten Form Preproalbumin vor. Nach der Translation dient diese Sequenz als Signalpeptid zur Sekretion und wird bis zur Sekretion des Proteins abgespalten.
Tabelle 1: Spotting des Ratten DNA-Microarrays
7.3 RNA-Isolierung
Die RNA der Hepatozyten wurde mit RNeasy midi bzw. maxi Kits [Qiagen] isoliert, Angaben in eckigen Klammern beziehen sich auf Volumina im maxi Kit. Bei einer Zellzahl von 5·10⁶ bis 5·10⁷ (embryonale Hepatozyten) erfolgte die Isolation im midi Kit, bei einer Zellzahl von 1·10⁸ bis 5·10⁸ (adulte Hepatozyten) im maxi Kit.

– Pellet embryonaler Hepatozyten (eingefrorene Zellen auftauen) vortexen bzw. embryonale Lebern auftauen
– zu den Zellen bzw. embryonalen Lebern 2,0 [15] ml RL7 Puffer (Zugabe von 10 μl (3-Mercaptoethanol pro 1,0 ml RLT Puffer) geben
– je 1 ml in ein Hybaid Ribolyser Green Tube geben
– Zellen in Green Tubes im Hybaid Ribolyser 20s bei 6 m/s homogenisieren
– Green Tubes zum Abkühlen für 10 min auf Eis lagern
– Zellsuspension embryonaler Hepatozyten oder homogenisierte adulte Hepatozyten aus dem Ultra Turrax in ein Blue cap (Falcon) überführen und 2,0 [15] ml 70 % Ethanol hinzufügen, gründlich vortexen
– Suspension auf eine RNeasy midi [maxi] Säule, platziert in ein 15 [50] ml tube, geben
– Säule bei ca. 3000 g 5 min zentrifugieren, Durchfluß verwerfen
– auf die Säule 4,0 [15] ml Puffer RW1 geben, 5 min bei ca. 3000 g zentrifugieren, Durchfluß verwerfen
– 2,5 [10] ml Puffer RPE auf die Säule geben, 2 min bei ca. 3000 g zentrifugieren, Durchfluß verwerfen
– 2,5 [10] ml Puffer RPE auf die Säule geben, 5 min bei ca. 3000 g zentrifugieren, Durchfluß verwerfen
– die Säule in ein neues 15 [50] ml tube geben, 250 [1200] μl RNAse freies Wasser auf die Säule geben und für 1 min stehen lassen, zentrifugieren für 3 min bei ca. 3000 g
– erneut 250 [1200] μl RNAse freies Wasser auf die Säule geben, 1 min einwirken lassen und bei ca. 3000 g 3 min zentrifugieren

Die so eluierte RNA wurde bis zur weiteren Bearbeitung bei –70°C gelagert, mit einem Aliquot von je 5 μl wurden Konzentrationsbestimmungen durchgeführt.
Phenol-Chloroform Extraktion
Alle RNA-Proben in H₂O wurden aufgetaut und weiterverarbeitet

– Zugabe von 1 VT Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1) zur Probe
– 30 s vortexen
– 1 min zentrifugieren (Tischzentrifuge 13.000 rpm)
– RNA in obiger wässriger Phase abnehmen und in ein neues Eppendorf-Gefäß überführen
– Zugabe von 1 VT Chloroform
– 30 s vortexen
– 1 min zentrifugieren (Tischzentrifuge 13.000 rpm)
– RNA in obiger wässriger Phase abnehmen und in ein neues Eppendorf-Gefäß überführen

Die so gereinigte RNA wurde bis zur weiteren Bearbeitung bei –70°C gelagert.
Ethanolfällung

– Zugabe von 1/10 VT NaCl 5 M und 2 VT Ethanol absolut, eiskalt
– mind. 45 min bei –70°C inkubieren
– 10 min zentrifugieren (Tischzentrifuge 13.000 rpm)
– Überstand absaugen und verwerfen
– Pellet in 300 μl 70% Ethanol resuspendieren
– 10 min zentrifugieren (Tischzentrifuge 13.000 rpm)
– Überstand absaugen und verwerfen
– Pellet lufttrocknen
– Pellet in 50 μl H₂O (RNAse frei) aufnehmen

