CN102574921B - 双特异性死亡受体激动型抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含特异性针对死亡受体的第一抗原结合位点和特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点的双特异性抗体,其生产方法,包含所述抗体的药物组合物,及其用途。
Description
本发明涉及包含特异性针对死亡受体(deathreceptor)的第一抗原结合位点和特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点的双特异性抗体,其生产方法,包含所述抗体的药物组合物,及其用途。
由于对癌细胞上差异表达的抗原的选择性靶向,单克隆抗体在癌症的治疗中已证明是有效的治疗剂。大多数目前开发的单克隆抗体的治疗策略包括靶向肿瘤相关的抗原,以修饰肿瘤细胞生物学,抑制生长因子受体,抑制血管生成,诱导凋亡和通过补体结合的细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性。一些抗体靶向对癌细胞存活极其重要的生长因子受体,例如曲妥珠单抗和西妥昔单抗用激动型单克隆抗体靶向癌细胞上的TRAIL死亡受体代表了新一代单克隆抗体治疗,因为其能够直接诱导靶向的细胞的凋亡。使用针对死亡受体(而不是TRAIL)的激动型单克隆抗体可能是有利的:TRAIL靶向包括死亡受体和诱捕受体(decoyreceptor)的多种受体,因此影响到选择性。另外,相比单克隆抗体,TRAIL具有短得多的血液半衰期,这是影响剂量和时间表参数的一个因素。相比单克隆抗体,TRAIL的非常短的血液半衰期将需要大量和频繁的剂量。另外,生产重组TRAIL是非常困难和耗时的。
MichaelsonJ.S.等人(mAbs,卷1,期号2,p:128-141;2009年3月/4月)描述了改造的IgG样双特异性抗体,其靶向2种TNF家族成员受体,即TRAIL-R2(TNF相关凋亡诱导配体受体-2)和LTβR(淋巴毒素β受体)。
HerrmannT.等人(CancerRes2008;68:(4);p:1221-1227)描述了针对CD95/Fas/Apo-1细胞表面受体和成胶质细胞瘤细胞上的3种靶抗原:NG2,EGFR和CD40的双特异性单价化学结合的Fab分子。
本发明涉及组合靶向死亡受体的抗原结合位点和靶向第二抗原的第二抗原结合位点的抗体。由此死亡受体变得交联并诱导靶细胞的凋亡。这些双特异性死亡受体激动型抗体相比传统的靶向死亡受体的抗体的优势在于,仅在表达第二抗原的位点诱导凋亡的特异性。
在第一个方面(object),本发明涉及包含特异性针对死亡受体抗原的第一抗原结合位点和特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点的双特异性抗体。
在双特异性抗体的优选实施方案中,死亡受体选自死亡受体4多肽(DR4),死亡受体5多肽(DR5)或FAS多肽,优选地人DR4多肽(Seq.Id.No.1),人DR5多肽(Seq.Id.No.2)或人FAS多肽(Seq.Id.No.3)。
在双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,第二抗原与肿瘤疾病或类风湿性关节炎相关。
在双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,第二抗原选自癌胚抗原(CEA)多肽,CRIPTO蛋白,神奇迂回(magicroundabout)同源物4(ROBO4)多肽,黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)多肽,腱生蛋白C多肽和成纤维细胞活化蛋白(FAP)多肽,优选地人CEA多肽(Seq.Id.No.4),人CRIPTO多肽(Seq.Id.No.5),人ROBO4多肽(Seq.Id.No.6),人MCSP多肽(Seq.Id.No.7),人腱生蛋白C多肽(Seq.Id.No.8)和人FAP多肽(Seq.Id.No.9)。
在双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,双特异性抗体是包含第一抗体和第二抗体的二聚分子,所述第一抗体包含第一抗原结合位点和所述第二抗体包含第二抗原结合位点。
在本发明的二聚双特异性抗体的优选实施方案中,第一和第二抗体包含抗体重链的Fc部分,其中第一抗体的Fc部分包含第一二聚化模块,第二抗体的Fc部分包含第二二聚化模块,从而允许2种抗体的异源二聚化。
在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,根据杵臼结构(knobsintoholes)策略(见CarterP.;RidgwayJ.B.B.;PrestaL.G.:Immunotechnology,卷2,号1,1996年2月,pp.73-73(1)),第一二聚化模块包含杵(knob)和第二二聚化模块包含臼(hole)。
在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,第一抗体是包含轻链和重链的免疫球蛋白(Ig)分子,和第二抗体选自scFv,scFab,Fab或Fv。
在进一步优选的实施方案中,双特异性抗体包含相比野生型Fc部分对Fcγ受体具有降低的结合亲和力的修饰的Fc部分,例如LALA修饰。
在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,Ig分子包含特异性针对死亡受体的第一抗原结合位点和第二抗体包含特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。
在双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,Ig分子包含特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点,和第二抗体包含特异性针对死亡受体的抗原结合位点。
在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,第二抗体被融合在Ig分子重链的N-或C-端。
在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,第二抗体被融合在Ig分子轻链的N-或C-端。
在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,Ig分子是IgG。在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,第二分子通过肽接头,优选地具有约10-30氨基酸长度的肽接头融合至Ig分子。
在二聚双特异性抗体的进一步优选的实施方案中,第二抗体包含另外的半胱氨酸残基以形成二硫键。
根据本发明的双特异性抗体至少是二价的且可为三价或多价的,例如四价或六价的。
在第二个方面,本发明涉及包含本发明的双特异性抗体的药物组合物。
在第三个方面,本发明涉及用于治疗癌症或类风湿性关节炎的本发明的双特异性抗体。
在另外的方面,本发明涉及包含编码本发明的双特异性抗体重链的序列的核酸序列,包含编码本发明的双特异性抗体轻链的序列的核酸序列,包含本发明的核酸序列的表达载体,并涉及包含本发明的载体的原核或真核宿主细胞。
发明详述
本文使用的术语“多肽”指本发明的多肽,即来自任意动物,例如哺乳动物物种(包括人)的DR4,DR5,FAS,CEA,CRIPTO,ROBO4,MCSP,腱生蛋白C和FAP的天然氨基酸序列和序列变体。
“天然多肽”指具有与天然存在的多肽相同的氨基酸序列的多肽,不管其制备模式。术语“天然多肽”特别包含本发明的多肽的天然存在的截短或分泌的形式,天然存在的变体形式(例如另外的剪接形式),和天然存在的等位基因变体。在序列表中的氨基酸序列(Seq.Id.No.1-9)指本发明的蛋白质的天然人序列。
术语“多肽变体”指在天然序列中包含一个或多个氨基酸取代和/或缺失和/或插入的天然序列的氨基酸序列变体。氨基酸序列变体一般与本发明的多肽的天然序列的氨基酸序列具有至少约75%,优选至少约80%,更优选至少约85%,甚至更优选至少约90%,最优选至少约95%的序列同一性。
术语“抗体”包含抗体结构的多种形式,包括但不限于整个抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选地是全人抗体,人源化抗体,嵌合抗体,或其它基因改造的抗体,只要其保留根据本发明的特征性能。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分,优选地其可变结构域,或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。在例如Houston,J.S.,MethodsinEnzymol.203(1991)46-96)中描述了scFv抗体。另外,抗体片段包含具有VH结构域特征(即能够与VL结构域组装在一起),或具有VL结构域特征(即能够与VH结构域组装在一起),以形成功能性抗原结合位点并因此提供全长抗体的抗原结合性能的单链多肽。
如本文中所用,术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。
术语“嵌合抗体”是指包含来自一种来源或物种的可变区即结合区,以及至少一部分来源于不同来源或物种的恒定区的抗体,通常通过重组DNA技术制备。优选包含鼠源可变区和人源恒定区的嵌合抗体。由本发明包括的“嵌合抗体”的其他优选形式是其中恒定区已经从原始抗体的恒定区得以修饰或改变,以产生根据本发明的特性,特别是有关C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些嵌合抗体。此类嵌合抗体也称为“类别转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。用于产生嵌合抗体的方法涉及本领域熟知的常规重组DNA和基因转染方法。参见,例如,Morrison,S.L.等,Proc.Natl.AcadSci.USA81(1984)6851-6855;美国专利No.5,202,238和5,204,244。
