JP2003509377A - 過剰なアンドロゲン状態を処置するためのミューラー阻害物質の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１以上のアンドロゲンの過剰によって特徴付けられる状態または疾患を処置する方法を提供し、該方法は、患者に有効量のＭＩＳタンパク質またはＭＩＳをコードする核酸を投与する工程を包含する。本発明はまた、１以上のアンドロゲンのレベルを正常レベル未満に低下させる方法を提供し、該方法は、有効量のＭＩＳタンパク質またはＭＩＳをコードする核酸を患者に投与する工程を包含する。本発明の方法は、前立腺癌、多嚢胞性卵巣疾患、良性前立腺肥大および性的早熟の処置に特によく適する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （資金提供を受けた研究および開発の下で行われた発明に対する権利に関する
記述） 本発明の開発の間に行われた研究の一部は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ助成金番号Ｒ２９ＣＡ７９４５９、ならびにＮａｔｉｏｎ
ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍ
ａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ助成金番号ＲＯ１−ＨＤ−３２１１２、Ｐ３０−
ＨＤ−２８１３８、Ｆ３２−ＨＤ−０７９５４、およびＵ５４ＨＤ３１３９８の
合衆国政府資金を利用した。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する
。

【０００２】 （発明の分野） 本出願は、一般に、前立腺癌、多嚢胞性卵巣疾患、良性前立腺肥大、および性
的早熟を処置する方法に関する。

【０００３】 （関連技術） ミューラー阻害物質（ＭＩＳ）は、トランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ
−β）ファミリーの増殖因子および分化因子のメンバーである。性的に重要でな
い性腺が精巣決定因子（ＳＲＹ）の影響下で精巣発生に方向付けた後、胎児精巣
のセルトリ細胞は、ＭＩＳ（精巣発生の表現型的に顕著な特徴である）を獲得し
始める（Ｓｗａｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：７６１−７６７（１９９８））
。ＭＩＳ（抗ミューラーホルモン（Ｊｏｓｓａら、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ．Ｈ
ｏｒｍ．Ｒｅｓ．４８：１−５９（１９９３））としても公知）は、正常な雄性
生殖路発生に絶対的に必要である。なぜなら、これは、両能性尿生殖隆線のミュ
ーラー管の退行に影響を及ぼすからである。ミューラー管は、退行しないままで
ある場合、雌性生殖路構造（例えば、子宮、ファローピウス管、および上部膣）
を生じる（Ｊｏｓｔ，Ａ．，Ａｒｃｈ．Ａｎａｔ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｍｏｒｐｈ
ｏｌ．Ｅｘｐ．３６：２７１−３１５（１９４７）；Ｃａｔｅら、Ｃｅｌｌ ４
５：６８５−６９８（１９８６）；ＴｅｉｘｅｉｒａおよびＤｏｎｏｈｏｅ，Ｊ
．Ａｎｄｒｏｌ．１７：３３６−３４１（１９９６））。成体の卵巣および精巣
はまた、胎児雄性におけるレベルよりはるかに低いレベルであってもＭＩＳを生
成し、そしてこれらの状況においてＭＩＳにより果たされるこの機能的役割は、
十分には解明されていない（Ｕｅｎｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２３
：１６５２−１６５９（１９８８）；Ｔｓａｆｒｉｒｉら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒ
ｏｄ．３８：４８１−４８５（１９８８））。しかし、ラットにおける研究によ
り、卵母細胞成熟におけるＭＩＳの役割（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４７：２２５−２３４（１９８６））、ならびに
ヒト卵巣においては、顆粒球細胞増殖のブロックおよびステロイド生成の減少（
Ｋｉｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７５：９１１−
９１７（１９９２）；Ｓｅｉｆｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．
Ｍｅｔａｂ．７６：７１１−７１４（１９９３））におけるＭＩＳの役割が示唆
されている。

【０００４】 （発明の要旨） 本発明は、１以上のアンドロゲンの過剰により特徴付けられる状態または疾患
を処置する方法を提供し、この方法は、有効量のＭＩＳを患者に投与する工程を
包含する。

【０００５】 本発明はまた、１以上のアンドロゲンの過剰により特徴付けられる状態または
疾患を処置する方法を提供し、この方法は、ＭＩＳをコードする有効量の核酸を
患者に投与する工程を包含する。

【０００６】 本発明はまた、１以上のアンドロゲンの血漿レベルを減少させる方法を提供し
、この方法は、有効量のＭＩＳを患者に投与する工程を包含する。ここで、ＭＩ
Ｓの量は、１以上のアンドロゲンの血漿レベルを１以上のアンドロゲンの正常な
レベル未満に減少させるに十分である。

【０００７】 本発明はまた、１以上のアンドロゲンの血漿レベルを減少する方法を提供し、
この方法は、ＭＩＳをコードする有効量の核酸を患者に投与する工程を包含する
。ここで、ＭＩＳの量は、１以上のアンドロゲンの血漿レベルを１以上のアンド
ロゲンの正常なレベル未満に減少させるに十分である。

【０００８】 本発明の方法は、特に、前立腺癌、多嚢胞性卵巣疾患、良性前立腺肥大、およ
び性的早熟の処置に十分適している。

【０００９】 （詳細な説明） 用語「ミューラー阻害物質」、「ＭＩＳ」、および「抗ミューラーホルモン」
は、同義語である。

【００１０】 １つ以上のアンドロゲンの過剰によって特徴付けられる症状または疾患として
は、多嚢胞性卵巣疾患または多嚢胞性卵巣症候群、性的早熟、およびマックキュ
ーン−オールブライト症候群からなる群から選択される症状または疾患が挙げら
れるがこれらに限定されない。アンドロゲンレベルが過剰であるか否かは、臨床
的化学（尿分析、および血液分析、血清分析または血漿分析を含む）を使用して
当業者によって容易に診察され得る。

【００１１】 用語「アンドロゲン」は、テストステロンおよびその代謝産物（例えば、ジヒ
ドロテストステロン、アンドロステロン、エストラジオール、およびエチオコラ
ノロン）を含む。従って、１つ以上のアンドロゲン（例えば、テストステロンま
たはその代謝産物）の過剰によって特徴付けられる症状または疾患は、正常レベ
ルのアンドロゲンと比較して、増加している。例えば、テストステロンの正常な
血漿レベルは、約１０〜３５ｎｍｏｌ／Ｌ（約３〜１０ｎｇ／ｍＬ）である。例
えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版、Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．ら編、ＭｃＧａｗ−Ｈｉ
ｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）２０４０頁、表３３２−２を参照のこと（
この内容は参考として援用される）。

【００１２】 患者が、１つ以上のアンドロゲンの過剰、特に多嚢胞性卵巣疾患もしくは多嚢
胞性卵巣症候群または性的早熟によって特徴付けられる症状または疾患を有する
か否かは、身体調査、臨床的化学分析、家族歴、および患者面接に基づいて、当
業者によって容易に診断され得る。例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版、Ｆａｕｃ
ｉ，Ａ．Ｓ．ら編、ＭｃＧａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）を参
照のこと。

【００１３】 良性前立腺肥大を有する患者（この患者にＭＩＳまたはＭＩＳをコードする核
酸が投与される）において、前立腺肥大の程度は消滅するかまたは減少する。前
立腺肥大の程度およびそこにおける変化は、当業者によって容易に決定され得る
。

【００１４】 前立腺癌を有する患者（この患者にＭＩＳまたはＭＩＳをコードする核酸が投
与される）において、腫瘍の進行（原発性かまたは転移性）は停止するかまたは
遅くなる。腫瘍の進行（原発性かまたは転移性）は、例えば、組織生検、超音波
、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＡＴスキャニング）
、または触診によって、当業者によって容易に決定され得る。

【００１５】 ミューラー阻害物質（ＭＩＳ）は、胎児の精巣によって、オス精巣におけるミ
ューラー管の後退の原因となる１４０ｋＤａのグリコシル化ジスルフィド結合ホ
モ二量体として産生される。還元条件下で、このタンパク質は、見かけ上７０ｋ
Ｄａの分子量で電気泳動ゲル上を移動する。このタンパク質は、外因性プラスミ
ンによってタンパク分解的に、インタクトの５３５アミノ酸モノマーの４２７残
基で切断を有して、５７ｋＤａおよび１２．５ｋＤａ部分として電気泳動的に移
動する２つの別個のタンパク質に切断され得る（Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１８９６１−４（１９８８））。

【００１６】 用語「ＭＩＳのカルボキシル末端（Ｃ末端）フラグメント」は、インタクトな
５３５アミノ酸ヒトＭＩＳモノマーの残基４２７でタンパク分解性（例えば、プ
ラスミン）切断から生じるＭＩＳの約１２．５ｋＤａ（非還元条件下で約２５ｋ
Ｄａ）のＣ末端フラグメントに構造的に類似する化合物および物質を含むことが
意図される。タンパク分解性（例えば、プラスミン）切断部位は、５５１アミノ
酸のウシＭＩＳ分子の残基４４３に存在する。特に「ＭＩＳのカルボキシル末端
（Ｃ末端）フラグメント」は、ＭＩＳの約２５ｋＤａホモ二量体Ｃ末端フラグメ
ントを含むことが意図される。

【００１７】 「ＭＩＳのＮ末端フラグメント」は、上記の５３５アミノ酸ヒトＭＩＳモノマ
ー（５５１アミノ酸ウシＭＩＳの残基４４３）の残基４２７での切断から生じる
約５７ｋＤａのフラグメントを意図する。

【００１８】 ＭＩＳの完全なヌクレオチド配列は、米国特許第５，０４７，３３６号におい
て開示される（これは本明細書中で参考として援用される）。ウシＭＩＳのＣ末
端アミノ酸およびヌクレオチド配列を米国特許第５，６６１，１２６号の図１７
に示す（その全体が本明細書中に参考として援用される）。ヒトＭＩＳのＣ末端
アミノ酸およびヌクレオチド配列を米国特許第５，６６１，１２６号の図１８に
示す。Ｎ末端およびＣ末端を示す、ヒトおよびウシＭＩＳのアミノ酸配列の比較
は、Ｃａｔｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌｏｇｙ ９５／ＩＩ：１８４、Ｍ．Ｂ．ＳｐｏｏｎおよびＡ．Ｂ．
Ｒｏｂｅｒｔｓ編、Ｓｐｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇ（１９９０）において示される（これは、本明細書中に参考として援
用される）。

【００１９】 さらに、本発明の方法は、ＭＩＳのＣ末端フラグメントと実質上同一の生物学
的活性を有するＭＩＳのＣ末端フラグメントの変異体形態を使用して実施され得
る。このような変異体形態の例は、アミノ酸配列の欠失、挿入、または変更を有
するＭＩＳ分子のＣ末端フラグメントである。特に、ＭＩＳのＣ末端フラグメン
トは、インビボでのその半減期を増加するために改変され得る。例えば、Ｃ末端
フラグメントのアミノ末端および／またはカルボキシル末端に１つ以上のアミノ
酸または他の化学薬剤を付加することは、フラグメントの安定性を増加するため
に使用され得る。

【００２０】 ＭＩＳのＣ末端フラグメントは、哺乳動物供給源からかもしくは組換えＤＮＡ
技術の使用を介してか、またはＣ末端のポリペプチドの化学的合成から獲得され
得る。

【００２１】 遺伝子が組換えＤＮＡ技術の適用から生じる場合、遺伝子は「組換え」である
といわれる。組換えＤＮＡ技術の例としては、クローニング、突然変異誘発、形
質転換などが挙げられる。組換えＤＮＡ技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２，１９８９）に開示
される。「組換えＭＩＳ」は、組換え方法を使用して調製される、ＭＩＳポリペ
プチド、またはそのフラグメント、および特にＣ末端フラグメントをいう。

【００２２】 組換えＭＩＳは、タンパク質発現系において発現され得る。原核生物発現系お
よび真核生物発現系の使用は、当業者によって十分に理解される。例えば、細菌
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系、真菌（例えば、酵母）発現系、哺乳動物細胞
（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞）発現系または昆虫細胞（例えば、バキュロ
ウイルス細胞）発現系が、使用され得る。例えば、Ｃ末端フラグメント（ヒトま
たはウシ）は、米国特許第５，０４７，３３６号に記載される組換えＤＮＡ技術
によって容易に産生され得、これは本明細書中において十分に参考として援用さ
れる。Ｃ末端フラグメントはグリコシル化されないため、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他
の細菌中のＣ末端フラグメントの発現は、特に興味深い。

【００２３】 特定のクローニングビヒクルまたは発現ビヒクル内で、種々の部位が、ＭＩＳ
またはＭＩＳのＣ末端フラグメントに対してコードする遺伝子の挿入のために選
択され得る。これらの部位は、通常、それらを切断し当業者によって十分に理解
される制限エンドヌクレアーゼによって示される。組換えＤＮＡ分子を形成する
ためにＤＮＡ配列をこれらの部位に挿入するための種々の方法はまた、周知であ
る。これらには、例えば、ｄＧ−ｄＣまたはｄＡ−ｄＴテーリング（ｔａｉｌｉ
ｎｇ）、直接連結、合成リンカー、エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ関連
修復反応およびその後の連結、またはＤＮＡポリメラーゼおよび適切な一本鎖テ
ンプレートを用いるＤＮＡ鎖の伸長およびその後の連結が挙げられる。当然、本
発明において有用なクローニングビヒクルまたは発現ビヒクルが、選択されたＤ
ＮＡフラグメントの挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有することを必
要としないことは、理解される。実際に、ビヒクルは、代替の手段によってフラ
グメントに接合され得る。

