NO303735B1

NO303735B1 - Fremgangsmöte for fremstilling av en hirudinanalog, samt DNA-sekvens, sekresjonsvektor og transformerte mikroorganismer som inneholder vektoren

Info

Publication number: NO303735B1
Application number: NO922671A
Authority: NO
Inventors: Satoru Misawa; Hitoshi Matsuda; Yoshifumi Inoue; Hideyuki Furuya
Original assignee: Japan Energy Corp
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1992-07-07
Publication date: 1998-08-24
Also published as: NO922671D0; DE69121192T2; AU5470194A; ATE176500T1; DE69130872D1; ES2093717T3; US5516656A; FI107928B; DK0511393T3; FI922963A; EP0511393A1; AU8846691A; DK0687731T3; NO922671L; ATE140929T1; CA2072375C; US5573929A; CA2255396A1; DE69121192D1; NO982207D0

Description

Teknisk bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av en hirudinanalog, en DNA-sekvens som koder for hirudinanalogen, transformerte mikroorganismer og en sekresjonsvektor for fremstilling av hirudinanalog HV1C3.

Den nye hirudinanalog fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, er anvendbar som antikoagulant grunnet dens høyere antitrombinaktivitet og lavere tendens til å forårsake blødning, sammenlignet med kjent hirudin HVI.

Oppfinnelsens bakgrunn

Hirudin er en antikoagulasjonsfaktor som utskilles fra spyttkjertlene til blodigler, Hirudo medicinalis, og er en blanding av peptider som består av 65 og 66 aminosyrer. Struk-turen av hirudin ble bestemt av Dodt et al. [FEBS Lett. 165, 180 (1984)] som hirudin variant 1 (HVI). En annen variant, hirudin HV2, [Harvey et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 83,

1084 (1986)], har ni forskjellige aminosyrer sammenlignet med hirudin HVI, og ytterligere en variant, hirudin HV3, [Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 367, 803 (1986)] har ti forskjellige aminosyrer sammenlignet med HV2, med samme sekvens som HV2 opptil Ser32, og en innsatt aminosyre (Ala63) i det C-terminale område. Strukturene av disse tre hirudinvarianter er5vist i fig. 1.

Disse naturlig forekommende varianter omfatter 65 eller 66 aminosyrer, og to domener kan observeres. Disse er det sfærisk strukturerte, N-terminale område med tre disulfid-broer, og det sure, C-terminale område som viser homologi med o trombinkløyvingssetet i protrombinmolekylet, eller med kløyv-ingssetet i fibrinogen.

Oppfinnerne har oppdaget at HVI inneholder Leu<64->Gln65, mens HV3 inneholder Asp<65->Glu<66>i det C-terminale område.

En patentsøknad er blitt innlevert (japansk patentskrift nr.

s 3-164184 (1991)) som tar for seg syntesen av syntetiske gener for HVI og HV3 og deres ekspresjon i E. coli.

Hirudinvariantene HVI, HV2 og HV3 som alle har anti-trombotisk aktivitet, er ikke aksepterbare medikamenter for klinisk bruk grunnet deres alvorlige bivirkninger, som f.eks.

forlenget blødningstid.

En rekke systemer for fremstilling av hirudin ved genmanipuleringsteknologi er blitt foreslått, men en tilfreds-stillende fremgangsmåte er imidlertid ennå ikke blitt utvik-let. Fra et industrielt synspunkt er et ekstracellulært prod-uksjonssystem spesielt ønskelig da ekstracellulær utskillelse av det fremstilte protein vil gi fordeler ikke bare når det gjelder separering og rensing av produktet grunnet dets nærvær i aktiv form, men også fordi produktet vil være beskyttet for omsetning av intracellulære bakterieproteaser.

Fremgangsmåter som benytter Bacillus subtilis, gjær eller E. coli som verter, er blitt foreslått for fremstilling av hirudin ved utskillelse.

Fremgangsmåter som benytter Bacillus subtilis som vert, er ufordelaktige da plasmider generelt er ustabile i denne bakterie og de derfor ofte forsvinner fra bakterien, noe som gjør stabil proteinfremstilling vanskelig, og fordi pro-teinproduktene i mediet er utsatt for å omsettes av bakteriens egne proteaser som også utskilles i mediet. Fremgangsmåter foreslått for hirudinfremstilling (f .eks. japansk patentskrift nr. 2-35084 (1990)), har ikke løst slike problemer, og frem-stillingsutbyttet er bare tilnærmet 100 mg/l.

I fremgangsmåter som benytter gjær som vert, er det kjent at de C-terminale aminosyrer i produktene hydrolyseres av karboksypeptidase.

