CN107810195B - 重组丛生蛋白及其在疾病治疗和预防中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了重组丛生蛋白多肽其含有其的组合物。在一些方面，重组丛生蛋白或编码其的核酸可以用来治疗和预防患有疾病(例如心血管疾病或酒精中毒)的哺乳动物的形态和功能的异常。

Description

重组丛生蛋白及其在疾病治疗和预防中的应用

本申请要求于2014年12月4日提交的美国临时专利申请号No.62/087,364的权利，其全文以引用的方式并入本申请中。

序列表

序列表保存在一个名为“UTSHP0306US_ST25.txt”的文件中，此文件创建于2015年12月2日，大小为60KB(以Microsoft

系统为标准)，随同本申请共同以电子申请的形式提交，并以引用的方式纳入本申请中。

背景技术

1.技术领域

本发明涉及重组丛生蛋白(recombinant clusterin)产品，及其在疾病预防和治疗中的应用。

2.相关技术概述

动脉粥样硬化是一种可以引发心肌梗塞和脑梗塞的动脉疾病，而高胆固醇血症则是最易引发动脉粥样硬化的危险因素。低密度脂蛋白(LDL)将胆固醇从肝脏运输至外周组织，当LDL在血液中浓度升高时，其会将脂质沉降在动脉壁上，进而发展为动脉粥样硬化斑块，增加动脉发生血栓的风险。相较之下，高密度脂蛋白(HDL)起到逆向运输胆固醇的作用，可将动脉壁上的脂质移除并运输到肝脏中进行代谢。实际上，LDL导致动脉粥样硬化的发生，而HDL则抗动脉粥样硬化的发生(Nicholls et al.，2005；Ansell et al.，2004；vonEckardstein et al.，2005)。LDL主要包括载脂蛋白B 100(Apo B 100)，HDL主要包括载脂蛋白E(Apo E)和载脂蛋白A-I(Apo A-I)。虽然采用他汀类药物降低LDL-胆固醇的疗法对治疗动脉粥样硬化十分有效，但是采用Torcetrapib(胆固醇酯转运蛋白(CETP)抑制剂)来提高HDL水平的疗法却对动脉粥样硬化患者作用甚微(Kastelein et al.，2007；Nissen etal.，2007)。Torcetrapib疗法的失败使研究者意识到目前对HDL功能的基本认知仍不完善。HDL分子的种类很多，且在外形、密度、大小、组成上也不一致，且不同的HDL分子具有不同的功能，如胆固醇的逆向运输、抗氧化、抗炎、抗血栓等。实际上，功能失调的、促炎症反应的HDL已经在某些病理学情况中被发现，包括动脉粥样硬化(Smith et al.，2010)，糖尿病(Hoofnagle et al.2010)，以及自身免疫系统紊乱(McMahon et al.，2009；Volkmann etal.，2010)。因此，研究可以发挥HDL有益作用的制剂，如抗动脉粥样硬化、抗细胞凋亡、抗炎的制剂，是具有临床意义的。

丛生蛋白是一种硫酸化异源二聚体糖蛋白，包括两条40kDa的多肽链，两条多肽链通过一个独特的含有五个二硫键的模体1)相连接。该蛋白包括若干个结构域，如两亲性螺旋、肝素结合结构域以及脂质结合结构域等。丛生蛋白在绵羊的睾丸膜体液中首次被发现，并因其能引起支持细胞(Sertoli cell)的聚集，从而促进精细胞的成熟和发育而命名(NCBI/GenBank Accession No.NM_203339，NM_001831)。此后，多个不同领域的研究人员对物种同系物进行分离和克隆，得到了多种丛生蛋白同类物质，包括雄激素抑制前列腺信号蛋白-2(TRPM-2)、硫酸化糖蛋白-2(SGP-2)、载脂蛋白J(Apo-J)、分泌蛋白-40，40(SP-40,40)、补体溶解抑制因子(CLI)，以及二聚酸性糖蛋白(DAG)、糖蛋白80(gp 80)，NA1/NA2，糖蛋白III等。

丛生蛋白从位于小鼠的第14染色体和人类的第8p21染色体上的单拷贝基因转录，编码于一个长为2-kb的信使核糖核酸(mRNA)上(Fink et al.，1993)，经翻译成为包含427个氨基酸序列的约为51kD的蛋白质(Jordan-Starck et al.，1994)。在血液中，丛生蛋白主要是作为一种载脂蛋白随着HDL进行循环(Choi-Miura et al.，1992；Stuart et al.，1992)，但是一小部分丛生蛋白可能会出现在LDL中(Karlsson et al.，2005)。丛生蛋白的表达被应激反应所诱导(Wilson et al.，2000)，并可以与megalin/LRP-2受体结合，上述受体是LDL受体家族的成员之一。无论在人(Mackness et al.，1997；Ishikawa et al.，2001；Ishikawa et al.，1998)，还是在试验动物(Jordan-Starck et al.，1994；Navab et al.，1997)中，动脉粥样硬化都会带来丛生蛋白表达量的提高。截至目前，已报道过丛生蛋白的功能包括抑制细胞凋亡(Kowolik et al.2006)，灭活补体因子(Correa-Rotter et al.，1992)，脂质的回收和转运(Gelissen et al.，1998)，细胞膜的保护，以及维持细胞间或细胞与基质间的联系等。丛生蛋白还可以有效地与脂质结合，并促进载脂泡沫细胞(Lipid-laden foam cells)释放胆固醇和氧化型胆固醇，而该细胞的存在正是动脉粥样硬化的一个标志性特征(Gelissen et al.，1998)。丛生蛋白与一系列生物配体均具有高亲和力，其所兼备的亲水结构域和疏水结构域可以使其作为分子伴侣或“生物学清洁剂”。

丛生蛋白对新陈代谢的调控和多种组织与器官的功能都起到作用，特别是对心血管系统。研究发现，对于胰岛素抵抗代谢综合症患者，HDL中丛生蛋白水平的降低与心肌梗塞的高发生率有关(Hoofnagle et al.，2010)。据报道，口服丛生蛋白肽类可以降低Apo-E缺失小鼠(ApoE-null mice)的动脉粥样硬化发生几率(Navab et al.，2005)，而静脉注射丛生蛋白可以减少大鼠心肌梗塞的发生(Van Dijk et al.，2010)。对于被乙醇损伤的心肌细胞，丛生蛋白的转导(transduction of clusterin)可以恢复其线粒体膜电位，并阻止线粒体中的细胞色素c释放到细胞质中(Li et al.，2007)。进一步的，研究人员发现，肌细胞中丛生蛋白表达量的增加，可以提高细胞在CXCR4诱导下的迁移和归巢的能力，所述的CXCR4，是一种基质细胞衍生因子(SDF)的趋化因子受体。

人丛生蛋白基因位于第8号染色体上(8p21-p18)，长度为17876bp，总共包含10个外显子。外显子1和外显子2的选择性表达形成了丛生蛋白的两个不同转录本异构体(Transcript isoform)，其余的外显子被这两种异构体所共用(Ansell et al.，2004；vonEckardstein et al.，2005；Kastelein et al.，2007；Nissen et al.，2007；Smith etal.，2010；Hoofnagle et al.2010；McMahon et al.，2009；Volkmann et al.，2010)。丛生蛋白的转录本具有3个位于读码框中的翻译起始位点(ATG)。最具特征性的蛋白异构体，源自转录本异构体2，从外显子2的第二个ATG密码子开始翻译，而此密码子刚好位于一个以内质网为靶点的引导肽序列上游。丛生蛋白前体蛋白(NP-976084)由449个氨基酸组成。有证据显示，从上述转录本异构体2上可以表达出两个核蛋白异构体，一个是从外显子3的ATG密码子开始翻译(由417个氨基酸组成)，另一个从外显子1的ATG密码子开始翻译(由459个氨基酸组成)。分泌型丛生蛋白是由转录本异构体2翻译得到的。最初的前体蛋白，分泌前的psCLU(约60kDa)，在内质网中被进一步水解和糖基化，最终由α、β多肽链通过5个二硫键相连接形成一个成熟的异源二聚体分泌蛋白sCLU(约75-80kDa)。

在离子辐射及氧化压力的刺激下，核型丛生蛋白首先被翻译成一个未被糖基化的前体蛋白，pnCLU(约49kDa)，然后进入细胞核内。有证据表明，分别从外显子3或外显子1的ATG密码子起始表达可以翻译生成两种不同分子量(约50kDa及约60kDa)的核型丛生蛋白(Pajak et al.，2007)。分泌型丛生蛋白起到保护细胞的作用，而核型丛生蛋白则具有细胞毒性。对于丛生蛋白功能的争议主要是源自对这两种蛋白异构体作用的不确定性，而这两种蛋白异构体还具有不同的亚细胞定位，甚至在一定程度上发挥着相反的功能。丛生蛋白一些已知的功能包括参与细胞凋亡，此种参与可以通过与Ku70自身抗原配位(nCLU，促凋亡)，或阻断Bax蛋白的激活(sCLU，抗凋亡)来完成(Araki et al.，2005；Klokov et al.，2004；Leskov et al.，2003；Yang et al.，2000)。同时，丛生蛋白也参与精子形成、上皮细胞分化、TGF-beta通过Smad2/Smad3的信号转导(Shin et al.，2008；Ahn et al.，2008；Leeet al.，1992)、补体活化(Dietzsch et al.，1992；O'Bryan et al.，1990)等过程相关。分泌型野生丛生蛋白包含了核型丛生蛋白的序列结构域，而这些序列结构域对细胞核转位以及对与核凋亡信号蛋白如Ku70的结合，是至关重要的。

尽管丛生蛋白在细胞调节中扮演着多种角色，治疗用的重组丛生蛋白及其类似物依然亟待进一步的研究。本发明公开了一种制备重组丛生蛋白的方法，所得的丛生蛋白产物与分泌型野生丛生蛋白具有很高的同源性，并具有保护功能，含有此种重组丛生蛋白的药物组合物可以用于哺乳动物疾病的预防和治疗。

发明内容

在本发明的第一种实施方式中，提供一种包含哺乳动物丛生蛋白编码序列的重组多肽。在多个方面，所述丛生蛋白编码序列可以为核定位信号结构域和/或跨膜结构域(TMD)缺失的序列。在某些方面，所述多肽可以为包含丛生蛋白编码序列及其异源多肽序列的一个融合蛋白。例如，所述多肽还可以包含一个标签序列。另一方面，所述多肽可以包含一个蛋白酶酶切位点(例如，所述酶切位点可以是凝血酶酶切位点(Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser；SEQ ID NO:16)，或肠激酶酶切位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；SEQ ID NO:17)。例如，所述酶切位点可以位于标签序列和丛生蛋白编码序列之间。在多个方面，所述标签序列可以为一个多聚组氨酸标签。所述标签序列可以位于丛生蛋白编码序列的N端，也可以位于丛生蛋白编码序列的C端。

