JPH0584084A

JPH0584084A - マウス・インターロイキン−１産生プラスミド及びそれを用いたマウス・インターロイキン−１の製造法

Info

Publication number: JPH0584084A
Application number: JP4454091A
Authority: JP
Inventors: Tomoyuki Sako; 知行左古; Saeko Sawaki; 佐重子沢木; Makoto Owaki; 眞大脇
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1991-01-11
Filing date: 1991-01-11
Publication date: 1993-04-06

Abstract

(57)【要約】【目的】遺伝子組換え技術を用いて、高産生能を有す
るマウス・インターロイキン−１（以下、ＩＬ−１）産
生プラスミド及びマウス・ＩＬ−１の製造法を得ること
を目的とする。【構成】マウス・マクロファージより得たｃＤＮＡラ
イブラリーから、マウス・ＩＬ−１をコードするｃＤＮ
Ａ断片を挿入したクローンを選抜し、予め知られている
マウス・ＩＬ−１ｃＤＮＡの塩基配列を照らし合わせ
て、欠失部位に必要な塩基配列を挿入して前駆体ポリペ
プチドを産生する発現プラスミドを作成し、不要な塩基
配列を削除して成熟体ＩＬ−１ポリペプチドを産生する
発現プラスミドを得た。また、高産生能を有するプラス
ミドを得るため、転写活性の高いｔａｃプロモータをマ
ウス・ＩＬ−１ｃＤＮＡ断片の上流に備えたプラスミド
を得た。また更に、得られたプラスミドを宿主細菌に導
入して培養し、マウス・ＩＬ−１を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換え技術を用
いたマウス・インターロイキン−１産生プラスミド及び
それを用いたマウス・インターロイキン−１の製造法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−１（以下、ＩＬ−１
と記す）は1972年にゲリー（Gery）らによってヒト単球
培養上清中にマウス胸線細胞に対する増殖促進因子すな
わちリンパ球活性化因子（lymphocyte activating fact
or(LAF) ）として見出された(Gery,I.et al.: Potentia
tion of the T-lymphocyte response to mitogens.1.th
e responding cell.J.Exp.Med.,139:128,1972)。その後
ＩＬ−１の精製が進むにつれ、ＬＡＦ活性とは異なる生
物活性を持った内因性発熱因子（ＥＰ）、破骨細胞活性
因子がＩＬ−１と同一物質であることが判った。現在で
は、ＩＬ−１は単球・マクロファージのみならず、Ｂリ
ンパ球、上皮細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、線
維芽細胞、滑膜細胞等からも産生され、免疫，炎症，細
胞の増殖・分化の制御等幅広く生体反応に重要な役割を
果していることが判った。

【０００３】ＩＬ−１は動物種を問わず、分子量12,000
〜20,000の蛋白質であり、等電点で5.0と 7.0の２つに
分けられ、前者はα型、後者はβ型と呼ばれている。

【０００４】両者間のアミノ酸配列における相同性は３
０％以下で、α，βそれぞれの型の動物種間の相同性よ
りも非常に低いが、両者は同じＩＬ−１リセプターに結
合してその活性を発現し、機能的な相違はこれまでのと
ころ見出されていない。

【０００５】ところで、細胞質内でα型，β型とも約3
0,000の分子量の前駆体として翻訳され、ＩＬ−１αは
前駆体の形で成熟体と等しいＬＡＦ活性やレセプター結
合能を有すると考えられるが、ＩＬ−１β前駆体はいず
れの活性も示さない。これらの前駆体がどのように細胞
外に放出されるかは、未だに明らかにされていないが、
最終的にアミノ末端側の約半分が切断され、分子量約1
7,000の成熟体として細胞外へ遊離し活性を発現すると
考えられている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】例えばマウスの各種培
養細胞の研究分野で試験用試薬として重要なＩＬ−１α
及びβは、従来、マウスのマクロファージの培養細胞か
ら単離抽出する方法が知られているが、微量にしか得ら
れず、高価でありかつ需要に充分応えられないという欠
点があった。

【０００７】また、遺伝子組換え法による製造も試みら
れているが、産生能も低く実用的でない。

【０００８】本発明は、遺伝子組換え技術を用いて、高
産生能を有するマウス・ＩＬ−１産生プラスミド及びそ
れを用いたマウス・ＩＬ−１の製造法を得ることを目的
とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本請求項１に記載の発明
に係るマウス・ＩＬ−１産生プラスミドでは、マウス・
マクロファージ由来のマウス・ＩＬ−１ｃＤＮＡ断片を
備えたことを特徴とするものである。

【００１０】本請求項２に記載の発明に係るマウス・Ｉ
Ｌ−１産生プラスミドでは、前記マウス・ＩＬ−１ｃＤ
ＮＡ断片を成熟体又は前駆体マウス・ＩＬ−１αｃＤＮ
Ａ断片としたものである。

【００１１】本請求項３に記載の発明に係るマウス・Ｉ
Ｌ−１産生プラスミドでは、前記マウス・インターロイ
キン−１産生プラスミドが、ｓａｋ（スタフィロキナー
ゼ）産生遺伝子のリボゾーム結合部位及び翻訳開始コド
ンを前記ｃＤＮＡ断片の上流に備えたものである。

【００１２】更に、本請求項４に記載の発明に係るマウ
ス・ＩＬ−１産生プラスミドでは、前記マウス・インタ
ーロイキン−１αｃＤＮＡ断片を備えたマウス・インタ
ーロイキン−１産生プラスミドが、ｔａｃプロモータを
前記ｓａｋ遺伝子のリボゾーム結合部位及び翻訳開始コ
ドンとそれに続くｃＤＮＡ断片の上流に備えたものであ
る。

【００１３】更に詳細には、本請求項５に記載の発明に
係るマウス・ＩＬ−１産生プラスミドでは、前記マウス
・インターロイキン−１産生プラスミドが、ｔａｃプロ
モータを備えたpKK223-3の SmaＩ切断部位に前記ｓａｋ
遺伝子のリボゾーム結合部位及び翻訳開始コドンとそれ
に続く成熟体マウス・インターロイキン−１αｃＤＮＡ
断片を融合したＤＮＡ断片を挿入したマウス・ＩＬ−１
α産生プラスミドpTS2051 を開示するものである。

【００１４】また、本請求項６に記載の発明に係るマウ
ス・ＩＬ−１産生プラスミドでは、前記マウス・ＩＬ−
１ｃＤＮＡ断片を成熟体又は前駆体ＩＬ−１βｃＤＮＡ
断片としたものである。

【００１５】本請求項７に記載の発明に係るマウス・Ｉ
Ｌ−１産生プラスミドでは、前記マウス・インターロイ
キン−１ｃＤＮＡ断片が、ｓａｋ（スタフィロキナー
ゼ）遺伝子のリボゾーム結合部位及び翻訳開始コドンを
前記ｃＤＮＡ断片の上流に備えたものである。

【００１６】更に、本請求項８に記載の発明に係るマウ
ス・ＩＬ−１産生プラスミドでは、前記マウス・インタ
ーロイキン−１βｃＤＮＡ断片を備えたマウス・インタ
ーロイキン−１産生プラスミドが、ｔａｃプロモータを
前記ｓａｋ遺伝子のリボゾーム結合部位及び翻訳開始コ
ドンと前記ｃＤＮＡ断片との上流に備えたものである。

【００１７】更に詳細には、本請求項９に記載の発明に
係るマウス・ＩＬ−１産生プラスミドでは、前記マウス
・インターロイキン−１産生プラスミドがｔａｃプロモ
ータを備えたpKK223-3の SmaＩ切断部位に前記ｓａｋ遺
伝子のリボゾーム結合部位及び翻訳開始コドンと成熟体
マウス・インターロイキン−１βｃＤＮＡ断片を融合し
たＤＮＡ断片を挿入したマウス・ＩＬ−１β産生プラス
ミドpTS2058 を開示するものである。

