KR20120056857A - 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체 - Google Patents
이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20120056857A KR20120056857A KR1020127007953A KR20127007953A KR20120056857A KR 20120056857 A KR20120056857 A KR 20120056857A KR 1020127007953 A KR1020127007953 A KR 1020127007953A KR 20127007953 A KR20127007953 A KR 20127007953A KR 20120056857 A KR20120056857 A KR 20120056857A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- leu
- gly
- ser
- ala
- val
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
본 발명은 사멸 수용체에 특이적인 1 차 항원 결합 부위 및 2 차 항원에 특이적인 2 차 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체, 이의 생성 방법, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 사멸 수용체에 특이적인 1 차 항원 결합 부위 및 2 차 항원에 특이적인 2 차 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체, 이의 생성 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.
단일클론 항체는, 암 세포에서 상이하게 발현되는 항원의 선택적 표적화로 인해 암 치료에 있어서 강력한 치료제인 것으로 알려져 있다. 가장 최근에 개발된 단일클론 항체의 치료적 전략은 종양-세포 생물상을 변형시키기 위한 종양-관련 항원의 표적화, 성장 인자 수용체의 저해, 혈관형성의 저해, 세포자멸사 유도 및 보체 결합 또는 항체-의존적 세포독성을 통한 세포독성을 포함한다. 트라스투주맙 (Herceptin) 및 세툭시맙 (Erbitux) 과 같은 일부 항체는 암 세포 생존에 결정적인 성장 인자 수용체를 표적으로 한다. 아고니스트성 단일클론 항체로 암 세포 상의 TRAIL 사멸 수용체를 표적화하는 것은 단일클론 항체 요법의 새로운 세대를 나타내는데, 이들이 표적 세포의 세포자멸사를 직접적으로 유도할 수 있기 때문이다. TRAIL 대신 사멸 수용체에 대해 아고니스트성 단일클론 항체를 사용하는 것이 유리할 수 있는데: TRAIL 은 사멸 수용체와 유인 수용체 모두를 포함하는 다중 수용체를 표적화하므로, 선택성이 관건이다. 또한 TRAIL 이 단일클론 항체에 비해 매우 짧은 혈액 반감기를 가지는데, 이것은 용량 및 일정 매개변수에 영향을 주는 인자이다. TRAIL 의 매우 짧은 혈액 반감기는 단일클론 항체에 비해 크고 빈번한 용량을 필요로 한다. 또한 재조합 TRAIL 은 생성시키기에 매우 어렵고 단조롭다.
Michaelson J.S. 등 (mAbs, Vol 1, Issue 2, p:128 - 141; 2009 년 3 월 / 4 월) 은 2 개의 TNF 패밀리 일원 수용체, 즉 TRAIL-R2 (TNF 관련 세포자멸사 유도 리간드 수용체-2) 및 LTβR (림포톡신-베타 수용체) 을 표적화하는 이중특이적 항체와 유사한 조작된 IgG 를 기재하고 있다.
Herrmann T. 등 (Cancer Res 2008; 68: (4); p: 1221 - 1227) 은 CD95/Fas/Apo-1 세포 표면 수용체 및 교모세포종 세포 상 3 개의 표적 항원: NG2, EGFR 및 CD40 에 대해 유도된 이중특이적 1 가 화학적 결합 Fab 분자를 기재하고 있다.
본 발명은 항원 결합 부위를 표적화하는 사멸 수용체와 2 차 항원을 표적화하는 2 차 항원 결합 부위를 결합시키는 항체에 관한 것이다. 이로 인해 사멸 수용체가 가교되고, 표적 세포의 세포자멸사가 유도된다. 통상적인 사멸 수용체 표적화 항체에 대한 이러한 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체의 이점은, 2 차 항원이 발현되는 부위에서만 세포자멸사를 유도하는 특이성이다.
제 1 목적에서, 본 발명은 사멸 수용체 항원에 특이적인 1 차 항원 결합 부위 및 2 차 항원에 특이적인 2 차 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이다.
상기 이중특이적 항체의 바람직한 구현예에서, 사멸 수용체는 사멸 수용체 4 폴리펩티드 (DR4), 사멸 수용체 5 폴리펩티드 (DR5) 또는 FAS 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 DR4 폴리펩티드 (Seq. Id. No. 1), 인간 DR5 폴리펩티드 (Seq. Id. No. 2) 또는 인간 FAS 폴리펩티드 (Seq. Id. No. 3) 에서 선택된다.
이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, 2 차 항원은 종양성 질환 또는 류마티스 관절염과 관련된다.
이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, 2 차 항원은 암 태아성 항원 (CEA) 폴리펩티드, CRIPTO 단백질, "마법의 회전목마 (magic roundabout)" 상동체 4 (ROBO4) 폴리펩티드, 흑색종-관련 콘드로이친 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 폴리펩티드, 테나신 C 폴리펩티드 및 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP) 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 CEA 폴리펩티드 (Seq. Id. No. 4), 인간 CRIPTO 폴리펩티드 (Seq. Id. No. 5), 인간 ROBO4 폴리펩티드 (Seq. Id. No. 6), 인간 MCSP 폴리펩티드 (Seq. Id. No. 7), 인간 테나신 C 폴리펩티드 (Seq. Id. No. 8) 및 인간 FAP 폴리펩티드 (Seq. Id. No. 9) 에서 선택된다.
이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, 이중특이적 항체는 1 차 항원 결합 부위를 포함하는 1 차 항체 및 2 차 항원 결합 부위를 포함하는 2 차 항체를 포함하는 이합체성 분자이다.
본 발명의 이합체성 이중특이적 항체의 바람직한 구현예에서, 1 차 및 2 차 항체는 항체 중쇄의 Fc 부분을 포함하는데, 1 차 항체의 Fc 부분은 1 차 이합체화 모듈을 포함하며 2 차 항체의 Fc 부분은 2 차 이합체화 모듈을 포함한다 (2 개 항체를 이종이합체화시킴).
이합체성 이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, 1 차 이합체화 모듈은 놉 (knobs) 을 포함하며 2 차 이합체화 모듈은 홀 (holes) 을 포함한다 (놉 인투 홀 (knobs into holes) 전략에 따라) (Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, 1996 년 2 월, pp. 73-73(1) 참조).
이합체성 이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, 1 차 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 면역글로불린 (Ig) 분자이며, 2 차 항체는 scFv, scFab, Fab 또는 Fv 로 이루어지는 군에서 선택된다.
추가로 바람직한 구현예에서 이중특이적 항체는 야생형 Fc 부분에 비해 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 변형된 Fc 부분을 포함한다 (예를 들어 LALA 변형).
이합체성 이중특이적 항체의 더욱 추가로 바람직한 구현예에서, Ig 분자는 사멸 수용체에 특이적인 1 차 항원 결합 부위를 포함하며 2 차 항체는 2 차 항원에 특이적인 2 차 항원 결합 부위를 포함한다.
이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, Ig 분자는 2 차 항원에 특이적인 2 차 항원 결합 부위를 포함하며 2 차 항체는 사멸 수용체에 특이적인 항원 결합 부위를 포함한다.
이합체성 이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, 2 차 항체는 Ig 분자의 중쇄의 N- 또는 C-말단에 융합된다.
이합체성 이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, 2 차 항체는 Ig 분자의 경쇄의 N- 또는 C-말단에 융합된다.
이합체성 이중특이적 항체의 또다른 더욱 바람직한 구현예에서, Ig 분자는 IgG 이다. 이합체성 이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, 2 차 분자는 펩티드 링커, 바람직하게는 약 10 - 30 아미노산 길이의 펩티드 링커에 의해 Ig 분자에 융합된다.
이합체성 이중특이적 항체의 추가로 바람직한 구현예에서, 2 차 항체는 이황화물 결합을 형성하기 위해 추가적인 시스테인 잔기를 포함한다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 2 가일 수 있으며 3 가 또는 다가, 예를 들어 4 가 또는 6 가일 수 있다.
제 2 목적에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제 3 목적에서, 본 발명은 암 또는 류마티스 관절염의 치료를 위한 본 발명의 이중특이적 항체에 관한 것이다.
제 4 목적에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체의 중쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 이중특이적 항체의 경쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
용어 "폴리펩티드" 는 본원에서 본 발명의 폴리펩티드의 선천적 아미노산 서열 및 서열 변이체, 즉 예를 들어 인간을 포함하는 포유류 종과 같은 임의의 동물로부터의 DR4, DR5, FAS, CEA, CRIPTO, ROBO4, MCSP, 테나신 C 및 FAP 를 지칭하는 것으로 사용된다.
"선천적 폴리펩티드" 는 그의 생성 방법에 관계없이 자연적으로 발생하는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "선천적 폴리펩티드" 는 구체적으로는, 본 발명의 폴리펩티드의 자연적으로 발생하는 절단형 또는 분비형, 자연적으로 발생하는 변이체형 (예를 들어 대안적으로는 스플라이싱 형) 및 자연적으로 발생하는 대립형질적 변이체를 포함한다. 서열 목록 (Seq. Id. No. 1 - 9) 에서의 아미노산 서열은 본 발명의 단백질의 선천적 인간 서열을 지칭한다.
용어 "폴리펩티드 변이체" 는 선천적 서열에서의 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함하는 선천적 서열의 아미노산 서열 변이체를 지칭한다. 아미노산 서열 변이체는 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드의 선천적 서열의 아미노산 서열과 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
용어 "항체" 는 전체 항체 및 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 항체 구조를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 완전 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 추가로 유전자 조작된 항체이다 (본 발명에 따른 특징적인 특성을 보유하는 한).
"항체 단편" 은 전장 항체의 일부, 바람직하게는 이의 가변 도메인, 또는 적어도 이의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예는 디아바디 (diabody), 단일 사슬 항체 분자 및 다중특이적 항체 (항체 단편으로부터 형성됨) 를 포함한다. scFv 항체는, 예를 들어 [Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96] 에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은 VH 도메인의 특징 (즉, VL 도메인을 기능적 항원 결합 부위에 함께 어셈블리시킬 수 있다는 특징) 또는 VL 도메인의 특징 (즉, VH 도메인을 기능적 항원 결합 부위에 함께 어셈블리시킬 수 있다는 특징) 을 가짐으로써 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공하는 단일 사슬 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물" 은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제조물을 지칭한다.
용어 "키메라 항체" 는 가변부, 즉 하나의 근원 또는 종으로부터의 결합부 및 상이한 근원 또는 종에서 유래한 불변부의 일부 이상을 포함하는 항체를 지칭한다 (통상 재조합 DNA 기술에 의해 생성됨). 쥐과 가변부 및 인간 불변부를 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 의해 포함되는 다른 바람직한 형태의 "키메라 항체" 는 본래 항체의 불변부가 본 발명에 따른 특성이 생성되도록 변형되거나 변화된 (특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합에 대해) 것들이다. 이러한 키메라 항체는 또한 "클래스 전환 항체" 로서 지칭된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변부를 인코딩하는 DNA 분절 및 면역글로불린 불변부를 인코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라 항체의 생성 방법은 통상적인 재조합 DNA 를 포함하며, 유전자 트렌스펙션 기술이 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어 [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; 미국 특허 제 5,202,238 호 및 제 5,204,244 호를 참조한다.
용어 "인간화 항체" 는 골격부 또는 "상보성 결정 부위" (CDR) 가 모체 면역글로불린과 비교하여 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 변형된 항체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 쥐과 CDR 이 인간 항체의 골격부에 이식되어 "인간화 항체" 가 생성된다. 예를 들어 [Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327]; 및 [Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270] 을 참조한다. 특히 바람직한 CDR 은 키메라 항체에 대해 상기 표기한 항원을 인지하는 서열을 나타내는 것들에 상응한다. 본 발명에 의해 포함되는 다른 형태의 "인간화 항체" 는 본 발명의 특성이 생성되도록 본래 항체의 불변부가 추가적으로 변형되거나 변화된 (특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합에 대해) 것들이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 항체" 는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에서 유래한 가변부 및 불변부를 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 당업계에 널리 알려져 있다 (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 또한, 면역화시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리 또는 선별물을 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스) 에서 생성될 수 있다. 이러한 생식 계열 돌연변이체 마우스에서의 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 어레이의 이동은 항원 챌린지시 인간 항체의 생성을 야기할 것이다 (예를 들어, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40 참조). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생성될 수 있다 (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). [Cole et al. and Boerner et al] 의 기술이 또한 인간 단일클론 항체의 생성을 위해 이용가능하다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 본 발명에 따른 키메라 및 인간화 항체에 대해 이미 언급한 바와 같이, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 항체" 는 또한 본 발명에 따른 특성이 생성되도록 예를 들어 "클래스 전환" (즉 Fc 부분의 변화 또는 돌연변이) (예를 들어 IgG1 에서 IgG4 로, 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이) 에 의해 불변부에 있어서 변형된 (특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합에 대해) 이러한 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "재조합 인간 항체" 는 숙주 세포 내로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대해 트랜스제닉인 동물 (예를 들어 마우스) 또는 NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은, 재조합 방법에 의해 생성되고, 발현되고, 제작되거나 단리되는 모든 인간 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태로 가변부 및 불변부를 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 초돌연변이를 거친다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 부위의 아미노산 서열은, 인간 생식 계열 VH 및 VL 서열에서 유래하며 이와 관련된 서열이지만 생체내 인간 항체 생식 계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "가변 도메인" (경쇄 (VL) 의 가변 도메인, 중쇄 (VH) 의 가변 도메인) 은 항체가 항원에 결합하는 것에 있어서 직접적으로 관여하는 경쇄 및 중쇄 도메인 쌍 각각을 나타낸다. 가변 경쇄 및 중쇄 도메인은 동일한 일반적 구조를 가지며, 각각의 도메인은 그 서열이 광범위하게 보존된, 3 개의 "과가변부" (또는 상보성 결정 부위, CDR) 에 의해 연결된 4 개의 골격부 (FR) 를 포함한다. 골격부는 β-시트 형태를 차용하며, CDR 은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 사슬 내 CDR 은 골격부에 의해 그의 3 차원 구조를 유지하며 다른 사슬로부터의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 부위는 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 있어서 특히 중요한 역할을 하므로, 본 발명의 추가적인 목적을 제공한다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "항체의 항원-결합 부위" 는 항원-결합에 있어서 역할하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원-결합 부위는 "상보성 결정 부위" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격부" 또는 "FR" 은 본원에 정의된 바와 같은 과가변부 외의 가변 도메인 부분이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단에서 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 대부분 항원 결합에 기여하며 항체의 특성을 정의하는 부분이다. CDR 및 FR 부분은 "과가변 루프" 로부터의 이들 잔기 및/또는 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 결정된다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인지를 지칭한다. 자연 항체는 예를 들어 단일특이적이다. 본 발명에 따른 "이중특이적 항체" 는 두 가지 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 본 발명의 항체는 두 개의 상이한 항원 (즉, 1 차 항원 및 2 차 항원으로서 사멸 수용체 항원) 에 특이적이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "단일특이적" 항체는 동일한 항원의 동일한 에피토프에 각각 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "이중특이적" 항체는 동일한 항원 또는 상이한 항원의 상이한 에피토프에 각각 결합하는 두 개 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.
현 출원 내에서 사용되는 바와 같은 용어 "~가" 는 항체 분자 내 명기된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 그로서, 용어 "2 가", "4 가" 및 "6 가" 는 각각 항체 분자 내에 2 개의 결합 부위, 4 개의 결합 부위 및 6 개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 "2 가" 이고, "3 가" 또는 "다가" (예를 들어 "4 가" 또는 "6 가") 일 수 있다.
본 발명의 항체는 2 개 이상의 결합 부위를 가지며 이중특이적이다. 즉, 상기 항체는 심지어 2 개 초과의 결합 부위가 있는 경우에도 (즉, 항체가 3 가 또는 다가임) 이중특이적일 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 예를 들어 다가 단일 사슬 항체, 디아바디 및 트리아바디 (triabody) 뿐 아니라 하나 이상의 펩티드-링커를 통해 추가의 항원-결합 부위 (예를 들어 단일 사슬 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab, 또는 (Fab)2) 와 연결되는 전장 항체의 불변 도메인 구조를 갖는 항체를 포함한다. 항체는 단일 종으로부터의 전장 항체일 수 있거나, 키메라화 또는 인간화될 수 있다.
"단일 사슬 Fab 단편" 은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 이루어지는 폴리펩티드이며, 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로의 하기 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL; 상기 링커는 30 개 이상의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50 개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 단편 a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 및 d) VL-CH1-링커-VH-CL 은, CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 자연 이황화물 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단일 사슬 Fab 분자는 시스테인 잔기 삽입을 통한 (예를 들어 카밧 번호화 (Kabat numbering) 에 따른 가변 중쇄에서의 위치 44 및 가변 경쇄에서의 위치 100) 사슬간 이황화물 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 용어 "N-말단" 은 N-말단의 마지막 아미노산을 나타내고, 용어 "C-말단" 은 C-말단의 마지막 아미노산을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자" 는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 이다.
본 출원 내에서 사용되는 바와 같은 용어 "아미노산" 은 알라닌 (3 문자 코드: ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루탐산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I), 류신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y) 및 발린 (val, V) 을 포함하는 자연 발생적 카르복시 α-아미노산의 군을 나타낸다.
핵산은 또다른 핵산과의 기능적 관계에 놓이는 경우 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 전서열 (presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA 는, 폴리펩티드의 분비에 관여하는 단백질 전구물 (preprotein) 로서 발현되는 경우 상기 폴리펩티드에 대한 DNA 와 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역이 촉진되도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결되는" 은 연결되는 DNA 서열이 공직선성 (colinear) 이고, 분비 리더의 경우 인접하며 판독 프레임 내에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 이루어진다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적 실행에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양액" 은 상호교환가능하게 사용되며 이러한 모든 지정은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "트랜스펙션물" 및 "트랜스펙션된 세포" 는 제 1 대상 세포 및 이동 수에 관계없이 이로부터 유래한 배양물을 포함한다. 또한, 고의의 또는 우연한 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 내용물에 있어서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것이 이해된다. 본래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는" 은 시험관내 검정, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 검정 (SPR, BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 에서 항원의 에피토프에 항체가 결합하는 것을 지칭한다. 결합 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터의 항체의 결합에 대한 속도 상수), kD (해리 상수) 및 KD (kD/ka) 에 의해 정의된다. '결합하는' 또는 '특이적으로 결합하는' 은 10-8 mol/ℓ 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 mol/ℓ 의 결합 친화성 (KD) 을 의미한다.
사멸 수용체에 대한 항체의 결합은 BIAcore 검정 (GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 에 의해 조사할 수 있다. 결합 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터의 항체의 결합에 대한 속도 상수), kD (해리 상수) 및 KD (kD/ka) 에 의해 정의된다.
용어 "에피토프" 는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정자를 포함한다. 특정 구현예에서, 에피토프 결정자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 분류물을 포함하며, 특정 구현예에서는 특이적 3 차원 구조 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원 부분이다.
항체의 "Fc 부분" 은 항체가 항원에 결합하는데 있어서 직접적으로 관여하지는 않으나, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. "항체의 Fc 부분" 은 당업자에게 널리 알려져 있는 용어이며 항체의 파파인 분열을 기반으로 하여 정의된다. 이의 중쇄의 불변부의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 의 클래스로 분류되며, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (아이소타입 (isotype)) 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2 로 더 분류될 수 있다. 중쇄 불변부에 따라서, 상이한 클래스의 면역글로불린은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 불린다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합을 바탕으로 하여 ADCC (항체-의존적 세포 매개성 세포독성) 및 CDC (보체-의존적 세포독성) 에 직접적으로 관여한다. 보체 활성화 (CDC) 는 보체 인자 C1q 를 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 Fc 부분에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 특정 조건에 의존적이지만, Fc 부분에서의 정의된 결합 부위에 의해 C1q 에 대한 결합이 유발된다. 이러한 결합 부위는 기술적 수준에 있어서 알려져 있으며 예를 들어 Boakle et al., Nature 282 (1975) 742-743, Lukas et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse and Cebra, Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184, Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan et al., Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0307434 에 의해 기재되고 있다. 이러한 결합 부위는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 이다 (번호화는 카밧의 EU 색인에 따름, 하기 참조). 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3 의 항체는 통상 보체 활성화 및 C1q 및 C3 결합을 나타내는 한편, IgG4 는 보체 시스템을 활성화시키지 않으며 C1q 및 C3 에 결합하지 않는다.
