JPH0376579A - ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法 - Google Patents
ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法Info
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- JPH0376579A JPH0376579A JP21244289A JP21244289A JPH0376579A JP H0376579 A JPH0376579 A JP H0376579A JP 21244289 A JP21244289 A JP 21244289A JP 21244289 A JP21244289 A JP 21244289A JP H0376579 A JPH0376579 A JP H0376579A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒト−アンジオジェニンの発現ベクターおよ
びこのベクターを大腸菌に組み込んでヒト−アンジオジ
ェニンを大量に生産する方法に関する。 〔従来の技術〕 ヒト−アンジオジェニンは、血管新生因子で、培養HT
29大腸腺癌細胞の上澄から見出された〔フェット(F
ett)ら、バイオケミストリー(Bio−chemi
stry)、24.5480〜5486(1985)及
びストリダム(Strydoa+) ら、バイオケミ
ストリー(Bioche−eeistry)、24.
5486〜5494(1985))。 このヒト−アンジオジェニンは分子量142000、等
電点が9.5以上のポリペプチドで、71ノ酸配列も既
に知られており、リボヌクレアーゼAと35%相同的で
あり、リボヌクレアーゼ活性を有するが、この活性はり
ボヌクレアーゼへの場合よりも特異的で、100万分の
1以下の活性であることが知られている〔シャピロ(S
hapiro) ら、バイオケミスドリー(Bioch
emistry)、25 3527〜3532(198
6) 〕。 一方、このヒト−アンジオジェニンは、その血管新生作
用のため、創傷治癒用、或いは皮膚移植用としての治療
用途が可能であり、また、リボヌクレアーゼAとの相同
性を考慮すれば、合成低分子インヒビターを開発するこ
とにより、充実性腫瘍及びそれらの移転並びにリュウマ
チ様関節炎、糖尿病の続発症及びその他の症状に関する
診断及び治療等に利用できる。 しかし、これらの治療に用いるためには、生物活性をも
った、充分な量のヒトーアンジオジ翼ニンを得ることが
必要であるが、癌細胞の上澄から大量のヒト−アンジオ
ジェニンを集めることは、極めて、労力を有し、効率的
でなかった。また、ヒト−アンジオジェニンを遺伝子工
学的手法で産生しようとする試みも種々提案されている
(例えば、特開昭63−304987号公報)、シかし
ながら、これらの方法においても、未だ充分に満足でき
る方法は提案されていない。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、上記課題を解決したもので、本発明の目的は
、ヒトーアンジオジエニンの発現が高く、これを効率よ
(生産できる発現ベクターを提供するとともに、大量に
しかも安価にヒト−アンジオジェニンを生産する方法を
提供することにある。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、tacプロモーター又はtrpプロモーター
のフラグメントとプラスミドpUc18の復製開始点(
OrOのフラグメントとヒト−アンジオジェニンのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNAとを含む
ことから構成される発現ベクター及びこれらのベクター
を大腸菌に形質導入してヒトーアンジオジュニンを発現
させ、これを採取することからなるヒト−アンジオジェ
ニンの製造方法に関する。 本発明にいうtacプロモーター又はtrpプロモータ
ーのフラグメントは、第2図a及び第2図すに示した塩
基配列を有するもので、DNA合威合成により容易に合
成することかできる。従って、これらのプロモーターを
合成し、これをプラスミドpUC18の複製開始点(O
ri)のフラグメント等と組合せても良いが、市販のプ
ラスミドの切り出しや接合等を組合せることにより比較
的容易に調製できる。例えば、市販のプラスミドpKK
223−3 (ファルマシア製)を制限酵素Pvu I
及びNru Iで切断したtaeプロモーターフラグメ
ントを含むサイト部と市販、のプラスミドplJc18
を1ti11限酵素Pvu l及びNru Kで切断し
た複製開始点(Ori)のフラグメントを含むサイト部
とをT4 DNAリガーゼで接合することにより、ta
eプロモーターのフラグメントとプラスミドpHc1B
の複製開始点(Ori)のフラグメントとを含んだプラ
スミドを得ることができる。 一方、このプラスミドを制限酵素EcoRI及びEeo
47 mで切断し、復製開始点(Ori)のフラグメ
ントを含むサイト部とをllNA合戒機等により合成し
たtrpプロモーターのフラグメントを接合することに
より、trpプロモーターのフラグメントとプラス元ド
pLlc18の複製開始点くOrOのフラグメントとを
含んだプラスミドを比較的容易に調製するこ占ができる
。 本発明では、上述のようなtaeプロモーターまたはt
rpプロモーターのフラグメントとプラスミドpHc1
8の複製開始点(Oroのフラグメントとを含むベクタ
ーを利用するものであるが、これら以外に、使用したプ
ラスミド由来の他の遺伝子を含んでいても何ら支隊はな
いが、例えばrrnBターミネ・−ター、テ[・ラサイ
クリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等のフラグ
メント等を含んでいると、高発現を行うことができ、ま
たスクリーニングが簡便となり、特に好ましい。 ヒトーアンジオジュニンの遺伝子は、ヒトーアンジオジ
美ニンを構成するアミノ酸数が123と比較的小さいた
め、DNA合或機を用いることにより、比較的簡便に調
製できる。勿論、cDNAライブラリーからeDNAを
スクリーニングすることによって得ても良いことはいう
までもない。この遺伝子は、大腸菌での使用頻度の高い
コドンを用いることが好ましく、特に、第1図に示した
塩基配列の遺伝子を用いることが好ましい。 次に、上記のベクターに、ヒト−アンジオジェニンの遺
伝子を組み込むが、この方法は、前記ベクターを、I!