【００１８】また、本請求項１０に記載の発明に係るマ
ウス・ＩＬ−１の製造法では、前記請求項１〜９のいず
れかに記載のマウス・ＩＬ−１産生プラスミドを宿主細
菌に導入し、組み換え体を取得し、該組換体を培養し
て、該培養液又は培養菌体よりマウス・ＩＬ−１（以
下、これをｒＩＬ−１と記す）を回収する方法である。

【００１９】

【作用】本発明においては、チオグリコレート投与によ
り腹腔内に浸出したマウス・マクロファージを分離し、
in vitroにおいてLC9018（Lactobacillus casei YIT901
8 の死菌）を添加して６時間培養した際に産生されるｍ
ＲＮＡから合成した相補鎖ＤＮＡ（以下、ｃＤＮＡと記
す）断片をλgt−１０ＤＮＡに挿入することよりｃＤＮ
Ａライブラリーを得た。

【００２０】更に本発明では、得られたｃＤＮＡライブ
ラリーから合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、
前駆体マウス・ＩＬ−１αをコードするｃＤＮＡ断片を
挿入したクローンを選抜した。この前駆体マウス・ＩＬ
−１αｃＤＮＡ断片をラムダファージＰ_R プロモータと
スタフィロキナーゼ遺伝子（以下ｓａｋ遺伝子）のプロ
モータ、リボゾーム結合部位、開始コドンとそのすぐ下
流にクローニング部位をもつ発現ベクターpTS566に挿入
し、予め知られているマウス・ＩＬ−１αｃＤＮＡの塩
基配列を照らし合わせて、欠失部位に必要な塩基配列を
部位特異的変異導入法により挿入してＩＬ−１α前駆体
ポリペプチドを産生する発現プラスミドを作成し、更に
前駆体マウスＩＬ−１αｃＤＮＡ断片をPst Ｉにより切
断して得られるフラグメントを前記pTS566に挿入し51塩
基を部位特異的変異導入法によって削除して成熟体ＩＬ
−１αポリペプチドを産生する発現プラスミドを得た。

【００２１】また更に、高産生能を有するプラスミドを
得るため、転写活性の高いｔａｃプロモータをマウス・
ＩＬ−１αｃＤＮＡ断片の上流に備えたプラスミドを得
た。このため、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β
−Ｄ−ガラクトシド）の添加によって高い転写活性を実
現し、高生産を実現した。具体的にｔａｃプロモータを
備えたpKK223-3の SmaＩ切断部位に成熟体ｓａｋ遺伝子
のリボゾーム結合部位と開始コドンを持つマウス・ＩＬ
−１αｃＤＮＡ断片を挿入したマウス・ＩＬ−１α産生
プラスミドpTS2051 を開示するものである。

【００２２】また別の発明でも同様に、上記ｃＤＮＡラ
イブラリーから、マウスＩＬ−１βｍＲＮＡの一部に相
補的な合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、マウ
ス・ＩＬ−１βｃＤＮＡ断片を持つクローンを選抜し
た。

【００２３】更に、このマウス・ＩＬ−１βｃＤＮＡ断
片をpTS566に挿入し、ｓａｋ遺伝子との融合部位にある
余分なアミノ酸残基をコードする配列を部位特異的変異
導入法によって削除してＩＬ−１β前駆体ポリペプチド
をコードする発現プラスミドを得た。また同様に、得ら
れた前駆体マウス・ＩＬ−１βｃＤＮＡ断片を切断し
て、成熟体ＩＬ−１βをコードする断片を分離し、これ
をpTS566に挿入した。このプラスミドから不要な塩基対
を部位特異的変異導入法によって削除して成熟体ＩＬ−
１βポリペプチドを産生する発現プラスミドを得た。

【００２４】また更に、高産生能を有するプラスミドを
得るため、転写活性の高いｔａｃプロモータをマウス・
ＩＬ−１βｃＤＮＡ断片の上流に備えたプラスミドを得
た。このため、ＩＰＴＧの添加によって高い転写活性を
実現し、高生産を実現した。具体的にｔａｃプロモータ
を備えたpKK223-3の SmaＩ切断部位に成熟体マウス・Ｉ
Ｌ−１βｃＤＮＡ断片を挿入したマウス・ＩＬ−１β産
生プラスミドpTS2058を開示するものである。

【００２５】また、前記請求項１〜９のいずれかに記載
のマウス・ＩＬ−１産生プラスミドを宿主細菌に導入
し、該組み換え体細菌を培養して、該培養液又は培養菌
体よりマウス・ＩＬ−１を回収して、マウス・ＩＬ−１
を製造するため、高生産を実現できる。更に好ましく
は、組み換え体細菌を培養する際に、マウス・ＩＬ−１
βｃＤＮＡ断片と同じ遺伝子上に存在するプロモータを
有効に発現させるための操作を行う。例えば、λファー
ジのＰ_R プロモータであれば、組み換え体細胞を対数増
殖期まで培養した後に、培養温度を42℃に上昇すること
によりＰ_R プロモーターの発現を促す手段を講じる。ま
た、ｔａｃプロモータであれば、同じく組み換え体細胞
を対数増殖期まで培養した後に、培地中にＩＰＴＧを添
加してｔａｃプロモータの発現を促す手段を講じる。

【００２６】尚、マウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β産生プ
ラスミドｐＴＳ２０５１及びｐＴＳ２０５８は大腸菌に
形質転換し、微工研菌寄第１１９３０号及び１１９３１
号として寄託済みである。

【００２７】

【実施例】Ｉ．マウス・ＩＬ−１α １．ｃＤＮＡライブラリーの作製マウス・マクロファージ（以下、Ｍφと記す）にLC9018
処理を行い、Ｍφを刺激して産生するｍＲＮＡ（ポリA⁺
ＲＮＡ）から、ｃＤＮＡライブラリーを得る。

【００２８】［ＲＮＡの調製］ＢＡＬＢ／ｃマウス♂ 2
0 匹にチオグリコレート培地（ＴＧＣ）を１ml/mouseで
腹腔内に投与し、４日後に４×10⁸ の腹腔浸出細胞を得
た。これを、５×10⁶/ml，10 ml/dishでまき、１時間培
養後、洗浄して、未付着細胞を除いてから、LC9018を50
μg/mlの濃度で含む培地を加えて６時間培養することに
よってＭφを刺激した（ＬＣ処理）のち、ＭφをＰＢＳ
で３回洗浄し、２mlの４Ｍグアニジニウムイソチオシア
ネート混液（4Mグアニジニウムイソチオシアネート、0.
1M Tris-HCl pH7.6 、0.02M ＥＤＴＡ）を加えて、細胞
を溶解させた。細胞溶解液をチューブに集め、グアニジ
ニウム／ホットフェノール法（Maniatisら:Molecularcl
oning:a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laora
tory,1982 ）によってＲＮＡを抽出、分離した。これを
500μl の水で溶解し、ＲＮase 阻害剤ＲＮasinを500
ユニット/ml となるように加え、−70℃で保存した。濃
度は約6.4mg/mlであった。