본 발명에 따른 항체는 재조합 수단에 의해 생성된다. 따라서, 본 발명의 한 양상은 본 발명에 따른 항체를 인코딩하는 핵산이고, 추가의 양상은 본 발명에 따른 항체를 인코딩하는 상기 핵산을 포함하는 세포이다. 재조합체 생성 방법은 기술적 수준에 있어서 널리 알려져 있으며, 원핵생물 및 진핵생물 세포에서의 단백질 발현과 그 이후의 항체 단리, 및 약학적으로 허용가능한 순도로 통상적으로 정제하는 것을 포함한다. 숙주 세포에서 상술한 바와 같이 항체를 발현시키기 위해서, 각각의 변형된 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산이 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 (HEK293 EBNA 포함) 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 대장균 (E.coli) 세포와 같은 적절한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현이 수행되며, 세포로부터 (용해 후 세포 또는 상청액) 항체가 회수된다. 항체의 재조합체 생성을 위한 일반적인 방법은 기술적 수준에 있어서 널리 알려져 있으며, 예를 들어 Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 의 종설 (review articles) 에서 기재되어 있다.
본 발명에 따른 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로오스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리된다. 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA 및 RNA 는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 및 RNA 의 근원으로서 역할할 수 있다. 단리되고 나면, DNA 는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있는데, 이는 이후 HEK 293 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포와 같은, 다르게는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포 내로 트랜스펙션되어 숙주 세포에서 재조합 단일클론 항체의 합성이 이루어진다.
본 발명에 따른 항체의 아미노산 서열 변이체 (또는 돌연변이체) 는 적절한 뉴클레오티드 변화물을 항체 DNA 에 도입하거나, 뉴클레오티드를 합성함으로써 제조된다. 이러한 변형이 수행될 수 있으나, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 매우 제한된 범위 내에서만 수행될 수 있다. 예를 들어, 변형은 IgG 아이소타입 및 항원 결합과 같은 상기 언급한 항체 특징을 변경시키지 않지만, 재조합체 생성 수율, 단백질 안정성을 향상시키거나 정제를 촉진시킬 수 있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 항체가 생성되도록 조작될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 나타낸다. 한 구현예에서 HEK293 세포 및 CHO 세포가 숙주 세포로서 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물" 은 상호교환가능하게 사용되며 이러한 모든 지정은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "트랜스펙션물" 및 "트랜스펙션된 세포" 는 제 1 대상 세포 및 이동 수에 관계없이 이로부터 유래한 배양물을 포함한다. 또한, 고의의 또는 우연한 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 내용물에 있어서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것이 이해된다. 본래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
NS0 세포에서의 발현은 예를 들어 Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 에 의해 기재되어 있다. 일시적 발현은 예를 들어 Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 에 의해 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87 에 의해 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템 (HEK 293) 은 Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83, 및 Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 에 의해 기재되어 있다.
원핵생물에 적합한 조절 요소 서열은 예를 들어, 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.
항체의 정제는 세포 성분 또는 기타 오염물, 예를 들어 기타 세포 핵산 또는 단백질을 표준 기술 (알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로오스 겔 전기영동 및 당업계에 널리 알려져 있는 다른 방법을 포함함) 에 의해 제거하기 위해 수행된다. Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 을 참조한다. 상이한 방법이 잘 확립되어 있으며 단백질 정제에 널리 보급되어 사용된다 (예컨대 미생물 단백질로의 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환), 친황성 (thiophilic) 흡착 (예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드로의), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 (aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐붕산으로의), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질로의), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동)) (Vijayalakshmi, M.A. Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학 담체" 는 생리학적으로 혼화가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여 (예를 들어 주사 또는 주입에 의한) 에 적합하다 .
본 발명의 조성물은 당업계에 알려져 있는 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 숙련된 기술자에게 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 가변적일 것이다. 본 발명의 화합물을 특정 경로의 투여에 의해 투여하기 위해서, 상기 화합물을 이의 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅하거나, 상기 화합물을 이와 함께 동시 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 적절한 담체, 예를 들어 리포솜, 또는 희석제 중에서 대상에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 염수 및 완충제 수용액을 포함한다. 약학 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제를 사용하는 것은 당업계에 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된" 은 장 및 국소 투여 외의 투여 방식 (통상 주사에 의한) 을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 낭내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 낭하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내측 주사 및 주입을 비제한적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 암은 증식성 질환, 예컨대 림프종, 림프성 백혈병, 폐암, 비-소세포 폐 (NSCL) 암, 세기관지 폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부성 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위 암, 위암 (stomach cancer), 위장암 (gastric cancer), 결장암, 유방암, 자궁관 암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질 암종, 음문 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추 신경계 (CNS) 의 신생물, 척수 축추 (spinal axis) 종양, 뇌 줄기 신경아교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 샘종 및 유잉 육종 (상기 암 중 임의의 것의 불응형, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합 포함) 을 지칭한다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 상기 멸균 절차, 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함 모두에 의해 확실히 될 수 있다. 등장제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 작용제를 포함시킴으로써 주사가능한 약학 형태의 연장된 흡수가 야기될 수 있다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투약 형태로 제형화된다.
본 발명의 약학 조성물에서의 활성 성분의 실제 투약 수준은 환자에게 독성이 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 원하는 치료 반응을 얻기에 효과적인 활성 성분량이 수득되도록 가변적일 수 있다. 선택된 투약 수준은, 사용한 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용한 특정 화합물의 분비 속도, 치료 지속기간, 사용한 특정 조성물과 병용하여 사용한 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 병상, 일반적인 건강 상태 및 사전 병력 등의 의료계에 널리 알려져 있는 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 의존적일 것이다.
조성물은 멸균이어야 하며 상기 조성물이 주사기에 의해 전달가능한 정도로 유체여야 한다. 물에 추가로, 담체는 바람직하게는 등장 완충 염수액이다.
예를 들어 레시틴과 같은 코팅물의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "형질전환" 은 벡터/핵산을 숙주 세포 내로 이동시키는 방법을 지칭한다. 강력한 세포벽 배리어가 없는 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 예를 들어 [Graham and Van der Eh, Virology 52 (1978) 546ff] 에 의해 기재된 바와 같은 인산칼슘 침전법에 의해 트랜스펙션이 실행된다. 그러나, 예컨대 핵 주입 또는 원형질체 융합에 의해 DNA 를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 실제적인 세포벽 구조를 포함하는 세포 또는 원핵생물 세포가 사용되는 경우, 예를 들어 형질전환의 한 방법은 [Cohen, F. N, et al, PNAS. 69 (1972) 7110ff] 에 의해 기재된 바와 같은 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "발현" 은 핵산이 mRNA 내로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA (또한 전사체로도 지칭함) 가 이후 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 인코딩된 폴리펩티드를 집합적으로 유전자 산물로 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA 에서 유래하는 경우, 진핵생물 세포에서의 발현은 mRNA 의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"벡터" 는, 특히 자가-복제하는, 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 사이에 이동시키는 핵산 분자이다. 상기 용어는 DNA 또는 RNA 를 세포 내로 삽입 (예를 들어 염색체 통합) 하는데 주로 기능하는 벡터, DNA 또는 RNA 복제에 주로 기능하는 벡터, 및 DNA 또는 RNA 의 전사 및/또는 번역에 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 기재된 바와 같은 기능 중 하나 초과의 기능을 제공하는 벡터가 또한 포함된다.
"발현 벡터" 는 적절한 숙주 세포 내로 도입된 경우 폴리펩티드로 전사되고 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템" 은 통상 원하는 발현 산물이 산출되도록 기능할 수 있는 발현 벡터로 이루어지는 적합한 숙주 세포를 지칭한다.
하기의 실시예, 서열 목록 및 도면이 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 본질적인 범주는 첨부된 청구항에서 설명된다. 본 발명의 취지에 벗어나지 않고, 설명한 절차에 변형을 가할 수 있음이 이해된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 검출을 위해, 표지되지 않은, 시판되는 쥐과 IgG1 항체 (CEA: Abcam # 11330; DR5: R&D # MAB631; FAS: BD # 555671) 및 통상적인 염소 항 마우스 FITC 표지된 IgG (Serotec Star105F) 를 사용하는, 상이한 인간 세포주 (Lovo, OVCAR-3, AsPC-1, BxPC3, LS174T 및 MKN-45) 에서의 CEA, DR5 및 FAS 발현 수준의 FACS 결합 분석. 대조군으로서 세포만 함유하거나, 세포 및 2 차 항체 단독을 함유하는 샘플을 사용하였다. Lovo 세포를 제외한 모든 시험 세포주는 표면 상에서 유의량의 DR5 및 FAS 를 발현하였다. CEA 발현과 비교하여, 이는 다소 낮았다. 동일한 세포를 3 개 항원에 대한 다른 항체로 시험하는 경우, 또한 Lovo 세포는 DR5, FAS 및 CEA 가 발현되도록 FACS 검정에서 양성이었다 (데이터는 나타내지 않음).
도 2: 교차-결합 없이 용액 내에서 세포자멸사를 유도할 수 있는 시판되는 항체 (DR5: R&D # MAB631; FAS: Millipore / Upstate: CH11) 와 함께 4 시간 인큐베이션 후 상이한 세포주의 세포자멸사 유도 분석 (DNA 단편화 검정). 세포자멸사 검출을 위해, 히스톤-결합 DNA 단편화 분석용 Cell Death Detection ELISAPLUS 키트를 사용하였다. BxPC-3, Lovo 및 LS174T 세포에서 세포자멸사는 DR5 및 FAS 를 통해 명백히 유도될 수 있는 한편, ASPC-1 세포는 세포자멸사를 전혀 거치지 않았다. MKN-45 세포는 다른 세포주에 비해 DR5 에 대해 보다 저항성이었다.
도 3: ApomAb (백색 막대), 항 인간 Fc 항체와 교차-결합한 ApomAb (교차 무늬, 회색 막대), ApomAb_sm3e_A (흑색 막대) 및 ApomAb_sm3e_A1 (점각 회색 막대) 이중특이적 분자와 함께 4 시간 인큐베이션 후 LS174T 세포의 세포자멸사 유도 (DNA 단편화 검정). 이중특이적 항체를 통한 표적화된 과도 교차 결합 (hyper-cross linking) 에 의한 세포자멸사의 CEA 결합 의존적 유도를 검출할 수 있다. 이러한 효과는 ApomAb 의 교차 결합에 의해 유도된 세포자멸사와 동일한 범위 내에 있으며, 과량의 sm3e IgG 와 함께 사전-인큐베이션함으로써 완전히 무효화될 수 있다. 대조군 (세포 단독 또는 sm3e IgG) 으로는 세포자멸사가 관찰되지 않았으며, ApomAb 단독 또한 사용 농도 (1 ㎍/㎖) 에서 세포자멸사를 유도하지 않았다.
도 4: 세포자멸사 유도제와 함께 4 시간 동안 인큐베이션한 LS174T 세포로의 DNA 단편화 검정에서의, ApomAb (백색 막대) 단독 또는 항 인간 Fc 항체와 교차 결합한 ApomAb (교차 무늬, 회색 막대) 에 비한 상이한 ApomAb_sm3e 이중특이적 분자의 세포자멸사 유도 활성의 비교. 일반적으로, sm3e scFv 가 ApomAb 의 중쇄의 C-말단에 융합된 분자 (포맷 A, 흑색 막대) 는 sm3e scFv 가 ApomAb 의 경쇄의 C-말단에 융합된 구성물 (포맷 B, 회색 막대) 보다 더 활성인 것으로 보인다. 또한, 이황화물 안정화된 scFv 함유 이중특이적 항체 (포맷 A1, 점 회색 막대 및 B1, 소격자 막대) 는 야생형 scFv 를 갖는 분자에 대해 약간 하위에 있는 것으로 보인다.
도 5: Apomab (백색 막대), 항 인간 Fc 항체와 교차 결합한 ApomAb (교차 무늬, 회색 막대) 또는 ApomAb_PR1A3_이중특이적 구성물 (흑색 막대) 과 함께 4 시간 인큐베이션 후 LS174T 세포의 세포자멸사 유도 분석 (DNA 단편화 검정). 각각의 경우 세포자멸사 유도는 사용한 항체의 농도에 의존적이었다. ApomAb 단독은 또한 고농도에서 저수준의 세포자멸사를 유도했으나, 이는 교차 결합에 의해 유의하게 증가하였다. 이중특이적 ApomAb_PR1A3_A 분자는 2 차 교차 결합제 없이도, 교차 결합한 ApomAb 보다 심지어 더 활성이었다.
도 6: Apomab (백색 막대), 항 인간 Fc 항체와 교차 결합한 ApomAb (회색 막대) 또는 ApomAb_PR1A3_이중특이적 구성물 (흑색 막대) 과 함께 4 시간 인큐베이션 후 Lovo 세포의 세포자멸사 유도 분석 (DNA 단편화 검정). 각각의 경우 세포자멸사 유도는 사용한 항체의 농도에 의존적이었다. ApomAb 단독은 또한 고농도에서 저수준의 세포자멸사를 유도했으나 (기재된 바와 같이), 이는 교차 결합에 의해 유의하게 증가하였다. 이중특이적 ApomAb_PR1A3_A 분자는 교차 결합한 ApomAb 만큼 그 스스로 활성이었다.
도 7: 상이한 세포자멸사 유도 이중특이적 항체와 함께 4 시간 인큐베이션 후 LS174T 세포에서의 DNA 단편화의 비교. 사용한 분자는 PR1A3 scFv (wt = A / B 또는 이황화물 안정화체 = A1 / B1) 가 중쇄의 C-말단 (A, 교차 무늬 회색 막대) 또는 경쇄 (B, 점 막대) 에 융합되는 ApomAb_PR1A3 이중특이적 분자이다. 이러한 경우 scFv 의 융합 위치가 세포자멸사 유도 면에 있어서 차이를 만드는 것으로 보이지는 않지만, 사용한 scFv 의 종류가 중요하며: 이황화물 안정화된 scFv 를 사용하는 것은 ApomAb 에 융합된 wt scFv 를 포함하는 구성물 (각각 흑색 및 회색 막대) 에 비해 세포자멸사 유도를 거의 완전히 무효화하였다. sm3e 에 비해 낮은 PR1A3 의 친화성으로 인해, 또한 세포자멸사의 전체적 유도는 PR1A3 함유 이중특이적 분자로 더 낮았다.
도 8: MKN-45 세포에서의 ApomAb - CEA (PR1A3) 이중특이적 구성물의 FACS 결합 분석. 야생형 (A) 또는 이황화물 안정화된 scFv (A1) 를 갖는 ApomAb_PR1A3 이중특이적 구성물의 비교. 두 이중특이적 구성물 모두 농도 의존적 방식으로 표적 세포에 결합하지만, 야생형 scFv 포맷에서의 PR1A3 를 함유하는 분자는 이황화물 안정화된 PR1A3 scFv 보다 크게 높은 친화성으로 항원에 결합한다.
도 9: FACS 결합 실험에 의한, NCCIT 및 재조합체, CRIPTO 발현 HEK293 세포에서의 CRIPTO, FAS 및 DR5 의 표면 발현 분석. NCCIT 세포는 FAS 를 발현하지 않으며, 단지 소량의 CRIPTO 만을 발현하지만 재조합체 HEK293 - CRIPTO 세포에 비해 유사량의 DR5 를 발현한다. HEK293 - CRIPTO 세포는 저수준의 FAS, 유의한 수준의 DR5 및 다소 고수준의 CRIPTO 발현을 나타낸다.
도 10: FAS (HFE7A IgG), 항 인간 Fc 항체를 통해 교차 결합한 FAS (HFE7A IgG) 및 FAS - CRIPTO 이중특이적 분자 (wt (A) 또는 이황화물 안정화된 (A1) CRIPTO scFv 가 HFE7A 의 중쇄의 C-말단에 융합되는 HFE7A_LC020 H3L2D1) 를 사용하는 세포자멸사 유도 비교 (HEK293-CRIPTO 세포에서의 DNA 단편화). FAS IgG 단독, CRIPTO IgG 단독 및 FAS - MCSP 이중특이적 분자는 세포자멸사를 유도하지 않은 한편, 교차 결합한 FAS 및 HFE7A - CRIPTO 이중특이적 분자는 4 시간 인큐베이션 후 DNA 단편화를 나타내었는데 이는 과량의 항 CRIPTO IgG 와 함께 사전-인큐베이션함으로써 또한 일부 무효화될 수 있다.
도 11: 재조합 HEK293-FAP (섬유모세포 활성화 단백질) 세포 (백색 막대) 와 비교한, 재조합 HEK293-CRIPTO 세포 (흑색 막대) 에서의 HFE7A-CRIPTO 이중특이적 분자에 의한 세포자멸사 유도 (DNA 단편화 검정). 두 세포주 모두에서 세포자멸사는 시판되는 세포자멸사 유도 항체 (CH11) 를 사용하여, 2 차, Fc 특이적 항체를 통해 교차 결합한 HFE7A IgG 로 유도될 수 있는 한편, HFE7A 단독으로는 사용 조건 하에서 세포자멸사가 유도되지 않았다. 이중특이적 FAS-CRIPTO 분자로의 세포자멸사 유도는 교차 결합한 HFE7A IgG 로의 유도보다 더 높았으나, 과량의 항 CRIPTO IgG 와 함께 사전-인큐베이션함으로써 완전히 저해되지 않을 수 있다. HEK293-FAP 세포에서 특정한 낮은 배경 세포자멸사가 관찰될 수 있는데, 이는 또한 과량의 CRIPO IgG 에 의해서는 보다 잘 수행되지 않을 수도 있다. 심지어 음성 대조군 분자 (이황화물 안정화된 MCSP 특이적 scFv 가 HFE7 의 중쇄의 C-말단에 융합된) 는 HEK293-FAP 세포에서 낮은 정도의 세포자멸사를 나타내었다.
도 12: 2 개의 상이한 항체를 사용하여 상이한 세포주 (MCF7, SkBr3, A431, A549, HCT-116 및 U87-MG) 에서 MCSP 의 표면 발현 수준을 측정하기 위한 FACS 결합 분석. 두 항체 모두를 사용하여, 동일한 수준의 MCSP 발현이 검출될 수 있었으며, 이는 U87-MG 가 최고 MCSP 발현을 나타내고, HCT-116 은 낮은 MCSP 발현을 가진 한편 모든 다른 시험 세포주는 MCSP 음성이었다는 것을 표시한다 (비염색 세포와 같은 음성 대조군의 범위에서).
도 13: 가용성 및 교차 결합한 ApomAb (흑색 막대) 및 HFE7A (회색 막대) 및 관련 대조군 분자 (항 FAS_CH11, 항 DR5_R2 및 항 Fc-IgG 단독) 를 사용하는 U87-MG (A) 및 HCT-116 (B) 세포의 세포자멸사 능력 평가. HCT-116 세포에서 세포자멸사가 4 시간 후 DR5 수용체를 통해서만 유도될 수 있으며 FAS 를 통해서는 유도되지 않지만, 이는 U87-MG 세포에 대해서는 상이하였다. 여기서, 유의한 세포자멸사는 24 시간 후에만 관찰될 수 있었다. U87-MG 에서의 HCT-116 세포와 반대로, 가교 결합한 HFE7A 에 의한 세포자멸사 유도는 가교 결합한 ApomAb 의 경우보다 2 배 효과적이었다. 대조군 항체는 심지어 더 효과적인 경우 용액 내에서 세포자멸사를 부여한다.
도 14: 야생형 (A 포맷) 또는 이황화물 안정화된 MCSP scFv (A1 포맷) 이 ApomAb 의 중쇄의 C-말단에 융합되는 이중특이적 HFE7A-MCSP 항체 (mAb 9.2.27) 와 함께 24 시간 인큐베이션 후 U87-MG 신경아교종 세포에서의 세포자멸사 유도 분석. 이러한 경우 이황화물 안정화된 scFv 를 함유하는 구성물은 유의하게 높은 세포자멸사를 입증하였는데, 상기 분자는 야생형 scFv 을 함유한다 (DNA 단편화에 의해 측정된 세포자멸사 양은 상대적으로 낮았음에도 불구하고). 그러나, 두 경우 모두에서 세포자멸사 유도는 과량의 경쟁 MCSP IgG 와 함께 세포를 사전-인큐베이션함으로써 완전히 무효화될 수 있다.
