PT94949A - Vector de expressao para hirudina, microorganismos transformados e metodos para a producao de hirudina - Google Patents

Description

*

DESCRIC

Sll

FUNDAMENTO DO INVENTO U orassnts mvsnt reiscionaoo com um vector οε irf**·* v~ss3o pa!*"*· a w hii rudina ou s ua V-S Γ Í. βΠ i-irf r. ϋ.ίϊΚ& Ο f~ Q2.i~\3. CIO ! LL:r--P.O da hirudina, i um i iliic roorgsnismo tl ~ a π S- τ o ína d o q li s : obtido através da introdução _i _ wC LUTí vector em Esc zhsrichia cqII e um método para a oroduçao sass i va do tl ú. P Li Ο ΐ-Πβ, QU do tytia stie var Ίante, usando o iiiXu ruurqsn i-ir-Hiu tran^toriiiâuu:

DESCRIuSO DE IKABALHUS ANiERIORES medicinal, cacno accla especi tic s usos ierap A hirudina é Bicudo mediei ! bloquear a o d a. a c t i v i q ad s i 'ti Li Γ-IC Q S 0 OS S* na! is oagul .ideo encc ífl trado i 5Lí!ísS san (2 Linn„ Uma vez que o peptideo tem -ão do sanyus através da inibição ombina ? ê i mportante a ρIi c á~1a a ΟάΓά a 5U8 t aplicação foram dsssn™ ;i V3.SOÍ

Recentemante, a. sequência, ds aminoácidos desta proteína foi confirmada EFEBS LETTERS Vol. 165, N22, pl8ô~!84 (19B4>, Biol. Chsfiu Boppe-Seyler vol= 367, p8®3-811 (1986)3= Mostrou-se qus a proteína consiste numa sequência de 65 aminoácidos e o resíduo tirosina na posição 63 caracteristicamente está sulfatado-. Tem sido muito difícil proporcionar uma grande quantidade de hirudina para a utilização terapêutica à disponibilidade limitada de hirudina purificada a partir as sanguessugas=

Assim3 foram feitas várias propostas para produzir hirudina por tecnologia de genética EPor exemplo, PCT8504418 ou EP158564, EP168342, EP1710243, no entanto, ainda nSo surgiu um método satisfatório»

Também, quando a hirudina foi produzida pela tecnologia ds genética a tirosina sulfatada característica na posição 63 ficou dessu.1 fatada, ou seja, é expressa hirudina dessulfatada (esta â designada apenas «hirudina» no qus se segue)» Assim foi clarificado com o progresso dos estudos de biologia molecular que existem várias variantes ds hirudina que têm diferentes sequências de aminoácidos Eibid», Japanese Laid Open Μ26Θ—233Θ98, US479110Ô ou ΕΡ2Θ9Θ61, Ρ8Τ86β34935 EP207956 ou US 4767742, FCT8603517 ou EP236330, EP193175, EP27380O3. CProblsma a ser resolvido pelo invento! 5 - \ *

Ο presente invento é para proporcionar o vsctor de expressão com o qual a hirudina ou sua variante pode ser altamente expressa e eficazmente produzida e assim proporcionar o método pelo qual hirudina ou sua variante pode ser produzida em grandes quantidades e a um custo baixo usando tecnologia genética»

SUMÁRIO DO INVENTO

Constituí um objectivo do presente invento proporcionar um novo vector de expressão com o qual a hirudina ou. sua variante-: pode ser altamente expressa s ef ica.zmente produzida» 0 outro objectivo do presente invento é proporcionar um microorganismo <Escherichia coli)que foi transformado pelo referido vector de esprssslo» Ainda» o outro objectivo do presente invento é proporcionar o método de produçSo pelo qual o referido microorganismo é cultivadon a proteína fundida de hirudina ou sua variante é expressa e a hirudina e sua variante é purificada» Ainda» o outro objectivo do presente invento é proporcionar nova proteína de fusão da hirudina»

Estes s outros objectivos foram atingidos pela utilização de um nova vector com a qual pode ser expressa proteína de ·* \

i,"! uXílUU 0111 -c Χ$ ] ·£1'Ξ-ζ "udxna

Ainda,, o presente invento pode ser usada cosi um DMA codificador de adsnilato-cinase porcina no qual foram subsiitui-

Portanto, o presente invento est-á. relacionado com \ i> um vector fragmentos de DMA origem de replicado do a rurudxna que cosipreenos sntendo a região do promc tona * ·'* r * as-ffiídso pUC18s ia sequen cia de sdenilato—cinase porcina e sequência codificadora de hirudina ou sua variante e que se caracterisa proteína de fusão da hirudina ou ••ua variante ou. uma r- pk í»rpssar uma rte da (2> Uma proteína de fusão da hirudina que compreende toda ou parte áa adenilato-cinase porcina e hirudina ou sua variante, (3) Um microorganisino transformado que é obtido pela introdução do vector de acordo com í1> atrás em Escherichia cali. (4) Um método de produção tíe hirudina que é caractsris por o microorçsanismo transformado de acordo com C3> 7

cultivada5 a proteína de fusão da hirudina ou sua variante ser expressa e a hirudina ou sua variante ser recuperada por clivagem da proteína de fusão seguido da sua separação*