【００２９】［PolyA⁺ＲＮＡの調製］ＬＣ処理ＭφのＲ
ＮＡ 640μg を常法(Maniatis ら、先述）に従いにオリ
ゴ-dT-セルロース・カラムにかけてポリA⁺ＲＮＡを集め
た。但し、カラムに対する非特異的吸着を出来るだけ減
らすために、ＬＣ処理ＭφのＲＮＡをカラムにかける前
に、カラムに対してｔＲＮＡもしくはｒＲＮＡを吸着用
バッファーに溶解したものを用いて、吸着及び溶出の操
作を行った後、再び吸着用バッファーで平衡化したもの
を用いた。得られたポリA⁺ＲＮＡの収量は、40μg で、
収率は6.25％であった。

【００３０】［ＩＬ−１ｍＲＮＡの検出］全ＲＮＡ及
び、PolyA⁺ＲＮＡを１Ｍグリオキサール，50％ジメチル
スルホキシド、10mMリン酸Ｎa(pH7.0)を含む溶液中で50
℃60分間インキュベートしたのち、１％アガロースによ
るアガロースゲル電気泳動にかけ、ノーザン・ブロット
法(Thomas,P,S.(1980)Proc.Natl.Acod.Sci,USA 77;520
1) によって、ＩＬ−１ｍＲＮＡの存在を確認した。ポ
リA⁺ＲＮＡ中にもＩＬ−１ｍＲＮＡが存在し、また、ｒ
ＲＮＡの混入はわずかに認められたのみだった。

【００３１】［ｃＤＮＡの合成］ポリA⁺ＲＮＡ５μg
を用いて、アマシャム（Amersham）社のｃＤＮＡ合成キ
ット付属のマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。合
成したｃＤＮＡにEcoRＩリンカーを結合した後、セファ
ロースＣＬ−４Ｂ，或いは，バイオゲルＡ５０ｍ(100-2
00mesh) を用いてＤＮＡのサイズによって分画した。１
kb以上の画分を集めベクターとの結合にもちいた。

【００３２】［組換え体ファージ粒子の作製］EcoRＩ処
理したｃＤＮＡとEcoRＩ処理及びアルカリ性フォスファ
ターゼ処理したλｇｔ−１０ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガー
ゼで結合したのち、プロメガ・バイオテック（Promega
Biotec）社のパッケージング・システムを用いてファー
ジ粒子を作製した。ｃＤＮＡ断片を取り込んだファージ
粒子の数は、E.coli hflA をインジケータ・セルとした
プラーク数の測定によって計測した。結果として、４×
10⁶ pfu の組換え体ファージが得られた。

【００３３】２．ＩＬ−１遺伝子のクローニングＬＣ処理ＭφｃＤＮＡライブラリーより、合成オリゴヌ
クレオチドをプローブにしてＩＬ−１αのクローンの選
抜を行ない、前記組換え体ファージからクローンを得
て、挿入されたｃＤＮＡのサイズ、制限酵素による切断
箇所等を検討し、その中から、ロメディコ(Lomedico)ら
が報告している（Lomedico,P.A.et al.:Cloning and ex
pression of murine interleukin-1 cDNA in Escherich
ia coli.Nature,312:458,1984 ）1961bpのマウス・ＩＬ
−１αのｃＤＮＡと相同なクローンを得る。尚、ＤＮＡ
塩基配列の決定は、Ｍ１３ベクター系のｐＵＣ１１９ベ
クターを用いたジデオキシチェインターミネーション法
によって決定し、ＤＮＡの切断、結合、コンピテント細
胞への導入、プラスミドＤＮＡの精製等は、通常の方法
によって行った。

【００３４】［ＩＬ−１αクローンの選抜］λgt−１０
組換え体ファージ（ＬＣ処理Ｍφ ｃＤＮＡライブラリ
ー）を２×10⁴ pfu/13.5cmシャーレに展延したプレート
を20枚作製し、総数４×10⁵ pfu のファージからプラー
クハイブリダイゼーションにより27個の陽性プラークを
拾いあげ、スポットハイブリダイゼーションによって９
個の陽性プラーク（ No.２，４，７，10，12，13，19，
25，26）の存在を確認し、これらについて更に単プラー
ク分離(single plaque isolation) を行なった。

【００３５】［ｃＤＮＡのサイズの測定］９個の陽性ク
ローン（I-21,41,71,101,121,131,191,251, 261 ）の各
ファージから抽出したＤＮＡをEcoRＩで切断してから、
電気泳動法により、挿入されたｃＤＮＡのサイズを測定
した。１クローン（I-131 ）は約２kb、６クローン（I-
21,41,101,121,191,251 ）は約1.3kb であった（残り２
クローン、I-71,261は不明）。また、I-101,121 の２ク
ローンは挿入フラグメント中にEcoRＩによる切断箇所が
１箇所あり、約1.3kb と 100bpの２本のバンドに分れ
た。

【００３６】［各クローンの相互関係の検討］I-131 と
I-121 を³²Ｐでラベルしてプローブを作製し、サザン・
ハイブリダイゼーション（Southern Hybridization）法
により、各クローンの相互関係を検討した。I-131 はI-
21,41,131,191,251,261 と強く結合したが、I-71,101,1
21とはハイブリダイズしなかった。

【００３７】［クローンI-131 の切断部位の検討］クロ
ーンI-131 から分離した約２kbのEcoRＩ断片を大腸菌プ
ラスミドpUC119にサブクローニングし、ｃＤＮＡ断片を
持つ組換えプラスミドを調製した後、 HpaII， PstＩ，
NdeＩ， DraＩ， Sau3AＩの５種の制限酵素による切断
箇所の検討をおこなった。I-131 は全長1910−1920bp、
HpaIIの切断点から5'側に 200bp伸びたフラグメントで
あることが判明した。

【００３８】［クローンI-131 の全塩基配列］ＩＬ−１
αの合成オリゴヌクレオチドプローブで選抜したクロー
ンの中の最大のサイズのクローンであるI-131 は、制限
酵素 PstＩ， PvuII， HpaII， DraＩ等の切断点を持
ち、ロメディコらの報告のマウス・ＩＬ−１αｃＤＮＡ
クローン同様のシークエンスを持っていると考えられた
ので、ジデオキシチェーンターミネーション法により全
塩基配列を決定した。

【００３９】I-131 は、5'末端からAAGGTTで始まり、3'
末端側に21個のポリＡテールをもつ全長1928塩基対のｃ
ＤＮＡであった。既報のＩＬ−１αの塩基配列と比較す
ると、5'側の57塩基対（オープン・リーディング・フレ
ーム(Open Reading Frame)の７塩基対ATGGCCA を含む）
を欠失し、オープン・リーディング・フレーム内で１
個、3'側の非翻訳領域(Franking Frame)内で12個、ロメ
ディコらの報告にあるＩＬ−１αｃＤＮＡと塩基が異な
っていた。しかし、オープン・リーディング・フレーム
内の１個の塩基の変異は、GAC →GAT で、アミノ酸はい
ずれもAsp となり、アミノ酸のシークエンスとしては既
報のＩＬ−１αと完全に一致した。

【００４０】３．ＩＬ−１αの大腸菌における発現系の
構築マウス前駆体及び成熟体ＩＬ−１αの大腸菌における高
発現プラスミドの構築を行った。すなわち、クローンI-
131 のｃＤＮＡおよび、このｃＤＮＡを制限酵素Pst Ｉ
で切断したフラグメントを、λファージのＰ_Rプロモー
タ、ｓａｋ遺伝子のＳ−Ｄ配列及び開始コドンを持つベ
クターにつなぎ、欠失しているアミノ酸Met-Ala-Lys を
加えた天然型ＩＬ−１α前駆体ポリペプチド、及び Pst
Ｉフラグメントの5'側から51塩基対を除いた成熟体ＩＬ
−１αポリペプチドをコードするＤＮＡを持つ発現プラ
スミドを、部位特異的変異導入(site-directed mutagen
esis) 法を用いて作製する。