도 15: 인간 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP) 의 발현 수준에 대한 두 가지 상이한 세포주 (SW872 및 GM05389) 의 FACS 결합 분석 (A). 상이한 농도의 항 FAP 항체로 측정된 형광 세기를 세 등급 범위에 걸쳐 나타낸다 (흑색, 회색 및 교차 무늬 막대). 2 차 항체 및 세포 단독으로서의 음성 대조군 반응을 각각 점각 및 백색 막대로 나타내었다. GM05389 세포가 배경 초과인 모든 시험 항체 농도에 걸쳐 FAP 의 발현을 입증한 한편, SW872 세포로는 FAP 발현은 사용한 최고 항체 농도 (10 ㎍/㎖) 로만 검출될 수 있었는데, 이는 이들 세포가 FAP 기준 결합/세포자멸사 유도 실험에 대해 적합하지 않다는 것을 표시한다. 추가로, 상기 세포주는 ApomAb 매개 세포자멸사를 거의 거치지 않는다는 것이 나타난다 (B). ApomAb 단독 또는 또다른, 시판되는 항 DR5 항체는 관련 DNA 단편화를 유도하지 않았다. ApomAb 가 항 인간 Fc 항체와 교차 결합하는 경우에만, 검출가능한 저수준의 세포자멸사 유도가 관찰될 수 있다.
도 16: 두 세포주 모두 (흑색 막대) 의 동시-배양시 세포자멸사 유도와 비교한, GM05389 (백색 막대) 및 MDA-MB-231 (회색 막대) 단독의 세포자멸사 유도 분석. 모든 세포주에서 ApomAb 단독은 단지 작은 효과만을 가진 한편, ApomAb 의 교차 결합은 MDA-MB-231 세포에서 유의한 세포자멸사 유도를 야기하였다. 사멸 수용체 아고니스트성 이중특이적 구성물 (ApomAb - FAP) 로의 DNA 단편화 유도는 두 세포주 모두가 동시-배양되는 경우 고수준으로만 발생하였다. 여기서 ApomAb 단독의 교차 결합은 동일한 범위 내에서 세포자멸사를 증가시키지 않았는데, 이는 세포자멸사의 최적 유도를 위하여 두 개의 세포주가 필요하다는 것을 표시한다 (첫 번째 것은 사멸 수용체를 발현하고 두 번째 것은 FAP 항원을 발현함).
도 17: scFab 가 ApomAb 의 중쇄의 C-말단에 융합되는 4 가 이중특이적 ApomAb_PR1A3_scFab 분자 (A 포맷) 로의 MKN-45 세포에서의 세포자멸사 유도 검정 결과 (24 시간). 세포자멸사 유도를 ApomAb (+/- 10 배 과량의 항-인간-Fc-항체와 교체 결합) 및 음성 대조군과 비교하였다. 모든 구성물을 0.1 및 1.0 ㎍/㎖ 의 농도에서 사용하였다. 사용한 검정 조건 하에서 이중특이적 ApomAb_PR1A3_scFab 구성물 (흑색 막대) 은 세포자멸사의 농도 의존적 유도를 명백히 나타내는데, 이는 과도 교차 결합한 ApomAb (회색 막대) 로 관찰된 바와 동일한 범위 내에 있으며 ApomAb 단독 (교차 무늬 막대) 의 경우보다 유의하게 더 높다.
도 18: 이중특이적 3 가 구성물 (ApomAb_sm3e_scFab; 2x1 결합가, 흑색 막대) 및 음성 대조군과 비교한, ApomAb (단독, 교차 무늬 막대 또는 과도 교차 결합, 회색 막대) 에 의한 LS174T 세포의 세포자멸사 유도 분석. 0.1 및 1.0 ㎍/㎖ 농도의 구성물을 사용하여 검정을 4 시간 동안 수행하였다. 이중특이적 ApomAb_sm3e_scFab 구성물은 과도 교차 결합한 ApomAb 와 동일한 범위 내에서 농도 의존적 방식으로 세포자멸사를 유도할 수 있다.
도 19: 인간 결장 암종 세포주 LS174T 를 사용하는, 비장내 전이 모델에서의 비히클 대조군과 비교한, ApomAb 및 이중특이적 DR5 아고니스트성 항체 ApomAb_sm3e_A1 의 생체내 효능 분석. 각각 10 마리 마우스의 무작위군을 PBS (흑색 선, ApomAb (흑색 원형) 또는 ApomAb-sm3e_A1 이중특이적 항체 (흑색 사각형) 로 처리하였다. 생존율을 실험의 시간 추이에 대해 점으로 표시하였다.
실시예
실시예
1: 인간 사멸 수용체 5 및 인간
CEA 를
인지하는
이중특이적
항체의 설계
하기에서, 펩티드 링커를 통해 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된 2 차 항원 (인간 암 태아성 항원, CEA) 에 결합하는 2 개의 단일 사슬 Fv 단편과 조합된 1 차 항원 (인간 사멸 수용체, DR5) 에 결합하는 전장 항체를 포함하는 4 가 이중특이적 항체를 기재하였다. 상기 단일 사슬 Fv 에서의 링커 및 항체 도메인은 하기의 배향을 갖는다: VH - 링커 - VL.
DR5 인지 항체의 가변 경쇄 및 중쇄로서, US2007/0031414 A1 에서의 Adams 에 의해 기재된 ApomAb 항체 서열을 사용하였다.
CEA 항원 결합 scFv 에 대해서는 PR1A3 (Bodmer et al., 1999; US5965710) 및 sm3e (Begent et al., 2003; US7232888 B2) 의 가변 경쇄 및 중쇄의 서열을 사용하였다.
유전자 합성 및 재조합 DNA 기술에 의해, 상응하는 CEA 항체의 VH 및 VL 을 글리신-세린 (G4S)4 링커에 의해 연결하여, (G4S)n 커넥터 (n = 2 또는 4) 에 의해 ApomAb IgG1 의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된 단일 사슬 Fv 를 생성시켰다.
'야생형' scFv 에 추가로, 가변 중쇄에서의 카밧 위치 44 및 가변 경쇄에서의 카밧 위치 100 에서 시스테인 잔기를 포함하는 변이체를 제조하여, VH 와 VL 사이에 사슬간 이황화물 다리를 생성시켰다. 이는 scFv 분자를 안정화시켜 잠재적 응집 경향을 최소화하기 위한 것이었다.
예를 들어 인간 Fcγ IIIa 로서 Fcγ 수용체를 통한 이중특이적 분자의 비특이적 교차 결합을 방지하기 위해서, 이중특이적 분자의 IgG 부분의 Fc 부분에서의 2 개 아미노산을 바꾸었다. 위치 지정 돌연변이유발에 의해 Fc 부분에서의 위치 234 및 235 에서의 2 개 류신 잔기를 알라닌 잔기로 교체하였다. 이러한 이른바 LALA 돌연변이는 Fc - FcR 상호작용을 무효화하는 것으로 기재되어 있다 (Hessell et al., Nature 449 (2007), 101 ff).
모든 이들 분자는 재조합적으로 발현되고, 생성되고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 이후 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 표준 항체 정제 기술을 사용하여 정제된다. 상기 분자를 발현 수율, 안정성 및 생물학적 활성 면에 있어서 분석하였다.
ApomAb - CEA 조합으로 이루어지는 상이한 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체 분자의 요약을 하기 표 1 에 나타내었다. 상이한 분자 설계의 설명은 분자 명칭으로부터 결정될 수 있는데, 첫 번째 부분은 사멸 수용체 표적화 IgG 의 특징을 나타내고 (예를 들어 ApomAb), 두 번째 명칭은 CEA 표적화 scFv 의 근원을 설명하며 (예를 들어 PR1A3 또는 sm3e), 문자 및 숫자 조합은 scFv 의 융합 위치 및 이황화물 안정성 특성을 설명한다.
[표 1]
인간 DR5 및 인간 CEA 를 표적화하는 상이한 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체의 그의 관련 특징으로의 설명
실시예
2:
이중특이적
사멸 수용체
아고니스트성
항체의 발현 및 정제
각각의 이중특이적 항체에 대한 경쇄 및 중쇄에 대한 개별적인 발현 벡터를 구축하였다. 이들 벡터는 원핵생물 선별 마커, 포유류 세포에서의 유전자 발현을 위한 조절 요소 및 복제 기원, oriP (EBNA 함유 HEK293 세포에서의 플라스미드의 자율 복제를 위한 엡스테인 바 (Ebstein-Barr) 바이러스로부터의) 를 포함한다. 상기 플라스미드를 대장균 (E. coli) 에서 증식시키고, 정제하고, 일시적 발현을 위한 인산칼슘 매개 침전법을 사용하여 HEK293 EBNA 세포 내로 동시-트랜스펙션하였다. 7 일 후 세포 배양물 상청액을 수확하고 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다. 정제된 분자를 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (동결-해동 단계 전 및 후) 및 SDS-PAGE 분석 (비환원 및 환원 조건 하) 에 의해 동질성, 안정성 및 무결성에 대해 분석하였다.
[표 2]
상이한 사멸 수용체 아고니스트성 이중특이적 항체의 정제 수율 및 단량체 함량의 요약
모든 분자는 추가의 분석 및 시험을 위해 충분량 및 적절한 품질로 생성되고 정제될 수 있다. 정제 후 수율은 일부 분자에 대해 일부 편차와 함께, 약 5 mg/ℓ 범위 내에 있었다. 예를 들어 ApomAb-sm3e-B1 에 대한 수율은 유의하게 낮은 한편 (2.19 mg/ℓ), 상응하는 구성물, ApomAb-PR1A3_B1 은 심지어 11 mg/ℓ 초과로 정제될 수 있었다.
동결/해동 및 항체 농도 증가 후 응집물 형성 측정은, 분자에 따라, 사슬간 이황화물 다리를 통한 안정화가 응집물이 형성되는 경향에 대해 유익한 효과를 가질 수 있다는 것을 나타내었다. 일반적으로 이황화물 안정화는 적어도 높은 농도에서 높은 단량체 함량의 분자를 산출시켰다 (표 3).
[표 3]
단백질 농도와 관련된 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체의 응집물 형성
응집물을 형성하는 경향은 scFv 의 이황화물 안정화에 의존적일 뿐 아니라 사용한 항원 결합 scFv 에도 의존적이다. 표 3 으로부터, PR1A3 scFv 를 함유하는 이중특이적 ApomAb 분자가 단백질 농도 증가시 유의한 응집을 거친다는 것이 명백하였다. 3 mg/㎖ 초과의 농도에서, 단지 80% 의 물질만이 단량체로서 나타난 한편, 2 개의 추가적인 시스테인 잔기 (카밧 번호화에 따라 VH44/VL100) 의 도입 후 이들 분자는 사용 농도에서 응집물을 형성하지 않았다.
sm3e scFv 를 함유하는 이중특이적 ApomAb 분자로의 응집물 형성 정도는 두드러지는 정도는 아닌데, 이는 단량체 함량이 각각 이황화물 안정화 부재 하에는 여전히 약 94% 이고 이황화물 안정화 존재 하에는 97% 이기 때문이다.
실시예
3: 사멸 수용체
이중특이적
DR5
-
CEA
항체 분자에 의한
세포자멸사
유도
인간 DR5 사멸 수용체 아고니스트성 항체 ApomAb 는 결장암 세포주 LS180 또는 Colo-205 와 같은 DR5 발현 종양 세포의 세포자멸사를 유도한다. 시험관내의 경우, ApomAb 스스로는 ApomAb 의 인간 Fc 부분에 결합하는 항체와 ApomAb-결합 DR5 와의 교차 결합에 의해 극적으로 증가할 수 있는 유의한 세포자멸사를 매개한다. 이러한 세포자멸사 유도는 또한, 가장 바람직하게는 인간 Fc-수용체를 통한 교차 결합 사건에 의해, ApomAb 가 유의한 효능을 나타내는 상이한 종양 모델에 대해 나타날 수 있는 생체내의 경우로 환원된다 (Jin et al., 2008; Adams et al., 2008). DR5 의 종양 부위 표적화된 교차 결합에 대한 DR5 - CEA 이중특이적 항체, 이후 세포자멸사의 유도의 가능성을 평가하기 위해서, 세포자멸사 매개에 있어서의 ApomAb - CEA 이중특이적 분자의 활성을 시험관내 분석하였다.
DR5 - CEA 이중특이적 항체 분자가 표적 세포의 종양 항원 결합 의존적 세포자멸사를 유도할 수 있는지를 측정하기 위해서, 세포자멸사의 측정으로서 사멸 수용체 아고니스트성 이중특이적 항체와 인큐베이션한 후 종양 세포에서의 DNA 단편화를 세포 사멸 검출 ELISA 검정을 사용하여 분석하였다.
어떤 세포주가 세포자멸사 유도를 유발하는 DR5 의 항원 결합 의존적 교차 결합을 측정하기에 적합한지 파악하기 위해서, 여러 상이한 종양 세포주를 DR5, FAS 및 CEA 의 표면 발현에 대해 분석하였다.
사용한 모든 표적 세포주를, 하기와 같이 세포자멸사 검정을 수행하기 전에 종양-관련 항체 및 FAS 또는 DR5 사멸 수용체의 상대적 발현 수준에 대해 분석하였다.
세포의 수 및 생육성을 측정하였다. 이를 위해, 착생하여 생장하는 세포를 세포 해리 완충액 (Gibco - Invitrogen # 13151-014) 으로 분리시켰다. 세포를 원심분리 (4 분, 400 x g) 로 수확하고, FACS 완충액 (PBS / 0.1% BSA) 으로 세척하고, 세포수를 FACS 완충액 중 1.111 X 106 세포/㎖ 로 조정하였다. 180 ㎕ 의 상기 세포 현탁액을 96 웰 원형 바닥 플레이트의 웰 당 사용하여 웰 당 2 x 105 세포가 되게 하였다. 상기 세포를 적절히 희석된 1 차 항체와 함께 30 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 원심분리 (4 분, 400 x g) 로 수확하고, 상청액을 완전히 제거하고, 150 ㎕ 의 FACS 완충액으로 세포를 1 회 세척하였다. 세포를 150 ㎕ FACS 완충액으로 재현탁하고, 암환경에서 30 분 동안 4℃ 에서 2 차 항체와 함께 인큐베이션하였다 (미표지된 1 차 항체를 사용한 경우). FACS 완충액으로의 2 회 세척 단계 후, 세포를 200 ㎕ 의 FACS 완충액으로 재현탁하고 HTS FACSCanto II (BD, Software FACS Diva) 에서 분석하였다. 대안적으로는, 세포를 FACS 완충액 중 2% PFA (파라포름알데히드) 200 ㎕ 로 20 분 동안 4℃ 에서 고정시키고, 이후 분석할 수 있다. 모든 검정을 삼중으로 수행하였다.
도 1 에서, CEA, DR5 또는 FAS 를 인지하는 세 가지 특이적 항체를 갖는 상이한 종양 세포주의 FACS 결합 분석 결과를 나타내었다. Lovo 세포를 제외하고, 모든 다른 시험 세포주는 상이한 수준으로 시험 항원을 발현하였다. CEA 발현은 MKN-45 세포에서 가장 높았으며 OVCAR-3, AsPC-1, BxPC-3 및 LS174T 에서 대체로 유사하였다. DR5 발현 면에 있어서, LS174T 가 가장 낮은 DR5 발현 수준을 갖는 한편, AsPC-1 및 BxPC.3 세포는 다른 세포주 이후 OVCAR-3 및 MKN-45 에 비해 대부분의 수용체를 발현하였다. FAS 발현에 관해, 세포주는 상이하였으나 모두 유의한 FAS 발현을 나타내었다. 이 검정에서 음성이었던 Lovo 세포를 이후 CEA, DR5 및 FAS 에 대해 상이한 항체로 분석하였는데, 이들 또한 시험 항원의 유의한 발현을 나타내었다 (데이터는 나타내지 않음).
유도된 세포자멸사의 측정을 위해서, Roche 사의 Cell Death Detection ELISA PLUS 키트를 사용하였다. 간단히 하면, 96-웰 플레이트의 웰 당 104 세포 (분리, 및 세포 수 및 생육성 측정 후) 를 200 ㎕ 의 적절한 배지에 시딩하고, 37℃ 에서 5% CO2 분위기 하에 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 세포자멸사 유도 항체, 대조군 항체 및 기타 대조군을 적절한 농도로 함유하는 신선한 배지로 교체하였다.
이중특이적 항체를 최종 농도 0.01 - 10 ㎍/㎖ 로 사용하고; 대조군 항체를 0.5 ㎍/㎖ 로 사용하고, 교차 결합 항체를 100 ㎍/㎖ 로 사용하였다. 경쟁 항체를 100 배 과량으로 사용하였다.
세포를 4 - 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션하여 세포자멸사를 유도하였다. 세포를 원심분리 (10 분, 200 x g) 로 수확하고 200 ㎕ 의 용해 완충액 (키트에 의해 공급됨) 에서 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 미손상 세포를 원심분리 (10 분, 200 x g) 에 의해 침전시키고, 20 ㎕ 의 상청액을 세포자멸사 유도에 대한 제조사의 지시사항에 따라 분석하였다.
세포주 집합을 또한, 용액 내에서 이미 사멸 수용체에 교차 결합하는 것으로 알려져 있는 DR5 또는 FAS 에 대한 시판 항체와 함께 인큐베이션하여, 세포자멸사를 거치는 능력에 대해 분석하였다 (도 2).
여기서, 세포주 사이의 유의한 차이가 도 2 에 나타낸 바와 같이 세포자멸사 유도 면에 있어서 관찰되었다. MKN-45 및 BxPC-3 에서 DR5 및 FAS 를 통한 세포자멸사가 유사하였으나 (MKN-45 에서 DNA 단편화 값이 BxPC-3 의 단지 50% 에 도달하였음에도 불구하고), LS174T 및 Lovo 세포에서 세포 세포자멸사는 FAS 결합 항체보다 DR5 교차 결합 항체로 더 양호하게 유도될 수 있었다. LS174T 세포에서 DR5 교차 결합을 통한 세포자멸사 유도는 FAS 교차 결합을 통한 세포자멸사의 약 2 배만큼 효과적이었다. Lovo 세포에서 세포자멸사에 있어서의 이러한 차이는 심지어 4 배였다. ASPC-1 세포는 사멸 수용체 교차 결합을 통한 세포자멸사 유도에 대해 매우 저항성이었다. 이러한 결과를 근거로, 두 세포주 Lovo 및 LS174T 를 선택하여 DR5 의 종양 항원 표적화 교차 결합에 의한 세포자멸사 유도를 분석하였다.
ApomAb 또는 가교 결합한 ApomAb 의 효과와 비교하여, 이중특이적 DR5 - CEA 분자 (ApomAb - sm3e) 로의 처리시 LS174T 세포에서의 세포자멸사 유도 결과를 도 3 에서 설명하였다. 사용한 검정 조건 하에서 (1 ㎍/㎖ 농도에서 4 시간 인큐베이션) ApomAb 단독 또는 sm3e (IgG1 포맷으로의) 는 검출가능한 DNA 단편화를 나타내지 않은 한편 ('세포 단독' 값으로 정규화됨), 이중특이적 ApomAb-sm3e 분자 (야생형 (포맷 A) 또는 이황화물 안정화된 (포맷 A1) scFv) 는 과도 가교 결합한 ApomAb 의 이론적 최대치와 비교가능한 유의한 세포자멸사 유도를 나타내었다. 두 이중특이적 분자는 매우 유사한 활성을 나타내었는데, 이는 사슬간 이황화물 삽입에 의한 분자의 안정화가 생물학적 활성에 영향을 주지 않는다는 것을 입증한다. 세포를 과량의 sm3e IgG (이중특이적 구성물에 비해 100 배 더 높은 농도) 와 함께 사전-인큐베이션했을 때, 세포자멸사가 더이상 유도될 수 없었는데, 이는 sm3e IgG 가 세포 표면 상 모든 CEA 항원을 차단하며 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 분자의 추가적인 결합을 방지한다는 것을 나타낸다. 이는 유도된 세포자멸사가 특이적으로는 종양 항원을 통한 DR5 사멸 수용체의 교차 결합에 의존적이라는 것을 입증한다.
