ES2505269T3

ES2505269T3 - Anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte

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Publication number: ES2505269T3
Application number: ES10757604.3T
Authority: ES
Inventors: Peter Bruenker; Claudia Ferrara Koller; Sandra Grau; Sylvia Herter; Christoph Lampert; Ekkehard Moessner; Pablo Umana; Inja Waldhauer
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2010-09-27
Publication date: 2014-10-09
Anticipated expiration: 2030-09-27
Also published as: WO2011039126A1; SI2483310T1; EP2483310B1; MX2012003598A; PL2483310T3; US9481730B2; PT2483310E; KR20120056857A; JP2013505732A; CA2773515A1; HK1169132A1; CY1115639T1; KR101508043B1; CN102574921B; DK2483310T3; BR112012006326A2; IL218437A0; JP5695059B2; US20120184718A1; AU2010303142A1

Abstract

Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno específico para DR5 y un segundo sitio de unión al antígeno específico para FAP.

Description

Anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión al antígeno específico para un receptor de muerte y un segundo sitio de unión al antígeno específico para un segundo antígeno, los métodos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos, y usos de los mismos.

Se ha probado que los anticuerpos monoclonales son agentes terapéuticos potentes en el tratamiento del cáncer debido a la dirección selectiva contra antígenos que se expresan diferencialmente en las células cancerosas. Las estrategias terapéuticas de la mayoría de los anticuerpos monoclonales desarrollados actualmente incluyen la dirección hacia antígenos asociados a tumores para modificar la biología celular tumoral, inhibición de los receptores de factores de crecimiento, inhibición de la angiogénesis, inducción de apoptosis y citotoxicidad por medio de citotoxicidad celular por fijación del complemento, o dependiente de anticuerpo. Algunos anticuerpos se dirigen a los receptores del factor de crecimiento que son cruciales para la supervivencia de las células cancerosas, tales como el trastuzumab (Herceptin®) y cetuximab (Erbitux®). La dirección de anticuerpos monoclonales agonistas hacia los receptores de muerte TRAIL de las células cancerosas representa una nueva generación de terapia con anticuerpos monoclonales, ya que son capaces de inducir directamente apoptosis en las células diana. El uso de un anticuerpo monoclonal en vez de TRAIL contra los receptores de muerte puede ser ventajoso: TRAIL se dirige a múltiples receptores diana que incluyen receptores de muerte y receptores señuelo, por lo tanto hay un problema con la selectividad. Además, TRAIL tiene una semivida en la sangre mucho más corta comparada con la de los anticuerpos monoclonales, un factor que afecta la dosis y los parámetros de frecuencia de la dosificación. La semivida en la sangre tan corta de TRAIL necesitaría dosis grandes y frecuentes en comparación con los anticuerpos monoclonales. Además es muy difícil y tedioso de producir un TRAIL recombinante.

Michaelson J.S. y col. (mAbs, Vol 1, Punto 2, p: 128 - 141; Marzo/Abril 2009) describen anticuerpos biespecíficos similares a IgG modificados dirigidos contra dos miembros de la familia del receptor TNF, a saber el TRAIL-R2 (Ligando del receptor que induce apoptosis relacionado con el TNF-2) y LTR (Receptor beta-linfotoxina).

Herrmann T. y col. (Cancer Res 2008; 68: (4); p: 1221 - 1227) describen moléculas Fab combinadas químicamente monovalentes biespecíficas dirigidas contra el receptor celular de superficie CD95/Fas/Apo-1 y tres antígenos de células de glioblastoma: NG2, EGFR y CD40.

El documento WO2005/092927 A1 desvela un anticuerpo biespecífico que se dirige contra TRAIL-R2 (DR5) y LTR un miembro de la familia del TNF. El documento US 5.965.710 desvela anticuerpos monoclonales que se dirigen al epítopo PR1A3 del antígeno carcino-embrionario (CEA).

La presente invención se refiere a anticuerpos que combinan un sitio de unión al antígeno que se dirige al receptor de muerte con un segundo sitio de unión al antígeno que se dirige a un segundo antígeno. Por lo que los receptores de muerte se entrecruzan y se induce apoptosis de la célula diana. La ventaja de estos anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte sobre los anticuerpos convencionales que se dirigen al receptor de muerte es la especificidad de inducción de apoptosis solamente en el sitio donde se expresa el segundo antígeno.

En un primer objetivo, la presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno específico para DR5 y un segundo sitio de unión al antígeno específico para FAP.

En una realización preferida del anticuerpo biespecífico, el receptor de muerte es el receptor de muerte polipéptido 5 (DR5), preferentemente el polipéptido DR5 humano (Sec. Id. Nº 2).

La presente divulgación se refiere también a un anticuerpo biespecífico, en el que el segundo antígeno se selecciona de entre, polipéptido antígeno carcinoembrionario (CEA), proteína CRIPTO, polipéptido homólogo de rotonda mágica 4 (ROBO4), polipéptido proteoglicano de sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP), polipéptido tenascina C y polipéptido de la proteína de activación del fibroblasto (FAP), preferentemente el polipéptido CEA humano (Sec. Id. Nº 4), polipéptido CRIPTO humano (Sec. Id. Nº 5), polipéptido ROBO4 humano (Sec. Id. Nº 6), polipéptido MCSP humano (Sec. Id. Nº 7), polipéptido tenascina C humano (Sec. Id. Nº 8) y polipéptido FAP humano (Sec. Id. Nº 9).

En una realización preferida más del anticuerpo biespecífico, el anticuerpo biespecífico es una molécula dimérica que comprende un primer anticuerpo que comprende el primer sitio de unión al antígeno y un segundo anticuerpo que comprende un segundo sitio de unión al antígeno.

En una realización preferida del anticuerpo biespecífico dimérico de la presente invención, el primer y segundo anticuerpos comprenden una parte Fc de una cadena pesada de anticuerpo, en el que la parte Fc del primer anticuerpo comprende un primer módulo de dimerización y la parte Fc del segundo anticuerpo comprende un segundo módulo de dimerización que permiten la heterodimerización de los dos anticuerpos.

En una realización preferida más del anticuerpo biespecífico dimérico, el primer módulo de dimerización comprende protuberancias y el segundo módulo de dimerización comprende huecos según la estrategia botón en ojal (véase Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volumen 2, Número 1, Febrero 1996, pp. 73-73(1)).

En una realización más del anticuerpo biespecífico dimérico, el primer anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina (Ig) que comprende una cadena ligera y una cadena pesada y el segundo anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en scFv, scFab, Fab o Fv.

En una realización preferida más el anticuerpo biespecífico comprende una parte Fc modificada que tiene una afinidad de unión reducida para los receptores Fc comparada con la parte Fc de tipo silvestre, por ejemplo una modificación LALA.

En una realización preferida aún más del anticuerpo biespecífico dimérico, la molécula de Ig comprende el primer sitio de unión al antígeno específico para DR5 y el segundo anticuerpo comprende el segundo sitio de unión al antígeno específico para FAP.

En una realización preferida más del anticuerpo biespecífico, la molécula de Ig comprende el segundo sitio de unión al antígeno específico para y el segundo anticuerpo comprende el sitio de unión al antígeno específico para DR5.

En una realización preferida más del anticuerpo biespecífico dimérico, el segundo anticuerpo se fusiona en el extremo N o C de la cadena pesada de la molécula de Ig.

En una realización preferida más del anticuerpo biespecífico dimérico, el segundo anticuerpo se fusiona en el extremo N o C de la cadena ligera de la molécula de Ig.

En otra realización preferida del anticuerpo biespecífico dimérico, la molécula de Ig es una IgG. En una realización preferida más del anticuerpo biespecífico dimérico, la segunda molécula se fusiona a la molécula de Ig por un péptido enlazador, preferentemente un péptido enlazador que tiene una longitud de aproximadamente 10 – 30 aminoácidos.

En una realización preferida más del anticuerpo biespecífico dimérico, el segundo anticuerpo comprende restos adicionales de cisteína para formar enlaces disulfuro.

Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son al menos bivalentes y pueden ser trivalentes o multivalentes, por ejemplo, tetravalentes o hexavalentes.

En un segundo objetivo, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de la presente invención.

En un tercer objetivo, la presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico de la presente invención para el tratamiento del cáncer.

En más objetivos, la presente divulgación se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una cadena pesada de un anticuerpo biespecífico de la presente invención, un vector de expresión que comprende dicha secuencia de ácido nucleico y una célula huésped procariota o eucariota que comprende dicho vector.

Descripción detallada de la invención

El término “polipéptido” se utiliza en el presente documento para referirse a secuencias nativas de aminoácidos y variantes de la secuencia de los polipéptidos de la presente invención es decir, DR4, DR5, FAS, CEA, CRIPTO, ROBO4, MCSP, Tenascina C y FAP de cualquier animal, por ejemplo especies de mamíferos, incluyendo seres humanos.

“Polipéptido nativo” se refiere a un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido de origen natural independientemente de su modo de preparación. La expresión “polipéptido nativo” engloba específicamente formas truncadas o segregadas de origen natural, formas variantes de origen natural (por ejemplo formas empalmadas alternativamente), y variantes alélicas de origen natural de los polipéptidos de la presente invención. Las secuencias de aminoácidos del Listado de Secuencias (Sec. Id. Nº 1-9) se refieren a secuencias nativas humanas de las proteínas de la presente invención.

La expresión “variante de polipéptido” se refiere a variantes de la secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa que contiene una o más sustituciones y/o eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos de la secuencia nativa. Las variantes de la secuencia de aminoácidos generalmente tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 75%, preferentemente al menos aproximadamente un 80%, más preferentemente al menos aproximadamente un 85%, aún más preferentemente al menos aproximadamente un 90%, más preferentemente al

menos aproximadamente un 95% con la secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa de un polipéptido de la presente invención.

El término “anticuerpo” engloba varias formas de estructuras de anticuerpo incluyendo pero sin limitarse a estos, anticuerpo completos y fragmentos de anticuerpo. El anticuerpo de acuerdo con la invención es preferentemente un anticuerpo completo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo modificado genéticamente siempre y cuando mantenga las propiedades características de acuerdo con la invención.

“Fragmentos de anticuerpo” comprende una parte de un anticuerpo de longitud completa, preferentemente el dominio variable del mismo, o al menos el sitio de unión al antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, moléculas de anticuerpo monocatenario, y anticuerpo multiespecífico formadas a partir de fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos scFv están descritos, por ejemplo, en Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos de una cadena que tienen características de un dominio VH, concretamente que es capaz de ensamblarse junto con un dominio VL, o de un dominio VL, concretamente que es capaz de ensamblarse junto con un dominio VH a un sitio de unión al antígeno funcional y que por lo tanto proporciona la propiedad de unión al antígeno de los anticuerpos de longitud completa.

Las expresiones “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” como se utiliza en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición de aminoácidos.

La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir, una región de unión, de una fuente o especie y al menos una parte de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, normalmente preparado por técnicas de ADN recombinante. Se prefieren los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana. Otras formas preferidas de “anticuerpos quiméricos” englobadas por la presente invención son aquellas en las que se ha modificado o se ha cambiado la región constante del anticuerpo original para generar propiedades de acuerdo con la invención, especialmente respecto a la unión a C1q y/o la unión al receptor Fc (FcR). Tales anticuerpos quiméricos también se refieren a “anticuerpos con cambio de clase”. Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulinas y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulinas. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y transfección genética que son bien conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Morrison, S.L., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81 (1984) 6851-6855; Patente de EE. UU. Nos 5.202.238 y 5.204.244.

La expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a anticuerpos en los que el armazón, o las “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) se han modificado para comprender la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente en comparación con la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferida, se injerta una CDR murina en una región de armazón de un anticuerpo humano para preparar un “anticuerpo humanizado”. Véase por ejemplo, Riechmann, L., y col., Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M.S., y col., Nature 314 (1985) 268-270. Las CDR particularmente preferidas son las que se corresponden con las secuencias representativas que reconocen los antígenos señalados anteriormente para los anticuerpos quiméricos. Otras formas de “anticuerpos humanizados” englobados por la presente invención son en los que la región constante del anticuerpo original se ha modificado o cambiado adicionalmente para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente respecto a la unión con C1q y/o la unión con el receptor Fc (FcR).