I en tidligere rapport (N. Riehl-Bellon et al., Bio-chemistry 1989, 28, 2941-2949) er sideprodukter hvor 1 eller 2 aminosyrerester er fjernet fra den C-terminale ende av HV2, beskrevet.

For å løse dette problem er en fremgangsmåte som benytter gjær med karboksypeptidasemangel (japansk patentskrift nr. 2-104279 (1990)) som vert, blitt foreslått, men dette har ikke ført til tilstrekkelig produktivitet.

Ved bruk av E. coli som vert er en fremgangsmåte som benytter signalsekvensen til alkalisk fosfatase, blitt beskrevet (J. Dodt et al., FEBS Lett. 202. 373-377 (1986)). Selv om dette er et sekresjonssystem, skilles produktet i det ves-entlige ut i periplasmarommet, noe som ikke er tilfredsstil-lende da det krevet oppbrytning av bakteriecellene ved et til- leggstrinn i utvinningsprosessen, f.eks. osmotisk sjokk, og produktutbyttet er så lavt som 4 mg/l.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnerne har fremstilt forskjellige hirudinanaloger basert på primærstrukturene til det foran nevnte hirudin HVI, HV2 og HV3, for å sammenligne deres egenskaper i dyre-modeller. De har funnet at en hirudinanalog (kimært hirudin) med hirudin HVl-aminosyresekvensen opptil den 52. aminosyre, fulgt av sekvensen til HV3, ikke bare viste høy antitrombinaktivitet, men også en redusert forlengelse av blødningstiden.

Foreliggende oppfinnelse gjelder således en fremgangsmåte for fremstilling av en ny hirudinanalog, kjennetegnet ved at den omfatter dyrkning av den transformerte mikroorganisme erholdt ved å transformere E.coli med en ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for polypeptidet med aminosyresekvensen som er vist i formel 1 nedenfor

slik at dette uttrykkes, og utvinning av hirudinanalogen fra dyrkningsmediet.

Foreliggende oppfinnelse gjelder videre en DNA-sekvens som koder for aminosyresekvensen til hirudinanalogen med den foran nevnte, høye antitrombinaktivitet og lave blødnings- tendens, transformerte mikroorganismer som er kjennetegnet ved at de er erholdt ved transformasjon av E. coli med en ekspresjonsvektor som inneholder en operativt tilknyttet DNA-sekvens som koder for aminosyresekvensen vist i formel 1 i krav 1.

Et eksempel på en DNA-sekvens som koder for aminosyresekvensen til denne analog, kan vises ved følgende formel:

Hirudinanalogen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse og vist i formel 1, kan syntetiseres ved kjemisk syn-tese, eller den kan fremstilles ved genmanipuleringsmetodikk.

For fremstilling av hirudinanalogen ved genmanipuler-ing ble først, som beskrevet i et senere eksempel, hirudin HVl-sekresjonsplasmidene pMTSHVl og pMKSHVl oppbygd og benyttet til transformasjon av E. coli. Hirudin HVI ble fremstilt ved utskillelse ved bruk av de transformerte mikroorganismer. Plasmid pMTSHVl omfatter en promoter (Ptrp), en DNA-sekvens som koder for et signalpeptid (PhoA-signal), en DNA-sekvens som koder for aminosyresekvensen til HVI, et replikasjonsorigo

(ori) og en DNA-sekvens som inneholder et translasjonstermin-eringssignal (rrnBT^Tj), som vist i fig. 3. I foreliggende oppfinnelse ble, for å innføre aminosyresekvensen til HV3 etter den 52. aminosyre i hirudin HVI, HVl-sekresjonsplasmidet pMTSHVl kuttet med et restriksjonsenzym for å fjerne DNA-sekvensen som koder for aminosyresekvensen etter den 52. aminosyre i hirudin HVI. Samtidig ble DNA-sekvensen som koder for aminosyresekvensen som begynner med den 53. aminosyre i HV3-ekspresjonsplasmidet pUCHV3, kuttet ut ved hjelp av et

restriksjonsenzym. DNA-et med sekvensen som koder for opptil den 52. aminosyre i hirudin HVI fra plasmid pMTSHVl, og DNA-et som koder for aminosyresekvensen som begynner med den 53. aminosyre i hirudin HV3 avledet fra plasmid pUCHV3, ble ligert med DNA-ligase for oppbygging av plasmidet pMTSHVlC3 som inneholder DNA-et som koder for aminosyresekvensen til hirudinanalogen ifølge foreliggende oppfinnelse.