在另一种实施方式中，提供一种药物组合物，该组合物包含上述实施方式中所述的丛生蛋白多肽及其在药学上可接受的载体。在各个方面，所述组合物可以被冷藏或冻干。

在另一种实施方式中，提供一种经分离的多聚核苷酸分子，所述多聚核苷酸分子包括一段编码上述实施方式中所述的丛生蛋白多肽的核酸序列。在一些方面，编码所述多肽的核苷酸序列可操作地连接于启动子上。在某些方面，所述启动子可以是能够在哺乳动物、细菌或昆虫细胞中行使功能的启动子。在一些方面，所述多聚核苷酸可以为某一表达载体的一部分，如质粒、附加型表达载体或病毒表达载体。

在另一种实施方式中，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含一段编码上述实施方式中所述的丛生蛋白多肽的多聚核苷酸分子。在一些方面，所述宿主细胞可以为细菌细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞。在某些特定的方面，所述宿主细胞为人体细胞，如多能细胞(pluripotent cell)、心脏细胞、内皮细胞，或者是心脏细胞或内皮细胞的前体细胞。

在另一种实施方式中，提供一种制备重组丛生蛋白多肽的方法，该方法包括(a)在细胞中表达一段编码上述实施方式中所述的丛生蛋白多肽的多聚核苷酸分子；(b)从所述细胞中纯化得到此段多肽。在多个方面，所述多肽可以包含一个纯化标签，在所述纯化过程中，使用与所述纯化标签具有亲和作用的介质对所述多肽进行纯化。在一些方面，所述纯化标签可以为多聚组氨酸标签，在所述纯化过程中，采用金属亲和层析柱对所述多肽进行纯化。在某些方面，所述纯化标签还可以包含一个蛋白酶酶切位点，所述蛋白酶酶切位点位于标签序列与丛生蛋白编码序列之间，所述纯化过程中包含蛋白酶在所述酶切位点上对多肽进行酶切。

在某些方面，一些实施方式的方法中涉及对编码丛生蛋白核苷酸在哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞中的构建和/或转染，使得丛生蛋白多肽在上述细胞内充分表达。在某些实施方式中，大量表达核苷酸编码丛生蛋白的步骤包括，将编码整条丛生蛋白多肽序列或编码具有生物活性部分的丛生蛋白序列的DNA序列转染进组织细胞中，所述序列可操作地连接于启动子上，并能够在细胞中得以表达，获得大量的丛生蛋白，用于后续的鉴定、浓缩、提取、纯化。

在另一种实施方式中，提供一种治疗或预防心血管疾病的方法，所述方法包括服用有效剂量的丛生蛋白药物组合物，所述组合物包括(a)重组丛生蛋白多肽，(b)编码丛生蛋白多肽的多聚核苷酸(例如，一种表达载体)，和/或(c)可以表达上述实施方式中的外源性丛生蛋白多肽的细胞。在一些方面，所述心血管系统疾病可以为高血压、高血脂、高胆固醇血症、高血糖症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化合并缺血性心力衰竭、狭窄症(stenosis)、心血管钙化、中风、心肌梗塞、脑梗塞等。在一些方面，所述心血管系统疾病可以是高血脂、高胆固醇血症，或动脉粥样硬化。另一方面，所述心血管系统疾病可以是糖尿病。在各个方面，有效剂量的所述丛生蛋白药物组合物可以有效降低血液中胆固醇、血糖、甘油三酯、促进细胞外排胆固醇，和/或提高血管或心脏细胞的存活率。在一些方面，在细胞毒性因子或细胞生长抑制因子存在时，有效剂量的所述丛生蛋白药物组合物可以增强或促进细胞的存活和生长，所述细胞毒性因子或细胞生长抑制因子包括但不限于，氧化型胆固醇、氧化型脂蛋白或促炎细胞因子。

根据某些实施方式，提供一种治疗或预防哺乳动物动脉粥样硬化或其并发症的方法。为了更清楚地阐释本发明，所述的“预防”动脉粥样硬化具有本领域中的通常含义，同时也具有“抑制”和“降低”动脉粥样硬化的含义。所述治疗方法包含采用上文所述的方法，通过使丛生蛋白多肽与组织中的细胞相接触，从而有效地阻止或预防细胞凋亡，或降低动脉粥样硬化损伤发生的风险，所述组织为具有动脉粥样硬化损伤的心脏或血管或脑组织，或具有发生动脉粥样硬化风险的组织。在一些实施方式中，丛生蛋白多肽与组织中细胞的接触可以阻止或预防组织损伤或恶化，或降低动脉粥样硬化损伤引起破裂的风险。

在某些方面，所述动脉粥样硬化损伤包括伴随有炎症的血管钙化或瓣膜钙化，这导致血管组织失去弹性，以及心脏或主动脉瓣膜病变，如主动脉瓣膜狭窄或主动脉瓣膜关闭不全。在上文所述的方法中，一定剂量的丛生蛋白药物组合物，可以有效地阻止或预防钙化，和/或保护机体免于炎症损伤，所述钙化或炎症损伤由下述至少一种情况引起：高胆固醇血症、高血糖症、高磷酸盐血症，和/或高血压。

在一些方面，动脉粥样硬化损伤或斑块包括由高血脂和炎症引起的不稳定斑块，一定剂量的丛生蛋白应用于治疗靶点以稳定斑块的发展(例如，防止斑块的破裂，血栓的形成，或其他的并发症)。

本发明的另一种实施方式，提供了一种治疗哺乳动物急性血管综合症和心力衰竭的方法，所述方法包括递送大量丛生蛋白药物组合物到哺乳动物心脏以保护和增强心脏机能。

在另一种实施方式中，提供一种治疗和预防酒精中毒的方法，所述方法包括服用有效剂量的丛生蛋白药物组合物，所述药物组合物包括(a)重组丛生蛋白多肽，(b)编码丛生蛋白多肽的多聚核苷酸(例如，一种表达载体)，和/或(c)可以表达上述实施方式中的外源性丛生蛋白多肽的细胞。在一些方面，丛生蛋白药物组合物的有效剂量为可以减轻戒断症状、酒精危害(Alcohol intact)或肝脏损伤的剂量。

在一些方面，上述实施方式中所述的丛生蛋白药物组合物(例如，重组丛生蛋白多肽，编码丛生蛋白多肽的多聚核苷酸，和/或可以表达上述实施方式中的外源性丛生蛋白多肽的细胞)可以通过静脉注射或导管给药的方式进行给药。在一些方面，丛生蛋白药物组合物被递送到一个或多个哺乳动物组织或器官中，所述组织或器官正在受到物理和/或化学损伤，或存在受到物理和/或化学损伤风险。在一些实施方式中，所述组织为心脏或血管或脑组织。在某些实施方式中，所述血管或心脏组织受到动脉粥样硬化或心力衰竭的影响。在一些实施方式中，所述血管或心脏组织没有受到动脉粥样硬化、急性血管综合症或心力衰竭的影响。在一些实施方式中，所述细胞为下述细胞的一种或多种：血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、脑细胞。

因此，在某些方面，本发明提供一种将哺乳动物细胞，如干细胞，导入到某个组织或器官的方法，所述哺乳动物细胞为能够提高重组丛生蛋白表达量，或是经重组丛生蛋白处理过的细胞。在一些实施方式中，所述组织或器官包括患有心力衰竭的心脏或患有动脉粥样硬化的血管。在一些实施方式中，所述干细胞通过静脉注射、动脉导管、肌肉注射或组织内注射的方式导入。在某些实施方式中，所述干细胞与血管扩张制剂和/或抗血栓制剂共同被递送或注射。对于上述或其他的实施方式，本领域技术人员可以通过下文的具体实施方式或附图理解本发明的特征和优点。

另一方面，递送大量重组丛生蛋白的过程包括将其溶解在溶液或缓冲液中，并将上述溶解了丛生蛋白的溶液注射进血液或组织、或施用在损伤组织或器官表面。

在本文所用的术语中，“丛生蛋白(Clusterin)”，“载脂蛋白J(ApolipoproteinJ)”，“Apo J”代表相同的含义。

在本文所用的术语中，“基本不含有”为对某种特定组分的限定，其意义为所述特定组分不存在于组合物中，和/或所述特定组分含量极微。所述特定组分来源于非目性的污染，其含量不超过组合物的0.05％。在一些方面，更为优选的方案为，在组合物中，所述特定组分无法用现有的检测方法检测到。

在本文说明书及权利要求书所用的术语中，“一个”或“某一个”可以表示一个或多个。在本文说明书及权利要求书所用的术语中，当“一个”或“某一个”与“包含”或“包括”联用时，可以表示一个或多个。在本文说明书及权利要求书所用的术语中，“另一个”或“又一个”代表至少有两个或超过两个。

在本文说明书及权利要求书所用的术语中，“大约”表示用某种方法定义变量时，该变量包含系统误差的固有变差，或者该变差存在于研究对象中。

此外，通过下文具体实施方式的描述，本发明的特征和优点是显而易见的。应该理解的是，具体实施方式和具体实施例仅仅是对本发明的某种实施方式进行举例说明，因此，对本文具体实施方式进行符合本发明内容或范围的各种改动或改进，对于本领域技术人员来说，均是显而易见的。

附图说明

下文的附图作为说明书的一部分用于进一步的解释本发明。通过将上述具体的实施方式与一个或多个的附图相结合，可以更好的理解本发明。

附图1-为含有丛生蛋白类似物的质粒pCluAg的示意图。表示丛生蛋白cDNA的亚克隆，以及通过插入丛生蛋白类似物编码的cDNA片段来构建表达载体(SEQ ID NO:26)。

附图2A-2E-本发明实施方式中各种丛生蛋白多肽的多肽序列及其结构。

附图3-重组人丛生蛋白保存在溶液中，或以干粉形式保存三个月后，用考马斯亮蓝(G250)染色，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果。结果表明该多肽具有长期稳定性。