La expresión “anticuerpo humano”, como se utiliza en el presente documento, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos se conocen bien en el estado de la técnica (van Dijk, M.A., y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, en la inmunización de producir un repertorio completo de una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. La transferencia de la matriz genética de la línea germinal de inmunoglobulina humana en tal línea germinal de ratones mutantes dará como resultado la producción de anticuerpos humanos frente al desafío antigénico (véase, por ejemplo, Jakobovits, A., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., y col., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., y col., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en bibliotecas de fagos de presentación (Hoogenboom, H.R., y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., y col., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Cole y col. y Boerner y col. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan

R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P., y col., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Como se ha mencionado ya para los anticuerpos quiméricos y humanizados de acuerdo con la presente invención, la expresión “anticuerpo humano” como se usa en el presente documento también comprende tales anticuerpos que se han modificado en la región constante para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente con respecto a la unión con C1q y/o la unión con FcR, por ejemplo, por “cambio de clase”, es decir por cambio o mutación de partes Fc (por ejemplo de IgG1 a IgG4 y/o mutación IgG1/IgG4).

La expresión “anticuerpo recombinante humano”, como se utiliza en el presente documento, se pretende que incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados de una célula huésped tal como las células NS0 o CHO o de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Tales anticuerpos recombinantes humanos tienen regiones variables y constantes de forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos de acuerdo con la invención se han sometido a hipermutación somática in vivo. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias, que aunque derivan y están relacionadas con las secuencias de la línea germinal de VH y VL, pueden no existir naturalmente en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

El “dominio variable” (dominio variable de cadena ligera (VL), dominio variable de cadena pesada (VH)) como se utiliza en el presente documento denota cada una de las parejas de dominios de cadena ligera y pesada que están implicados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) cuyas secuencias están conservadas ampliamente, se conectan por medio de tres “regiones hipervariables” (o regiones determinantes de complementariedad, CDR). Las regiones marco conservadas adoptan una conformación de hojas  y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura en hojas . Las CDR de cada cadena mantienen su estructura tridimensional por las regiones marco conservadas y forman junto con las CDR de la otra cadena el sitio de unión al antígeno. Las regiones CDR3 de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo tienen un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos de acuerdo con la invención y por lo tanto proporcionan un objetivo más de la invención.

La expresión “sitio de unión al antígeno de un anticuerpo” cuando se utiliza en el presente documento se refiere a los restos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La parte de unión al antígeno de un anticuerpo comprende restos de aminoácidos de las “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”. Regiones “marco conservadas” o “FR” son las regiones del dominio variable distintas de los restos de la región hipervariable como se han definido en el presente documento. Por lo tanto los dominios variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo comprenden del extremo N al C los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. Especialmente la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión al antígeno y define las propiedades del anticuerpo. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición de referencia de Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) y/o los restos de un “bucle hipervariable”.

La especificidad de anticuerpos se refiere al reconocimiento selectivo por el anticuerpo de un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos. “Anticuerpos biespecíficos” de acuerdo con la invención son anticuerpos que tienen dos especificidades de unión al antígeno. Los anticuerpos de la presente invención son específicos de dos antígenos, es decir el antígeno receptor de muerte y un segundo antígeno.

El término anticuerpo “monoespecífico” como se utiliza en el presente documento denota un anticuerpo que tiene uno o más sitios de unión cada uno de los cuales se une al mismo epítopo del mismo antígeno.

El término anticuerpo “biespecífico” como se utiliza en el presente documento denota un anticuerpo que tiene al menos dos sitios de unión cada uno de los cuales se une al diferentes epítopos del mismo antígeno o de un antígeno diferente.

El sufijo “valente” como se utiliza con la presente solicitud denota la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Como tales, los términos “bivalente”, “tetravalente” y “hexavalente” denotan la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión, y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de anticuerpo Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son al menos “bivalentes” y pueden ser “trivalentes” o “multivalentes” (por ejemplo, “tetravalente” o “hexavalente”).

Los anticuerpos de la presente invención tienen dos o más sitios de unión y son biespecíficos. Es decir, los anticuerpos pueden ser biespecíficos incluso en los casos en los que tienen más de dos sitios de unión (es decir, que el anticuerpo es trivalente o multivalente). Los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos de cadena simple multivalentes, diacuerpos o triacuerpos, así como anticuerpos que tienen la estructura del dominio constante de los anticuerpos de longitud completa a la que se unen los sitios de unión al antígeno (por ejemplo, Fv de cadena sencilla, un dominio VH y/o un dominio VL, Fab, o F(ab)2) por medio de uno o más péptidos enlazadores. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa de una especie, o pueden ser quimerizados o humanizados.

Un “fragmento Fab de cadena sencilla” es un polipéptido que consiste en un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH), un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL), un dominio constante de cadena ligera (CL) y un enlazador, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho enlazador están ordenados en una de las siguientes maneras en dirección del extremo N al extremo C:

a) VH-CH1-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CH1, c) VH-CL-enlazador-VL-CH1 o d) VL-CH1-enlazador-VH-CL; donde dicho enlazador es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos, preferentemente entre 32 y 50 aminoácidos. Dichos fragmentos Fab de cadena sencilla a) VH-CH1-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CH1, c) VH-CL-enlazador-VL-CH1 y d) VL-CH1-enlazador-VH-CL. se estabilizan por medio de enlaces disulfuro entre el dominio CL y el dominio CH1. Además estas moléculas Fab de cadena sencilla pueden estabilizarse más por la generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de inserción de restos de cisteína (por ejemplo, en la posición 44 en la cadena pesada variable y en la posición 100 en la cadena ligera variable según la numeración de Kabat). La expresión “extremo N” denota el último aminoácido del extremo N. La expresión “extremo C” denota el último aminoácido del extremo C.

Las expresiones “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico”, como se utilizan en el presente documento, se pretende que incluya moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de doble cadena, pero preferentemente es un ADN de doble cadena.

El término “aminoácido” como se utiliza en esta solicitud denota el grupo de carboxi -aminoácidos que comprende alanina (código e tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, N), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y), y valina (val, V).

Un ácido nucleico está “unido operativamente” cuando se sitúa en relación funcional con otro ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o director secretor está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si se posiciona de forma que facilita la traducción. Generalmente, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que se unen son co-lineales, y, en el caso de un director secretor, contiguas en la fase de lectura. Sin embargo los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se consigue por unión en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se utilizan adaptadores sintéticos oligonucleótidos o enlazadores según la práctica convencional.

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “célula”, “línea celular”, y “cultivo celular” se utilizan de manera intercambiable y todas tales denominaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras “transfectantes” y “células transfectantes” incluyen el sujeto celular primario y los cultivos derivados del mismo independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no tendrá precisamente el mismo contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluyen las variantes de la progenie que pueden tener la misma función o actividad biológica que la seleccionada en la célula transfectada originalmente.

Como se utiliza en el presente documento, el término “unión” o “unido específicamente” se refiere a la unión del anticuerpo con un epítopo del antígeno en un ensayo in vitro, preferentemente un ensayo de resonancia de plasmones superficiales (SPR, BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suecia). La afinidad de unión se define en términos de ka (tasa constante de asociación del anticuerpo a partir del complejo antígeno/anticuerpo), kD (constante de disociación, y KD (kD/ka). Unión o unión específica significa una afinidad de unión (KD) de 10-8 mol/l o menos, preferentemente 10-9 a 10-13 mol/l.

La unión del anticuerpo al receptor de muerte se puede investigar por el ensayo BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suecia). La afinidad de unión se define por los términos ka (tasa de constante de asociación del anticuerpo a partir del complejo antígeno/anticuerpo), kD (constante de disociación), y KD (kD/ka).

El término “epítopo” incluye cualquier polipéptido determinante capaz de unión específica a un anticuerpo. En ciertas realizaciones, epítopo determinante incluye agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilo, o sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, puede tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que se une a un anticuerpo.

La “parte Fc” de un anticuerpo no está implicada directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero desempeña varias funciones efectoras. Una “parte Fc de un anticuerpo” es una expresión bien conocida por los expertos en la técnica y se define basándose en la escisión de los anticuerpos por la papaína. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1, e IgA2. De acuerdo con las regiones constantes de cadena pesada las clases diferentes de inmunoglobulinas se llaman , , , , y  respectivamente. La parte Fc de un anticuerpo está directamente implicada en la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) y CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) que se basa en la activación del complemento, la unión con C1q y la unión al receptor Fc. La activación del complemento (CDC) se inicia por la unión del factor complemento C1q a la parte Fc de la mayoría de las subclases de anticuerpo IgG. Aunque la influencia de un anticuerpo en el sistema del complemento depende de ciertas condiciones, la unión a C1q se produce por sitios definidos de unión en la parte Fc.

Tales sitios de unión se conocen en el estado de la técnica y están descritos por ejemplo, en Boakle y col., Nature 282 (1975) 742-743, Lukas y col., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse y Cebra, Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton y col., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen y col., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie y col., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184, Hezareh y col., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan y col., Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0307434. Tales sitios de unión son por ejemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat, véase posteriormente). Los anticuerpos de las subclases IgG1, IgG2 e IgG3 muestran normalmente activación del complemento y unión con C1q y C3, mientras que IgG4 no activa el sistema de complemento y no se une a C1q y C3.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se producen por medios recombinantes. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de acuerdo con la invención y un aspecto más es una célula que comprende dicho ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invención. Los métodos para la producción recombinante son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con el posterior aislamiento del anticuerpo y normalmente la purificación a una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de anticuerpos como se ha mencionado anteriormente en una célula huésped, los ácidos nucleicos que codifican las respectivas cadenas pesada y ligera se insertan en vectores de expresión por métodos de referencia. La expresión se lleva a cabo en células huésped procariotas o eucariotas como las células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293 (incluyendo las HEK293 EBNA), células COS, células PER.C6, levaduras, o células E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (sobrenadante o células después de su lisis). Los métodos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica y se han descrito, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., y col., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se separan adecuadamente del medio de cultivo por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharosa, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. El ADN y ARN que codifican los anticuerpos monoclonales se aíslan y se secuencian fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como una fuente de tales ADN y ARN. Una vez que se aísla, el ADN se puede insertar en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células huésped tales como células HEK293, células CHO, o células de mieloma que no producen proteínas inmunoglobulinas de otra manera, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped.

Las variantes de secuencias de aminoácidos (o mutantes) del anticuerpo de acuerdo con la invención se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o por síntesis de nucleótidos. Tales modificaciones se pueden llevar a cabo, sin embargo, solamente en un intervalo muy limitado, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características del anticuerpo mencionadas anteriormente tales como el isotipo de IgG y la unión al antígeno, pero puede mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad proteica o facilitar la purificación.

La expresión “célula huésped” como se utiliza en la presente solicitud denota cualquier clase de sistema celular que se puede modificar para para generar anticuerpos de acuerdo con la presente invención. En una realización se utilizan células HEK293 y células CHO como células huésped. Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “célula”, “línea celular”, y “cultivo celular” se utilizan de manera intercambiable y todas tales denominaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras “transfectantes” y “células transfectantes” incluyen el sujeto celular primario y los cultivos derivados del mismo independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no tendrá precisamente el mismo contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluyen las variantes de la progenie que pueden tener la misma función

o actividad biológica que la seleccionada en la célula transfectada originalmente.

La expresión en las células NS0 se describe, por ejemplo, en Barnes, L.M., y col., Cytotechnology 32 (2000) 109123; Barnes, L.M., y col., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria se describe, por ejemplo, en Durocher, Y., y col., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. La clonación de dominios variables se describe en Orlandi, R., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 42854289; y Norderhaug, L., y col., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Un sistema de expresión transitoria preferido (HEK293) se describe en Schlaeger, E.-J., y Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 y en Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

Las secuencias de elementos reguladores que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de poliadenilación.