Plasmid pMTSHVlC3 omfatter en DNA-sekvens som inneholder en promoter, et signalpeptid og et replikajonsorigo (ori) avledet fra plasmid pMTSHVl, en DNA-sekvens som koder for aminosyrene 1-52 i hirudin HVI og et translasjonsterminer-ingssignal, og en DNA-sekvens som koder for aminosyrene som begynner med den 53. aminosyre i hirudin HV3 avledet fra plasmid pUCHV3, som er innsatt mellom den foran nevnte DNA-sekvens som koder for aminosyrene 1-52 i hirudin HVI og translasjons-termineringssignalet.

Hirudinanalogen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse produseres intracellulært og utskilles i mediet når plasmid pMTSHVlC3 innføres i E. coli, fulgt av dyrkning av de transformerte mikroorganismer.

Ved foreliggende oppfinnelse ble hirudinanalogen separert ved vanlig kjente fremgangsmåter og renset ved fremgangsmåter som kolonnekromatografi, reversfase-HPLC, osv.

Den erholdte hirudinanalog viste høyere antitrombinaktivitet og lavere blødningstendens enn hirudin HVI i dyre-modellen. Den kan formuleres til et ypperlig antikoagulasjons-medikament ved å tilberede den ved vanlig benyttede formuler-ingsmetoder. Med andre ord kan hirudinanalogen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse videre tilberedes ved en rekke kjente fremgangsmåter, med vanlige bærerstoffer for farmasøyt-isk bruk eller formuleringstilsetninger. Det farmasøytiske preparat kan tilføres intravenøst, intrakutant, subkutant eller intramuskulært, eller lokalt utenfor munnen. Selv om en passende dose vil bestemmes i hvert enkelt tilfelle ut fra faktorer som pasientens symptomer, alder og kjønn, vil den vanligvis ligge i området fra 0,1 mg til 100 mg pr. dag for voksne, og totalmengden vil tilføres i én eller flere doser.

Foreliggende oppfinnelse gjelder videre en sekresjonsvektor for fremstilling av hirudinanalog HV1C3, kjenne- ■tegnet ved at den omfatter en DNA-sekvens som inneholder et replikasjonsorigo (ori) fra et pUC-plasmid, en DNA-sekvens til en tac- eller en trp-promoter, en DNA-sekvens som koder for signalpeptid, og en DNA-sekvens som koder for en hirudinanalog HV1C3 som omfatter en aminosyresekvens med formel 1.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også transformerte mikroorganismer som er kjennetegnet ved at E. coli ble transformert med sekresjonsvektoren ifølge et av kravene 4 til 6, samt en fremgangsmåte for fremstilling av hirudinanalog HV1C3 ifølge formel 1, kjennetegnet ved at den omfatter dyrkning av de transformerte mikroorganismer ifølge krav 7 og utvinning av produktet fra dyrkningsmediet.

DNA-fragmentet som inneholder replikasjonsorigoet (ori) fra et pUC-plasmid, kan fremstilles ved kutting av kommersielt tilgjengelige plasmider av pUC-familien, f.eks. pUC9, pUC18 eller pUC19, med kombinasjoner av egnede restriksjonsenzymer. Et DNA-fragment på tilnærmet 1440 basepar som inneholder et replikasjonsorigo (ori) fremstilt ved kutting av pUC18 med restriksjonsenzymene Pvul, eller Pvul og PvuII, kan benyttes som et pUC-replikasjonsorigo i plasmidene.

Tac-promoteren og trp-promoteren har nukleotidsekven-sene vist i henholdsvis fig. 7 og 8, og kan lett syntetiseres ved bruk av en DNA-syntesemaskin eller lignende. Disse pro-moterer kan følgelig syntetiseres og ligeres med fragmenter som inneholder replikasjonsorigoet (ori) fra plasmid pUC18. Alternativt kan de relativt enkelt fremstilles ved ligering av DNA-fragmenter dannet ved kutting av kommersielt tilgjengelige plasmider med restriksjonsenzymer. Plasmid pMK2 kan f.eks. fremstilles ved hjelp av T4 DNA-ligase ved å ligere DNA-fragmenter som inneholder DNA-sekvensen til tac-promoteren erholdt ved kutting av det kommersielt tilgjengelige plasmid pKK223-3 (Pharmacia) med restriksjonsenzymene Pvul og Nrul, og et DNA-fragment som inneholder et replikasjonsorigo (ori) erholdt ved kutting av det kommersielt tilgjengelige plasmid pUC18 med restriksjonsenzymene Pvul og PvuII.

Plasmid pMTl kan fremstilles ved å fjerne fragmentet som inneholder DNA-sekvensen til tac-promoteren ved L kutte det ovenfor nevnte plasmid pMK2 med restriksjonsenzymene EcoRl og Eco47III, og deretter innsette et fragment som inneholder trp-promotersekvensen syntetisert ved bruk av en DNA-syntesemaskin.