术语“人源化抗体”指这样的抗体,其中框架或“互补决定区”(CDR)已经被修饰,以包含与亲本免疫球蛋白相比具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR。在优选的实施方案中,将鼠CDR移植至人抗体的框架区,以制备“人源化抗体”。参见例如,Riechmann,L.等,Nature332(1988)323-327;以及Neuberger,M.S.等,Nature314(1985)268-270。特别优选的CDR对应于提供这样序列的CDR,所述序列识别上述嵌合抗体的抗原。由本发明包括的“人源化抗体”的其他形式是其中恒定区已经从原始抗体的恒定区得以修饰或改变,以产生根据本发明的特性,特别是有关C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些人源化抗体。
如本文所用,术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。人抗体在本领域是众所周知的(vanDijk,M.A.和vandeWinkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体也可以在转基因动物(如小鼠)中生产,所述转基因动物经免疫后能够生产全部或选择的人抗体,而无内源免疫球蛋白生产。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠中导致在抗原刺激时生产人抗体(参见例如Jakobovits,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.等,Nature362(1993)255-258;Bruggemann,M.等,YearImmunol.7(1993)33-40)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中生产(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.等,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。还可以利用Cole等及Boerner等的技术制备人单克隆抗体(Cole等,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985);和Boerner,P.等,J.Immunol.147(1991)86-95)。如已经提及的根据本发明的嵌合抗体和人源化抗体,如本文中所用,术语“人抗体”也包含其中例如通过“类别转换”(即改变或突变Fc部分,例如从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4的突变)修饰恒定区,以产生根据本发明的特性,特别是有关C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的此类抗体。
如本文所用,术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体,例如,从宿主细胞例如NS0或CHO细胞或者从转基因人免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有以重排形式的可变区和恒定区。可以将根据本发明的重组人抗体进行体内体细胞高度突变。因此,重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是在体内人抗体种系所有组成成分内并不天然存在的序列,尽管其来源于并与人种系VH和VL序列有关。
如本文所用的“可变结构域”(轻链可变结构域(VL)、重链可变结构域(VH))表示直接参与抗体与抗原结合的每一对轻链和重链结构域。轻链和重链可变结构域具有相同的一般结构,并且每一区域包含由三个“高变区”(或互补决定区,CDR)连接的序列广泛保守的四个构架(FR)区。该构架区采用β折叠构象,并且CDR可以形成连接β折叠结构的环。每一链中的CDR通过构架区固定在其三维结构中并与来自其他链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力中起着特殊的重要作用,并因此提供了本发明的另外目的。
当在本文中使用时,术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是非如本文中定义的高变区残基的这些可变区区域。因此,抗体的轻链和重链可变结构域从N末端到C末端包含区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地,重链的CDR3是最有助于抗原结合的和定义抗体性能的区域。CDR和FR根据Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的标准定义和/或来自“高变环”的残基确定。
抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如天然抗体是单特异性的。根据本发明,“双特异性抗体”是具有两个不同的抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体特异性针对两种不同的抗原,即作为第一抗原的死亡受体抗原和第二抗原。
如本文中所用,术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的抗体,其中每一结合位点结合相同抗原的相同表位。
如本文中所用,术语“双特异性”抗体指具有至少两个结合位点的抗体,其中每一结合位点结合相同抗原或不同抗原的不同表位。
如在本申请中所用,术语“价”指在抗体分子中存在的结合位点的具体数目。因此,术语“二价的”、“四价的”和“六价的”指在抗体分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。根据本发明的双特异性抗体至少是“二价的”,且可为“三价的”或“多价的”(例如“四价的”或“六价的”)。
本发明的抗体具有两个或多个结合位点,并且是双特异性的。即,甚至在存在多于两个结合位点(即抗体是三价的或者多价的)的情况下,抗体也可以是双特异性的。本发明的双特异性抗体包括,例如多价单链抗体,双抗体和三链抗体,以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体,其上可通过一个或多个肽接头连接另外的抗原结合位点(例如单链Fv,VH结构域和/或VL结构域,Fab或(Fab)2)。抗体可为来自单个物种的全长抗体,或为嵌合的或人源化的。
“单链Fab片段”是由抗体重链可变结构域(VH),抗体恒定结构域1(CH1),抗体轻链可变结构域(VL),抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体结构域和所述接头从N-端至C-端方向上具有以下顺序之一:
a)VH-CH1-接头-VL-CL,b)VL-CL-接头-VH-CH1,c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL;其中所述接头是至少30氨基酸,优选在32和50氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL,b)VL-CL-接头-VH-CH1,c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL通过在CL结构域和CH1结构域之间的天然的二硫键稳定。另外,可通过半胱氨酸残基的插入(例如,在根据Kabat编号的重链可变区第44位和轻链可变区第100位之间)形成链间二硫键进一步稳定这些单链Fab分子。术语“N-端”指N-端的最后一个氨基酸。术语“C-端”指C-端的最后一个氨基酸。
如本文使用的,术语“核酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可为单链或双链的,但优选是双链DNA。
如在本申请中使用的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸组,其包括丙氨酸(三字母编码:ala,单字母编码:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),组氨酸(his,H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),赖氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),丝氨酸(ser,S),苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y),和缬氨酸(val,V)。
当核酸与另一核酸序列处于功能关联状态时,其“有效连接”。例如,如果前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA的连接表达为参与所述多肽分泌的前蛋白,则他们有效连接;如果启动子或增强子的连接影响编码序列的转录,则他们有效连接;或者如果核糖体结合位点与编码序列的排置有利于翻译,则他们有效连接。通常,“有效连接”表示连接的DNA序列是相邻的,而且在分泌前导序列的情况下是相邻且同读框连接的。不过,增强子不必相邻。连接通过便利的限制性位点处的连接实现。如果不存在这样的位点,则按照常规操作使用合成的寡核苷酸适配体(adaptor)或接头。
如本文使用的,措辞“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”是互换使用的,且所有名称包括其后代。因此,词语“转染体”和“转染细胞”包括原代对象细胞和来源于其的培养物,不管传代次数。也应当理解,由于故意或无意突变,所有后代在DNA含量中不是精确相同的。包括与原始转化细胞所筛选的功能或生物学活性具有相同功能或生物学活性的变体后代。