附图4-对重组人丛生蛋白多肽的免疫印迹分析。对丛生蛋白多肽(1μg/泳道)进行SDS-PAGE(7％)。电泳后，将蛋白条带转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用兔抗人丛生蛋白抗体(1：200)进行标记，通过化学发光法显示出免疫组化染色条带。结果再次表明该多肽具有长期稳定性。

附图5-对重组人丛生蛋白进行离子交换快速蛋白液相色谱(FPLC)。将丛生蛋白多肽与其他组分分离，并分散于水溶液或缓冲液中。缓冲液流速由正排量泵进行控制且保持不变，同时，该缓冲液的组成可以通过调整两个或更多储液罐中溶液的进液比例进行改变。离子交换FPLC(BioRad UnoQ12column)；缓冲液A：20mM Tris(pH8.0)0.5mM EDTA；缓冲液B：20mM Tris(pH8.0)0.5mM EDTA+1N NaCl；流速：2ml/min；进样量：250ug；结果采集：80分钟后的洗脱峰。

附图6A-6C-对经重组丛生蛋白静脉注射的野生型和ApoE基因缺失型小鼠进行免疫印迹分析。对注射不同重组丛生蛋白类似物(CluAg)或生理盐水(7日)的野生型和ApoE基因缺失型小鼠进行免疫印迹分析，检测血浆中丛生蛋白和ApoAI的含量(附图6A)。密度计量结果显示，注射Clu的小鼠，相比于注射生理盐水的小鼠，具有更高的丛生蛋白水平(附图6B)。C57BL/6小鼠注射重组人丛生蛋白类似物后，对其血浆的丛生蛋白(Clu)进行共沉淀(附图6C)。载脂蛋白-A1，作为一种已知的HDL组成成分，被抗载脂蛋白-A1抗体沉淀，对载脂蛋白-A1沉淀的蛋白质印记分析(Western blot)由抗丛生蛋白抗体进行。

附图7-对人平滑肌细胞(SMC)进行培养，并用氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和带有HisTR标签的重组丛生蛋白类似物(CluAg)进行处理，对从培养基上清液提取的丛生蛋白和带有HisTR标签的蛋白的免疫印迹分析。

附图8-生长曲线，所述生长曲线表明，孵育重组丛生蛋白类似物可以刺激人血管SMC的增殖。SMC在含有CluAg-I(1-6μg/ml)的DMEM培养基中进行培养。

附图9-生长曲线，所述生长曲线表明，孵育重组丛生蛋白类似物可以阻止氧化脂蛋白对SMC的抑制作用，同时还可以刺激人血管SMC的增殖。SMC在含有CluAg-I(1-6μg/ml)及50μg/ml oxLDL的DMEM培养基中进行培养。

附图10-野生型小鼠(上图)和ApoE^-/-型小鼠(下图)的血浆对比。附图显示，注射重组丛生蛋白，CluAg-I后，ApoE^-/-动脉粥样硬化倾向小鼠的血液中葡萄糖、胆固醇、甘油三酯以及LDL的水平均有降低，但鼠龄性别均相同的野生型小鼠的上述指标则没有变化。

附图11-野生型小鼠(上图)和ApoE^-/-型小鼠(下图)的血压对比。附图显示，静脉注射人重组丛生蛋白类似物、CluAg-I三个月后，ApoE^-/-动脉粥样硬化倾向小鼠收缩压和血压均有降低，但是鼠龄(6-8个月)性别(雄性)均相同的野生型小鼠的上述指标则没有变化。

附图12-注射CluAg-I的野生型小鼠和ApoE^-/-型小鼠的超声心动图。野生型小鼠和ApoE^-/-型小鼠注射CluAg三个月后，用Visualsonics^TM echo装置进行超声检测。

附图13-野生型小鼠和ApoE^-/-型小鼠左室射血分数的对比。静脉注射人重组丛生蛋白类似物、CluAg-I三个月后，ApoE^-/-动脉粥样硬化倾向小鼠血压降低，但是鼠龄(6-8个月)性别(雄性)均相同的野生型小鼠的血压则没有没有上述变化。

附图14-野生型小鼠和ApoE^-/-型小鼠主动脉的油红O染色结果，证明了每周静脉注射人重组丛生蛋白类似物、CluAg-I，持续三个月后，ApoE^-/-动脉粥样硬化倾向小鼠中斑块的大小会减小，但是鼠龄(6-8个月)性别(雄性)均相同的野生型小鼠则没有上述变化。经CluA处理的ApoE^-/-型小鼠油红O染色变弱(图d)。

附图15-对鼠血管SMC茜素红染色的结果显示CluAg可以通过表达ApoER2和VLDLR，来减少磷酸盐诱导的ApoE^-/-小鼠SMC细胞的钙化。SMC细胞在含Pi(3.6mmol/L)+/-CluAg的5％FBS的DMEM培养基中培养6天，并用ApoER2或VLDLR的shRNA进行处理。培养结束后，用PBS洗涤细胞，在10％的福尔马林中固定，并用2％茜素红在37℃下染色10分钟。减弱的茜素红染色可能是受到ApoER2和VLDLR shRNA的影响。

附图16A-16C-附图显示CluAg的处理可以通过表达ApoER2和VLDLR，来减少磷酸盐诱导的ApoE^-/-血管SMC的钙化。SMC细胞在含Pi(3.6mmol/L)、添加或不添加CluAg(6μg/ml)的5％FBS的DMEM培养基中培养6天，并用ApoER2或VLDLR的shRNA进行处理。培养结束后，用PBS洗涤细胞，在0.6M HCl中过夜孵育。细胞裂解液与0.1N的NaOH混合，用于裂解细胞，然后测定蛋白浓度。收集上清液，通过钙测定实验来测定其中的钙含量；与90μl显色试剂混合，加入60μl钙测定缓冲液，轻轻混合；在避光条件，室温下反应5-10分钟；测量溶液在575nm下的OD值。附图16A，血管SMC经阴性对照ShRNA处理；附图16B，经ApoER2的ShRNA处理；附图16C，经VLDLR的ShRNA处理；数值采用平均值±标准差的形式，**代表p<0.01，#代表p<0.05。

附图17-茜素红染色结果表明，每周静脉注射人重组丛生蛋白类似物、CluAg，持续3个月后，ApoE^-/-动脉粥样硬化倾向小鼠的动脉粥样硬化及钙化过程均受到抑制。图a为野生型小鼠作为对照。主动脉在37℃下用2％茜素红染色10分钟。图a和图b为4倍的放大倍数，图c和图d为10倍的放大倍数。观察到，经CluAg处理的ApoE^-/-小鼠，斑块减小的同时茜素红染色也有减弱。

附图18-图a-h为野生型小鼠和ApoE^-/-小鼠经过或不经CluAg处理后，主动脉中骨形成蛋白-2(BMP2)的免疫荧光反应结果。同样的，结果表明经CluAg处理后，ApoE^-/-小鼠BMP2表达量降低。

附图19A-19B-野生型和ApoE缺失型小鼠主动脉分离出的SMC的钙沉积。ApoE^-/-鼠的VSMC细胞更易被磷(Pi)诱导形成钙化。对野生型小鼠和ApoE^-/-小鼠主动脉分离出的VSMC细胞的茜素红染色(图19A)和钙测定(19B)。比例尺为200μm。野生型小鼠和ApoE^-/-小鼠的VSMC细胞在有或没有Apo J(6μg/mL)的存在情况下，经过无机磷酸盐(Pi)处理。柱状图代表平均值±标准差，n＝5，*代表相比对照组P<0.05；**代表相比对照组P<0.01；#代表相比含Pi组P<0.05；##代表相比含Pi组P<0.01。

附图20A-20B-SMC细胞经或不经Apo J处理后的钙沉积示意图。Apo J对ApoE^-/-鼠VSMC细胞钙化的抑制作用与Apo J的浓度相关。图a：对ApoE^-/-小鼠VSMC细胞的茜素红S染色。VSMC细胞在钙化过程中用不同浓度的Apo J(0-12μg/ml)处理。比例尺为200μm。图b：对ApoE^-/-鼠VSMC细胞用不同浓度的Apo J(0-12μg/ml)和Pi处理后，进行钙测定。柱状图代表平均值±标准差，n＝5。**代表相比对照组P<0.01；##代表相比含Pi组P<0.01。

附图21A-21D-Apo J调节平滑肌特异性标记和钙化相关基因的蛋白表达。VSMC细胞经过Pi和Apo J(0-12μg/ml)的处理。图21A：取40μl细胞培养基来检测Apo J在培养基中的含量水平。通过蛋白质印记分析对SM22α、αSMA和Runx2蛋白表达水平进行测定。以GAPDH作为内参照。附图21B-21D：通过密度计量分析对SM22α、αSMA和Runx2进行定量。柱状图代表平均值±标准差，n＝5。*代表相比对照组P<0.05；**代表相比对照组P<0.01；#代表相比含Pi组P<0.05；##代表相比含Pi组P<0.01。

附图22A-22B-Apo J在钙化过程中的表达量。附图22A：取40μl细胞培养基通过蛋白质印记分析检测Apo J的表达量。附图22B，通过qRT-PCR检测Apo J mRNA的表达量。以GAPDH作为内部对照。柱状图代表平均值±标准差，n＝3。*代表相比对照组P<0.05；**代表相比对照组P<0.01。

附图23A-23D-Apo J影响钙化过程中mRNA水平上的成骨细胞标记。VSMC细胞采用Pi和Apo J(0-12μg/ml)共同处理。Runx2(23A)，BMP-2(23B)，ALP(23C)及OPN(23D)mRNA的表达通过qRT-PCR进行定量，并通过内部对照GAPDH进行归一化。柱状图代表平均值±标准差，n＝5。**代表相比对照组P<0.01；#代表相比含Pi组P<0.05；##代表相比含Pi组P<0.01。

附图24A-24F-对慢病毒shRNA中ApoER2和VLDLR受体的抑制。附图24A-24B：ApoE-/-细胞被ApoER2shRNA、VLDLR shRNA或阴性对照shRNA转染，以收集全部细胞裂解物，用于对ApoER2或VLDLR的蛋白质印记分析。附图24C-24D：通过密度计量分析对ApoER2或VLDLR表达进行定量。附图24E-24F：实时PCR的柱状图数据表明ApoER2或VLDLR已经成功的在mRNA水平上被抑制。mRNA的相对表达量用GAPDH作为内部对照进行归一化。柱状图代表平均值±标准差，n＝3。*代表相比对照组P<0.05；**代表相比对照组P<0.01；#代表相比含Pi组P<0.05；##代表相比含Pi组P<0.01。