Die so gereinigte RNA wurde bis zur weiteren Bearbeitung bei –70°C gelagert.
Bestimmung der RNA Konzentration
Die Konzentration der RNA wurde durch Messung der optischen Dichte ermittelt. Dafür wurden 5 μl der eluierten RNA mit 495 μl TE-Puffer (pH 8,0) verdünnt (1:100) und die Extinktion gegen TE-Puffer (pH 8,0) bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt Ammersham, [Ultraspec 3300pro]. Der Proteingehalt wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm ermittelt.
Dabei entspricht
1 OD ≡ 40 μg/ml RNA
Das Verhältnis von RNA- zu Proteinkonzentration sollte mindestens 1,60 betragen.
7.4 cDNA Synthese
Die Synthese der cDNA erfolgte aus der gewonnenen RNA mit Hilfe eines Oligo dT Primers und Fluorescein markierten Nukleotiden. Nach Anbindung der markierten cDNA an die DNA auf dem Microarray wurde das Fluorescein mit fluoreszenten Cy3 konjugiert. Die Fluoresceinmarkierung stellt somit ein Signalverstärkungssystem dar, welches erlaubt, die initial eingesetzte RNA-Konzentration auf 2 μg zu reduzieren.

– Je Ansatz pipettieren:
– 2 μg RNA
– 1 μl Reaction Mix Concentrate
– 1 μl Fluorescein-Nukleotide
– 8 μl Oligo dT Primer (50 pmol/μl)
– ad 20 μl mit RNAse-freien H₂O auffüllen
– Inkubation für 10 min bei 65°C
– Inkubation für 5 min bei 25°C
– Inkubation für 3 min bei 42°C
– Zum Ansatz pipettieren:
– 2,5 μl 10 × RT Reaction Buffer
– 2 μl AMV RT/RNAse Inhibitor Mix
– Inkubation für 1,5 h bei 42°C
– Inkubation für 5 min auf Eis
– Zum Ansatz pipettieren:
– 2,5 μl 0,5 M EDTA pH 8,0
– 2,5 μl 1 N NaOH
– Inkubation für 30 min bei 65°C
– Inkubation für 5 min auf Eis
– Zum Ansatz pipettieren:
– 6,5 μl 1 M Tris-HCl pH 7,5

Aufreinigung der cDNA
Die Aufreinigung der cDNA wurde mit dem QIAquick PCR Purification Kit [Qiagen] durchgeführt. Das Prinzip dieses Kits beruht auf der pH abhängigen Bindung der DNA an eine Säule mit einer Silica-Gel Membran. Dabei wird bei einem pH unter 7,5 (optimal 5,0) die cDNA an die Membran adsorbiert, störende Nukleotide und Proteine binden nicht. Durch Erhöhung des pH-Wertes auf über 7,5 wird die cDNA von der Säule eluiert.

– Zum Volumen der gewonnenen cDNA 5 Volumenteile PB Puffer geben und vortexen
– Gesamtes Volumen auf eine QIAquick Säule geben, die sich in einem 2 ml Reaktionsgefäß befindet, und 1 min bei ca. 10.000 g [Eppendorf Tischzentrifuge] zentrifugieren
– Durchfluss verwerfen
– Zugabe von 700 μl Guanidinhydrochlorid 35% wässrige Lösung auf die Säule
– 1 min bei ca. 10.000 g zentrifugieren
– Durchfluss verwerfen
– Zugabe von 750 μl PE Puffer auf die Säule
– 1 min bei ca. 10.000 g zentrifugieren
– Durchfluss verwerfen
– Säule 1 min bei ca. 10.000 g trocken zentrifugieren
– Säule in ein neues 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß geben
– 30 μl Elutionspuffer auf die Säule geben und 1 min stehen lassen
– 1 min bei ca. 10.000 g zentrifugieren

Hybridisierung der Microarrays
Vor der Hybridisierung mit cDNA auf dem gespotteten Microarray werden diese reduziert und blockiert. Dazu die Microarrays

– 4 h bei 50°C in feuchter Kammer im Wasserbad rehydratisieren
– 24 h im Dunkeln inkubieren
– 2 min mit 0,2% SDS waschen
– 2 × 1 min mit a.d. waschen
– 5 min in NaBH₄ reduzieren lassen
– 1 min in eiskaltem a.d. waschen
– 2 min mit 0,2% SDS waschen
– 2 × 1 min mit a.d. waschen
– lufttrocknen
– 45 min mit Blockingreagenz im Wasserbad bei 42°C blockieren
– 5 × 2 min mit a.d. waschen
– lufttrocknen
– im Dunkeln lagern