La purificación de anticuerpos se lleva a cabo con el fin de eliminar componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, por técnicas de referencia, incluyendo el tratamiento alcalino/SDS, bandeo CsCI , cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa, y otras bien conocidas en la técnica. Véase Ausubel, F., y col., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley

Interscience, New York (1987). Se han establecido diferentes métodos y se han utilizado ampliamente para purificación proteica, tales como cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G), cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo de intercambio catiónico (resinas carboximetilo), intercambio aniónico (resinas aminoetilo) y de intercambio en modo mixto), adsorción tiofílica (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH), cromatografía de interacción hidrofóbica o adsorción aromática (por ejemplo, con fenil-sepharosa, resinas aza-arenofílicas, o ácido m-aminofenilborónico), cromatografía de afinidad de metales quelados (por ejemplo, con material de afinidad Ni(II) y Cu(II)), cromatografía de exclusión por tamaño, y métodos electroforéticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A. Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

Como se utiliza en el presente documento, “vehículo farmacéutico” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de absorción retardada e isotónicos, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, medular, o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión)

Una composición de la presente invención se puede administrar por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará un experto, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención por ciertas vías de administración, puede ser necesario revestir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones salinas tampón y acuosas. Los vehículos farmacéuticos incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conocen en la técnica.

Las frases “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral” como se utilizan en el presente documento significan modos de administración distintos de la administración enteral y la administración tópica, normalmente por inyección, e incluyen, sin limitación, la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intramedular, epidural, e intraesternal.

El término cáncer como se utiliza en el presente documento se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL), cáncer de pulmón de células bronquioalveolares, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de las glándulas adrenales, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer de riñón o uréteres, carcinoma celular renal, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumor del eje medular, glioma del tallo cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenomas pituitarios y sarcoma de Ewing, incluyendo las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los canceres anteriores.

Estas composiciones pueden contener también adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se asegura por los procedimientos de esterilización, mencionados anteriormente, y por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico, y similares en las composiciones. Además, se puede conseguir la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable incluyendo agentes que retrasan la absorción tales como el monoestearato de aluminio y gelatina.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que se pueden utilizar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables según los métodos convencionales conocidas por los expertos en la técnica.

Los niveles actuales de dosificación de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar de forma que se obtenga una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares empleadas en la presente invención, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se va a

emplear, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado físico, el estado general de salud y la historia médica previa del paciente que se va a tratar, y factores similares bien conocidos en la técnica médica.

La composición debe estar estéril y fluida para que la composición se pueda suministrar con una jeringa. Además del agua, el vehículo preferentemente es una solución salina tamponada.

Se puede mantener una fluidez adecuada, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño adecuado de partícula en el caso de una dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro sódico.

El término “transformación” como se utiliza en el presente documento se refiere al proceso de transferencia de unos vectores/ácido nucleico en una célula huésped. Si se utilizan células sin paredes celulares que representen una barrera importante como células huésped, la transfección se lleva a cabo, por ejemplo, por el método de precipitación en fosfato cálcico como se describe en Graham y Van der Eh, Virology 52 (1978) 546 y sig. Sin embargo, se pueden utilizar también otros métodos para introducir ADN en las células tales como inyección nuclear

o por fusión de protoplastos. Si se utilizan células procariotas o células que tengan una pared celular importante, un método de transformación es por ejemplo, el tratamiento con calcio utilizando cloruro cálcico como se describe en Cohen, F. N, y col, PNAS. 69 (1972) 7110 y sig.

Como se utiliza en el presente documento, “expresión” se refiere al proceso por el que se transcribe un ácido nucleico en ARNm y/o el proceso por el que el ARNm transcrito (también designado como transcripción) se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos, o proteínas. Las transcripciones y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente productos genéticos. Si el polinucleótido se deriva de ADN genómico, la expresión en células eucariotas pueden incluir el corte y empalme del ARNm.

Un “vector” es una molécula de ácido nucleico, en particular auto replicante, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada en y/o entre células huésped. El término incluye vectores que funcionan primariamente por inserción de ADN o ARN en una célula (por ejemplo, por integración cromosómica), replicación de vectores que funcionan primariamente por la replicación del ADN o ARN, y vectores de expresión que funcionan por transcripción y/o traducción de ADN o ARN. También se incluyen vectores que proporcionan más de una de las funciones que se han descrito.

Un “vector de expresión” es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula huésped adecuada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Un “sistema de expresión” normalmente se refiere a una célula huésped adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar para producir un producto de expresión deseado.

Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar al entendimiento de la presente invención, cuyo ámbito real se expone en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que se pueden hacer modificaciones en los procedimientos expuestos sin alejarse del espíritu de la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Análisis de unión FACS de los niveles de expresión de CEA, DR5, y FAS en diferentes líneas celulares humanas (Lovo, OVCAR-3, AsPC-1, BxPC3, LS174T y MKN-45) utilizando anticuerpos IgG murinos no marcados disponibles comercialmente (CEA: Abcam nº 11330; DR5: R&D nº MAB631; FAS: BD nº 555671) y una IgG común de cabra anti-ratón, marcada con FITC (Serotec Star 105F) para la detección. Como muestras de control se utilizaron solamente células o células y anticuerpo secundario solo. Excepto para las células Lovo todas las líneas celulares ensayadas expresan cantidades significativas de DR5 y FAS en la superficie. Cuando se comparan con CEA la expresión era bastante baja. Cuando las mismas células se ensayaban con toros anticuerpos para los tres antígenos también fueron positivas las células Lovo en el análisis FACS en la expresión de DR5, FAS y CEA (datos no mostrados).

Figura 2: Análisis de inducción de apoptosis (ensayo de fragmentación de ADN) de diferentes líneas celulares tras 4 horas de incubación con anticuerpos disponibles comercialmente que son capaces de inducir apoptosis en solución sin entrecruzamiento (DR5: R&D nº MAB631; FAS: Millipore / Upstate: CH11). Para la detección de la apoptosis se utilizó el análisis de fragmentación de ADN asociado con histona con el kit ELISAPLUS de detección de muerte celular. En las células BxPC-3, Lovo y LS174T se podía inducir claramente la apoptosis por medio de DR5 y FAS, mientras que las células ASPC-1 no sufrieron apoptosis. Las células MKN-45 son más resistentes a DR5 en comparación con las otras líneas celulares.

Figura 3: Inducción de apoptosis (ensayo de fragmentación de ADN) de las células LS174T tras 4 horas de incubación con moléculas biespecíficas ApomAb (barra blanca), ApomAb entrecruzado con un anticuerpo Fc anti humano (barra gris, sombreada), ApomAb_sm3e_A (barra negra) y ApomAb_sm3e_A1 (barra gris punteada). Se

puede detectar la inducción de apoptosis dependiente de unión con CEA por híper-entrecruzamiento dirigido por medio de anticuerpos biespecíficos. Este efecto está en el mismo intervalo que la apoptosis inducida por entrecruzamiento de ApomAb y podría abolirse completamente por preincubación con una cantidad en exceso de IgG sm3e. No se observó apoptosis con los controles (solamente células o IgG sm3e) y tampoco se inducía apoptosis con el ApomAb solo a la concentración utilizada (1 g/ml).

Figura 4: Comparación de la actividad de inducción de apoptosis de diferentes moléculas biespecíficas ApomAb_sm3e con ApomAb solo (barra blanca) o ApomAb entrecruzado con un anticuerpo Fc humano (barra gris sombreada), en un ensayo de fragmentación de ADN con células LS174T incubadas durante 4 horas con agentes inductores de apoptosis. En general las moléculas en las que se fusionaba el scFv sm3e en el extremo C de la cadena pesada de ApomAb (formato A, barra negra) parecían ser más activas que las construcciones en las que se fusionaba el scFv sm3e en el extremo C de la cadena ligera de ApomAb (formato B, barra gris). Además, los anticuerpos biespecíficos que contenían scFv estabilizado por enlaces disulfuro (Formato A1, barra gris moteada y B1, barra cuadriculada) parecen ser ligeramente inferiores a las moléculas con el scFv tipo silvestre.

Figura 5: Análisis de inducción de apoptosis (ensayo de fragmentación de ADN) de las células LS174T tras 4 horas de incubación con o bien ApomAb (barras blancas), ApomAb que estaba entrecruzado con anticuerpo Fc antihumano (barras grises, sombreadas) o la construcción biespecífica ApomAb_PR1A3_A (barras negras). En cada caso la inducción de la apoptosis era dependiente de la concentración de anticuerpo utilizada. El ApomAb solo inducía bajos niveles de apoptosis a altas concentraciones pero aumentaba significativamente con el entrecruzamiento. La molécula biespecífica ApomAb_PR1A3_A era incluso más activa sin un agente de entrecruzamiento secundario de lo que era el ApomAb entrecruzado.

Figura 6: Análisis de inducción de apoptosis (ensayo de fragmentación de ADN) de células Lovo tras 4 horas de incubación con o bien ApomAb (barras blancas), ApomAb que estaba entrecruzado con anticuerpo Fc antihumano o construcción biespecífica ApomAb_PR1A3_A (barras negras). En cada caso la inducción de apoptosis dependía de la concentración del anticuerpo utilizado. El ApomAb solo inducía bajos niveles de apoptosis también a altas concentraciones (como se ha descrito) pero aumentaba significativamente con el entrecruzamiento. La molécula biespecífica ApomAb_PR1A3_A era tan activa por sí sola como el ApomAb entrecruzado.

Figura 7: Comparación de la fragmentación de ADN en células LS174T tras 4 horas de incubación con diferentes anticuerpos biespecíficos que inducen apoptosis. Las moléculas utilizadas eran moléculas biespecíficas ApomAb_PR1A3 en las que se ha fusionado scFv PR1A3 (tipo silvestre = A/B o estabilizado con enlaces disulfuro A1/B1) o bien al extremo C de la cadena pesada (A, barra gris sombreada) o a la cadena ligera (B, barra moteada). Aunque la posición de fusión del scFv no parece en este caso tener una diferencia en términos de inducción de apoptosis, el tipo de scFv utilizado es importante: utilizando el scFv estabilizado con enlaces disulfuro casi abolía completamente la inducción de apoptosis al compararse con las construcciones que contenían el scFv tipo silvestre fusionado al ApomAb (barras negra y gris, respectivamente). Debido a la baja afinidad de PR1A3 en comparación con sm3e la inducción de apoptosis total también era más baja con las moléculas biespecíficas que contenían PR1A3.

Figura 8: Análisis de unión FACS de construcciones biespecíficas ApomAb – CEA (PR1A3) en células MKN-45. Comparación de construcciones biespecíficas ApomAb_PR1A3 del tipo silvestre (A) o scFv estabilizado con enlaces disulfuro (A1). Ambas construcciones se unieron de manera dependiente de concentración a las células diana pero la molécula que contenía PR1A3 en el formato scFv tipo silvestre se une con una afinidad mucho más alta al antígeno que el scFv estabilizado con enlaces disulfuro.

Figura 9: Análisis de la expresión de superficie de CRIPTO, FAS y DR5 en células NCCIT y recombinantes, células HEK293 que expresan CRIPTO por experimentos de unión FACS. Las células NCCIT no expresan FAS, solamente pequeñas cantidades de CRIPTO pero expresan cantidades similares de DR5 al compararse con las células recombinantes HEK293-CRIPTO. Estas últimas células mostraban niveles bajos de expresión de FAS, niveles significativos de DR5 y niveles bastante altos de CRIPTO.

Figura 10: Comparación de inducción de apoptosis (fragmentación de ADN en células HEK293-CRIPTO) utilizando FAS (IgG HFE7A), FAS (IgG HFE7A) entrecruzada por medio de anticuerpo Fc antihumano y moléculas biespecíficas FAS-CRIPTO (HFE7A_LC020 H3L2D1, en las que se fusionaba el scFv CRIPTO de tipo silvestre (A) o estabilizado con enlaces disulfuro (A1) con el extremo C de la cadena pesada de HFE7A. La IgG FAS sola, la IgG CRIPTO sola y la molécula biespecífica FAS-MCSP no inducían apoptosis, aunque la FAS entrecruzada y las moléculas biespecíficas HFE7A-CRIPTO mostraban fragmentación de ADN tras 4 horas de incubación lo que también en parte se podía abolir con pre-incubación con un exceso de IgG anti CRIPTO.