co R1,S+wal、BamHI、5ail。 Pst I 、 Hindll[等の制限酵素、特に、
好ましくは!!coRIを用いて開裂し、ヒト−アンジ
オジェニン遺伝子をDNAリガーゼで結合することによ
り得ることができる。そして、これを大腸菌に導入し、
スクリーニングすることにより形質転換菌を得ることが
できる。 この形質転換菌を所定の培地で培養することにより、ヒ
ト−アンジオジェニンを生産させ、次いで、菌体を破壊
した後、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の手段
により、単離、精製する。 〔実施例〕 実施例1 (1) ヒトーアンジオジエニン の A と
±fl製 第1図に示したヒト−アンジオジェニンの塩基配列を1
4本のフラグメントに分けてフォスホアミダイト法によ
る全自動合成m<アブライドバイオシステムズモデル3
80^〉で台底した。各DNAフラグメントの5′−末
端にDMTr (ジメトキシトリチル)基を残存させた
状態で逆相C18カラムに吸着させ、アセトニトリル0
.1M )リエチルアンモニウムアセテート(TEA
A)のバッファー系を用いアセトニトリルの濃度勾配で
溶出させた。目的ピークを分取し、濃縮乾固後80%酢
酸水la1!を加え、室温に20分間放置した後、濃縮
乾固した。内容物を水に溶かし、再度逆相C18カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製した。 (2)フラグメントの゛ 心 ヒト−アンジオジェニン遺伝子を第1図に示すように旧
ndm部位でAバートとBバートに分けて構築した。 Aバートについては5′−末端のフラグメントを除く6
本のフラグメント500p謡O1をリン酸化反応液50
pl中、T4ポリヌクレオチドキナーゼ10単位と1m
MATP溶液1.5μlとを加え、37℃で1時間加熱
した後、連結反応に用いた。さらにマO℃で3分間加熱
した後、連結反応に用いた。 Aパートを構成する8本のフラグメントを20pmol
ずつ混合し、3分間加熱後、急冷し、再度75°Cで1
0分間加熱した後、室温まで約2時間かけて徐冷するこ
とによりアニーリングした。これにT4DNA リガー
ゼを含む溶液20u l (60mM Tris −C
2、pH7,5、5mM MgC1t、 5■M
DTT、 1tM ATP)中において、16℃
で一晩反応させた。 Bパートを構成する6本のフラグメントも同様にリン酸
化後、アニーリング及び連結反応させた。 反応後、水を加えて200μ2とし、フェノール及びク
ロロホルムでタンパクを除き、冷エタノールで沈澱させ
、目的とするAバート及びBバートに対応する二重11
DNAを得た。 (3) ヒ −アンジオジェニンへ のクロー
ニング クローニングベクターには大腸菌のプラスミドpUC1
8を用いた。 pUc18 lOu gをEcoR[3
0単位、Hindll[30単位を用いて37”Cで2
時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供して
ベクタ一部分を抽出し、フェノール抽出によりタンパク
を除き、エタノールで沈澱させた後、50μlのTE!