Hybridisierung der cDNA auf den Microarray
Zur Hybridisierung der Proben auf den Microarray wurde die jeweilige cDNA im Elutionspuffer vakuumgetrocknet, in Hybridisierungspuffer resuspendiert und auf den Microarray appliziert. Das Protokoll erfolgte modifiziert mit dem NEN^®Micromax^TMTSA^TM Labeling and Detection working protocol [Perkin Elmer]:

– cDNA Probe (im Elutionspuffer) im geöffneten Eppendorf Reaktionsgefäß bei 30°C für 30 min im Vakuum [Concentrator 5361, Eppendorf] einrotieren
– Pellet in 20 μl Hybridisierungspuffer [Telechem] lösen
– 3 min bei 95°C denaturieren
– 1 min auf Eis abkühlen
– Probe auf Chip applizieren
– Deckglas luftblasenfrei aufgeben, Seiten des Deckglases mit Fixogum [Marabu] luftdicht verschließen
– Microarray in feuchter Kammer über Nacht bei 42°C hybridisieren
– Fixogum abziehen, Microarrays in Waschpuffer geben und schütteln:
– 5 min in Waschpuffer 1
– 5 min in Waschpuffer 2
– 2 min in Waschpuffer 3
– mit ImmEdgePen^® [Vector Inc.] Rahmen um den gespotteten Bereich ziehen
– 300 μl TNB-G Blocking Puffer aufgeben, 10 min inkubieren
– 10 min Inkubation mit 200 μl Anti-F1-HRP Conjugate Solution (2 μl Anti-FI-HRP conjugate in 200 μl TNB-G)
– 3 × 1 min in TNT Puffer (42°C) waschen
– 10 min Inkubation mit 250 μl Cyanine-3 Tyramide Solution (0,5 μl Cyanine-3 Tyramide (gelöst in 20 μl DMSO) in 250 μl Amplification Diluent)
– 3 × 5 min in TNT Puffer (42°C) waschen
– 1 min in 0,06 × SSC waschen
– Slide im Falcon trockenzentrifugieren bei 1200 rpm für 2 min
– Microarray im Array Scanner (GMS 418 Microarrayscanner) bei Wellenlängen von Cy3: 532 nm scannen