Hirudina HV-i; HV-2 e HV-3 sSo conhecidas como a hirudina atrás referida* SSo conhecidas outras variantes de hirudina em que alguns aminoâcidos são substituídos por outros afflinoácidos ou omitidos íreferido atrás)* Ss bem a hirudina ou estas variantes de hirudina possam ser aplicadas no presente invento* HV-i e HV-3 são prefsrsncia1mente adequadas no que respeita às sua actividades farmacológicas e outras» As suas sequências de aminoâcidos e de nucleotídeos estão apresentados na Fig»! e na Fig„2» A região do promotor tac ou trp referida no presente invento têm as sua sequências de nucleotídeos descritas na Fig» 3 b 4., respectivamente5 s podem ser fàcilmente sintetizadas num sinesticador de DNA= Assims o promotor sintetizado pode ser usado na ligação da origem de replicaçSodo plasmídeo pUCIS para construir o vector do presente invento» Ho entanto3 os plasmídeos comercialmente disponíveis podem ser usados na construção tíe vectores. 0 fragmento Pvul-MruI do plasmídeo pKK223~3 (Pharmacia} incluindo a região do promotor tac soo fragmento Pvul-Mrul do plasmídeo pUCíB incluindo a origem de replieação são ligados com DWA-ligass de T4 para dar o plasmídeo pMK2 como se mostra na 8

Fig«7, E em seguida todo ou parta da cDNA da adenilato-cinase porcina é inserido no plasmideo» Assim pode ser construído um yector que compreende os fragmentos de DMA contendo a regiSo do promotor tac» a origem de replicaçao derivada do plasmideo pUCiB a toda ou uma parta do cDNA da adenilato-cinase porcina» 0 vsctor em que está inserido todo o cDNA de adenilato-cinase porcina foi proposto paios presentes inventores como vector de axprsssãoda adsnilato-cinase porcina pliKAK3 <Japansse Dpen M9 64-51088), 0 vector de expressão da hirudina no presente invento pode ser construído de modo relativamente conveniente empregando este vector de expressão»

Por outro lado? o plasmideo pMK2 atrás referido foi digerido com EcoRI e Eco47III e o fragmenta maior foi isolado. Um fragmento. Um fragmento sintetizado quimicamente do promotor trp foi inserido no sitio EcoRI-Eco47ííI do fragmento derivado do plasmideo pMK2 para dar o plasmideo pMTi como se mostra na Fig,B»

Ma presente inventa, pode ser usada a vector atrás referido compreendendo os fragmentos contendo a regiSo do promotor tac au trps a origem da raplicaçSo derivada do plasmideo pUC'18 e toda ou uma parte da sequência codificadora da adenilsto— —cinass porcina, Não existem obstáculos ao emprego tio vector incluindo outros genes além do derivado do plasmideo usado, Por

BxsmpiDj é cte sr^ênc i«s cia a a i ável usar o vector que inclui os fr&gmentos do terminador rrnB ? çf en e d e r ss i s t ’e'n c i a w, tóíí í w X C. .i* JL ώίίcz', zz outros 3 cia vido a poder ocorrer níveis elevados de skprsssSG & o ΟSϋΞ-piiin- L0 Ssèsrí" f 8l1 X

Em seguida a sequência codificadora da hirudina ou usando um sintetizador de DMA pois a hirudina é composta por 65 aesejâvei empregar os Escherichla osli para seoutncia de aminaâcido5 α que à relativamente pouco.·: codaes mais frequentemente usados em ssosc xa 1 íTisn tso gene que teji nuc1eotideos de HV—1 ou HV—3 apresentado na Fiq. i & Fiq = 2,- Este DMA sintetizado S inserido no sitio EcoRi-HindlIIdo plasmifleo ρϋϋ:ΐ8= Os plasmídeos em que foi inserida a sequência de nucleotí™ isente = βγ o vector de supressão do presente invsn to, o qlasmideo priKAK-i s q olasmídeo pUCHVi ou pUuHV-i foram ímpreoaí

Digeridos cdíií enzimas de restrição., é enzimas de restrição Nco I e HindiII para clivar o primeiro ρ x asíiíXiieu priK.mK.w« i~^3íjir?cj.ai.iííSipcs, e oesiávex restrição EcoRI e HindIII relativamente ao plasmídeo pUCHVí e PvuII rslatãvamsnte ao plasmídeo pUCHV3.. Quando se usa estas

DMA enzimas tis restrição é clivado um DMA da. aden ilatG--cins.se porcina irsDSt.rS.OG Π-S. r 10 , a'si.r ílssu ϊ·ά- u'

Por outro lado» é

ndicado peia ssts. coíii as enzxcoas U u é desejá V -™ 1 recuperar os genes > pl asmideo n| |Πί Hy í cosi Ncq 1 e Hind P~» T- : of\ i. e Hindi T T 8 ffiSDSC ti V«Uft©n te ,= Os- itra rj i~l CZ, n.5S Fig β 1 e Fiq» 2, i e o u gene HV—i foi isolado a partir do pl&smideo pUUHVi Jcol-HindiIIs inserida na sitia McoI-HindiII do plasíiíídeo pMKAI<3? préviaments obtido 5 para dar o plasmideo sto é conseguido por ligação de DNa usanoo í/Nh Izqase ι por digestão aos 002S pSQSCCS Ssc hericnia ca li com a mistura de reacçao da ligaçãos seguido de !4Ç -cransTormaçao as SSiSLL-ãO O c-sz CiíBa colónia por tadora do plasmíoeo correc to u Este plssmideo pHAKHVl compreende fragmentos de DMA contenda a regilo do promotor tac ç a origem de replicaçâOj uma parte da s-equ/anc i a C Od X T X C Sd Ο Γ 8. d S 8 tS; ίϋ. -~l - -U—ÍS í ase porcina s a sequência codifica- d q r 8. d 8. π i rud I. Π 8. HV-i. j a qual foi confirmada por ssqusnc iacao do DMA do plasíirídeo pe i O iTsê tod Q de Sanger. I QU.-& i Π50Π ΟΞ: ? Q V8C t€3f Qw ©Kpf“SS-SMO Ú© HV' DOO© £P«:

0 gene Ην-3 foi isolado por digestSo' ' da plasmidso q Μ fj. r4 v -.i* coiTe hcoHi-Hindl 11 e d o x. -s o o os Sr κ τι reniDS cereee· Pont K. J. sn Ov4 s Par outra lado* a plasmidea p!1KAf<3 foi digerido com PvuII e tratada coai fosfatase alcalina para remover α resíduo fosfato 5? „ Escherichis coli foi transformada com a mistura de Xiqacão destes dOÍ ^ ptódauo^ DMA, t^SQu ido dsr aeleuçãu d S Uma u w 1onia purtâuure do plasmídeo correctc Ϊ c flS sim ο ρ1asm ideo obtido piiAKHve c om ρ r eeri *“ ds um Tragos rnto de DNh con canoa a i* %=?i4X ão do promotaT " l. DQ113. L α Q Ο Γ S d© origem oe repiicaçaoP uma parre adenilato-canas® porcina e a sequência codificadora da hirudina HV-3S a qual foi confirmada por sequenciaçlo do plasmídeo pelo método de Sanger.

Vss. 5.ur construído

LP:L lUli idD u r o m d x o r trp 0 ρ1asmí dso dMT1 Toi digerido com tcoRI e Hindi11 e aaa o fraqsTisnto maior contendo a região do promotor trp s a em de re d 1 i. c ac 'Mo =

1 ν porcina e o fragmento NcoI-HindlII codif icadsr'v'da sequência de aminoàcidos de HV~I conjugada no sítio Ncol = 0 fragmento de DMA foi inserido no sítio EcoR!-Hindi II do plasmídea pMTl para dar o plasmídeo pMTAKHVl como se mostra na Fig,9» Isto foi feito por ligação dos dois pedaços de DMA usando DMA-lioase de T4 = transformação de Escherichia coli com a mistura de reacção da ligação, seguido de selecção de uma colónia portadora do plasmídeo corrsc-to. 0 plasmídeo pMTAKHVl compreende fragmentos de DMA contendo e. região do promotor trp, a origem de replicação, uma parte da sequência codificadora da aosnilato-cinase porcina e a seoutncia codificadora de hirudina HV-i5 a qual foi confirmada por sequenciaçlo do plasmídeo pelo método de 3anger=

Também o DMA da adsnílato-cinase porcina foi isolado por digestão do plasmídeo pHKAK3 com EcoRI-HindIII e inserido no sítio EcoR!-Hindi II do plasmídeo pMTl para se obter o plasmídeo ρ!1ΤΑΚ3=, E em seguida o plasmídeo pMTAK3 foi digerido com PvuII e ligada è sequência codificadora de hirudina HV-3 referida atrás usando DNA-ligase de 14= Escherichia coli foi transformada com a mistura de ligação, seguido de selecção de uma colónia portadora do plasmídeo correcto» Assim o plasniideo obtido pMTAKHV3 compreende um fragmento de DMA? compreendendo a região do promotor trp, a origem de replicação do plasmídeo pUCIS, uma parte da sequência

-JU Â- Ϊ

de hirudina HV--ò3 a p 1 aSífí '1. G OG £35? £ O íB0 t.OQ Q

foi. COO f 2. ΓίΏβ.ίίβ. ΟΟΓ ΟοΟΙΑΟΟο 2. 3.·,. Su QO

SSHQS

!SU pHTAKHVi e PÍ1TAKHV3 sunSrXCnXa Cu 1 x Jills; invento, o mxcroorganxsmo transTorisaoo pooí plasmideos pMrKHVI 5 dHrRHvo Sn-! Escherichia col j o c •Jri 1 ί··9 e II-0.530 í -mas o= iiiicraar— na. dc tu.sSÍo a Lrâs re i snúa i oi proiiu^xda psía cui tura dos micro*-· D Γ Q BS\ X íõO! OS· transtoF: técnicas de centrif! o r ebeniamento dos proteína de i LtvscAU É ios· s beooxs· x^c-laos?. 0 ourxmx^..aoa o.u-s.r*,do íçSo?. cromatoqrafia em coluna e outros após :roorganismos «= Neste passo d© purif iea.ção a fLtsáu é tratada com brometo ds cxanoçjénxo e outros o dividida em fracções de hiru.di.na ou suas variantes s adenilato-- “C! ii !5γΗ-·3 £3Gr C 1.flS-. =

Em pMAKHVi „ pMAKHV3? phTrKHvI , pMTAKHV*5? a fracção adenilato cinase porcina na proteína de fusão da hirudina /& do estremo M além tr'e'5 resxouos meucmns na posição 57, -J ». _ U -re'. íj ietionin ia no sitio de Tusão com hirudi na (a hi Γϋοΐπβ 1 Obtl ,o^. por O Jt X \í?,ElC| Oíl! OS5-t^0 sitio coo! i „ Quando a prote fusSo da hirudina aue *0 A Ο r tr? 3 3. u r" 0 T v5 rio O 0- C! £ ÍV"0lQ0. QO Γ 0 ν’* ·3. t =3. % i \ vr: Ti L O COflí I_11\| v ~ Q£?.4“í !Λ - é gerada uma pequena quantidade de hirudina s sfi» e obter hirutíi— a tendo íuaxs *5

1 Ή- de c I i. yaqeín pretendido do resíduo de t i ο ο ϊ π a = mas sííté no sítio coo hirudina,, Portanto para evitar a geração de hirudina tendo PMTAKHV1M3. em que tr§s resíduos metionina na adsnilato—einase

ϊ!~l_ 3.i I ·· ram substitui : uí dí; A Escherichia coli transformada com estes vectores» pHTAkHVl!i2 ou. pnlARHVlíi3 podem eKprsssar a mesma quantidade de proteína d fusão da célula transformada com piiTAHVI e pode ser obtida HV—1 altamente purificada» 0 presente invento proporciona o vsctor de sxprsss& usanoo e eficazmente produzida, proporcionando assim o método pelo qual a 3 í i!'luj ii ϊ-a sua visr xai t j_e pude ser p r ud u E i d a. em granaes quanti·” dades e baiKO custo usando tecnologia genética.