도 4 에서, LS174T 세포의 세포자멸사 유도에서의 이중특이적 ApomAb - sm3e 구성물의 상이한 분자 포맷 사이의 비교 결과를 요약하였다. 세포 자멸사 유도를 4 시간 동안 1 ㎍/㎖ 의 농도에서 수행하였다. 다시금, sm3e scFv 가 ApomAb 중쇄의 C-말단에 융합된 이중특이적 ApomAb - sm3e 분자 (A 및 A1 포맷) 는 유의한 세포자멸사 유도를 입증하였는데, 이러한 경우, 이는 심지어 과도 교차 결합한 ApomAb 보다도 우수하였다. ApomAb 단독은 사용 조건 하에서 검출가능한 DNA 단편화를 유도하지 않았다. 2 개의 추가적인 이중특이적 구성물 (ApomAb 경쇄의 C-말단에 융합된 sm3e scFv, 야생형 = B 포맷 또는 이황화물 안정화체 = B1 포맷) 은 또한 높은 수준의 세포자멸사 유도를 나타내었으며, 이는 적어도 B 포맷에 대해서 교차 결합한 ApomAb 와 유사한 범위 내에 있었는데, 이것은 두 포맷 모두가 기본적으로 기능적이라는 것을 나타낸다. ApomAb 중쇄의 C-말단에 대한 scFv 의 융합은 경쇄에 대한 융합에 대해 약간 유리한 것으로 보인다. 도 4 에서 나타낸 결과와 비교하여, 이황화물-안정화된 분자는 또한 야생형 scFv 를 갖는 분자에 비해 약간 감소된 활성을 나타낼 수 있다.
상기 기재된 ApomAb - sm3e 구성물은 도 3 및 4 에서 나타낸 바와 같이 세포자멸사의 항원 의존적 특이적 유도 면에 있어서 매우 잘 작용하였다. 이러한 CEA 항체, sm3e 는 이의 항원에 대해 매우 높은 친화성을 나타낸다 (낮은 피코몰 범위). 이중특이적 DR5 - CEA 구성물로의 세포자멸사 유도 효과가 또한 종양 항원에 대해 낮은 결합 친화성을 갖는 분자로 매개될 수 있는지를 평가하기 위해서, 이와 유사한 추가적인 구성물을 생성시켰다. CEA 표적화 scFv 를, 마이크로몰 범위에서 CEA 에 대해 다소 낮은 친화성을 갖는 CEA 항체 PR1A3 의 서열을 사용하여 조작하였다. 이러한 항체의 평가를 위해, PR1A3 scFv (야생형 또는 이황화물 안정화된) 를 ApomAb IgG 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합시킨 이중특이적 구성물을 생성시켰다. 생성된 분자의 명칭은 이미 기재된 바와 유사하다: ApomAb_PR1A3_A / A1 / B / B1 (상기 A 및 A1 은 중쇄의 C-말단에 대한 융합을 나타내고, B 및 B1 은 경쇄의 C-말단에 대한 융합을 나타냄). A 및 B 는 야생형 scFv 를 포함하는 한편, A1 및 B1 은 이황화물 안정화된 scFv 를 나타낸다.
도 5 에서, ApomAb, 교차 결합한 ApomAb 및 ApomAb_PR1A3 이중특이적 항체 (ApomAb 중쇄의 C-말단에 융합된 야생형 PR1A3 scFv) 에 의한 LS174T 세포에서의 세포자멸사의 유도는 0.01 내지 10.0 ㎍/㎖ 의 농도 범위에 걸쳐 나타났다. ApomAb 스스로는 특정 정도의 농도 의존적 세포자멸사 유도를 나타내었는데, 이는 항 인간 Fc 항체와 ApomAb 와의 교차 결합에 의해 유의하게 증가될 수 있었다. 이중특이적 ApomAb-PR1A3 분자는 또한 10.0 ㎍/㎖ 의 농도에서의 세포자멸사의 농도 의존적 유도가 동일 농도에서의 교차 결합한 ApomAb 의 경우보다 심지어 더 높다는 것을 입증하였는데, 이는 이러한 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체 포맷으로 가장 높은 친화성 종양 항원 결합체를 사용하는 것이 세포자멸사 유도 면에 있어서 양호한 시험관내 효능을 얻기 위해 절대적으로 필요한 것은 아니라는 것을 나타낸다.
DR5 - CEA 이중특이적 분자와 함께 인큐베이션시 세포자멸사 유도의 관찰된 효과가 다른 세포주에도 적용될 수 있는지 조사하기 위해서, 도 6 에서 나타낸 바와 같은 유사한 실험을 또다른 결장암 세포주인 Lovo 세포를 사용하여 수행하였다.
ApomAb 및 교차 결합한 ApomAb 를 통한 세포자멸사 유도에 비교한, 사멸 수용체 아고니스트성 이중특이적 분자 ApomAb_R1A3_A (DR5-CEA) 를 사용하는 Lovo 세포에서의 세포자멸사 유도의 결과를 도 6 에 나타내었다. 모든 구성물에 대해서 세포자멸사의 농도 의존적 유도가 관찰되었다. 여기서 ApomAb 단독은 10 ㎍/㎖ 의 농도로 사용한 경우 교차 결합한 ApomAb 활성의 약 20% 에 도달하였다. 이 농도 미만에서 세포자멸사 유도는 교차 결합한 ApomAb 에 비해 매우 낮았다. 임의의 교차 결합 분자의 부재 하에, ApomAb_PR1A3 이중특이적 항체는 과도 교차 결합 ApomAb 항체와 동일한 DNA 단편화 유도를 나타내었는데, 이는 사멸 수용체 아고니스트성 항체를 사용하는 세포자멸사 유도 효과가 모든 세포자멸사 적격 세포주에 대해 적용될 수 있는 일반적인 현상이라는 것을 입증한다.
도 7 에서, 상이한 ApomAb - PR1A3 및 ApomAb - sm3e 구성물 사이의 비교 결과를 나타내었다. 여기서, 1 ㎍/㎖ 농도로 4 시간 인큐베이션한 후 LS174T 세포에서의 세포자멸사 유도를 요약하였다. 결과로부터, CEA 항원에 대한 친화성이 사멸 수용체 교차 결합을 통한 세포자멸사 매개에 있어서 실제로 역할할 수 있다는 것이 꽤 명백해졌다. 저친화성 결합체에 비해, 고친화성 CEA 결합체를 함유하는 구성물로의 세포자멸사 유도에서는 명백한 차이가 존재한다. ApomAb - PR1A3 은 ApomAb - sm3e 에 비해 LS174T 세포에서의 세포자멸사 유도의 단지 1/3 만을 나타내었다. 또한, 세포자멸사 유도의 능력에 있어서 또한 반영되는 상이한 분자에서의 고유의 차이가 존재하는 것으로 보인다. PR1A3 scFv 가 ApomAb 에 융합되는 경우, scFv 가 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합되는 분자 사이에는 활성에 있어서 차이가 없다. 두 분자 모두 동일한 세포자멸사 유도를 나타내었다. 이와 반대로, sm3e scFv 를 함유하는 구성물은 상이하게 거동한다. 여기서, 중쇄의 C-말단에 대한 scFv 의 융합은 경쇄의 C-말단에 대한 융합보다 우수하다.
두 일련의 구성물 사이의 추가적인 차이는 scFv 의 이황화물 안정화의 상이한 효과가 존재한다는 사실이다. 이황화물 안정화된 sm3e scFv 함유 구성물이 세포자멸사 유도에 관련하여 영향을 주지 않지만, 이는 PR1A3 scFv 에 대해서는 반대이다. 이황화물 안정화 형태로 사용되는 경우, 이는 유의한 세포자멸사 유도를 더 이상 나타내지 않는다.
실시예
4: 종양 항원으로서
FAS
(
CD95
) 및
CRIPTO 를
표적화하는
이중특이적
사멸 수용체
아고니스트성
항체의 생성 및 이들 분자의
시험관내
평가
CRIPTO 는 암 세포에서 과발현되지만 정상 세포에서는 적거나 없는 것으로 보고되는 GPI-고정 성장 인자이다. CRIPTO 는 결장 종양 및 간 전이에서 상향 조절되는 것으로 발견되었다. EGF 패밀리의 일원으로서, 이는 종양 세포의 증식, 전이 및/또는 생존에서 역할하는 자가분비 성장 인자인 것으로 고려된다. 상기 성장 인자는 여러 잠재적 수용체 또는 동시-수용체를 통한 많은 신호전달 통로를 활성화시킨다.
CRIPTO 가 사멸 수용체 아고니스트성 이중특이적 항체 접근에 대한 적합한 표적인지를 파악하기 위해서, 사멸 수용체로서 FAS 및 종양 항원으로서 CRIPTO 를 표적화하는 4 가, 이중특이적 항체를 생성시켰다. 이들 분자는 CRIPTO 표적화 scFv 가 중쇄의 C-말단에 융합된 전장 IgG1 항체 (FAS 를 인지함) 로 이루어진다.
분자의 FAS 표적화 IgG 부분의 중쇄 및 경쇄에 대해서 HFE7A 항체 서열을 사용하였는데 (Haruyama et al., 2002), 이는 CD95 에 대한 인간 / 마우스 교차-반응성 항체이다. CRIPTO scFv 는 면역화에 의해 생성된 인간화 항-CRIPTO 항체의 서열로부터 생성되었다 (LC020_H3L2D1). 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 scFv 를 생성시키고, 짧은 펩티드 링커에 의해 FAS IgG1 중쇄의 C-말단에 융합시켰다. scFv 에서의 단일 도메인 순서는 VH - (G4S)4 링커 VL 이다.
불행히도, CRIPTO 표적화에 사용할 수 있는 이용가능한 많은 적합한 세포주가 없다. 그러므로, 이중특이적 FAS / CRIPTO 항체를 통한 FAS 교차 결합 매개 세포자멸사 유도에 대한 표적 세포주로서 사용하는 이의 가능성에 대해 두 세포주를 평가하였다. 도 9 에서, NCCIT 및 재조합체, 인간 CRIPTO 발현 HEK 세포 (이하, HEK-CRIPTO 로 지칭함) 에서의 FAS, DR5 및 CRIPTO 의 표면 발현의 평가 결과를 나타내었다. HEK-CRIPTO 세포와 반대로, NCCIT 는 표면 상에 FAS 를 거의 발현하지 않고 매우 낮은 수준의 CRIPTO 만을 발현한 한편, DR5 발현은 정상으로 보인다. HEK-CRIPTO 세포가 높은 수준의 CRIPTO, 유의한 수준의 DR5 및 적합한 수준의 FAS를 발현하는 것과 반대로, 이는 FAS - CRIPTO 이중특이적 항체로의 세포자멸사 유도의 생체내 분석을 위해 이들 세포가 선택된 이유이다.
도 10 은 HFE7A, 교차 결합한 HFE7A 또는 HFE7A - CRIPTO 이중특이적 구성물을 사용하는 HEK-CRIPTO 세포에서의 세포자멸사 유도에 대한 시험관내 실험 결과를 요약하였다. HFE7A 또는 CRIPTO (LC020) 단독으로는 유의한 세포자멸사 유도가 없었다. 항 인간 Fc 항체와 HFE7A 와의 교차 결합은 이중특이적 HFE7A - CRIPTO 분자에서와 같이 높은 수준의 DNA 단편화를 일으킨다. 이러한 경우 야생형 CRIPTO scFv (HFE7A_LC020_A) 또는 이황화물 안정화된 scFv (HFE7A_LC020_A1) 를 함유하는 이중특이적 분자는 HFE7A 중쇄 C-말단에 융합되었다. 분자에 대한 이들 사이의 세포자멸사 유도에 있어서 차이는 거의 관찰될 수 없었다.
두 경우 모두에서, 과량의 CRIPTO IgG 와 함께 사전-인큐베이션하는 것은 세포자멸사 유도를 유의하게 감소시키지만, 이러한 감소는 완전한 것이 아니었다. 이의 이유는 명백하지 않으며, 평가할 필요가 있다. MCSP 표적화 scFv 가 HFE7A 중쇄의 C-말단에 융합된 유사한 구성물 (HFE7A_LC007_A1) 은 HEK-CRIPTO 세포의 어떠한 세포자멸사도 유도하지 않았는데, 이는 이중특이적 HFE7A - CRIPTO 분자로 관찰된 세포자멸사가 종양 항원 특이적이라는 것을 나타낸다.
HFE7A - CRIPTO 이중특이적 항체로 처리시 HEK-CRIPTO 와 재조합 인간 FAP (섬유모세포 활성화 단백질) 발현 HEK 세포 (HEK-FAP) 사이의 세포자멸사 유도의 비교 결과를 도 11 에 나타내었다. 용액 내에서 이미 세포자멸사를 부여하는 양성 대조군 항체와 함께 인큐베이션되거나 교차 결합한 HFE7A 로 처리되는 경우, 두 세포주 모두 세포자멸사를 거친다. 항 FAS 항체 HFE7A 는 스스로가 이들 세포주에서 세포자멸사를 매개하지 못하였다. 이중특이적 HFE7A - CRIPTO 분자는 HEK-CRIPTO 세포에서만 세포자멸사를 유도하였으나 대조군 HEK-FAP 세포에서는 세포자멸사를 유도하지 않았다. 낮은 수준의 DNA 단편화가 또한 HEK-FAP 세포에 존재하는 것으로 보이나, 관련이 없는 HFE7A - MCSP 대조군 분자 및 심지어는 항 CRIPTO 및 항 Fc 항체 단독으로도 또한 관찰될 수 있기 때문에, 이는 비특이적인 기저 활성이다. 도 10 에서 기재된 실험에서 관찰된 바와 같이 이러한 경우에도 또한 과량의 CRIPTO IgG 와 함께 사전-인큐베이션함에 의한 세포자멸사 저해는 완전하지 않았다.
실시예
5:
FAS
-
MCSP
이중특이적
사멸 수용체
아고니스트성
항체의 생성 및 이의
세포자멸사
유도 가능성 평가
종양 세포 표면 상에서 직접적으로 발현되고 디스플레이되는 항원 중에서, 세포자멸사를 유도하기 위한 사멸 수용체의 표적화된 교차 결합을 위해 또한 다른 항원이 고려되고 있다. 특히 이들은 스트로마 또는 신생혈관으로부터의 항원이다. 신생혈관으로부터의 항원에 대한 한 예는 흑색종 관련 콘드로이친 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 이다. MCSP 는 다수의 흑색종 세포 상에서 발현되지만 신경아교종 세포 및 신생혈관 상에서도 또한 발현된다. 인간 MCSP 를 표적화하는 여러 단일클론 항체가 기재된 바 있으나, 효능 손실로 인해 (예를 들어 ADCC 의 결여) 이들 중 암 치료요법에 사용하기에 적합한 것은 없었다. 그러므로, MCSP 항체는 종양 부위 표적화 세포자멸사를 매개할 수 있는 이중특이적 포맷으로 사용되는 경우 그 가치를 얻을 수 있다.
세포자멸사 유도와 관련된 동시 종양 / 신생혈관 표적화를 평가하기 위해서, MCSP 특이적 scFv (야생형 또는 이황화물 안정화된) 가 항 FAS 항체 HFE7A 의 C-말단에 융합된 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체를 생성시켰다. 이들 scFv 는 짧은 펩티드 링커를 통해 HFE7A 에 융합된다. MCSP 표적화 scFv 를 생성시키기 위한 가변 경쇄 및 중쇄의 서열을 MCSP 항체 9.2.27 로부터 취하였다 (Beavers et al., 1996; US5580774).
시험관내 세포자멸사 유도의 분석에 적합한 세포주를 정의하기 위해서, FACS 결합 분석으로써 MCSP 발현에 대해 여러 세포주를 시험하였다 (도 12). 시험 세포주 중에서, HCT-116 및 U-87MG 만이 2 개의 항 MCSP 항체 (9.2.27 및 LC007) 으로 검출된 바와 같이 유의한 MCSP 발현을 나타내었다. 모든 다른 시험 세포주는 매우 낮은 MCSP 의 발현을 나타내거나 발현을 나타내지 않았다. 그런 이유로, 이들 두 세포주를 교차 결합한 아고니스트성 사멸 수용체 항체 또는 용액 내에서 이미 세포자멸사를 부여하는 대조군 항체로 처리한 경우 이들이 세포자멸사를 거치는지를 분석하였다. U-87MG 세포에서 세포자멸사는 항 FAS 및 항 DR5 항체 둘 모두에 의해 유도될 수 있는 한편 (도 13A), 이는 HCT-116 세포에 대해서는 상이하였다. 세포자멸사는 항 DR5 항체로만 유도될 수 있었다 (도 13B). 그러므로 U-87MG 세포를 장래의 세포자멸사 유도 실험을 위한 표적 세포로서 사용되도록 선택하였다.
도 14 는 MCSP 결합 scFv (9.2.27) 와 조합되는 FAS 표적화 HFE7A IgG 로 이루어지는 FAS 아고니스트성 이중특이적 항체로 처리한 후의 (1 ㎍/㎖ 의 농도로) 신경아교종 세포주 U-87MG 로의 세포자멸사 유도 실험으로부터 수득한 결과를 나타낸다. 야생형 (A 포맷) 및 H44 / L100 이황화물 안정화 scFv (A1 포맷) 모두를 HFE7A 단독 또는 2 차 항 인간 Fc 항체를 통해 교차 결합한 HFE7A 와 비교하였다. 일반적으로 이들 U-87MG 세포의 세포자멸사의 유도가 다소 낮음에도 불구하고 (심지어 24 시간 인큐베이션 후에도), 이중특이적 FAS 아고니스트성 항체를 사용한 경우 유의한 DNA 단편화를 관찰할 수 있었다. 이러한 경우 이황화물 안정화 scFv 를 함유하는 구성물은 야생형 scFv 를 함유하는 구성물보다 우수한 것으로 보이며, 둘 모두 교차 결합한 HFE7A IgG 분자보다 더 높은 세포자멸사 유도 능력을 나타낸다. 100 배 과량의 MCSP (9.2.27) IgG 와 함께 세포를 사전-인큐베이션하는 것은 이중특이적 구성물에 의한 세포자별사 유도를 완전히 저해하였는데, 이는 경쟁 항체의 부재 하의 관찰된 DNA 단편화 / 세포자멸사가 MCSP 항원을 통한 FAS 의 교차 결합에 특이적이고 의존적이라는 것을 나타낸다.
실시예
6:
DR5
-
FAP
사멸 수용체
아고니스트성
이중특이적
항체는 제 2 세포주에 의한 교차 결합을 통해 한 세포주의
세포자멸사를
매개할 수 있음
DR5 로서 사멸 수용체의 교차 결합에 의한 세포자멸사 유도의 또다른 접근법은 (종양 세포에 의해 발현된 항원을 통한 교차 결합 제외), 종양을 둘러싸는 스트로마를 표적화하는 것이다. 이러한 경우 표적화된 항원은 종양 세포에 의해서는 직접적으로 디스플레이되지 않지만 2 차, 상이한 세포 유형에 의해서는 디스플레이된다. 이러한 유형의 항원에 대한 한 예는 FAP (섬유모세포 활성화 단백질) 이다. 상기 단백질은 종양 스트로마에서 발견되기 때문에, 활성화된 섬유모세포 상에서 발현된다.
종양 스트로마로부터의 항원 및 인간 DR5 를 표적화하는 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체를 사용하는 세포자멸사의 종양 표적화 유도 가능성을 조사하기 위해서, DR5 및 FAP 결합 scFv (항체 중쇄의 C-말단에 융합되는) 를 인지하는 IgG1 부분으로 이루어지는 이중특이적 분자를 생성시켰다. DR5 표적화 IgG 의 서열을 US2007 / 0031414 A1 에서 기재된 바와 같이 ApomAb 서열로부터 취하였다. FAP 결합 scFv 의 가변 중쇄 및 경쇄의 서열을 서열 # 1 및 2 에서 나타낸 바와 같은 파지 디스플레이에 의해 단리된 Fab 항 FAP 분자로부터 취하였다. FAP scFv 는 (G4S)2 커넥터에 의해 항 DR5 IgG 중쇄의 C-말단에 융합된다.