附图25A-25B-对ApoER2或VLDLR基因的抑制消除了Apo J对钙化过程的抑制。对受体抑制的VSMC细胞在含Pi，添加或不添加Apo J(6μg/ml)的处理后，进行茜素红染色(25A)和钙测定(25B)。比例尺为200μm。柱状图代表平均值±标准差，n＝3。**代表相比对照组P<0.01；##代表相比含Pi组P<0.01。

附图26A-26G-ApoER2基因抑制消除了Apo J对钙化标记和平滑肌特异性标记的影响。ApoE-/-鼠的VSMC细胞用Pi和Apo J(6μg/ml)进行处理。附图26A：ApoER2抑制细胞的SM22α和Runx2蛋白表达量，通过蛋白质印记分析进行检测。以GAPDH作为内参照。附图26A-C：采用密度计量分析来对ApoER2抑制细胞的SM22α和Runx2蛋白进行定量。附图26D-G：实时PCR的柱状图数据反映了Runx2、BMP-2、ALP和OPN的mRNA表达。mRNA的相对表达量通过内参照GAPDH进行归一化。柱状图代表平均值±标准差，n＝3。+表示阴性对照shRNA转染细胞相对ApoER2shRNA转染细胞，P<0.05；++表示阴性对照shRNA转染细胞相对ApoER2shRNA转染细胞，P<0.01；*代表相比对照组P<0.05；**代表相比对照组P<0.01；#代表相比含Pi组P<0.05；##代表相比含Pi组P<0.01。

附图27A-27G-VLDLR基因抑制消除了Apo J对钙化标记和平滑肌特异性标记的影响。ApoE-/-鼠的VSMC细胞用Pi和Apo J(6μg/ml)进行处理。附图27A：VLDLR抑制细胞的SM22α和Runx2蛋白表达量，通过蛋白质印记分析进行检测。以GAPDH作为内参照。附图27B-C：采用密度计量分析来对VLDLR抑制细胞的SM22α和Runx2蛋白进行定量。附图27D-G：实时PCR的柱状图数据反应了Runx2、BMP-2、ALP和OPN的mRNA表达。柱状图代表平均值±标准差，n＝3。+表示阴性对照shRNA转染细胞相对ApoER2shRNA转染细胞，P<0.05；++表示阴性对照shRNA转染细胞相对ApoER2shRNA转染细胞，P<0.01；*代表相比对照组P<0.05；**代表相比对照组P<0.01；#代表相比含Pi组P<0.05；##代表相比含Pi组P<0.01。

附图28a-28d示出：ApoJ突变体通过竞争性抑制猪血中纤维蛋白原的转化发挥抗凝血作用，所述的Apo J突变体包含带有凝血酶特异性酶切割位点的肽。(A)为含有Apo J突变体的猪血，(B)为不含Apo J突变体的猪血。取成熟猪的血液(0.3ml)，稀释至不同浓度(0、1/2/、1/4的比例溶于PBS中)，并与重组Apo J突变体混合，使其浓度为10或10mg/ml，在37℃下孵育，并做血栓弹力图(Rotational thromboelastometry)(ROTEM^TM)。图a，凝血时间，图b，α角凝固速度，图c，最大凝块硬度，图d，10分钟时最大凝块硬度。数据为Apo J突变体，Clusterin-ΔTMD-TRHis(SEQ ID NO:8)两次独立实验的平均值。

具体实施方式

丛生蛋白是一种多功能蛋白，它在哺乳动物体内，具有调控多种细胞存活、增殖、分化的重要作用。本发明公开了重组丛生蛋白多肽并验证了所述重组多肽的疗效。特别的，本发明提供的数据证明了所述重组丛生蛋白可以被高效地合成和纯化，且具有很好的稳定性。所述重组多肽在动物体内基本上是无毒的。然而，在鼠心血管疾病模型中，丛生蛋白多肽能够减轻心血管疾病的症状，如高血糖症、高血压、钙化等，并能使血清的脂质水平趋于正常。这些数据表明，所述实施方式中的重组丛生蛋白多肽(或者能够表达该多肽的细胞和编码该多肽的核酸)可以安全并有效地用于治疗和预防心血管系统疾病和酒精中毒。

I.重组丛生蛋白多肽

为了披露本发明，所述“丛生蛋白”或“重组丛生蛋白”代表基于哺乳动物丛生蛋白序列的蛋白质。在一个优选的方面，重组丛生蛋白多肽包含了删除核定位信号及跨膜结构域，和/或融合了一段异源的多肽序列(例如，一个纯化标签)。本领域技术人员可以理解，对丛生蛋白跨膜结构域的删除可以破坏重组丛生蛋白定位于内质网的过程。所述“Apo J”与“丛生蛋白”代表相同的含义。所述的丛生蛋白多肽，包括但不限于NCBI Acc.No.NM_203339、NM_001831、NM_013492、NM_053021、NM_012679，且以引用的方式并入本申请中。在某些方面，重组丛生蛋白大约或至少有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列与丛生蛋白多肽SEQ ID NOs:1-3一致。例如，在一些方面，所述重组丛生蛋白多肽大约或至少有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列与丛生蛋白多肽序列SEQ ID NOs:1一致，且删除核定位信号，包含内质网定位序列和/或跨膜结构域。在另一方面，所述重组丛生蛋白大约或至少有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列与丛生蛋白多肽序列SEQ ID NOs:4-15一致。

丛生蛋白多肽及其片段、突变体、截短片段或删除片段和/或丛生蛋白融合蛋白可以用于多种用途，包括但不限于，促进抗体的生成、诊断用试剂、作为用于鉴定与丛生蛋白调节失调相关的其他细胞基因产物试剂、作为用于筛选治疗丛生蛋白调节失调的化合物的试剂、作为一种可以用于治疗与丛生蛋白相关失调的药物试剂。

本发明的实施方式还包括与所述核苷酸序列编码的丛生蛋白功能相当的蛋白质，所述功能通过一些标准来判定，所述标准包括但不限于，引起丛生蛋白的生物学效应、当丛生蛋白等效物存在于特定细胞时产生的表现型变化情况。所述功能性丛生蛋白等效物包括但不限于，所述丛生蛋白核苷酸序列编码的氨基酸序列中某些氨基酸残基的添加或替代，但是此种序列上的变化对蛋白功能不产生影响，从而生成一种功能等效的基因产物。

在另一方面，丛生蛋白多肽可以在保持其生物学的活性的同时，进一步通过一个或多个氨基酸的替换进行改造。例如，氨基酸的替换可以在一个或多个位点进行，替换的氨基酸与被替换氨基酸具有相似的亲水性。亲水氨基酸指数对蛋白质相互作用的生物功能的重要性是本领域所公知的(Kyte and Doolittle，1982)。众所周知，氨基酸的相对亲水性质会影响所获蛋白质的二级结构，而所获蛋白质的二级结构决定着该蛋白质与其他分子的相互作用，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。因此，上述保守的替换方式可以被用在GrB中，并对其活性不会产生明显影响。在美国专利4554101的描述中，给出了下述氨基酸残基的亲水性数值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。上述数据可以作为参考，当替换前后的氨基酸亲水值之差在±2时为优选的替换，当替换前后的氨基酸亲水值之差在±1时为更优选的替换，当替换前后的氨基酸亲水值之差在±0.5时为最优选的替换。因此，本文所述的任一种GrB多肽均可以通过用相似亲水值的氨基酸进行替换来进行改造。氨基酸的亲水性在±1.0或±0.5以内可以被认为是同源的。进一步地，我们可以预见到，丛生蛋白序列可以在维持其生物学活性的前提下，通过氨基酸的删除、替换、添加或插入而被改性。

在某些方面，丛生蛋白多肽可以与一个异源多肽序列进行融合。例如，异源多肽序列可以用于促进细胞靶向产物的辅助合成和纯化。本发明提供几段可以与丛生蛋白相连接的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括但不限于，纯化标签(例如，a T7、MBP、GST、HA、或polyHis标签)，蛋白酶酶切位点，如凝血酶或弗林蛋白酶(Furin)酶切位点，细胞内定位信号或分泌信号。在某些方面，所述丛生蛋白还可以包含一段细胞穿透肽(CPP)。本文所述的CPP和膜转运肽(MTP)意义相同，代表一段可以加强蛋白进入细胞能力的肽序列。根据本文的实施方式，所述CPP可以是但不限于，来源于HIV Tat蛋白的肽片段、疱疹病毒VP22、果蝇触角同源盒基因产物、Protegrin I、以及T1、T2、或INF7肽。

上文所述的编码序列的其他突变方式可以被用来构建更适合于宿主细胞表达或工艺放大的多肽。例如，每个氨基酸对应的密码子可以通过优化，来适应宿主细胞翻译装置的使用偏好，或者转录出一段具有更长半衰期的信使RNA分子。将核苷酸序列进行优化来适应密码子的使用偏好，或者使信使RNA稳定性更强，均可以使用本领域的熟知技术。这些资料可以通过如下方式获取，例如，通过使用电脑程序，通过含有密码子使用和信使RNA稳定性的研究数据的综述文章，或通过其他本领域的熟知方法获得。

由丛生蛋白的一段或多段组成的多肽、序列被截断或删除的丛生蛋白、或由全部丛生蛋白或部分截断丛生蛋白与某一不相关蛋白相融合形成的融合蛋白，均属于本发明所保护的范围，且可以基于上文所述的编码丛生蛋白的核苷酸序列或丛生蛋白的氨基酸序列进行设计。上述融合蛋白包含但不限于IgFc融合蛋白，所述IgFc融合蛋白可以使丛生蛋白多肽更加稳定，延长其在体内和体外的半衰期；或与氨基酸序列融合后可以锚定在细胞膜上的蛋白；或与酶、荧光蛋白、发光蛋白等可以提供标记功能的蛋白进行融合。

此外，丛生蛋白基因可以被亚克隆到重组质粒上，从而使所述基因的开放读码框可翻译地与包含多个(约为6个)组氨酸残基的氨基末端标签相融合。从感染或转染了上述质粒的细胞中获得的抽提物，被装载入Ni²⁺次氮基二乙酸琼脂糖柱后，通过含有咪唑的缓冲液将带有组氨酸标签的蛋白选择性的洗脱下来。