【００２４】 種々の発現調節配列はまた、組換えＤＮＡ配列の発現を実施するために選択さ
れ得る。これらの発現調節配列として、例えば、ｌａｃ系、β−ラクタマーゼ系
、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主なオペレーター領域およびプ
ロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼまたは他の解糖酵素に対するプロモーター、酸ホスホターゼ（例えば、Ｐ
ｈｏ５）のプロモーター、酵母α−交配因子のプロモーター、哺乳動物細胞に対
するプロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター）、アデノウイルス後期
プロモーターおよびメタロチオニンプロモーター、および原核生物細胞または真
核生物細胞またはそれらのウイルスおよびそれらの種々の組み合わせの遺伝子の
発現を調節することが公知の他の配列が挙げられる。哺乳動物細胞において、遺
伝子をジヒドロ葉酸還元酵素についてのそれに連結することによって、および宿
主中国ハムスター卵巣細胞に選択肢を適用することによって、発現ユニットを増
幅することが、さらに可能である。

【００２５】 組換えＤＮＡ配列の発現のために、これらのＤＮＡ配列は、発現ベクター内の
上記の発現調節配列の１種以上に作動可能に連結される。このような作動可能な
連結（これは、ＭＩＳまたはＭＩＳ ＤＮＡ配列のＣ末端フラグメントがクロー
ンビヒクル内に挿入される前または後に実施され得る）は、発現調節配列がＤＮ
Ａ配列の発現を調節および促進するのを可能にする。

【００２６】 ベクターまたは発現ビヒクル、特に本発明で使用される選択されたＤＮＡフラ
グメントおよび発現調節配列の挿入のためにその中で選択された部位は、種々の
因子、例えば、特定の制限酵素に対して感受性の部位の数、発現されるタンパク
質のサイズ、ベクター配列に対する開始コドンおよび終止コドンのような発現特
性、および当業者によって理解される他の因子によって決定される。ベクターの
選択、発現調節配列、およびＭＩＳのついての挿入部位またはＭＩＳ ＤＮＡ配
列のＣ末端フラグメントは、これらの因子のバランスによって決定され、全ての
選択肢が与えられた場合について等しく効果的あるわけではない。

【００２７】 クローニングビヒクルまたは発現ビヒクルの選択された部位において挿入され
る、ＭＩＳまたはＭＩＳのＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡ配列が、ＭＩ
ＳまたはＭＩＳのＣ末端フラグメントをコードする実際の遺伝子の一部ではない
ヌクレオチドを含み得るか、あるいはその実際の遺伝子のフラグメントのみを含
み得ることもまた、理解されるべきである。いかなるＤＮＡ配列が使用されよう
と、形質転換された宿主がＭＩＳまたはＭＩＳのＣ末端フラグメントを産生する
ことが唯一必要とされる。例えば、本発明のＭＩＳ ＤＮＡ配列は、少なくとも
１つの真核生物シグナル配列または原核生物シグナル配列、またはそれらの組み
合わせをコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部に対して、本発明の発現ベクタ
ー内の同じリーディングフレーム内で融合され得る。このような構築物は、例え
ば、本発明の一部である、メチオニルまたは他のペプチジル−ＭＩＳポリペプチ
ドの産生を可能にする。次いで、このＮ末端メチオニンまたはペプチドは、種々
の公知のプロセスによって細胞内でまたは細胞外で切断され得るか、あるいは、
メチオニンまたはペプチドが結合したＭＩＳポリペプチドが、切断されずに、本
発明の薬学的組成物および方法において使用され得る。

【００２８】 本発明のＭＩＳまたはＭＩＳポリペプチドコード配列のＣ末端フラグメントを
含有するクローニングビヒクルまたは発現ベクターは、初期腫瘍増殖または転移
性腫瘍増殖を阻害するための有効量のＭＩＳまたは有効量のＭＩＳのＣ末端フラ
グメントの発現を可能にするように腫瘍細胞を形質転換するために本発明に従っ
て使用される。

【００２９】 示されるように、ＭＩＳポリペプチド（本発明に従って調製された）として、
融合タンパク質の形態のポリペプチド（例えば、活性Ｃ末端フラグメントを放出
するために、排出を指向し、安定性を改善し、精製を改善し、またはアミノ酸残
基４４３における可能な切断を改善するために、真核生物、原核生物、または組
み合わせのＮ末端セグメントに連結された）、ＭＩＳの前駆体の形態のポリペプ
チド（例えば、他の真核生物シグナル配列または原核生物シグナル配列のＭＩＳ
シグナル配列の全てまたは一部で開始する）、成熟ＭＩＳポリペプチドの形態の
ポリペプチド、またはｆｍｅｔ−ＭＩＳポリペプチドの形態のポリペプチドが挙
げられ得ることが理解されるべきである。

【００３０】 本発明はまた、ＭＩＳのコドンまたはＭＩＳヌクレオチド配列のＣ末端フラグ
メントをコドンに置換する工程を包含する。これらの置換されるコドンは、置き
換えられるコドンによってコードされるアミノ酸と同一のアミノ酸をコードし得
るが、より高い収量のポリペプチドを生じ得る。あるいは、アミノ酸置換あるい
はより長いかまたは短いポリペプチドを導く１つまたは組み合わせのコドンの置
換は、有用な方法でその性質を変化させ得る（例えば、安定性の増加、溶解性の
増加または治療活性の増加）。

【００３１】 あるいは、非組換えＭＩＳまたはそのフラグメント、および特にＣ末端フラグ
メントは、本発明の方法において使用され得る。非組換えＭＩＳを精製するため
の方法は、当業者に周知である。米国特許第４，４０４，１８８号、同第４，４
８７，８３３号および同第５，０１１，６８７号を参照のこと。

【００３２】 （ＭＩＳポリペプチド送達方法） ＭＩＳポリペプチドまたはそのフラグメントおよびＭＩＳコード核酸は、薬学
的組成物の形態で投与され得る。薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製
するために公知な方法に従って処方され得、これによってＭＩＳまたはＭＩＳの
Ｃ末端フラグメントまたはそれらの機能的誘導体が薬学的に受容可能なキャリア
ビヒクルとの混合物で組み合わせられる。適切なビヒクルおよびそれらの処方物
（他のヒトタンパク質（すなわち、ヒト血清アルブミン）を含む）は、例えば、
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、
第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．、Ｅｓｔｏｎ、Ｐ
Ａ（１９９０）に記載される。効果的な投与に適切な薬学的に受容可能な組成物
を形成するために、このような組成物は、適切な量のキャリアビヒクルとともに
、有効量のＭＩＳまたはＭＩＳのＣ末端フラグメントまたはそれらの機能的誘導
体を含む。

【００３３】 本発明の１つの実施形態において、「有効量」のＭＩＳは、多嚢胞性卵巣疾患
または多嚢胞性卵巣症候群の進行を抑制するおよび／またはその重篤度を減少す
るか、あるいは性的早熟を遅らせるおよび／または進行を停止するのに十分な量
である。同様に、「有効量」のＭＩＳのＣ末端フラグメントは、多嚢胞性卵巣疾
患または多嚢胞性卵巣症候群の進行を抑制するおよび／またはその重篤度を減少
するか、あるいは性的早熟を遅らせるおよび／または進行を停止するのに十分な
量である。

【００３４】 本発明の別の実施形態において、「有効量」のＭＩＳは、１つ以上のアンドロ
ゲン（テストステロンおよび／またはその代謝物（例えば、ジヒドロテストステ
ロン、アンドロステロン、エストラジオール、およびエチオコラノロン）を含む
）の血漿レベルを正常レベルより下に下げるのに十分な量である。テストステロ
ンの正常な血漿レベルは、約１０〜３５ｎｍｏｌ／Ｌ（約３〜１０ｎｇ／ｍＬ）
より下である。Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版、Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．ら編、ＭｃＧａ
ｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）、２０４０頁、表３３２−２を参
照のこと（この内容は、参考として援用される）。好ましい実施形態において、
有効量のＭＩＳは、約１０〜３５ｎｍｏｌ／Ｌ（約３〜１０ｎｇ／ｍＬ）より下
のテストステロンの血漿レベルを減少するのに十分な量である。特に好ましい実
施形態において、有効量のＭＩＳは、約１５〜３０ｎｍｏｌ／Ｌより下のテスト
ステロンの血漿レベルを減少するのに十分な量である。なおより好ましい実施形
態において、有効量のＭＩＳは、約２０〜２５ｎｍｏｌ／Ｌより下のテストステ
ロンの血漿レベルを減少するのに十分な量である。

【００３５】 有効量は、レシピエントの年齢、体重、身体的条件、過去の医学的履歴、およ
び重症度のような基準に依存して変化し得る。有効量はまた、投与が、経口的か
、静脈内的か、筋肉内的か、皮下的か、局所的か、または腫瘍への直接的適用で
あるかに依存して変化する。直接的な腫瘍への適用の場合、少なくとも０．１ｎ
Ｍ、好ましくは０．１〜１．０ｎＭのＭＩＳの最終血清濃度が達成されることが
好ましい。同様に、ＭＩＳのＣ末端フラグメントの直接的な腫瘍適用について、
少なくとも０．１ｎＭ、好ましくは約０．１〜１．０ｎＭのＭＩＳのＣ末端フラ
グメントの最終血清濃度が達成されることが好ましい。さらに指名される手段の
投与による有効な個々の投薬量は、当業者に周知の方法によって容易に決定され
得る。例えば、上記のようなサイズ比の計算を使用して、当業者は、任意の手段
の投与のための最適な投薬レベルを決定し得る。患者を処置する際に、少なくと
も１０ｎｇ／ｍｌのＭＩＳの血清濃度を達成することが好ましい。患者をＭＩＳ
のＣ末端フラグメントで処理する際に、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌのＭ
ＩＳのＣ末端フラグメントの範囲の血清レベルを達成することが好ましい。

【００３６】 組成物は、その投与がレシピエントの患者によって耐性であり得る場合、「薬
学的に受容可能」であると言われる。このような薬剤は、その存在がレシピエン
トの患者の生理学的状態において検出可能な変化を生じる場合、生理学的に有意
であると言われる。

【００３７】 ＭＩＳまたはＭＩＳのＣ末端フラグメントまたはそれらの機能的誘導体を含む
組成物は、経口的、静脈内的、筋肉内的、皮下的、または局所的に投与され得る
。さらなる薬学的方法は、作用の期間を制御するために使用され得る。制御放出
調製物は、ＭＩＳまたはＭＩＳのＣ末端フラグメントまたはそれらの機能的誘導
体を複合体化するかまたは吸収するためのポリマーの使用によって達成され得る
。制御送達は、適切な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビ
ニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロース、および硫酸プロタミン）および巨大分子の濃度ならびに放出を
制御するための組み込み方法を選択することによってなされ得る。

【００３８】 制御放出調製物によって活性の時間を制御するための別の可能な方法は、ＭＩ
ＳまたはＭＩＳのＣ末端フラグメントを、ポリマー材料（例えば、ポリエステル
、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコ
ポリマー）の粒子に取り込むことである。あるいは、ＭＩＳまたはＭＩＳのＣ末
端フラグメントをこれらのポリマー粒子に取り込む代わりに、マイクロカプセル
（例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合により、例えば、ヒドロキ
シメチルセルロースから調製される）またはそれぞれゼラチンマイクロカプセル
およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、あるいはコロイド
状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロ粒子、マイクロエマル
ジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中に、あるいはマクロエマルジョン）
中にＭＩＳまたはＭＩＳのＣ末端フラグメントを包理することが可能である。こ
のような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．
，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に記載される。