l衝液(10mM Tris−C1,pH8,0、1m
MEDTA)に溶解した。この溶液の50ngO相当量
に、上記(2)で得たAパート及びBパートに対応する
二重鎖IIN^を含む溶液Lop l (66a+M
Tris−CI 5pH7,5,5mMMgC/!*、
5鵬M DTT、 1mM ATP 、 300単位T
4 DNAリガーゼ)を加え、16°Cで一晩反応させ
た。この反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換
し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。この形質転換
体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素による分解
パターン、さらにはDNAシークエンシングを行い、p
UC18のEcoRIと旧ndulとの間にAバート及
びBパートのフラグメントが挿入されたプラスくドpA
にN−A及びpAGN−1’lが導入されていることを
確認した。 (4) ヒ −アンジオジエニン の上記pAG
N−^及びpAGN−8各々IOμg @ EeoRI
30単位、旧nd III 30単位を用いて37℃
で2時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供
して、約220bpの^バートと約150hpのBパー
トを抽出し、フェノール抽出によりタンパクを除き、エ
タノールで沈澱させた後、各々500ng/μ℃になる
ようTB緩衝液に溶解した。AパートとBバートを含む
溶液をそれぞれ5μ君を含む溶液50μl (Tris
・ Cj!、pH7,5,5ml’l YIgCnt、
5mM DTT、 1sM ATP、 300単位T
4DNAリガーゼ)中において16℃で一晩反応させ、
Aバート乏Bバートを連結した0反応後、フェノール及
びクロロホルム抽出によりタンパクを除き、エタノール
で沈澱させた後、30単位のEeoRIを用いて37℃
で2時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供
し、ヒトーアンジオジエニン遺伝子に対感する約370
bpのフラグメントを得た。このヒ叶−アンジオジェニ
ン遺伝子を増幅し、塩基配列を確認するためにplJc
18へのクローニングを行った。 pUcIB 5#
gを20単位のReo fl 1で消化した後、脱リ
ン酸化酵素(アルカリホスファターゼBAP) 1単位
を含む溶液Sou I!、 (500s+MTris
・Cff1. pH9,0,1mM MgCj!g
、1 aiM Zr+Cj!g)を加え、37°Cで3
0分間反応させた。ツメノール抽出により除タンパクし
、冷エタノールで沈澱させた後、TI!緩衝液に溶解し
た。この溶液の50rig相当量に上記370bpのア
ンジオジュニン遺伝子500ngを含む溶液1011
N (66d Tris−(J! 、 pH7,5,5
mM MgCP、z、5aM DTT 、 1mMAT
P、 300単位T4ONAリガーゼ)を加え、16℃
で一晩反史させた。この反応液を用いて大腸菌JM 1
09株を形質転換し、X−gal(5ブロモ−4−クロ
ロ−3−インドリル−β−ガラクトシド)とIPTG
(イソプロピル−β−p−チオガラクトシド〉入りのア
ンピシリン含有LBプレート上にまき、白色コロニーを
拾い、目的の組換え体プラスミドを持つ菌株を得た。こ
の形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素
による分解パターンからクローニングの方向を決定し、
塩基配列はサンガー等の方法で確認した。このようにし
てヒト−アンジオジェニン遺伝子が挿入されたプラスミ
ドをpAGN 1と命名した。(第3図)(5)発韮と
じシ吐二Q摘−製 第4図に示すように市販のプラスミドp■2233(フ
ァルマシア社製〉5μgを制限酵素Pvu I 20単
位及びNruI20単位で切断し、tacプロモーター
及びrrnBター電ネータネ−ター1821b、のフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動により回収した。 またプラスミドp[Ic18 5μgを制限酵素Pvu
120単位及びPvun 20単位で切断し、複製開始
点(Ori)を含んでいる1438bpのフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により回収した。これらのフ
ラグメント1100nずつを10uIlの反応液(66
−Tris ・Cl 、、pH1,5,5aiM Mg
C12z、5mM DTT、 1aiMATP、 30
0単位T4 DNAリガーゼ)中において16°Cで一
晩反応させた。この反窓液を用いて大腸菌卸109株を
形質転換し、β−ラクタマーゼ遺伝子が再構築されたア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。 この形質転換体からプラス改ドDNAを調製し、制限酵
素による分解パターン及びコピー数の増幅を指標にして
p■223−3のtacプロモーターとpUolBのO
riを有する発現ベクターを得た。このプラスミドの塩
基配列はサンガー等の方法で確認し、pMK2と命名し
た。次にプラスミドpMK25μgを20単位のEco
R■で切断し、脱リン酸化酵素(アルカリホスファター
ゼBAP) 1単位を含む溶液50μl(500mM
Tris−C1,pH9,0、ld Mgcg、 、
1sMZnC121)を加え、37℃で30分間反応さ
せた。フェノール抽出により除タンパクし、冷エタノー
ルで沈澱させた後、TB緩衝液に溶解した。また前述の