如本文使用的,术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定中,优选在表面等离子共振(SPR,BIAcore,GE-HealthcareUppsala,Sweden)测定中,抗体与抗原表位的结合。通过术语ka(抗体/抗原复合物中的抗体的结合速率常数),kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义结合亲和力。结合或特异性结合指10-8mol/l或更低,优选10-9M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)。
可通过BIAcore测定(GE-HealthcareUppsala,Sweden)研究抗体与死亡受体的结合。通过术语ka(抗体/抗原复合物中的抗体的结合速率常数),kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义结合亲和力。
术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任意多肽决定簇。在某些实施方案中,表位决定簇包括分子的化学活性表面基团,例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基,在某些实施方案中,可以具有特殊三维结构特征和/或特殊电荷特征。表位是抗原结合抗体的区域。
抗体的“Fc部分”不直接参与抗体与抗原的结合,但展示多种效应子功能。“抗体的Fc部分”是本领域技术人员熟知的术语,并基于抗体的木瓜蛋白酶切割定义。取决于抗体的重链的恒定区的氨基酸序列,将抗体或免疫球蛋白分为:IgA型、IgD型、IgE型、IgG型和IgM型,并且可以将这些的几种进一步分成亚型(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。根据重链恒定区将免疫球蛋白的不同种类分别称为α,δ,ε,γ和μ。抗体的Fc部分直接参与基于补体激活、C1q结合和Fc受体结合的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体活化(CDC)通过补体因子C1q与大多数IgG抗体亚型的Fc部分结合引发。尽管抗体对补体系统的影响取决于特定的条件,通过Fc部分中的确定的结合位点引起与C1q的结合。这样的结合位点是现有技术中已知的,并例如由Boakle等人,Nature282(1975)742-743,Lukas等人,J.Immunol.127(1981)2555-2560,BrunhouseandCebra,Mol.Immunol.16(1979)907-917,Burton等人,Nature288(1980)338-344,Thommesen等人,Mol.Immunol.37(2000)995-1004,Idusogie等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184,Hezareh等人,J.Virology75(2001)12161-12168,Morgan等人,Immunology86(1995)319-324,EP0307434描述。这样的结合位点是,例如,L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号,见下)。IgG1,IgG2和IgG3亚类的抗体通常显示补体激活和C1q和C3结合,而IgG4不激活补体系统且不结合C1q和C3。
根据本发明的抗体通过重组手段生产。因此,本发明的一个方面是编码根据本发明的抗体的核酸,且进一步的方面是包含编码根据本发明的抗体的所述核酸的细胞。用于重组产生的方法在本领域广为人知,并且包括在原核和真核细胞中表达蛋白质,随后分离抗体多肽,并通常纯化至可药用的纯度。为在宿主细胞中表达如前所述的抗体,通过标准方法将各自编码修饰的轻链和重链的核酸插入表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293(包括HEK293EBNA)细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达,从细胞(裂解后的上清液或细胞)中回收抗体。用于抗体的重组生产的一般方法在本领域众所周知,并描述于例如Makrides,S.C.,ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.等,ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.,DrugRes.48(1998)870-880的综述文章中。
可以通过常规的免疫球蛋白纯化方法例如,如蛋白质A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基中适当地分离根据本发明的抗体。编码单克隆抗体的DNA和RNA利用常规方法很容易分离,并进行测序。杂交瘤细胞可用作为此类DNA和RNA的来源。DNA一经分离,即可将DNA插入到表达载体中,随之转染到否则将不生产免疫球蛋白的宿主细胞例如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中,以实现宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。
通过将合适的核苷酸改变引入到抗体DNA中,或者通过核苷酸合成制备根据本发明的抗体的氨基酸序列变体(或突变体)。可以进行此类修饰,然而,仅以非常有限的范围,例如,如上所述。例如,修饰并不改变上述的抗体特征,例如IgG同种型和抗原结合,但可以改进重组产物的产率、蛋白质稳定性或有助于纯化。
如在本申请中所有,术语“宿主细胞”指可以工程改造以产生根据本发明的抗体的任一类型的细胞系统。在一个实施方案中,将HEK293细胞和CHO细胞用作为宿主细胞。如本文使用的,措辞“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”是互换使用的,且所有名称包括其后代。因此,词语“转染体”和“转染细胞”包括原代对象细胞和来源于其的培养物,不管传代次数。也应当理解,由于故意或无意突变,所有后代在DNA含量中不是精确相同的。包括与用于筛选原始转化细胞的功能或生物学活性具有相同功能或生物学活性的变体后代。
在NS0细胞中表达由例如,Barnes,L.M.等,Cytotechnology32(2000)109-123;Barnes,L.M.等,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬时表达由例如,Durocher,Y.等,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可变区的克隆由Orlandi,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837;Carter,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289;和Norderhaug,L.等,J.Immunol.Methods204(1997)77-87描述。优选的瞬时表达系统(HEK293)由Schlaeger,E.-J.,andChristensen,K.,在Cytotechnology30(1999)71-83中和由Schlaeger,E.-J.,在J.Immunol.Methods194(1996)191-199中描述。
适合于原核生物的调控元件序列,例如,包括启动子,备选的操纵序列和核糖体结合位点。真核细胞已知利用启动子、增强子和多聚腺苷化作用信号。
通过标准技术,包括本领域众所周知的碱/SDS处理、氯化铯分带(CsClbanding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳等等进行抗体的纯化,以除去其他细胞组分或其他杂质,如其他细胞核酸或蛋白质(参见Ausubel,F.等编辑CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987))。已经建立了不同的方法并广泛用于蛋白质纯化,例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水作用或芳族吸附层析(例如用苯基琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸(m-aminophenylboronicacid))、金属螯合亲和层析(例如用Ni(II)和Cu(II)亲和材料)大小排阻层析和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
如本文中所用,“药物载体”包括生理上相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。优选载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊锥(spinal)或表皮给药(例如通过注射或输注)。
本发明的组合物可通过本领域公知的多种方法给药。正如技术人员将会理解的那样,给药路径和/或方式将随期望的结果而变动。为通过某些给药路径给药本发明的化合物,可能需要用防止化合物失活的材料对其进行包衣,或化合物与之共给药。例如,可以向受试者给药处于适宜载体例如脂质体或稀释剂中的化合物。可药用稀释剂包括盐溶液和水性缓冲溶液。可药用载体包括无菌水性溶液或分散液,以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。
如本文所用的短语“肠胃外给药”和“经肠胃外给药”,表示不同于肠和局部给药的给药方式,通常是通过注射,包括但不限于:静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