【００４１】［発現プラスミドの作製］図１はアミノ末
端にわずかに変異を持つ前駆体ＩＬ−１α蛋白をコード
する発現プラスミドpIL1-27 の作成を示す工程図、図２
は完全な前駆体ＩＬ−１αをコードする発現プラスミド
pIL1-274の模式図である。

【００４２】マウス・ＩＬ−１αは、 270個のアミノ酸
残基からなる前駆体として翻訳されるが，翻訳後Ｎ末端
から 105番目のSer の前で切られて成熟体ＩＬ−１αと
して分泌されると考えられている。

【００４３】シークエンシングの結果、I-131 は、前駆
体ＩＬ−１αをコードするｃＤＮＡと考えられたが、開
始コドンATG を含んで７塩基対を欠失していることが判
ったので、第１図に示す通り、先ずこのＩＬ−１αｃＤ
ＮＡのほぼ全領域を含む断片をｓａｋ遺伝子のＳ−Ｄ配
列（リボゾーム結合部位）及び開始コドンを持ち、λフ
ァージのＰ_R プロモータによって高発現が可能な発現ベ
クターpTS566（第４図）の SalＩサイトに繋ぎpIL1-27
を作製し、次に合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特
異的変異導入法(Iino,T.,Takahashi,M.and Sako,T. Rol
e of amino-terminal positive charge on signal pept
ide in Staphylokinase export acrossthe cytoploasmi
c membrane of Escherichia coli. J.Biol.Chem.,262,7
412-7417,1987.)により不要なアミノ酸を除き、欠失し
ているアミノ酸Ala-Lys を加えた完全なＩＬ−１α前駆
体蛋白をコードする発現プラスミドpIL1-274を作った。

【００４４】［ＩＬ−１α活性の測定］図３はpIL1-274
を持つ大腸菌ＨＢ１０１が産生する前駆体ｒＩＬ−１α
の活性を測定した結果を示す線図であり、該組換え大腸
菌細胞を５mlの 100μg/mlアンピシリン（Ａｐ）を含む
ＬＢ培地に、約10⁷cells/ml となるように接種し、30℃
で培養した。約５×10⁷cells/ml になった時点で42℃に
移し、更に３時間培養した。その培養液から0.5 mlを取
って10,000 rpmで３分間遠心し、集めた菌体の培地を除
くためにＳバッファーで１回洗った。菌体を20％sucros
e/10mM Tris-HClpH8.0/30mM NaCl/10mM EDTA 90μl に
懸濁し、５mg/ml リゾチ−ム５μl を加えて、氷水浴と
EtOH−ドライアイスバスに交互につけてfreezing-thawi
ngを３回繰り返した。その後アストラソン超音波細胞破
砕機により20秒間処理し、15,000×g ５分間遠心したも
のの上澄みを活性測定試料とした。

【００４５】この試料をＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの胸腺細
胞に対する増殖促進作用をGeryらの方法によって(Gery
et al,1972 J.Exp.Med.139;128) 測定してＩＬ−１の活
性の有無を検討した。

【００４６】この結果、pIL1-274を持つ大腸菌ＨＢ１０
１は42℃で培養した時に比較的高いＩＬ−１活性を示
し、前駆体ｒＩＬ−１αを産生していることが判かっ
た。この株は30℃においてもわずかに前駆体ｒＩＬ−１
αを産生しているが、これは発現ベクターpTS566にはλ
ファージのＰ_R プロモータ以外にｓａｋ遺伝子のプロモ
ータがあり、これが30℃においても転写活性を持ってい
るためと考えられる。

【００４７】［種々の成熟体ｒＩＬ−１α発現プラスミ
ドの構築］ (1) pTS2027及びpTS2028 図４は発現プラスミドpTS2027 及びpTS2028 の構築を示
す工程図である。図に示したpTS566プラスミドは、ｃＩ
₈₅₇ 遺伝子とＰ_R プロモータとを持つ蛋白質高発現用の
プラスミドでpBR322プラスミドの一部と前記ｃＩ₈₅₇ 遺
伝子とＰ_R プロモータ及びｃｒｏ遺伝子の一部を含む断
片とを結合したpTS160のBamHＩ切断点に、前述したｓａ
ｋ遺伝子のプロモータ、Ｓ−Ｄ配列、及び開始コドンか
ら２アミノ酸残基をコードするＤＮＡ断片を挿入したも
のである。

【００４８】このpTS566プラスミドの PstＩ切断点にＩ
Ｌ−１αをコードする1.7kb PstＩ断片をpIL1-27 プラ
スミドより切り出して挿入してpTS2013 を得た。

【００４９】しかしこの状態ではｓａｋの開始コドンと
ＩＬ−１αが同一フレーム中で結合していないためＩＬ
−１αの発現はない。そこで、合成オリゴヌクレオチド
を用いた部位特異的変異導入法により欠失変異を導入し
て完全な成熟体型ＩＬ−１αの配列が読まれるようなプ
ラスミドを構築することを試みた。

【００５０】なお、部位特異的変異導入法は、次のよう
にして行った。BamHｌと XbaＩで切断し、子牛小腸アル
カリ性フォスファターゼで処理したpTS160と、 PvuＩで
切断し、子牛小腸アルカリ性フォスファターゼで処理し
たpTS2013 またはpTS2027 を各0.1 μg 、リン酸化した
合成オリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマ
ー）0.05μg を6.5mM Tris-HCl pH7.5/100mM NaCl/8 mM
MgCl₂/l mM２−メルカプトエタノールを含む緩衝液に入
れ、３分間沸騰水中に置いた後、37℃に20分、室温に20
分、４℃に20分、そして０℃に10分順次起き、その反応
液にクレノウ・フラグメント（Klenow fragment ）１ユ
ニットとＴ４リガーゼ 300ユニットを加えて、12℃で２
〜15時間インキュベートした。

【００５１】この反応液を用いてＨＢ101 をトランスフ
ォームし、アンピシリン耐性を示すコロニーを選択し
た。生育したコロニーをコロニー／プラークスクリーン
（ＮＥＮ社製）に転写し、上述したプライマーをプロー
ブにしてハイブリダイゼーションを行なった。フィルタ
ーの洗浄には２×ＳＳＣ／0.5％ＳＤＳを用いて40〜45
℃で行なった。

【００５２】以上のような部位特異的変異導入法を行っ
たが、pTS2013にはＮ末端に余分なアミノ酸残基が20個
ついており、これを一度に全部欠失することはできなか
った。そこで、まず別のプライマーを用いて、不要部分
を一部取り除いて、８個の余分な残基をコードする中間
体（pTS2027 ）を分離した。更に、得られたpTS2027か
ら余分の８残基を本来のプライマーを用いて取り除いた
プラスミドpTS2028 を構築した。

【００５３】［ｒＩＬ−１α蛋白質の検出と活性］pTS2
027 をもつＨＢ１０１から溶菌液を調整しＩＬ−１活性
を測定した（溶菌液の調整法は前述の［ＩＬ−１α活性
の測定］を参照）。図５に示すように、42℃のサンプル
は 2700 倍の希釈の後もまだ高い活性を示していた。こ
のＨＢ１０１(pTS2027) の菌体蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで解析したところ、予想される約20ｋＤａのバンドが
42℃に培養したものにのみ顕著に認められた（図示せ
ず）。活性の強さから考えて恐らくこのバンドがｒＩＬ
−１α蛋白質と考えられる。一方、pTS2028 を持つＨＢ
１０１から調整した溶菌液のＩＬ−１活性はpTS2027 を
持つＨＢ１０１からのそれと比較して約1/5 と低く、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによっても明らかに同定できるバンドは
認めることができなかった。