V

BREVE DESCRlçaO DOS DESENHOS A Fig, 1 e Fig = 2 mostram sequências de DMA e de affiinoécidos dos genes HV-l e Hv~3s respectívamente^ as quais sSo usadas no presente invento. A Fig.3 s Fiq.4 mostram sequências de DMA dos promotores tap a trp. respectivamente» A Fiq.5 mostra sequências de cDNA e de aminoácidos da adsnilato-cinase porcina que se usou no presente invento. A Fig.é é um esquema da construção dos vsctorss de esKpressao do presente invento,. pMAKHVl a pMAKHV3« A Fig, 7 e Fig. 8 são esquemas da construção dos piãsmidsos ρπΚ2 s pliTi raspsctivamsnts, os quais são usados para a preparação do vsctor de expressão no presente invento, pMTAKHVl „ A hig» v é um esquema da construção do veelor de expressão do presente invento5 pMTAKHVl do plasmideo pMTí. V"

i < ίΠθ~· l.!'~S ":cruii£;i iU 1 S=> tií~ D NA de /\ r: ς 0·-· 12 b um esquema da c υΠΟΐΙ!' ϋ.L.&.O d*-! Vttutor de B> : Di''“SS'5"SO do p :res .en to i nven to, plasmideo pHTAKHV!M3a partir dos p] . aso í deos pMi 3AK "HV 1Μ i s p-M 13 AK.HV ϊ nd! =

DESCRIçgQ

Es-is invento está apresentado deisIlisdsfnsnis com SKSínplos= No entanto, os direitos do presente EXEMPLOS í i) C1> Sintase química e purificação de fragmentos de DMA dos genes

HV—í e HV

Cada um dos fragmentos de DMA foi' ' sintetizado pelo método de fosforaínidetos usando um sintetizador automático de DMA (Applied Biosystems Modelo 38®A>= Cada fragmenta de DMA com resídua DríT no extrema 5S foi aplicado numa coluna C13 de fase reversa e sluida com um gradiente linear de acetonitrilo usando o tampão acetonitrilo--·®5i!1 Trietillamónio-acatato (TEA A) = 0 pico foi colhido e após a sus evaporação adicionou-se í ml de ácido acética a 8®%= Deixou-se permanecer à temperatura ambiente durante 2Θ minutos e depois evaporou-se* Os conteúdos foram dissolvidas com água e purificadas por HPLC usando novamente uma coluna CíB de fase reversa» Í2> Reacçgp de combinação dos fraqmsntos

Os genes de HV—i e HV—3 foram sintetizados e purificados por separação de cada em 8 fragmentos coma se mostra na Fig.l s F ig . 2 *

Nd caso de HV-15 5ΦΘ pmol de 6 fragmentos exceptuando o fragmento do extremo 5? r SaÇiu. *-ufíi íí unidades de pudznuoleotx — deo—cinase de T4 ε 1?5 μΐ de ImM ATP em 5© μΐ de mistura de reacção de fosforilação a 37 °C durante 1 hora* Após aquecimento a 7fcv-!C durante 3 min a concentração foi ajustada a 1@ pmol/ul» *>

Misturou-se 2Θ ρπιαΐ de cada um dos 8 í ragmentèss» aquecau-se a 75°C durante 1Θ min e arrefeceu-se lentamente até à temperatura amfc?iente durante aproximadamente 2 hr para completar et emparelha-mento,. Isto reagiu a !q°C durante a noite em 2Θ μΐ da solução contendo DMA-liqsse de T4 <66 mH Tris-Cl, oH7,5, 5 mM MaCl„„ 5mM ui,

DTTj 1 mH ATP>„ Md caso de HV~3» rsalisou-ss o processo semelhante» Após a reacção o DMA de cadeia dupla pretendido foi obtido através da adição de água para 2@0 μ1? remoção da proteína com feno! e clorofórmio e precipitação com etanol frio» <3) Clonaqefli dos genes HV-1 e HV--S IÍ5DU-5S o plasmideo pUCÍS como vector de clonagsm» 1Φ μα de pUCÍS foi digerido a 37°C durante 2 hr usando 3® unidades sís EcoRI e 3Θ unidades de HindiII* Isto foi submetido a eletroforese em gel ds sqarosa e a banda correspondendo ao vector foi extraída» Após remoção da proteína por sxtraeção com fenol s precipitação com etanol frio., dissolveu-se em 5& μΐ ds tampão TE (:ίθ mH Tris-Cl» pH 8S0„ 1 mfi EDTA) = A quantidade correspondente a 50 ng desta solução adicionou-se 1Θ ui de solução contendo o DMA de cadeia dupla obtido como atrás (2) <66 mM Tris-Clç pH 7f5u 5 mH MgCIOJ 5 mM DTT» ImH ATPs 3ΘΘ unidades de DMA—ligase de T4) s a reacçSo decorreu a 16°C durante a noite* Escherichia coli JH1Ó9