如本文中所用,术语癌症指增生性疾病,例如淋巴瘤、淋巴细胞白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈的癌、皮的或眼内的黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区的癌、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管的癌、子宫内膜的癌、子宫颈的癌、阴道的癌、外阴的癌、霍奇金病、食管的癌、小肠的癌、内分泌系统的癌、甲状腺的癌、甲状旁腺的癌、肾上腺的癌、软组织的肉瘤、尿道的癌、阴茎的癌、前列腺癌、膀胱的癌、肾或输尿管的癌、肾细胞癌、肾盂的癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNS)的瘤、脊椎轴肿瘤(spinalaxistumor)、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星细胞瘤、斯万细胞瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文肉瘤,包括任一上述癌的难治类型或者一种或多种上述癌的组合。
这些组合物还可以含有佐剂,如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过前述灭菌操作,以及通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等,均可以确保防止微生物的存在。还可能期望在组合物中纳入等渗剂,如糖、氯化钠等。另外,可注射药物形式的延迟吸收可以通过纳入延迟吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无论所选的施用路径如何,可以以适宜水合物形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物通过本领域公知的常规方法配制为可药用剂型。
根据本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可有变动,以获得有效量的活性成分,从而对于特定的患者、组合物和给药方式实现期望的治疗反应,而对患者没有毒性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素,包括所采用的本发明特定组合物的活性、给药路径、给药时间、所采用特定化合物的排泄速率、与所采用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、总体健康和既往病史、以及医学领域众所周知的类似因素。
组合物必需是无菌和流动的,从而组合物可以通过注射器递送。除了水之外,载体还可以是等渗缓冲盐溶液。
例如,可以通过使用包衣如卵磷脂,分散剂的情况下通过维持所需的颗粒大小,通过使用表面活性剂,来维持适当的流动性。在许多情况下,优选在组合物中纳入等渗剂,例如糖,多元醇如甘露醇或山梨糖醇,和氯化钠。
如本文中所用,术语“转化”指将载体/核酸转移到宿主细胞中的方法。如果将没有坚固的细胞壁屏障的细胞用作为宿主细胞,例如通过如Graham,F.L.,和vanderEb,A.J.,Virology52(1973)456-467所述的磷酸钙沉淀方法实施转染。然而,也可以使用将DNA引入细胞的其他方法,例如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用含有坚固的细胞壁结构的原核细胞或细胞,例如,转染的一种方法是使用如由Cohen,S.N.等,PNAS.69(1972)2110-2114所述的氯化钙的钙处理。
如本文中所用,“表达”指核酸转录成mRNA的过程和/或所述转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽都称为基因产物。如果多核苷酸来源于基因组DNA,那么在真核细胞中表达包括mRNA的剪接。
“载体”是将核酸分子插入到宿主细胞中和/或之间的,特别是自复制的核酸分子。该术语包括主要用于将DNA或RNA插入到细胞中(例如,染色体整合)的载体,载体的复制主要用于DNA或RNA的复制,以及用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。也包括提供一个以上的如上所述功能的载体。
“表达载体”是当将其引入到合适的宿主细胞时,能转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常指包含可以用于产生想要的表达产物的表达载体的合适宿主细胞。
提供如下实施例、序列列表和附图以帮助理解本发明,本发明的真正范围阐释在所附权利要求书中。应当理解,可以对所示的操作进行改动而不会偏离本发明的精神。
附图简述
图1:在不同人细胞系(Lovo,OVCAR-3,AsPC-1,BxPC3,LS174T和MKN-45)中的CEA,DR5和FAS表达水平的FACS结合分析,使用未标记的市售鼠IgG1抗体(CEA:Abcam#11330;DR5:R&D#MAB631;FAS:BD#555671)和常用的山羊抗小鼠FITC标记的IgG(SerotecStar105F)检测。使用仅包含细胞或包含细胞和仅第二抗体的样品作为对照。除了Lovo细胞以外,所有检测的细胞系在表面上表达大量的DR5和FAS。与这相比,CEA表达非常低。当用针对3种抗原的其他抗体检测相同的细胞时,Lovo细胞也在FACS分析中为DR5,FAS和CEA表达阳性的(数据未显示)。
图2:在与市售的能够在溶液中诱导凋亡的无交联的抗体(DR5:R&D#MAB631;FAS:Millipore/Upstate:CH11)孵育4小时后,不同细胞系的凋亡诱导(DNA片段化测定)分析。为了检测凋亡,使用用于分析组蛋白相关的DNA片段化的细胞死亡检测ELISAPLUS试剂盒。在BxPC-3,Lovo和LS174T细胞中,通过DR5和FAS可明显地诱导凋亡,而ASPC-1细胞完全没有经历凋亡。相比其他细胞系,MKN-45细胞对DR5更具抗性。
图3:与ApomAb(白色条)、与抗人Fc抗体交联的ApomAb(阴影线灰色条)、ApomAb_sm3e_A(黑色条)和ApomAb_sm3e_A1(带点灰色条)双特异性分子孵育4小时后LS174T细胞的诱导凋亡(DNA片段化测定)。可检测通过双特异性抗体靶向的高度交联的CEA结合依赖的凋亡的诱导。此作用与通过ApomAb的交联诱导的凋亡在相同的范围内,并可通过与过量的sm3eIgG的预孵育完全消除。在对照(仅有细胞或sm3eIgG)中未观察到凋亡,且单独的ApomAb在使用的浓度(1μg/ml)上没有诱导凋亡。
图4:在使用与凋亡诱导剂孵育4小时的LS174T细胞的DNA片段化测定中,相比单独的ApomAb(白色条)或与抗人Fc抗体交联的ApomAb(阴影线灰色条),不同的ApomAb_sm3e双特异性分子的凋亡诱导活性的比较。大体上,其中sm3escFv与ApomAb重链的C-端融合的分子(形式A,黑色条)似乎比其中sm3escFv与ApomAb轻链的C-端融合的构建体(形式B,灰色条)活性高。此外,包含二硫化物稳定的scFv的双特异性抗体(形式A1,带点灰色条和B1,小网格条)似乎比具有野生型scFv的分子活性略差。
图5:与ApomAb(白色条)、与抗人Fc抗体交联的ApomAb(阴影线灰色条)或ApomAb_PR1A3_A双特异性构建体(黑色条)孵育4小时后的LS174T细胞的凋亡诱导分析(DNA片段化测定)。在每种情况下,凋亡诱导都依赖于使用的抗体浓度。单独的ApomAb也在高浓度下诱导了低水平的凋亡,但通过交联凋亡水平显著提高了。双特异性ApomAb_PR1A3_A分子在没有第二交联剂时甚至比交联的ApomAb活性更高。
图6:与ApomAb(白色条)、与抗人Fc抗体交联的ApomAb(灰色条)或ApomAb_PR1A3_A双特异性构建体(黑色条)孵育4小时后的Lovo细胞的凋亡诱导分析(DNA片段化测定)。在每种情况下,凋亡诱导都依赖于使用的抗体浓度。单独的ApomAb也在高浓度下诱导了低水平的凋亡(如上所述),但通过交联凋亡水平显著提高了。双特异性ApomAb_PR1A3_A分子自身与交联的ApomAb一样有活性。
图7:在与不同凋亡诱导双特异性抗体孵育4小时后,在LS174T细胞中的DNA片段化的比较。使用的分子是ApomAb_PR1A3双特异性分子,其中PR1A3scFv(wt=A/B或二硫化物稳定的=A1/B1)与重链(A,阴影线灰色条)或轻链(B,带点条)的C端融合。尽管在此情况下scFv的融合位置似乎就凋亡诱导而言没有区别,使用的融合scFv的类型却是重要的:相比包含与ApomAb融合的wtscFv,使用二硫化物稳定的scFv几乎完全消除了凋亡的诱导(分别是灰色和黑色条)。由于PR1A3相比sm3e的较低的亲和力,用包含PR1A3的双特异性分子的整体凋亡诱导也较低。
图8:ApomAb-CEA(PR1A3)双特异性构建体在MKN-45细胞上的FACS结合分析。比较了具有野生型(A)或二硫化物稳定的scFv(A1)的ApomAb_PR1A3双特异性构建体。两种双特异性构建体都以浓度依赖的方式与靶细胞结合,但包含野生型scFv形式的PR1A3的分子比包含二硫化物稳定的PR1A3scFv的分子以高得多的亲和力结合抗原。
图9:在NCCIT和重组的表达CRIPTO的HEK293细胞上通过FACS结合实验进行CRIPTO,FAS和DR5表面表达分析。相比重组的HEK293-CRIPTO细胞,NCCIT细胞不表达FAS,仅表达少量的CRIPTO但表达类似量的DR5。后一种细胞显示了低水平的FAS,显著水平的DR5和相当高水平的CRIPTO表达。
图10:使用FAS(HFE7AIgG),通过抗人Fc抗体交联的FAS(HFE7AIgG)和FAS-CRIPTO双特异性分子(HFE7A_LC020H3L2D1,其中wt(A)或二硫化物稳定的(A1)CRIPTOscFv与HFE7A重链的C端融合)的凋亡诱导比较(在HEK293-CRIPTO细胞中的DNA片段化)。单独的FASIgG,单独的CRIPTOIgG和FAS-MCSP双特异性分子不诱导凋亡,而交联的FAS和HFE7A-CRIPTO双特异性分子在4小时的孵育后显示了DNA片段化,所述DNA片段化可通过与过量的抗CRIPTOIgG预孵育部分消除。