プラスミドpAGN110μgを30単位のBeo I
で消化後、アガロースゲル電気泳動によりアンジオジエ
ニン遺伝子を回収した。上記処理後のプラスミドpMK
250ngに、このアンジオジュニン遺伝子フラグメン
ト500 ngを含む溶液10μN (66d Tri
s =Cj!、pH7,5,5+++M MgC1,*
、5mM DTT 、 ld ATP 、 300単位
T4 DNA リガーゼ)を加え、16℃で一晩反応せ
た。この反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換
し、目的のアンジオジェニン発現ベクターを持つ菌株を
得た。この形質転換体からプラスミドDNAを調製し、
制限酵素による分解パターンからクローニング方向を決
定し、正しい方向にクローン化されたアンジオジェニン
発現ベクターヲpMAGN1とした。尚、この発現ベク
ターにより形質転換された菌株は、E、coliJM1
09 pMAGN 1 (微工研条寄第2504号)と
して寄託されている。 実施例2 ベ − MTAGN の 第6図に示すように上記プラスミドpMK210μgを
制限酵素Eco RI 30単位及びEco 47m3
0単位で切断し、tacプロモーターを含む断片を除去
し、複製開始点を含む2980bpの断片をアガロース
ゲル電気泳動によって回収した。一方、第2図に示した
trpプロモーターの塩基配列をTRP 1とTRP
2とに分割してDNA合威合成台底した。 これらを逆相C18カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製し、各々100100pをアニーリ
ングして二重@ DNAを得た。この断片と前記pMK
2 EcoR1及びEco 41mで消化した断片とを
T4DNA リガーゼにより16℃で一晩反応させた。 この反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、
trpプロモーターとPMに2の複製開始点(Ori)
を有する発現ベクターを得た。このプラスミドの塩基配
列はサンガー等の方法で確認し、pnr iと命名した
。このpMT 15ugを20単位のEcoRlで消化
した後、アルカリホスファターゼ1単位を含む溶液50
μlを加え、37°Cで30分間反応させた。フェノー
ル抽出により除タンパクし、冷エタノールで沈澱させた
後、TE緩衝液に溶解した。このフラグメント50ng
と前記アンジオジェニン遺伝子500ngをT4DNA
リガーゼにより16°Cで一晩反応させた。 この反応液を用いて大IJiiiiJM109株を形質
転換し、アンジオジェニン発現ベクターを持つ菌株を得
た。 この形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵
素による分解を行いクローニング方向を決定し、正しい
方向にクローン化されたプラスミドをpMTAGN 1
とした。尚、この発現ベクターにより形質転換された菌
株は、E、coli JM109 pMTAGN 1
(微工研条寄第2524号)として寄託されている。 実施例3 ヒ −アンジオジェニンの 上記の発現ベクターpMAGN 1により形質転換され
た大腸菌E、coli JM109株を50 tt g
/ dのアンピシリンを含むLB培地(バクトドリプト
ン10g/ t、バクトイ−ストエキストラクト5g#
!、NaCj! 10g/i!、、pH7,5)で培養
した。−晩培養後、培養液1mを集菌し、レムリのサン
プル緩衝液に懸濁し、加熱溶解後、SDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供した。泳動後、クマシーブリリ
アントブルーにより染色し、脱色したところ、分子量約
14.000の位置にアンジオジェニンの発現が確認さ
れた。 電気泳動したゲルをデンシトメーターにかけ発現効率を
調べた。その結果、ヒト−アンジオジェニンは全菌体蛋
白質の約10〜20%の発現を示し、培地lj!当たり
60−120gの生産量であった。またプラスミドI)
MTAGN 1により形質転換された大腸E。 colt JM109株を50 a g/−のアンピシ
リンを含むM9培地(グリコース5g/ l 、カリξ
)酸5g/ j! 。 NaxHPOa 6g/l、 KllzPO43g/
j!5NaCI Ig/j!、チアミン塩酸塩lO■/
12 、1mM Mg5Oa 、100μHCaCl
宜、トリプトファン50wg/ l 5pH7,2)
で培養した。その結果ヒトーアンジオジエニンの発現量
は全菌体蛋白質の約7%であり、培地17!当たりの生
産量は30mg/j!でpMAGN 1と比較すると低
い値であった。一方大量培養系に移すと発現量は多くな
り、発現量は200[/j!を示した。実施例2のプラ
スミドpMTAGN 1が挿入された大腸菌は大量培養
や高密度培養に適している。なお、大腸菌H8101株
にpMTAGN 1を組込むとヒト−アンジオジェニン
は発現したが、その発現量はJM109株を用いたとき
よりも低く、宿主により発現量に差があり、この点から
みて大腸菌JM 109株はヒト−アンジオジェニンの
発現に好適な宿主であるといえる。
びこのベクターを大腸菌に組み込んでヒト−アンジオジ
ェニンを大量に生産する方法に関する。 〔従来の技術〕 ヒト−アンジオジェニンは、血管新生因子で、培養HT
29大腸腺癌細胞の上澄から見出された〔フェット(F
ett)ら、バイオケミストリー(Bio−chemi
stry)、24.5480〜5486(1985)及
びストリダム(Strydoa+) ら、バイオケミ
ストリー(Bioche−eeistry)、24.