【００３９】 ＭＩＳの「機能的誘導体」は、ＭＩＳの生物学的活性に実質的に類似する生物
学的活性（機能的または構造的のいずれか）を有する化合物である。用語「機能
的誘導体」は、分子の「フラグメント」、「改変体」、「アナログ」または「化
学的誘導体」を含むことが意図される。このようないずれかのＭＩＳ分子の「フ
ラグメント」は、この分子の任意のポリペプチドサブセットを言及することを意
味する。活性を有し、そして溶解性（すなわち、膜に結合しない）であるＭＩＳ
のフラグメントは、特に好ましい。ＭＩＳのような分子の「改変体」は、全分子
またはそのフラグメントのいずれかと構造および機能において実質的に類似する
分子を言及することを意味する。分子は、両方の分子が実質的に類似した構造を
有する場合または両方の分子が類似した生物学的活性を有する場合、別の分子と
「実質的に類似」していると言及される。従って、２個の分子が類似した活性を
有する場合、この分子の一方の構造が他方の分子に見出されないとしても、また
はこのアミノ酸残基の配列が同一でないとしても、この用語が本明細書中で使用
される場合、改変体とみなされる。ＭＩＳのような分子の「アナログ」は、全分
子またはそのアナログのいずれかに機能において実質的に類似している分子を言
及することを意味する。本明細書中で使用される場合、分子は、通常に分子の一
部でないさらなる化学的部分を含む場合、別の分子の「化学的誘導体」として言
及される。このような部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善
し得る。この部分は、分子の毒素を代わりに減少させ、分子の任意の所望しない
副作用などを除去または和らげ得る。このような効果を媒介し得る部分は、Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１
８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（
１９９０）に記載される。「毒素誘導体化」分子は、「化学的誘導体」の特定の
クラスから構成される。「毒素誘導体化」分子は、毒素部分を含む分子（例えば
、ＭＩＳまたはそのレセプターに対する抗体）である。このような分子の細胞へ
の結合は、毒素部分を細胞の近くに誘導し、これにより細胞死を促進する。任意
の適切な毒素部分が使用され得るが、例えば、リシン毒素、ジフテリア毒素、放
射性同位体毒素、膜チャネル形成毒素などのような毒素を使用することが好まし
い。このような部分を分子に結合させるための手順は、当該分野で周知である。

【００４０】 ＭＩＳ（またはその機能的誘導体、アナログ、もしくはアンタゴニスト）は、
静脈内、筋肉内、皮下、腸内または非経口的に患者に投与され得る。注射により
このような化合物を投与する場合、この投与は、連続注入または単一ボーラスも
しくは複数ボーラスにより投与され得る。

【００４１】 ＭＩＳ分子（ならびにそれらの機能的誘導体、アゴニストおよびアンタゴニス
ト）が、薬学的に有用である組成物を調製するための公知の方法に従って処方さ
れ得、これにより、これらの材料、またはそれらの機能的誘導体は、薬学的に受
容可能なキャリアビヒクルとの混合物中に組み合わされる。他のヒトタンパク質
を含む、適切なビヒクルおよびそれらの処方物（例えば、ヒト血清アルブミン）
が、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．，Ｅ
ａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に記載される。有効な投与のために適切な薬学的
に受容可能な組成物を形成するために、このような組成物が、適切な量のキャリ
アビヒクルと共に、有効量のＭＩＳ分子、またはその機能的誘導体、アゴニスト
またはアンタゴニストを含む。

【００４２】 さらなる薬学的方法は、作用の持続を制御するために使用され得る。制御放出
調製物が、ＭＩＳまたはその機能的誘導体、アゴニストまたはアンタゴニストを
複合体化するかまたは吸収するために、ポリマーの使用を介して達成され得る。
制御された送達が、放出を制御するために、適切な高分子（例えば、ポリエステ
ル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン、サルフェート
）および高分子の濃度ならびに取り込みの方法を選択することにより、行われ得
る。制御放出調製物による活性の持続を制御する別の可能な方法は、ＭＩＳ分子
、またはその機能的誘導体、アゴニスト、またはアンタゴニストの、ポリマー材
料（例えば、ポリエステルコポリマー、ポリアミノ酸コポリマー、ヒドロゲルコ
ポリマー、ポリ（乳酸）コポリマー、またはエチレンビニルアセテートコポリマ
ー）を、粒子中に取り込むことである。あるいは、これらの因子のポリマー材料
への取り込みの代わりに、例えば、コアセルベーション技術によるか、または界
面重合により（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン
ミクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）ミクロカプセル）、あるい
はコロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マ
イクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）において、あるいはミク
ロエマルジョンにおいて、調製されたミクロカプセル中にこれらの材料を閉じ込
めることを可能にする。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，
編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示される。本
発明の組成物は、製品（例えば、「キット」）の商品として調製され得る。好ま
しくは、このようなキットは、ＭＩＳまたはその機能的誘導体の１つおよびＭＩ
Ｓのアゴニストを受容するために特に適する２つ以上の容器を備える。

【００４３】 用語「患者」は、動物患者を含むことが意図される。より好ましくは、「患者
」は、哺乳動物患者、最も好ましくは、ヒト患者を含むことが意図される。

【００４４】 用語「タンパク質フラグメント」は、ＭＩＳの天然に存在するアミノ酸配列か
ら誘導可能な合成アミノ酸配列および天然に存在するアミノ酸配列の両方を含む
ことが意味される。このタンパク質は、ＭＩＳの天然に存在する選択された配列
をフラグメント化することにより得られ得る場合か、またはそれが天然に存在す
るアミノ酸配列の配列またはこの配列をコードする遺伝材料（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）の知識に基づいて合成される場合、「ＭＩＳの天然に存在するアミノ酸配列
から導き出され得る」ことが言われる。

【００４５】 （ＭＩＳ遺伝子治療法） 本発明の１つの実施形態において、ＭＩＳをコードする核酸の「有効量」は、
多嚢胞性卵巣疾患または症候群の進行を阻害するためおよび／または多嚢胞性卵
巣疾患または症候群の重篤度を低減するためか、あるいは性的早熟の進行を遅ら
せるためかおよび／または停止するために十分である量である。同様に、ＭＩＳ
のＣ末端フラグメントをコードする核酸の「有効量」は、多嚢胞性卵巣疾患また
は症候群の進行を阻害するためおよび／または多嚢胞性卵巣疾患または症候群の
重篤度を低減するためか、あるいは性的早熟の進行を遅らせるためかおよび／ま
たは停止するために十分である量である。

【００４６】 本発明の別の実施形態において、ＭＩＳをコードする核酸の「有効量」は、テ
ストステロンおよび／またはその代謝産物（例えば、ジヒドロテストステロン、
アンドロステロン、エストラジオール、およびエチオコラノロン）を含む１つ以
上のアンドロゲンの血漿レベルを、正常レベル以下に減少させるに十分である量
である。テストステロンの正常な血漿レベルは、約１０〜３５ｎｍｏｌ／Ｌ以下
（約３〜１０ｎｇ／ｍＬ）である。Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１４版、Ｆａｕｃｉ，Ａ．
Ｓ．ら、編、ＭｃＧａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）、２０４０
頁、表３３２〜２を参照のこと（この内容は、参考として援用される）。好まし
い実施形態において、ＭＩＳの有効量は、約１０〜３５ｎｍｏｌ／Ｌ（約３〜１
０ｎｇ／ｍＬ）以下のテストステロンの血漿レベルを減少させるのに十分な量で
ある。特に好ましい実施形態において、ＭＩＳの有効量は、約１５〜３０ｎｍｏ
ｌ／Ｌ以下のテストステロンの血漿レベルを減少させるのに十分である量である
。なおより好ましい実施形態において、ＭＩＳの有効量は、約２０〜２５ｎｍｏ
ｌ／Ｌ以下のテストステロンの血漿レベルを減少させるのに十分な量である。

【００４７】 ベクターが、「有効量のＭＩＳ」または「有効量のＭＩＳのＣ末端フラグメン
ト」を発現させることが可能な遺伝子を含むか否かは、米国特許第５，６６１，
１２６号における実施例４に示されるプロトコールに従って、決定され得る（こ
れは、その全体が、本明細書中により、参考として援用される）。

【００４８】 遺伝子治療方法は、本発明のＭＩＳポリペプチドの発現を達成するための、動
物への、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲ
ＮＡ）配列の導入に関する。この方法は、標的組織によるポリペプチドの発現の
ために必要であるプロモーターおよび任意の他の遺伝的エレメントに作動可能に
連結されるＭＩＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。こ
のような遺伝子治療および送達技術は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９
０／１１０９２を参照のこと（これは、本明細書中に参考として援用される）。

【００４９】 従って、例えば、患者由来の細胞は、操作された細胞を用いて、エキソビボで
ＭＩＳポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレ
オチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作され得、次いで、このポリペプチドで処置
される患者に提供される。このような方法は、当該分野で周知である。例えば、
Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５
：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔ
ｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−４６１５（１
９９５）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０：２２１−２
２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５
０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら，Ｈｕ
ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄ
ｏｎａｔｏ，Ｌ．ら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６−１２５５（１
９９７）；およびＺｈａｎｇ Ｊ．−Ｆ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと（これらは、本明細書中に
参考として援用される）。１つの実施形態において、操作される細胞は、動脈細
胞である。この動脈細胞は、動脈、この動脈を覆う組織への直接注射を介してか
、またはカテーテル注入を介してこの患者に再導入され得る。

【００５０】 以下でより詳細に議論されるように、このＭＩＳポリヌクレオチド構築物は、
注入可能な材料を動物の細胞へ送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉
、皮膚、肺、肝臓など）の間質空間への注射）によって送達され得る。このＭＩ
Ｓポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で
送達され得る。

【００５１】 １つの実施形態において、このＭＩＳポリヌクレオチドは、細胞への侵入を補
助、促進または容易にするように作用する任意の送達ビヒクルなしで送達される
。別の実施形態において、このＭＩＳポリヌクレオチドは、ウイルス配列なしで
送達される。別の実施形態において、このＭＩＳポリヌクレオチドは、ウイルス
粒子なしで送達される。別の実施形態において、このＭＩＳポリヌクレオチドは
、リポソーム処方物なしで送達される。別の実施形態において、このＭＩＳポリ
ヌクレオチドは、リポフェクチンなしで送達される。別の実施形態において、こ
のＭＩＳポリヌクレオチドは、沈殿剤なしで送達される。しかし、このＭＩＳポ
リヌクレオチドはまた、リポソーム処方物中で送達され得、そしてリポフェクチ
ン処方物などは当業者に周知の方法によって調製され得る。このようは方法は、
例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号、および
同第５，５８０，８５９号（これらは、本明細書中で参考として援用される）に
おいて記載される。

【００５２】 遺伝子治療法において使用されるＭＩＳポリヌクレオチドベクター構築物は、
好ましくは、宿主のゲノムに組み込まれず、そしてまた複製を可能にする配列を
含まない構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入
手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；
Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳ
ＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮ
Ａ３．１およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者
に容易に明らかである。

【００５３】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ＭＩＳ ＤＮＡの発現を駆動す
るために使用され得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモー
ター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモータ
ー（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（
ＲＳＶ）プロモーター；誘導プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター）；メ
タロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキ
ナーゼプロモーター（例えば、単純疱疹チミジンキナーゼプロモーター）；レト
ロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモ
ーターが挙げられる。これらのプロモーターはまた、ＭＩＳについてのネイティ
ブなプロモーターであり得る。

【００５４】 他の遺伝子治療技術と異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入することの１つ
の主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一時的な性質である。非
複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて６ヶ月までの期間に所望のポリペプチドの産
生を提供し得るということが、研究により示されてきた。

【００５５】 ＭＩＳポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓
、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、
腸管、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を含む）の間
隙に送達され得る。これらの組織の間隙は、細胞間液、器官組織の細網線維間の
ムコ多糖類基質、脈管もしくは室の壁における弾性線維、線維性組織の膠原線維
、または結合組織鞘性（ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ）筋細胞内もしくは骨の裂孔の
同じ基質を含む。循環の血漿およびリンパチャネルのリンパ液により占められる
空間は同様である。筋肉組織の間隙への送達は、以下に議論される理由で好まし
い。これらは、これらの細胞を含む組織への注射により簡便に送達され得る。こ
れらは好ましくは、分化した持続性非分割細胞に送達されかつこの細胞において
発現されるが、送達および発現は、未文化細胞または完全には分化していない細
胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。イン
ビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込みそして発現するその能力にお
いて特に適切である。

【００５６】 裸の酸配列注射について、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、体重１ｋｇに
つき約０．０５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０
．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは約０．０
５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。当然、当業者が理解するように、この投
薬量は、注射の組織部位に従って変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は
、当業者により容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存
し得る。

【００５７】 好ましい投与経路は、組織の間隙への注射の非経口経路による。しかし、他の
非経口経路（例えば、特に肺もしくは気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への送達
のためのエーロゾル処方物の吸入）もまた使用され得る。さらに、裸のＭＩＳ
ＤＮＡ構築物は、手順において使用されるカテーテルにより血管形成の間に動脈
に送達され得る。

【００５８】 裸のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法により送達され、これ
らとしては、送達部位での直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注
入、およびいわゆる「遺伝子銃」が挙げられるがこれらに限定されない。これら
の送達方法は、当該分野で公知である。

【００５９】 構築物はまた、送達ビヒクル（例えば、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソ
ーム処方物、リポフェクチン、沈降剤など）を用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。

【００６０】 特定の実施形態において、ＭＩＳポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製
物において複合体化される。本発明における使用のためのリポソーム調製物は、
カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物および
中性の調製物を含む。しかし、カチオン性リポソームは、特に好ましい。なぜな
らば、密接な（ｔｉｇｈｔ）荷電複合体は、カチオン性リポソームとポリアニオ
ン性核酸との間で形成され得る。カチオン性リポソームは、機能的形態で、プラ
スミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６（本明細書中で参考として援用され
る））；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１（本明細書中で参考として援用さ
れる））；および精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２（本明細書中で参考として援用さ
れる））の細胞内送達を媒介することが示されてきた。