For DNA-sekvensen til signalpeptidene kan DNA-sek-venser som koder for signalpeptider til proteiner som er lokalisert i periplasmaet i E. coli, benyttes, f.eks. enzymer som alkalisk fosfatase (pho A) og b-laktamase (bla), eller proteiner i ytre membran som OmpA, OmpB og OmpF. Disse DNA-fragmenter kan lett fremstilles ved bruk av en DNA-syntesemaskin.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser aminosyresekvensene til hirudinene HVI, HV2,

HV3 og HV1C3.

Fig. 2 viser DNA-sekvensen til phoA-signalpeptidet.

Fig. 3 viser en oversikt over oppbyggingen av det hirudin

HVI-utskillende plasmid pMTSHVl.

Fig. 4 viser en oversikt over oppbyggingen av plasmid

pMKSHVl.

Fig. 5 viser en oversikt over oppbyggingen av det hirudin

HVlC3-utskillende plasmid pMTSHVlC3.

Fig. 6 (A) viser C4-reversfase-HPLC-profilen for hirudin HVI; (B) viser C4-reversfase-HPLC-profilen for hirudin HV1C3. Fig. 7 viser DNA-sekvensen til tac-promoteren benyttet i

foreliggende oppfinnelse.

Fig. 8 viser DNA-sekvensen til trp-promoteren benyttet i

foreliggende oppfinnelse.

Fig. 9 viser en oversikt over oppbyggingen av det hirudin

HV3-utskillende plasmid pMTSHV3.

Fig. 10 viser DNA-sekvensen til signalpeptidet PhoA for

hirudin HV3-utskillelse benyttet i eksempel 5.

Fig. 11 viser C4-reversfase-HPLC-profilen for renset hirudin

HV3.

Den foretrukne utførelse av foreliggende oppfinnelse

Fremgangsmåtene for oppbygging av plasmidene pUCHVl, pMTl og pMK2 som benyttes til oppbygging av pMTSHVl eller pMKSHVl som hirudin HVl-sekresjonsplasmider benyttet i foreliggende oppfinnelse, og av plasmid pUCHV3 for bruk til opp bygging av plasmid pMTSHVlC3, er gitt i de følgende refer-anseeksempler.

[Referanseeksempel 1]

Fremstilling av plasmid pUCHVl og plasmidPUCHV3

10 ug av det kommersielt tilgjengelige plasmid pUC18 ble kuttet med 30 enheter EcoRI og 30 enheter Hindi 11 ved 37 °C i 2 timer. Vektorresten ble så separert ved agarosegelelektroforese fulgt av ekstraksjon. Proteiner ble fjernet ved fenol-ekstraksjon, DNA ble felt med kald etanol og løst i 50 ul TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Til denne mengde løsning som skulle inneholde 50 ng DNA, ble 10 pl 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 300 enheter T4 DNA-ligase som inneholdt dobbelttrådet HVI- eller HV3-DNA, tilsatt, fulgt av reaksjon over natten ved 16°C for å danne plasmid pUCHVl eller pUCHV3, i hvilke henholdsvis HVl-genet eller HV3-genet var innsatt mellom EcoRI- og HindiII-setene i plasmid pUC18.

[Referanseeksempel 2]

Fremstilling av plasmid pMK2 og plasmid pMTl

(a) Fremstilling av plasmid pMK2

Et fragment inneholdende tac-promoteren som ble erholdt ved kutting av det kommersielt tilgjengelige plasmid pKK223-3 (Pharmacia) med restriksjonsenzymene Pvul og Nrul, et fragment inneholdende et replikasjonsorigo (ori) erholdt ved kutting av kommersielt tilgjengelig pUC18 med restriksjonsenzymene Pvul og PvuII, og et fragment inneholdende ampicil-linresistensgenet, ble ligert ved bruk av T4 DNA-ligase. Det

) således erholdte fragment ble innført i E. coli JM109 fulgt av dyrkning og screening for ampicillinresistens, og en vektor med både tac-promoteren og replikas jonsorigo (ori) fra pUC18 ble erholdt og kalt pMK2.

(b) Fremstilling av plasmid pMTl

10 ug plasmid pMK2 ble kuttet med 30 enheter EcoRI og Eco47III som fjernet fragmentet som inneholder tac-promoteren, hvoretter fragmentet som inneholdt replikasjonsorigo (ori), ble gjenvunnet ved agarosegelelektroforese. DNA-fragmentet som inneholdt trp-promoteren, ble syntetisert ved bruk av en DNA-syntesemaskin. Dette fragment ble ligert med det foran nevnte fragment dannet ved kutting av pMK2 med EcoRI og Eco47III, ved bruk av T4 DNA-ligase ved 16°C over natten. Ligeringsproduk-tene ble benyttet til transformasjon av E. coli JM109 for fremstilling av en vektor med både trp-promoteren og replikasjonsorigo (ori) fra plasmid pMK2. DNA-sekvensen til dette plasmid ble bekreftet ved fremgangsmåten til Sanger et al. og kalt pMTl.

Foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detalj i det følgende eksempel.

[Eksempel 1]

(1) Oppbygging av hirudin HVl- sekresionsplamidet pMTSHVl

Plasmid pMTSHVl ble oppbygd ifølge fremgangsmåten vist i fig. 3. Fire oligonukleotider vist i fig. 2, ble syntetisert for konstruksjon av et DNA-fragment som tilsvarer signalpeptidet i alkalisk fosfatase (phoA) fra E. coli og DNA-fragment et som koder for Val<1->Val<2>i den N-terminale del av hirudin HVI. Etter deproteksjon ble hvert oligonukleotid renset ved 10% polyakrylamidgelelektroforese.

Etter fosforylering av 500 pmol av hvert av de to oligonukleotider S2 og S4 ble 20 pmol av hver av de 4 oligonukleotider blandet, annealet og behandlet ved 16°C over natten i 20 ul løsning med T4 DNA-ligase. Etter fjerning av protein ved bruk av fenol og kloroform og felling med kald etanol ble det ønskede, dobbelttrådede DNA-fragment erholdt. 1/10 av mengden av det erholdte fragment og 100 ng plasmid pUCHVl (japansk patentskrift 3-164184 (1991)) kuttet med restriksjonsenzymene EcoRI og AccI, ble omsatt med T4 DNA-ligase ved 16°C over natten. Det hybride plasmid pSHVl som inneholder fusjonsgenet i hvilket DNA-sekvensen som koder for hirudin HVI er innsatt umiddelbart etter sekvensen som koder for phoA-signalpeptidet, ble erholdt ved transformasjon av E. i coli JM109. DNA-sekvensen til dette plasmid pSHVl ble bekreftet ved fremgangsmåten til Sanger et al. 10 ug pSHVl ble kuttet med restriksjonsenzymene EcoRI (30 enheter) og Hindi 11 (30 enheter), og det 276 bp store fusjonsgenfragment ble renset ved agarosegelelektroforese.

100 ng av det erholdte DNA-fragment og 100 ng DNA fremstilt ved kutting av E. coli-ekspresjonsvektoren pMTl (japansk patentskrift 3-76579 (1991)) med restriksjonsenzymene EcoRI og Hindlll, fulgt av rensing av DNA-fragmentene ved agarosegelelektroforese, ble ligert ved bruk av T4 DNA-ligase ved 16°C over natten. Den resulterende reaksjonsblanding ble benyttet til transformasjon av E. coli JM109 for å erholde hirudin HVl-sekresjonsplasmidet pMTSHVl, i hvilket fusjonsgenet som koder for phoA-signalpeptidet og hirudin HVI etter-følger trp-promoterområdet. DNA-sekvensen til pMTSHVl ble bekreftet ved fremgangsmåten til Sanger et al.

(2) Oppbygging av det hirudin HVI- utskillende plasmid pMKSHVl

Plasmid pMKSHVl ble oppbygd ifølge fremgangsmåten vist i fig. 4.

Det foran nevnte, fuserte DNA som koder for phoA-signalpeptidet og hirudin HVI, og DNA-fragmentet erholdt ved kutting av E. coli-ekspresjonsplasmidet pMK2 (japansk patentskrift 3-76579 (1991)) med restriksjonsenzymene EcoRI og Hindlll, ble ligert ved bruk av T4 DNA-ligase, ligeringsprod-uktene ble benyttet til transformasjon av E. coli JM109, og det hirudin HVl-utskillende plasmid pMKSHVl med fusjonsgenet innsatt nedstrøms for tac-promoteren, ble erholdt. DNA-sekvensen til plasmid pMKSHVl ble bekreftet ved fremgangsmåten til Sanger et al.

(3) Sekresionsproduksion av hirudin HVI med pMTSHVl

E. coli JM109 transformert med plasmid pMTSHVl eller pMKSHVl oppbygd i (1) og (2) ovenfor, ble dyrket i 2 x YT-medium (16 g/l baktotrypton, 10 g/l bakto-gjærekstrakt og 5 g/l NaCl) med 100 ug/ml ampicillin. Etter dyrkning ved 37°C i 24 timer ble 1 ml dyrkningsmedium uttatt.