이러한 종류의 경우, 2 개의 상이한 세포주가 시험관내 활성 검정을 위해 사용되어야 하며: 인간 DR5 를 발현해야 하는 1 개의 세포주 (표적 세포주) 는 세포자멸사 적격이어야만 하지만 FAP 를 발현할 필요는 없다. 제 2 세포주 (효과기 세포주) 는 세포자멸사 음성이어야 하지만 (세포자멸사 저항성에 의해, 또는 DR5 를 발현하지 않음으로써) 표면 상에 FAP 를 발현할 필요가 있다.
원하는 기준을 충족시키는 하나의 가능한 효과기 세포주는 인간 섬유모세포 세포주 GM05389 이다. 도 15A 에서 나타낸 바와 같이, 상기 세포주는 세포주 SW872 에 비해 유의한 수준의 FAP 를 발현하는데, 이는 최고 시험 항체 농도 (10 ㎍/㎖) 로 단지 FAP 발현만을 나타내었으나 비-교차 결합한 ApomAb 에 의한 세포자멸사를 거치지 않는다 (도 15B 에서 나타낸 바와 같음). 따라서 상기 세포주는 표적 세포주의 DNA 단편화가 제 2 세포주 상에서 발현된 항원을 통한 교차 결합에 의해 유도되는 경우 세포자멸사 검정에서 잠재적 효과기 세포주인 것으로 보인다.
표적 세포주로서, 낮은 수준의 DR5 를 발현하며 DR5 매개 세포자멸사 유도에 민감한 인간 유방-선암 세포주 MDA-MB-231 을 사용하였다. 도 16 에서 FAP 를 통한 DR5 의 종양 표적화 교차 결합에 의한 두 세포주 조합과 비교한, GM05389 세포 및 MDA-MB-231 세포의 DNA 단편화 유도 결과를 요약하였다. 사멸 수용체 아고니스트성 항체와 인큐베이션한 후 유의한 세포자멸사 유도는 두 세포주 모두가 동시 배양되는 경우 (흑색 막대) 에만 관찰될 수 있는 한편, 항체 항 Fc 표적화 ApomAb 와 DR5 와의 교차 결합에 의한 세포자멸사는 두 세포주 모두에서 따로따로 낮은 정도로 검출될 수 있었다 (각각 백색 및 회색 막대). MDA-MB-231 세포 상의 DR5 수용체가 섬유모세포 세포주 GM05389 에 의해 발현된 FAP 항원에 결합시 교차 결합되는 방식으로 이러한 결과를 해석한다.
실시예
7:
DR5
-
CEA
이중특이적
아고니스트성
항체 생성을 위한,
ApomAb
에 대한
CEA
단일 사슬
Fab
분자 (
scFab
) 의 융합
응집물 형성을 방지하기 위한 scFv 의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 내의 내부 시스테인 잔기의 명시된 삽입에 의한 이중특이적 항체의 안정화 외에, 단일 사슬 Fab (scFab) 의 사용은 비특이적 교차 결합을 피하기 위해 전체 이중특이적 항체를 안정화시키기 위한 또다른 가능한 전략이다.
이러한 포맷 (DR5 아고니스트성 항체에 융합된 scFab) 이 상응하는 scFv 함유 분자와 유사한 세포자멸사 유도 활성을 나타내는지를 평가하기 위해서, CEA scFab 가 ApomAb 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된 상이한 이중특이적 항체를 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생성시켰다.
scFab 의 상이한 도메인의 배향은 하기와 같다: VL - CL - VH - CH1. 불변 경쇄 (CL) 의 C-말단은 34mer 펩티드 링커를 통해 가변 중쇄 (VH) 의 N-말단에 연결된다. scFab 의 융합은 G4S 커넥터 (2mer 또는 4mer) 에 의해 발생한다.
단일 사슬 Fab 함유 이중특이적 항체를 2 개의 기본적으로 상이한 포맷으로 생성시켰는데: 한 포맷에서는 2 개의 scFab 가 ApomAb 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된다 (이중특이적, 4 가 동종이합체성 분자). 한편, 오직 1 개의 scFab 가 오직 1 개의 ApomAb 중쇄의 C-말단에 융합되는 이중특이적 분자가 구성되었다 (이중특이적, 3 가 이종이합체성 분자). 이러한 이종이합체화는 즉 이종이합체성 IgG 분자의 형성만을 가능하게 하는 Fc 돌연변이를 사용하는 "놉 인투 홀 (knob into holes)" 기술을 사용하여 이루어졌다.
도 17 에서 ApomAb_PR1A3_scFab 를 ApomAb 또는 과도 교차 결합한 ApomAb 와 비교하는 세포자멸사 유도 실험 결과를 나타내었다. 이 검정에서 위암 세포주 MKN-45 를 사용하였고, DNA 단편화 검정을 사용하여 24 시간 후 세포자멸사를 측정하였다. 명백히, 이중특이적 구성물은 항 Fc 항체를 통해 교차 결합한 ApomAb 로 관찰될 수 있는 바와 동일한 범위 내에 있으며 ApomAb 단독으로의 경우보다 유의하게 더 높은 세포자멸사 유도 활성을 나타낸다. 그러나, ApomAb 스스로의 세포자멸사 유도는 다소 높은데, 이는 필시 아마도 사용한 MKN-45 세포주에서의 최대 세포자멸사 유도를 입증하는데 필요한 24 시간의 연장된 인큐베이션 시간으로 인한 것이다 (예를 들어 검정을 단지 4 시간 동안만 실행한 LS174T 세포와는 반대임).
이중특이적, 3 가 DR5 아고니스트성 항체 (종양 표적, CEA 에 대해서 1 가, 및 DR5 에 대해서 2 가) 가 또한 종양 표적화 세포자멸사를 유도할 수 있는지를 평가하기 위해서, CEA scFab (sm3e 특이성) 가 ApomAb 중쇄의 C-말단 (놉 돌연변이 포함) 에 융합된 분자를 생성시켰다. 상기 중쇄는 '홀' 돌연변이를 포함하는 상응하는 ApomAb 중쇄, 및 ApomAb 경쇄로 동시 발현되었다. 이중특이적, 3 가 분자를 LS174T 세포 (0.1 및 1.0 ㎍/㎖ 의 농도) 에서 분석한 4 시간 세포자멸사 유도 검정 결과를 도 18 에서 요약하였다. 이들 결과로부터, 또한 기재된 3 가 포맷이 과도 교차 결합한 ApomAb 의 경우와 동일한 범위 내에서 표적화 세포자멸사를 유도할 수 있다는 것이 명백하였다. 낮은 농도에서 이중특이적 포맷은 심지어 교차 결합시 ApomAb 만큼 약간 더 활성인 것으로 보인다.
실시예
8:
ApomAb
에 비해 우수한
생체내
효능을 갖는
DR5
-
CEA
이중특이적
아고니스트성 항체
시험관내 입증된 사멸 수용체 아고니스트성 항체의 세포자멸사 활성이 또한 우수한 생체내 효능으로 환언되는지를 평가하기 위해서, 인간 결장 암종 세포주 LS174T 를 모델로서 사용하는 생체내 실험을 준비하였다.
간단히 말하자면, 실험 제 1 일에 암컷 SCID 베이지 마우스를 3 x 106 종양 세포의 비장내 주사로 처리하였다. 제 7 일에 스카우트 동물을 1 일 후 항체 처리로 시작하기 위한 기준으로서 종양 접종에 대해 시험하였다. 처리는 일련의 3 회 주사 (각각 10 mg/kg, i.v. 7 일 간격) 로 이루어졌다. 매일 동물을 종료 기준을 입증하기 위해 분석하였다.
도 19 에서 생체내 실험에서 수득한 결과를 요약하였다. 3 군의 마우스 (각각 초기에 10 마리로 이루어지고, 상이한 분자로 처리됨) 의 생존 지속 기간을 비교하였다. 대조군 (PBS, 흑색 선) 은 종양 주사 후 37 일에 완전히 종료된 한편, ApomAb 처리군 (흑색 원형) 은 연장된 생존을 나타내었다 (최대 44 일). 이중특이적 항체 처리군 (ApomAb_sm3e_A1, 흑색 사각형) 은 심지어 ApomAb 단독군보다 더 긴 생존을 나타내었다 (52 일). 수득한 데이터의 수학적 분석은 이들 결과가 통계학적으로 유의하다는 것을 입증하였는데 (p-값이 0.05 미만), 이는 ApomAb 가 PBS 대조군에 비해 생체내 효능을 나타내며 이중특이적 ApomAb_sm3e_A1 이 심지어는 ApomAb 에 비해 우수한 생체내 효능을 입증하였다는 것을 의미한다.
재료 및 방법:
트랜스펙션
HEK293
EBNA
세포
본원에서 사용한 모든 (이중특이적) 항체는 하기 기재된 바와 같이 중쇄 및 경쇄에 대해 인산칼슘 의존적 동시-트랜스펙션 절차를 사용하여 HEK 293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성되었다.
세포를 10% FCS (Gibco, # 16000) 를 함유하는 표준 DMEM 배지 (Invitrogen) 에서 5% CO2 분위기를 갖는 가습화 인큐베이터에서 37℃ 에서 성장시켰다. 트랜스펙션 전 48 시간에 3 x 107 세포를 롤러 바틀 (Falcon # 353069, 1400 ㎠) 에서 200 ㎖ DMEM / 10% FCS 중 접종하고, 롤러 바틀 인큐베이터 (0.3 rpm) 에서 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 트랜스펙션을 위해서, 880 ㎍ 총 DNA (각각, 중쇄 및 경쇄 벡터에 대해 440 ㎍) + 4.4 ㎖ CaCl2 를 총 부피 8.8 ㎖ 까지 H2O 로 채웠다. 상기 용액을 간단히 혼합하였다. 혼합 후, 8.8 ㎖ 의 1.5 mM 인산염 완충액 (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1.5 mM NaH2PO4; pH 7.05) 을 DNA 침전을 위해 첨가하였다. 10 초 동안 추가적인 혼합 및 실온에서의 짧은 인큐베이션 (20 초) 후, 200 ㎖ 의 DMEM / 2% FCS 를 DNA 용액에 첨가하였다. 배지 / DNA 용액을 사용하여, 세포를 트랜스펙션하기 위해 롤러 바틀 내의 본래 배지를 교체하였다. 37℃ 에서 48 시간 인큐베이션한 후, 트랜스펙션 배지를 200 ㎖ DMEM / 10% FCS 로 교체하고 항체 생성을 7 일 동안 지속하였다.
생성 후, 상청액을 수확하고 항체 함유 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통해 여과하고, 정제시까지 4℃ 에서 보관하였다.
정제
단백질을 HEK293 EBNA 세포에서 일시적 발현에 의해 생성시켰다. 여기서 기재된 모든 이중특이적 분자를, 단백질 A 친화성 정제 (Akta Explorer) 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 표준 절차를 사용하여 2 단계로 정제하였다.
상청액을 pH 8.0 (2 M TRIS pH 8.0 사용) 으로 조정하고, 완충액 A (50 mM 인산나트륨, pH 7.0, 250 mM NaCl) 로 평형화된 TricornTM 5/50 컬럼 (GE Healthcare, 컬럼 부피 (cv) = 1 ㎖) 내에 패킹된 Mabselect Sure 수지 (GE Healthcare) 에 적용하였다. 10 컬럼 부피 (cv) 의 완충액 A, 20 cv 의 완충액 B (50 mM 인산나트륨, pH 7.0, 1 M NaCl) 및 다시금 10 cv 의 완충액 A 로 세척한 후, pH-단계적 구배를 사용하여 단백질을 20 cv 초과의 완충액 B (50 mM 인산나트륨, 50 mM 구연산나트륨 pH 3.0, 250 mM NaCl) 로 용리하였다. 단백질을 함유하는 분획물을 풀링하고, 용액의 pH 를 서서히 pH 6.0 (2 M TRIS pH 8.0 사용) 으로 조정하였다. 초-농축기 (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) 를 사용하여 샘플을 2 ㎖ 로 농축한 후, 20 mM 히스티딘, pH 6.0, 150 mM NaCl 로 평형화된 HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200 분취 등급 (GE Healthcare) 에 적용하였다. 용리된 분획물의 응집물 함량을 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 따라서, 50 ㎕ 의 각 분획물을 2 mM MOPS, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.02% w/v NaN3 으로 평형화된 SuperdexTM200 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare) 에 로딩하였다. 2% 미만의 올리고머를 함유하는 분획물을 풀링하고, 초-농축기 (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius) 를 사용하여 최종 농도 1 - 1.5 mg/㎖ 로 농축하였다. 정제된 단백질을 액체 N2 에서 동결시키고 -80℃ 에서 보관하였다.
FACS
결합 분석
사용한 모든 표적 세포주를, 세포자멸사 검정을 수행하기 전에 종양-관련 항원 및 FAS 또는 DR5 사멸 수용체의 상대적 발현 수준에 대해 분석하였다.
세포의 수 및 생육성을 측정하였다. 이를 위해서, 착생하여 성장하는 세포를 세포 해리 완충액 (Gibco - Invitrogen # 13151-014) 으로 분리시켰다. 세포를 원심분리 (4 분, 400 x g) 로 수확하고, FACS 완충액 (PBS / 0.1% BSA) 으로 세척하고, 세포 수를 FACS 완충액 중 1.111 X 106 세포/㎖ 로 조정하였다. 96 웰 둥근 바닥 플레이트의 웰 당 180 ㎕ 의 상기 세포 현탁액을 사용하여, 웰 당 2 x 105 세포를 야기시켰다. 상기 세포를 적절히 희석된 1 차 항체와 함께 30 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션하였다. 이후 세포를 원심분리 (4 분, 400 x g) 로 수확하고, 상청액을 완전히 제거하고, 세포를 150 ㎕ 의 FACS 완충액으로 1 회 세척하였다. 세포를 150 ㎕ FACS 완충액에서 재현탁하고, 2 차 항체 (미표지된 1 차 항체를 사용한 경우) 와 함께 암환경에서 30 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션하였다. FACS 완충액으로의 2 회 세척 단계 후, 세포를 200 ㎕ 의 FACS 완충액에서 재현탁하고 HTS FACSCanto II (BD, Software FACS Diva) 에서 분석하였다. 대안적으로는, 세포를 20 분 동안 4℃ 에서 FACS 완충액 중 2% PFA (파라포름알데히드) 200 ㎕ 로 고정시키고 이후 분석할 수 있다. 모든 검정을 삼중으로 수행하였다.
사용 항체 및 농도:
Biacore
분석 (표면
플라스몬
공명,
SPR
)
SPR 실험을 실행 완충액으로서 HBS-EP (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, GE Healthcare) 를 사용하여 Biacore T100 에서 수행하였다. 바이오티닐화 항원 각각의 1220, 740 및 300 공명 단위 (RU) 의 직접 결합을 표준 방법 (GE Healthcare) 을 사용하여 스트렙타비딘 칩에서 수행하였다. 상이한 농도의 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체를 278 K 에서 90 초 동안 유동 셀 (flow cell) 을 40 ㎕/분의 흐름으로 통과시켜 결합 상을 기록하였다. 해리 상을 300 초 동안 모니터링하였고, 샘플 용액에서 HBS-EP 로 바꿈으로써 촉발시켰다. 빈 스트렙타비딘 표면에서 수득한 반응을 뺌으로써 벌크 굴절률 차이를 수정하였다. 운동 상수를 Biacore T100 평가 소프트웨어 (vAA, Biacore, Freiburg/Germany) 를 사용하여 얻어, 수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 맞추었다. 항원이 고정되었기 때문에, 수치 적분에 의한 1:1 랭뮤어 결합을 사용하여 수득한 운동 상수는 단지 명백한 KD-값 또는 친화력 (avidity) 을 제공하였다.
세포자멸사
유도
유도된 세포자멸사를 측정하기 위해서, Roche 사제 Cell Death Detection ELISA PLUS 키트를 사용하였다. 간단히 말해, 96-웰 플레이트의 웰 당 104 세포 (분리, 및 세포 수 및 생육성 측정 후) 를 200 ㎕ 적절한 배지에 시딩하고, 5% CO2 분위기에서 밤새 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 세포자멸사 유도 항체, 대조군 항체 및 기타 대조군을 적절한 농도로 함유하는 신선한 배지로 교체하였다.
이중특이적 항체를 최종 농도 0.01 - 10 ㎍/㎖ 로 사용하였고; 대조군 항체를 0.5 ㎍/㎖ 로 사용하였고 교차 결합 항체를 100 ㎍/㎖ 로 사용하였다. 경쟁 항체를 100 배 과량으로 사용하였다.
세포를 4 - 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션하여 세포자멸사를 유도하였다. 세포를 원심분리 (10 분, 200 x g) 로 수확하고, 200 ㎕ 의 용해 완충액 (키트에 의해 공급) 에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 미손상 세포를 원심분리 (10 분, 200 x g) 로 침전시키고, 20 ㎕ 의 상청액을 세포자멸사 유도에 대한 제조사의 권고에 따라 분석하였다.
본 발명의 현재 바람직한 구현예를 나타내고 기재하였으나, 본 발명이 이에 제한되지 않지만 다르게는 첨부된 청구항의 범주 내에서 다양하게 구현되고 실행될 수 있다는 것이 명백하게 이해될 것이다.