【００６１】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎとして、Ｇ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．から入手可能である（
Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８
７）８４：７４１３〜７４１６（これは本明細書中で参考として援用される）も
また参照のこと）。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクタス（ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。

【００６２】 他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手
可能な材料から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイル
オキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載に
ついてのＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１０９２（これは本明細書中で参考として援用
される）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は、文献に説明される。例
えば、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：７４１３〜７４１７（これは本明細書中で参考として援用される）を参
照のこと。類似の方法を使用して、他のカチオン性脂質材料からリポソームを調
製し得る。

【００６３】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ）から容易に入
手可能であるか、または容易に入手可能な材料を使用して簡単に調製され得る。
このような材料としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、
ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファジチルコリン（ＤＯＰ
Ｃ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの材料はまた
、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合で混合され得る。これらの
材料を使用するリポソームの作製方法は、当該分野で周知である。

【００６４】 例えば、市販のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイ
ルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジ
ルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、コレステロールを添加するかまたは添加せ
ずに、従来のリポソームを作製するために様々な組み合わせで使用され得る。従
って、例えば、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣベシクルは、各々５０ｍｇのＤＯＰＧおよび
ＤＯＰＣを、超音波処理容器への窒素ガス流下で乾燥することによって調製され
得る。このサンプルを、真空ポンプ下に一晩置き、そして次の日に脱イオン水で
水和する。次いで、バスを１５ＥＣで循環させながら、反転カップ（バス型）プ
ローブを備えたＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓモデル３５０ソニケータを最大設定で
使用して、このサンプルを、栓をした容器内で２時間超音波処理する。あるいは
、負に荷電したベシクルを超音波処理なしで調製して、多層ベシクルを生成し得
るか、または核細孔（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）を通して押し出すことによって、
別個のサイズの単層ベシクルを生成し得る。他の方法が公知であり、そして当業
者に利用可能である。

【００６５】 リポソームは、多層ベシクル（ＭＬＶ）、小単層ベシクル（ＳＵＶ）、または
大単層ベシクル（ＬＵＶ）を含み、ＳＵＶが好ましい。様々なリポソーム−核酸
複合体が、当該分野で周知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕ
ｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３），
１０１：５１２〜５２７（これは本明細書中で参考として援用される）を参照の
こと。例えば、核酸を含むＭＬＶは、リン脂質の薄層をガラスチューブの壁に沈
着させ、次いでカプセル化される材料の溶液で水和することによって調製され得
る。ＳＵＶは、ＭＬＶを長時間超音波処理して、単層リポソームの均質な集団を
生成することによって調製され得る。捕捉される材料は、予め形成されたＭＬＶ
の懸濁液に添加され、そして超音波処理される。カチオン性脂質を含むリポソー
ムを使用する場合、乾燥脂質膜は、適切な溶液（例えば、滅菌水または１０ｍＭ
トリス／ＮａＣｌのような等張性緩衝液）に再懸濁され、超音波処理され、次い
で予め形成されたリポソームが直接ＤＮＡと混合される。リポソームおよびＤＮ
Ａは、正に荷電したリポソームがカチオン性ＤＮＡに結合することに起因して、
非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを伴う用途を見
出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多数の方法によって調製される。一般的に使
用される方法には、Ｃａ²⁺−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐａｕｌ
ｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｄｔａ（１９７５）３９４：４８
３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；エーテル注入（Ｄｅ
ａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
，Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４
８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ
．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４６
）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．およびＰａｐａ
ｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ（１９８２）２１５：１６６）（これらは本明細書中で参考として援用され
る）が挙げられる。

【００６６】 一般的に、ＤＮＡ対リポソームの比は、約１０：１〜約１：１０である。好ま
しくは、この比は、約５：１〜約１：５である。より好ましくは、この比は、約
３：１〜約１：３である。さらにより好ましくは、この比は、約１：１である。

【００６７】 米国特許第５，６７６，９５４号（これは本明細書中で参考として援用される
）は、カチオン性リポソームキャリアと複合体化した遺伝材料のマウスへの注射
について報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７
号、同第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，
４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７
０３，０５５号および国際公開ＷＯ９４／２９４６９（これらは本明細書中で参
考として援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする
際に使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号、および国際公開ＷＯ９４／２９４６９（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達するため
の方法を提供する。

【００６８】 特定の実施形態においては、細胞は、エキソビボまたはインビボで、ＭＩＳを
コードする配列を含むＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を用いて操作される。そ
こからレトロウイルスプラスミドベクターが誘導され得るレトロウイルスとして
は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイル
ス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類の白
血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性
肉腫ウイルスおよび乳腺癌ウイルス。

【００６９】 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質転換して
プロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得る
パッケージング細胞の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、Ｖ
Ｔ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖ
ＡＭ１２、およびＭｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｊ：
５−１４（１９９０）（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される
）に記載されるようなＤＡＮ細胞株。ベクターは、当該分野において公知の任意
の手段によりパッケージング細胞を形質転換し得る。このような手段としては、
エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ₄沈降が挙げられ
るが、これらに限定されない。１つの代替法においては、レトロウイルスプラス
ミドベクターは、リポソーム中にカプセル化され得るか、または脂質と結合され
得、次いで宿主に投与される。

【００７０】 プロデューサー細胞株は、ＭＩＳをコードするポリヌクレオチドを含む感染性
レトロウイルスベクター粒子を生じる。次いで、このようなレトロウイルスベク
ター粒子は、真核生物細胞をインビトロまたはインビボのいずれかで形質転換す
るために使用され得る。形質転換された真核生物細胞は、ＭＩＳを発現する。

【００７１】 特定の他の実施形態においては、細胞は、エキソビボまたはインビボで、アデ
ノウイルスベクターに含まれるＭＩＳポリヌクレオチドを用いて操作される。ア
デノウイルスは、ＭＩＳをコードし、発現するように操作され得、そして同時に
、正常な溶解性ウイルスライフサイクルにおいて複製するその能力の点で不活化
される。アデノウイルス発現は、宿主細胞の染色体へウイルスＤＮＡを組み込む
ことなく達成され、それによって挿入性の変異原性についての問題を軽減する。
さらに、アデノウイルスは、優れた安全性プロフィールにより、長年の間、生腸
内ワクチンとして使用されてきた（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら（１９７４）
Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３−２３８）。最終的に、
遺伝子移入を媒介するアデノウイルスは、α−１−アンチトリプシンおよびＣＦ
ＴＲのコットンラット（ｃｏｔｔｏｎ ｒａｔ）の肺への移入を含む、多くの例
を実証してきた（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８
：１４３−１５５）。さらに、アデノウイルスをヒトの癌における原因物質とし
て確立する試みのための広範な研究は、変わりなく否定的であった（Ｇｒｅｅｎ
，Ｍ．ら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：
６６０６）。

【００７２】 本発明において有用な適切なアデノウイルスベクターは、例えば、Ｋｏｚａｒ
ｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．３
：４９９−５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４
３−１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．
Ｔｈｅｒ．４：７５９−７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅ
ｎｅｔ．７：３６２−３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３
６５：６９１−６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４号（
これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。例えば、アデノ
ウイルスベクターＡｄ２は有用であり、ヒト２９３細胞において増殖し得る。こ
れらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そしてＥｌａおよびＥｌｂ（
これらは、このベクターから欠失した遺伝子の産物を提供することによって欠損
アデノウイルスを補完する）を構成的に発現する。Ａｄ２に加えて、アデノウイ
ルスの他の種類（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、本発明にお
いて有用である。

【００７３】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠乏性である
。複製欠乏性アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイル
スおよび／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られるウイルス
は、細胞を感染させ得、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的のポリ
ヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞において複製し得ない。複製欠乏
性アデノウイルスは、以下の遺伝子の全てまたは一部のうちの１つ以上において
欠失され得る：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａ、またはＬ１〜Ｌ５。

【００７４】 特定の他の実施形態においては、細胞は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用
いて、エキソビボまたはインビボで操作される。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、そのＤＮＡを
非分裂細胞に組み込み得るいくつかのウイルスのうちの１つである。ＡＡＶの３
００塩基対程度に少ない塩基対を含むベクターは、パッケージングされ得そして
組み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに制限される
。このようなＡＡＶを生成および使用するための方法は、当該分野において公知
である。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号
、同第５，３５４，６７８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９
３５号、同第５，４７８，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこ
と。

【００７５】 例えば、本発明における使用に適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、キャプ
シド形成、および宿主細胞組み込みのために必要な全ての配列を含む。ＭＩＳポ
リヌクレオチド構築物は、標準的なクローニング方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に
見出される方法）を用いて、ＡＡＶベクターに挿入される。次いで、組換えＡＡ
Ｖベクターは、任意の標準的な技術（リポフェクション、エレクトロポレーショ
ン、リン酸カルシウム沈降などを含む）を用いて、ヘルパーウイルスに感染した
パッケージング細胞にトランスフェクトされる。適切なヘルパーウイルスとして
は、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘル
ペスウイルスが挙げられる。一旦、パッケージング細胞がトランスフェクトおよ
び感染されると、これらはＭＩＳポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウ
イルス粒子を生成する。次いで、これらのウイルス粒子は、真核生物細胞をエキ
ソビボまたはインビボのいずれかで形質転換するために使用される。形質転換さ
れた細胞は、そのゲノムに組み込まれたＭＩＳポリヌクレオチド構築物を含み、
そしてＭＩＳを発現する。

【００７６】 遺伝子治療の別の方法は、異種制御領域と内因性ポリヌクレオチド配列（例え
ば、ＭＩＳをコードする）を、相同組換えによって作動可能に結合する工程を包
含する（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日発行
）；国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公
開第ＷＯ ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１
９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８
（１９８９）を参照のこと）。この方法は、標的細胞に存在するが、細胞におい
て通常発現されないか、または所望より低いレベルで発現される遺伝子の活性化
を包含する。

【００７７】 ポリヌクレオチド構築物が、当該分野で公知の標準的な技術を使用して作製さ
れ、このポリヌクレオチド構築物は、プロモーターに隣接する標的化配列を有す
るプロモーターを含む。適切なプロモーターが本明細書中に記載される。この標
的化配列は、プロモーター−標的化配列と内因性配列との相同組換えを可能にす
るために、内因性配列と十分に相補的である。標的化配列は、ＭＩＳの所望の内
因性ポリヌクレオチド配列の５’末端に十分に近く、その結果、このプロモータ
ーは、相同組換えの際に内因性配列に作動可能に連結される。

【００７８】 プロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ましく
は、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に個別の制限酵素
部位を有する。好ましくは、第一の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第二の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列は、消化され、そして一緒に連結される。

【００７９】 プロモーター−標的化配列構築物は、裸のポリヌクレオチドとしてか、または
上により詳細に記載されるトランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、
ウイルス配列、ウイルス粒子、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）、リポフ
ェクチン、沈澱剤など）とともにかのいずれかで、細胞に送達される。Ｐプロモ
ーター−標的化配列は、任意の方法（直接的な針注入、静脈内注入、局所的投与
、カテーテル注入、粒子促進剤など）によって送達され得る。これらの方法は、
以下により詳細に記載される。

【００８０】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞によって取り込まれる。構築物と内
因性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内因性ＭＩＳ配列が、プロモ
ーターの制御下で配置される。次いで、このプロモーターは、内因性ＭＩＳ配列
の発現を駆動する。

【００８１】 好ましくは、ＭＩＳをコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の分泌を容
易にする分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配列は、コード領域
の５’末端に向かって、または５’末端で、発現されるべきポリヌクレオチドの
コード領域に配置される。このシグナル配列は、目的のポリヌクレオチドに相同
的または非相同的であり得、そしてトランスフェクトされるべき細胞に相同的ま
たは非相同的であり得る。さらに、このシグナル配列は、当該分野で公知の方法
を使用して化学的に合成され得る。

【００８２】 上記のポリヌクレオチド構築物のいずれかの投与の任意の様式は、この様式が
治療効果を提供するために十分な量で１つ以上の分子の発現を生じる限り、使用
され得る。これは、直接的な針注入、全身注入、カテーテル注入、微粒子銃注入
器、粒子促進器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジ蓄積、他の
市販の蓄積材料、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口または坐
剤固体（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術の間の、デカンティング（
ｄｅｃａｎｔｉｎｇ）または局所適用を含む。例えば、裸のリン酸カルシウム沈
澱プラスミドのラット肝臓およびラット脾臓への直接注入、またはタンパク質被
覆プラスミドの門脈への直接注入は、ラット肝臓において外来遺伝子の遺伝子発
現を生じた（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：３７５（１９８９））
。

【００８３】 局所投与の好ましい方法は、直接注入による。好ましくは、送達ビヒクルと複
合体化した、本発明の組換え分子は、動脈の領域への直接注入によってか、また
はその領域内に局所的に投与される。動脈の領域内に局所的に組成物を投与する
ことは、動脈内に、その組成物を、センチメートル、および好ましくはミリメー
トル注入することをいう。