Nedsentrifugerte celler fra hver prøve ble suspendert i 1 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) med 25% sukrose og 1 mM EDTA, fulgt av inkubasjon ved romtemperatur i 10 minutter. Etter oppsamling av cellene ved sentrifugering ved 6.000 x g i 10 minutter ble cellene suspendert i 1 ml kaldt vann for å fri-gjøre stoffene i det periplasmatiske rom ved osmotisk sjokk. Cellene ble fjernet fra periplasmafraksjonen ved sentrifugering ved 6.000 x g i 10 minutter. Mengden utskilt og peri-plasmaakkumulert hirudin ble bestemt ved måling av antitrombinaktiviteten i supernatanten. Antitrombinaktiviteten er basert på kvantitativ måling av fargeintensiteten som dannes ved trombins hydrolytiske aktivitet på det syntetiske, kromo-gene substrat kromozym TH (tosylglysilprolylarginin-4-nitro-anilidacetat, Boehringer-Mannheim) og hirudins inhibitoriske virkning på trombin, som vil undertrykke fargedannelsen.

Denne reaksjon ble utført som følger. I et reaksjons-volum på 1 ml ble 0,36 NIH-U humant trombin (Sigma) tilsatt til buffer med 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 150 mM NaCl og 0,1% polyetylenglykol-6000, fulgt av tilsetning av standardhirudin eller ukjent prøve, fulgt av preinkubasjon ved 37°C i 3 minutter.

Både substratet og kromozym TH ble tilsatt i en sluttkonsentrasjon på 200 uM for å måle frigjørelsen av p-nitroanilid ved løsningens absorbansøkning ved 405 nm pr. min-utt, og antitrombinaktiviteten (ATU) ble beregnet.

Resultatet var at stammen som inneholdt plasmid pMTSHVl, viste 450 ATU antitrombinaktivitet pr. ml dyrkningsvæske. Stammen med plasmid pMKSHVl viste 360 ATU antitrombinaktivitet pr. ml dyrkningsvæske. Resultater av videre under-søkelser angående fremstilling av hirudin med forskjellige E. coli-stammer som JM101, JM103, JM109, TG1, HB101, JA221, IF03301, C600, RR1 og DH5 i hvilke plasmid pMTSHVl ble innført ved transformasjonsfremgangsmåten til Hanahan et al., er vist i tabell 1.

Når RR1 ble benyttet som vert, ble tilnærmet 2000 ATU/ml av HVI fremstilt ekstracellulært.

(4) Utskilling av hirudin HVI til dyrkninqsvæsken av transformert E. coli JM109/ pMTSHVl

Når E. coli-stamme JM109 ble transformert med plasmid pMTSHVl (E. coli JM109/pMTSHVl) (FERM BP-3266) og dyrket i 2 liter 2 x YT-dyrkningsmedium med 2% glukose i en 5-liters

fermentor med røring og luftgjennomstrømning ved 37°C i

24 timer, ble tilnærmet 5300 ATU pr. ml hirudin HVI fremstilt ekstracellulært.

(5) Rensing av hirudin HVI fra dyrkningsvæske

Etter fermentering ble 1,5 1 dyrkningsvæske oppsamlet og sentrifugert ved 6000 x g i 10 minutter for å fjerne super-natant fra cellerester. Da saltkonsentrasjonen i supernatanten var 1,3% målt med et saltmeter, ble supernatanten fortynnet

4 ganger med 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0) og filtrert gjennom et 3,2 uM filter (Pole Co. Ltd). Filtratet ble påsatt en "QAE-toyopearl" kolonne (4,4 x 7 cm) ekvilibrert med 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0). Etter påsetting av prøven ble kolonnen ekvilibrert i buffer, fulgt av trinnvis eluering av hirudin HVI med 0,2M NaCl. Den eluerte løsning ble konsentrert med en "Amicon Diaflow"-membran (YM5), fulgt av gelfiltrering på "Sephacryl S-100HR" forekvilibrert med 10 mM kaliumfosfat-buf f er (pH 7,0) for avsalting.

De aktive fraksjoner ble påsatt en kolonne med "DEAE-toyopearl" (4,4 x 40 cm) ekvilibrert med 10 mM kaliumfosfat-buf f er (pH 7,0), vasket grundig og så eluert med en lineær gradient dannet mellom 3 liter ekvilibreringsbuffer og 3 liter 0,3M NaCl i ekvilibreringsbuf fer. Den endelige rensing ble utført på en C4-reversfase-HPLC-kolonne med "Delta-prep 3000" som er et Waters-produkt. Det rensede hirudin HVI ble erholdt ved eluering fra søylen med en lineær gradient fra 15 til 30%

(volum/volum) acetonitril med 0,065% (volum/volum) trifluor-acetat.

Rensingsgraden for hvert trinn er vist i tabell 2.