<110> GlycArt Biotechnology AG
<120> Bispecific death receptor agonistic antibodies
<130> 25917 WO
<150> EP09171659.7
<151> 2009-09-29
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 468
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Pro Pro Pro Ala Arg Val His Leu Gly Ala Phe Leu Ala Val
1 5 10 15
Thr Pro Asn Pro Gly Ser Ala Ala Ser Gly Thr Glu Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Thr Pro Ser Lys Val Trp Gly Ser Ser Ala Gly Arg Ile Glu Pro Arg
35 40 45
Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Pro Thr Ser Met Gly Gln His Gly Pro
50 55 60
Ser Ala Arg Ala Arg Ala Gly Arg Ala Pro Gly Pro Arg Pro Ala Arg
65 70 75 80
Glu Ala Ser Pro Arg Leu Arg Val His Lys Thr Phe Lys Phe Val Val
85 90 95
Val Gly Val Leu Leu Gln Val Val Pro Ser Ser Ala Ala Thr Ile Lys
100 105 110
Leu His Asp Gln Ser Ile Gly Thr Gln Gln Trp Glu His Ser Pro Leu
115 120 125
Gly Glu Leu Cys Pro Pro Gly Ser His Arg Ser Glu His Pro Gly Ala
130 135 140
Cys Asn Arg Cys Thr Glu Gly Val Gly Tyr Thr Asn Ala Ser Asn Asn
145 150 155 160
Leu Phe Ala Cys Leu Pro Cys Thr Ala Cys Lys Ser Asp Glu Glu Glu
165 170 175
Arg Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Ala Cys Gln Cys Lys Pro
180 185 190
Gly Thr Phe Arg Asn Asp Asn Ser Ala Glu Met Cys Arg Lys Cys Ser
195 200 205
Arg Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp
210 215 220
Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Asn Gly His Asn Ile
225 230 235 240
Trp Val Ile Leu Val Val Thr Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Val Ala
245 250 255
Val Leu Ile Val Cys Cys Cys Ile Gly Ser Gly Cys Gly Gly Asp Pro
260 265 270
Lys Cys Met Asp Arg Val Cys Phe Trp Arg Leu Gly Leu Leu Arg Gly
275 280 285
Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala His Asn Glu Ile Leu Ser Asn Ala Asp
290 295 300
Ser Leu Ser Thr Phe Val Ser Glu Gln Gln Met Glu Ser Gln Glu Pro
305 310 315 320
Ala Asp Leu Thr Gly Val Thr Val Gln Ser Pro Gly Glu Ala Gln Cys
325 330 335
Leu Leu Gly Pro Ala Glu Ala Glu Gly Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu
340 345 350
Val Pro Ala Asn Gly Ala Asp Pro Thr Glu Thr Leu Met Leu Phe Phe
355 360 365
Asp Lys Phe Ala Asn Ile Val Pro Phe Asp Ser Trp Asp Gln Leu Met
370 375 380
Arg Gln Leu Asp Leu Thr Lys Asn Glu Ile Asp Val Val Arg Ala Gly
385 390 395 400
Thr Ala Gly Pro Gly Asp Ala Leu Tyr Ala Met Leu Met Lys Trp Val
405 410 415
Asn Lys Thr Gly Arg Asn Ala Ser Ile His Thr Leu Leu Asp Ala Leu
420 425 430
Glu Arg Met Glu Glu Arg His Ala Lys Glu Lys Ile Gln Asp Leu Leu
435 440 445
Val Asp Ser Gly Lys Phe Ile Tyr Leu Glu Asp Gly Thr Gly Ser Ala
450 455 460
Val Ser Leu Glu
465
<210> 2
<211> 440
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
1 5 10 15
Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu
20 25 30
Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu
35 40 45
Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln
50 55 60
Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu
65 70 75 80
Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser
85 90 95
Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe
100 105 110
Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro
115 120 125
Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe
130 135 140
Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys
145 150 155 160
Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile
165 170 175
Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro
180 185 190
Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro
195 200 205
Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val
210 215 220
Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val
225 230 235 240
Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu
245 250 255
Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu
260 265 270
Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu
275 280 285
Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser
290 295 300
Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser
305 310 315 320
Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu
325 330 335
Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp
340 345 350
Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile
355 360 365
Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr
370 375 380
Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His
385 390 395 400
Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln
405 410 415
Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu
420 425 430
Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser
435 440
<210> 3
<211> 335
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp
165 170 175
Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Lys Arg
180 185 190
Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly
195 200 205
Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala Ile Asn Leu
210 215 220
Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Thr Ile Ala Gly Val Met
225 230 235 240
Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu
245 250 255
Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu
260 265 270
Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys
275 280 285
Glu Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys
290 295 300
Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser
305 310 315 320
Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val
325 330 335
<210> 4
<211> 702
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr
20 25 30
Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly
35 40 45
Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly
50 55 60
Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile
65 70 75 80
Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile
100 105 110
Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp
115 120 125
Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu
130 135 140
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys
145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
165 170 175
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
180 185 190
Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn
195 200 205
Asp Ser Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg
210 215 220
Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240
Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn
245 250 255
Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn
275 280 285
Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser
290 295 300
Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu
325 330 335
Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr
340 345 350
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg
355 360 365
Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr
370 375 380
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser
385 390 395 400
Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp
405 410 415
Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser
435 440 445
Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile
450 455 460
Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn
465 470 475 480
Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val
485 490 495
Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro
500 505 510
Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln
515 520 525
Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540
Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn
545 550 555 560
Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser
565 570 575
Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly
580 585 590
Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly
595 600 605
Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln
610 615 620
Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu
625 630 635 640
Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe
645 650 655
Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile
660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr
675 680 685
Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile
690 695 700
<210> 5
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile
1 5 10 15
Met Ala Ile Ser Lys Val Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly
20 25 30
His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Tyr Leu Ala Phe Arg Asp
35 40 45
Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser
50 55 60
Gln Arg Val Pro Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg
65 70 75 80
Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala
85 90 95
Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys
100 105 110
Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys
115 120 125
Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala
130 135 140
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met
165 170 175
Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr
180 185
<210> 6
<211> 1007
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Gly Ser Gly Gly Asp Ser Leu Leu Gly Gly Arg Gly Ser Leu Pro
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Ile Met Gly Gly Met Ala Gln Asp Ser Pro Pro
20 25 30
Gln Ile Leu Val His Pro Gln Asp Gln Leu Phe Gln Gly Pro Gly Pro
35 40 45
Ala Arg Met Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gln Pro Pro Pro Thr Ile Arg
50 55 60
Trp Leu Leu Asn Gly Gln Pro Leu Ser Met Val Pro Pro Asp Pro His
65 70 75 80
His Leu Leu Pro Asp Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Ala Arg
85 90 95
Gly His Ala His Asp Gly Gln Ala Leu Ser Thr Asp Leu Gly Val Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Ala Ser Asn Arg Leu Gly Thr Ala Val Ser Arg Gly Ala
115 120 125
Arg Leu Ser Val Ala Val Leu Arg Glu Asp Phe Gln Ile Gln Pro Arg
130 135 140
Asp Met Val Ala Val Val Gly Glu Gln Phe Thr Leu Glu Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Trp Gly His Pro Glu Pro Thr Val Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys
165 170 175
Pro Leu Ala Leu Gln Pro Gly Arg His Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu
180 185 190
Leu Met Ala Arg Ala Glu Lys Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Met Cys Val
195 200 205
Ala Thr Asn Ser Ala Gly His Arg Glu Ser Arg Ala Ala Arg Val Ser
210 215 220
Ile Gln Glu Pro Gln Asp Tyr Thr Glu Pro Val Glu Leu Leu Ala Val
225 230 235 240
Arg Ile Gln Leu Glu Asn Val Thr Leu Leu Asn Pro Asp Pro Ala Glu
245 250 255
Gly Pro Lys Pro Arg Pro Ala Val Trp Leu Ser Trp Lys Val Ser Gly
260 265 270
Pro Ala Ala Pro Ala Gln Ser Tyr Thr Ala Leu Phe Arg Thr Gln Thr
275 280 285
Ala Pro Gly Gly Gln Gly Ala Pro Trp Ala Glu Glu Leu Leu Ala Gly
290 295 300
Trp Gln Ser Ala Glu Leu Gly Gly Leu His Trp Gly Gln Asp Tyr Glu
305 310 315 320
Phe Lys Val Arg Pro Ser Ser Gly Arg Ala Arg Gly Pro Asp Ser Asn
325 330 335
Val Leu Leu Leu Arg Leu Pro Glu Lys Val Pro Ser Ala Pro Pro Gln
340 345 350
Glu Val Thr Leu Lys Pro Gly Asn Gly Thr Val Phe Val Ser Trp Val
355 360 365
Pro Pro Pro Ala Glu Asn His Asn Gly Ile Ile Arg Gly Tyr Gln Val
370 375 380
Trp Ser Leu Gly Asn Thr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Trp Thr Val Val
385 390 395 400
Gly Glu Gln Thr Gln Leu Glu Ile Ala Thr His Met Pro Gly Ser Tyr
405 410 415
Cys Val Gln Val Ala Ala Val Thr Gly Ala Gly Ala Gly Glu Pro Ser
420 425 430
Arg Pro Val Cys Leu Leu Leu Glu Gln Ala Met Glu Arg Ala Thr Gln
435 440 445
Glu Pro Ser Glu His Gly Pro Trp Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ala Thr
450 455 460
Leu Lys Arg Pro Glu Val Ile Ala Thr Cys Gly Val Ala Leu Trp Leu
465 470 475 480
Leu Leu Leu Gly Thr Ala Val Cys Ile His Arg Arg Arg Arg Ala Arg
485 490 495
Val His Leu Gly Pro Gly Leu Tyr Arg Tyr Thr Ser Glu Asp Ala Ile
500 505 510
Leu Lys His Arg Met Asp His Ser Asp Ser Gln Trp Leu Ala Asp Thr
515 520 525
Trp Arg Ser Thr Ser Gly Ser Arg Asp Leu Ser Ser Ser Ser Ser Leu
530 535 540
Ser Ser Arg Leu Gly Ala Asp Ala Arg Asp Pro Leu Asp Cys Arg Arg
545 550 555 560
Ser Leu Leu Ser Trp Asp Ser Arg Ser Pro Gly Val Pro Leu Leu Pro
565 570 575
Asp Thr Ser Thr Phe Tyr Gly Ser Leu Ile Ala Glu Leu Pro Ser Ser
580 585 590
Thr Pro Ala Arg Pro Ser Pro Gln Val Pro Ala Val Arg Arg Leu Pro
595 600 605
Pro Gln Leu Ala Gln Leu Ser Ser Pro Cys Ser Ser Ser Asp Ser Leu
610 615 620
Cys Ser Arg Arg Gly Leu Ser Ser Pro Arg Leu Ser Leu Ala Pro Ala
625 630 635 640
Glu Ala Trp Lys Ala Lys Lys Lys Gln Glu Leu Gln His Ala Asn Ser
645 650 655
Ser Pro Leu Leu Arg Gly Ser His Ser Leu Glu Leu Arg Ala Cys Glu
660 665 670
Leu Gly Asn Arg Gly Ser Lys Asn Leu Ser Gln Ser Pro Gly Ala Val
675 680 685
Pro Gln Ala Leu Val Ala Trp Arg Ala Leu Gly Pro Lys Leu Leu Ser
690 695 700
Ser Ser Asn Glu Leu Val Thr Arg His Leu Pro Pro Ala Pro Leu Phe
705 710 715 720
Pro His Glu Thr Pro Pro Thr Gln Ser Gln Gln Thr Gln Pro Pro Val
725 730 735
Ala Pro Gln Ala Pro Ser Ser Ile Leu Leu Pro Ala Ala Pro Ile Pro
740 745 750
Ile Leu Ser Pro Cys Ser Pro Pro Ser Pro Gln Ala Ser Ser Leu Ser
755 760 765
Gly Pro Ser Pro Ala Ser Ser Arg Leu Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser
770 775 780
Leu Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Leu Thr Pro Glu Glu Val Ala Leu
785 790 795 800
Cys Leu Glu Leu Ser Glu Gly Glu Glu Thr Pro Arg Asn Ser Val Ser
805 810 815
Pro Met Pro Arg Ala Pro Ser Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Tyr Ile Ser
820 825 830
Val Pro Thr Ala Ser Glu Phe Thr Asp Met Gly Arg Thr Gly Gly Gly
835 840 845
Val Gly Pro Lys Gly Gly Val Leu Leu Cys Pro Pro Arg Pro Cys Leu
850 855 860
Thr Pro Thr Pro Ser Glu Gly Ser Leu Ala Asn Gly Trp Gly Ser Ala
865 870 875 880
Ser Glu Asp Asn Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ser Leu Val Ser Ser Ser
885 890 895
Asp Gly Ser Phe Leu Ala Asp Ala His Phe Ala Arg Ala Leu Ala Val
900 905 910
Ala Val Asp Ser Phe Gly Phe Gly Leu Glu Pro Arg Glu Ala Asp Cys
915 920 925
Val Phe Ile Asp Ala Ser Ser Pro Pro Ser Pro Arg Asp Glu Ile Phe
930 935 940
Leu Thr Pro Asn Leu Ser Leu Pro Leu Trp Glu Trp Arg Pro Asp Trp
945 950 955 960
Leu Glu Asp Met Glu Val Ser His Thr Gln Arg Leu Gly Arg Gly Met
965 970 975
Pro Pro Trp Pro Pro Asp Ser Gln Ile Ser Ser Gln Arg Ser Gln Leu
980 985 990
His Cys Arg Met Pro Lys Ala Gly Ala Ser Pro Val Asp Tyr Ser
995 1000 1005
<210> 7
<211> 2322
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Gln Ser Gly Pro Arg Pro Pro Leu Pro Ala Pro Gly Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Thr Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ser Phe
20 25 30
Phe Gly Glu Asn His Leu Glu Val Pro Val Ala Thr Ala Leu Thr Asp
35 40 45
Ile Asp Leu Gln Leu Gln Phe Ser Thr Ser Gln Pro Glu Ala Leu Leu
50 55 60
Leu Leu Ala Ala Gly Pro Ala Asp His Leu Leu Leu Gln Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Gly Arg Leu Gln Val Arg Leu Val Leu Gly Gln Glu Glu Leu Arg Leu
85 90 95
Gln Thr Pro Ala Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ser Ile Pro His Thr Val
100 105 110
Val Leu Thr Val Val Glu Gly Trp Ala Thr Leu Ser Val Asp Gly Phe
115 120 125
Leu Asn Ala Ser Ser Ala Val Pro Gly Ala Pro Leu Glu Val Pro Tyr
130 135 140
Gly Leu Phe Val Gly Gly Thr Gly Thr Leu Gly Leu Pro Tyr Leu Arg
145 150 155 160
Gly Thr Ser Arg Pro Leu Arg Gly Cys Leu His Ala Ala Thr Leu Asn
165 170 175
Gly Arg Ser Leu Leu Arg Pro Leu Thr Pro Asp Val His Glu Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Glu Phe Ser Ala Ser Asp Asp Val Ala Leu Gly Phe Ser Gly
195 200 205
Pro His Ser Leu Ala Ala Phe Pro Ala Trp Gly Thr Gln Asp Glu Gly
210 215 220
Thr Leu Glu Phe Thr Leu Thr Thr Gln Ser Arg Gln Ala Pro Leu Ala
225 230 235 240
Phe Gln Ala Gly Gly Arg Arg Gly Asp Phe Ile Tyr Val Asp Ile Phe
245 250 255
Glu Gly His Leu Arg Ala Val Val Glu Lys Gly Gln Gly Thr Val Leu
260 265 270
Leu His Asn Ser Val Pro Val Ala Asp Gly Gln Pro His Glu Val Ser
275 280 285
Val His Ile Asn Ala His Arg Leu Glu Ile Ser Val Asp Gln Tyr Pro
290 295 300
Thr His Thr Ser Asn Arg Gly Val Leu Ser Tyr Leu Glu Pro Arg Gly
305 310 315 320
Ser Leu Leu Leu Gly Gly Leu Asp Ala Glu Ala Ser Arg His Leu Gln
325 330 335
Glu His Arg Leu Gly Leu Thr Pro Glu Ala Thr Asn Ala Ser Leu Leu
340 345 350
Gly Cys Met Glu Asp Leu Ser Val Asn Gly Gln Arg Arg Gly Leu Arg
355 360 365
Glu Ala Leu Leu Thr Arg Asn Met Ala Ala Gly Cys Arg Leu Glu Glu
370 375 380
Glu Glu Tyr Glu Asp Asp Ala Tyr Gly His Tyr Glu Ala Phe Ser Thr
385 390 395 400
Leu Ala Pro Glu Ala Trp Pro Ala Met Glu Leu Pro Glu Pro Cys Val
405 410 415
Pro Glu Pro Gly Leu Pro Pro Val Phe Ala Asn Phe Thr Gln Leu Leu
420 425 430
Thr Ile Ser Pro Leu Val Val Ala Glu Gly Gly Thr Ala Trp Leu Glu
435 440 445
Trp Arg His Val Gln Pro Thr Leu Asp Leu Met Glu Ala Glu Leu Arg
450 455 460
Lys Ser Gln Val Leu Phe Ser Val Thr Arg Gly Ala Arg His Gly Glu
465 470 475 480
Leu Glu Leu Asp Ile Pro Gly Ala Gln Ala Arg Lys Met Phe Thr Leu
485 490 495
Leu Asp Val Val Asn Arg Lys Ala Arg Phe Ile His Asp Gly Ser Glu
500 505 510
Asp Thr Ser Asp Gln Leu Val Leu Glu Val Ser Val Thr Ala Arg Val
515 520 525
Pro Met Pro Ser Cys Leu Arg Arg Gly Gln Thr Tyr Leu Leu Pro Ile
530 535 540
Gln Val Asn Pro Val Asn Asp Pro Pro His Ile Ile Phe Pro His Gly
545 550 555 560
Ser Leu Met Val Ile Leu Glu His Thr Gln Lys Pro Leu Gly Pro Glu
565 570 575
Val Phe Gln Ala Tyr Asp Pro Asp Ser Ala Cys Glu Gly Leu Thr Phe
580 585 590
Gln Val Leu Gly Thr Ser Ser Gly Leu Pro Val Glu Arg Arg Asp Gln
595 600 605
Pro Gly Glu Pro Ala Thr Glu Phe Ser Cys Arg Glu Leu Glu Ala Gly
610 615 620
Ser Leu Val Tyr Val His Arg Gly Gly Pro Ala Gln Asp Leu Thr Phe
625 630 635 640
Arg Val Ser Asp Gly Leu Gln Ala Ser Pro Pro Ala Thr Leu Lys Val
645 650 655
Val Ala Ile Arg Pro Ala Ile Gln Ile His Arg Ser Thr Gly Leu Arg
660 665 670
Leu Ala Gln Gly Ser Ala Met Pro Ile Leu Pro Ala Asn Leu Ser Val
675 680 685
Glu Thr Asn Ala Val Gly Gln Asp Val Ser Val Leu Phe Arg Val Thr
690 695 700
Gly Ala Leu Gln Phe Gly Glu Leu Gln Lys Gln Gly Ala Gly Gly Val
705 710 715 720
Glu Gly Ala Glu Trp Trp Ala Thr Gln Ala Phe His Gln Arg Asp Val
725 730 735
Glu Gln Gly Arg Val Arg Tyr Leu Ser Thr Asp Pro Gln His His Ala
740 745 750
Tyr Asp Thr Val Glu Asn Leu Ala Leu Glu Val Gln Val Gly Gln Glu
755 760 765
Ile Leu Ser Asn Leu Ser Phe Pro Val Thr Ile Gln Arg Ala Thr Val
770 775 780
Trp Met Leu Arg Leu Glu Pro Leu His Thr Gln Asn Thr Gln Gln Glu
785 790 795 800
Thr Leu Thr Thr Ala His Leu Glu Ala Thr Leu Glu Glu Ala Gly Pro
805 810 815
Ser Pro Pro Thr Phe His Tyr Glu Val Val Gln Ala Pro Arg Lys Gly
820 825 830
Asn Leu Gln Leu Gln Gly Thr Arg Leu Ser Asp Gly Gln Gly Phe Thr
835 840 845
Gln Asp Asp Ile Gln Ala Gly Arg Val Thr Tyr Gly Ala Thr Ala Arg
850 855 860
Ala Ser Glu Ala Val Glu Asp Thr Phe Arg Phe Arg Val Thr Ala Pro
865 870 875 880
Pro Tyr Phe Ser Pro Leu Tyr Thr Phe Pro Ile His Ile Gly Gly Asp
885 890 895
Pro Asp Ala Pro Val Leu Thr Asn Val Leu Leu Val Val Pro Glu Gly
900 905 910
Gly Glu Gly Val Leu Ser Ala Asp His Leu Phe Val Lys Ser Leu Asn
915 920 925
Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Glu Val Met Glu Arg Pro Arg His Gly Arg
930 935 940
Leu Ala Trp Arg Gly Thr Gln Asp Lys Thr Thr Met Val Thr Ser Phe
945 950 955 960
Thr Asn Glu Asp Leu Leu Arg Gly Arg Leu Val Tyr Gln His Asp Asp
965 970 975
Ser Glu Thr Thr Glu Asp Asp Ile Pro Phe Val Ala Thr Arg Gln Gly
980 985 990
Glu Ser Ser Gly Asp Met Ala Trp Glu Glu Val Arg Gly Val Phe Arg
995 1000 1005
Val Ala Ile Gln Pro Val Asn Asp His Ala Pro Val Gln Thr Ile Ser
1010 1015 1020
Arg Ile Phe His Val Ala Arg Gly Gly Arg Arg Leu Leu Thr Thr Asp
1025 1030 1035 1040