【００８４】 局所投与の別の方法は、外科的創傷内、またはそのまわりに、本発明のポリヌ
クレオチド構築物を接触させることである。例えば、患者が手術を受け得、そし
てポリヌクレオチド構築物が、創傷の内部の組織の表面上にコートされ得るか、
またはこの構築物は、創傷内部の組織の領域に注入され得る。

【００８５】 全身投与において有用な治療組成物は、本発明の標的化送達ビヒクルに複合体
化された、本発明の組換え分子を含む。全身投与を用いる使用に適切な送達ビヒ
クルは、ビヒクルを特定の部位に標的化するためのリガンドを含むリポソームを
含む。

【００８６】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口送達および
経皮（局所）送達が挙げられる。静脈内注射は、当該分野において標準的な方法
を使用して、実施され得る。エアロゾル送達もまた、当該分野において標準的な
方法を使用して、実施され得る（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７−１１２８１（１９９
２）を参照のこと、これは、本明細書中に参考として援用される）。経口送達は
、本発明のポリヌクレオチド構築物を、動物の消化管内の消化酵素による分解に
耐え得るキャリアと複合体化させることによって、実施され得る。このようなキ
ャリアの例としては、当該分野において公知のもののような、プラスチックのカ
プセルまたは錠剤が挙げられる。局所送達は、本発明のポリヌクレオチド構築物
を、皮膚内に通過し得る脂肪親和性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と混合することに
よって、実施され得る。

【００８７】 送達される物質の有効量の決定は、多数の因子（例えば、その物質の化学構造
および生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およ
びその重篤度、ならびに投与経路が挙げられる）に依存し得る。処置の頻度は、
多数の因子（例えば、１用量あたり投与されるポリヌクレオチド構築物の量、な
らびに被験体の健康および病歴）に依存する。正確な量、投薬の数および投薬の
タイミングは、主治医によって決定される。

【００８８】 遺伝的に変更された成体マウスの表現型は、この成体におけるＭＩＳに関する
可能な役割（ステロイド生成の調節を含む）についてのいくつかの手掛かりを与
えた。ヒトＭＩＳ導入遺伝子を慢性的に過剰発現するマウスは、成体において、
種々の程度の性腺異常を発生させる（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３
４５：１６７−１７０（１９９０））。生後すぐに、卵巣は生殖細胞を発生させ
るようになり、そして精細管に類似の構造に組織化する；後に、これらの卵巣は
、成体において退化する。最も高いＭＩＳ過剰発現動物由来の雄性マウス（２５
％）は、停留精巣を有し、これらもまた生殖細胞を枯渇する。これらの雄性は、
性嚢を欠き、そして発生不足の精巣上体、雌性化外性器、および正常雄性マウス
における血清テストステロンレベルの１／１０のテストステロンの血清レベルを
有した（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：１６７−１７０（１９
９０）；Ｌｙｅｔら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５２：４４４−４５４（１９９
５））。これらの結果は、ＭＩＳ過剰発現が、ライディッヒ細胞におけるアンド
ロゲン生合成を妨害し得ることを示唆した。逆に、ＭＩＳリガンド（Ｂｅｈｒｉ
ｎｇｅｒら、Ｃｅｌｌ ７９：４１５−４２５（１９９４））もＭＩＳ ＩＩ型
レセプター（Ｍｉｓｈｉｎａら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０：２５７７−２５８
７（１９９６））もいずれももはや発現しないように、マウスを相同組換えする
こともまた、ライディッヒ細胞過形成からなる性腺異常および胚上皮の限局性萎
縮症を生じた。従って、ＭＩＳは、生後の雄性および雌性の両方の性腺において
ステロイドホルモンバランスを維持する際に、役割を有するようである。

【００８９】 ライディッヒ細胞または腸管細胞は、精細管の周囲の精巣において見出される
。これらの主要な機能は、テストステロンを産生することであり、これは、正常
な雄性表現型のために必須である。テストステロンは、コレステロールから、５
工程において、４つの酵素の活性によって合成され（図１）、これらの酵素のう
ちの３つを、本発明者らは研究した（Ｐ４５０ｓｃｃ、Ｐ４５０ｃ１７、および
３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲネート／Δ⁵−Δ⁴−イソメラーゼ（３β
ＨＳＤ）（ＰａｙｎｅおよびＹｏｕｎｇｂｌｏｏｄ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．
５２：２１７−２２５（１９９５）））。Ｐ４５０ｃｃ（シトクロムＰ４５０側
鎖切断、ＣＹＰ１１Ａとしても公知）は、シトクロムＰ４５０ヘムタンパク（ｈ
ｅｍｅｐｒｏｔｅｉｎ）のスーパーファミリーのメンバーであり（Ｎｅｌｓｏｎ
ら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：１−５１（１９９３））、ミトコンド
リア内膜に位置し、そして２７炭素のコレステロール分子を２１炭素のプレグネ
ノロンに転換することによって、コレステロールのステロイドホルモンへの転換
の方向付けられた工程を触媒する。プレグネノロンは、ミトコンドリアから移動
し、そして３βＨＳＤ（非Ｐ４５０酵素）の活性によって、プロゲステロンに転
換される。シトクロムＰ４５０ｃ１７αヒドロキシラーゼ／Ｃ_17-20リサーゼ（
ｌｙｓａｓｅ）（Ｐ４５０Ｃ１７、ＣＹＰ１７）は、二重の活性を有する；これ
は、プロゲステロンを１７α位においてヒドロキシル化し、そして２１炭素の１
７α−ヒドロキシプロゲステロンを、１９炭素のアンドロステンジオンに転換す
る。次いで、アンドロステンジオンは、１７−ケトステロイドレダクターゼ（１
７位の炭素においてケトンを還元する非Ｐ４５０酵素）の活性によって、テスト
ステロンに転換される。

【００９０】 最近の研究は、ステロイド誘発性酵素Ｐ４５０ｃｃ、３βＨＳＤおよびＰ４５
０Ｃ１７についてのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の定常状態レベルが、Ｍ
ＩＳ過剰発現トランスジェニックマウスの前立腺および精製されたライディッヒ
細胞において、血清テストステロンおよびエストラジオールレベルと同様に、ダ
ウンレギュレートされるようであることを示した（Ｒａｃｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：５９４−５９９（１９９８）；Ｒ
ｏｕｉｌｌｅｒ−Ｆａｂｒｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９：１２１
３−１２２０（１９９８））。相関性ＰＴ−ＰＣＲの結果は、ＭＩＳ ＩＩ型レ
セプターｍＲＮＡが、精製されたライディッヒ細胞に存在することを示した。こ
のことは、ＭＩＳが、ＭＩＳレセプターを介して直接的にその観察されたライデ
ィッヒ細胞の効果に影響を与えたことを示唆する（Ｒａｃｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：５９４−５９９（１９９８））。

【００９１】 糖タンパク質ホモ二量体のＴＧＦβファミリーのメンバーによるシグナル伝達
は、そのリガンドが、膜貫通セリン／スレオニンキナーゼのみのヘテロマー複合
体に結合する場合に起こる。このファミリーにおけるリガンド特異性は、ＩＩ型
レセプターによって決定され、このレセプターは次に、その適切なＩ型レセプタ
ーを、リガンド特異的Ｓｍａｄのサブセットを介して、引き続く下流シグナル伝
達のために漸増およびリン酸化する（ＫｒｅｔｚｓｃｈｍａｒおよびＭａｓｓａ
ｇｕｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．８：１０３−１１１（１９
９８））。ＭＩＳシグナル伝達の分子的機構を決定する努力により、ＭＩＳリガ
ンドおよびそのＭＩＳ ＩＩ型レセプターのクローニングならびにこれらの特徴
付けがなされた（Ｃａｔｅら、Ｃｅｌｌ ４５：６８５−６９８（１９８６）；
Ｐｉｃａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５４
６４−５４６８（１９８６）；Ｂａａｒｅｎｄｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
１２０：１８９−１９７（１９９４）；ｄｉ Ｃｌｅｍｅｎｔｅら、Ｍｏｌ．Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：１００６−１０２０（１９９４）；Ｔｅｉｘｅｉｒａ
ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：１６０−１６５（１９９６））。Ｍ
ＩＳリガンドがそのレセプターに結合することによって活性化される、下流の経
路を理解するために、本発明者らは、ライディッヒ細胞機能およびストロイド生
成においてＭＩＳが果たす役割を検討する。げっ歯類のライディッヒ腫瘍細胞株
Ｒ２ＣおよびＭＳ−１０を使用して、本発明者らは、ＭＩＳシグナル伝達を研究
するための系を樹立し、そしてＭＩＳが転写レベルにおいてステロイド生成を調
節することを示すことができた。

【００９２】 本発明を一般的に記載したが、同じことは、以下の実施例を参照することによ
って、より容易に理解される。この実施例は、例示の目的で提供され、そして限
定として意図されない。

【００９３】 以下の実施例において、使用された材料および方法は、以下の通りである。

【００９４】 （材料） 化学薬品を、他に記載されない限り、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（
Ｆａｉｒｌａｗｎ，ＮＪ）またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。Ｍａｙｍｏｕｎｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１
培地、ゲンタマイシン、オリゴヌクレオチド、およびトリプシン−ＥＤＴＡを、
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，
ＮＹ）から得た。制限酵素および修飾酵素、ホタルルシフェラーゼおよびＲｅｎ
ｉｌｌａルシフェラーゼベクター、ならびに試薬を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ
．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔ
ｏｎ，ＭＡ）から購入した。ラットＰ４５０ｓｃｃ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は
、Ｊ．Ｓ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ博士（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から贈呈された。雌性ウシ胎仔血清（Ｆ
ＣＳ）を、Ａｉｒｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｂｉｏｌｏｇｏｓ（Ｒｉｃｈａ
ｒｄｓｏｎ，ＴＸ）から得た。標準的な組換えＤＮＡ技術を使用した（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））
。有利なポリメラーゼ酵素を、ＰＣＲ増幅において使用した（ＣＬＯＮＴＥＣＨ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。すべて
の動物研究を、実験動物の管理と使用に関するＮＩＨ指針（ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ａｎｉｍａｌｓ）に従って実施した。

【００９５】 （細胞培養） Ｒ２Ｃ（ラットライディヒ腫瘍細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））を、１５％ウマ
血清および２．５％雌性ＦＣＳ（Ａｉｒｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｂｉｏｌ
ｏｇｏｓ）を含むＦ−１０培地において維持した。Ｍａｒｉｏ Ａｓｃｏｌｉ博
士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）から贈呈された
マウスＭＡ−１０ライディヒ腫瘍細胞株を、２０ｍｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４
）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および１５％ウマ血清を含むように改変さ
れたＷａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において維持した。これらの実験について、Ｒ２Ｃおよび
ＭＡ−１０細胞を、５％ＣＯ₂を有する加湿雰囲気下で３７℃にてインキュベー
トし、そして８０〜９０％コンフルエンスに到達するまで、１日おきに給餌した
。

【００９６】 （ノーザン分析） 総ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート−塩化セシウム方法（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））を
使用して抽出した。すべてのＲＮＡを、連続回のフェノール、クロロホルムおよ
びエーテル；エタノールでの沈殿により抽出し、そしてＡ₂₆₀での吸光度によっ
て定量した。１０μｇの各ＲＮＡサンプルを、６５℃にてジメチルスルホキシド
およびグリオキサールを用いて変性させ、１．５％アガロースゲル中で分離させ
、ナイロン膜に一晩ブロッティングし、そして真空オーブン中で８０℃でのベー
キングまたはＵＶ架橋のいずれかをした。精巣を、生後３０日目のラットから外
科的に取り出し、そしてホモジネートし、そしてポジティブコントロールとして
使用するために、先に述べたようにＲＮＡを抽出した。パーコール密度勾配遠心
分離によって９５％均質性まで精製された、２１日齢のラットの単離された原発
性ライディヒ細胞由来のＲＮＡは、Ｍａｒｙ Ｌｅｅ博士（Ｌｅｅら，「Ｍｕｌ
ｌｅｒｉａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｔｙｐｅ ＩＩ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎ ｐ
ｒｉｍａｒｙ Ｌｅｙｄｉｇ ｃｅｌｌｓ」，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（印
刷中））より贈呈された。ブロットを３時間、５０％ホルムアミドハイブリダイ
ゼーション溶液中で、１００μｇ／ｍｌの音波破砕サケ精子ＤＮＡと共に、リボ
プローブについては６５℃で、そしてランダムプライムプローブについては４２
℃で、プレハイブリダイズさせた。ＭＩＳ ＩＩ型レセプタープラスミドを、Ｅ
ｃｏＲＶおよび標準的技術を使用して５Ｐ６ポリメラーゼで作製されたリボプロ
ーブを用いて、線状化した。³²Ｐ標識化ランダムプライムｃＤＮＡプローブを、
Ｐ４５０ｃｃおよび３βＨＳＤについて作製した。ラットＰ４５０ｃｃ ｃＤＮ
Ａは、Ｊ．Ｓ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ博士（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から贈呈された。Ｐ４５０ｃ１７プラスミドを、ＥｃｏＲＩ
および標準的技術を使用してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで作製された³²Ｐ標識化
リボプローブを用いて、線状化した。ブロットを、リボプローブでは６５℃にて
２×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌプローブを用いて一晩ハイブリダイズさせ、そして７２
℃で洗浄し、ランダムプライムヒトプローブでは４２℃にて２×１０⁶ｃｐｍ／
ｍｌプローブを用いて一晩ハイブリダイズさせ、そして６０℃で洗浄した。この
洗浄には、０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５
ｍＭクエン酸ナトリウム）−０．１％ＳＤＳを用いた。そしてこれらのブロット
を、−７０℃にて３日間、増感スクリーンを有する放射線用フィルムに曝露した
。すべての動物研究を、登録番号９７−４２１６のもとで８−１９−９８に認可
された施設を用いて、実験動物の管理と使用に関するＮＩＨ指針に従って実施し
た。