Figura 11: Inducción de apoptosis (ensayo de fragmentación de ADN) por moléculas biespecíficas HFE7A-CRIPTO en células recombinantes HEK293-CRIPTO (barras negras) comparada con células HEK293-FAP (proteína activadora de fibroblastos) (barras blancas). En ambas líneas celulares se puede inducir apoptosis

utilizando un anticuerpo disponible comercialmente (CH11) y con IgG HFE7A que estaba entrecruzada por medio de un anticuerpo Fc específico secundario, mientras que HFE7A solo no induce apoptosis bajo las condiciones utilizadas. La inducción de apoptosis con la molécula biespecífica FAS-CRIPTO era más alta que con la IgG HFE7A entrecruzada pero no podía inhibirse completamente por pre-incubación con una IgG CRIPTO en exceso. En las células HEK293-FAP se podía observar una cierta apoptosis de fondo que tampoco se podía sacar de competición con IgG CRIPTO en exceso. Incluso una molécula de control negativo (en la cual se fusionó un scFv específico de MCSP estabilizado con enlaces disulfuro con el extremo C de la cadena pesada de HFE7A) mostraba un bajo grado de apoptosis en células HEK293-FAP.

Figura 12: Análisis de unión FACS para la determinación de niveles de expresión en superficie de MCSP sobre diferentes líneas celulares (MCF7, SkBr3, A431, A549, HCT-116 y U87-MG) utilizando 2 anticuerpos. Con ambos anticuerpos se podían detectar los mismos niveles de expresión de MCSP, indicando que U87-MG mostraba el nivel de expresión de MSCP más alto, HCT-116 tenía una baja expresión de MCSP mientras que las otras líneas celulares ensayadas eran negativas a MCSP (en el intervalo del control negativo tal como células sin teñir).

Figura 13: Evaluación de la capacidad de apoptosis de células U87-MG (A) y HCT-116 (B) que utilizan ApomAb entrecruzado (barras negras) y HFE7A (barras grises) y las moléculas de control relevantes (anti FAS_CH11, anti DR5_R2 y anti IgG-Fc sola). Aunque la apoptosis en células HCT-116 solamente podía inducirse por medio del receptor DR5 después de cuatro horas y no por medio de FAS, era diferente en las células U87-MG. Aquí, solo se podía observar una apoptosis significativa después de 24 horas. Al contrario que en las células HCT-116 la inducción de apoptosis en U87-MG por HFE7A entrecruzado era dos veces más eficaz que por ApomAb entrecruzado. Los anticuerpos de control que conferían apoptosis ya en solución eran incluso más eficaces.

Figura 14: Análisis de inducción de apoptosis en células U87-MG de glioma tras 24 horas de incubación con el anticuerpo biespecífico HFE7A-MCSP (mAb 9.2.27) en el que tanto la forma silvestre (formato A) o el scFv MCSP estabilizado con enlaces disulfuro (formato A1) está fusionado con el extremo C de la cadena pesada de ApomAb. En este caso la construcción que contenía el scFv estabilizado con enlaces disulfuro demostraba una apoptosis significativamente más alta que la molécula que contenía el scFv tipo silvestre (aunque la cantidad medida de apoptosis por fragmentación de ADN era relativamente baja). Sin embargo, en ambos casos la inducción de apoptosis se podía abolir completamente por pre-incubación de las células con un exceso de IgG MCSP en competición.

Figura 15: Análisis de unión FACS de dos líneas celulares diferentes (SW872 y GM05389) de los niveles de expresión de la proteína de activación de los fibroblastos humana (FAP) (A). Se muestra la intensidad de fluorescencia medida con diferentes concentraciones de un anticuerpo anti FAP sobre un intervalo de tres magnitudes (barras negras, grises y sombreadas). Las reacciones del control negativo como solamente anticuerpo secundario y células se muestran como barras punteadas y barras blancas, respectivamente. Aunque las células GM05389 demostraban expresión de FAP en todas las concentraciones de anticuerpo ensayadas, que estaba por encima de la de fondo, con las células SW872 la expresión de FAP solo se podía detectar con la concentración de anticuerpo utilizada más alta (10 g/ml), indicando que estas células no son adecuadas para experimentos basados en la inducción de apoptosis/unión de FAP. Además se demuestra que esta línea celular difícilmente sufre apoptosis mediada por ApomAb (B). El ApomAb solo u otro anticuerpo anti DR5 disponible comercialmente no inducía una fragmentación relevante de apoptosis. Solamente cuando ApomAb se entrecruzaba con un anticuerpo Fc antihumano se podía observar un bajo nivel detectable de apoptosis.

Figura 16: Análisis de inducción de apoptosis de GM05389 (barras blancas) y MDA-MB-231 (barras grises) solas comparado con la inducción de apoptosis en el co-cultivo de las dos líneas celulares (barras negras). En todas las líneas celulares el ApomAb solo tenía solamente un efecto mínimo, mientras que el ApomAb entrecruzado daba como resultado una inducción de apoptosis significativa en las células MDA-MB-231. La inducción de la fragmentación de ADN con construcciones biespecíficas agonistas del receptor de muerte (ApomAb-FAP) solamente se producía en altos niveles cuando ambas líneas celulares se co-cultivaban. Aquí el entrecruzamiento del ApomAb solo no aumentaba la apoptosis en el mismo intervalo, indicando que para la inducción de apoptosis óptima son necesarias dos líneas celulares: una que expresa el receptor de muerte y una segunda que expresa el antígeno FAP.

Figura 17: Resultados del ensayo de inducción de apoptosis (24 h) en células MKN-45 con moléculas de ApomAb_PR1A3_scFab biespecífico tetravalente en el que el scFab se fusiona con el extremo C de la cadena pesada de ApomAb (formato A). La inducción de apoptosis se compara con ApomAb (+/- entrecruzamiento con un exceso de anticuerpo Fc antihumano de 10 veces) y controles negativos. Todas las construcciones se utilizaron a concentraciones de 0,1 a 1,0 g/ml. Bajo las condiciones de ensayo utilizadas la construcción biespecífica ApomAb_PR1A3_scFab (barras negras) mostraba claramente una inducción de apoptosis dependiente de la concentración que está en el mismo intervalo que el que se observa con el ApomAb híperentrecruzado (barras grises) y que es significativamente más alto que con el ApomAb solo (barras sombreadas).

Figura 18: Análisis de inducción de apoptosis de células LS174T por ApomAb (solo, barras sombreadas o híperentrecruzado, barras grises) comparado con las construcciones biespecíficas trivalentes (ApomAb_sm3e_scFab;

2x1 valencias, barras negras) y controles negativos. El ensayo se llevó a cabo durante 4 horas utilizando las construcciones a concentraciones de 0,1 y 1,0 g/ml. La construcción biespecífica Apo-mAb_sm3e_scFab es capaz de inducir apoptosis de una manera dependiente de la dosis en el mismo intervalo que lo hacía el ApomAb híper-entrecruzado.

Figura 19: Análisis de la eficacia in vivo de ApomAb y el anticuerpo agonista ApomAb_sm3e_A1 comparado con el vehículo control en un modelo metastático intraesplénico utilizando la línea celular de carcinoma de colon humano LS174T. Se trataron grupos aleatorios de diez ratones bien con PBS (línea negra), con ApomAb (círculos negros) o anticuerpo biespecífico ApomAb_sm3e_A1 (cuadros negros). El porcentaje de supervivencia se representa frente al transcurso de tiempo del experimento.

Ejemplos

Ejemplo 1: Diseño de anticuerpo biespecíficos que reconocen el receptor de muerte 5 humano y CEA humano

A continuación se describen anticuerpos biespecíficos tetravalentes que comprenden un anticuerpo de longitud completa que se une a un primer antígeno (receptor de muerte humano, DR5) combinado con dos fragmentos Fv de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno (antígeno carcinoembrionario humano, CEA) fusionados por medio de un péptido enlazador con el extremo C bien de la cadena pesada o de la cadena ligera del anticuerpo de longitud completa. Los dominios de anticuerpo y el enlazador en dichas cadenas sencillas Fv tienen la siguiente orientación: VH-enlazador-VL.

Se utilizaron como cadenas pesada y ligera variables las secuencias de anticuerpo que reconocen el DR5 del anticuerpo ApomAb descrito por Adams en el documento US2007 / 0031414 A1.

Se utilizaron como secuencias scFv de cadenas pesada y ligera variables que se unen al antígeno CEA, PR1A3 (Bodmer y col., 1999; US5965710) y sm3e (Begent y col., 2003; US7232888 B2).

Por tecnología de síntesis genética y ADN recombinante se unieron las VH y VL de los correspondientes anticuerpos antiCEA por un enlazador glicina – serina (G4S)4 para generar Fv de cadena sencilla que se fusionaron por un conector (G4S)n (donde n = 2 o 4) al extremo C de la cadena pesada o ligera de la IgG1 ApomAb.

Además del tipo silvestre de scFv, se produjeron variantes que contenían restos de cisteína en la posición Kabat 44 de la cadena pesada variable y la posición Kabat 100 de la cadena ligera variable para generar puentes disulfuro entre VH y VL. Esto tenía la intención de estabilizar la molécula de scFv para minimizar la tendencia potencial de agregación.

Para prevenir el entrecruzamiento no específico de las moléculas biespecíficas, por ejemplo por medio de receptores F como el FcRIIIa humano, se cambiaron dos aminoácidos en la región Fc de la parte IgG de las moléculas biespecíficas. Por mutagénesis dirigida al sitio se intercambiaron los dos restos de leucina en las posiciones 234 y 235 de la región Fc por restos alanina. Se ha descrito que esta mutación denominada LALA impide la interacción Fc-FcR (Hessell y col., Nature 449 (2007), 101 y sig.).

Todas estas moléculas se expresaron recombinantemente, se produjeron y purificaron utilizando técnicas de purificación de anticuerpos de referencia incluyendo cromatografía de afinidad de proteína A seguida por cromatografía de exclusión por tamaño. Las moléculas se caracterizaron en términos de rendimiento de expresión, estabilidad y actividad biológica.

Un resumen de las moléculas de anticuerpo biespecífico agonistas del receptor de muerte que consisten en combinaciones de ApomAb – CEA se enumera en la tabla 1. La descripción del diseño de las diferentes moléculas se puede llegar a concebir por los nombres de la molécula, donde la primera parte caracteriza la IgG (por ejemplo el ApomAb) que se dirige al receptor de muerte, el segundo nombre describe la fuente del scFv (por ejemplo, PR1A3 o sm3e) que se dirige al CEA y la combinación de letra y número describe la posición de fusión y la estabilización con enlaces disulfuro propias del scFv.

Tabla 1: Descripción de los diferentes anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte que se dirigen a DR5 humano y CEA humano con sus características relevantes.

Nombre: IgG scFv (CEA) Posición de la fusión Enlazador Conector Estabilización con enlaces disulfuro

ApomAb-sm3e-A: ApomAb sm3e Extremo C de la cadena pesada (G4S)4 (G4S)2 no

ApomAb-sm3e-A1: ApomAb sm3e Extremo C de la cadena pesada (G4S)4 (G4S)2 Sí

ApomAb-sm3e-B: ApomAb sm3e Extremo C de la cadena ligera (G4S)4 (G4S)2 no

ApomAb-sm3e-B1: ApomAb sm3e Extremo C de la cadena ligera (G4S)4 (G4S)2 Sí

ApomAb-PR1A3-A: ApomAb PR1A3 Extremo C de la cadena pesada (G4S)4 (G4S)2 no

ApomAb-PR1A3-A1: ApomAb PR1A3 Extremo C de la cadena pesada (G4S)4 (G4S)2 Sí

ApomAb-PR1A3-B: ApomAb PR1A3 Extremo C de la cadena ligera (G4S)4 (G4S)2 no

ApomAb-PR1A3-B1: ApomAb PR1A3 Extremo C de la cadena ligera (G4S)4 (G4S)2 Sí

Ejemplo 2: Expresión y purificación de anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte

5 Se construyeron vectores de expresión por separado de las cadenas pesada y ligera de cada anticuerpo biespecífico. Estos vectores contenían un marcador de selección de procariota, elementos reguladores para la expresión genética en células de mamífero y un origen de replicación, oriP, del virus de Ebstein-Barr para la replicación autónoma de los plásmidos en células HEK293 que contenían EBNA. Los plásmidos se propagaron en E. coli, se amplificaron, se purificaron y se cotransfectaron en células HEK293 EBNA para expresión transitoria

10 utilizando precipitación mediada por fosfato Ca. Tras siete días se recolectaron los sobrenadantes del cultivo y se purificaron los anticuerpos por cromatografías de proteína A y exclusión por tamaño. Las moléculas purificadas se analizaron en cuanto a su homogeneidad, estabilidad e integridad por análisis de cromatografía de exclusión por tamaño (antes y después de una etapa de congelación-descongelación) y análisis SDS-PAGE (bajo condiciones de reducción y no reducción).