虽然丛生蛋白多肽可以通过化学合成的方法获得(如，Creighton，1983所提及的方法)，但是采用重组DNA技术生产来源于丛生蛋白的大分子多肽和标准长度丛生蛋白则更加简便，该重组DNA技术为本领域熟知的核酸表达方法。上述方法可以用来构建含丛生蛋白核苷酸序列及适当转录和翻译控制信号的表达载体。所述方法包括，如体外重组DNA技术，合成技术，以及机体内的基因重组技术。上述技术记载在Sambrook et al.，1989，supra和Ausubel et al.，1989，supra等文献中。或者，编码丛生蛋白核苷酸序列信息的RNA可以通过RNA合成仪等方法进行化学合成。上述技术记载在如“Oligonucleotide Synthesis”，1984，Gait，M.J.，ed.，IRL Press，Oxford的文献中，且其全文以引用的方式并入本申请。

可以应用多种宿主表达载体系统表达本发明的实施方式所述的丛生蛋白核苷酸序列。当丛生蛋白多肽为一种可溶性的衍生物(如，删除跨膜结构域)时，所述多肽可以从培养过程中获得，如，从不分泌丛生蛋白多肽的宿主细胞中，或从分泌丛生蛋白多肽的细胞培养基中获得。进一步，所述表达系统同样可以包含工程宿主细胞，所述宿主细胞可以原位表达丛生蛋白或其等效物，如锚定在细胞膜上。从所述表达系统中纯化或富集丛生蛋白可以通过使用适当的洗涤剂或脂质胶束，或本领域熟知的方法来完成。进一步，当不仅要保持丛生蛋白的结构和功能特性，还要对其生物学活性进行评价时，如药物筛选实验，可以使用上述的工程宿主细胞。

为了长期和高效的生产重组蛋白，优选的是进行稳定的表达。例如，构建出能够稳定表达丛生蛋白序列的细胞系，如上述的SEQ ID NOs:4-15及后文的实施例。与使用含病毒复制起始位点的表达载体相比，使用由适当表达控制元件(如启动子、增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的DNA片段转化宿主细胞是更为优选的方案。引入外源DNA后，工程细胞先在富集培养基生长1-2天，然后转移到选择培养基中。重组质粒中的选择标记赋予细胞对选择条件的抗性，并能使细胞将质粒整合到染色体中，生长并形成集落，从而可以被克隆并扩增为细胞系。该方法便于用来构建能够表达丛生蛋白基因产物的细胞系。上述工程细胞系可以用于筛选和评价对丛生蛋白基因产物内源活性造成影响的化合物。大量选择系统可以被应用于上述功能，所述选择系统包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，et al.，1977)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski，1962)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy，et al.，1980)基因分别进入胸腺激酶缺陷型(tk-)，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型(hgprt-)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt-)细胞中。同时，抗代谢物抗性可以用于筛选下列基因：dhfr，提供对甲氨蝶呤的抗性(Wigler，et al.，1980；O'Hare，et al.，1981)；gpt，提供对麦考酚酸的抗性(Mulligan&Berg，1981)；neo，提供对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin，et al.，1981)；hygro，提供对潮霉素的抗性(Santerre，et al.，1984)。

可被用于实现本发明实施例目的的表达系统包括但不限于，用含有丛生蛋白核苷酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的微生物，比如细菌(例如，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌)；用含有丛生蛋白核苷酸序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用含有丛生蛋白序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)转染的昆虫细胞系统；用含有丛生蛋白核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染的植物细胞系统或用含有丛生蛋白核苷酸序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或含有重组表达载体的哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BHK，293，3T3)，所述载体包含有来源于哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子。

在细菌系统中，可以选择多种表达载体以实现表达丛生蛋白基因产物的目的。例如，当需要产出大量蛋白，以用于制备丛生蛋白的药物组合物或者为了提高丛生蛋白的抗体含量时，那么制备能够直接高水平表达、易于纯化的融合蛋白的载体是理想的选择，所述载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，1983)，丛生蛋白编码序列可独立的连接到该载体lac Z编码区域的可读框中，从而使融合蛋白可以被表达；pIN载体(Inouye&Inouye，1985；Van Heeke&Schuster，1989)等。pGEX载体还可以被用来表达融合蛋白，所述融合蛋白可以包含外源多肽及谷胱苷肽S-转移酶(GST)。大体上，所述融合蛋白是可溶性的，可以很容易的从被裂解的细胞中纯化出来，该纯化过程通过将蛋白吸附在谷胱甘肽-琼脂糖微球上，再用谷胱甘肽洗脱得到。pGEX载体设有凝血酶或Xa因子蛋白酶酶切位点，从而使目标基因产物可以与GST部分分离。

在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)被作为一个用于表达外源序列的载体。该病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。丛生蛋白基因编码序列可以被单独克隆在病毒的非必需区域(如多角体蛋白基因)，并设置在可以被AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)调控的区域。丛生蛋白编码序列的成功插入会导致多角体蛋白基因的失活，并形成非包涵体重组病毒(例如，缺失多角体蛋白基因形成的没有蛋白质类外壳的病毒)。所述的重组病毒随后用于感染草地贪夜蛾细胞，来表达插入的多聚核苷酸(例如，详见Smith et al.，1983和申请号为No.4，215，051的美国专利)。

在哺乳动物宿主细胞中，许多基于病毒的表达系统均可以被应用。当腺病毒作为表达载体时，目的丛生蛋白核苷酸序列可以绑定到腺病毒转录/翻译的控制组件上，例如晚期启动子和三联前导序列。上述嵌合基因可以通过体内或体外重组插入到腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)会获得可以并能够在被感染宿主中表达丛生蛋白基因产物的重组病毒(例如，参见文献Logan&Shenk，1984)。特定的起始信号对于高效翻译插入的丛生蛋白核苷酸序列同样十分重要。所述信号包含ATG起始密码子及其相邻的序列。当包含自身起始密码子及其相邻的序列的丛生蛋白基因或cDNA，被插入到适当的表达载体中，则不需要额外的翻译控制信号。然而，当只有一部分丛生蛋白编码序列被插入时，包括如ATG起始密码子的外源的翻译控制信号是必需的。进一步地，起始密码子必须与目的编码序列的读码框同相，以保证整条插入序列能够被完整翻译。这些外源的翻译控制信号及起始密码子可以有多种来源，如野生型或合成型。表达效率可以通过适当的转录增强元件或转录终止子等提高(详见Bitter，et al.,1987)。

在酵母中，含有组成型或诱导型启动子的多种载体可以被使用。其相关内容，可以参见Current Protocols in Molecular Biology，1988；Grant，et al.，1987；Wu&Grossman，1987；Bitter，1987；和“The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces”，1982。

当使用植物表达载体时，编码序列的表达可以用多种启动子中的任意一种来驱动。例如，可以使用病毒启动子如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson et al.，1984)，或TMV的壳体蛋白启动子(Takamatsu et al.，1987)；或者，植物启动子如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RUBISCO)的小亚基启动子(Coruzzi et al.，1984；Broglie et al.，1984)；或者可以使用热休克启动子如大豆的hsp17.5-E或hsp17.3-B启动子(Gurley etal.，1986)。这些结构可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA导入、微注射、电穿孔等方法被引入到植物细胞内。对于上述技术的综述文章，可以详见如Methods forPlant Molecular Biology 1988；和Grierson&Corey，1988。

当腺病毒被用作表达载体时，目的核苷酸序列可以被绑定到腺病毒转录/翻译控制组件上，如晚期启动子和三联前导序列。所述的嵌合基因可以通过体内或体外重组插入到腺病毒基因组内。插入到病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)会获得可以并能够在被感染宿主中表达丛生蛋白基因产物的重组病毒获(例如，参见文献Logan&Shenk，1984)。如上所述的特定起始信号对于高效翻译插入的目的核苷酸序列同样十分重要。

此外，应选择能够调控插入序列的表达，或定向修饰和处理基因产物的宿主细胞株。所述对蛋白产物进行的修饰(如糖基化)和处理(如酶切)会对蛋白的功能起到非常关键的作用。不同的宿主细胞对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有各自独特和特定的机制。因此，应选择适宜的细胞系或宿主系统以确保对表达的外源蛋白进行正确的修饰和处理。为此，应选择那些具有适当细胞机器(Cellular machinery)的真核宿主细胞，该细胞机器应可以正确地处理基因产物初级转录本、糖基化、磷酸化等过程。所述的哺乳动物宿主细胞包括但不限于，CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和U937细胞。II.治疗制剂及给药

患者可以通过施用有效治疗剂量的包含丛生蛋白多肽和/或编码丛生蛋白多肽的核酸(如SEQ ID NOs:4-15)的药物制剂来治疗或改善如下症状，所述症状包含但不限于心血管疾病如高血压、高血脂、高胆固醇血症、高血糖、高血压、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化伴随的缺血性心力衰竭、狭窄症、心血管组织钙化、中风、心机梗塞、脑梗塞。在某些方面，所述心血管系统疾病为高血脂、高胆固醇血症或动脉粥样硬化。在另一方面，所述心血管系统疾病为糖尿病。在各个方面，丛生蛋白组合物的有效剂量可以为降低血液胆固醇、降低血糖、降低血甘油三酯、加速胞内胆固醇外排、和/或增加血管或心肌细胞存活的剂量。在某些方面，有效剂量的丛生蛋白组合物可以增强或促进在细胞毒因子或细胞生长抑制因子存在下，细胞的存活或生长能力，所述细胞毒因子或细胞生长抑制因子包括但不限于氧化型胆固醇、氧化脂蛋白、促炎细胞因子等由酒精中毒诱导的因子。在另一方面，治疗的有效剂量为足以改善或减缓患有急性血管综合症的哺乳动物的疾病症状或病情发展，足以预防和治疗包括瓣膜组织的心血管组织的退化、狭窄和钙化的施用药量。在另一方面，丛生蛋白衍生多肽与野生型丛生蛋白一样，可用于治疗和预防雄性不育，如促进精细胞的成熟和发育。

所述丛生蛋白衍生物组合物的毒性及治疗效力可以通过细胞培养或动物实验等标准药物流程来评价，如评价LD₅₀(50％致死率的剂量)和ED₅₀(50％有效率的剂量)。毒性和治疗效力的剂量之比为治疗指数，该治疗指数可以用LD₅₀/ED₅₀来表示。具有高治疗指数的组合物为优选的方案。由于组合物在使用时会有毒副作用，因此治疗时应设计一个传送系统，将组合物定位到被感染的组织，从而减小会对未感染细胞造成的潜在损伤，从而减小副作用。