【００９７】 （ラジオイムノアッセイ） ＭＡ−１０細胞を、０日目に、示される各時点について、１２ウェルプレート
中に５×１０⁴／ウェルにて六連でプレーティングした。組換えヒトＭＩＳ（ｒ
ｈＭＩＳ）を、ヒトＭＩＳ遺伝子の線状構築物で安定的にトランスフェクトされ
たチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から調製した（Ｃａｔｅら，Ｃｅ
ｌｌ ４５：６８５−６９８（１９８６））。次いで、増殖培地中で活性に分泌
されたタンパク質を、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ−１０（Ｒａｇｉｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２３６−２４５（１９９２））に結合体化された
モノクローナルＭＩＳ抗体（６Ｅ１１）で調製された免疫親和性カラムに対して
通過させた。次いで、結合したＭＩＳを、３Ｍアンモニウムチオシアネート溶液
（ｐＨ７．４）または１Ｍ酢酸（ｐＨ３．０）を用いて、このカラムから溶出し
た。タンパク質濃度を、ｐＨ中和および遠心濾過による脱塩処理後に、ブラッド
フォードアッセイによって決定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４（１９７６））。次いで、ＭＩＳの生物
活性を、確立された器官培養物アッセイ（これは、１４．５日目の妊娠率泌尿生
殖隆線（１４．５−ｄａｙ ｇｅｓｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｕｒｏｇｅｎｔｉ
ａｌ ｒｉｄｇｅ）の後退を分類分けする（Ｄｏｎｏｈｏｅら，Ｊ Ｓｕｒｇ．
Ｒｅｓ．２３：１４１−１４８（１９７７）））を使用して確認した。（Ｂｕ） ₂ ｃＡＭＰ（５０μｍ）の存在下または非存在下において、ビヒクルコントロー
ルまたは１０５ｎＭ ＭＩＳを、プレーティングの２日後にＭＡ−１０細胞に添
加し、そして示された日数の間、インキュベートした。培養培地を収集し、そし
てＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ ＨｏｓｐｉｔａｌのＮＩＣＨ
ＨＤ Ｐ３０ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ ＲＩＡ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより、総蓄積プロゲ
ステロンおよびテストステロンについてＲＩＡによってアッセイした。

【００９８】 （ルシフェラーゼレポーターアッセイ） １０１８ｂｐのＰ４５０ｃ１７プロモーターフラグメントを、マウスゲノムＤ
ＮＡから、５’−ＧＡＧＣＴＣＧＡＧＴＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＴＣＣＣおよ
び５’−ＣＴＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡをプライマー
として用いて、相補的ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ部位を使用して、ＰＣＲによって
増幅した（Ｐａｙｎｅら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ． ４３：８９５−９０６（１９９２））。優位ポリメラーゼ酵素（ａｄｖ
ａｎｔａｇｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）をＰＣＲ増幅に使用した
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ，ＣＡ）。そのＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に、配列分析のためにクローニングし、ＳａｃＩ
／ＸｈｏＩで切り出した。ＰＧＬ３Ｂベクターを、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消
化し、そしてＰ４５０ｃ１７プロモーターフラグメントに連結し、Ｐ４５０ｃ−
１７−Ｌｕｃを生成した。その構築物を塩化セシウム超遠心分離によって精製し
た。ＭＡ−１０細胞を２×１０⁵で、３連でプレートし、そしてＰ４５０ｃ−１
７−α−Ｌｕｃで、ＦｕＧｅｎｅ ６脂質プロトコルを使用してトランスフェク
ト（ｔｒａｎｓｅｃｔｅｄ）した（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）。プロモーターのない親プラスミドであるＰＧＬ３Ｂを、ネ
ガティブコントロールとして使用した。ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーターの
制御下のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｃｏｒｐ）を、トランスフェクション効率およびステロイド経路特異性の
ための内部コントロールとして同時トランスフェクトした。細胞の溶解物を作製
し、そしてＢｅｒｔｈｏｌｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ照度計（Ｍａｌｌａｃ，Ｉｎ
ｃ．，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、ルシフェラーゼ活性について
アッセイした。

【００９９】 （実施例１） （ＭＩＳ ＩＩ型レセプターは、ライディッヒ細胞において発現される） ＭＩＳリガンドは、ＭＩＳ ＩＩ型レセプターに結合して、下流のシグナリン
グを開始する。ノーザン分析（図２を参照のこと）を行って、ラットの精巣、Ｒ
２Ｃ細胞、ＭＡ−１０細胞から単離した総ＲＮＡにおいてＭＩＳ ＩＩ型レセプ
ターの必要な発現が存在するか否かを決定し、そして一次ライディッヒ細胞を精
製した。これらの知見は、ライディッヒ細胞が、近傍のセルトリ細胞におけるＭ
ＩＳのパラクリン産生からＭＩＳ ＩＩ型レセプターを介して直接応答し得るこ
とを示す。細胞株および精製されたライディッヒ細胞においてストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下で観察されたバンドは、精巣ＲＮＡで観察され
たと同様の距離移動し、これはＭＩＳ ＩＩ型レセプタープローブが同じｍＲＮ
Ａ種にハイブリダイズしたことを示唆する。ＭＡ−１０細胞は、他のノーザン実
験においてＲ２Ｃ細胞で観察されるものより早い移動バンドを示す。

【０１００】 （実施例２） （ＭＩＳは、ライディッヒ細胞によってステロイド産生を阻害する） ＭＩＳをインビボで過剰発現するマウスにおいて観察されるステロイドホルモ
ン産生のダウンレギュレーションを研究するためにＭＡ−１０が適切な細胞とし
て作用するか否かを決定するために、ＭＡ−１０をＭＩＳとともにインキュベー
トし、そして培地に分泌されるプロゲステロンおよびテストステロンのレベルを
測定した（図３Ａおよび３Ｂ）。ＭＡ−１０細胞は、さらに機能的ゴナドトロピ
ンレセプターを有してｃＡＭＰまたはＬＨ／ｈＣＧに応答して増強したステロイ
ド産生を生じ、そのためライディッヒ細胞のインビボでの生理学的状態を模倣す
る、マウスライディッヒ細胞腫瘍株である（ＰａｙｎｅおよびＹｏｕｎｇｂｌｏ
ｏｄ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５２：２１７−２２５（１９９５）；Ａｓｃｏ
ｌｉ，Ｍ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １０８：８８−９５（１９８１））
。

【０１０１】 図３Ａは、ＭＡ−１０細胞のＭＩＳとの２日間のインキュベーションが、ｃＡ
ＭＰ刺激状態および非刺激状態の両方で、プロゲステロン分泌における、中程度
の、しかし有意な、４０％の減少を生じたことを示す。図３Ｂは、２日間ＭＩＳ
とインキュベートしたＭＡ−１０細胞によって分泌されたテストステロンの濃度
が、ＭＩＳで処理していない細胞のそれよりも１０倍低かったことを示す。ステ
ロイドホルモン減少のレベルおよび時間経過は、インビボでの受精の時点で収集
されたヒト濾胞細胞が、組換えＭＩＳとインキュベートされた場合に観察された
もの（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７５：９
１１−９１７（１９９２））および初代ライディッヒ細胞がＭＩＳとインキュベ
ートされた場合に観察されたもの（Ｒｏｕｉｌｌｅｒ−Ｆａｂｒｅら、Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９：１２１３−１２２０（１９９８））と類似してい
た。

【０１０２】 （実施例３） （ＭＩＳは、ｃ１７ｍＲＮＡの定常状態レベルを減少させる） これらの効果を担う分子機構を解明するために、ステロイド産生酵素Ｐ４５０
ｓｃｃ、３βＨＳＤ、およびＰ４５０ｃ１７についてのｍＲＮＡの定常状態に対
するＭＩＳの効果を試験した（図４Ａ〜Ｃ）。ノーザン分析により、ｍＲＮＡの
レベルが、ＭＩＳでの３時間の処理後のＲ２Ｃおよび一晩の処理後のＭＡ−１０
細胞の両方について、Ｐ４５０ｓｃｃおよび３βＨＳＤについてわずかに低いが
（それぞれ、図４Ａおよび４Ｂ）、劇的に、Ｐ４５０ｃ１７についてｃＡＭＰ刺
激したＭＡ−１０細胞において検出不能なレベルまで減少したことが明らかにな
った。

【０１０３】 本発明者らはまた、ＭＩＳによるｃ１７ｍＲＮＡのダウンレギュレーションが
、タンパク質合成を必要とするか否か（これは、ｃ１７ｍＲＮＡに対するＭＩＳ
の効果が直接的であるか否かを示すであろう）を試験し、そしてシクロヒキサミ
ド（タンパク質合成のインヒビター）の存在下でのＭＡ−１０細胞のＭＩＳとの
一晩のインキュベーションが、ｃ１７ｍＲＮＡの定常状態レベルにおける有意な
減少を引き起こし続けたことを見出した（図４Ｃ）。ＲＮＡを、ＭＡ−１０細胞
から調製し、シクロヘキサミドの存在下または非存在下で、ＭＩＳとともにイン
キュベートし、そしてｃ１７ｍＲＮＡについてノーザンブロットによって分析し
た。驚いたことに、シクロヘキサミド単独の添加は、ｃＡＭＰ誘導で観察された
レベルを超えてｃ１７ｍＲＮＡの発現を誘導するのに十分であった。

【０１０４】 （実施例４） （ＭＩＳは、転写レベルでのｃ１７発現を調節する） ステロイド産生酵素についてのｍＲＮＡの変化は、とりわけ、メッセージの安
定性、核輸送、または転写における差異に反映され得る。これらの全ては、ＭＩ
Ｓによる調節についてのポテンシャルポイント（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｏｉｎ
ｔ）であり得る。ＭＩＳによるＣｙｐ１７遺伝子の転写調節を研究するために、
ＤＮＡ構築物（これは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と融合した約１ｋｂのＣｙ
ｐ１７プロモーターを含む）を作製し、これをＭＡ−１０細胞にトランスフェク
トし、そしてルシフェラーゼ活性についてアッセイした（図５Ａ〜Ｃ）。実験の
第１のセットにおいて、レポーター構築物を用いるトランスフェクションの翌日
、ＭＡ−１０細胞を、可変濃度のＭＩＳと共にインキュベートし、そして１８時
間後かまたは２９時間後のいずれかで収集して、ルシフェラーゼ活性を誘導させ
、これを測定および比較した（図５Ａ）。ＭＩＳは、７０ｎＭ ＭＩＳを用いて
、１８時間後でのみ、外因性Ｃｙｐ１７プロモーター／ルシフェラーゼレポータ
ーに対するその効果を発揮するようである。２９時間までに、３５ｎＭ ＭＩＳ
は、ルシフェラーゼ活性を著しく低下させ得、そして１０５ｎＭ ＭＩＳでは、
ルシフェラーゼ活性を、バックグラウンドレベルまで低下させた。これらの濃度
（これはＴＧＦβファミリーの他のメンバーによる転写活性化に必要とされる濃
度と比較して高い）は、他のアッセイにおけるＭＩＳ効果に必要とされる濃度に
類似し、そしてＭＩＳ調製物の能力を試験するために用いられる器官培養バイオ
アッセイ（Ｒａｃｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：５９４−５９９（１９８８）；ＭａｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３５８−３６９（１９９１））において、ミュラ
ー管の完全な退行に必要とされる３５−ｎＭのＭＩＳ濃度を有する。また、ホタ
ルルシフェラーゼ活性化を同時トランスフェクトしたＲｅｎｉｌｌａレポーター
に対して正規化して、ＭＩＳによる細胞に対する非特異的効果を除外する。ＭＩ
Ｓ調製物を試験し、そして酵素結合イムノソルベントアッセイにより、アクチビ
ンおよびＴＧＦβを含まないことを見出したこと、ならびにＴＧＦβをＭＡ−１
０に添加した場合に、Ｃｙｐ１７駆動ルシフェラーゼ活性は、未処理細胞の活性
とは優位に異なっていなかった（データ示さず）ことに注目することもまた重要
である。