ί4) Preparação do vector desx pressão para a proteína de fusão hirudina (1) Preparação do vector de expressão pMAKHV: 0 fragmen to de UlnOQ O OOFMS COCfÍ’fÍC*3 dor da sequtnci a Oe snuFiDé, eidos N—terminai „ j- ~ú Ct u à metxLfiiXtia na pus ição B® da adeni lato-cinase porei nas o qual •foi obtido por diqestã o de 1 . .,*! «,t H i-' V μ*Γ D f~ rl P’* sxprss 3 cã Ο O on r*í®C para a adenilato -cinass porcina, wri{'.Ai·-**cjí3 pansse Laid Open NS 64-510883 com i® u nidades de Ncd I E: Hm d I X1 , foi extraído por e1sct rof orese em gel de aoa roirso a T-S*ísDê?*it O T raomen to de DMA cod i ficador do gene HV1 de 2l€? pb foi Obtido ΡΟΓ* digss tão de Ι© μα do plasmideo pUCHVl que incluiu ri Γ? 0Γ’· g: My~. 1 com 30 unidades d s Nco i s HindiII „ Este fragmento de DMA s a fragmento de .DMA que foi formado por digestão do plasmideo atrás referido pnKAK3 com Nco I e HindiII foram dissolvidos no tampão ligase (66 mil Tris-Cl, pH 7S5P 5mM MgCI^? 5 mH DTT5 1 mH ATP> e adicionou-ss 30® unidades da DNA-ligsse de Ϊ4,= A reacção prosseguiu a 16°C durante a noite5 Escherichia colí drfi®9 foi transformada usando esta mistura de reacçSo e obtida a estirpe que tinha d plasmideo recombinante pretendido pMAKHvl ,= Esta estirpe foi depositada no Fermentation Research Institute com um número de depósito FERM BP-2537= A sequfncia de nuclsotí-deos do plasmídecs pnAKHví foi confirmada pelo método de Sanger» (2) Preparação do vector de expressão pMAKHV3

Como se mostra na Fig= è5 após 1 pg do plasmideo atrás referido pr!KAK3 ter sido digerido com 1® unidades de PvulI, adicionou-se 5® μΐ da solução Í5@® mH Tris—Cl? pH 9?0S X mH

HgC I ,-j s 1 mn ZnCl^) contendo i unidade de fosfatase alcalina tíAP e a reacção prosseguiu a 37°C durante 30 min* Isto foi dissolvido em tamplto TE após remoção das proteínas poe extcacção com fenol a precipitação com etanol frio* Também foi obtido o fragmento de DMA codificador de um gene de HV—3 de 2i€> pb que inclui o gene Hv-3 com 3® unidades de EcdRI b HindlII, Este fragmento de DMA X foi disso! vido em 25 ul de tainpSo Klenow Cl Θ ΙΒΠ Tris-Cl, p U o =; ‘ , w *1 V,- mil :'íC{Lf i. . r e a d icionado 2 unidades da enaim ia K! shdn na prs sença de ei M T P CdATP 3 dT TP. dCTP „ dBTP) = A reacção d ecor T0U a 37°C durante «* ir a. ÍSln » 0 t rag -‘-uri i to d ss dWh do qsne HV”3 COÍH o eMtreina c erse 5? foi obtido ; por precipi tação desta mistura de r sacçSCo com et-anol» α fragmento de ϋΝΑ que é feito aU do ol« ssíni deo atrás referido pMl<A!<3 com P’ vul i r:^e.QÍ.~* íA- 1igase uS 14 a 4°C durante a noi t8 - Ηξ"! richia c ο I x correc s beta l estirpe TO t· t · * i iistlt Ijfçz com uni número de .a mistura de reacção e obtida -a oíti oinars te |Js in í.·*! 3* 3*T** _ 4 —. 4- — Ϊ rcí. OFi-bn •i ta d a no Par S W 1 men ta.tion Reses rc π rΐ~Γ\π cl" usuusi íuíí de rmeleotídeos do plasmídeo pMAKHV3 foi confirmada pelo método de Banqer» (3) Preparação do vector de expressão, pMTAKHVl ía) Preparação do plasmídeo pMTl

4- ί-~· , Como os mostra ! :β. h 1Q s / j S i~ feíQ X ãkíJ d5—* promotor tsc nfíSS -i - - ·— a po: r digestão dα ρ1asm idea pKK223~3 i ~r‘ ha r mac i a} 3 COíTi frsqssnto ιηαιαηαο a origem de replicaç&G

Pvuí e

Wru I s

__ plasmideo pUCiS com Pvul e PvuII foram combinados cam DMA-ligass» Isto foi introduzido em Escherichia coli JM109 e cultivados os microorganismos, 0 vector incluindo o promotor tac e a origem de replicaçiCo de pUClB foi obtido através do despiste de resistência á ampiciiina» Este plasmideo foi designado pMK2» Como ss mostra na Fig=8» 1Φ μο deste plasmideo foram digeridos com 3Θ unidades de EcoRl e Eco47!!I s o fragmento ds DMA incluindo o promotor tac foi removido» 0 fragmento de DMA incluindo a origem de replicarão foi isolado por slsctroforese em gel ds sgaross= Por outro lado3 a sequfncia de nucleotideos do promotor trp aprsentado na Fig» 4 foi sintetizado pela sua divislo em 2 partes TRP-1 e TRP-2 usando um sintetizados- de DMA» Este foi purificado por HPLC usando uma coluna ds fase reversa Cl-3 e o DMA da cadeia dupla foi obtido por empareihamento de pmol de cada» Este fragmento de DMA e o fragmento de DMA que foi feito por digestão de pMK2 atrás referido com EcoRl e Eco47 III reagiram com DMA—ligase de T4 a lèc'C durante a noite» Escherichia coli JMÍ09 foi transiarmada usando esta mistura de reacçlo e obtido o vector incluindo o promotor trp e a origem de replicaçlo de ρΗΚ2» A sequência de nucleotideos deste plasmideo foi confirmada pelo método de Sanger e este plasmideo foi designado pMTl» íb) Preparação do plasmideo pMTAKHVl