根据细胞培养实验及动物实验的数据可以制定人用药的剂量范围。组合物的剂量优选在一个包含ED₅₀的循环浓度范围内，并具有很小的或没有毒性。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和使用的给药途径。对于在实施方式的方法中使用的任何组合物，可以最初从细胞培养实验中估算治疗有效剂量。可以在动物模型中推算剂量以获得循环血浆浓度范围，该浓度范围包括在细胞培养中测定的IC₅₀(例如，即被测化合物浓度达到抑制症状的半量浓度)。这些信息可用于更精确地确定人体中的可用剂量。血浆中的药物含量可以通过如高效液相色谱来测量。

当考虑到对疾病的治疗时，也可以使用动物实验来确定合适的剂量，以确定测试对象对该生物活性剂的每千克重量最大耐受剂量或MTD。一般来说，至少一种被检测的动物应是哺乳动物。本领域技术人员可以按常规的方法推断对包括人在内的其它物种有效且无毒的剂量。在进行人体药效学研究之前，正常受试者的I期临床研究有助于安全剂量的确定。

另外，生物活性制剂(例如，丛生蛋白多肽)可以与各种熟知的化合物或结构进行组合，例如，所述化合物或结构可以增强生物活性剂的稳定性，或以其它方式增强其药理学性质(例如，增加体内的半衰期，降低毒性等)。

根据本实施方式使用的药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。

上述治疗药物可通过本领域普通技术人员已知的任何方法施用，包括但不限于，通过吸入、皮下(Sub-q)、静脉内(I.V.)、腹膜内(I.P.)、肌内(I.M.)或鞘内注射等方法施用；或作为局部施用的药剂(透皮剂，软膏，霜剂，药膏，滴眼剂等)。因此，可以通过吸入或喷入(通过口或鼻)或口服，口腔，肠胃外或直肠给药来配制并施用组合物。

对于口服给药，药物组合物可以采取例如通过常规方法制备的片剂或胶囊剂的形式，其具有药学上可接受的赋形剂，例如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁，滑石或二氧化硅)；崩解剂(如马铃薯淀粉或羧甲基淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法进行包衣。用于口服给药的液体制剂可以采取例如溶液，糖浆或悬浮液的形式，或者它们可以是干燥产品的形式，在使用前用水或其它合适的溶媒配制成为可施用的制剂。这种液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的添加剂如悬浮剂(例如山梨醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏仁油，油性酯，乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)等制备。制剂还可以含有适当的缓冲盐，矫味剂，着色剂和甜味剂。用于口服给药的制剂可以适当地配制以对活性组合物进行控释。

对于口腔给药，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于通过吸入给药，根据实施方式中所述的组合物，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体，通过加压包装或喷雾器，以气雾剂喷雾的形式方便地递送。在加压气雾剂中，剂量单位可以通过设置一个阀来确定，所述的阀可以递送定量的计量。用于吸入器或吹入器的采用明胶制备的胶囊和药筒，按处方配置可含有化合物的粉末混合物以及含有合适的粉末基质，如乳糖或淀粉。

所述组合物可以配制成肠胃外给药的形式，通过如推注或连续输液等注射形式进行给药。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在安瓿或多剂量容器中，加入防腐剂。组合物可以采取在油性或水性载体中的悬浮液，溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用之前用合适的载体例如无菌无热原的水来配制成为可施用的制剂。

还可以将组合物配制成用于直肠给药的制剂如栓剂或保留灌肠剂，且含有如可可脂或其它甘油酯的常规栓剂基质。

除了前述制剂之外，所述化合物还可以配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌内注射施用。因此，例如，所述化合物可以用合适的聚合物或疏水材料(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，或作为微溶衍生物，例如作为微溶盐形式，进行配制。如果需要，组合物可以配制于包装或分配器装置中，所述包装或分配器装置中可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂量(Unit dosage form)。举例来说，包装可以包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有用于给药的说明书。

III.实施例

引入以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术为发明人发现的在本发明的实践中效果良好的方案，因此可被认为是实践中的优选实施例。然而，根据本文的公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施例中进行诸多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。

实施例1-一般方法及结果

野生和重组丛生蛋白类似物的制备。为了用丛生蛋白处理干细胞，制备了两种类型的丛生蛋白。野生丛生蛋白(NCBI Accession No.NM_0134921，通过引用形式并入本文)，和使用抗丛生蛋白抗体进行亲和层析从血浆中制备丛生蛋白。此外，构建一种质粒，在所述质粒中，将小鼠或人丛生蛋白cDNA与组氨酸标签融合并插入能在哺乳动物(例如，人类细胞)或非哺乳动物(例如细菌)细胞中激活的启动子。具有丛生蛋白cDNA-His插入片段的质粒pCluAg的示意图显示于图1中。通过使用TOPO质粒(Invitrogen)插入丛生蛋白-TR/EK-His cDNA构建pCluAg。对通过转染的哺乳动物细胞(例如人293细胞)或细菌细胞(E.coli)制备的重组丛生蛋白进行纯化。不同丛生蛋白类似物cDNA通过RT-PCR获得，并对不同丛生蛋白类似物多肽序列进行序列预测(图2A-D和表1)。

表1.序列信息

序列信息：	SEQ ID NO:
		CluAg-a(recombinant Clusterin)	1
CluAg-b(recombinant Clusterin-△TMD)	2
		CluAg-c(recombinant Clusterin-△TMD-△NLS)	3
CluAg-Ia(HisTR-Clusterin)	4
		CluAg-Ib(HisTR-Clusterin-△TMD)	5
CluAg-Ic(HisTR-Clusterin-△TMD-△NLS)	6
		CluAg-IIa(Clusterin-TR-His)	7
CluAg-IIb(Clusterin-TR-His-△TMD)	8
		CluAg-IIc(Clusterin-TR-His-△TMD-△NLS)	9
CluAg-IIIa(HisEK-Clusterin)	10
		CluAg-IIIb(HisEK-Clusterin-△TMD)	11
CluAg-IIIc(HisEK-Clusterin-△TMD-△NLS)	12
		CluAg-IVa(HisEK-Clusterin)	13
CluAg-IVb(HisEK-Clusterin-△TMD)	14
		CluAg-IVc(HisEK-Clusterin-△TMD-△NLS)	15

重组丛生蛋白类似物蛋白质性质的分析。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组丛生蛋白类似物的纯度。从pCluAg转染的细胞中分离出丛生蛋白类似物蛋白，储存在溶液或干粉中，并上样到SDS-PAGE。电泳后，将蛋白质电转移到PVDF膜上，并用抗丛生蛋白抗体进行检测。通过使用化学发光试剂盒对该膜进行显色。由考马斯蓝染料G250染色的SDS-PAGE中可以观察到单一条带的丛生蛋白类似物CluAg-I(图3)，并通过用抗Clu抗体进行免疫印迹分析验证(图4)。此外，通过离子交换层析检测类似物，显示了很清晰的丛生蛋白类似物洗脱峰(图5)。

小鼠HDL组分中的丛生蛋白类似物。载脂蛋白E缺乏型(ApoE^-/-)小鼠是广泛使用的用于动脉粥样硬化研究的鼠模型。采用apo AI单克隆抗体和丛生蛋白的免疫沉淀法来评估血液中与Apo AI结合的丛生蛋白的水平。在注射CluAg的小鼠血浆中，Apo AI抗体与Apo AI和CluAg产生共沉淀，表明Apo AI与CluAg相结合(图6)。为了进一步证实CluAg的存在并将其与野生丛生蛋白进行比较，将CluAg加入到SMC培养基中，并在oxLDL存在下用含有野生型丛生蛋白的5％血清孵育2天。将培养基的上清液在CluAg中进行多聚组氨酸标签的分析。在具有或不具有oxLDL的培养基中，CluAg显然没有携带多聚组氨酸标签(图7)，而CluAg在无细胞培养物中含有多聚组氨酸标签(图7)。

丛生蛋白类似物在培养中对血管细胞增殖的调控。首先使用体外系统来检测丛生蛋白类似物对血管细胞存活和生长的保护作用。在具有或不具有氧化LDL的培养基中，用不同浓度的丛生蛋白类似物处理细胞。在刺激2-4天后，使用如下所述的包括流式细胞技术，荧光显微镜和放射性同位素标记的技术组合来检查细胞存活和增殖。使用其他类型的蛋白质如牛血清白蛋白建立对照实验。图8和9显示存在或不存在oxLDL(50μg/ml)的情况下用或不用CluAg(1-6μg/ml)处理后，SMC的生长曲线。即使暴露在oxLDL的条件下，用上述类似物处理后也能够增加SMC的增殖。即使在oxLDL存在下，CluAg也可以剂量依赖性地增加SMC的增殖(图8和图9)。

对野生型和动脉粥样硬化倾向的小鼠注射丛生蛋白后，对其血脂、胆固醇、葡萄糖和甘油三酯进行分析。对野生型和apoE缺失型小鼠中每周注射CluAg(30-40μg)，持续三个月。在尾部DNA取样时，从注射CluAg的小鼠中收集血样。从血液样品中制备血清。分别测定胆固醇水平，脂蛋白图谱和丛生蛋白浓度。简而言之，用PBS稀释的血清在包覆兔丛生蛋白多克隆抗体的96孔板中孵育。在孵育和用PBS洗涤后，通过与小鼠丛生蛋白单克隆抗体孵育来检测结合的丛生蛋白。使用与过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG作为第二抗体。胆固醇和HDL在药物实验室部门的实验室中进行测定。丛生蛋白与HDL的比例经脂质含量归一化计算得到。除ELISA之外，可以进行免疫印迹分析测定以验证结果。CluAg注射显著降低apoE缺失型小鼠血液中总胆固醇、葡萄糖、甘油三酯和LDL的水平，但在野生型小鼠中没有发现变化(图10)。

血压分析。使用尾套法对尾动脉进行血压测量。每次测量重复3次以确保重现性。每周注射CluAg(30-40μg)持续3个月，导致apoE缺失型小鼠(图11，左图)收缩期和舒张期的尾动脉血压降低，但在野生型小鼠中未发现血压变化(图11，右图)。