5486〜5494(1985))。 このヒト−アンジオジェニンは分子量142000、等
電点が9.5以上のポリペプチドで、71ノ酸配列も既
に知られており、リボヌクレアーゼAと35%相同的で
あり、リボヌクレアーゼ活性を有するが、この活性はり
ボヌクレアーゼへの場合よりも特異的で、100万分の
1以下の活性であることが知られている〔シャピロ(S
hapiro) ら、バイオケミスドリー(Bioch
emistry)、25 3527〜3532(198
6) 〕。 一方、このヒト−アンジオジェニンは、その血管新生作
用のため、創傷治癒用、或いは皮膚移植用としての治療
用途が可能であり、また、リボヌクレアーゼAとの相同
性を考慮すれば、合成低分子インヒビターを開発するこ
とにより、充実性腫瘍及びそれらの移転並びにリュウマ
チ様関節炎、糖尿病の続発症及びその他の症状に関する
診断及び治療等に利用できる。 しかし、これらの治療に用いるためには、生物活性をも
った、充分な量のヒトーアンジオジ翼ニンを得ることが
必要であるが、癌細胞の上澄から大量のヒト−アンジオ
ジェニンを集めることは、極めて、労力を有し、効率的
でなかった。また、ヒト−アンジオジェニンを遺伝子工
学的手法で産生しようとする試みも種々提案されている
(例えば、特開昭63−304987号公報)、シかし
ながら、これらの方法においても、未だ充分に満足でき
る方法は提案されていない。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、上記課題を解決したもので、本発明の目的は
、ヒトーアンジオジエニンの発現が高く、これを効率よ
(生産できる発現ベクターを提供するとともに、大量に
しかも安価にヒト−アンジオジェニンを生産する方法を
提供することにある。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、tacプロモーター又はtrpプロモーター
のフラグメントとプラスミドpUc18の復製開始点(
OrOのフラグメントとヒト−アンジオジェニンのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNAとを含む
ことから構成される発現ベクター及びこれらのベクター
を大腸菌に形質導入してヒトーアンジオジュニンを発現
させ、これを採取することからなるヒト−アンジオジェ
ニンの製造方法に関する。 本発明にいうtacプロモーター又はtrpプロモータ
ーのフラグメントは、第2図a及び第2図すに示した塩
基配列を有するもので、DNA合威合成により容易に合
成することかできる。従って、これらのプロモーターを
合成し、これをプラスミドpUC18の複製開始点(O
ri)のフラグメント等と組合せても良いが、市販のプ
ラスミドの切り出しや接合等を組合せることにより比較
的容易に調製できる。例えば、市販のプラスミドpKK
223−3 (ファルマシア製)を制限酵素Pvu I
及びNru Iで切断したtaeプロモーターフラグメ
ントを含むサイト部と市販、のプラスミドplJc18
を1ti11限酵素Pvu l及びNru Kで切断し
た複製開始点(Ori)のフラグメントを含むサイト部
とをT4 DNAリガーゼで接合することにより、ta
eプロモーターのフラグメントとプラスミドpHc1B
の複製開始点(Ori)のフラグメントとを含んだプラ
スミドを得ることができる。 一方、このプラスミドを制限酵素EcoRI及びEeo
47 mで切断し、復製開始点(Ori)のフラグメ
ントを含むサイト部とをllNA合戒機等により合成し
たtrpプロモーターのフラグメントを接合することに
より、trpプロモーターのフラグメントとプラス元ド
pLlc18の複製開始点くOrOのフラグメントとを
含んだプラスミドを比較的容易に調製するこ占ができる
。 本発明では、上述のようなtaeプロモーターまたはt
rpプロモーターのフラグメントとプラスミドpHc1
8の複製開始点(Oroのフラグメントとを含むベクタ
ーを利用するものであるが、これら以外に、使用したプ
ラスミド由来の他の遺伝子を含んでいても何ら支隊はな
いが、例えばrrnBターミネ・−ター、テ[・ラサイ
クリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等のフラグ
メント等を含んでいると、高発現を行うことができ、ま
たスクリーニングが簡便となり、特に好ましい。 ヒトーアンジオジュニンの遺伝子は、ヒトーアンジオジ
美ニンを構成するアミノ酸数が123と比較的小さいた
め、DNA合或機を用いることにより、比較的簡便に調
製できる。勿論、cDNAライブラリーからeDNAを
スクリーニングすることによって得ても良いことはいう
までもない。この遺伝子は、大腸菌での使用頻度の高い
コドンを用いることが好ましく、特に、第1図に示した
塩基配列の遺伝子を用いることが好ましい。 次に、上記のベクターに、ヒト−アンジオジェニンの遺
伝子を組み込むが、この方法は、前記ベクターを、I!