Die Intensitäten der Fluoreszenzen wurden mit Hilfe des Programms ImaGene 4.1 [BioDiscovery Inc.] berechnet.
7.5 Ergebnisse
Es konnten deutliche Unterschiede in der Expression verschiedener Gene festgestellt werden, welche durch die Intensität der Fluoreszenz dargestellt wurden. Die relativen Intensitäten der gescannten Fluoreszenzen wurden, nach automatischem Abzug der Hintergrundintensitäten durch die Software, nach funktionellen Gruppen geordnet tabellarisch dargestellt. Alle Microarrays wurden mit cDNA hybridisiert, die aus 2 μg RNA hergestellt wurde, um vergleichbare cDNA Synthesen und Meßwerte zu erhalten. RNA aus Kulturen auf Feeder-Zellen enthielten sowohl Feeder-Zell- als auch Hepatozyten-RNA. Es wurde daher der prozentuale Anteil der Hepatozyten-RNA zur Gesamt-RNA bestimmt. Dieser prozentuale Anteil wurde bei Berechnung der Endmesswerte der relativen Intensitäten der Genexpression berücksichtigt.
Von Bedeutung ist die relative Änderung der Genexpression, so dass die Verhältnisse der Ansätze berechnet wurden (Tabelle 2). So konnte direkt eine verhältnismäßige Unter- oder Überregulation der Genexpression erkannt werden. Als deutlich wurden 1,50fache, als stark 5,00fache Veränderungen der Verhältnisse angesehen und markiert. Verhältnisse unter 1,00 wurden zur optischen Verdeutlichung der relativen Unterexpression als negativer Kehrwert dargestellt. Beurteilt wurden die Veränderungen der Genexpression zwischen adulter und embryonaler (E12) Leber, zwischen 5 Tage kultivierten Hepatozyten (auf Collagen IV, I und 3T3 jeweils mit und ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren) und embryonaler (E12) Leber, sowie zwischen 5 Tage kultivierten Hepatozyten mit und ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren (auf Collagen IV, I und 3T3).
Ein Großteil der untersuchten Gene adulter Lebern wurde im Vergleich zu embryonalen Lebern (E12) stärker exprimiert. Insbesondere stark exprimiert wurden die adulten Serumproteine Preproalbumin (2,6fach), welches durch späteres Prozessing zu Albumin modifiziert wird, Transthyretin (5,1fach) und Transferrin (11fach), die Matrixproteine wie Laminin (2fach) und Glypican (2,6fach), Proteine des Fettstoffwechsels wie Fatty Acid Binding Protein (5fach) und Apolipopro tein C-III (6,3fach), Enzyme des Aminosäure- und Harnstoffwechsels sowie nahezu alle Akutphaseproteine, besonders Hemopexin (5,1 fach). Auch die untersuchten Phase-2 Enzyme der Detoxifikation (Galactosid β-1,3-glucuronyltransferase, Hydroxysteroidsulfotransferase und Glutathion-S-Transferase), Protooncogene, leberspezifische Transkriptionsfaktoren sowie Wachstumsfaktoren wurden adult stärker transkribiert als embryonal. Die RNA des embryonalen Serumproteins Alpha Fetoprotein (AFP) wurde dagegen adult über 12fach geringer exprimiert als embryonal, ebenso wurde im Mittel die mitochondriale Cytochromoxidase geringer transkribiert. Die Expression der Phase-1 Enzyme der Detoxifikation erfolgte adult im Vergleich zu embryonal nicht einheitlich stärker oder geringer.
Embryonale Hepatozyten in Kultur auf Collagen IV ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren wiesen nach 5 Tagen in nahezu allen untersuchten Genen eine geringere Expression auf als embryonale Lebern (E12). Insbesondere das embryonale Serumprotein AFP (fast 10fach), Phase-1 Enzyme der Detoxifikation (Alkoholdehydrogenase 6fach, mitochondriale Aldehyddehydrogenase 5fach) und Enzyme des Energiemetabolismus (mitochondriale Cytochromoxidase im Mittel etwa 7,4fach, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase über 12fach) wurden schwächer transkribiert. Nur das Matrixprotein Fibrillin-2 und das Akutphaseprotein α-1-Protein wurden nach 5 Tagen in Kultur stärker exprimiert als in embryonalen Lebern (3 bzw. über 3fach).
Der Zusatz von Wachstumsfaktoren (Hepatozytenwachstumsfaktor und Thrombopoietin je 20ng/ml) während der Kultur von embryonalen Hepatozyten auf Collagen IV hatte nach fünftägiger Kultur einen nach funktionellen Gruppen differenzierten Einfluss auf die Stärke der Genexpression. Die Expression der Phase-1 und -2 Enzyme wurde kaum verändert, nur die mitochondriale Aldehyddehydrogenase wurde in ihrer Expression um circa die Hälfte verringert. Ebenso die Matrixproteine, von denen unter Einfluss der Wachstumsfaktoren nur Fibronectin-1 halb so stark exprimiert wurde, und Wachstumsfaktoren, von denen nur der Neu regulin-like Transmembrane Activator for ErbB Kinases (NTAK) 2,6fach geringer exprimiert wurde. Eine Erhöhung der Genexpression durch den Zusatz von Wachstumsfaktoren konnte bei einigen Akutphaseproteinen (α-Macroglobulin 2,9fach, α-1-Microglobulin 2fach, α-1-Protein 1,9fach und Haptoglobin 1,4fach), dem Serumprotein Transferrin (1,6fach) und der Cytochromoxidase (maximal 3,3fach) beobachtet werden.
Kulturen embryonaler Hepatozyten nach 5 Tagen in vitro (DIV) auf Collagen I ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren erhöhten deutlich in nahezu allen untersuchten Genen die Expression im Vergleich zu embryonalen Lebern (E12), im offensichtlichen Gegensatz zu Kulturen auf Collagen IV. Nur die Expression des NTAK, des Fibronectin-1 und der mitochondrialen Aldehyddehydrogenase wurde verringert (über 5fach, 3fach bzw. 2fach). Enorm stärker waren alle untersuchten Akutphaseproteine (α-1-Protein über 26fach) und adulte Serumproteine exprimiert, deutlich auch die Protooncogene, Proteine und Enzyme des Fett-, Aminosäure-, und Harnstoffwechsels sowie Proteine des Zytoskeletts (GFAP, α-Tubulin) und des Zellteilungszyklus (CyclinD3).
Die Kultur mit Thrombopoietin (20 ng/ml) führte zu einer Erniedrigung der Genexpression fast aller untersuchten Gene nach 5 DIV in Kultur auf Collagen I im Vergleich zu Kulturen auf Collagen I ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren. Dabei wurden insbesondere die Expression des EGF-Rezeptors und des Akutphaseproteins α-Fibrinogen verringert (4,6fach bzw. 5,8fach). Einzig die Transkription des NTAK wurde durch den Zusatz von Wachstumsfaktor erhöht (1,5fach). Embryonale Hepatozyten auf 3T3 Feeder-Zellen zeigten nach 5 Tagen in Kultur ohne Wachstumsfaktorzusatz im Verhältnis zu embryonalen Lebern differenzierte Änderungen in der Intensität der Genexpression. Untersuchte Phase-1 und -2 Enzyme der Detoxifikation wurden meist stärker exprimiert mit Ausnahme der Alkoholdehydrogenase (1,8fach geringer) und der mitochondrialen Aldehyddehydrogenase (2,2fach geringer). Die Matrixproteine wurden, bis auf Fibronectin-1 (fast 5fach erniedrigt), stärker transkribiert. Eine deutliche Verminderung in der Expression wies das embryonale Serumprotein AFP auf (über 6fach erniedrigt), dagegen erhöhte sich die Expression der adulten Serumproteine Transferrin um das 6,7fache, sowie Transthyretin und Albumin je um das doppelte. Gleichfalls verstärkte sich die Transkription der Protooncogene, der leberspezifischen Transkriptionsfaktoren, Proteine und Enzyme des Fett-, Aminosäure- und Harnstoffwechsels, Akutphaseproteine und Wachstumsfaktoren, nicht jedoch des NTAK (2,5fach erniedrigt). Enzyme der ATP-Gewinnung wurden deutlich unterexprimiert (Cytochromoxidase ca. 2,5fach geringer). Cyclin3, ein Protein des Zellteilungszyklus, wurde deutlich stärker als in embryonalen Leber transkribiert (fast 8fach).
Der Zusatz von Wachstumsfaktor (Thrombopoietin 20 ng/ml) in die Kultur embryonaler Hepatozyten auf 3T3 Feeder-Zellen führte, im Gegensatz zu Kulturen auf Collagen I, bei mehreren der untersuchten Genen zu einer erhöhten Expression im Verhältnis zu Kulturen ohne Wachstumsfaktorzusatz. Deutlich verstärkte sich die Expression des Matrixproteins Fibronectin-1 (5,6fach) und des NTAK (4,9fach), wie auch des Phase-1 Enzyms mitochondriale Aldehyddehydrogenase (1,8 fach). Deutlich verringerte sich die Expression des Albumins (2,2fach).
Tabelle 2: Verhältnisse der relativen Intensität der Genexpression.
8. Signifikanzanalyse
Es erfolgte eine Signifikanzanalyse der Zellzahlen nach 5 Tagen in Kultur von Hepatozyten, die auf unterschiedlichen Beschichtungen bzw. Feeder-Zellen mit und ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren kultiviert wurden. Dabei wurde ermittelt, ob der Zusatz von Wachstumsfaktoren) zu einer signifikanten Zunahme der Zellzahl führte (jeweils im Vergleich zu Kontrollen ohne Zusatz von Wachstums faktoren). Der für jede Beschichtung optimale Wachstumsfaktorzusatz wurde ausgewählt (Tabelle 3).
Tabelle 3
Die Analyse ergab, dass bis auf Kulturen auf Matrigel und primären Fibroblasten der Zusatz von Wachstumsfaktoren) zu einer signifikanten Erhöhung der Zellzahl führte.