对用CluAg注射的小鼠进行超声心动图检测。每周注射CluAg后，使用超声心动图监测形态和功能变化。注射后1周，6周，10周和18周，进行B模式和M模式超声心动图检查。由于小鼠的心脏很小，超声心动图研究实际上采用超声检查进行。用氯胺酮和赛拉嗪麻醉小鼠，剃掉胸部毛发，并将一层超声耦合凝胶涂布在胸部。使用加温的盐水袋平衡调节剂(asa standoff)应用动态聚焦的9MHz阵列换能器(Annual array transducer)。所有超声研究都是使用最先进的超声心动仪(HP Model Sonos 5500HP)进行的。通过胸骨旁短轴舒张和收缩容积的面积测量确定面积分数。由两个对所研究动物单盲的独立的观察者采用M模式测量三次以上心跳的左心室舒张末期径和收缩末期径。LVEF(左室射血分数)计算公式如下：LVEF＝[(LVIDd)-(LVIDs)]/(LVIDd)，LVIDd：左心室舒张末期内径；LVIDs：左心室收缩末期直径。图12显示了在2D和M模式中有或没有CluAg注射的鼠心脏的超声图像。图13表明，每周施用CluAg(30-40μg/小鼠)增加ApoE-/-动脉粥样硬化倾向小鼠心脏中的射血分数，但相同CluAg剂量下，野生型小鼠则没有发生变化。

主动脉壁的油红O染色。在CluAg处理3个月后处死小鼠。将主动脉跨长轴切开，固定在10％缓冲福尔马林中进行组织学评价。主动脉用油红O溶液染色以评估中性脂质含量。在野生型小鼠的主动脉中检测到少量染色。然而，与野生型小鼠主动脉相比，ApoE缺失型小鼠的主动脉油红O染色非常密集，从而使动脉粥样硬化斑块肉眼可见。在注射了CluAg蛋白后，ApoE缺失型小鼠中油红O染色减少(图14)。

主动脉组织和细胞钙化的分析。在磷酸钠(3.6mmol/L)存在下，将主动脉SMC与CluAg孵育6天。茜素红S(Sigma，St.Louis，MO，USA)染色评估在茜素红S染料与细胞层基质中Ca离子结合反应中发生的钙沉积。细胞用2％多聚甲醛固定，用1％茜素红S(pH 4.2)染色。在光学显微镜下拍摄培养板，并评估显示为红色的矿化结节(图15)。CluAg治疗显著降低SMC中的钙化。为了确定丛生蛋白受体是否介导了CluAg对SMCs磷酸化诱导的钙化的抑制作用，构建了两个已知的丛生蛋白受体ApoER2和VLDLR的snRNA，所述snRNA可以抑制ApoER2和VLDLR。在snRNA抑制受体的SMC中，CluAg的处理对所述SMC的钙化没有抑制作用(图15)。通过直接钙测定验证了该结果(图16A-C)。为了评估活体主动脉组织的钙化情况，在用CluAg注射的野生型和apoE-缺失型小鼠的主动脉中进行茜素红S染色。来自apoE-缺失型小鼠的主动脉切片显示动脉粥样硬化斑块的出现，但野生型对照小鼠未显示上述斑块。钙沉积在ApoE缺失型小鼠体内高度丰富。用CluAg处理可以减少ApoE缺失型小鼠的钙化(图18A-H)。

主动脉组织的免疫组化。为了评估CluAg注射是否改变主动脉组织中钙化调节蛋白如BMP-2的表达，将主动脉切片用抗BMP-2抗体染色。用罗丹明标记的第二抗体(Sigma，St.Louis，Mo.)进行BMP-2的免疫荧光反应。将载玻片装载在具有4'，6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Vector，Burlingame，Calif.)的Vectashield封片剂中，并在Olympus荧光显微镜下检查。在ApoE缺失型小鼠的主动脉中观察到强烈的BMP-2免疫荧光，但CluAg的注射降低了BMP-2的荧光强度。

实施例2-对活体内丛生蛋白的进一步分析

方法和材料

细胞培养。从5至6周龄的雄性ApoE-/-或野生型C57BL/6小鼠分离得到主动脉VSMC细胞。将细胞培养在Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)培养基中，添加含有100ng/mL青霉素和链霉素(Invitrogen)的10％胎牛血清(FBS)，在37℃、含5％二氧化碳的潮湿环境中培养。通过将NaH₂PO₄(pH调节至7.4)加入到5％FBS培养基中以获得最终浓度为3.6mM的无机磷酸盐，用以制备钙化介质。使用传代5-10代的VSMC细胞。Apo J培养基每2或3天需要更换，共培养9天。使用在含0.9mM磷酸盐的常规培养基中培养的细胞作为对照。

慢病毒感染与筛选。为了对VSMC细胞中的ApoER2或VLDLR基因表达体产生稳定(长期)抑制，用含有pLKO.1载体的慢病毒颗粒感染VSMC，所述pLKO.1载体含有能够表达shRNA的遗传信息，所述shRNA可抑制小鼠的ApoER2或VLDLR基因表达。该质粒还具有嘌呤霉素抗性基因，从而可以通过向培养基中加入嘌呤霉素来筛选稳定表达所需shRNA的细胞。在开始实验(滴定测定)之前，VSMC细胞的最佳嘌呤霉素浓度为1μg/ml。为了进行慢病毒感染，使用汇合度80％的细胞。将1.5ml含有病毒的新鲜培养基加入到细胞中。新鲜培养基在感染48小时后，每3天进行更换。为了筛选感染的细胞，在感染后48小时使用含有嘌呤霉素的筛选培养基进行培养。ApoER2和VLDLR基因表达的抑制体可在四次传代后获得，并通过蛋白质印记分析进行检测。用含有已被验证与已知哺乳动物基因不具有同源性的shRNA的pLKO.1载体感染的一组细胞进行平行试验。该组细胞用作以下实验的阴性对照。

钙测定。通过比色钙检测试剂盒(Abcam)测定VSMC细胞中的钙含量。用PBS洗涤细胞，然后采用0.6M HCl在37℃下孵育过夜，进行脱钙。使用光谱仪测量上清液中的钙含量。然后用0.1mol/L NaOH和0.1％SDS裂解细胞。用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific)测定蛋白质含量，并将钙含量归一化计算总蛋白质含量。

茜素红S染色。将细胞固定在2.5％戊二醛中，并在37℃下与2％茜素红S一起孵育15分钟。然后用PBS洗涤VSMC细胞三次。在显微镜下观察到通过红色染色显现的钙矿化。

实时RT-PCR。使用Trizol(Invitrogen)从VSMC细胞中提取总RNA。在20μL的混合体系中使用4μg总RNA在SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)仪器中合成cDNA。在ICYCLERIQTMthermocycler(Bio-Rad)中用IQTMSYBR Green Supermix(Bio-Rad)进行实时PCR扩增。使用以下引物组：ALP，5'-CACAATATCAAGGATATCGACGTGA-3'(正义链；SEQ ID NO：18)和5'-ACATCAGTTCTGTTCTTCGGGTACA-3'(反义链；SEQ ID NO：19)；BMP-2，5'-TTGTATGTGGACTTCAGTGATGTG-3'(正义链；SEQ ID NO：20)和5'-AGTTCAGGTGGTCAGCAAGG-3'(反义链；SEQ ID NO：21)；骨桥蛋白，5'-TGGCTATAGGATCTGGGTGC-3'(正义链；SEQ ID NO：22)和5'-ATTTGCTTTTGCCTGTTTGG-3'(反义链；SEQ ID NO：23)；Runx2,5'-TTACCTACACCCCGCCAGTC-3'(正义链；SEQ ID NO：24)和5'-TGCTGGTCTGGAAGGGTCC-3'(反义链；SEQ ID NO：25)。

蛋白质印记分析。使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)的RIPA缓冲液(Pierce)从VSMC细胞中分离蛋白质。将在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上，并使用标准操作进行蛋白质印记分析实验。用5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭膜，所述5％的牛血清白蛋白(BSA)用含有0.1％Tween-20的TBS(TBST)稀释得到。将第一抗体用3％BSA稀释[(山羊抗Apo J 1：1000(Santa CruzBiotechnology)，兔抗Runx2 1：1000(Cell Signaling)，山羊抗SM22α1：5000(Abcam)，兔抗-αSMA1：1600(Abcam)，兔抗GAPDH 1：30000(Abcam)]，并采用已用HRP标记过的第二抗体检测所述第一抗体[驴抗山羊1：5000(Santa Cruz Biotechnology)，山羊抗兔1：20000(Santa Cruz Biotechnology)]，所述第二抗体用含3％BSA的TBST进行稀释。

数据分析和统计。使用Scion Image(Scion Corp)通过光密度法分析蛋白质印记分析结果。使用

软件(Microsoft Corp)对实时聚合酶链式反应数据进行量化。将经至少三次测定的数据，以平均值±标准差的形式绘图。统计学分析(t检验和方差分析)使用Graphpad软件(Graphpad Software Inc)进行。P<0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

Apo J减弱ApoE-/-和野生型小鼠SMC中的钙化过程。由于ApoE-/-小鼠比野生型组更易发生血管钙化，因此检查ApoE-/-和野生型小鼠VSMC细胞对无机磷酸(Pi)的反应以及Apo J对这两组细胞钙化的影响。研究表明，当用Pi诱导时，ApoE-/-组VSMC细胞在处理后第6天比野生型组细胞显示出更高的钙化水平。在培养基中加入Apo J(6μg/mL)可同时降低两组的钙水平，其中对ApoE-/-组VSMC细胞的钙化具有更显著的抑制作用，具体见茜素S染色(图19A和20A)和钙测定实验(图19B和20B)。因此，使用ApoE-/型VSMC细胞进行了额外的实验。应用不同浓度的Apo J(3μg/ml，6μg/ml，9μg/ml和12μg/ml)来测试Apo J对血管细胞钙化的抑制作用是否具有剂量依赖性。数据表明，在培养中6μg/ml Apo J足以显著降低ApoE-/-型VSMC细胞中的钙沉积水平，而与9μg/ml组相比，12μg/mL组并不能进一步减弱钙化过程(图20B)，这可能是由于Apo J受体已经饱和。

Apo J在ApoE-/-型VSMC细胞钙化期间对成骨相关基因的调节。为了证实Apo J对钙化的影响，分别对在钙化过程中添加和未添加Apo J的ApoE-/-型VSMC细胞的骨形成调节因子Runx2及平滑肌谱系标记物SM22α和αSMA进行检测，其中，所述钙化过程为用Pi处理6天。应用浓度为3μg/ml至12μg/ml的Apo J。在实验终点，对等体积(40μl)的培养基用Apo J抗体进行免疫印迹实验，以验证培养基中Apo J蛋白的存在。数据表明，钙化细胞的mRNA和野生分泌型的Apo J水平均有增加(图21A和22A-B)；Apo J的添加导致通过Apo J抗体检测到更强的信号，表明培养基中的Apo J与对照组相比维持在一个有效水平，并且在实验期间不出现本体降解。研究发现在Pi存在下，Runx2会随之增加，但是这种增加在所有的Apo J处理组中会有减弱，6μg/ml的Apo J足以使Runx2蛋白表达量降到与未钙化细胞中大致相同的水平。在6μg/ml，9μg/ml和12μg/ml组之间没有观察到Runx2水平的显著差异(图21A-21B)。Pi组与对照组相比，SM22α和αSMA蛋白表达有所下调；Apo J仅在3μg/ml的浓度下，就可以使SM22α和αSMA降低的表达量有所恢复(图21A，21C和21D)。在钙化期间，包括Runx2，BMP-2，OPN和ALP在内的成骨基因的mRNA表达量增加，而Apo J可以减弱这种作用(图23A-23D)。