【０１０５】 図５Ｂは、１日のトランスフェクションの後のＭＩＳインキュベーションが、
３時間後にルシフェラーゼに対するわずかだが優位な効果を有し、そしてこの効
果が、１８時間後に明確になることを示す。別の実験では、ＭＡ−１０細胞は、
Ｌ９（ｐｒｏ−ＭＩＳが切断されて、ホルモンの生理活性Ｃ末端部分を生成し得
ないように変異させているＭＩＳリガンドの不活化形態（ＭａｃＬａｕｇｈｌｉ
ｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３１：２９１−２９６（１９９２）））
と共にインキュベートした場合、同じ濃度および時間で生理活性の切断可能なＭ
ＩＳに影響するようには、ルシフェラーゼ活性に影響しない（図５Ｂにおいて＊
で示す）。Ｌ９が、ＣＨＯ細胞において産生され、そして野生型ＭＩＳと同じ様
式で精製されるので、本発明者らは、Ｐ４５０ｃ１７転写に対する効果が、ＭＩ
Ｓに起因し、そしておこり得る同時精製される夾雑物に起因しないと結論付け得
る。

【０１０６】 ルシフェラーゼ発現は、一晩のトランスフェクションの後に極大を表す。なぜ
ならば、ルシフェラーゼ活性は、３〜１８時間のさらなるインキュベーションを
伴うコントロールＭＡ−１０細胞において優位に異ならないからである（図５Ｂ
）。より速くＭＩＳ効果の利点を得るために、本発明者らは、Ｃｙｐ１７レポー
ター構築物をトランスフェクトし、そして同じ時間でＭＩＳを添加した。図５Ｃ
に示されるように、トランスフェクションの１８時間後、本発明者らは、ＭＩＳ
添加で、ルシフェラーゼ活性における４倍の減少を観察した。これは、ＭＩＳを
添加した１日後に観察した減少よりもかなり高い。この観察は、ＭＩＳが、それ
が完全に活性化する前にＣｙｐ１７プロモーター駆動レポーターの発現をより有
効に抑制し得ることを示唆する。

【０１０７】 ヒト男性では、誕生した１年後に、ＭＩＳの発現と血清テストステロン濃度（
これは一生を通じて維持する）との間に相関関係が存在する（Ｂａｒｄｉｎら、
「Ａｎｄｒｏｇｅｎｓ」，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｄａｓｈｉら、編、
Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９５），
５０５−５２５頁；Ｊｏｓｓｏら、Ｅａｒｌｙ Ｈｕｍ、Ｄｅｖ．３３：９１−
９９（１９９３）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａ
ｂ．８１：５７１−５７６（１９９６））。しかし、胎児期の間および周産期の
直後におけるテストステロンの最下点の後に再び、ＭＩＳおよびテストステロン
レベルの両方が高くなる。出生時に、男性におけるＭＩＳのレベルは、わずかに
低いが、なお依然として、女性のレベルよりも１０倍高い。人生の最初の６ヶ月
（小思春期（ｍｉｎｉｐｕｂｅｒｔｙ））の間、血清テストステロンにおける鋭
いピークおよびＭＩＳ濃度におけるその最も高いレベルまでの緩やかな増加が存
在する。最も高いレベルは、男性における血清テストステロンの濃度が再び低点
になる最初の１２ヶ月齢までに達する。精巣中毒症（ｔｅｓｔｏｔｏｘｉｃｏｓ
ｉｓ）またはマックキューン−オールブライト症候群を併発するような早発思春
期症候群では、テストステロンレベルが若齢で上昇する。精巣中毒症は、マック
キューン−オールブライト症候群の原因である規定のＧタンパク質共役レセプタ
ーにおける変異の活性化（これは、初期の胚発生の間の体細胞変異に通常起因す
る）により引き起こされる（Ｙｅｎら、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｅｎｄｃｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，
ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉ
ｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９），ｖｉｉｉ８３９頁）。血清ＭＩＳおよびテス
トステロン濃度が、正常な思春期と早発思春期との間で逆の関係にあるので、他
のものは、アンドロゲンがＭＩＳ発現を調節すると推測される（Ｒｅｙら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７７：１２２０−１２２６（１
９９３））。しかし、組織培養物におけるアンドロゲン調節ＭＩＳ発現を刺激す
る試み（ＨａｐｐおよびＰ．Ｋ．Ｄｏｎａｈｏｅ，未公開）は達成されておらず
、従ってこの仮説は推測のままである。

【０１０８】 本発明者らは、ＭＡ−１０細胞によるプロゲステロン分泌に対するＭＩＳの効
果を観察した。これは、Ｐ４５０ｓｃｃおよび３βＨＳＤの両方についての定常
状態ｍＲＮＡレベルの低下を反映した。

【０１０９】 Ｃｙｐ１７の転写コントロールによるライディヒ細胞におけるステロイド生成
のＭＩＳ調節は、発生調節を示し得るテストステロン合成のＭＩＳ媒介抑制にお
ける難問をあらわにする。胎児ライディヒ細胞は増殖し、かつ増加したアンドロ
ゲン合成を示す。これは、齧歯類におけるゴナドトロピン刺激とは無関係に、雄
性表現型の発達のために必要とされる（Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙら、Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９：１１４１−１１４６（１９９８）；Ｋｅｎｄａ
ｌｌら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：２００７−２０１９（１９９５））。本発明
者らは、これらの胎児ライディヒ細胞が、アンドロゲン合成のＭＩＳ媒介阻害に
対して不能性でなくてはならない。なぜならば、ＭＩＳのレベルはまたこの時間
で高いからである。しかし、ＭＩＳ過剰発現マウス（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４５：１６７−１７０（１９９０））では、胎児ウォルフ管（こ
れは、精管、精巣上体、および精嚢の前駆体である）のテストステロン調節分化
の機能障害が観察された。また、インビトロでのＭＩＳとの胎児ラットライディ
ヒ細胞のインキュベーションは、テストステロン合成の抑制を生じる（Ｒｏｕｉ
ｌｌｅｒ−Ｆａｂｒｅら、Ｅｎｄｏｃｒｎｏｌｏｇｙ １３９：１２１３−１２
２０（１９９８））。誕生後、ＭＩＳレベルが高いままである場合、胎児誘導ラ
イディヒ細胞は退行をはじめ、そしてより低いレベルのアンドロゲンが結果とし
て起こる。ＭＩＳレベルがそれらの再下点に達した時に、成体ライディヒ細胞が
生じ、そして思春期に間葉前駆体から増殖し（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８１：５７１−５７６（１９９６）；Ｈｕｄｓｏ
ｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７０：１６−２２（
１９９０））、ＬＨでの刺激の後にアンドロゲンの生成を開始する（Ｓａｅｚ，
Ｊ．Ｍ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：５７４−６２６（１９９４））。本発
明者らの研究で用いられるＭＩＳ調節細胞株は、初めから、この成体ライディヒ
細胞集団に由来する。この区別は、なぜライディヒ細胞（これは高レベルのＭＩ
Ｓを有する環境にある）がアンドロゲンを産生し続けるのかを理解することを試
みる場合に重要である。

【０１１０】 ＭＡ−１０細胞により分泌されるテストステロンの量は、精製されたＬｅｙｄ
ｉｇ細胞によって分泌された量よりもかなり少なく（Ｒｏｕｉｌｌｅｒ−Ｆａｂ
ｒｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９：１２１３〜１２２０（１９９８
））、そしてプロゲステロンのレベルよりも有意に低いが、このことは、ＭＡ−
１０細胞がテストステロンを生じないという意見を克服するものである。本発明
者らの結果は、ＭＡ−１０細胞が培地中に測定可能な量のテストステロンを分泌
することだけでなく、ｃＡＭＰ添加によって３倍に増強され得ることも明白に示
す。ＭＡ−１０細胞株のクローニングおよび特徴づけを詳述する元の報告はまた
、ｈＣＧで誘導された低レベルのテストステロン分泌を示す。ＭＡ−１０細胞は
、Ｃｙｐ１７発現のＭＩＳ媒介阻害を理解することにおいてかなりの価値を証明
し、そしてその阻害の分子機構を理解するための本発明者らの将来の取組みにお
いて非常に有用である。

【０１１１】 ＭＩＳシグナル伝達が、タンパク質合成の非存在下でＣｙｐ１７ ｍＲＮＡ発
現の抑制を直接媒介したか否かを決定するための本発明者らの研究において、本
発明者は、シクロヘキサミド単独でＣｙｐ１７ ｍＲＮＡの発現を誘導し得るこ
とを観察した。シクロヘキサミド処理でのＣｙｐ１７ ｍＲＮＡの増大は、おそ
らく人為現象ではなく、通常は不安定なｍＲＮＡで観察される（Ｔｈｅｏｄｏｒ
ａｋｉｓおよびＣｌｅｖｅｌａｎｄ，ｉｎ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔ
ｒｏｌ，Ｈｅｒｓｈｅｙら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（
１９９６）ｐｐ６３１〜６５２）；このことはＣｙｐ１７発現の重要な成分を不
活性化するかまたは反転させるタンパク質の存在を示し得る。ｃ−ｍｙｃ ｍＲ
ＮＡの場合、ｍＲＮＡの安定性は、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ自体の翻訳に関連して
いる。すなわち、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ崩壊は、その翻訳によって加速される。
シクロヘキサミドは、ｃ−ｍｙｃの翻訳をブロックし、従ってｃ−ｍｙｃ ｍＲ
ＮＡの半減期を延長する（Ｙｅｉｌｄｉｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
３：１５７４９〜１５７５７（１９９８））。

【０１１２】 ＴＧＦβシグナル伝達機構の理解において長足の進歩がなされた。これは、Ｔ
ＧＦβおよびレポーター遺伝子に反応する両方の細胞株（これでその反応を測定
する）の有用性によるものである。現在まで、ＭＩＳシグナル伝達を研究するた
めのこのようなモデルシステムはなかった。ＭＩＳによるげっ歯類Ｌｅｙｄｉｇ
細胞のステロイド合成酵素の転写調節の証拠は、本発明者らのＭＩＳシグナル伝
達の理解における重大な進歩である。ＭＩＳによる遺伝子の転写調節のこの最初
の例は、関連するＭＩＳ特異的シスエレメントおよびトランス活性化因子ならび
に上流経路（ＭＩＳレポーター媒介分子事象の原因である）を分析し規定するた
めに利用され得る。

【０１１３】 このＭＩＳシグナル伝達経路の研究から、多数の可能性のある臨床的な意味が
広がり得る。例えば、テストステロン合成のＭＩＳ媒介下方調節におけるＭＩＳ
特異的チエックポイントは、活性化され得、そして前立腺癌および良性前立腺肥
大のような臨床設定において内因性テストステロンを低下させるために、または
性的早熟症におけるステロイドの上昇を低下させるために用いられ得る。ＧｎＲ
Ｈレセプターを下方制御するためのＧｎＲＨ長時間作用性アナログを用いる現在
の処置は、中枢性性的早熟の処置において成功した（ＨｏｆｆｍａｎおよびＣｒ
ｏｗｌｅｙ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：１２３７〜１２４１（１９８
２））。しかしこのアナログは下流改変体でありこの処置にはまだ至適とはいえ
ず、そしてＭＩＳ関連処置により増強され得る。ＭｃＣｕｎｅ−Ａｌｂｒｉｇｈ
ｔ患者（理由は不明だが女性対男性の比が３１）の６０％以上が、Ｇタンパク質
調節性アデニルシクラーゼのαサブユニットにおける活性化変異に起因して、ゴ
ナドトロピン（性腺刺激ホルモン）の上昇がない状態で性ステロイドを上昇した
（Ｒｉｎｇｅｌら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７５：１７１〜１８４（１９９６））。
ゴナドトロピン依存性性的早熟のこれらの患者において、ＭＩＳによるステロイ
ド産生経路における複数の酵素の抑制は、例えば、短時間では助けになるが長期
間（１〜３年）では有効性が低い、現在用いられるアロマターゼ阻害剤を増強す
るために用いられ得る（Ｆｅｕｉｌｌａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１
５：１１１５〜１１１９（１９８６）；Ｈａｕｆｆａら、Ｈｅｌｖ．Ｐａｅｄｉ
ａｔｒ．Ａｃｔａ ４２：４７１〜４８０（１９８７））。

【０１１４】 （実施例５） （ＭＩＳはインビボでテストステロンを調節する） 成体雄性ラット（２５０ｇ）に、ｈＣＧ（５０Ｕ，ｎ＝３、白抜きバー）、ま
たは５０Ｕ ｈＣＧおよび１ｍｇ ＭＩＳ（ｎ＝３、黒色バー）のいずれかを複
腔内投与した。１８時間後、各動物から血清を収集し、そして放射免疫アッセイ
（ラジオイムノアッセイ）を用いてテストステロン濃度について試験した。結果
を表６に示す。各群の平均値を示しており、誤差バーはＳＥＭを示す（ｐ＜０．
０５）。これらのデータは、血清テストステロンがＭＩＳ投与によって低下され
ることを示す。