图11:相比重组的HEK293-FAP(成纤维细胞活化蛋白)细胞(白色条),在重组的HEK293-CRIPTO细胞(黑色条)中通过HFE7A-CRIPTO双特异性分子的凋亡诱导(DNA片段化测定)。在两种细胞系中,可使用诱导凋亡的市售抗体(CH11)和使用通过第二种Fc特异性抗体交联的HFE7AIgG诱导凋亡,而单独的HFE7A在所使用条件下不诱导凋亡。使用双特异性FAS-CRIPTO分子的凋亡诱导比用交联的HFE7AIgG更高,但不能通过与过量的抗CRIPTOIgG预孵育被完全抑制。在HEK293-FAP细胞中可观察到一定的低背景凋亡,这也不能被过量的CRIPTOIgG完全竞争(out-competed)。甚至阴性对照分子(其中二硫化物稳定的MCSP特异性scFv与HFE7A重链的C端融合)在HEK293-FAP细胞中显示了低程度的凋亡。
图12:使用2种不同抗体在不同细胞系(MCF7,SkBr3,A431,A549,HCT-116和U87-MG)上测定MCSP表面表达水平的FACS结合分析。使用2种抗体都可检测到相同水平的MCSP表达,表明U87-MG显示了最高的MCSP表达,HCT-116具有低MCSP表达,而所有其他检测的细胞系为MCSP阴性的(在阴性对照例如未染色细胞的范围中)。
图13:使用可溶的和交联的ApomAb(黑色条)和HFE7A(灰色条)和相关对照分子(单独的抗FAS_CH11,抗DR5_R2和抗Fc-IgG)评估U87-MG(A)和HCT-116(B)细胞的凋亡能力。尽管在HCT-116细胞中仅可通过DR5受体在4小时后诱导凋亡且不通过FAS诱导凋亡,在U87-MG细胞中则不同。这里,在24小时后才观察到显著的凋亡。与HCT-116细胞相反,通过交联的HFE7A的U87-MG凋亡诱导效率是使用交联的ApomAb的2倍。已经在溶液中赋予凋亡的对照抗体甚至更有效。
图14:与双特异性HFE7A-MCSP抗体(mAb9.2.27)(其中野生型(A形式)或二硫化物稳定的MCSPscFv(A1形式)与ApomAb重链的C-端融合)孵育24小时后在U87-MG神经胶质瘤细胞中的凋亡诱导分析。在此情况中,包含二硫化物稳定的scFv的构建体证明了比包含野生型scFv的分子显著更高的凋亡(尽管通过DNA片段化测量的凋亡量相对低)。然而,在两种情况下,可通过细胞与过量竞争MCSPIgG的预孵育完全消除凋亡的诱导。
图15:2种不同细胞系(SW872和GM05389)的人成纤维细胞活化蛋白(FAP)表达水平的FACS结合分析(A)。使用不同浓度的抗FAP抗体测量的荧光强度在3个数量级的范围上显示(黑色、灰色和阴影线条)。仅有第二抗体和细胞的阴性对照反应分别以带点条和白色条显示。尽管GM05389细胞在所有检测的抗体浓度上展示了高于背景的FAP表达,在SW872细胞中仅在使用的最高抗体浓度(10μg/ml)上可检测到FAP表达,表明这些细胞不适合用于基于FAP的结合/凋亡诱导实验。另外显示,此细胞系几乎不经历ApomAb介导的凋亡(B)。单独的ApomAb或另一种市售的抗DR5抗体没有诱导相关的DNA片段化。只有当ApomAb与抗人Fc抗体交联时,可观察到可检测的低水平的凋亡诱导。
图16:相比共同培养两种细胞系(黑色条),单独的GM05389(白色条)和MDA-MB-231(灰色条)的凋亡诱导分析。在所有细胞系中,单独的ApomAb仅具有微弱的作用,而ApomAb的交联导致在MDA-MB-231细胞中的显著的凋亡诱导。用死亡受体激动型双特异性构建体(ApomAb-FAP)诱导的DNA片段化仅在共同培养两种细胞系时出现高水平。这里,单独ApomAb交联没有在相同的范围中提高凋亡,表明为了最佳的诱导凋亡,两种细胞系是必需的:一种表达死亡受体和第二种表达FAP抗原。
图17:使用四价双特异性ApomAb_PR1A3_scFab分子(其中scFab与ApomAb(A形式)重链的C-端融合)在MKN-45细胞上的凋亡诱导测定(24小时)的结果。与ApomAb(+/-与10倍过量的抗人Fc抗体交联)和阴性对照比较凋亡诱导。以0.1和1.0μg/ml的浓度使用所有构建体。在使用的测定条件下,双特异性ApomAb_PR1A3_scFab构建体(黑色条)清楚显示了浓度依赖的凋亡诱导,其与高度交联的ApomAb(灰色条)所观察到的在相同的范围中,且其显著高于使用单独的ApomAb(阴影线条)诱导的凋亡。
图18:相比双特异性三价构建体(ApomAb_sm3e_scFab;2x1价,黑色条)和阴性对照,通过ApomAb(单独的,阴影线条或高度交联的,灰色条)的LS174T细胞的凋亡诱导分析。使用0.1和1.0μg/ml浓度的构建体进行4小时测定。双特异性ApomAb_sm3e_scFab构建体能够以浓度依赖的方式诱导凋亡,所述凋亡与高度交联的ApomAb诱导的凋亡在相同范围中。
图19:相比载体对照,ApomAb和双特异性DR5激动型抗体ApomAb_sm3e_A1在使用人结肠癌细胞系LS174T的脾内转移模型中的体内效力分析。用PBS(黑色线)、ApomAb(黑色圆圈)或ApomAb-sm3e_A1双特异性抗体(黑色方块)处理每组10只小鼠的随机组。将存活百分比对实验的时间进程作图。
实施例
实施例1:识别人死亡受体5和人CEA的双特异性抗体的设计
以下描述了四价双特异性抗体,其包含与第一抗原(人死亡受体,DR5)结合的全长抗体和与第二抗原(人癌胚抗原,CEA)结合的2条单链Fv片段的组合,所述单链Fv片段通过肽接头与所述全长抗体的重或轻链的C-端融合。在所述单链Fv中的抗体结构域和接头具有以下方向:VH-接头-VL。
使用Adams在US2007/0031414A1中描述的ApomAb抗体的序列作为DR5识别抗体的轻和重链可变区。
用于结合CEA抗原的scFv,使用PR1A3(Bodmer等人,1999;US5965710)和sm3e(Begent等人,2003;US7232888B2)的轻和重链可变区的序列。
通过基因合成和重组DNA技术,通过甘氨酸-丝氨酸(G4S)4接头连接对应的CEA抗体的VH和VL以产生单链Fv,所述单链Fv通过(G4S)n连接头(其中n=2或4)与ApomAbIgG1的重或轻链的C-端融合。
除了“野生型”scFv以外,制备了在重链可变区的Kabat位置44和轻链可变区的Kabat位置100上包含半胱氨酸残基的变体,以在VH和VL之间产生链间二硫键。这具有稳定scFv分子以最小化潜在的聚集倾向的目的。
为了避免双特异性分子的非特异性交联,例如通过Fc受体作为人FcγRIIIa,改变了双特异性分子的IgG部分的Fc区中的2个氨基酸。通过定点诱变,用丙氨酸残基替换了Fc区中的第234和235位的2个亮氨酸残基。描述了此所谓的LALA突变以消除Fc-FcR相互作用(Hessell等人,Nature449(2007),101ff)。
所有这些分子被重组表达,制备和使用标准抗体纯化技术(包括蛋白质A亲和层析后的大小排阻层析)纯化。在表达产量、稳定性和生物活性方面表征了分子。
表1中提供了由ApomAb-CEA组合组成的不同的双特异性死亡受体激动型抗体分子的总结。可从分子名称中推断不同分子的设计描述,其中第一部分表征靶向死亡受体的IgG(例如ApomAb),第二名称描述了靶向CEA的scFv的来源(例如PR1A3或sm3e),字母和数字组合描述了融合位置和scFv的二硫化物稳定性能。
表1:靶向人DR5和人CEA的不同的双特异性死亡受体激动型抗体及其相关特征的描述。
实施例2:双特异性死亡受体激动型抗体的表达和纯化
构建了用于每种双特异性抗体的轻和重链的单独的表达载体。这些载体包含原核选择标记,用于在哺乳动物细胞中的基因表达的调控元件,和用于质粒在包含EBNA的HEK293细胞中自主复制的来自Ebstein-Barr病毒的复制起点,oriP。在大肠杆菌中增殖质粒,纯化并使用用于瞬时转染的磷酸钙介导的沉淀共转染进HEK293EBNA细胞。7天后收获细胞培养物上清并通过蛋白质A和大小排阻层析纯化抗体。通过分析型大小排阻层析(在一次冻融步骤前和后)和SDS-PAGE分析(在非还原和还原条件下)分析纯化分子的同质性、稳定性和完整性。
表2:不同死亡受体激动型双特异性抗体的纯化产量和单体含量的总结
可制备和纯化足够量和具有适当质量的所有分子用于进一步表征和检测。在纯化后的产量在约5mg/L的范围中,有些分子具有一些偏差。例如,ApomAb-sm3e-B1的产量显著较低(2.19mg/L),而对应的构建体ApomAb-PR1A3_B1甚至可纯化至超过11mg/L。
在冻/融后的聚集物形成的测定和抗体浓度的渐增表明,取决于分子,通过链间二硫键的稳定对形成聚集物的倾向可具有有利影响。大体上,二硫键稳定导致至少在更高浓度上的分子的更高的单体含量(表3)。
表3:双特异性死亡受体激动型抗体的聚集物形成与蛋白质浓度相关
形成聚集物的倾向不仅依赖于scFv的二硫键稳定,而且依赖于使用的结合抗原的scFv。从表3中明显可见,包含PR1A3scFv的双特异性ApomAb分子在蛋白质浓度增加后经历显著的聚集。在超过3mg/ml的浓度时仅80%的材料显示为单体,而在引入2个另外的半胱氨酸残基(根据Kabat编号的VH44/VL100)后,这些分子在使用的浓度上不形成聚集物。
包含sm3escFv的双特异性ApomAb分子的聚集物形成程度没有那么显著,因为在这里单体含量分别是:在没有二硫化物稳定时仍为约94%,在存在二硫化物稳定时为97%。
实施例3:通过死亡受体双特异性DR5-CEA抗体分子诱导凋亡
人DR5死亡受体激动型抗体ApomAb诱导表达DR5的肿瘤细胞,例如结肠癌细胞系LS180或Colo-205的凋亡。在体外,ApomAb自身介导显著的凋亡,所述凋亡可通过结合ApomAb的DR5与结合ApomAb的人Fc区的抗体的交联显著提高。此凋亡的诱导也可转入体内,其中不同肿瘤模型可显示,ApomAb展示显著的效力(Jin等人,2008;Adams等人,2008),很可能是通过经由人Fc受体的交联事件。为了评估DR5-CEA双特异性抗体在靶向肿瘤位点的DR5交联和随后的凋亡诱导中的潜能,在体外分析了ApomAb-CEA双特异性分子在凋亡介导方面的活性。