15 Tabla 2: Sumario de los rendimientos de la purificación y contenido en monómeros de diferentes anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte

Nombre: Rendimiento [mg /l] Concentración [mg/ml] Contenido en monómeros [%] Aumento de agregados tras la congelación

ApomAb-sm3e-A: 4,34 0,14 100,00 no

ApomAb-sm3e-A1: 4,38 1,25 100,00 no

ApomAb-sm3e-B: 3,18 1,27 100,00 no

ApomAb-sm3e-B1: 2,19 1,10 100,00 no

ApomAb-PR1A3-A: 5,83 0,22 98,48 Sí

ApomAb-PR1A3-A1: 5,62 0,20 100,00 no

ApomAb-PR1A3-B: 5,00 0,43 98,88 Sí

ApomAb-PR1A3-B1: 11,46 1,25 100,00 no

Todas las moléculas se podían producir y purificar en cantidades suficientes y con la calidad adecuada para posteriores caracterizaciones y ensayos. Los rendimientos tras la purificación estaban en el intervalo de aproximadamente 5 mg/l con algunas desviaciones en algunas moléculas. Por ejemplo el rendimiento de ApomAb

20 sm3e-B1 era significativamente menor (2,19 mg/l) mientras que la construcción correspondiente, ApomAb-PR1A3_B1 pudo purificarse en incluso más de 11 mg/l.

La determinación de formación de agregados tras la congelación/ descongelación y el aumento de la concentración de anticuerpo revelaba que, dependiendo de la molécula, la estabilización por medio de puentes disulfuro 25 intercatenarios podía tener efectos beneficiosos sobre la tendencia a formar agregados. En general la estabilización

con enlaces disulfuro daba mayores rendimientos en contenido de monómeros de las moléculas al menos a altas concentraciones (tabla 3).

Tabla 3: Formación de agregados de los anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte en correlación con la concentración de proteína

Construcción: Concentración [mg/ml] Contenido en monómeros [%]

0,22: 98,48

ApomAb-PR1A3-A: 1,73 90,90

3,30: 81,50

0,20: 100,00

ApomAb-PR1A3-A1: 1,50 100,00

3,37: 100,00

0,14: 100,00

ApomAb-sm3e-A: 1,11 95,00

2,74: 94,00

1,25: 100,00

ApomAb-sm3e-A1: 0,79 98,60

2,00: 97,10

La tendencia a formar agregados no solo depende de la estabilización con enlaces disulfuro del scFv sino también por el antígeno al que se une el scFv. En la tabla 3 se ve que es obvio que las moléculas ApomAb biespecíficas que contienen scFv PR1A3 sufren una agregación significativa con el aumento de concentración de proteína. A concentraciones de más de 3 mg/ml solo el 80% del material aparece como monómeros, mientras que tras la introducción de dos restos adicionales de cisteína (VH44/VL100 según la numeración Kabat) estas moléculas no formaban agregados en la concentración utilizada.

El grado de formación de agregados con moléculas de ApomAb biespecíficas que contenían scFv sm3e no es tan pronunciado ya que aquí el contenido de monómeros es aún alrededor del 94% sin y el 97% con la estabilización con enlaces disulfuro, respectivamente.

Ejemplo 3: Inducción de apoptosis por moléculas de anticuerpo biespecíficas DR5-CEA del receptor de muerte

El anticuerpo ApomAb agonista del receptor de muerte DR5 humano induce apoptosis de las células tumorales que expresan DR5 tales como las líneas celulares de cáncer de colon LS180 o Colo-205. In vitro, el ApomAb por sí mismo interviene en una apoptosis significativa que puede aumentar drásticamente por entrecruzamiento del ApomAb unido a DR5 con anticuerpos que se unen a la región Fc humana del ApomAb. Esta inducción de apoptosis también se traduce in vivo como se puede demostrar en diferentes modelos tumorales en los que el ApomAb muestra una eficacia significativa (Jin y col., 2008; Adams y col., 2008), más probablemente por acontecimientos de entrecruzamiento a través de los receptores Fc humanos. Para evaluar el potencial del entrecruzamiento en los anticuerpos biespecíficos DR5-CEA para dirigirlos al sitio tumoral con DR5 y la posterior inducción de apoptosis se analizó in vitro la actividad de moléculas de ApomAb biespecíficas CEA en términos de mediación de apoptosis.

Con el fin de determinar si las moléculas de anticuerpo biespecíficas DR5-CEA eran capaces de inducir apoptosis tumoral dependiente de unión al antígeno en las células diana, se analizó la fragmentación de ADN en las células tumorales tras la incubación con anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte como medida de la apoptosis, utilizando un ensayo ELISA de detección de muerte celular.

Para hacerse una idea de las líneas celulares que serían adecuadas para medir el cruzamiento de DR5 dependiente de la unión al antígeno que dé lugar a la inducción de apoptosis se analizaron varias líneas celulares tumorales en cuanto a la expresión de superficie de DR5, FAS y CEA.

Todas las líneas celulares diana se analizaron en cuanto a los niveles de expresión de antígenos relacionados con tumores y receptores de muerte FAS o DR5 antes de que se llevaran a cabo los ensayos de apoptosis de la siguiente manera.

Se determinó el número y viabilidad de las células. Para ello, se separaron las células en crecimiento adherente con un tampón de disociación celular (Gibco - Invitrogen nº 13151-014). La células se recolectaron por centrifugación (4 min, 400 x g), se lavaron con tampón FACS (PBS/0,1% BSA) y se ajustó el número de células a 1,111 x 106 células/ml en tampón FACS. Se utilizaron 180 l de esta suspensión celular por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo, que daba como resultado 2 x 105 células por pocillo. Las células se incubaron durante 30 min a 4 ºC con el primer anticuerpo a una dilución adecuada. Luego se recolectaron las células por centrifugación (4 min, 400 x g), se retiró completamente el sobrenadante y las células se lavaron una vez con 150 l de tampón FACS. Las células se resuspendieron en 150 l de tampón FACS y se incubaron con el anticuerpo secundario (en el caso de que se usara un anticuerpo primario sin marcar) durante 30 min a 4 ºC en oscuridad. Tras dos etapas de lavado con tampón FACS se resuspendieron las células en 200 l de tampón FACS y se analizaron en un HTS FACSCanto II (BD, Software FACS Diva). De manera alternativa las células se pueden fijar con 200 l de PFA (paraformaldehído) al 2% en tampón FACS durante 20 min a 4 ºC y se analiza más tarde. Todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.

En la figura 1 se muestran los resultados del análisis de unión FACS de diferentes líneas celulares con tres anticuerpos específicos que reconocen CEA, DR5 o FAS. Excepto en las células Lovo todas las otras líneas celulares expresan los antígenos ensayados a diferentes niveles. La expresión de CEA más alta se observaba en las células MKN-45 y más o menos similar en OVCAR-3, AsPC-1, BxPC-3 y LS174T. En términos de expresión de DR5 las células AsPC-1 y BxPC.3 expresaban el receptor más en comparación con las otras líneas celulares seguidas por OVCAR-3 y MKN-45 mientras que LS174T era la de menor expresión de DR5. Con respecto a la expresión de FAS las líneas celulares diferían pero todas mostraban una expresión significativa de FAS. Cuando las células Lovo eran negativas en este ensayo se analizaron más tarde con diferentes anticuerpos contra CEA, DR5 y FAS y también mostraron expresión significativa de los antígenos ensayados (datos no mostrados).

Para la determinación de la apoptosis inducida se utilizó el kit de Detección de Muerte Celular ELISA PLUS de Roche. En resumen, se sembraron 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos (después de separarlas, y de la determinación del número de células y la viabilidad) en 200 l de medio apropiado y se incubaron una noche a 37 ºC en una atmósfera con el 5% de CO2. Al día siguiente el medio se remplazó con medio recién preparado que contenía los anticuerpos que inducen apoptosis, los anticuerpos control y otros controles en concentraciones apropiadas:

Los anticuerpos biespecíficos se utilizaron en una concentración final de 0,01 – 10 g/ml; los anticuerpos control se utilizaron a 0,5 g/ml y se utilizaron anticuerpos entrecruzados a 100 g/ml. Los anticuerpos de competición se utilizaron a 100 veces de exceso.

Se incubaron las células de 4 – 24 horas a 37 ºC, 5% de CO2 para permitir la inducción de apoptosis. Las células se recolectaron por centrifugación (10 min, 200 x g) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en 200 l de tampón de lisis (suministrado en el kit). Las células intactas se sedimentaron por centrifugación (10 min, 200 x g) y se analizaron 20 l de sobrenadante según las recomendaciones del fabricante para la inducción de apoptosis.

Un grupo de líneas celulares se analizó también en cuanto a su capacidad de sufrir apoptosis por la incubación con anticuerpos ya en solución contra DR5 o FAS disponibles comercialmente que se sabía que se entrecruzaban con receptores de muerte (figura 2).

Se observaron aquí diferencias significativas entre las líneas celulares en términos de inducción de apoptosis como se muestra en la figura 2. Mientras que la inducción de apoptosis en MKN-45 y BxPC-3 por medio de DR5 y FAS era similar (aunque en MKN-45 el valor de fragmentación de ADN alcanzaba solamente el 50% que en BxPC-3), en células LS174T y Lovo la apoptosis podía inducirse mucho mejor con entrecruzamiento del anticuerpo con DR5 que con unión del anticuerpo a FAS. En las células LS174T la inducción de apoptosis por entrecruzamiento por medio de DR5 era aproximadamente dos veces más eficaz que con el entrecruzamiento por medio de FAS. En las células Lovo esta diferencia en la inducción de apoptosis era incluso de cuatro veces. Las células ASPC-1 eran muy resistentes a la inducción de apoptosis por medio de entrecruzamiento con el receptor de muerte. Basándose en estos resultados las dos líneas celulares Lovo y LS174T se eligieron para analizar la inducción de apoptosis por entrecruzamiento de antígenos tumorales diana DR5.

Los resultados de inducción de apoptosis en células LS174T con el tratamiento con moléculas biespecíficas DR5-CEA (ApomAb-sm3e) en comparación con el efecto de ApomAb o ApomAb entrecruzado se ilustra en la figura 3. Bajo las condiciones utilizadas en el ensayo (4 horas de incubación a una concentración de 1 g/ml) el ApomAb solo

o el sm3e en formato IgG1 no mostraba fragmentación de ADN detectable (valor normalizado a ‘solamente células’), mientras que las moléculas biespecíficas ApomAb-sm3e (sea con el Fcv tipo silvestre (formato A) o estabilizado con enlaces disulfuro (formato A1) mostraban una inducción de apoptosis significativa que era comparable al máximo teórico de ApomAb hiper-entrecruzado. Las dos moléculas biespecíficas mostraban una actividad muy similar, demostrando que la estabilización de la molécula por la inserción de enlaces disulfuro intercatenarios no afecta a la actividad biológica. Cuando las células se pre-incubaron con un exceso de IgG sm3e (a una concentración 100 veces mayor comparada con las construcciones biespecíficas) no se indujo más ninguna apoptosis, indicando que la

IgG sm3e bloquea todo el antígeno CEA en la superficie celular y evita la unión adicional de la molécula biespecífica agonista del receptor de muerte. Esto demuestra que la apoptosis inducida depende específicamente del entrecruzamiento del receptor de muerte DR5 por medio del antígeno tumoral.