【０１１５】 （実施例６） （ＭＩＳの急性投与はインビボでテストステロンを調節する） ステロイドの急性調節を研究するために、ＬＨまたはｈＣＧ（ｒｈＭＩＳを伴
うかまたは伴わない）を、複腔内投与によって動物に投与する。６つの時点（そ
れぞれ１０匹）で、ＭＩＳと一緒にまたはＭＩＳなしで、ＬＨ（２５ＩＵ）を単
回注射で動物に複腔内注射する。示した時点（３０分、１時間、２時間、４時間
、８時間、１８時間）で血清ＭＩＳ、ＬＨおよびテストステロンの測定のために
血液を収集し、そしてＲＮＡの調製のためおよび組織学のために精巣を回収する
。ステロイド合成酵素（ＳＣＣ、３βＨＳＤ、Ｃｙｐ１７など）のｍＲＮＡ発現
を、ノーザン分析で分析する。ｒｈＭＩＳは、血清テストステロン濃度を抑制す
る。

【０１１６】 （実施例７） （ＭＩＳの長期間投与はインビボでテストステロンを調節する） ステロイドの長期間調節を研究するために、ＬＨまたはｈＣＧ（ｒｈＭＩＳを
伴うかまたは伴わない）を、Ａｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプによって動物に投与す
る。慢性ＭＩＳ曝露の効果を１週間毎日分析する。低いテストステロンが上昇し
、次にテストステロン濃度が増大して、ＭＩＳ効果を補償し、そしておそらくＭ
ＩＳ効果を隠すまで、ＬＨレベルを測定する。逆に、ＭＩＳ阻害性効果を観察す
るには、インビトロでのＭＡ−１０細胞のｃＡＭＰ刺激と同様に、ＬＨまたはｃ
ＡＭＰおよび引き続いて高いテストステロンレベルが要求され得る。ＬＨがイン
ビボでＭＩＳ効果を補償することが見出されれば、下垂体切除したラットまたは
長時間作用性ＬＨＲＨアナログで生理学的にクランプされた動物のいずれかで、
ＭＩＳ処置の前に引き続く注意深く制御されたｈＣＧまたはＬＨ送達を用いて、
この研究を繰り返す。ｒｈＭＩＳは血清テストステロン濃度を抑制する。

【０１１７】 本発明は、前述の詳細な説明および実施例において具体的に記載された以外に
も実施され得ることが明らかである。

【０１１８】 本発明の多くの改変および変更が上記の教示に照らして可能であり、従って添
付の特許請求の範囲の範囲内である。

【０１１９】 本明細書において引用した全ての刊行物（特許、特許出願、文献記事、実験マ
ニュアル、書籍、または他の文書を含む）の全開示が、参考として本明細書に援
用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、テストステロン生合成の経路を示す。２１炭素のテストステロンは、
Ｐ４５０−ｓｃｃ（シトクロムＰ４５０側鎖切断）、Ｐ４５０ｃ１７（シトクロ
ムＰ４５０ｃ１７ヒドロキシラーゼ／リアーゼ）、３βＨＳＤ、および１７ＫＳ
Ｒ（１７−ケトステロイドレダクターゼ）の活性によって、２７炭素のコレステ
ロール分子から合成される。

【図２】 図２は、齧歯目ライディヒ細胞におけるＭＩＳＩＩ型レセプターｍＲＮＡ発現
の研究の結果を示す。総ＲＮＡを、その示される供給源から単離し、変性し、電
気泳動し、ナイロンメンブレンにブロットし、そして放射標識したＭＩＳＩＩ型
レセプターリボプローブでプローブした。このブロットを、Ｘ線フィルムに露光
し、ハイブリダイズされたｍＲＮＡの移動を検出した。示される分子量マーカー
は、λＨｉｎｄＩＩＩ消化物の２ｋｂのバンドの移動を表す。

【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、ＭＡ−１０細胞のステロイド産生の分析の結果を示す。
培養培地を収集し、蓄積された総プロゲステロン（図３Ａ）および総テストステ
ロン（図３Ｂ）についてＲＬＡによってアッセイした；５０μＭのｃＡＭＰの存
在下または非存在下での１０５ｎＭのＭＩＳでの処置後１日目または２日目のレ
ベルを示す。交差形態（ｃｒｏｓｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）は、ＭＩＳ処理細
胞と未処理細胞との間で区別不能であった。以前に測定されたように（Ｂｒａｄ
ｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４（１９
７６））、ＭＩＳ処理細胞と未処理細胞との間で総タンパク質含量において有意
な差異は存在しなかった。誤差俸は、ＳＥＭを表す。^*Ｐ＜０．０５；^**Ｐ＜０
．００１；^***Ｐ＜０．０００１。有意性をスチューデントＴ検定を使用して測
定した。

【図４】 図４Ａ〜Ｃは、ステロイド産生（ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）酵素のＲＮＡ
の発現のノーザン分析を示す。その示される細胞由来のステロイド産生酵素のｍ
ＲＮＡの定常状態レベルのノーザン分析を、その示されるプローブを用いて、「
材料および方法」に記載のように行った。ブロットを、ヒトβ−アクチンでリプ
ローブして、サンプルロードについて調節した。図４Ａにおいて、Ｒ２Ｃ細胞を
、示されるように、ＭＩＳ（１０５ｎＭ）またはビヒクルコントロールで３時間
処理した。総ＲＮＡを、インキュベーション後の細胞培養物から抽出し、そして
ノーザンブロットを、１０μｇの各サンプルを使用し、コントロールとして生後
３０日のラット精巣ＲＮＡを用いて行った。図４Ｂにおいて、ＭＡ−１０細胞を
、示されるように、（Ｂｕ）₂−ｃＡＭＰ（５０μＭ）の存在下または非存在下
で、ＭＩＳ（１０５ｎＭ）またはビヒクルコントロールで１８時間処理した。図
４Ｃにおいて、ＭＡ−１０細胞を、示されるように、ＭＩＳまたはビヒクルコン
トロールでの処置の３０分前に１０μＭ／ｍｌのシクロヘキサミドで処理した。

【図５】 図５Ａ〜Ｃは、Ｐ４５０ｃ１７αプロモーターのＭＩＳ調節の研究の結果を示
す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用するプロモーター／レポーターミニ
遺伝子系を用いて、Ｐ４５０ｃ１７α遺伝子のプロモーターを特徴付けた。図５
Ａにおいて、ＭＡ−１０細胞を、トランスフェクションの２４時間後、ビヒクル
コントロールまたは１、４、７、３５、７０、１０５および１７５ｎＭのＭＩＳ
と共に、１８時間または２９時間インキュベートした。細胞抽出物を、ホタルル
シフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの活性についてアッセイし、
その結果を、ビヒクルコントロール値を１０００相対光単位に正規化した、ホタ
ル／Ｒｅｎｉｌｌａ値として示す。図５Ｂにおいて、細胞を、トランスフェクシ
ョン後２４時間で開始してその示される時間の間、ビヒクルコントロールまたは
１０５ｎＭ ＭＩＳと共にインキュベートした。細胞をまた、不活性なＬ９非切
断変異体ＭＩＳと共に１８時間インキュベートした（アスタリスクで示す）。細
胞抽出物をルシフェラーゼ活性についてアッセイし、そして結果を、１８時間の
ビヒクルコントロール値を１０００相対光単位に正規化した、ホタル／Ｒｅｎｉ
ｌｌａ値として示す。図５Ｃにおいて、細胞を、トランスフェクションの開始時
に１０５ｎＭのＭＩＳで処理し、その示される時間の間、インキュベートした。
細胞抽出物をルシフェラーゼ活性についてアッセイし、そして結果を、１８時間
のビヒクルコントロール値を１０００相対光単位に正規化した、ホタル／Ｒｅｎ
ｉｌｌａ値として示す。誤差俸は、ＳＥＭを表す。

【図６】 図６は、インビボでのテストステロン濃度のＭＩＳ調節の研究の結果を示す。
成体雄性ラット（２５０ｇ）に、ｈＣＧ（５０Ｕ、ｎ＝３、白俸）または５０Ｕ
のｈＣＧおよび１ｍｇのＭＩＳ（ｎ＝３、黒俸）のいずれかを、腹腔内投与した
。１８時間後、血清を各動物から収集し、そして放射免疫アッセイを使用してテ
ストステロン濃度について試験した。各群における平均値を示す。誤差俸はＳＥ
Ｍを表す。ｐ＜０．０５。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/08 Ａ６１Ｐ 15/00 15/00 15/08 15/08 35/00 35/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ティセイラ， ホセ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02118， ボストン， ウエスト コンコ ード ストリート 116 (72)発明者 フィン−トンプソン， エリック アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02115， ボストン， アベニュー ルイ ス パストゥール 107 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 BA44 DB01 DB70 MA13 MA17 MA24 MA32 MA35 MA37 MA38 MA52 MA56 MA57 MA59 MA63 MA65 MA66 NA14 ZA812 ZB262 ZC032 ZC412 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 MA13 MA17 MA24 MA32 MA35 MA37 MA38 MA52 MA56 MA57 MA59 MA63 MA65 MA66 NA14 ZA81 ZB26 ZC03 ZC41 4C087 AA01 AA02 BC83 CA09 CA12 CA20 MA13 MA17 MA24 MA32 MA35 MA37 MA38 MA52 MA56 MA57 MA59 MA63 MA65 MA66 NA14 ZA81 ZB26 ZC03 ZC41

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １以上のアンドロゲンの過剰によって特徴付けられる状態ま
   たは疾患を処置する方法であって、該方法は、患者に有効量のＭＩＳを投与する
   工程を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記１以上のアンドロゲンが、テストステロンである、請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記ＭＩＳが、約１４０ｋＤａまたは約７０ｋＤａの分子量
   を有する、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記ＭＩＳが、ＭＩＳのＣ末端フラグメントである、請求項
   １に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記Ｃ末端フラグメントが、約２５ｋＤａまたは約１２．５
   ｋＤａの分子量を有する、請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記状態または疾患が、多嚢胞性卵巣疾患および性的早熟か
   らなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記状態または疾患が、多嚢胞性卵巣疾患である、請求項６
   に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記状態または疾患が、性的早熟である、請求項６に記載の
   方法。
9. 【請求項９】 １以上のアンドロゲンの過剰によって特徴付けられる状態ま
   たは疾患を処置する方法であって、該方法は、ＭＩＳをコードする有効量の核酸
   を患者に投与する工程を包含する、方法。
10. 【請求項１０】 前記１以上のアンドロゲンが、テストステロンである、請
    求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記ＭＩＳが、約１４０ｋＤａまたは約７０ｋＤａの分子
    量を有する、請求項９に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記ＭＩＳが、ＭＩＳのＣ末端フラグメントである、請求
    項９に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記Ｃ末端フラグメントが、約２５ｋＤａまたは約１２．
    ５ｋＤａの分子量を有する、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記状態または疾患が、多嚢胞性卵巣疾患および性的早熟
    からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記状態または疾患が、多嚢胞性卵巣疾患である、請求項
    １４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記状態または疾患が、性的早熟である、請求項１４に記
    載の方法。
17. 【請求項１７】 １以上のアンドロゲンの血漿レベルを低下させる方法であ
    って、該方法は、有効量のＭＩＳを患者に投与する工程を包含し、該量のＭＩＳ
    は、該１以上のアンドロゲンの血漿レベルを、該１以上のアンドロゲンの正常レ
    ベル未満に低下させるに十分である、方法。
18. 【請求項１８】 前記１以上のアンドロゲンが、テストステロンである、請
    求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記ＭＩＳが、約１４０ｋＤａまたは約７０ｋＤａの分子
    量を有する、請求項１７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記ＭＩＳが、ＭＩＳのＣ末端フラグメントである、請求
    項１７に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記Ｃ末端フラグメントが、約２５ｋＤａまたは約１２．
    ５ｋＤａの分子量を有する、請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記患者が、良性前立腺肥大を有し、そして前記ＭＩＳの
    投与の結果として、該肥大の程度が減少される、請求項１７に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記患者が、前立腺癌を有し、そして前記ＭＩＳの投与の
    結果として、該癌の進行が停止するかまたは遅くなる、請求項１７に記載の方法
    。
24. 【請求項２４】 １以上のアンドロゲンの血漿レベルを低下させる方法であ
    って、該方法は、ＭＩＳをコードする有効量の核酸を患者に投与する工程を包含
    し、該量のＭＩＳは、該１以上のアンドロゲンの血漿レベルを、該１以上のアン
    ドロゲンの正常レベル未満に低下させるに十分である、方法。
25. 【請求項２５】 前記１以上のアンドロゲンが、テストステロンである、請
    求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記ＭＩＳが、約１４０ｋＤａまたは約７０ｋＤａの分子
    量を有する、請求項２４に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記ＭＩＳが、ＭＩＳのＣ末端フラグメントである、請求
    項２４に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記Ｃ末端フラグメントが、約２５ｋＤａまたは約１２．
    ５ｋＤａの分子量を有する、請求項２７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記患者が、良性前立腺肥大を有し、そして前記核酸の投
    与の結果として、該肥大の程度が減少される、請求項２４に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記患者が、前立腺癌を有し、そして前記核酸の投与の結
    果として、該癌の進行が停止するかまたは遅くなる、請求項２４に記載の方法。