为了测定DR5-CEA双特异性抗体分子是否能够诱导靶细胞的肿瘤抗原结合依赖性凋亡,使用细胞死亡检测ELISA测定分析了与死亡受体激动型双特异性抗体孵育后的肿瘤细胞中的DNA片段化作为凋亡的测量。
为了找出适于测量导致凋亡诱导的抗原结合依赖的DR5交联的细胞系,分析了若干不同肿瘤细胞系的DR5,FAS和CEA的表面表达。
在进行如下的凋亡测定以前,分析了所有使用的靶细胞系的肿瘤相关抗原和FAS或DR5死亡受体的相对表达水平。
测定了细胞数和活力。为此,使用细胞分离缓冲液(Gibco-Invitrogen#13151-014)使粘附生长的细胞分离。通过离心(4分钟,400xg)收获细胞,用FACS缓冲液(PBS/0.1%BSA)洗涤并在FACS缓冲液中将细胞数调整为1.111X106细胞/ml。对96孔圆底板的每个孔使用180μl此细胞悬浮液,得到每孔2x105细胞。将细胞与适当稀释的第一抗体在4℃孵育30分钟。然后通过离心(4分钟,400xg)收获细胞,彻底去除上清并用150μlFACS缓冲液洗一次细胞。在150μlFACS缓冲液中重悬细胞,并在黑暗中与第二抗体(在使用无标记的第一抗体的情况下)在4℃孵育30分钟。在2个用FACS缓冲液洗涤的步骤后,在200μlFACS缓冲液重悬细胞并在HTSFACSCantoII(BD,软件FACSDiva)中分析。可选地,可用200μl在FACS缓冲液中的2%PFA(多聚甲醛)在4℃固定细胞20分钟并以后分析。所有测定一式三份进行。
在图1中显示了使用3种特异性识别CEA,DR5或FAS的抗体的不同肿瘤细胞系的FACS结合分析的结果。除了Lovo细胞以外,所有其他检测的细胞系在不同水平上表达检测的抗原。CEA表达在MKN-45细胞中最高,并在OVCAR-3,AsPC-1,BxPC-3和LS174T中差不多类似。在DR5表达的方面,AsPC-1和BxPC.3细胞相比其他细胞系表达最多的受体,接着是OVCAR-3和MKN-45,而LS174T具有最低的DR5表达水平。至于FAS表达,细胞系表达有差异但都显示了显著的FAS表达。当后来用针对CEA,DR5和FAS的不同抗体分析Lovo细胞(其在此测定中为阴性)时,其也显示了显著的检测抗原的表达(数据未显示)。
为了测定诱导的凋亡,使用来自Roche的细胞死亡检测ELISAPLUS试剂盒。简单地说,在200μl合适的培养基中在96孔板的每个孔中接种104细胞(分离后测定细胞数和存活)并在5%CO2大气中在37℃下过夜培养。第二天用包含合适浓度的凋亡诱导抗体、对照抗体和其他对照的新鲜培养基替换培养基:
以0.01-10μg/ml的终浓度使用双特异性抗体;以0.5μg/ml使用对照抗体和以100μg/ml使用交联抗体。使用100倍过量的竞争抗体。
在37℃,5%CO2下培养细胞4-24小时以允许凋亡的诱导。通过离心(10分钟,200xg)收获细胞,并在室温下在200μl裂解缓冲液(试剂盒提供的)中孵育1小时。通过离心(10分钟,200xg)沉淀完整的细胞,并根据制造商的建议分析20μl上清以检测凋亡的诱导。
通过与市售的针对DR5或FAS的抗体(已知其交联已经在溶液中的死亡受体)孵育,也分析了一组细胞系承受凋亡的能力(图2)。
这里观察到如图2所示的细胞系之间在凋亡诱导方面的显著差异。尽管在MKN-45和BxPC-3中通过DR5和FAS的凋亡诱导是类似的(尽管在MKN-45中DNA片段化的值仅达到BxPC-3中的50%),在LS174T和Lovo细胞中,用DR5交联抗体诱导的凋亡比用结合FAS的抗体诱导的凋亡好得多。在LS174T细胞中,通过DR5交联的凋亡诱导大约是通过FAS交联的诱导效率的2倍。在Lovo细胞中,在凋亡诱导中的此差异甚至是4倍。ASPC-1细胞对通过死亡受体交联的凋亡诱导非常有抗性。基于这些结果,选择细胞系Lovo和LS174T用于分析通过肿瘤抗原靶向的DR5交联诱导的凋亡。
图3中说明了相比ApomAb或交联的ApomAb的作用,在用双特异性DR5-CEA分子(ApomAb-sm3e)处理后的LS174T细胞中的凋亡诱导结果。在使用的测定条件下(以1μg/ml的浓度孵育4小时),单独的ApomAb或以IgG1形式的sm3e没有展示可检测的DNA片段化(标准化为“仅有细胞”的值),而双特异性ApomAb-sm3e分子(野生型(形式A)或二硫化物稳定的(形式A1)scFv)显示了与高度交联的ApomAb的理论最大值差不多的显著的凋亡诱导。2种双特异性分子显示了非常类似的活性,证明通过插入链间二硫化物稳定分子不影响生物活性。当细胞与过量的sm3eIgG(相比双特异性构建体高100倍的浓度)预孵育时,不再诱发凋亡,表明sm3eIgG封闭了细胞表面上的所有CEA抗原并阻止双特异性死亡受体激动型分子的另外结合。这证明诱导的凋亡特异性依赖于DR5死亡受体通过肿瘤抗原的交联。
在图4中总结了双特异性ApomAb-sm3e构建体的不同分子形式对LS174T细胞的凋亡诱导的比较结果。在1μg/ml浓度下进行4小时凋亡的诱导。再一次地,双特异性ApomAb-sm3e分子(其中sm3escFv与ApomAb重链的C-端融合(A和A1形式))展示了显著的凋亡诱导,在此情况中其甚至比高度交联的ApomAb更有效。单独的ApomAb在使用条件下不诱导可检测的DNA片段化。2种另外的双特异性构建体(sm3escFv与ApomAb轻链的C-端融合,野生型=B形式或二硫化物稳定的=B1形式)也展示了高水平的凋亡诱导,其中至少B形式与交联的ApomAb展示了类似的范围,表明2种形式基本上都有功能。scFv与ApomAb重链的C-端融合似乎比与轻链的融合略有优势。与图4中所示的结果相比,相比具有野生型scFv的分子,二硫化物稳定的分子似乎也展示了略微降低的活性。
如图3和4中所示,上述ApomAb-sm3e构建体在抗原依赖的特异性凋亡诱导方面起了非常好的作用。此CEA抗体sm3e展示了对其抗原的非常高的亲和力(低皮摩尔范围)。为了评估双特异性DR5-CEA构建体的凋亡诱导作用是否也可由具有对肿瘤抗原结合亲和力较低的分子介导,生成了类似前一种的另外的构建体。使用具有对CEA在微摩尔范围中的相当低的亲和力的CEA抗体PR1A3的序列改造靶向CEA的scFv。为了评估此抗体生成了双特异性构建体,其中PR1A3scFv(野生型或二硫化物稳定的)与ApomAbIgG重或轻链的C-端融合。得到的分子的命名与已描述的类似:ApomAb_PR1A3_A/A1/B/B1,其中A和A1描述了与重链的C-端融合,B和B1显示了与轻链的C-端融合。A和B包含野生型scFv,而A1和B1指示二硫化物稳定的scFv。
在图5中,显示了在从0.01至10.0μg/ml范围的浓度上,ApomAb、交联的ApomAb和ApomAb_PR1A3双特异性抗体(野生型PR1A3scFv与ApomAb重链的C-端融合)的对LS174T细胞的凋亡诱导。ApomAb自身展示了一定程度的浓度依赖的凋亡诱导,这可通过ApomAb与抗人Fc抗体的交联被显著提高。双特异性ApomAb-PR1A3分子也展示了浓度依赖的凋亡诱导,在10.0μg/ml的浓度上诱导的凋亡甚至比相同浓度的交联的ApomAb还高,表明为了获得在凋亡诱导方面的良好的体外效力,没有绝对必要在此双特异性死亡受体激动型抗体形式中使用最高亲和力的肿瘤抗原结合剂。
为了研究在与DR5-CEA双特异性分子孵育后观察到的凋亡诱导是否可应用于其他细胞系,使用另一种结肠癌细胞系Lovo细胞进行了如图6中所示的类似的实验。
相比通过ApomAb和交联的ApomAb的凋亡诱导,使用死亡受体激动型双特异性分子ApomAb_R1A3_A(DR5-CEA)在Lovo细胞中诱导凋亡的结果显示在图6中。对所有构建体观察到浓度依赖的凋亡诱导。在这里,当以10μg/ml浓度使用时,单独的ApomAb达到交联的ApomAb的20%活性。低于此浓度时,诱导的凋亡相比交联的ApomAb要低得多。ApomAb_PR1A3双特异性抗体在缺乏任何交联分子的情况下显示了与高度交联的ApomAb抗体的相同程度的DNA片段化的诱导,证明使用死亡受体激动型抗体的凋亡诱导效果是可应用于所有能够凋亡的细胞系的普遍现象。
在图7中,显示了不同ApomAb-PR1A3和ApomAb-sm3e构建体之间的比较结果。这里总结了用1μg/ml浓度孵育4小时后在LS174T细胞中的凋亡诱导。从结果中显而易见地,对CEA抗原的亲和力的确可能在介导通过死亡受体交联的凋亡中起作用。相比低亲和力结合剂,包含高亲和力CEA结合剂的构建体在凋亡诱导中存在明显的差异。相比ApomAb-sm3e,ApomAb-PR1A3仅显示了约1/3的在LS174T细胞中的凋亡诱导。此外在不同分子中似乎存在固有差异,这也反映在凋亡诱导能力中。在PR1A3scFv与ApomAb融合的情况中,在scFv与重或轻链的C-端融合的分子之间没有活性的差异。2种分子都显示了相同的凋亡诱导。与之相反,包含sm3escFv的构建体表现得不同。在这里,scFv与重链C-端的融合比与轻链C-端的融合更有效。
在2个系列的构建体之间的另一个差异是以下事实,即具有scFv的二硫化物稳定的不同效果。尽管二硫化物稳定的包含sm3escFv的构建体在凋亡诱导方面不受影响,对PR1A3scFv则相反。如果使用二硫化物稳定的形式则不再显示显著的凋亡诱导。
实施例4:靶向FAS(CD95)和作为肿瘤抗原的CRIPTO的双特异性死亡受体激动型抗体的生成和这些分子的体外评估:
CRIPTO是GPI锚定的生长因子,据报导其在癌细胞中过表达,但在正常细胞中低表达或缺乏。在结肠肿瘤和肝转移中发现CRIPTO的上调。作为EGF家族的成员,其被认为是在肿瘤细胞的增殖、转移和/或存活中起作用的自分泌生长因子。此生长因子通过若干潜在的受体或共受体激活一些信号转导途径。
为了弄清楚CRIPTO是否是死亡受体激动型双特异性抗体方法的合适靶,生成了靶向FAS作为死亡受体和CRIPTO作为肿瘤抗原的四价双特异性抗体。这些分子由全长IgG1抗体(识别FAS)组成,将靶向CRIPTO的scFv与所述抗体重链的C-端融合。