【００５４】４．ｒＩＬ−１α成熟体蛋白質の生産条件ｒＩＬ−１α成熟体蛋白質を高生産する発現プラスミド
ＨＢ１０１(pTS2027)を培養してｒＩＬ−１α成熟体蛋
白質を生産する条件について検討する。

【００５５】尚、成熟体ｒＩＬ−１αを合成する組換え
体ＨＢ１０１(pTS2027) は、−80℃に凍結保存し、使用
の前日からＬＢ培地（１% Bacto-tryptone/0.5% Bacto-
yeast extract/0.5% NaCl,pH 7.0) 中で30℃で一夜培養
した。Ｍ９合成培地は１リットル中に、6g Na₂HPO₄/3g
KH₂PO₄/0.5g NaCl/1g NH₄Cl/2mM MgSO₄/2mg thimine/0.
4% sugarを含み、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）はレムリの
方法(Laemmli,U.K.(1970),Nature277;680) の系を用い
た。

【００５６】経時的な変化を見るためにサンプリングし
た菌には、等量の10％トリクロロ酢酸を加えて混合し、
０℃で１時間静置し、15,000 rpm５分間の遠心で沈殿物
を集め、これを冷アセトンで１回洗浄した後に乾燥し、
適当量のサンプルバッファーを加えて３分間煮沸するこ
とにより溶解し、ゲルにかけた。細胞を分画したサンプ
ルでは、その一部を等量の２×サンプルバッファーと混
合し、３分間煮沸した後、ゲルにかけた。電気泳動後の
ゲルはクマシーブリリアントブルーＲで染色した。

【００５７】［栄養状態の変化に対する影響］pTS2027
上のＩＬ−１α遺伝子は成熟体領域とそのアミノ末端側
に前駆体領域に由来する８アミノ酸残基と開始コドンに
由来するチメオニン残基がついた蛋白質をコードしてい
る。この遺伝子の発現は、λファージＰ_R プロモータと
ｃＩ₈₅ ₇ リプレッサーによって制御されており、高温
（通常は42℃を用いる）で誘発される。そこで、ＨＢ１
０１(pTS2027) を誘発した後、栄養状態を変えたときに
ｒＩＬ−１αの合成にどのように影響するかを調べた。

【００５８】まず、菌を完全培地であるＬＢ培地（１%
Bacto-tryptone/0.5% Bacto-yeastexyract/0.5% NaCl)
または１％カザミノ酸と0.4%グルコースを含むＭ９合成
培地に生育させ、ｒＩＬ−１αの合成をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって見たとき、ＬＢ培地を用いたときの方が明ら
かに多量のｒＩＬ−１α蛋白質を合成した。

【００５９】次に、ＬＢ培地をベースにして、グルコー
スまたは酵母エキスの添加がｒＩＬ−１αの合成に及ぼ
す影響を調べた。ＬＢ培地または0.2%グルコースを添加
したＬＢ培地で対数増加増殖期にまで生育させたＨＢ１
０１(pTS2027) を42℃に移して培養を続け、１，２，
３，４時間後にＬＢ培地のものには10％酵母エキスを0.
2 ml、グルコースを添加したＬＢ培地のものには25％グ
ルコースを0.08mlを各々添加して、８時間までその増殖
を追うと共にサンプリングを行ない、ｒＩＬ−１α蛋白
質の蓄積を調べた。

【００６０】図６はＨＢ１０１(pTS2027) の増殖を示す
線図、図７は図６の各時間におけるｒＩＬ−１α蛋白質
の量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの模式図である。図６に示
すように、大腸菌の増殖はグルコース添加培地のものは
初期には著しいが、３時間目以降ほとんど増殖を停止す
ることがわかる。一方、酵母エキス添加培地のものは７
時間を過ぎても増殖が認められ、最終的にグルコース添
加培地のものに比べて約２倍の濁度をしめすにいたっ
た。また、図７に示す通り、各時間におけるｒＩＬ−１
α蛋白質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ、酵母
エキス添加培地での蓄積量が明らかに多いことが示され
た。この実験では徐々に酵母エキスを添加したが、42℃
に移す時点または培養開始点で終濃度１％となるように
加えた場合でもほぼ同程度の生産量を示した（データは
省略）。

【００６１】以上のことから、ｒＩＬ−１αの生産条件
として、ＨＢ１０１(pTS2027) を1%Bacto-Tryptone/1%
Bacto-Yeast extract/0.5% NaClを含む培地（これをＬ
ＢＲ培地と呼ぶ）で30℃で対数増殖中期まで増殖させ、
42℃に移して更に６〜８時間培養をした後に集菌するこ
ととした。

【００６２】一方、大腸菌で高生産された異種生物の蛋
白質はしばしば凝集物（封入体ともいう）となって不溶
化することが知られている。ＨＢ１０１(pTS2027) が産
生したｒＩＬ−１α蛋白質がどうなっているかを調べる
ために、細胞を遠心により分画した。ＬＢＲ培地中42℃
で８時間培養した培養液８mlから菌体を遠心によって集
め、１mlの50mM Tris-HCl(pH8.0)/50mM NaCl/1mM EDTA/
1mM PMSFに懸濁した。超音波処理により菌体を破砕し
（画分Ｉ）、微量遠心機で10,000 rpm５分間の遠心を行
なって上清（画分II）と沈殿とに分けた。沈殿は上記緩
衝液で懸濁して総量１mlとした（画分III ）。上清は更
に卓上型超遠心機で40,000 rpm（100,000×g)１時間の
遠心によって上清（画分IV）と沈殿に分けた。沈殿は上
記緩衝液に懸濁して総量１mlとした（画分Ｖ）。各画分
の10μをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたのちクマシーブル−
染色して、ｒＩＬ−１α蛋白質の分布をみた。

【００６３】図８はその結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの
模式図である。図に示すように、ｒＩＬ−１α蛋白質の
多くは画分IVに認められ、大腸菌菌体中で可溶化した状
態で存在することが強く示唆された。尚、図中Ｍは分子
量マーカである。

【００６４】ＨＢ１０１(pTS2027) が産生するｒＩＬ−
１α蛋白質は42℃で培養することによって顕著に認めら
れるようになった。その産生には、ここで用いたＬＢＲ
培地のようなより栄養価の高い培地が良いと思われる。

【００６５】５．ｒＩＬ−１αの発現系の改良とその精
製前述のように、λファージＰ_R プロモータを用いたプラ
スミドでｒＩＬ−１α蛋白質を発現させることができた
が、より効率のよい発現系を得るため、ｔａｃプロモー
タを用いたマウスｒＩＬ−１αの発現系を構築し、ｒＩ
Ｌ−１α蛋白質を精製し、活性化する。

【００６６】［高発現系の構築］ｔａｃプロモータは人
工的につくられたプロモータで、通常はラクトースオペ
ロンのリプレッサー LacＩによってその発現が抑えられ
ているが、ＩＰＴＧの添加によって、強い転写活性を示
すことが知られている。この発現系を用いれば、ｒＩＬ
−１αについても高発現が期待される。

【００６７】図９はｔａｃプロモータを有するベクター
pKK223-3の制限酵素地図である。前述のpTS2027 及びpT
S2028 上のリボゾーム結合部位からＩＬ−１αにいたる
領域をこのプロモータを持つベクターpKK223-3に挿入し
た。詳しくは、pTS2027 及びpTS2028 からBamHＩと Bgl
IIで切り出されるそれぞれ1.9kb と1.3kb のＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動で精製し、両末端を平滑端に
したのちにpKK223-3のSmaＩサイトに挿入した。ｔａｃ
プロモータからの転写により正しく転写されるものを選
択し、pTS2027 由来のものをpTS2049 及びpTS2028 由来
のものをpTS2051 とした。両プラスミドは、 LacＩを多
量に産生する宿主菌ＪＭ１０９株に導入して以後の解析
に用いた。