Aminosyresammensetningen til det således erholdte hirudin HVI viste verdier i samsvar med naturlig hirudin HVI, som vist i tabell 3. Den N-terminale aminosyresekvens til renset hirudin HVI startet med Val-Val-Tyr som vist i tabell 4, som tyder på at korrekt kløyving av phoA-signalpeptidet hadde skjedd. Antitrombinaktiviteten var 8202 ATU/mg.

( 6) Fremstilling av kimært hirudin HVlC3- sekresionsplas-midetPMTSHV1C3

Plasmid pMTSHVlC3 ble oppbygd ifølge fremgangsmåten beskrevet i fig. 5. For å erstatte sekvensen etter den 52. aminosyre i hirudin HVI med sekvensen fra HV3, ble HVl-sekresjonsplasmidet pMTSHVl (10 ug) kuttet med restriksjonsenzymene Kpnl (30 enheter) og Hindlll (30 enheter), fulgt av agarosegelelektroforese for å rense et DNA-fragment på 2,8 kbp.

Tilsvarende ble 10 ug plasmid pUCHV3 (japansk patentskrift nr. 3-164184 (1991)) også kuttet med Kpnl og Hindlll, og et 80 bp stort DNA-fragment som koder for den C-terminale

aminosyresekvens til HV3, ble renset.

100 ng av begge DNA-fragmenter ble behandlet med T4 DNA-ligase ved 16°C over natten, og den resulterende reaksjonsblanding ble benyttet til transformasjon av E. coli JM109 for å erholde kimært hirudin HVlC3-sekresjonsplasmidPMTSHV1C3. DNA-sekvensen til plasmid pMTSHVlC3 ble bekreftet ved fremgangsmåten til Sanger et al.

(7) Fremstilling av kimært hirudin HV1C3 ved utskillelse med hirudinsekresionsplasmidetPMTSHV1C3

E. coli RR1 (FERM BP-3130) transformert med plasmidPMTSHV1C3 oppbygd i (6) ovenfor, ble dyrket i 2 x YT-medium med 100 ug/ml ampicillin. Etter dyrkning ved 37°C i 24 timer ble 1 ml dyrkningsvæske uttatt, og osmotisk sjokk ble benyttet for å måle antitrombinaktiviteten i periplasmafraksjonen.

Resultatet var at 3060 ATU antitrombinaktivitet pr. ml dyrkningsvæske ble påvist.

(8) Utskillelse av kimært hirudin HV1C3 i fermenterings-eller dvrkningsvæsken av den transformerte stamme E. coli JM109/ PMTSHV1C3

Når E. coli JM109 (FERM BP-3104) transformert med plasmid pMTSHVlC3 ble dyrket i 2 liter 2 x YT-dyrkningsmedium med 2% glukose i en 5-liters fermentor med røring og luftgjen-nomstrømning ved 37°C i 24 timer, ble en total antitrombinaktivitet på 6050 ATU/ml, 350 ATU/ml i periplasmaet og 5700ATU/ml i dyrkningsvæsken, påvist.

(9 ) Rensing av kimært hirudin HV1C3

Hirudin HV1C3 ble renset fra dyrkningsvæsken erholdt i (8) ovenfor ifølge fremgangsmåten i (5) ovenfor. Når aminosyresekvensen til renset, kimært hirudin HV1C3 ble bestemt, ble det bekreftet, som beregnet, at den C-terminale aminosyresekvens var forskjellig fra HVI, som vist i fig. 1. Den spesi-fikke aktivitet var 11.250 ATU/mg. HPLC-profilene for rensetHVI og HV1C3 er vist i fig. 6. Eksperimentet ble utført med en "Vydac C4"- (0,46 x 25 cm) kolonne med en lineær acetonitril-gradient fra 15 til 30% med en strømningshastighet på

1 ml/min. i 30 minutter.

[Eksempel 2]

Forebyggende virkning av hirudin mot trombinindusert død

Trombin (10 NIH-enheter/10 g) ble tilført intravenøst til hannmus (20-25 g) uten bedøvelse, og antitrombinaktiviteten til den analyserte forbindelse ble evaluert ved å be-nytte fraværende overrullingsrefleks og død som mål. Alle de analyserte forbindelser ble oppløst i saltvann, og 0,05 ml/10 g ble tilført intravenøst 5 minutter forut for trombininjeksjonen. Resultatene er vist i tabell 5.

Som det fremgår av tabellen, viste kimært hirudin (HV1C3) ifølge foreliggende oppfinnelse tilnærmet 4-5 ganger høyere forebyggende aktivitet enn hirudin HVI.