使用HFE7A抗体的序列(Haruyama等人,2002)用于所述分子的靶向FAS的IgG部分的重和轻链,HFE7A抗体是针对CD95的人/小鼠交叉反应性抗体。从通过免疫法(LC020_H3L2D1)产生的人源化抗CRIPTO抗体的序列生成CRIPTOscFv。使用标准重组DNA技术生成scFv并通过短的肽接头融合至FASIgG1重链的C-端。在scFv中的单个结构域的顺序为VH-(G4S)4接头VL。
不幸地是,没有许多合适的现有细胞系可用于CRIPTO靶向。因此评估了2种细胞系用作通过双特异性FAS/CRIPTO抗体的FAS交联介导的凋亡诱导的靶细胞系的潜能。在图9中显示了FAS,DR5和CRIPTO在NCCIT和重组的表达人CRIPTO的HEK细胞(以下称为HEK-CRIPTO)中的表面表达的评估结果。与HEK-CRIPTO细胞相反,NCCIT几乎不在表面上表达FAS,仅表达非常低水平的CRIPTO,而DR5表达似乎是正常的。与之相反,HEK-CRIPTO细胞表达高水平的CRIPTO,显著水平的DR5和合适水平的FAS,因此选择这些细胞用于FAS-CRIPTO双特异性抗体诱导的凋亡的体外分析。
图10总结了使用HFE7A、交联的HFE7A或HFE7A-CRIPTO双特异性构建体在HEK-CRIPTO细胞上的凋亡诱导的体外实验的结果。使用单独的HFE7A或CRIPTO(LC020)没有显著的诱导凋亡。HFE7A与抗人Fc抗体的交联导致如双特异性HFE7A-CRIPTO分子所导致的高水平的DNA片段化。在此情况中,双特异性分子包含与HFE7A重链的C-端融合的野生型CRIPTOscFv(HFE7A_LC020_A)或二硫化物稳定的scFv(HFE7A_LC020_A1)。几乎观察不到这两种分子之间在凋亡诱导中的差异。
在两种情况下,与过量的CRIPTOIgG的预孵育显著降低了凋亡诱导,但此降低是不完全的。其原因不清楚并有待评估。包含与HFE7A重链的C-端融合的靶向MCSP的scFv的类似的构建体(HFE7A_LC007_A1)没有诱导HEK-CRIPTO细胞的任何凋亡,表明观察到的使用双特异性HFE7A-CRIPTO分子的凋亡是肿瘤抗原特异性的。
在图11中显示了用HFE7A-CRIPTO双特异性抗体处理后,在HEK-CRIPTO和重组的表达人FAP(成纤维细胞活化蛋白)的HEK细胞(HEK-FAP)之间的凋亡诱导的比较结果。如果与已经在溶液中赋予凋亡的阳性对照抗体孵育或当用交联的HFE7A处理时,2种细胞系均经历凋亡。抗FAS抗体HFE7A自身不介导这些细胞系中的凋亡。双特异性HFE7A-CRIPTO分子仅在HEK-CRIPTO细胞中但不在对照HEK-FAP细胞中诱导凋亡。似乎在HEK-FAP细胞中也有低水平的DNA片段化,但这是非特异性的基础活性,因为其也可在使用不相关的HFE7A-MCSP对照分子和甚至使用单独的抗CRIPTO和抗Fc抗体中被观察到。如在图10中描述的实验中观察到的,在此情况中通过与过量的CRIPTOIgG的预孵育的凋亡的抑制是不完全的。
实施例5:FAS-MCSP双特异性死亡受体激动型抗体的生成和其凋亡诱导潜能的评估
在直接表达和展示在肿瘤细胞表面上的抗原中,也考虑了其他抗原用于死亡受体的靶向交联以诱导凋亡。特别是来自基质或新血管系统的抗原。后者的一个实例是黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。MCSP在大多数黑色素瘤细胞以及神经胶质瘤细胞和新血管系统上表达。已经描述了若干靶向人MCSP的单克隆抗体,但由于缺乏效力(例如缺乏ADCC)没有一种适用于癌症治疗。因此如果在能够介导靶向肿瘤位点的凋亡双特异性形式中使用将使MSCP抗体得到利用。
为了评估有关凋亡诱导的同时肿瘤/新血管系统靶向,生成了双特异性死亡受体激动型抗体,其中MCSP特异性scFv(野生型或二硫化物稳定的)与抗FAS抗体HFE7A的C端融合。这些scFv通过短的肽接头与HFE7A融合。用于产生靶向MCSP的scFv的轻和重链可变区的序列来自MCSP抗体9.2.27(Beavers等人,1996;US5580774)。
为了定义适于分析体外凋亡诱导的细胞系,通过FACS结合分析检测了若干细胞系的MCSP表达(图12)。在检测的细胞系中,如用2种抗MCSP抗体(9.2.27和LC007)所检测的,只有HCT-116和U-87MG展示了显著的MCSP表达。检测的所有其他细胞系仅显示了非常低的MCSP表达或无表达。因此分析了这两种细胞系,当用交联的激动型死亡受体抗体或用已经在溶液中赋予凋亡的对照抗体处理时是否经历凋亡。在U-87MG细胞中,抗FAS和抗DR5抗体二者都可诱导凋亡(图13A),而HCT-116细胞则不同。这里仅抗DR5抗体可诱导凋亡(图13B)。因此选择U-87MG细胞用作靶细胞,用于以后的凋亡诱导实验。
图14显示了用由与结合MCSP的scFv(9.2.27)组合的靶向FAS的HFE7AIgG组成的FAS激动型双特异性抗体(以1μg/ml的浓度)处理后,使用神经胶质瘤细胞系U-87MG的凋亡诱导实验得到的结果。将野生型(A形式)和H44/L100二硫化物稳定的scFv(A1形式)二者与单独的HFE7A或通过第二抗人Fc抗体交联的HFE7A比较。尽管大体上这些U-87MG细胞的凋亡诱导相当低(甚至在24小时的孵育后),当使用双特异性FAS激动型抗体时可观察到显著的DNA片段化。在此情况中,包含二硫化物稳定的scFv的构建体似乎比包含野生型scFv的构建体有效,且二者都显示了比交联的HFE7AIgG分子高得多的凋亡诱导能力。细胞与100倍过量的MCSP(9.2.27)IgG的预孵育完全抑制了双特异性构建体的凋亡诱导,表明在缺乏竞争抗体的情况下观察到的DNA片段化/凋亡是特异性的并且依赖于通过MCSP抗原的FAS的交联。
实施例6:DR5-FAP死亡受体激动型双特异性抗体能够通过第二种细胞系的交联介导一种细胞系的凋亡
通过死亡受体DR5的交联的凋亡诱导的另一种方法(除了通过肿瘤细胞表达的抗原的交联以外),是靶向肿瘤周围的基质。在该情况中,靶向的抗原不直接展示在肿瘤细胞上,而是展示在第二种不同的细胞类型上。此类抗原的一个实例是FAP(成纤维细胞活化蛋白)。此蛋白质在活化的成纤维细胞上表达,因为其在肿瘤基质中被发现。
为了调查使用靶向人DR5和来自肿瘤基质抗原的双特异性死亡受体激动型抗体诱导靶向肿瘤的凋亡的可能性,生成了由识别DR5的IgG1部分和与抗体重链的C-端融合的结合FAP的scFv组成的双特异性分子。靶向DR5的IgG的序列来自如US2007/0031414A1中描述的ApomAb序列。结合FAP的scFv的重和轻链可变区的序列来自如序列#1和2所示的通过噬菌体展示分离的Fab抗FAP分子。FAPscFv通过(G4S)2连接头与抗DR5IgG重链的C-端融合。
在此类设置中必须使用2种不同的细胞系用于体外活性测定:一种细胞系(靶细胞系)应该表达人DR5,必须是能够凋亡的但不需要表达FAP。第二种细胞系(效应细胞系)必须是凋亡阴性的(通过凋亡抗性或通过不表达DR5)但需要在表面上表达FAP。
满足期望标准的一种可能的效应细胞系是人成纤维细胞系GM05389。如在图15A中所示,相比仅在检测的最高抗体浓度(10μg/ml)下显示FAP表达的细胞系SW872,此细胞系表达显著水平的FAP,但如在图15B中所示,其不经历由未交联的ApomAb诱导的凋亡。因此此细胞系似乎是凋亡测定中的潜在效应细胞系,在所述凋亡测定中通过在第二种细胞系上表达的抗原的交联诱导靶细胞系的DNA片段化。
使用表达低水平的DR5且对DR5介导的凋亡诱导敏感的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为靶细胞系。在图16中,总结了通过FAP的DR5的肿瘤靶向交联的GM05389细胞和MDA-MB-231细胞相比两种细胞系组合的DNA片段化的诱导结果。只有当2种细胞系共培养时(黑色条)可观察到在与死亡受体激动型抗体孵育后的显著的凋亡诱导,而在单独的2种细胞系中(分别为白色和灰色条)仅可检测到较低程度的DR5与抗人Fc靶向ApomAb的交联诱导的凋亡。我们这样解释此结果,即在MDA-MB-231细胞上的DR5受体通过与成纤维细胞系GM05389表达的FAP抗原结合而被交联。
实施例7:CEA单链Fab分子(scFab)与ApomAb融合以生成DR5-CEA双特异性激动型抗体
除了通过在scFv的重和轻链中确定的插入内部半胱氨酸残基稳定双特异性抗体以避免聚集物形成以外,使用单链Fab(scFab)是稳定整个双特异性抗体以避免非特异性交联的另一种可能的策略。
为了评估此形式(scFab与DR5激动型抗体融合)是否展示与相应的包含scFv的分子类似的凋亡诱导活性,通过标准重组DNA技术生成了不同的双特异性抗体,其中CEAscFab与ApomAb的重或轻链的C-端融合。
scFab的不同结构域的方向如下:VL-CL-VH-CH1。轻链恒定区(CL)的C-端通过34个氨基酸的肽接头与重链可变区(VH)的N-端连接。通过G4S连接头(2个氨基酸或4个氨基酸)进行scFab的融合。
生成了2种在基本形式不同的包含单链Fab的双特异性抗体:在一种形式中,2个scFab与ApomAb的重或轻链的C-端融合(双特异性,四价同源二聚体分子)。另一方面,构建了其中仅融合1个scFab至仅一个ApomAb重链C-端的双特异性分子(双特异性,三价异源二聚体分子)。通过使用所谓的杵臼技术获得此异源二聚化,其中使用仅允许形成异源IgG分子的Fc突变。
在图17中,显示了凋亡诱导实验的结果,其中将ApomAb_PR1A3_scFab与ApomAb或高度交联的ApomAb比较。在此测定中使用胃癌细胞系MKN-45并在24小时后使用DNA片段化测定测量凋亡。明显地,双特异性构建体展示了与用通过抗Fc抗体交联的ApomAb可观察到的相同范围的凋亡诱导活性,且所述活性显著高于用单独的ApomAb所观察到的。然而,ApomAb自身诱导的凋亡相当高,这最有可能是由于24小时的延长的孵育时间,这是在使用的MKN-45细胞系上显示最大凋亡诱导所必需的时间(与例如LS174T细胞相反,使用LS174T细胞的测定仅进行4小时)。