【００６８】各プラスミドを持つＪＭ１０９株をアンピ
シリン（ 100μg/ml）を含むＬＢ培地に培養し、対数増
殖期に半量ずつにＩＰＴＧを終濃度１mMとなるように加
え、更に４時間培養した。

【００６９】各培養液から溶菌液を調製して、その蛋白
質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、そのＩＬ−１活性を胸
腺細胞の増殖を指標にして調べた。

【００７０】図１０は得られた菌蛋白質のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ泳動図、図１１はＩＬ−１活性を示す線図である。
図１０に示すように両株ともＩＰＴＧを添加したときに
のみpTS2049 では18Ｋの、pTS2051 では17Ｋの強いバン
ドが認められ、ｒＩＬ−１αであると思われた。図１１
に示した溶菌液のＩＬ−１活性は非常に高く、10⁵ 希釈
後も活性を持っていた。またＪＭ１０９（pTS2051 ）の
溶菌液の方が、ＪＭ１０９（pTS2049 ）の溶菌液よりも
約４倍の活性を持っていた。この活性の違いは、必ずし
も定量的ではないが、図１０でみられる蛋白質量を反映
していると考えられた。このことは、ｔａｃプロモータ
を用いた発現系では、完全な成熟体型ｒＩＬ−１αの発
現が著しく上昇したことを示している。

【００７１】６．ｒＩＬ−１αの精製［ｒＩＬ−１αの精製］ｔａｃプロモータによる発現系
で、ｒＩＬ−１αの合成を行なった。ＪＭ１０９（pTS2
051 ）をアンピシリン（ 100μg ／ml）を含むＬＢＲ培
地に一夜培養し、翌朝 2.7リットル（ 900ml×３）のア
ンピシリンを含むＬＢＲ培地に27mlの一夜培養液を植菌
した。これを37℃で２時間振盪培養し、ＩＰＴＧを終濃
度0.5mMとなるように加えた。更に、５時間培養した後
に、菌体を遠心によって集めた。集めた菌体は一度ＴＥ
緩衝液で洗浄した後に、30％ショ糖/15mM Tris-HCl(pH
8.0)/45mM NaCl/1.5m EDTA 溶液20mlに懸濁した。

【００７２】図１２はｒＩＬ−１αの精製のステップの
概略を示す工程図である。先ず、10mg／mlリゾチームを
0.6 ml加えて凍結と融解を３回繰り返し、超音波処理す
ることによって菌体を破砕した。この溶菌液を100,000
×g,60分間の超遠心にかけて、細胞残渣を除去した。し
かし、この操作によって約半分のｒＩＬ−１αの蛋白質
が、細胞残渣とともに沈殿した（図１５レーン３）。

【００７３】この沈殿物はより低速（10,000×g)の遠心
によっても生じ、恐らく蛋白質がアグリゲート（集塊）
を形成しているためと思われたが、以後の精製には用い
なかった。超遠心によって得られた上澄み液（ 136ml）
には34mlの0.2Mクエン酸緩衝液（pH3.4)を加え、室温で
15分間攪拌した後、7,000×g,10分間遠心をして沈殿物を
除去した。このような酸処理はクロンハイム(Kronheim)
らがヒト組み換え型ＩＬ−１αの精製に用いて(Kronhei
m,SR.,et al.(1986)Biotechnology 4 ;1078-1082) 、よ
い成績を残しており、我々の結果も満足できるものであ
った（図１５レーン４）。上澄み液には硫酸アンモニウ
ムを70％飽和までいれて、蛋白質を沈殿させ、沈殿物を
少量のＴＥに溶かした後、ＴＥに対して透析した。

【００７４】得られた試料(13.5 ml) をＴＥで平衡化し
たＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（1.6 ×30
cm）にのせ、０−0.3M NaCl 直線濃度勾配で溶出した。
図１３はＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムでの
溶出パターンを示した線図である。フラクション37−38
にかけて見られるピークがｒＩＬ−１α蛋白質を含むピ
ークで、のせた試料中には夾雑蛋白質が非常に少ないこ
とがわかる。フラクション36−39を集め、これに終濃度
１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、次の疎水ク
ロマトグラフィーのための試料とした。

【００７５】図１４は疎水クロマトクラフィーでの溶出
パターンを示した線図である。疎水クロマトクラフィー
では、フェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（1.5×3
0cm）を用い、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＥで平衡
化した同カラムに上の試料をのせ、１−０Ｍ硫酸アンモ
ニウム直線濃度勾配によって溶出した。図１４に示す通
り、疎水クロマトグラフィーでは、ｒＩＬ−１α蛋白質
は広い硫酸アンモニウムの濃度範囲で溶出した。この幅
広いピーク（フラクション４０〜９５）を４つの画分に
分けた。速く溶出するものから画分Ｉ（フラクション４
５〜７５），画分II（フラクション７６〜８２），画分
III （フラクション８３〜８８），画分IV（フラクショ
ン８９〜９５）とした。各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る解析の結果（図示せず）、わずかづつではあるが、そ
れぞれに夾雑蛋白質が認められた。

【００７６】しかし、これらを更にＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂカラムを用いて再クロマトグラフィーを
行なった結果、夾雑蛋白質をほぼ除去することができた
（データは省略、図１５レーン８参照）得られたそれぞ
れの画分Ｉ^*,画分II^*,画分III ^*,画分IV^* は、総量8.58
mg,6.9mg,8.1mg,7mgのｒＩＬ−１α蛋白質を含んでい
た。図１５には各ステップごとの蛋白質のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥでの解析結果を示してある。画分III ^* のｒＩＬ−
１α蛋白質についてプロテインシークェンサーを用いて
アミノ末端からのアミノ酸配列を解析した。

【００７７】その結果、解析に使用した量に比して検出
されたピークは小さかったが、NH₂-Ser-Ala-Pro-Tyr-X-
Tyr-Gln-Ser-Asp-Leu-X-Tyr-Lys-Ley （Ｘは不明）の配
列が解読でき、アミノ末端のホルミルMet がはずれて天
然型の成熟体型ＩＬ−１αと同じ配列をしている分子種
の存在が確認された。他の画分についても同じ結果が得
られた。しかし、検出されたピークが予想よりもはるか
に小さかったことから、これらの試料中の大部分のｒＩ
Ｌ−１α蛋白質はそのアミノ末端にホルミルMet 残基を
つけたまま存在していることが示唆される。

【００７８】［精製したｒＩＬ−１α蛋白質の活性］精
製したｒＩＬ−１α蛋白質標品には、夾雑物はわずかし
か含まれないと思われる。図１６は精製したｒＩＬ−１
α蛋白質標品のＩＬ−１α活性の結果を示す線図であ
る。この曲線から画分III ^* のｒＩＬ−１αの比活性
は、約2.5 ×10⁷units/mg protein と計算され、天然型
ＩＬ−１αの比活性約10⁸ units/mg proteinの約1/4 と
低い、また、最大活性値も期待される値よりもかなり低
いところにとどまっていた。

【００７９】以上の結果は、一次構造が天然型ＩＬ−１
αと同一であるｒＩＬ−１α蛋白質の高次構造が、天然
型ＩＬ−１αの高次構造と何らかの点で異なっているこ
とを示唆している。

【００８０】そこで、画分III ^* の標品に尿素を加えて
６Ｍの濃度にした後、ＴＥに対して充分に透析を行なっ
て再活性化したものについて、そのＩＬ−１活性を測定
した。これは尿素によって、一旦完全に変性した蛋白質
を透析によって徐々に尿素を除くことによって、穏やか
にフォールディングを起こさせ、天然型ＩＬ−１αの高
次構造と同様の構造にすることを目的としている。