Como se mostra na Fig«9? 1 pg do plasmideo atrás referido pMTi foi digerido com 1¾¾ unidades· de EcoRl e HindiII e a

banda correspondente ao vector fai isolada por eleotroforese em gel de agarose» Por outro Iados 1Θ pg de pMAKHvi foi digerido com 3Θ unidades de EcoRI e HindiII s o fragmento de DMA codificador da gene da proteína de fusão foi isolado do gel= Este fragmento de DNA que foi feito por digestão do pHTl atrás referido com EooRI e Ecd47III reagiu com DlMA-xigase de T4 a lè°C durante a noite» Escherichia c:o l i JM109 foi transformada usando esta mistura ae reacção e obtida a estirpe que tinha o plasmideo recambinante pretendido pMTAKHVl» Esta estirpe foi depositada no Fermentation Research Institute com um número de depósito FERM BP--2538» A sequãncia de nucleotidsos do plasmideo pMTAKHVifoi confirmada pelo método de Sanger» (c) Preparação do plasmideo pM?AKHV3 ΙΘμπ do pMKAK3 foram digeridos com EcoRI e HindiII e o fragmento de DNA do gene da. adenilato—cinase porcina foi isolado por eleotroforese em gel de agarose» Este fragmento de DNA e o fragmento de DNA que foi feito por digestão tio plasmideo atrás referido pMTl com EcoRI e HindiII reagiu com DNA-ligsse de T4 a Í6*C durante a noite» Escherichia coli JM109 foi transformada com esta mistura de reacção e obtida a estirpe que tinha o plasmideo recombinante pretendido ρΗΤΑΚ3» Após Ipg do plasmideo pMTAÍ<3 ter

sido digerido com 1® unidades de PvuII? adicionau-se 5® μΐ da solução (5ΘΘ mrf Tris~Cls pH 95β5 1 míl MgCI^5 i mH ZnCl^í contendo í unidade de fosfatass alcalina SAP e a reacção decorreu a 37*0 durante 3® min.Ista foi dissolvida em tampão TE após remoção das proteínas por extracção com fenol e precipitação com stanol frio. Este fragmento de DMA s o fragmento de DNA do gene HV-3 que foi dotado de extremos cerses com enzima Llenow reagiram com DMA-li-gase de T4 a 4°C durante a noite. Escherlchia coli JM109 foi transformada usando esta mistura de rsscçlo s obtida a estirpe que tinha o plasmideo recomhinants pretendida pMTAKHVS» Esta estirpe foi depositada no Fermentation Research Institute com um número de depósito FERM ΒΡ-254Θ. A sequência de nucleotídeas da plasmideo pMTAKBVS foi confirmada pelo método de Sanger« (5) Expressão da hirudina g/1 de casaminoácidos5 6 g/lds

Escherichia coli JÍ1109 foi transformada pelos plasmí-deos atrás referidas pHAKHVl? pMAKHV3? pHTAKHVl e pMTAKHV3 foi cultivada em meio 2XTY cantendo 5©pg/ml de ampicilina (ióq/1 de Baeta Tripiona? 1® gl de extracta de levedura Bacto. 5q/l NaCl ;i pH 7?2). Também Escherichia coli JM1©9 que foi transformada por pMTAKHVi e pHTAKHVS foi cultivada em meio M9 contendo 5®pgníl de ampicilina (5 gl de glucose. 5

i^â2íirU45 mg/1 Uír? ilAUi i de t riptofai 1’ 0 XI3. fGU'"S0 Ap<is dí IbbG X' Q0l de do 1 i de ΚΗπκυΛ, 0,0 q/i de «aLi, ; loreto ds ti anu na , i mPl MqSQ^;! iyfc^uM '— |~ι·*-ί ·*- - a -3/ WL ourance a noixis s L.-at«-1v, D& COQ 5Π1da cu1tu ra em tampão ds amostra ds Remi j

M"! 4" .-"t —. 1»». 1 V polx&crxlemide» hs bandas 00 poixpeotideos com pesos g 14 000 ncs casos das proteínas ds fusão moleculares ds 1/ ΘΘΘ tís HV—i s Hv—3 h rssosctivamsntí yo~ia ubservsoas aq-£>s co 1 cra.y. ac da gsl com azul Coomassie s desço1oração* Usaram-se as estirpe JHI05 e 1F0 33@i 0 0'B t ud Q Li ”*0-0 £*« *Í' *1 c a.L. x a d tf 0 j< p« j ressão nos vário· wOC-p0u0 XΓ08 r. EsfcSíS rssul tadoe 0*0- XL-ãO apresentadoí 3 na Tabela X « tj resultados indicam que todas as estirpes apresentaram expressão elevada, em especial, Escherichia coli Ji1i®9 e IFO 3 pMTAKHVl mcíuinao o elevada» promotor trp foram introduzidos mostraram

Λ

I Η Ν 3 <D '0 Τ) Ο t. ω α. ο Ό Η ttí Πϊ <ϋ χ) C S •rK *r-í -Ρ Ό C 3 Cd Ρ 3 ·Η Cd θ' W Ό