为了评估双特异性三价DR5激动型抗体(单价用于肿瘤靶CEA,和双价用于DR5)是否也能够诱导靶向肿瘤的凋亡,生成了下述分子,其中CEAscFab(sm3e特异性)与ApomAb重链(包含杵突变)的C-端融合。此重链与对应的包含“臼”突变的ApomAb重链和ApomAb轻链共表达。在图18中总结了4小时凋亡诱导测定的结果,其中在LS174T细胞上分析了双特异性三价分子(浓度为0.1和1.0μg/ml)。从这些结果显而易见的,描述的三价形式也能够诱导与高度交联的ApomAb诱导的凋亡在相同范围中的靶向凋亡。在较低的浓度上,双特异性形式甚至似乎比交联后的ApomAb活性更大。
实施例8:相比ApomAb,DR5-CEA双特异性激动型抗体具有更高的体内效力
为了评估已在体外证明的死亡受体激动型抗体的凋亡活性是够也具有高体内效力,建立了使用人结肠癌细胞系LS174T作为模型的体内实验。
简而言之,在实验的第1天,用3x106肿瘤细胞的脾内注射处理雌性SCID米色小鼠。在第7天,检测动物的肿瘤移植作为一天后开始用抗体处理的标准。处理由一系列3次注射组成(每次10mg/kg,静脉内注射,间隔7天)。每天分析动物以显示终止标准。
图19总结了在此体内实验中得到的结果。这里比较了3组小鼠(每组由初始的10只动物组成并用不同分子处理)的存活期。尽管对照组(PBS,黑色线)在肿瘤注射后37天全部终止,用ApomAb处理的组(实心圆圈)显示了延长的存活(最大44天)。用双特异性抗体(ApomAb_sm3e_A1,黑色方块)处理的组甚至比获得单独的ApomAb的组显示了更长的存活(52天)。对得到的数据的数学分析证明,这些结果在统计上是显著的(p值小于0.05),表明ApomAb相比PBS对照显示了体内效力,并且双特异性ApomAb_sm3e_A1证明了比ApomAb甚至更高的体内效力。
材料和方法:
HEK293EBNA细胞的转染
如下所述对重和轻链载体使用磷酸钙依赖的共转染程序在HEK293EBMA细胞中瞬时产生本文使用的所有(双特异性)抗体。
在37℃下在具有5%CO2大气的湿润的培养箱中在包含10%FCS(Gibco,#16000)的标准DMEM培养基(Invitrogen)中培养细胞。在转染前48小时,将3x107细胞接种在滚瓶(Falcon#353069,1400cm2)中的200mlDMEM/10%FCS中并在滚瓶培养箱(0.3rpm)中在37℃下培养。用于转染,用H2O将880μg总DNA(重和轻链载体各440μg)+4.4mlCaCl2填充至8.8ml的总体积。短暂混合此溶液。在混合后加入8.8ml1.5mM磷酸缓冲液(50mMHepes,280mMNaCl,1.5mMNaH2PO4;pH7.05)用于DNA沉淀。在另外混合10秒并在室温短暂孵育(20秒)后,对DNA溶液加入200mlDMEM/2%FCS。使用培养基/DNA溶液替换滚瓶中原来的培养基以转染细胞。在37℃下孵育48小时后,用200mlDMEM/10%FCS替换转染培养基并持续7天生产抗体。
在生产后收获上清并通过0.22μm无菌滤器过滤含有抗体的上清,并储存在4℃直至纯化。
纯化
通过在HEK293EBNA细胞中的瞬时表达产生蛋白质。使用标准程序,例如蛋白质A亲和纯化(Explorer)和大小排阻层析分两步纯化本文描述的所有双特异性分子。
将上清调节为pH8.0(使用2MTRISpH8.0)并应用于装在用缓冲液A(50mM磷酸钠,pH7.0,250mMNaCl)平衡的TricornTM5/50柱(GEHealthcare,柱体积(cv)=1ml)中的MabselectSure树脂(GEHealthcare)。在用10倍柱体积(cv)的缓冲液A,20cv的缓冲液B(50mM磷酸钠,pH7.0,1MNaCl)和再一次10cv的缓冲液A洗涤后,使用超过20cv的过渡至缓冲液B(50mM磷酸钠,50mM柠檬酸钠pH3.0,250mMNaCl)的pH梯度洗脱蛋白质。合并含有蛋白质的级分并将溶液pH缓慢调节至pH6.0(使用2MTRISpH8.0)。使用超速离心机(Vivaspin15R30.000MWCOHY,Sartorius)将样品浓缩至2ml,并随后应用于用20mM组氨酸,pH6.0,150mMNaCl平衡的HiLoadTM16/60SuperdexTM200制备级(GEHealthcare)。通过分析型大小排阻层析分析洗脱级分的聚集物含量。因此将50μl每个级分上样至用2mMMOPS,pH7.4,150mMNaCl,0.02%w/vNaN3平衡的SuperdexTM20010/300GL柱(GEHealthcare)。合并低于2%寡聚物的级分并使用超速离心机(Vivaspin15R30.000MWCOHY,Sartorius)浓缩至1-1.5mg/ml的终浓度。纯化的蛋白被冷冻在液氮中并储存在-80℃。
FACS结合分析
在进行凋亡测定前,分析了所有使用的靶细胞系的肿瘤相关抗原和FAS或DR5死亡受体的相对表达水平。
测定了细胞数和活力。为此,使用细胞分离缓冲液(Gibco-Invitrogen#13151-014)使粘附生长的细胞分离。通过离心(4分钟,400xg)收获细胞,用FACS缓冲液(PBS/0.1%BSA)洗涤并在FACS缓冲液中将细胞数调整为1.111X106细胞/ml。对96孔圆底板的每个孔使用180μl此细胞悬浮液,得到每孔2x105细胞。将细胞与适当稀释的第一抗体在4℃孵育30分钟。然后通过离心(4分钟,400xg)收获细胞,彻底去除上清并用150μlFACS缓冲液洗一次细胞。在150μlFACS缓冲液中重悬细胞,并在黑暗中与第二抗体(在使用无标记的第一抗体的情况下)在4℃孵育30分钟。在2个用FACS缓冲液洗涤的步骤后,在200μlFACS缓冲液重悬细胞并在HTSFACSCantoII(BD,软件FACSDiva)中分析。可选地,可用200μl在FACS缓冲液中的2%PFA(多聚甲醛)在4℃固定细胞20分钟并以后分析。所有测定一式三份进行。
使用的抗体和浓度:
Biacore分析(表面等离子共振,SPR)
在BiacoreT100上使用HBS-EP(0.01MHEPESpH7.4,0.15MNaCl,3mMEDTA,0.005%表面活性剂P20,GEHealthcare)作为运行缓冲液进行SPR实验。使用标准方法(GEHealthcare)在链霉抗生物素芯片上分别进行生物素化抗原的1220,740和300共振单位(RU)的直接连接。不同浓度的双特异性死亡受体激动型抗体在278K下以40μl/分钟的流速通过流动池90秒以记录结合相。监控300秒解离相并通过将样品溶液转换为HBS-EP触发。通过扣除从空的链霉抗生物素表面得到的响应修正总体折射率差异。使用BiacoreT100评估软件(vAA,Biacore,Freiburg/Germany)得到动力学常数,以通过数值积分拟合1∶1的Langmuir结合的速率方程。因为抗原是固定的,使用通过数值积分的1∶1的Langmuir结合仅给出表观KD值或亲合力。
凋亡的诱导
为了测定诱导的凋亡,使用来自Roche的细胞死亡检测ELISAPLUS试剂盒。简单地说,在200μl合适的培养基中在96孔板的每个孔中接种104细胞(分离后测定细胞数和存活)并在5%CO2大气中在37℃下过夜培养。第二天用包含合适浓度的凋亡诱导抗体、对照抗体和其他对照的新鲜培养基替换培养基:
以0.01-10μg/ml的终浓度使用双特异性抗体;以0.5μg/ml使用对照抗体和以100μg/ml使用交联抗体。使用100倍过量的竞争抗体。
在37℃,5%CO2下培养细胞4-24小时以允许凋亡的诱导。通过离心(10分钟,200xg)收获细胞,并在室温下在200μl裂解缓冲液(试剂盒提供的)中孵育1小时。通过离心(10分钟,200xg)沉淀完整的细胞,并根据制造商的建议分析20μl上清以检测凋亡的诱导。
尽管目前显示和描述了本发明的优选实施方案,应当明确地理解,本发明不受限于优选实施方案,并可在以下的权利要求书的范围内被另外不同的实施和实践。
Claims (19)
1.二聚双特异性抗体,其包含含有特异性针对死亡受体5多肽(DR5)的第一抗原结合位点的第一抗体和含有特异性针对成纤维细胞活化蛋白(FAP)的第二抗原结合位点的第二抗体,其中所述二聚双特异性抗体是对于DR5二价的。
2.权利要求1的双特异性抗体,其中所述第一和第二抗体包含抗体重链的Fc部分,其中所述第一抗体的Fc部分包含第一种二聚化模块,所述第二抗体的Fc部分包含允许两种抗体的异源二聚化的第二种二聚化模块。
3.权利要求2的双特异性抗体,其中根据杵臼结构策略,所述第一种二聚化模块包含杵,所述第二种二聚化模块包含臼。
4.权利要求1的双特异性抗体,其中所述第一抗体是包含轻链和重链的免疫球蛋白Ig分子,所述第二抗体选自scFv,scFab,Fab或Fv。
5.权利要求4的双特异性抗体,其中所述第二抗体与Ig分子重链的N-或C-端融合。
6.权利要求4的双特异性抗体,其中所述第二抗体与Ig分子轻链的N-或C-端融合。
7.权利要求4-6的任一项的双特异性抗体,其中所述第二抗体通过肽接头与Ig分子融合。
8.权利要求7的双特异性抗体,其中所述肽接头为具有10-30个氨基酸长度的肽接头。
9.权利要求4-6和8的任一项的双特异性抗体,其中所述第二抗体包含另外的半胱氨酸残基以形成二硫键。
10.权利要求7的双特异性抗体,其中所述第二抗体包含另外的半胱氨酸残基以形成二硫键。
11.权利要求4-6、8和10的任一项的双特异性抗体,其中所述Ig分子包含Fc变体,所述Fc变体相比野生型Fc区具有对Fcγ受体的降低的亲和力。
12.权利要求7的双特异性抗体,其中所述Ig分子包含Fc变体,所述Fc变体相比野生型Fc区具有对Fcγ受体的降低的亲和力。
13.权利要求9的双特异性抗体,其中所述Ig分子包含Fc变体,所述Fc变体相比野生型Fc区具有对Fcγ受体的降低的亲和力。
14.权利要求4-6、8、10、12和13的任一项的双特异性抗体,其中所述Ig分子是IgG。
15.权利要求7的双特异性抗体,其中所述Ig分子是IgG。
16.权利要求9的双特异性抗体,其中所述Ig分子是IgG。
17.权利要求11的双特异性抗体,其中所述Ig分子是IgG。
18.药物组合物,其包含权利要求1-17的任一项的双特异性抗体。
19.权利要求1-17的任一项的双特异性抗体的用于制备药物的用途,所述药物用于治疗癌症。
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