【００８１】その結果、尿素処理した標品は、しないも
のに比べて４倍の比活性の上昇が認められ、10⁸units/m
g を示した。この値は、天然型ＩＬ−１αと同程度の値
であり、ほぼ完全な活性化ができたものと思われる。し
かし、最大活性値の上昇は認められず、マクロファージ
の培養液とｒＩＬ−１αとの増殖促進作用には、なお質
的な違いがあることが示唆される。

【００８２】II．マウス・ＩＬ−１βｃＤＮＡ１．ＩＬ−１βｃＤＮＡクローンの分離前述のように、マウス・ＩＬ−１αｃＤＮＡクローンを
分離し、大腸菌においてその蛋白質を発現させる系を構
築したが、ＩＬ−１αと同様の活性を有する因子として
ＩＬ−１βと呼ばれる蛋白質も知られている。

【００８３】ＩＬ−１αとＩＬ−１βとは、分子量や全
体的な構造的特徴については似ているが、アミノ酸配列
上の相同性は比較的低く（30％程度のアミノ酸残基が共
通）、等電点や抗原性が異なっている。ＩＬ−１βｍ
ＲＮＡは、ＩＬ−１αと同様LC9018で活性化されたマウ
ス・Ｍφで合成が誘導される。また、マウス・ＩＬ−１
βｃＤＮＡの配列はグレイ(Gray)らによって既に報告さ
れている(Gray,P.W.etal.:Two interleukin 1 genes in
the mouse:Cloning and expression of thecDNA for m
urine interleukin 1 β.J.Immunol.,137:3644,1986)。
そこで、報告されているマウス・ＩＬ−１βｃＤＮＡ配
列の一部を合成したオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、LC9018（Lactobacillus casei YIT9018 の死菌）で
活性化されたマウスＭφ由来ｃＤＮＡライブラリーより
ＩＬ−１βｃＤＮＡクローンの分離を試みる。

【００８４】［ＩＬ−１βｃＤＮＡクローンの分離］LC
9018処理したマウス・Ｍφから抽出分離したｍＲＮＡよ
り作成したλｇｔ−１０ｃＤＮＡライブラリーより、マ
ウス・ＩＬ−１βの合成オリゴヌクレオチドプローブを
用いて、ｃＤＮＡクローンを分離することを試みた。総
数1.8 ×10⁵pfu についてプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行なった結果、陽性を示したクローンが12クロー
ン分離された。この分離の頻度は、先に分離したＩＬ−
１αｃＤＮＡクローンの分離頻度に比して同程度または
それ以下であり、LC9018で活性化されたマウス・Ｍφで
は、ＩＬ−１αｍＲＮＡの合成がＩＬ−１βｍＲＮＡの
合成と同程度かまたはより盛んに起こっていることを示
唆する。

【００８５】これらのクローンのインサートの大きさを
サザンハイブリダイゼーションによって調べたところ、
No.12（約1.8kb), No.18（約1.0kb)及び No.22（約
１.0kb) にプローブとハイブリダイズする比較的長いイ
ンサートが検出された。そこでNo.12と No.18のインサ
ートについてそのＤＮＡ塩基配列を調べた。

【００８６】［クローンの塩基配列の決定］No.12と N
o.18から、制限酵素EcoRＩで切断した1.8kb 断片と1.0k
b 断片を分離精製し、EcoRＩで切断したpUC119ベクター
に再クローニングすることによって、両断片について相
異なる方向に挿入されたプラスミドを得た。これらのＤ
ＮＡ塩基配列をジデオキシチェーンターミネーション法
を用いて、決定した。まず No.12のＤＮＡ断片の両端か
ら、それぞれ 115ヌクレオチド、 639ヌクレオチドを解
読した。しかし、これらの配列は、既に報告されている
ＩＬ−１βｃＤＮＡの塩基配列との間に有意な相同性が
なく、ＤＮＡデータバンクの中の他の既知の配列とも相
同性は見出されなかった。

【００８７】以上のことは、クローン No.12がＩＬ−１
βｃＤＮＡの一部をプローブとしたサザンハイブリダイ
ゼーションによってＩＬ−１βｃＤＮＡクローン（下の
No.18）とほぼ同程度の強いシグナルを示したことか
ら、配列未決定の領域内にＩＬ−１βｃＤＮＡと高い相
同性を持つ部分が存在すると考えられる。

【００８８】次に No.18のＤＮＡ断片についてその全塩
基配列を決定し、その結果このＤＮＡ断片が全長約 900
bpからなり、既に報告されているマウス・ＩＬ−１βｃ
ＤＮＡの3'末端側配列とほぼ完全に一致することが明ら
かとなった。このクローンは成熟体ＩＬ−１β蛋白質の
アミノ末端から５番目のアミノ酸から始まるカルボキシ
ル末端側 147個のアミノ酸をコードする領域を持ち、3'
側非翻訳領域約 380bp塩基対がそれに続いていた。蛋白
をコードする領域内では塩基番号 125番の一塩基欠失以
外は、既知の配列と全く異なる点がなかったが、3'側非
翻訳領域内に３塩基の欠失と２塩基の付加が存在した。
125番目の塩基の欠失により、得られたｃＤＮＡからは
ＩＬ−１βのコードする領域内でフレームシフトを起こ
し、正常な蛋白質は合成できないことがわかるが、この
欠失がどの時点で入ったものなのかは不明である。

【００８９】また、グレイらによって既に報告されてい
るように、マウス・ＩＬ−１βのｍＲＮＡはおよそ1,40
0 ヌクレオチドの長さであるので、今回得たクローンの
上流にはまだ更に 500ヌクレオチド以上の部分が残され
ていることになる。そこで、全領域を含むｃＤＮＡクロ
ーンの分離を No.18のＤＮＡ断片をプローブにして試み
た。

【００９０】［完全なＩＬ−１βｃＤＮＡクローン分
離］ＭφｃＤＮＡライブラリーより、ＩＬ−１βｃＤＮ
Ａであるクローン No.18の0.9kb 断片ＤＮＡをプローブ
として、ＩＬ−１βをコードする領域全体を含み、且つ
その領域内に置換、欠失等の変異を持たないｃＤＮＡク
ローンを分離することを試みた。総数1.8 ×10⁵ pfu に
ついてプラークハイブリダイゼーションを行なった結
果、陽性を示したクローンが15クローン分離された。こ
れらのクローンのインサートの大きさをサザンハイブリ
ダイゼーションによって調べたところ、No.1411,1613,1
812( 約1.5kb)， No.813,1213,1311,1713(約1.4kb), N
o.611(約950bp) No.211(約900bp)にプローブとハイブリ
ダイズする長いインサートが検出された。

【００９１】この分離頻度は最初に合成オリゴヌクレオ
チドプローブを用いて分離したときの頻度に比べて高
く、また得られた陽性クローンのインサートの長さも長
いものが多かった。その要因としては長いＤＮＡ断片を
プローブとして用いたことによって、ハイブリダイゼー
ションが陽性のクローンの選択が容易で確実であったこ
とが挙げられる。しかし、このステップは必須のもので
はなく、合成プローブを用いても充分に長いｃＤＮＡク
ローンを分離することは可能である。

【００９２】得られた陽性のクローンのうち比較的長い
インサートを持つものは、大きさから分けると上記のよ
うに４種類に分けられたが、もとのライブラリーは一度
増殖させたものであるので、起源の同じ相同なクローン
が含まれている可能性がある。これらのクローンのいく
つかについて、ＤＮＡ塩基配列を決定した。