co R1,S+wal、BamHI、5ail。 Pst I 、 Hindll[等の制限酵素、特に、
好ましくは!!coRIを用いて開裂し、ヒト−アンジ
オジェニン遺伝子をDNAリガーゼで結合することによ
り得ることができる。そして、これを大腸菌に導入し、
スクリーニングすることにより形質転換菌を得ることが
できる。 この形質転換菌を所定の培地で培養することにより、ヒ
ト−アンジオジェニンを生産させ、次いで、菌体を破壊
した後、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の手段
により、単離、精製する。 〔実施例〕 実施例1 (1) ヒトーアンジオジエニン の A と
±fl製 第1図に示したヒト−アンジオジェニンの塩基配列を1
4本のフラグメントに分けてフォスホアミダイト法によ
る全自動合成m<アブライドバイオシステムズモデル3
80^〉で台底した。各DNAフラグメントの5′−末
端にDMTr (ジメトキシトリチル)基を残存させた
状態で逆相C18カラムに吸着させ、アセトニトリル0
.1M )リエチルアンモニウムアセテート(TEA
A)のバッファー系を用いアセトニトリルの濃度勾配で
溶出させた。目的ピークを分取し、濃縮乾固後80%酢
酸水la1!を加え、室温に20分間放置した後、濃縮
乾固した。内容物を水に溶かし、再度逆相C18カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製した。 (2)フラグメントの゛ 心 ヒト−アンジオジェニン遺伝子を第1図に示すように旧
ndm部位でAバートとBバートに分けて構築した。 Aバートについては5′−末端のフラグメントを除く6
本のフラグメント500p謡O1をリン酸化反応液50
pl中、T4ポリヌクレオチドキナーゼ10単位と1m
MATP溶液1.5μlとを加え、37℃で1時間加熱
した後、連結反応に用いた。さらにマO℃で3分間加熱
した後、連結反応に用いた。 Aパートを構成する8本のフラグメントを20pmol
ずつ混合し、3分間加熱後、急冷し、再度75°Cで1
0分間加熱した後、室温まで約2時間かけて徐冷するこ
とによりアニーリングした。これにT4DNA リガー
ゼを含む溶液20u l (60mM Tris −C
2、pH7,5、5mM MgC1t、 5■M
DTT、 1tM ATP)中において、16℃
で一晩反応させた。 Bパートを構成する6本のフラグメントも同様にリン酸
化後、アニーリング及び連結反応させた。 反応後、水を加えて200μ2とし、フェノール及びク
ロロホルムでタンパクを除き、冷エタノールで沈澱させ
、目的とするAバート及びBバートに対応する二重11
DNAを得た。 (3) ヒ −アンジオジェニンへ のクロー
ニング クローニングベクターには大腸菌のプラスミドpUC1
8を用いた。 pUc18 lOu gをEcoR[3
0単位、Hindll[30単位を用いて37”Cで2
時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供して
ベクタ一部分を抽出し、フェノール抽出によりタンパク
を除き、エタノールで沈澱させた後、50μlのTE!
l衝液(10mM Tris−C1,pH8,0、1m
MEDTA)に溶解した。この溶液の50ngO相当量
に、上記(2)で得たAパート及びBパートに対応する
二重鎖IIN^を含む溶液Lop l (66a+M
Tris−CI 5pH7,5,5mMMgC/!*、
5鵬M DTT、 1mM ATP 、 300単位T
4 DNAリガーゼ)を加え、16°Cで一晩反応させ
た。この反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換
し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。この形質転換
体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素による分解
パターン、さらにはDNAシークエンシングを行い、p
UC18のEcoRIと旧ndulとの間にAバート及
びBパートのフラグメントが挿入されたプラスくドpA
にN−A及びpAGN−1’lが導入されていることを
確認した。 (4) ヒ −アンジオジエニン の上記pAG
N−^及びpAGN−8各々IOμg @ EeoRI
30単位、旧nd III 30単位を用いて37℃
で2時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供
して、約220bpの^バートと約150hpのBパー
トを抽出し、フェノール抽出によりタンパクを除き、エ
タノールで沈澱させた後、各々500ng/μ℃になる
ようTB緩衝液に溶解した。AパートとBバートを含む
溶液をそれぞれ5μ君を含む溶液50μl (Tris
・ Cj!、pH7,5,5ml’l YIgCnt、
5mM DTT、 1sM ATP、 300単位T
4DNAリガーゼ)中において16℃で一晩反応させ、
Aバート乏Bバートを連結した0反応後、フェノール及
びクロロホルム抽出によりタンパクを除き、エタノール
で沈澱させた後、30単位のEeoRIを用いて37℃
で2時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供
し、ヒトーアンジオジエニン遺伝子に対感する約370
bpのフラグメントを得た。このヒ叶−アンジオジェニ
ン遺伝子を増幅し、塩基配列を確認するためにplJc
18へのクローニングを行った。 pUcIB 5#
gを20単位のReo fl 1で消化した後、脱リ
ン酸化酵素(アルカリホスファターゼBAP) 1単位
を含む溶液Sou I!、 (500s+MTris
・Cff1. pH9,0,1mM MgCj!g
、1 aiM Zr+Cj!g)を加え、37°Cで3
0分間反応させた。ツメノール抽出により除タンパクし
、冷エタノールで沈澱させた後、TI!緩衝液に溶解し
た。この溶液の50rig相当量に上記370bpのア
ンジオジュニン遺伝子500ngを含む溶液1011
N (66d Tris−(J! 、 pH7,5,5
mM MgCP、z、5aM DTT 、 1mMAT