Asp Val Ala Phe Ser Asp Ala Asp Ser Gly Phe Ala Asp Ala Gln Leu
1045 1050 1055
Val Leu Thr Arg Lys Asp Leu Leu Phe Gly Ser Ile Val Ala Val Asp
1060 1065 1070
Glu Pro Thr Arg Pro Ile Tyr Arg Phe Thr Gln Glu Asp Leu Arg Lys
1075 1080 1085
Arg Arg Val Leu Phe Val His Ser Gly Ala Asp Arg Gly Trp Ile Gln
1090 1095 1100
Leu Gln Val Ser Asp Gly Gln His Gln Ala Thr Ala Leu Leu Glu Val
1105 1110 1115 1120
Gln Ala Ser Glu Pro Tyr Leu Arg Val Ala Asn Gly Ser Ser Leu Val
1125 1130 1135
Val Pro Gln Gly Gly Gln Gly Thr Ile Asp Thr Ala Val Leu His Leu
1140 1145 1150
Asp Thr Asn Leu Asp Ile Arg Ser Gly Asp Glu Val His Tyr His Val
1155 1160 1165
Thr Ala Gly Pro Arg Trp Gly Gln Leu Val Arg Ala Gly Gln Pro Ala
1170 1175 1180
Thr Ala Phe Ser Gln Gln Asp Leu Leu Asp Gly Ala Val Leu Tyr Ser
1185 1190 1195 1200
His Asn Gly Ser Leu Ser Pro Arg Asp Thr Met Ala Phe Ser Val Glu
1205 1210 1215
Ala Gly Pro Val His Thr Asp Ala Thr Leu Gln Val Thr Ile Ala Leu
1220 1225 1230
Glu Gly Pro Leu Ala Pro Leu Lys Leu Val Arg His Lys Lys Ile Tyr
1235 1240 1245
Val Phe Gln Gly Glu Ala Ala Glu Ile Arg Arg Asp Gln Leu Glu Ala
1250 1255 1260
Ala Gln Glu Ala Val Pro Pro Ala Asp Ile Val Phe Ser Val Lys Ser
1265 1270 1275 1280
Pro Pro Ser Ala Gly Tyr Leu Val Met Val Ser Arg Gly Ala Leu Ala
1285 1290 1295
Asp Glu Pro Pro Ser Leu Asp Pro Val Gln Ser Phe Ser Gln Glu Ala
1300 1305 1310
Val Asp Thr Gly Arg Val Leu Tyr Leu His Ser Arg Pro Glu Ala Trp
1315 1320 1325
Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ala Ser Gly Leu Gly Ala Pro Leu
1330 1335 1340
Glu Gly Val Leu Val Glu Leu Glu Val Leu Pro Ala Ala Ile Pro Leu
1345 1350 1355 1360
Glu Ala Gln Asn Phe Ser Val Pro Glu Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ala
1365 1370 1375
Pro Pro Leu Leu Arg Val Ser Gly Pro Tyr Phe Pro Thr Leu Leu Gly
1380 1385 1390
Leu Ser Leu Gln Val Leu Glu Pro Pro Gln His Gly Ala Leu Gln Lys
1395 1400 1405
Glu Asp Gly Pro Gln Ala Arg Thr Leu Ser Ala Phe Ser Trp Arg Met
1410 1415 1420
Val Glu Glu Gln Leu Ile Arg Tyr Val His Asp Gly Ser Glu Thr Leu
1425 1430 1435 1440
Thr Asp Ser Phe Val Leu Met Ala Asn Ala Ser Glu Met Asp Arg Gln
1445 1450 1455
Ser His Pro Val Ala Phe Thr Val Thr Val Leu Pro Val Asn Asp Gln
1460 1465 1470
Pro Pro Ile Leu Thr Thr Asn Thr Gly Leu Gln Met Trp Glu Gly Ala
1475 1480 1485
Thr Ala Pro Ile Pro Ala Glu Ala Leu Arg Ser Thr Asp Gly Asp Ser
1490 1495 1500
Gly Ser Glu Asp Leu Val Tyr Thr Ile Glu Gln Pro Ser Asn Gly Arg
1505 1510 1515 1520
Val Val Leu Arg Gly Ala Pro Gly Thr Glu Val Arg Ser Phe Thr Gln
1525 1530 1535
Ala Gln Leu Asp Gly Gly Leu Val Leu Phe Ser His Arg Gly Thr Leu
1540 1545 1550
Asp Gly Gly Phe Arg Phe Arg Leu Ser Asp Gly Glu His Thr Ser Pro
1555 1560 1565
Gly His Phe Phe Arg Val Thr Ala Gln Lys Gln Val Leu Leu Ser Leu
1570 1575 1580
Lys Gly Ser Gln Thr Leu Thr Val Cys Pro Gly Ser Val Gln Pro Leu
1585 1590 1595 1600
Ser Ser Gln Thr Leu Arg Ala Ser Ser Ser Ala Gly Thr Asp Pro Gln
1605 1610 1615
Leu Leu Leu Tyr Arg Val Val Arg Gly Pro Gln Leu Gly Arg Leu Phe
1620 1625 1630
His Ala Gln Gln Asp Ser Thr Gly Glu Ala Leu Val Asn Phe Thr Gln
1635 1640 1645
Ala Glu Val Tyr Ala Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu Met Pro Pro
1650 1655 1660
Glu Pro Phe Trp Glu Ala His Asp Thr Leu Glu Leu Gln Leu Ser Ser
1665 1670 1675 1680
Pro Pro Ala Arg Asp Val Ala Ala Thr Leu Ala Val Ala Val Ser Phe
1685 1690 1695
Glu Ala Ala Cys Pro Gln His Pro Ser His Leu Trp Lys Asn Lys Gly
1700 1705 1710
Leu Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Arg Ile Thr Val Ala Ala Leu
1715 1720 1725
Asp Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Pro Gln Arg Ser Glu
1730 1735 1740
His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Ser Arg Gly Gln Leu
1745 1750 1755 1760
Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Gly Gln Pro His Phe Leu Gln
1765 1770 1775
Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His Gly Gly Gly Gly
1780 1785 1790
Thr Gln Gln Asp Gly Phe His Phe Arg Ala His Leu Gln Gly Pro Ala
1795 1800 1805
Gly Ala Ser Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser Glu Ala Phe Ala Ile Thr
1810 1815 1820
Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro Gln Pro Gln Ala Ser Val Pro
1825 1830 1835 1840
Leu Arg Leu Thr Arg Gly Ser Arg Ala Pro Ile Ser Arg Ala Gln Leu
1845 1850 1855
Ser Val Val Asp Pro Asp Ser Ala Pro Gly Glu Ile Glu Tyr Glu Val
1860 1865 1870
Gln Arg Ala Pro His Asn Gly Phe Leu Ser Leu Val Gly Gly Gly Leu
1875 1880 1885
Gly Pro Val Thr Arg Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ser Gly Arg Leu
1890 1895 1900
Ala Phe Val Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Ile Phe Gln Leu Ser
1905 1910 1915 1920
Met Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Leu Pro Met Ser Leu Ala Val Asp
1925 1930 1935
Ile Leu Pro Ser Ala Ile Glu Val Gln Leu Arg Ala Pro Leu Glu Val
1940 1945 1950
Pro Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Leu Ser Gln Gln Gln Leu Arg Val
1955 1960 1965
Val Ser Asp Arg Glu Glu Pro Glu Ala Ala Tyr Arg Leu Ile Gln Gly
1970 1975 1980
Pro Gln Tyr Gly His Leu Leu Val Gly Gly Arg Pro Thr Ser Ala Phe
1985 1990 1995 2000
Ser Gln Phe Gln Ile Asp Gln Gly Glu Val Val Phe Ala Phe Thr Asn
2005 2010 2015
Phe Ser Ser Ser His Asp His Phe Arg Val Leu Ala Leu Ala Arg Gly
2020 2025 2030
Val Asn Ala Ser Ala Val Val Asn Val Thr Val Arg Ala Leu Leu His
2035 2040 2045
Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Ala Thr Leu Arg Leu Asp
2050 2055 2060
Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu Leu Ala Asn Arg Thr Gly Ser Val
2065 2070 2075 2080
Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly Pro Arg His Gly Arg Val Val Arg
2085 2090 2095
Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly Gly Ser Gln Leu Val Glu Gln
2100 2105 2110
Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly Arg Leu Gly Leu Glu Val Gly
2115 2120 2125
Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro Ala Gly Asp Ser Leu Thr Leu
2130 2135 2140
Glu Leu Trp Ala Gln Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Ser Leu Asp Phe
2145 2150 2155 2160
Ala Thr Glu Pro Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Tyr Ser Val Ala Leu Leu
2165 2170 2175
Ser Val Pro Glu Ala Ala Arg Thr Glu Ala Gly Lys Pro Glu Ser Ser
2180 2185 2190
Thr Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met Ala Ser Ser Pro Glu Pro Ala
2195 2200 2205
Val Ala Lys Gly Gly Phe Leu Ser Phe Leu Glu Ala Asn Met Phe Ser
2210 2215 2220
Val Ile Ile Pro Met Cys Leu Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Leu
2225 2230 2235 2240
Pro Leu Leu Phe Tyr Leu Arg Lys Arg Asn Lys Thr Gly Lys His Asp
2245 2250 2255
Val Gln Val Leu Thr Ala Lys Pro Arg Asn Gly Leu Ala Gly Asp Thr
2260 2265 2270
Glu Thr Phe Arg Lys Val Glu Pro Gly Gln Ala Ile Pro Leu Thr Ala
2275 2280 2285
Val Pro Gly Gln Gly Pro Pro Pro Gly Gly Gln Pro Asp Pro Glu Leu
2290 2295 2300
Leu Gln Phe Cys Arg Thr Pro Asn Pro Ala Leu Lys Asn Gly Gln Tyr
2305 2310 2315 2320
Trp Val
<210> 8
<211> 2201
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Gly Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val Phe Leu Ala Phe Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ala Thr Glu Gly Gly Val Leu Lys Lys Val Ile Arg His Lys
20 25 30
Arg Gln Ser Gly Val Asn Ala Thr Leu Pro Glu Glu Asn Gln Pro Val
35 40 45
Val Phe Asn His Val Tyr Asn Ile Lys Leu Pro Val Gly Ser Gln Cys
50 55 60
Ser Val Asp Leu Glu Ser Ala Ser Gly Glu Lys Asp Leu Ala Pro Pro
65 70 75 80
Ser Glu Pro Ser Glu Ser Phe Gln Glu His Thr Val Asp Gly Glu Asn
85 90 95
Gln Ile Val Phe Thr His Arg Ile Asn Ile Pro Arg Arg Ala Cys Gly
100 105 110
Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu
115 120 125
Leu Glu Asn Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Cys Thr Ala Gly Ala
130 135 140
Gly Cys Cys Leu Gln Pro Ala Thr Gly Arg Leu Asp Thr Arg Pro Phe
145 150 155 160
Cys Ser Gly Arg Gly Asn Phe Ser Thr Glu Gly Cys Gly Cys Val Cys
165 170 175
Glu Pro Gly Trp Lys Gly Pro Asn Cys Ser Glu Pro Glu Cys Pro Gly
180 185 190
Asn Cys His Leu Arg Gly Arg Cys Ile Asp Gly Gln Cys Ile Cys Asp
195 200 205
Asp Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Gln Leu Ala Cys Pro Ser Asp
210 215 220
Cys Asn Asp Gln Gly Lys Cys Val Asn Gly Val Cys Ile Cys Phe Glu
225 230 235 240
Gly Tyr Ala Gly Ala Asp Cys Ser Arg Glu Ile Cys Pro Val Pro Cys
245 250 255
Ser Glu Glu His Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Cys Val Cys His Asp
260 265 270
Gly Phe Ala Gly Asp Asp Cys Asn Lys Pro Leu Cys Leu Asn Asn Cys
275 280 285
Tyr Asn Arg Gly Arg Cys Val Glu Asn Glu Cys Val Cys Asp Glu Gly
290 295 300
Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Leu Ile Cys Pro Asn Asp Cys Phe
305 310 315 320
Asp Arg Gly Arg Cys Ile Asn Gly Thr Cys Tyr Cys Glu Glu Gly Phe
325 330 335
Thr Gly Glu Asp Cys Gly Lys Pro Thr Cys Pro His Ala Cys His Thr
340 345 350
Gln Gly Arg Cys Glu Glu Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Phe Ala
355 360 365
Gly Leu Asp Cys Ser Glu Lys Arg Cys Pro Ala Asp Cys His Asn Arg
370 375 380
Gly Arg Cys Val Asp Gly Arg Cys Glu Cys Asp Asp Gly Phe Thr Gly
385 390 395 400
Ala Asp Cys Gly Glu Leu Lys Cys Pro Asn Gly Cys Ser Gly His Gly
405 410 415
Arg Cys Val Asn Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Thr Gly Glu
420 425 430
Asp Cys Ser Gln Leu Arg Cys Pro Asn Asp Cys His Ser Arg Gly Arg
435 440 445
Cys Val Glu Gly Lys Cys Val Cys Glu Gln Gly Phe Lys Gly Tyr Asp
450 455 460
Cys Ser Asp Met Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gln His Gly Arg Cys
465 470 475 480
Val Asn Gly Met Cys Val Cys Asp Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Cys
485 490 495
Arg Asp Arg Gln Cys Pro Arg Asp Cys Ser Asn Arg Gly Leu Cys Val
500 505 510
Asp Gly Gln Cys Val Cys Glu Asp Gly Phe Thr Gly Pro Asp Cys Ala
515 520 525
Glu Leu Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gly Gln Gly Arg Cys Val Asn
530 535 540
Gly Gln Cys Val Cys His Glu Gly Phe Met Gly Lys Asp Cys Lys Glu
545 550 555 560
Gln Arg Cys Pro Ser Asp Cys His Gly Gln Gly Arg Cys Val Asp Gly
565 570 575
Gln Cys Ile Cys His Glu Gly Phe Thr Gly Leu Asp Cys Gly Gln His
580 585 590
Ser Cys Pro Ser Asp Cys Asn Asn Leu Gly Gln Cys Val Ser Gly Arg
595 600 605
Cys Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Ser Gly Glu Asp Cys Ser Glu Val Ser
610 615 620
Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val Asn
625 630 635 640
Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu Tyr Leu Val Val Tyr
645 650 655
Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met Gln Phe Arg Val Pro Gly
660 665 670
Asp Gln Thr Ser Thr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Pro Gly Val Glu Tyr
675 680 685
Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys Lys Ser Ile Pro Val
690 695 700
Ser Ala Arg Val Ala Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe
705 710 715 720
Lys Ser Ile Lys Glu Thr Ser Val Glu Val Glu Trp Asp Pro Leu Asp
725 730 735
Ile Ala Phe Glu Thr Trp Glu Ile Ile Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu
740 745 750
Asp Glu Gly Glu Ile Thr Lys Ser Leu Arg Arg Pro Glu Thr Ser Tyr
755 760 765
Arg Gln Thr Gly Leu Ala Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Ile Ser Leu His
770 775 780
Ile Val Lys Asn Asn Thr Arg Gly Pro Gly Leu Lys Arg Val Thr Thr
785 790 795 800
Thr Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp
805 810 815
Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly
820 825 830
Ile Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr
835 840 845
Ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys
850 855 860
Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Ser Arg Arg Gly Asp Met
865 870 875 880
Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu Asp Ala Pro
885 890 895
Arg Asn Leu Arg Arg Val Ser Gln Thr Asp Asn Ser Ile Thr Leu Glu
900 905 910
Trp Arg Asn Gly Lys Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Ile Lys Tyr Ala
915 920 925
Pro Ile Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Val Asp Val Pro Lys Ser Gln
930 935 940
Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly Leu Arg Pro Gly Thr Glu
945 950 955 960
Tyr Gly Ile Gly Val Ser Ala Val Lys Glu Asp Lys Glu Ser Asn Pro
965 970 975
Ala Thr Ile Asn Ala Ala Thr Glu Leu Asp Thr Pro Lys Asp Leu Gln
980 985 990
Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu Thr Leu Leu Trp Lys Thr Pro
995 1000 1005
Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr Ser Leu Pro Thr Gly
1010 1015 1020
Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg Asn Thr Thr Ser Tyr Val Leu
1025 1030 1035 1040
Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Val Leu Leu Thr Ala Glu
1045 1050 1055
Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val Lys Ala Ser Thr Glu
1060 1065 1070
Gln Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Gly Trp Asp
1075 1080 1085
Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gln Ala Tyr Glu His Phe
1090 1095 1100
Ile Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Lys Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu
1105 1110 1115 1120
Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Lys Ala
1125 1130 1135
Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg
1140 1145 1150
Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Glu Thr Pro Asn Leu
1155 1160 1165
Gly Glu Val Val Val Ala Glu Val Gly Trp Asp Ala Leu Lys Leu Asn
1170 1175 1180
Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe Phe Ile Gln Val Gln
1185 1190 1195 1200
Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Val Pro Gly Gly
1205 1210 1215
Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr His Tyr Thr
1220 1225 1230
Ile Thr Ile Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Ser Thr Thr Pro Leu Ser
1235 1240 1245
Val Glu Val Leu Thr Glu Glu Val Pro Asp Met Gly Asn Leu Thr Val
1250 1255 1260
Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn Trp Thr Thr Pro Asp
1265 1270 1275 1280
Gly Thr Tyr Asp Gln Phe Thr Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Gln Val
1285 1290 1295
Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ser Met Glu
1300 1305 1310
Ile Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr Val Thr Leu His Gly
1315 1320 1325
Glu Val Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu Ala Val Glu Val Val Thr
1330 1335 1340
Glu Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val Ser Glu Val Gly Trp
1345 1350 1355 1360
Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His
1365 1370 1375
Phe Val Ile Gln Val Gln Glu Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn
1380 1385 1390
Leu Thr Leu Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu
1395 1400 1405
Ala Ala Thr Pro Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr
1410 1415 1420
Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Lys Glu Pro Glu
1425 1430 1435 1440
Ile Gly Asn Leu Asn Val Ser Asp Ile Thr Pro Glu Ser Phe Asn Leu
1445 1450 1455
Ser Trp Met Ala Thr Asp Gly Ile Phe Glu Thr Phe Thr Ile Glu Ile
1460 1465 1470
Ile Asp Ser Asn Arg Leu Leu Glu Thr Val Glu Tyr Asn Ile Ser Gly
1475 1480 1485
Ala Glu Arg Thr Ala His Ile Ser Gly Leu Pro Pro Ser Thr Asp Phe
1490 1495 1500
Ile Val Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Pro Ser Ile Arg Thr Lys Thr Ile
1505 1510 1515 1520
Ser Ala Thr Ala Thr Thr Glu Ala Leu Pro Leu Leu Glu Asn Leu Thr
1525 1530 1535
Ile Ser Asp Ile Asn Pro Tyr Gly Phe Thr Val Ser Trp Met Ala Ser
1540 1545 1550
Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe Leu Val Thr Val Val Asp Ser Gly Lys
1555 1560 1565
Leu Leu Asp Pro Gln Glu Phe Thr Leu Ser Gly Thr Gln Arg Lys Leu
1570 1575 1580
Glu Leu Arg Gly Leu Ile Thr Gly Ile Gly Tyr Glu Val Met Val Ser
1585 1590 1595 1600
Gly Phe Thr Gln Gly His Gln Thr Lys Pro Leu Arg Ala Glu Ile Val
1605 1610 1615
Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val Asp Asn Leu Leu Val Ser Asp Ala Thr
1620 1625 1630
Pro Asp Gly Phe Arg Leu Ser Trp Thr Ala Asp Glu Gly Val Phe Asp
1635 1640 1645
Asn Phe Val Leu Lys Ile Arg Asp Thr Lys Lys Gln Ser Glu Pro Leu
1650 1655 1660
Glu Ile Thr Leu Leu Ala Pro Glu Arg Thr Arg Asp Leu Thr Gly Leu
1665 1670 1675 1680
Arg Glu Ala Thr Glu Tyr Glu Ile Glu Leu Tyr Gly Ile Ser Lys Gly
1685 1690 1695
Arg Arg Ser Gln Thr Val Ser Ala Ile Ala Thr Thr Ala Met Gly Ser
1700 1705 1710
Pro Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu Asn Ser Ala Thr Val
1715 1720 1725
Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile Thr Tyr
1730 1735 1740
Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp Gly Thr
1745 1750 1755 1760
Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val Glu Tyr Leu
1765 1770 1775
Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser Glu Pro Val Ser
1780 1785 1790
Gly Ser Phe Thr Thr Ala Leu Asp Gly Pro Ser Gly Leu Val Thr Ala
1795 1800 1805
Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ala Arg Trp Gln Pro Ala Ile Ala
1810 1815 1820
Thr Val Asp Ser Tyr Val Ile Ser Tyr Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu
1825 1830 1835 1840
Ile Thr Arg Thr Val Ser Gly Asn Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp
1845 1850 1855
Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr Thr Leu Arg Ile Phe Ala Glu Lys Gly
1860 1865 1870
Pro Gln Lys Ser Ser Thr Ile Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp
1875 1880 1885
Ser Pro Arg Asp Leu Thr Ala Thr Glu Val Gln Ser Glu Thr Ala Leu
1890 1895 1900
Leu Thr Trp Arg Pro Pro Arg Ala Ser Val Thr Gly Tyr Leu Leu Val
1905 1910 1915 1920
Tyr Glu Ser Val Asp Gly Thr Val Lys Glu Val Ile Val Gly Pro Asp
1925 1930 1935
Thr Thr Ser Tyr Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro Ser Thr His Tyr Thr
1940 1945 1950
Ala Lys Ile Gln Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg Ser Asn Met Ile Gln
1955 1960 1965
Thr Ile Phe Thr Thr Ile Gly Leu Leu Tyr Pro Phe Pro Lys Asp Cys
1970 1975 1980
Ser Gln Ala Met Leu Asn Gly Asp Thr Thr Ser Gly Leu Tyr Thr Ile
1985 1990 1995 2000
Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Ala Gln Ala Leu Glu Val Phe Cys Asp Met
2005 2010 2015
Thr Ser Asp Gly Gly Gly Trp Ile Val Phe Leu Arg Arg Lys Asn Gly
2020 2025 2030
Arg Glu Asn Phe Tyr Gln Asn Trp Lys Ala Tyr Ala Ala Gly Phe Gly
2035 2040 2045
Asp Arg Arg Glu Glu Phe Trp Leu Gly Leu Asp Asn Leu Asn Lys Ile
2050 2055 2060
Thr Ala Gln Gly Gln Tyr Glu Leu Arg Val Asp Leu Arg Asp His Gly
2065 2070 2075 2080
Glu Thr Ala Phe Ala Val Tyr Asp Lys Phe Ser Val Gly Asp Ala Lys
2085 2090 2095
Thr Arg Tyr Lys Leu Lys Val Glu Gly Tyr Ser Gly Thr Ala Gly Asp
2100 2105 2110
Ser Met Ala Tyr His Asn Gly Arg Ser Phe Ser Thr Phe Asp Lys Asp
2115 2120 2125
Thr Asp Ser Ala Ile Thr Asn Cys Ala Leu Ser Tyr Lys Gly Ala Phe
2130 2135 2140
Trp Tyr Arg Asn Cys His Arg Val Asn Leu Met Gly Arg Tyr Gly Asp
2145 2150 2155 2160
Asn Asn His Ser Gln Gly Val Asn Trp Phe His Trp Lys Gly His Glu
2165 2170 2175
His Ser Ile Gln Phe Ala Glu Met Lys Leu Arg Pro Ser Asn Phe Arg
2180 2185 2190
Asn Leu Glu Gly Arg Arg Lys Arg Ala
2195 2200
<210> 9
<211> 760
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln
325 330 335
Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu
500 505 510
Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu
725 730 735
Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu
740 745 750
Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
Claims (25)
- 사멸 수용체 항원에 특이적인 1 차 항원 결합 부위 및 2 차 항원에 특이적인 2 차 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체.