[Eksempel 3]

Forlenget blødningstid

Prøver ble injisert i hannmus (20-25 g) via halevenen under bedøvelse med natriumpentobarbital (40 mg/kg i.p.). Et stikksår ble laget ved innføring av en 21G kanyle (ytre dia-meter 0,85 mm) inn i den andre side av halevenen 5 minutter

etter tilførsel av analyseforbindelsene, og sårets blødnings-tid ble målt. Et filterpapir ble plassert på såret og skiftet hvert 15. sekund. Blødningstiden er definert som den tid som kreves før ingen rød flekk kunne ses på filterpapiret. Resultatene er vist i tabell 6.

Generelt er forlenget blødningstid en av bivirknin-gene ved antikoagulasjonsmidler. Her ble det tydelig bekreftet at det kimære hirudin (HV1C3) ifølge foreliggende oppfinnelse forårsaket mindre blødning enn hirudin HVI.

[Eksempel 4]

Preparat med kimært hirudin HV1C3 som en bestanddel

Det rensede, kimære hirudin HV1C3 fra eksempel l-(9) ble avsaltet med "Sephadex G25" (Pharmacia), fulgt av filtrer-ing gjennom et 0,22 um filter under sterile betingelser. Løs-ningen ble fordelt i ampuller og frysetørket. Det således er holdte, frysetørkede pulver av kimært hirudin HV1C3 kan opp-løses i saltvann og benyttes som et injiserbart medikament.

Industriell anvendbarhet

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny hirudinanalog. Hirudinanalogen fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendbar som antikoagulasjonsmiddel med sterk antitrombinaktivitet og redusert tendens til å forårsake blødning.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre sek-resjonsvektorer for utskillelse av den foran nevnte hirudinanalog, transformerte mikroorganismer og fremgangsmåter for fremstilling av hirudinanalogen ved bruk av de transformerte mikroorganismer.

Deponerte mikroorganismer;

(1) E. coli JM109/pMTSHVlC3

(Post E. coli JM109/pMTPHOHVlC3 ble forbedret)

Deponeringsorganisasjon:

Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry Adresse: 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan Deponeringsdato:

18. september 1990

Deponeringsbetegnelse:

FERM BP-3104

(2) E. coli RRl/pMTSHVlC3

Deponeringsorganisasj on:

Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry

Adresse:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan Deponeringsdato: 11. oktober 1990

Deponeringsbetegnelse:

FERM BP-3130

(3) E. coli JM109/pMTSHVl

Deponeringsorganisasjon:

Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry

Adresse:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan

Deponeringsdato:

6. februar 1991

Deponeringsbetegnelse:

FERM BP-3266

(4) E. coli RRl/pMTSHV3

Deponeringsorganisasjon:

Adresse:

1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan

Deponeringsdato:

6. februar 1991

Deponeringsbetegnelse:

FERM BP-3267

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en hirudinanalog,karakterisert vedat den omfatter dyrkning av den transformerte mikroorganisme erholdt ved å transformere E.coli med en ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for polypeptidet med aminosyresekvensen som er vist i formel 1 nedenfor

slik at dette uttrykkes, og utvinning av hirudinanalogen fra dyrkningsmediet.

2. DNA-sekvens, karakterisert vedat den koder for aminosyresekvensen i formel 1 ifølge krav 1.

3. Transformert mikroorganisme,karakterisert vedat den er erholdt ved transformasjon av E. coli med en ekspresjonsvektor som inneholder en operativt tilknyttet DNA-sekvens som koder for aminosyresekvensen vist i formel 1 i krav 1.

4. Sekresjonsvektor for fremstilling av hirudinanalog HV1C3, karakterisert vedat den omfatter en DNA-sekvens som inneholder et replikasjonsorigo (ori) fra et pUC-plasmid, en DNA-sekvens til en tac- eller en trp-promoter, en DNA-sekvens som koder for signalpeptid, og en DNA-sekvens som koder for en hirudinanalog HV1C3 som omfatter en aminosyresekvens med formel 1.

5. Sekresjonsvektor ifølge krav 4,karakterisert vedat DNA-sekvensen som koder for signalpeptidet, er avledet fra alkalisk fosfatase.

6. Sekresjonsvektor ifølge kravene 4 eller 5,karakterisert vedat DNA-sekvensen til replikasjonsorigoet (ori) fra pUC-plasmidet er erholdt ved kutting av plasmid pUC18 med restriksjonsenzymene Pvul og PvuII.

7. Transformerte mikroorganismer,karakterisert vedat E. coli ble transformert med sekresjonsvektoren ifølge et av kravene 4 til 6.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av hirudinanalog HV1C3 ifølge formel 1, karakterisert vedat den omfatter dyrkning av de transformerte mikroorganismer ifølge krav 7 og utvinning av produktet fra dyrkningsmediet.