载脂蛋白E受体2(ApoER2)或极低密度脂蛋白受体(VLDLR)的抑制消除了Apo J对钙化的抑制作用。由于6μg/ml的Apo J已经显示出抑制钙矿化以及活化钙化相关基因的作用，因此后续实验中使用此浓度的Apo J处理VSMC细胞。ApoE-/-型VSMC细胞的Apo J受体ApoER2和VLDLR被慢病毒shRNA所抑制。通过蛋白质印记分析和qRT-PCR验证了抑制结果。数据表明，对VLDLR或ApoER2的抑制本身并不会改变在Pi影响下的钙化水平。阴性对照shRNA并没有改变钙化过程中VSMC细胞对Apo J的钙化敏感性，而阴性对照组经Apo J处理后钙含量仍然下降。相比之下，VLDLR或ApoER2的shRNA介导的对这些受体的抑制消除了Apo J对钙化的缓解影响，如茜素S和钙定量实验所示(图24A-24F)，表明Apo J通过ApoER2和VLDLR发挥功效，对钙化过程进行调节。

对ApoER2或VLDLR的抑制部分地消除了Apo J对钙化中成骨相关基因的影响。ApoER2或VLDLR的抑制减弱了Apo J对在钙化ApoE-/-型VSMC细胞中，Runx2蛋白质含量(图25A和26C)与mRNA含量(图27C)增强表达的负调控。尽管培养基中存在Apo J，但是在经Pi处理的ApoER2或VLDLR抑制细胞中，SM22α蛋白的表达依然下降(图25B和26D)。与未钙化对照组相比，ApoER2或VLDLR抑制细胞的成骨标志物碱性磷酸酶(ALP)，骨形态发生蛋白(BMP)-2和骨桥蛋白(OPN)保持着上调。Apo J处理组与未经Apo J处理组，在上述标志物的mRNA表达上没有显著的差异(图27D-27F)。这意味着ApoER2或VLDLR的抑制部分消除了Apo J对ApoE-/-型VSMC细胞在钙化中对成骨相关基因的影响。

通过研究以评估重组丛生蛋白对血液凝固的影响。具有包含凝血酶特异性酶酶切位点的肽的Apo J突变体(例如Clusterin-TRHis，Clusterin-△TMD-TRHis，Clusterin-△TMD-△NLS-TRHis，HisTR-Clusterin-△TMD-△NLS或HisTR-Clusterin-△TMD)通过竞争性抑制纤维蛋白原转化而发挥对含(A)或不含(B)ApoJ突变体猪血的抗凝血作用。取成熟猪的血液(0.3ml)，稀释至不同浓度(0、1/2、1/4的比例溶于PBS中)，与重组Apo J突变体(10或10mg/ml)混合，在37℃下孵育，然后进行血栓弹力测定(ROTEM^TM)。a，凝血时间；b，Alpha角凝血速度；c，最大凝块硬度；d，10分钟时最大凝块硬度。数据由Apo J突变体，Clusterin-△TMD-TRHis(SEQ ID NO：8)的两个独立实验的平均值来表示。因此，这些数据表明具有凝血酶酶切位点的重组丛生蛋白目标肽(Peptide target)，如Clusterin-TRHis，Clusterin-△TMD-TRHis，Clusterin-△TMD-△NLS-TRHis，HisTR-Clusterin-△TMD-△NLS或HisTR-Clusterin-△TMD可以通过有力地抑制纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而降低凝块硬度并增加血液的凝血时间，从而发挥抗凝作用。因此，重组丛生蛋白可以用作治疗患有心脏病患者的多功能试剂，例如心脏病伴有高胆固醇血症、高血压、高血糖症和血栓等。

***

根据本文所公开的方案，所有公开和提出的方法均可以在不进行过度实验的情况下完成和执行。虽然本文已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本发明的概念，精神和范围的情况下，对所述方法进行一系列的改进。更具体地，显而易见的是，化学和生理学性质相似的试剂可以替代本文所述的试剂，可以获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的是，上述所有类似的替代和修改均被认为落入在所附权利要求限定的本发明的精神，范围和概念内。

参考文献

以下参考文献，提供对本文所阐述内容的补充示例或其他细节的详细解释，通过引用方式并入本文。

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Claims (42)

1.一种重组多肽，包括丛生蛋白编码序列，所述编码序列与SEQ ID NO: 3一致，所述编码序列缺失核定位信号序列（LEEAKKKK; SEQ ID NO: 27），同时缺失跨膜结构域序列(LLLFVGLLL; SEQ ID NO:28)，所述重组多肽用于预防或治疗心血管疾病。

2.根据权利要求1所述的多肽，进一步包括与所述丛生蛋白编码序列融合的异源多肽序列。

3.根据权利要求2所述的多肽，所述异源多肽序列包含蛋白酶酶切位点。

4.根据权利要求3所述的多肽，所述蛋白酶酶切位点为凝血酶酶切位点。

5.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽是非糖基化的。

6.根据权利要求1所述的多肽，还含有标签序列。

7.根据权利要求6所述的多肽，在标签序列与丛生蛋白编码序列之间，包含有蛋白酶酶切位点。

8.根据权利要求7所述的多肽，所述的蛋白酶酶切位点为凝血酶或肠激酶酶切位点。

9.根据权利要求6所述的多肽，所述标签序列为多聚组氨酸标签。

10.根据权利要求6所述的多肽，所述标签序列位于丛生蛋白编码序列的N-端。

11.根据权利要求6所述的多肽，所述标签序列位于丛生蛋白编码序列的C-端。

12.一种组合物，包含权利要求1-11中任一项所述的多肽，及其药学上可接受的载体。

13.根据权利要求12所述的组合物，所述组合物被冷冻或冻干。

14.一种被分离的多聚核苷酸分子，包含编码如权利要求1-11中任一项所述的多肽的核酸序列。

15.根据权利要求14所述的多聚核苷酸分子，所述编码多肽的核酸序列可操作地连接在一个启动子上。

16.根据权利要求15所述的多聚核苷酸分子，所述启动子是在哺乳动物细胞内发挥功能的基因启动子。

17.根据权利要求16所述的多聚核苷酸分子， 所述多聚核苷酸分子是基因表达载体的一部分。

18.根据权利要求17所述的多聚核苷酸分子，所述表达载体为病毒表达载体。

19.一种宿主细胞，其包含编码如权利要求1-11中任一项所述的多肽的多聚核苷酸分子。

20.根据权利要求19所述的细胞，所述宿主细胞为细菌细胞。

21.根据权利要求19所述的细胞，所述宿主细胞为昆虫细胞。

22.根据权利要求19所述的细胞，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

23.根据权利要求22所述的细胞，所述细胞为多能细胞。

24.一种制备重组多肽的方法，包括：（a）表达编码如权利要求1-11任一项所述多肽的多聚核苷酸分子；（b）从细胞中纯化多肽。

25.根据权利要求24所述的方法，所述多肽包含一个纯化标签，纯化过程包含使用对所述纯化标签具有亲和力的基质。

26.根据权利要求25所述的方法，所述纯化标签为多聚组氨酸标签，纯化过程包含使用金属亲和层析柱进行多肽纯化。

27.根据权利要求25所述的方法，所述纯化标签还包含一个蛋白酶酶切位点，该蛋白酶酶切位点位于标签序列和丛生蛋白编码序列之间，纯化过程包含蛋白酶在酶切位点对多肽进行酶切。

28.一种用于治疗或预防受试者心血管疾病的组合物，所述组合物包含有效剂量的如权利要求1-11中任一项所述的多肽；如权利要求16-18中任一项所述的多聚核苷酸；或如权利要求22-23中任一项所述的细胞。

29.根据权利要求28所述的组合物，包含有效剂量的丛生蛋白多肽，所述丛生蛋白多肽与异源多肽序列融合。

30.根据权利要求28所述的组合物，包含有效剂量的编码丛生蛋白多肽的核酸表达载体，所述丛生蛋白多肽与异源多肽序列融合。

31.根据权利要求29或30所述的组合物，所述异源多肽序列包含一个蛋白酶酶切位点。

32.根据权利要求31所述的组合物，所述蛋白酶酶切位点为凝血酶酶切位点。

33.根据权利要求28所述的组合物，用于治疗患有心脏病的受试者。

34.根据权利要求33所述的组合物，所述受试者还患有高胆固醇血症、高血压、高血糖症和/或血栓。

35.根据权利要求28所述的组合物，所述心血管疾病是高血压、高血脂、高胆固醇血症、高血糖症、动脉粥样硬化和动脉粥样硬化伴随的缺血性心力衰竭、狭窄症、心血管组织钙化或中风。

36.根据权利要求28所述的组合物，所述心血管疾病为心肌梗塞和脑梗塞。

37.根据权利要求35所述的组合物，所述心血管疾病为高血脂或高胆固醇血症。

38.根据权利要求35所述的组合物，所述心血管疾病为动脉粥样硬化、血管钙化、瓣膜组织钙化或狭窄症。

39.根据权利要求28所述的组合物，所述心血管疾病为糖尿病、糖尿病血管并发症、血管炎症、血管细胞死亡或血管壁损伤。

40.根据权利要求28所述的组合物，所述的有效剂量是能够有效降低血液胆固醇、血糖、血液甘油三酯，增加细胞外排胆固醇和/或增加血管或心脏细胞存活的剂量。

41.一种用于治疗或预防受试者酒精中毒的组合物，所述组合物包含有效剂量的如权利要求1-11中任一项所述的多肽；如权利要求16-18中任一项所述的多聚核苷酸；或如权利要求22-23中任一项所述的细胞。

42.根据权利要求28-30、32-41中任一项所述的组合物，所述组合物通过静脉内注射、组织内注射和/或导管递送施用。

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