En la figura 4 se resumen los resultados de una comparación entre diferentes formatos de molécula de las construcciones biespecíficas ApomAb – sm3e sobre la inducción de apoptosis en células LS174T. La inducción de apoptosis se llevó a cabo durante 4 horas a una concentración de 1 g/ml. De nuevo, las moléculas biespecíficas ApomAb- sm3e en las que el scFv sm3e está fusionado al extremo C de la cadena pesada de ApomAb (formatos A y A1) demostraron una inducción de apoptosis significativa que era, en este caso, incluso superior a la del ApomAb hiper-entrecruzado. El ApomAb solo no inducía fragmentación de ADN detectable bajo las condiciones utilizadas. Dos construcciones biespecíficas adicionales (scFv sm3e fusionado al extremo C de la cadena ligera de ApomAb, sea de tipo silvestre = formato B, o estabilizado con enlaces disulfuro = formato B1) también exhibía altos niveles de inducción de apoptosis que eran, al menos para el formato B, en un intervalo similar al del ApomAb entrecruzado, lo que indica que ambos formatos son básicamente funcionales. La fusión de scFv al extremo C de la cadena pesada de ApomAb parece que es ligeramente ventajoso sobre la cadena ligera. Comparando los resultados que se muestran en la figura 4, puede ser también que las moléculas estabilizadas con enlaces disulfuro muestren una actividad ligeramente reducida comparada con las moléculas scFv tipo silvestre.

Las construcciones ApomAb – sm3e descritas anteriormente funcionan muy bien en términos de inducción de apoptosis específica dependiente de antígenos como se muestra en las figuras 3 y 4. Este anticuerpo contra CEA, el sm3e, muestra una afinidad muy alta hacia su antígeno (a intervalos bajos picomolares). Con el fin de evaluar si el efecto de la inducción de apoptosis con construcciones biespecíficas DR5-CEA también se pueden mediar con moléculas con una afinidad de unión más baja a los antígenos tumorales se generaron construcciones adicionales, análogas a las formadoras. El scFv que se dirige a CEA se modificó utilizando la secuencia del anticuerpo PR1A3 contra CEA que tiene una afinidad bastante baja para CEA que se encuentra en un intervalo micromolar. Para la evaluación de este anticuerpo se generaron construcciones biespecíficas en las que el scFv PR1A3 (tipo silvestre o estabilizado con enlaces disulfuro) se fusionaba o bien al extremo C de la cadena pesada o al de la cadena ligera de la IgG ApomAb. La nomenclatura de las moléculas resultantes es análoga a la descrita anteriormente: ApomAb_PR1A3_A/A1/B/B1 donde A y A1 describe la fusión al extremo C de la cadena pesada y B y B1 muestran la fusión el extremo C de la cadena ligera. A y B contienen el scFv tipo silvestre, mientras que A1 y B1 indican el scFv estabilizado con enlaces disulfuro.

En la figura 5 se muestra la inducción de apoptosis en células LS174T por ApomAb, ApomAb entrecruzado y anticuerpo biespecífico ApoAb_PR1A3 (scFv PR1A3 tipo silvestre fusionado en el extremo C de la cadena pesada) sobre un rango de concentración de 0,01 a 10, 0 g/ml. El ApomAb por sí mismo mostraba un cierto grado de inducción de la apoptosis dependiente de la concentración que podía aumentarse significativamente por entrecruzamiento del ApomAb con un anticuerpo Fc antihumano. La molécula biespecífica ApomAb-PR1A3 también demostró inducción de apoptosis dependiente de la concentración, que a una concentración de 10,0 g/ml, era incluso mayor que con el ApomAb entrecruzado a la misma concentración indicando que no es absolutamente necesario usar enlazadores de antígeno tumoral de alta afinidad en este formato de anticuerpos biespecíficos agonistas de receptor de muerte para conseguir una buena eficacia in vitro en términos de inducción de apoptosis.

Para investigar si el efecto de inducción de apoptosis observado en la incubación con moléculas biespecíficas DR5-CEA se puede aplicar a otras líneas celulares, se llevó a cabo un experimento similar al que se muestra en la figura 6 utilizando células Lovo, otra línea celular de cáncer de colon.

Los resultados de la inducción de apoptosis en las células Lovo utilizando la molécula biespecífica agonista del receptor de muerte ApomAb_R1A3_A (DR5-CEA) se comparó con la inducción de apoptosis por medio de ApomAb y ApomAb entrecruzado se muestran en la figura 6. Para todas las construcciones se observó una inducción de apoptosis dependiente de la dosis. Aquí el ApomAb solo conseguía aproximadamente el 20% de la actividad del ApomAb entrecruzado cuando se utilizaba a una concentración de 10 g/ml. Por debajo de esta concentración la inducción de apoptosis era mucho menor al compararse con el ApomAb entrecruzado. El anticuerpo biespecífico ApomAb_PR1A3 en ausencia de cualquier molécula entrecruzada mostraba la misma inducción de fragmentación de ADN que el anticuerpo ApomAb hiper-entrecruzado demostrando que el efecto de inducción de apoptosis utilizando anticuerpos agonistas del receptor de muerte es un fenómeno general que se puede aplicar a la apoptosis de todas las líneas celulares competentes.

En la figura 7 se muestran los resultados de una comparación entre las diferentes construcciones ApomAb PR1A3 y ApomAb – sm3e. Aquí se resume la inducción de apoptosis en células LS174T tras 4 h de incubación con una concentración de 1 g/ml. De estos resultados es bastante obvio que la afinidad para el antígeno CEA además puede tener un papel en la mediación de la apoptosis por medio del entrecruzamiento con el receptor de muerte. Hay una clara diferencia en la inducción de apoptosis con construcciones que contienen la alta afinidad del enlazador CEA comparado con el enlazador de baja afinidad. El ApomAb – PR1A3 muestra solamente aproximadamente un tercio de la inducción de apoptosis en células LS174T en comparación con el ApomAb – sm3e. Además parece que existen diferencias intrínsecas en las diferentes moléculas que se refleja también en la

capacidad de inducción de apoptosis. Por el contrario, las construcciones que contienen el scFv sm3e se comportaban de manera diferente. Aquí, la fusión del scFv al extremo C de la cadena pesada es superior a la fusión al extremo C de la cadena ligera.

Una diferencia adicional entre las dos series de construcciones es el hecho de que hay un diferente efecto de la estabilización con enlaces disulfuro de scFv. Aunque las construcciones que contienen scFv sm3e estabilizado con enlaces disulfuro no se afectan con respecto a la inducción de apoptosis pasa lo contrario con los scFv PR1A3. Estos no muestran más inducción de apoptosis significativa si se utiliza la forma estabilizada con enlaces disulfuro.

Ejemplo 4: Generación de anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte que se dirigen contra FAS (CD95) y CRIPTO como antígeno tumoral y evaluación de estas moléculas in vitro:

CRIPTO es un factor de crecimiento anclado a GPI del que se ha informado que está sobre-expresado en las células cancerosas, pero está bajo o ausente en las células normales. Se encuentra CRIPTO regulado positivamente en tumores de colon y metástasis hepáticas. Como miembro de la familia EGF, se considera que es un factor de crecimiento autocrino que tiene un papel en la proliferación, metástasis, y/o supervivencia de las células tumorales. Este factor de crecimiento activa varias rutas de señalización a través de varios receptores potenciales o correceptores.

Para averiguar si CRIPTO sería una diana adecuada para una estrategia con el anticuerpo biespecífico agonista del receptor de muerte, se generaron anticuerpos biespecíficos tetravalentes dirigidos al FAS como receptor de muerte y CRIPTO como antígeno tumoral. Estas moléculas consistían en un anticuerpo IgG1 de longitud completa (que reconoce FAS) al que se fusiona un scFv en el extremo C de la cadena pesada que se dirige contra CRIPTO.

Para las cadenas pesada y ligera de la parte de la molécula de IgG que se dirige a FAS se utilizaron las secuencias del anticuerpo HFE7A (Haruyama y col., 2002), que es un anticuerpo humano/ratón con reacción cruzada contra CD95. El scFv CRIPTO se generó a partir de secuencias de un anticuerpo anti-CRIPTO humanizado que se generó por inmunización (LC020_H3L2D1). El scFv se generó utilizando técnicas de ADN recombinante de referencia y se fusionó con un corto péptido enlazador al extremo C de la cadena pesada de la IgG1 FAS. El orden de los dominios sencillos en el scFv es VH – (G4S)4 enlazador VL.

Desafortunadamente no hay muchas líneas celulares adecuadas disponibles que puedan utilizarse para la dirección a CRIPTO. Por lo tanto se evaluaron dos líneas celulares para ver su potencial para utilizarse como línea celular diana para la inducción de apoptosis mediada por entrecruzamiento con FAS por anticuerpos biespecíficos FAS/CRIPTO. En la figura 9 se muestran los resultados de la evaluación de la expresión de superficie de FAS, DR5 y CRIPTO en células NCCIT y HEK que expresaban CRIPTO humano recombinante (de aquí en adelante denominadas HEK-CRIPTO). Al contrario que en las células HEK-CRIPTO las células NCCIT apenas expresaban FAS en la superficie y solo muy bajos niveles de CRIPTO, mientras que la expresión de DR5 parecía ser normal. Por el contrario, las células HEK-CRIPTO expresaban altos niveles de CRIPTO, niveles significativos de DR5 y niveles adecuados de FAS, por lo que se eligieron estas células para los análisis in vitro de inducción de apoptosis con anticuerpos biespecíficos FAS-CRIPTO.

La figura 10 resume los resultados de los experimentos in vitro de inducción de apoptosis en células HEK-CRIPTO utilizando tanto HFE7A, HFE7A entrecruzado o las construcciones biespecíficas HFE7A-CRIPTO. No hay inducción de apoptosis significativa con HFE7A o CRIPTO (LC020) solos. El HFE7A entrecruzado con un anticuerpo Fc antihumano da lugar a altos niveles de fragmentación de ADN al igual que las moléculas biespecíficas HFE7A-CRIPTO. En este caso las moléculas biespecíficas que contenían tanto el tipo silvestre de scFv CRIPTO (HFE7A_LC020_A) como el scFv (HFE7A_LC020_A1) estabilizado por enlaces disulfuro fusionados al extremo C de la cadena pesada de HFE7A. Podía observarse que casi no había diferencia en la inducción de apoptosis entre estas dos moléculas.

En ambos casos, la preincubación con un exceso de IgG CRIPTO reducía significativamente la inducción de apoptosis pero esta reducción no era completa. La razón para esto no está clara y es necesario evaluarla. Una construcción análoga en la que un scFv que se dirige a MCSP se fusiona al extremo C de la cadena pesada de HFE7A (HFE7A_LC007_A1) no inducía ninguna apoptosis en las células HEK-CRIPTO indicando que la apoptosis observada con las moléculas biespecíficas HFE7A – CRIPTO es específica del antígeno tumoral.

Los resultados de una comparación de la inducción de apoptosis entre HEK-CRIPTO y las células HEK que expresan FAP (proteína activadora de fibroblastos) recombinante humana (HEK-FAP) con el tratamiento con anticuerpos biespecíficos HFE7A – CRIPTO se muestran en la figura 11. Ambas líneas celulares sufren apoptosis si se incuban con un anticuerpo control positivo ya en solución confiriendo apoptosis o cuando se tratan con HFE7A entrecruzado. El anticuerpo HFE7A anti FAS por sí mismo no mediaba apoptosis en estas líneas celulares. La molécula HFE7A – CRIPTO inducía apoptosis solo en las células HEK-FAP pero se trata de una actividad basal no específica lo que se puede observar también con una molécula de control HFE7A – MCSP no relacionada e incluso con el anticuerpo anti CRIPTO y anti Fc solos. Como se observa en los experimentos descritos en la figura 10

también en este caso la inhibición de la apoptosis por pre-incubación con un exceso de IgG CRIPTO no era completa.

Ejemplo 5: Generación de anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte y evaluación de su potencial de inducción de apoptosis.

Entre los antígenos que se expresan directamente y se presentan en la superficie celular del tumor también se consideran otros antígenos para entrecruzamiento dirigido de receptores de muerte para inducir apoptosis. En particular estos son antígenos del estroma o neovasculares. Un ejemplo de este último es el proteoglicano sulfato de condroitina asociado al melanoma (MCSP). El MCSP se expresa en la mayoría de las células de melanoma pero también en las células de glioma y en la neovascularización. Se han descrito varios anticuerpos monoclonales que se dirigen al MCSP humano pero ninguno de ellos era adecuado para utilizarlo en terapia contra el cáncer debido a su ausencia de eficacia (por ejemplo, falta de ADCC). Por lo tanto los anticuerpos MCSP pueden ganar valor si se utilizan en un formato biespecífico que es capaz de mediar en la apoptosis dirigida al sitio tumoral.