P、 300単位T4ONAリガーゼ)を加え、16℃
で一晩反史させた。この反応液を用いて大腸菌JM 1
09株を形質転換し、X−gal(5ブロモ−4−クロ
ロ−3−インドリル−β−ガラクトシド)とIPTG
(イソプロピル−β−p−チオガラクトシド〉入りのア
ンピシリン含有LBプレート上にまき、白色コロニーを
拾い、目的の組換え体プラスミドを持つ菌株を得た。こ
の形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素
による分解パターンからクローニングの方向を決定し、
塩基配列はサンガー等の方法で確認した。このようにし
てヒト−アンジオジェニン遺伝子が挿入されたプラスミ
ドをpAGN 1と命名した。(第3図)(5)発韮と
じシ吐二Q摘−製 第4図に示すように市販のプラスミドp■2233(フ
ァルマシア社製〉5μgを制限酵素Pvu I 20単
位及びNruI20単位で切断し、tacプロモーター
及びrrnBター電ネータネ−ター1821b、のフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動により回収した。 またプラスミドp[Ic18 5μgを制限酵素Pvu
120単位及びPvun 20単位で切断し、複製開始
点(Ori)を含んでいる1438bpのフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により回収した。これらのフ
ラグメント1100nずつを10uIlの反応液(66
−Tris ・Cl 、、pH1,5,5aiM Mg
C12z、5mM DTT、 1aiMATP、 30
0単位T4 DNAリガーゼ)中において16°Cで一
晩反応させた。この反窓液を用いて大腸菌卸109株を
形質転換し、β−ラクタマーゼ遺伝子が再構築されたア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。 この形質転換体からプラス改ドDNAを調製し、制限酵
素による分解パターン及びコピー数の増幅を指標にして
p■223−3のtacプロモーターとpUolBのO
riを有する発現ベクターを得た。このプラスミドの塩
基配列はサンガー等の方法で確認し、pMK2と命名し
た。次にプラスミドpMK25μgを20単位のEco
R■で切断し、脱リン酸化酵素(アルカリホスファター
ゼBAP) 1単位を含む溶液50μl(500mM
Tris−C1,pH9,0、ld Mgcg、 、
1sMZnC121)を加え、37℃で30分間反応さ
せた。フェノール抽出により除タンパクし、冷エタノー
ルで沈澱させた後、TB緩衝液に溶解した。また前述の
プラスミドpAGN110μgを30単位のBeo I
で消化後、アガロースゲル電気泳動によりアンジオジエ
ニン遺伝子を回収した。上記処理後のプラスミドpMK
250ngに、このアンジオジュニン遺伝子フラグメン
ト500 ngを含む溶液10μN (66d Tri
s =Cj!、pH7,5,5+++M MgC1,*
、5mM DTT 、 ld ATP 、 300単位
T4 DNA リガーゼ)を加え、16℃で一晩反応せ
た。この反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換
し、目的のアンジオジェニン発現ベクターを持つ菌株を
得た。この形質転換体からプラスミドDNAを調製し、
制限酵素による分解パターンからクローニング方向を決
定し、正しい方向にクローン化されたアンジオジェニン
発現ベクターヲpMAGN1とした。尚、この発現ベク
ターにより形質転換された菌株は、E、coliJM1
09 pMAGN 1 (微工研条寄第2504号)と
して寄託されている。 実施例2 ベ − MTAGN の 第6図に示すように上記プラスミドpMK210μgを
制限酵素Eco RI 30単位及びEco 47m3
0単位で切断し、tacプロモーターを含む断片を除去
し、複製開始点を含む2980bpの断片をアガロース
ゲル電気泳動によって回収した。一方、第2図に示した
trpプロモーターの塩基配列をTRP 1とTRP
2とに分割してDNA合威合成台底した。 これらを逆相C18カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製し、各々100100pをアニーリ
ングして二重@ DNAを得た。この断片と前記pMK
2 EcoR1及びEco 41mで消化した断片とを
T4DNA リガーゼにより16℃で一晩反応させた。 この反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、
trpプロモーターとPMに2の複製開始点(Ori)
を有する発現ベクターを得た。このプラスミドの塩基配
列はサンガー等の方法で確認し、pnr iと命名した
。このpMT 15ugを20単位のEcoRlで消化
した後、アルカリホスファターゼ1単位を含む溶液50
μlを加え、37°Cで30分間反応させた。フェノー
ル抽出により除タンパクし、冷エタノールで沈澱させた
後、TE緩衝液に溶解した。このフラグメント50ng
と前記アンジオジェニン遺伝子500ngをT4DNA
リガーゼにより16°Cで一晩反応させた。 この反応液を用いて大IJiiiiJM109株を形質
転換し、アンジオジェニン発現ベクターを持つ菌株を得
た。 この形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵
素による分解を行いクローニング方向を決定し、正しい
方向にクローン化されたプラスミドをpMTAGN 1
とした。尚、この発現ベクターにより形質転換された菌
株は、E、coli JM109 pMTAGN 1
(微工研条寄第2524号)として寄託されている。 実施例3 ヒ −アンジオジェニンの 上記の発現ベクターpMAGN 1により形質転換され
た大腸菌E、coli JM109株を50 tt g
/ dのアンピシリンを含むLB培地(バクトドリプト
ン10g/ t、バクトイ−ストエキストラクト5g#
!、NaCj! 10g/i!、、pH7,5)で培養
した。−晩培養後、培養液1mを集菌し、レムリのサン