Ο C * 5? 60 OO OO OO OJ *^r ^r s c— O- LO ''T to 03 cn 03 ♦H »—1 r-í *—· * 1 4 03 03

ο !(fl w <Λ <υ V-ι ο χ UJ -Ρα ο ω •ο cd *ο Η w C ω Τ3

ο CO νΟ <U O- 03 c— C— h· LO co 03 03 cn LO ^r cn 03 C<1 t—H 03 03 03 03 ω| ω cd SP S- (Ώ α -ρ cd α ωο ο icd Ρ w ο. CQ •Η cd •Ρο -Ρ Μ Ο VO νΟ -=¾ Ι Ο α ο Τ3 cd Η a Ρω-ρ <υ Ό cd c •Η <D -Ρ Ο Ρ ρ ω Ό oo 03 cn o »114 « 4 LO oo rH co 1—H o- o- r 4 cn cn co > < r-H 03 ι -Ή &0 ΙΛ

TABELA ο H Cd 2 cd u® 3τ—- ο ο

Η | Cd Ω Cd ΩC0Ο CE

Ο CC

>- >H >“» >“· >-· f- F— f— E— E— X X 03 03 X X X 03 03 a a a 03 03 03 r—H o> ψ—I co O 03 LO 03 LO co 03 LO CO O O O O O O co w H t—H 1 4 r-H o r—4 t~"H o a a a a Cl-. a a Cju t—> *—> »—> 1—4 ►—> >—H ω •αρ •Η •Ρ Ρ cd Ο Ρ-Ο -Μο φ —> >-> 33 33 tá ttí ν < «t; Ν f— a ao. o. ΘΘΘΘ@©ΘΘ ο Ό cd -Η 3 Ο ι—ί cdο 27

(6) Purificação de hirudina a partir do meio da cultura

Colheram-se os microorganismos transformados por centrifugação a baixa velocidade a partir de 2 1 do meio de cultura atrás referido. Os sedimentos obtidos foram ressuspensos em 3©© ml de Ho0s ajustado a pH 4 com H.-,SQ/j5 rebentadas as células e centrifugado, Os sedimentos obtidos foram ressuspensos em 2Θ® ml de isopropanol e acetonas respectivamente, depois secos e dissolvidos em 20© ml de ácido térmico a 7©% insanos de 2© g/1, Adicionou-se CNBr numa concentração final de 1% e deixou-se ficar à temperatura ambiente durante a noite, Após o tratamento com CNBr,! eles foram concentrados e secos a 40°C sob pressão reduzida, depois dissolvidos em 40© ml de tampão Í©,1M Tris-Cl < pH 8,7) ο,ΙΙί íNH„)^,SO,, 0,1 mH TritonX-100) . 0 pH da mistura foi ajustado *r * 8,7 cdíTi NaOB, Adicionou-se à mistura L-cisteina para uma concentração de 6 mM e deixou—se & temperatura ambiente durante a noite. Após a adição de sulfato de amónio para uma concentração final da 2 N, foi imediatamente centrifugado» 0 sobrenadante obtido foi aplicado em sBuiyl-toyo psarl» (TOSO Co.LTD) qua foi equilibrado com tampão fosfato de sódio ρΗ 7 = © contendo sulfato de amónio 2M, lavado com o mesmo tampão e depois eluido com tampão fosfato de sódio 5© mH pH 7?© contendo sulfato de amónio 1,5 H. As fracçSes eluidas foram tratadas por filtração em gel ou tíiâlise para remover o sal tís amónio. Após remoção do sal.

aplicou-se em Q-Sepharose ou mono-Q Sepharase <ambos da Pharmacia) que foram equilibrados com tampSo fosfato de sódio 5ô mn pH 7,5 e depois eluidos com fosfata de sódio 5 mil contendo 1ΦΘ mM NsCl* A hirudina purificada foi obtida a partir da fracçâo eluida* EXEMPLOS C2í

Cl) Construção de fragmento contendo codSes de metionina substituído por codSes dg Isucina 10 μα de pnTAKHVl obtido nos EXEMPLOS Cl) foi digerido com 3® unidades de EcoRI e HindiII* A parte de adanilato—cinase — huridina foi isolada por electroforsss em gel de agsrose.

Por outro lado, i pg de faoo vsctor, pM13mp!9 foi digerido também com i® unidades de EcoRI e Hindi11 e o fragmento grande foi colhida do gel de agarose como se mostra na Fig» 1Θ» 0 fragmento grande e o fragmento codificador da adenilato-cinase -hirudina HV-l atrás referido reagiu com ligase de T4 a ló^C durante a noite* Realisou-se mutagénese dirigida através de um sistema de mutagénese in vit.ro com oligonucleotideo dirigido usando o vsctor plil3 atrás referido, M13AKHV codificador de

aden i1ato-cinass - hirudina HV-Í e moldes de DMA de cadeia siiTípIssM57-62 s n76Lqus foram sintetizados num sintetizador de DMA;, como ss mostra na Fio» li»

Assim5 obtsve~ss pMÍ3AKBvlMl com ambos os sítios do codSo metionina CATS) de 57 e 62 substituídos pela codâo ds isucina CCTS> s também pl113AI<HvlM2 em que o codSo 76 de metionina foi substituído par leucins ÍC-T8)» As sequências de DMA foram confirmadas pelo método didesoxi* Í2) Construção dos yectores de SKprsssSo pMTAKHV 1 li í, ptii AKHV1M2 e pMTAKHV1M5