Con el fin de evaluar la dirección simultánea tumoral/neovascular con respecto a la inducción de apoptosis se generaron anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte en los que el scFv específico de MCSP (tipo silvestre o estabilizado con enlaces disulfuro) se fusiona al extremo C del anticuerpo HFE7A anti FAS. Estos scFv se fusionaban por medio de un corto péptido enlazador con el HFE7A. Las secuencias de las cadenas ligera y pesada variables para generar el scFv dirigido a MCSP se tomaron del anticuerpo MCSP 9.2.27 (Beavers y col., 1996; US5580774).

Con el fin de definir una línea celular que sea adecuada para el análisis in vitro de la inducción de apoptosis se ensayaron varias líneas celulares en cuanto a su expresión de MCSP por análisis de unión FACS (figura 12). Entre las líneas celulares ensayadas solo HCT-116 y U-87MG mostraban una expresión significativa de MCSP como se detectaba con dos anticuerpos anti MCSP (9.2.27 y LC007). Todas las otras líneas celulares ensayadas mostraron solo una expresión muy baja o no expresaban MCSP. Por esta razón se analizaron estas dos líneas celulares para ver si desarrollaban apoptosis cuando se trataban por entrecruzamiento con anticuerpos agonistas del receptor de muerte o con anticuerpos ya en solución de control que confieren apoptosis. En las células U-87MG la apoptosis podía inducirse tanto por, anticuerpos anti FAS y anti DR5 (figura 13 A) mientras que era diferente para las células HCT-116. Aquí la apoptosis solo se podía inducir con anticuerpos anti DR5 (figura 13 B). Por lo tanto, se eligieron las células U-87MG para utilizarse como células diana para experimentos posteriores de inducción de apoptosis.

La figura 14 muestra los resultados obtenidos por los experimentos de inducción de apoptosis con la línea celular de glioma U-87MG tras el tratamiento con anticuerpos biespecíficos agonistas de FAS (con una concentración de 1 g/ml) que consistía en la IgG HFE7A dirigida a FAS que se combina con scFv (9.2.27) que se une a MCSP. Tanto el tipo silvestre (formato A) como el scFv estabilizado con enlaces disulfuro H44/L100 (formato A1) se compararon con HFE7A solo o con HFE7A entrecruzado con un anticuerpo secundario Fc antihumano. Aunque, en general, la inducción de apoptosis en estas células U-87MG es bastante baja (incluso tras 24 horas de incubación) se podía observar una fragmentación de ADN significativa cuando se utilizaban los anticuerpos biespecíficos agonistas de FAS. En este caso la construcción que contenía scFv estabilizado con enlaces disulfuro parecía ser superior con el que contenía el scFv tipo silvestre, y ambos mostraban una capacidad de inducción de apoptosis mucho más alta que la molécula de IgG HFE7A entrecruzada. La incubación de las células con un exceso de inmunoglobulina MCSP

(9.2.27) de 100 veces inhibía completamente la inducción de apoptosis de las construcciones biespecíficas, indicando que la fragmentación de ADN/apoptosis en ausencia de anticuerpo competidor es específica y dependiente del entrecruzamiento de FAS por medio del antígeno MCSP.

Ejemplo 6: Un anticuerpo biespecífico agonista del receptor de muerte DR5-FAP es capaz de mediar apoptosis de una línea celular por medio de entrecruzamiento con una segunda línea celular.

Otra estrategia de inducción de apoptosis por entrecruzamiento de receptores de muerte como DR5 (aparte del entrecruzamiento con un antígeno expresado por la célula tumoral), es dirigirse al estroma que rodea el tumor. En ese caso el antígeno no lo presentan directamente las células tumorales sino un segundo tipo celular diferente. Un ejemplo de este tipo de antígeno sería el FAP (proteína de activación de fibroblastos). Esta proteína se expresa en los fibroblastos activados y se encuentra en el estroma tumoral.

Para investigar las posibilidades de inducción de apoptosis en el tumor diana utilizando anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte que se dirigen al DR5 humano y un antígeno del estroma tumoral, se generaron moléculas biespecíficas que consistían en una parte de IgG1 que reconoce el DR5 y un scFv que se une a FAP que está fusionado en el extremo C de la cadena pesada del anticuerpo. La secuencia de la IgG que se dirige a DR5 se tomó de la secuencia de ApomAb como se describe en el documento US2007 / 0031414 A1. La secuencia de las cadenas variables pesada y ligera del scFv que se une a FAP se tomó de la molécula Fab anti FAP aislada por el fago de presentación que se muestra en las secuencias nos 1 y 2. El scFv FAP se fusiona por un conector (G4S)2 al extremo C de la cadena pesada de la IgG anti DR5.

En este tipo de agrupamiento se van a utilizar dos líneas celulares para los ensayos de actividad in vitro: una línea celular (la línea celular diana) debería expresar DR5 humano, tiene que ser competente de apoptosis pero no necesariamente tiene que expresar FAP. La segunda línea celular (línea celular efectora) tiene que ser negativa a apoptosis (sea por resistencia a apoptosis o por que no exprese DR5) pero tiene que expresar FAP en su superficie. Una posible línea celular efectora que cumple los criterios deseados es la línea celular de fibroblastos humanos GM05389. Como se muestra en la figura 15A esta línea celular expresa niveles significativos de FAP en comparación con la línea celular SW872 que solo mostraba expresión de FAP con la concentración de anticuerpos más alta (10 g/ml) pero que no sufre apoptosis con ApomAb no entrecruzado como se ve en la figura 15B. Por lo tanto esta línea celular parece que es una línea celular efectora potencial en un ensayo de apoptosis en el que la fragmentación de ADN de una línea celular está inducida por entrecruzamiento por medio de un antígeno expresado en una segunda línea celular.

Como línea celular diana se utilizó la línea celular de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 que expresa bajos niveles de DR5 y es sensible a la inducción de apoptosis mediada por DR5. En la figura 16 se resumen los resultados de inducción de fragmentación de ADN de células GM05389 y células MDA-MB-231 comparados con la de la combinación de ambas células por entrecruzamiento de DR5 dirigido al tumor por medio de FAP. Tras la incubación se puede observar una inducción de apoptosis significativa con los anticuerpos agonistas del receptor de muerte solamente cuando se co-cultivan las dos líneas celulares (barras negras) mientras que se puede detectar apoptosis en un bajo grado por entrecruzamiento de DR5 con un ApomAb dirigido a Fc antihumano en ambas líneas celulares por separado (barras blancas y grises, respectivamente). Los inventores interpretan estos resultados de manera que los receptores DR5 en las células MDA-MB-231 estaban entrecruzados con la unión del antígeno FAP expresado por la línea celular de fibroblastos GM05389.

Ejemplo 7: Fusión de moléculas Fab de cadena simple (scFab) CEA al ApomAb para la generación de anticuerpos biespecíficos agonistas DR5-CEA

Además de la estabilización de los anticuerpos biespecíficos por la inserción definida de restos de cisteína interna en la cadena variable pesada y la cadena variable ligera de scFv para prevenir la formación de agregados, el uso de Fab de cadena sencilla (scFab) es otra posible estrategia para estabilizar el anticuerpo biespecífico entero para evitar el entrecruzamiento no específico.

Para evaluar si este formato (scFab fusionado al anticuerpo agonista de DR5) mostraba una actividad de inducción de apoptosis similar a las moléculas correspondientes que contienen scFv, se generaron diferentes anticuerpos biespecíficos en los que el scFab CEA se fusionaba al extremo C de tanto la cadena pesada o la cadena ligera de ApomAb, por tecnología de ADN recombinante.

La orientación de los diferentes dominios de scFab es la siguiente: VL-CL-VH-CH1. El extremo C de la cadena ligera constante (CL) se conecta al extremo N de la cadena pesada variable (VH) por medio de un péptido enlazador 34mérico. La fusión del scFab se produce por un conector G4S (sea 2mérico o 4mérico)

El Fab de cadena sencilla contenido en los anticuerpos biespecíficos se generaron en dos formatos básicamente diferentes: en un formato dos scFab se fusionaban el extremo C de la cadena pesada o la cadena ligera de ApomAb (moléculas biespecíficas tetravalentes homodiméricas). Por otra parte se construyó una molécula en la que un scFab se fusionaba al extremo C de solo una cadena pesada de ApomAb (biespecífico, molécula trivalente heterodimérica). Esta heterodimerización se conseguía utilizando la tecnología denominada botón en ojal que utiliza mutaciones de Fc que solamente permiten la formación de moléculas de IgG heterodiméricas.

En la figura 17 se muestran los resultados de los experimentos de inducción de apoptosis en los que se compara el ApomAb_PR1A3_scFab con el ApomAb o el ApomAb entrecruzado. En este ensayo se utilizó la línea celular de cáncer gástrico MKN-45 y se midió la apoptosis tras 24 h utilizando un ensayo de fragmentación de ADN. Claramente, la construcción biespecífica mostraba actividad de inducción a la apoptosis que estaba en el mismo intervalo que la que se puede observar con ApomAb que estaba entrecruzado por medio de un anticuerpo anti Fc, y que es significativamente más alta que con ApomAb solo. Sin embargo, la inducción de la apoptosis con ApomAb por sí mismo es bastante alta, lo que probablemente es debido al tiempo de incubación dilatado de 24 h que es el necesario para demostrar el máximo de inducción de apoptosis en la línea celular MKN-45 utilizada (al contrario que en las células LS174T en las que el ensayo solo se ejecuta durante cuatro horas).

Para evaluar si los anticuerpos biespecíficos agonistas de DR5 trivalentes (monovalentes para la diana tumoral, CEA, y bivalentes para DR5) eran capaces de inducir apoptosis dirigida al tumor, se generó una molécula en la que un scFab CEA (con especificidad sm3e) se fusionó al extremo C de la cadena pesada de ApomAb (que contenía la mutación protuberante). Esta cadena pesada se co-expresó con la correspondiente cadena pesada de ApomAb que contenía las mutaciones de ‘hueco’ y la cadena ligera de ApomAb. Los resultados del ensayo de inducción de apoptosis a las 4 horas en las que la molécula biespecífica trivalente se analizó en células LS174T (en concentraciones de 0,1 y 1,0 g/ml) se resumen en la figura 18. A partir de estos resultados es obvio que también el formato trivalente descrito es capaz de inducir apoptosis dirigida en el mismo intervalo que lo hace el ApomAb hiper

entrecruzado. A una concentración más baja el formato biespecífico parece ser incluso ligeramente más activo que el ApomAb con entrecruzamiento.

Ejemplo 8: Anticuerpo biespecífico agonista DR5-CEA con eficacia in vivo superior en comparación con ApomAb

Para la evaluación de si la actividad apoptótica de los anticuerpos agonistas del receptor de muerte que se había demostrado in vitro también se traduce en una eficacia superior in vivo, se puso en marcha un experimento in vivo utilizando la línea celular LS174T de carcinoma de colon como modelo.

En resumen, el día uno del experimento se trataron ratones hembras SCID gris con una inyección intraesplénica de 3 x 106 células tumorales. El día siete se ensayó un animal de exploración respecto al injerto tumoral como criterio para comenzar con el tratamiento con anticuerpos un día más tarde. El tratamiento consistía en una serie de tres inyecciones (cada una de 10 mg/kg i.v. a intervalos de siete días). Cada día los animales se analizaban para demostrar los criterios de terminación.

La figura 19 resume los resultados obtenidos en este experimento in vivo. Aquí, se compara la duración de la supervivencia de tres grupos de ratones (cada uno consistía inicialmente en diez animales y se trataron con diferentes moléculas). Mientras que el grupo de control (PBS, línea negra) se terminó completamente a los 37 días tras la inyección del tumor, el grupo tratado con ApomAb (círculos llenos) mostraban una supervivencia prolongada (máximo de 44 días). El grupo tratado con el anticuerpo biespecífico (ApomAb_sm3e_A1, cuadrados negros) mostraban una supervivencia incluso más larga (52 días) que el grupo que había obtenido el ApomAb solo. El análisis matemático de los datos obtenidos demostraba que estos resultados eran estadísticamente significativos (con valores de p por debajo de 0,05) lo que significa que el ApomAb mostraba una eficacia in vivo comparada con el control PBS y que el ApomAb_sm3e_A1 biespecífico demostraba una eficacia in vivo superior incluso comparada con ApomAb.