プル緩衝液に懸濁し、加熱溶解後、SDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供した。泳動後、クマシーブリリ
アントブルーにより染色し、脱色したところ、分子量約
14.000の位置にアンジオジェニンの発現が確認さ
れた。 電気泳動したゲルをデンシトメーターにかけ発現効率を
調べた。その結果、ヒト−アンジオジェニンは全菌体蛋
白質の約10〜20%の発現を示し、培地lj!当たり
60−120gの生産量であった。またプラスミドI)
MTAGN 1により形質転換された大腸E。 colt JM109株を50 a g/−のアンピシ
リンを含むM9培地(グリコース5g/ l 、カリξ
)酸5g/ j! 。 NaxHPOa 6g/l、 KllzPO43g/
j!5NaCI Ig/j!、チアミン塩酸塩lO■/
12 、1mM Mg5Oa 、100μHCaCl
宜、トリプトファン50wg/ l 5pH7,2)
で培養した。その結果ヒトーアンジオジエニンの発現量
は全菌体蛋白質の約7%であり、培地17!当たりの生
産量は30mg/j!でpMAGN 1と比較すると低
い値であった。一方大量培養系に移すと発現量は多くな
り、発現量は200[/j!を示した。実施例2のプラ
スミドpMTAGN 1が挿入された大腸菌は大量培養
や高密度培養に適している。なお、大腸菌H8101株
にpMTAGN 1を組込むとヒト−アンジオジェニン
は発現したが、その発現量はJM109株を用いたとき
よりも低く、宿主により発現量に差があり、この点から
みて大腸菌JM 109株はヒト−アンジオジェニンの
発現に好適な宿主であるといえる。
本発明は、tacプロモーターまたはtrpプロモータ
ーのフラグメントとプラスミドpUc18の複製開始点
(OrOを含むフラグメントとヒト−アンジオジェニン
のアa)酸配列をコードする塩基配列からなるDNAと
を含むヒト−アンジオジェニン発現ベクターを用いてヒ
トーアンジオジ玉ニンを発現するようにしたため、発現
量を著しく向上でき、ヒトーアンジオジIニンを大量に
、しかも安価に、効率よく生産することがで色るtいう
格別の効果を奏する。
ーのフラグメントとプラスミドpUc18の複製開始点
(OrOを含むフラグメントとヒト−アンジオジェニン
のアa)酸配列をコードする塩基配列からなるDNAと
を含むヒト−アンジオジェニン発現ベクターを用いてヒ
トーアンジオジ玉ニンを発現するようにしたため、発現
量を著しく向上でき、ヒトーアンジオジIニンを大量に
、しかも安価に、効率よく生産することがで色るtいう
格別の効果を奏する。
第1図は、ヒト−アンジオジェニンの好ましい塩基配列
の例を、第2図Aはtaeプロモーターの又、第2図B
は、trpプロモーターを含む塩基配列の好ましい例を
それぞれ示す、また、第3図は、ヒト−アンジオジェニ
ン遺伝子を調製する過程の概略を示す、第4図は、プラ
スミドpMK 2を、第5図は、プラスミドpMAGN
1を、第6図はプラスミドpMTAGN 1をそれぞ
れ調製する過程の概略を示した図である。
の例を、第2図Aはtaeプロモーターの又、第2図B
は、trpプロモーターを含む塩基配列の好ましい例を
それぞれ示す、また、第3図は、ヒト−アンジオジェニ
ン遺伝子を調製する過程の概略を示す、第4図は、プラ
スミドpMK 2を、第5図は、プラスミドpMAGN
1を、第6図はプラスミドpMTAGN 1をそれぞ
れ調製する過程の概略を示した図である。
Claims (2)
- (1)tacプロモーターまたはtrpプロモーターの
フラグメントとプラスミドpUC18の複製開始点(O
ri)のフラグメントとヒト−アンジオジェニンのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNAとを含む
ことを特徴とするヒト−アンジオジェニン発現ベクター
。 - (2)tacプロモーターまたはtrpプロモーターの
フラグメントとプラスミドpUC18の複製開始点(O
ri)のフラグメントとヒト−アンジオジェニンのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNAとを含む
ベクターを大腸菌に形質導入してヒト−アンジオジェニ
ンを発現させ、これを採取することを特徴とするヒト−
アンジオジェニンの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21244289A JPH0376579A (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21244289A JPH0376579A (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0376579A true JPH0376579A (ja) | 1991-04-02 |
Family
ID=16622681
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21244289A Pending JPH0376579A (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0376579A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0687731A1 (en) | 1990-11-08 | 1995-12-20 | Japan Energy Corporation | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism |
-
1989
- 1989-08-18 JP JP21244289A patent/JPH0376579A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0687731A1 (en) | 1990-11-08 | 1995-12-20 | Japan Energy Corporation | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism |
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