Claims

Verwendung von Thrombopoietin zur Kultivierung von fötalen Hepatozyten.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Hepatozyten fötale Hepatozyten früher Entwicklungsstadien verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Variante von Thrombopoietin verwendet wird.
Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass die fötalen Hepatozyten auf einer Matrix, vorzugsweise eine die Proliferation unterstützende Matrix, kultiviert werden.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als eine die Proliferation unterstützende Matrix eine Laminin- und/oder Collagen IV-Matrix verwendet wird.
Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass die fötalen Hepatozyten auf Feeder-Zellen, vorzugsweise auf zur Differenzierung führenden Feeder-Zellen, kultiviert werden.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als zur Differenzierung führenden Feeder-Zellen Collagen I-, 3T3- und/oder MRC-5-Feeder-Zellen verwendet werden.
Verwendung von Trombopoietin nach mindestens einem der Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich weitere Wachstumsfaktoren verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als zusätzliche Wachstumsfaktoren Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und/oder transformierender Wachstumsfaktor alpha (TGF alpha) verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass Thrombopoietin, eine Variante von Thrombopoietin und/oder die zusätzlichen Wachstumsfaktoren jeweils in einer Konzentration von 1–100 ng/ml, vorzugsweise 10–20 ng/ml, insbesondere 20 ng/ml eingesetzt werden.