Material y métodos:

Transfección de células HEK293 EBNA

Todos los anticuerpos (biespecíficos) que se utilizan en el presente experimento se produjeron transitoriamente en células HEK293 EBNA utilizando un procedimiento de co-transfección dependiente de fosfato-Ca2+ para los vectores de cadena pesada y ligera como se describe posteriormente.

Las células se cultivaron en medio de referencia DMEM (Invitrogen) que contenía un 10% de FCS (Gibco, nº 16000) a 37 ºC en incubadoras humidificadas con una atmósfera de un 5% de CO2. 48 h antes de la transfección se inocularon 3 x 107 células en 200 ml de DMEM/ 10% de FCS en botellas giratorias (Falcon nº 353069, 1400 cm2) y se incubaron a 37 ºC en una incubadora de botellas giratorias (0,3 rpm). Para la transfección, se llevaron 880 g de ADN total (440 g de cada uno, vector de cadena pesada y ligera) + 4,4 ml de CaCl2 hasta un volumen total de 8,8 ml con H2O. La solución se mezcló un poco. Después del mezclado, se añadieron 8,8 ml de tampón fosfato 1,5 mM (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1,5 mM NaH2PO4; pH 7,05) para la precipitación del ADN. Tras un mezclado adicional durante diez segundos y una corta incubación a temperatura ambiente (20 segundos) se añadieron 200 ml de DMEM/2% FCS a la solución de ADN. Se utilizó el medio/solución ADN para remplazar el medio original en las botellas giratorias para transfectar las células. Tras 48 horas de incubación a 37 ºC se remplazó el medio de transfección por 200 ml de DMEM / 10% FCS y se continuó con la producción de anticuerpos durante 7 días.

Tras la producción, se recolectaron los sobrenadantes y los sobrenadantes que contenían anticuerpos se filtraron a través de filtros estériles de 0,22 m y se almacenaron a 4 ºC hasta su purificación.

Purificación

Las proteínas se produjeron por expresión transitoria en células HEK293 EBNA. Todas las moléculas biespecíficas descritas aquí se purificaron en dos etapas utilizando procedimientos de referencia, tales como purificación deafinidad A (Äkta Explorer) y cromatografía de exclusión por tamaño.

Los sobrenadantes se ajustaron a un pH de 8,0 (utilizando 2 M TRIS pH 8,0) y se aplicó a una resina Mabselect Sure (GE Healthcare) envasada en una columna TricornTM 5/50 (GE Healthcare, volumen de columna (vc) = 1 ml) equilibrada con tampón A (50 mM de fosfato sódico, pH 7,0, 250 mM NaCl=. Tras lavar con 10 volúmenes de columna (vc) de tampón A, 20 vc de tampón B (50 mM de fosfato sódico, pH 7,0, 1 M NaCl) y otra vez con 10 vc de tampón A, la proteína se eluyó utilizando etapas de gradiente de pH con el tampón B (50 mM fosfato sódico, 50 mM citrato sódico pH 3,0, 250 mM de NaCl) sobre 20 vc. Las fracciones que contenían la proteína se agruparon y se ajustó con cuidado el pH de la solución a pH 6,0 (utilizando 2 M TRIS pH 8,0). Las muestras se concentraron a 2 ml utilizando ultra-concentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) y posteriormente se aplicaron a un HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200 de calidad preparatoria (GE Healthcare) equilibrado con 20 mM de Histidina, pH 6,0, 150 mM NaCl. El contenido aglomerado de las fracciones eluídas se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño analítica. De esta forma, se cargaron 50 l de cada fracción en una columna SuperdexTM200 10/300 GL

(GE Healthcare) equilibrada con 2 mM de MOPS, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% p/v de NaN3. Las fracciones que contenían menos de un 2% de oligómeros se agruparon y se concentraron a una concentración final de 1 – 1,5 mg/ml utilizando ultra concentradores (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius). Las proteínas se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -80 ºC.

Análisis de unión FACS

Todas las líneas celulares utilizadas se analizaron con respecto a los niveles de expresión relativos de antígenos relacionados con el tumor y receptores de muerte FAS o DR5 antes de llevarse a cabo los ensayos de apoptosis.

10 Se determinó el número y viabilidad de células. Para esto, las células que crecían adherentemente se separaron con un tampón de disociación celular (Gibco - Invitrogen nº 13151-014). Se recolectaron las células por centrifugación (4 min, 400 x g), se lavaron en tampón FACS (PBS / 0,1% BSA) y el número de células se ajustó a 1.111 x 106 células / ml en tampón FACS. Se utilizaron 180 l de esta suspensión celular por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo

15 redondo, dando como resultado 2 x 105 células por pocillo. Las células se incubaron durante 30 min a 4 ºC con el primer anticuerpo en una dilución apropiada. Luego se recolectaron las células por centrifugación (4 min, 400 x g), se retiró completamente el sobrenadante y se lavaron las células una vez con 150 l de tampón FACS. Se resuspendieron las células en 150 l de tampón FACS y se incubaron con un anticuerpo secundario (en el caso de que se utilizara un primer anticuerpo sin marcar) durante 30 min a 4 ºC en oscuridad. Tras dos etapas de lavado con

20 tampón FACS se resuspendieron las células en 200 l de tampón FACS y se analizaron en un HTS FACSCanto II (BD, Software FACS Diva). De manera alternativa, las células se podían fijar con 200 l de PFA (paraformaldehído) al 2% en tampón FACS durante 20 min a 4 ºC y se analizaron más tarde. Todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.

25 Anticuerpos utilizados y concentraciones:

Anticuerpo: Fuente Descripción Conc. [g / ml] Conc. en el ensayo [g / ml]

1. Anticuerpos primarios

anti hu CD95 (FAS): BD nº 555671 mu IgG 1, kappa 0,5 5-10

anti hu DR5 (TRAIL R2): R&D nº MAB631 mu IgG1, clon 71903 0,5 5-10

anti hu CEA: Abcam nº ab11330 mu IgG1, clon C6G9 9,0 30

Isotipo control: BD nº 554121 mu IgG1 clon MOPC1

anti hu MCSP: en el laboratorio (por ejemplo M9.2.27, LC007) IgG1 human(izada) / quimérica dif. 30.

anti hu CRIPTO: en el laboratorio (por ejemplo LC020, H3L2D1) IgG1human(izada) / quimérica dif. 30.

anti hu ROBO4-PE: R&D nº FAB2454P mu IgG2a 0,05 0,005

Isotipo control: BD nº 555574 mu IgG2a-PE 0,05 0,005

2. Anticuerpos secundarios:

IgG-PE de cabra anti ratón: Serotec nº STAR105PE 0,1

Fc-PE (Fab’)2 de cabra anti humano: Jackson Immunoresearch nº 109-116-170

Análisis Biacore (Resonancia de plasmones superficiales, SPR)

30 Los experimentos SPR se llevaron a cabo en un Biacore T100 con HBS-EP (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % Tensioactivo P20, GE Healthcare) como tampón de operación. Se llevó a acabo el acoplamiento directo de 1220, 740 y 300 unidades de resonancia (UR), respectivamente de antígeno biotinilado en un chip de Estreptavidina utilizando el método de referencia (GE Healthcare). Se pasaron diferentes concentraciones de los anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte con un flujo de 40 l/min a través de las cámaras de flujo

35 a 278 K durante 9 s para registrar la fase de asociación. La fase de disociación se controló durante 300 s y se desencadenó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. Las diferencias de los índices de refracción se

corrigieron restando la respuesta obtenida a partir de una superficie de Estreptavidina vacía. Se derivaron las constantes cinéticas utilizando el software de evaluación del Biacore T100 (vAA, Biacore, Friburgo/Alemania), para fijar las ecuaciones de tasa para la unión de Langmuir 1:1 por integración numérica. Aunque el antígeno estaba inmovilizado las constantes cinéticas obtenidas utilizando la unión de Langmuir 1:1 por integración numérica daban

5 simplemente el valor KD aparente o la avidez.

Inducción de apoptosis

Para la determinación de la inducción de apoptosis se utilizó el kit de detección de muerte celular ELISA PLUS de

10 Roche. En breve, se sembraron 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos (después de separarlas, y de la determinación del número celular y la viabilidad) en 200 l de medio apropiado y se incubaron una noche a 37 ºC en una atmósfera con un 5% de CO2. Al día siguiente se remplazó el medio por medio nuevo que contenía los anticuerpos inductores de apoptosis, los anticuerpos de control y otros controles a concentraciones apropiadas.

15 Se utilizaron los anticuerpos biespecíficos a una concentración final de 0,01 – 10 g/ml; los anticuerpos de control se utilizaron a 0,5 g/ml y los anticuerpos entrecruzados se utilizaron a 100 g/ml. Los anticuerpos competitivos se utilizaron con un exceso de 100 veces.

Las células se incubaron durante 4 – 24 horas a 37 ºC, 5% de CO2 para permitir la inducción de apoptosis. Las

20 células se recolectaron por centrifugación (10 min, 200 x g) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en 200 l de tampón de lisis (suministrado por el kit). Las células intactas se sedimentaron por centrifugación (10 min, 200 x g) y se analizaron 20 l de sobrenadante según las recomendaciones del fabricante para la inducción de apoptosis.

25 Aunque se acaban de mostrar y describir las realizaciones preferidas de la invención, se entenderá sin lugar a dudas que la invención no se limita a estas sino que se puede realizar y practicar de formas distintas en el ámbito de las siguientes reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS 30

<110> GlycArt Biotechnology AG

<120> Anticuerpos biespecíficos agonistas del receptor de muerte

35 <130> 25917 WO

<150> EP09171659.7

<151>

40 <160> 9

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 45 <211> 468

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1 50

<210> 2

<211> 440

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 335

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 702

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 188

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 1007

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 2322

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 2201

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 760

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno específico para DR5 y un segundo

sitio de unión al antígeno específico para FAP. 5
2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, donde el anticuerpo biespecífico es una molécula dimérica que comprende un primer anticuerpo que comprende el primer sitio de unión al antígeno específico para DR5 y un segundo anticuerpo que comprende el segundo sitio de unión al antígeno específico para FAP.

10 3. El anticuerpos biespecífico de la reivindicación 2, en donde el primer y segundo anticuerpos comprenden una parte Fc de cadena pesada de anticuerpo, donde la parte Fc del primer anticuerpo comprende un primer módulo de dimerización y la parte Fc del segundo anticuerpo comprende un segundo módulo de dimerización permitiendo una heterodimerización de los dos anticuerpos.

15 4. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 3, en donde el primer módulo de dimerización comprende protuberancias y el segundo módulo de dimerización comprende huecos de acuerdo con una estrategia botón en ojal.

5 El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 2, en donde el primer anticuerpo es una molécula de 20 inmunoglobulina (Ig) que comprende una cadena ligera y una cadena pesada y el segundo anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en scFv, scFab, Fab o Fv.
6. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 5 en donde el segundo anticuerpo se fusiona en el extremo N o C

de la cadena pesada de la molécula de Ig. 25
7. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 5, en donde el segundo anticuerpo se fusiona en el extremo N o C de la cadena ligera de la molécula de Ig.
8. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde la molécula de Ig es una IgG. 30
9. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en donde la segunda molécula se fusiona a la molécula de Ig por un péptido enlazador, preferentemente un péptido enlazador de aproximadamente 10 – 30 aminoácidos.

35 10. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde la segunda moléculas comprende restos de cisteína adicionales para formar enlaces disulfuro.
11. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde la molécula de Ig comprende una

variante de Fc que tiene una afinidad reducida para los receptores Fc en comparación con la región Fc de tipo 40 silvestre.
12. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de las reivindicaciones 1 a 11.
13. El anticuerpo biespecífico de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento del cáncer. 45