- 제 1 항에 있어서, 사멸 수용체가 DR4, DR5 또는 FAS, 바람직하게는 인간 DR4, 인간 DR5 또는 인간 FAS 에서 선택되는 이중특이적 항체.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 2 차 항원이 종양성 질환 또는 류마티스 관절염과 관련되는 이중특이적 항체.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 차 항원이 CEA, CRIPTO, ROBO4, MCSP, 테나신 C 및 FAP, 바람직하게는 인간 CEA, 인간 CRIPTO, 인간 ROBO4, 인간 MCSP, 인간 테나신 C 및 인간 FAP 에서 선택되는 이중특이적 항체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 1 차 항원이 DR5 및 FAS 에서 선택되고 2 차 항원이 CEA, CRIPTO, FAP 및 MCSP 에서 선택되는 이중특이적 항체.
- 제 5 항에 있어서, 이중특이적 항체 DR5 - CEA, DR5 - FAP, FAS - CRIPTO 및 FAS - MCSP 에서 선택되는 이중특이적 항체.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 1 차 항원 결합 부위를 포함하는 1 차 항체 및 2 차 항원 결합 부위를 포함하는 2 차 항체를 포함하는 이합체성 분자인 이중특이적 항체.
- 제 7 항에 있어서, 1 차 및 2 차 항체가 항체 중쇄의 Fc 부분을 포함하며, 1 차 항체의 Fc 부분이 1 차 이합체화 모듈을 포함하고 2 차 항체의 Fc 부분이 2 차 이합체화 모듈을 포함하여 2 개의 항체의 이종이합체화를 가능하게 하는 이중특이적 항체.
- 제 8 항에 있어서, 놉 인투 홀 (knobs into holes) 전략에 따라 1 차 이합체화 모듈이 놉 (knobs) 을 포함하고 2 차 이합체화 모듈이 홀 (holes) 을 포함하는 이중특이적 항체.
- 제 7 항에 있어서, 1 차 항체가 경쇄 및 중쇄를 포함하는 면역글로불린 (Ig) 분자이고 2 차 항체가 scFv, scFab, Fab 또는 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는 이중특이적 항체.
- 제 10 항에 있어서, Ig 분자가 사멸 수용체에 특이적인 1 차 항원 결합 부위를 포함하고 2 차 항체가 2 차 항원에 특이적인 2 차 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체.
- 제 10 항에 있어서, Ig 분자가 2 차 항원에 특이적인 2 차 항원 결합 부위를 포함하고 2 차 항체가 사멸 수용체에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체.
- 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 차 항체가 Ig 분자 중쇄의 N- 또는 C-말단에 융합되는 이중특이적 항체.
- 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 차 항체가 Ig 분자 경쇄의 N- 또는 C-말단에 융합되는 이중특이적 항체.
- 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, Ig 분자가 IgG 인 이중특이적 항체.
- 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 차 분자가 펩티드 링커, 바람직하게는 약 10 - 30 아미노산 길이의 펩티드 링커에 의해 Ig 분자에 융합되는 이중특이적 항체.
- 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 차 분자가 이황화물 결합을 형성하기 위해 추가적인 시스테인 잔기를 포함하는 이중특이적 항체.
- 제 10 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, Ig 분자가 야생형 Fc 부분에 비해 Fcγ 수용체에 대해 감소된 친화성을 갖는 Fc 변이체를 포함하는 이중특이적 항체.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 또는 류마티스 관절염 치료를 위한 이중특이적 항체.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 중쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 경쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열.
- 제 21 항 또는 제 22 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 제 23 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포.
- 특히 전술한 실시예를 참조로 하여, 본원에서 기재된 바와 같은 본 발명.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP09171659.7 | 2009-09-29 | ||
EP09171659 | 2009-09-29 | ||
PCT/EP2010/064209 WO2011039126A1 (en) | 2009-09-29 | 2010-09-27 | Bispecific death receptor agonistic antibodies |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20120056857A true KR20120056857A (ko) | 2012-06-04 |
KR101508043B1 KR101508043B1 (ko) | 2015-04-06 |
Family
ID=43086853
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020127007953A KR101508043B1 (ko) | 2009-09-29 | 2010-09-27 | 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9481730B2 (ko) |
EP (1) | EP2483310B1 (ko) |
JP (1) | JP5695059B2 (ko) |
KR (1) | KR101508043B1 (ko) |
CN (1) | CN102574921B (ko) |
AU (1) | AU2010303142B2 (ko) |
BR (1) | BR112012006326A2 (ko) |
CA (1) | CA2773515C (ko) |
CY (1) | CY1115639T1 (ko) |
DK (1) | DK2483310T3 (ko) |
ES (1) | ES2505269T3 (ko) |
HK (1) | HK1169132A1 (ko) |
HR (1) | HRP20141032T1 (ko) |
IL (1) | IL218437A (ko) |
MX (1) | MX2012003598A (ko) |
PL (1) | PL2483310T3 (ko) |
PT (1) | PT2483310E (ko) |
SI (1) | SI2483310T1 (ko) |
WO (1) | WO2011039126A1 (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190099223A (ko) * | 2016-12-22 | 2019-08-26 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 암 치료용 결합 분자 |
Families Citing this family (54)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090162359A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
PE20120591A1 (es) * | 2009-04-02 | 2012-05-23 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla |
US20100256340A1 (en) | 2009-04-07 | 2010-10-07 | Ulrich Brinkmann | Trivalent, bispecific antibodies |
US9676845B2 (en) | 2009-06-16 | 2017-06-13 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bispecific antigen binding proteins |
US20120302737A1 (en) | 2009-09-16 | 2012-11-29 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
TW201138821A (en) | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
EA034742B1 (ru) | 2010-08-13 | 2020-03-16 | Роше Гликарт Аг | Антитела к fap, полинуклеотид, вектор и клетка для их получения и их применения |
KR101586128B1 (ko) | 2010-08-24 | 2016-01-15 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 디술피드 안정화 ― Fv 단편을 포함하는 이중특이적 항체 |
MX344200B (es) | 2010-10-29 | 2016-12-08 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Novedoso anticuerpo anti-dr5. |
BR112013013311A2 (pt) | 2010-11-30 | 2017-09-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | agente terapêutico de indução de citotoxicidade |
JP5766296B2 (ja) | 2010-12-23 | 2015-08-19 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用 |
RS62238B1 (sr) | 2011-02-10 | 2021-09-30 | Roche Glycart Ag | Mutantni interleukin-2 polipeptidi |
RU2607038C2 (ru) | 2011-02-28 | 2017-01-10 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Антигенсвязывающие белки |
EP2681240B1 (en) | 2011-02-28 | 2017-08-16 | F. Hoffmann-La Roche AG | Monovalent antigen binding proteins |
JP6046642B2 (ja) | 2011-03-02 | 2016-12-21 | ロシュ グリクアート アーゲー | Cea抗体 |
EA201892619A1 (ru) | 2011-04-29 | 2019-04-30 | Роше Гликарт Аг | Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2 |
CN104105711B (zh) | 2012-02-10 | 2018-11-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 单链抗体及其他异多聚体 |
KR102023401B1 (ko) | 2012-05-10 | 2019-11-04 | 바이오아트라, 엘엘씨 | 다중-특이적 모노클로날 항체 |
CN104395339A (zh) | 2012-06-27 | 2015-03-04 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于选择并产生含有至少两种不同结合实体的定制高度选择性和多特异性靶向实体的方法及其用途 |
CN104411718B (zh) | 2012-06-27 | 2018-04-24 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于制备包含特异性结合靶的至少一种结合实体的抗体Fc区缀合物的方法及其用途 |
RU2015140921A (ru) * | 2013-02-26 | 2017-04-03 | Роше Гликарт Аг | Антитела к mcsp |
US20160067337A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-03-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Combination of dr5 agonist and anti-pd-1 antagonist and methods of use |
UA118028C2 (uk) * | 2013-04-03 | 2018-11-12 | Рош Глікарт Аг | Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування |
GB201317928D0 (en) | 2013-10-10 | 2013-11-27 | Ucl Business Plc | Molecule |
CN105612182B (zh) | 2013-10-11 | 2019-12-10 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 多特异性结构域交换共有可变轻链抗体 |
MX2016012552A (es) * | 2014-04-07 | 2017-01-09 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molecula ligada a antigeno inmunoactivada. |
BR112016026299A2 (pt) | 2014-05-13 | 2018-02-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | molécula de ligação ao antígeno redirecionado à célula t para células tendo função de imunossupressão |
CA2962124A1 (en) * | 2014-10-08 | 2016-04-14 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy of bispecific antibodies specific for fap and dr5 and chemotherapeutic agents |
JP6779873B2 (ja) * | 2014-11-12 | 2020-11-04 | メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター | 抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4抗体およびその使用 |
MX2020012798A (es) | 2014-11-14 | 2022-04-07 | Hoffmann La Roche | Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf. |
US11566082B2 (en) | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
EP3227332B1 (en) | 2014-12-03 | 2019-11-06 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific antibodies |
EP3237451B1 (en) * | 2014-12-23 | 2019-07-24 | Università degli Studi di Parma | Pro-apoptotic anti-ng2/cspg4 antibodies and their uses for disease therapy |
RU2017129236A (ru) | 2015-01-26 | 2019-03-07 | Макродженикс, Инк. | Мультивалентные молекулы, содержащие dr5-связывающие домены |
CN104818295A (zh) * | 2015-02-03 | 2015-08-05 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法 |
JP6996979B2 (ja) | 2015-03-31 | 2022-02-04 | エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 三量体tnfファミリーリガンドを含む抗原結合分子 |
AR106188A1 (es) | 2015-10-01 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización |
US20180282410A1 (en) * | 2015-10-02 | 2018-10-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Anti-cd3xrob04 bispecific t cell activating antigen binding molecules |
US10526413B2 (en) | 2015-10-02 | 2020-01-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific antibodies specific for OX40 |
EP3378488A4 (en) | 2015-11-18 | 2019-10-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHOD FOR ENHANCING THE HUMORAL IMMUNE RESPONSE |
US11660340B2 (en) | 2015-11-18 | 2023-05-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function |
US10703774B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-07-07 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
JP7106187B2 (ja) | 2016-05-11 | 2022-07-26 | サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ | 分離マトリックスを保存する方法 |
EP3455243B1 (en) | 2016-05-11 | 2021-03-24 | Cytiva BioProcess R&D AB | Separation matrix |
EP3455241B1 (en) | 2016-05-11 | 2022-02-23 | Cytiva BioProcess R&D AB | Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix |
US10889615B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-01-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
US10730908B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-08-04 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
US10654887B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-05-19 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Separation matrix |
EP3565560B1 (en) | 2017-01-09 | 2024-05-29 | OnkosXcel Therapeutics, LLC | Predictive and diagnostic methods for prostate cancer |
EP3710482A4 (en) * | 2017-11-14 | 2021-08-18 | University Of Virginia Patent Foundation | COMPOSITIONS AND METHODS OF MANUFACTURING AND USING BISPECIFIC ANTIBODIES |
WO2020028635A1 (en) * | 2018-08-01 | 2020-02-06 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Optimized synthetic consensus immunogenic compositions targeting chondroitin sulfate proteoglycan 4 (cspg4) |
IL313258A (en) * | 2021-12-20 | 2024-08-01 | F Hoffmann La Roche Ag | Agonist LTBR antibodies and their component bispecific antibodies |
US20240052065A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-02-15 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Binding molecules for the treatment of cancer |
WO2024102962A1 (en) | 2022-11-10 | 2024-05-16 | Immuvia Inc | Cytotoxic bispecific antibodies binding to dr5 and muc16 and uses thereof |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3101690B2 (ja) | 1987-03-18 | 2000-10-23 | エス・ビィ・2・インコーポレイテッド | 変性抗体の、または変性抗体に関する改良 |
US5204244A (en) | 1987-10-27 | 1993-04-20 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
US5202238A (en) | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
US5580774A (en) * | 1989-07-31 | 1996-12-03 | Eli Lilly And Company | Chimeric antibodies directed against a human glycoprotein antigen |
GB9317423D0 (en) | 1993-08-21 | 1993-10-06 | Imp Cancer Res Tech | Monoclonal antibodies |
DE10034607A1 (de) * | 2000-07-20 | 2002-02-07 | Gundram Jung | Multispezifisches Reagenz zur selektiven Stimulierung von Zelloberflächenrezeptoren |
DE10045591A1 (de) * | 2000-09-15 | 2002-04-04 | Klaus Pfizenmaier | Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine) |
US20020155109A1 (en) * | 2001-04-20 | 2002-10-24 | Lynch David H. | Bispecific antibodies that bind TRAIL-R1 and TRAIL-R2 |
US7232888B2 (en) | 2002-07-01 | 2007-06-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Antibodies against tumor surface antigens |
BRPI0509201A (pt) * | 2004-03-23 | 2007-08-28 | Biogen Idec Inc | agentes de acoplamento de receptor e usos terapêuticos destes |
WO2007024249A2 (en) * | 2004-11-10 | 2007-03-01 | Macrogenics, Inc. | Engineering fc antibody regions to confer effector function |
NZ556788A (en) * | 2005-01-05 | 2011-03-31 | Biogen Idec Inc | Humanized CRIPTO binding molecules with CDRs from murine B3F6 |
US8029783B2 (en) | 2005-02-02 | 2011-10-04 | Genentech, Inc. | DR5 antibodies and articles of manufacture containing same |
JP5620626B2 (ja) | 2005-03-31 | 2014-11-05 | 中外製薬株式会社 | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
EA034742B1 (ru) | 2010-08-13 | 2020-03-16 | Роше Гликарт Аг | Антитела к fap, полинуклеотид, вектор и клетка для их получения и их применения |
UA118028C2 (uk) | 2013-04-03 | 2018-11-12 | Рош Глікарт Аг | Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування |
-
2010
- 2010-09-27 DK DK10757604.3T patent/DK2483310T3/da active
- 2010-09-27 SI SI201030786T patent/SI2483310T1/sl unknown
- 2010-09-27 CA CA 2773515 patent/CA2773515C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-27 PT PT107576043T patent/PT2483310E/pt unknown
- 2010-09-27 KR KR1020127007953A patent/KR101508043B1/ko active IP Right Grant
- 2010-09-27 WO PCT/EP2010/064209 patent/WO2011039126A1/en active Application Filing
- 2010-09-27 EP EP10757604.3A patent/EP2483310B1/en active Active
- 2010-09-27 BR BR112012006326A patent/BR112012006326A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-09-27 ES ES10757604.3T patent/ES2505269T3/es active Active
- 2010-09-27 AU AU2010303142A patent/AU2010303142B2/en not_active Ceased
- 2010-09-27 PL PL10757604T patent/PL2483310T3/pl unknown
- 2010-09-27 JP JP2012531338A patent/JP5695059B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-27 CN CN201080043541.2A patent/CN102574921B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-27 MX MX2012003598A patent/MX2012003598A/es active IP Right Grant
- 2010-09-27 US US13/498,390 patent/US9481730B2/en active Active
-
2012
- 2012-03-01 IL IL218437A patent/IL218437A/en active IP Right Grant
- 2012-10-10 HK HK12109973.8A patent/HK1169132A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-10-10 CY CY20141100823T patent/CY1115639T1/el unknown
- 2014-10-27 HR HRP20141032AT patent/HRP20141032T1/hr unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190099223A (ko) * | 2016-12-22 | 2019-08-26 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 암 치료용 결합 분자 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102574921A (zh) | 2012-07-11 |
CA2773515A1 (en) | 2011-04-07 |
CY1115639T1 (el) | 2017-01-04 |
SI2483310T1 (sl) | 2014-12-31 |
AU2010303142B2 (en) | 2013-05-09 |
IL218437A (en) | 2017-04-30 |
CN102574921B (zh) | 2016-05-04 |
US9481730B2 (en) | 2016-11-01 |
PT2483310E (pt) | 2014-10-07 |
MX2012003598A (es) | 2012-04-20 |
HK1169132A1 (zh) | 2013-01-18 |
CA2773515C (en) | 2015-04-28 |
HRP20141032T1 (hr) | 2015-01-30 |
DK2483310T3 (da) | 2014-09-01 |
AU2010303142A1 (en) | 2012-03-15 |
KR101508043B1 (ko) | 2015-04-06 |
WO2011039126A1 (en) | 2011-04-07 |
JP2013505732A (ja) | 2013-02-21 |
ES2505269T3 (es) | 2014-10-09 |
BR112012006326A2 (pt) | 2016-11-16 |
EP2483310A1 (en) | 2012-08-08 |
PL2483310T3 (pl) | 2015-01-30 |
US20120184718A1 (en) | 2012-07-19 |
EP2483310B1 (en) | 2014-08-13 |
JP5695059B2 (ja) | 2015-04-01 |
IL218437A0 (en) | 2012-04-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101508043B1 (ko) | 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체 | |
JP2013505732A5 (ko) | ||
US20180194862A1 (en) | Bispecific binding proteins | |
JP6708635B2 (ja) | CD3εおよびROR1に対する二特異性抗体 | |
US20170306044A1 (en) | Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 for use in the treatment of ovarian cancer | |
JP5501439B2 (ja) | 完全長抗体と単鎖Fabフラグメントとを含む多重特異的抗体 | |
KR20180103084A (ko) | Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물 | |
US20230235090A1 (en) | Bispecific antibody and use thereof | |
JP7510209B2 (ja) | ヘルパーT細胞TGF-βシグナルを特異的に中和する二重特異性抗体、その薬物組成物およびその使用 | |
CN112805068A (zh) | 靶向cd137的抗体及其使用方法 | |
WO2023109888A1 (zh) | 抗ang2-vegf双特异性抗体及其用途 | |
WO2024109678A1 (en) | Anti-cd137 antibodies and methods of use | |
WO2022242679A1 (en) | Anti-cd137 antibodies and methods of use | |
JP2024531462A (ja) | Fap/cd40結合分子及びその医薬的使用 | |
KR20240049318A (ko) | Fap/cd40 결합 분자 및 이의 의학적 용도 | |
AU2013203431A1 (en) | Bispecific death receptor agonistic antibodies |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171228 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181227 Year of fee payment: 5 |