Em seguida como se mostra na Fig= 12» as partes de adsnilato-cinass - hirudina que se formaram por digestão de PMa3AKHVIM1 ou pMÍ3AKHV!H2 com EcoRI e HindiII com as quais foi removida a parte de adenilato cinase - hirudina por digestão s pMTAKHVí foram combinados para construir pMTAKHVlMI ou pHTAKHV1M2 rss pec t i vaman ta»

Em seguida5 o fragmento grande obtido por digestão de pMTAKHVíMi com Pvuíl e Hindi II e o frag-menta pequeno obtido por digestão de pMTAKHV 1M2 com Pvu.II e Hindi I Iforam ligados para

construir pMTAKHViMó no qual os trfrs codSes metionina foram substituídos por leucina* A sequfncia de DNA foi confirmada* (3) Expressão ds hirudina

Escherichia col i Jrl ΪΘ9 foi transformada com pHTAKHVlrlE ou pHTAKHViM3s expressaram hirudina HV-Í como descrito no EXEM--PLDÍÍK Aquelas estirpes estio depositadas no Fermentation Research Instituis como depósito rã FERli BP-2988 e FERM BP-2989 respectivament* A expressão ds hirudina Hv-1 com pi1TAKHviiv!2 ou pMTAKHVíH3 apresentou um grau sesieíhants comparado com priTAKHvi respectivamente* Confirmou-se que a expressão de hirudina HV-i com pMTAKHVli’12 ou pM7AKHVlff3 diferiu da expressão de pflTAKHvl por nlo gerar hirudina tendo 5 resíduos de amincácidos extra no extremo M*

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES ΐ a μ/L, jf compreender 'fraosnsntos de DMA tís ume. rscsião do premotor tac ...., Df XueilS rspizcaçSo do piasmiaso puulfcíP 'coúa ssQirgncia cooiticafiora da adsniíato-cinass ? seau®neis i.Gui í ii.ador ώ oa lixr~Licixna d li sua variante a g \ι ^ s-s ~ s r c l s r .1.:.. a expressar uma proteína fundida da. hir udína ou SU*i tDQS QU p -S i “ T. S da adenila to cinsss porc *i p\ g n Vsctor ds s x pressão d a. hirudina dí reivindicação X Cai aC i»írrX xzado por ser designado r- ': vector ds &>i p r fôssSo d a hirudina d* rsivindicaçao 1 τ g-ir izado por ser designado po: 4ã - rigar* tor ds expressão da hirudina reivindicação 1 caractsr izado por ssr designado pM‘ — Vsctor ds expressão da H i r u Η *1 r> .~- di reivindicação •t t X C c« t ei L Έ id í" izado por ser IcíUi-í — 5«5‘ Hrí 6ê - Vsctor ds s);oressSo de. hirudina. as acorda com as acordo com acorda í_oni -rir om reivindicação 1 csracterizado por a totalidade ou par

   por outros aminoácidos diferentes de metionine· ue SC ΟΓΟ D C Οίΐΐ S reivindicação 6 caracterizado por ser designado por pHTAKHvili? Vscior de expressão da hirudin< âuOrOu Kjiii reivindicação 6 caracterizado oor ser designado por pntAKHVIM3 = 9â - Micraorganismo transformado caracterizado ρο-r ser obtido pela transducão do vector de acordo com gu-alguer uma das fa j. v ii í-u i.í.di.Ofc'5 « em Escnericnia coíi» 1®§ — Mi croor ganis-mo transformado carac ter içado por ser Ldo pela introdução da plasmideo oMAKHVl >1 i JM109 (FEKM uP-2537} de acordo com a reivindicação 9= caracterisado i ê obtido por introdução do plasmideo pnAKHV3 em Escherichit JM109 (FEKM tíH“2o..i95 de acordo com a reivindicação 9» 12â - Microorganismo transformado caracterizado por Ldeo onTAKHVl em Escherichia _ 5._ JU i _______ 4 u u «- jl u u pQ r x ntrodução do pia· υΗ1Θ9 CFEEM BP-2538) 0 0 £. C Ο ϊ~ O!

   !3â ~ Microorganismo fcransf orneado caracterizado par ssr obtido por introdução do plssmídeo pl1TAKHv3 em Eschsrichia coli JM109 (FERM BP-254€0 de acordo com a reivindicação 9 = 14â ~ Microorganismo transformado caracterizado por ssr obtido por introdução do plasmídeo pMTAKHVlH2 em Eschsrichia coli JMi®9 (FERM BP-29S8) ds acordo com a reivindicação 9« 15S -· Microorganismo transfarmado caracterizado por sor csbtido por introdução do plasmídeo pMTAKHV!M3 em Eschsrichia coli JM109 (FERM BP--298?) de acordo com a reivindicação 9 = 16§ - Método para a produção de hirudina? caracterizado por o microorganismo transformado ds acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15 ssr cultivado, a proteína ds fusão da hirudina ssr expressa e a hirudina ou uma sua variante ser recuperada por clivagem da proteína de fusão após extracção» 17ã - Método para a preparação de uma proteína de fusão da hirudina caracterizado pela combinação da totalidade ou parte ds uma adenilato-cinase porcina e hirudina ou sua variante» IBi- - Método para preparação de uma proteína de fusão da hirudina caractarlzsdo pela combinação da totalidade ou parte da adenilato-cinase porcina em que a totalidade ou parte dos

   --1 bL ! ϋΤϋϋϋΗΗΗ I UL ! bbHbfiHbD

   i 99®

   J. PEREIRA DA CRUZAgente Oficial da Propriedade Industriai RUA VICTOR CORDON, 10-A 3« 1200 LISBOA