【００９３】［塩基配列の決定］上記λファージクロー
ンのＤＮＡを、制限酵素EcoRＩで切断して生成する1.5k
b(1411,1812,),1.4kb(813,1213,1713),950bp(611) 及び
900bp(211)断片を分離精製し、EcoRＩで切断したpUC119
ベクターに再クローニングした。それぞれ得られた組換
えプラスミドのインサートのＤＮＡ塩基配列をジデオキ
シチェーンターミネーション法を用いて決定した。

【００９４】その結果、 No. 813と No.1713は全長1330
bpよりなる全く同じインサートをもつクローンであり、
ＩＬ−１βをコードする領域を全部含んでいることがわ
かった。またグレイらが報告したマウスＩＬ−１βｃＤ
ＮＡの塩基配列とも、非翻訳領域に数カ所の違いはある
ものの、翻訳領域内は完全に一致した。

【００９５】配列番号１は No.813,1713の全塩基配列で
ある。塩基配列を決定した他のクローンのインサートの
うち No. 211は、前述の No.18クローンと全く同じであ
り、翻訳領域内に一塩基の欠失があった。また、 No. 6
11は図１７にあるように 341番目の塩基から以降を持つ
941bpの長さのインサートを持っていた。 No.1213は全
領域を含むクローンであったが、 469番目の塩基対Ａ：
Ｔが欠失していた。 No.1411と No.1812は全く同一のク
ローンで、3'末端側半分はＩＬ−１βｃＤＮＡの配列を
持っていたが、5'末端側半分はまったく異なる配列をし
ていた。どこまでがＩＬ−１βの配列かは明確ではなか
ったが、恐らくクローニングの際に結合してできたもの
であろうと考えられる。

【００９６】このように、これまで分離したいくつかの
ＩＬ−１βｃＤＮＡクローンは、互いに独立な５種類の
群に分けられたが、このうち２種類のものには、一塩基
の欠失がみられ、正常なＩＬ−１βを合成できないもの
であった。これが、ｍＲＮＡへの転写段階で起きていた
ものか、あるいはｃＤＮＡ調製の時の人工産物なのかは
興味あるが、それを決定することは容易ではない。

【００９７】２．マウス・ＩＬ−１βｃＤＮＡの発現系
の構築［ラムダＰ_R プロモータを用いた発現系］図１７は発現
プラスミドpTS2059 及びpTS2058 の構築を示す工程図で
ある。pTS566（Ｉ−４．マウス成熟体ＩＬ−１αの発現
系の構築）のSalＩ切断点に、 No.813 ＤＮＡを制限酵
素HindIIIで切断して生じる1.35kb断片を挿入してpTS20
53 を構築した。このプラスミドでは、ｓａｋ遺伝子の
開始コドンがリンカー及び5'非翻訳領域を介してフレー
ム内で前駆体と連結している。しかし、アミノ末端側に
余分な16個のアミノ酸残基をコードする配列がついてい
るので、部位特異的変異導入法によりこの部分を除去
し、完全な前駆体ＩＬ−１βをコードするpTS2056 を構
築した。

【００９８】一方、成熟体ＩＬ−１βの発現系について
も、以下のようにして構築した。前駆体ＩＬ−１βと同
様に、pTS566の SalＩ切断点に、 No.813 を制限酵素Bs
pMＩで切断して生じる 985bpの断片を挿入してpTS2052
を構築した。このプラスミドでは、まだ開始コドンと成
熟体ＩＬ−１β領域の間に15塩基対の余分な配列が入っ
ているので、これを更に部位特異的変異導入法によって
除去し、開始コドンのすぐ下流にin frame（インフレー
ム）に完全な成熟体ＩＬ−１β領域を結合したpTS2054
を構築した。

【００９９】上記のようにして得たpTS2056 またはpTS2
054 を持つＨＢ１０１株を用いて、それらの作るｒＩＬ
−１β蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＩＬ−１活性を
測定することによって検出することを試みた。

【０１００】図１８は得られた組換え体の菌体蛋白質の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を示す模式図である。
ａ図において、ａはＰ_R プロモータを用いた発現系で、
前駆体ｒＩＬ−１βを産生するＨＢ１０１(pTS2056) 及
び成熟体ｒＩＬ−１βを産生するＨＢ１０１(pTS2054)
をアンピシリンを含むＬＢ培地中で30℃で対数増殖期に
あるものと、更に培養温度を42℃に移し、42℃で４時間
培養した後、全菌体タンパクを解析したもの。図中矢印
で示すバンドが約18kDa の成熟体ｒＩＬ−１β蛋白質で
ある。

【０１０１】ＨＢ１０１(pTS2054) の試料では、42℃で
培養したときにのみ、約18 KDaの蛋白質の強いバンドが
認められ、その大きさから成熟体ｒＩＬ−１βであると
判断された。

【０１０２】それに対し、ＨＢ１０１(pTS2056) の試料
では、予想される31 KDaの大きさのところには、42℃で
の培養に特異的なバンドを見出すことはできなかった。
また、両者の溶菌液を調整し、そのＩＬ−１活性を測定
したところＨＢ１０１(pTS2056) 由来の試料は18,000un
tis/mlの高い活性を示したが、ＨＢ１０１(pTS2056)由
来の試料には、約300units/ml の活性しかなかった（図
１９）。

【０１０３】これらの結果はプロモータ、リボゾーム結
合部位、及びその他のプラスミドの構造が全く同一であ
っても、発現される遺伝子の違いによって、その発現量
が違いうることを示している。また従来ＩＬ−１βの前
駆体型には活性が無いとされていたが、今回わずかなが
らも活性が検出されたことは、低い比活性ながら前駆体
も活性を有していることを示唆している。

【０１０４】［ｔａｃプロモータを用いた発現系］ラム
ダＰ_R プロモータを用いた発現系では、成熟体ｒＩＬ−
１β蛋白質の高発現が可能になったが、更に高い発現が
望まれる。また前駆体ｒＩＬ−１βの発現はこの系では
うまくいかなかった。そこで、ベクターをｔａｃプロモ
ータを持つpKK223-3に変えて、ｒＩＬ−１α蛋白質と同
様な高い発現量を得ることを試みた。

【０１０５】pTS2056 及びpTS2054 を制限酵素 DdeＩで
切断することにより、リボゾーム結合部位からＩＬ−１
βをコードする領域までを全部含む1.1kb 及び0.7kb の
断片をそれぞれ分離することができる。これらをpKK223
-3の SmaＩ切断点に挿入することによって、ｔａｃプロ
モータの制御下に前駆体及び成熟体ＩＬ−１βのｃＤＮ
ＡをおいたプラスミドpTS2059 及びpTS2058を構築した
（図１７）。

【０１０６】これらのプラスミドそれぞれをＪＭ１０９
に導入した株ＪＭ１０９(pTS2059)及びＪＭ１０９(pTS2
058) をアンピシリンを含むＬＢ培地で37℃で培養し、
対数増殖期にＩＰＴＧを0.5mMとなるように加えて、更
に４時間培養した。その後、上記のように上清画分と沈
殿画分とにわけ、蛋白質の検出とＩＬ−１活性の測定を
行なった。

【０１０７】図１８ｂに示すように、ＪＭ１０９(pTS20
58) の上清画分には約18 KDaの成熟体ｒＩＬ−１βと思
われる蛋白質が顕著に蓄積しているのが観察された。注
目されるのは、ＩＰＴＧを添加しないで培養した試料に
もこの蛋白質の蓄積が同程度にみられることで、リプレ
ッサーＬａｃＩによる発現の抑制がほとんどきかなくな
ったと考えられた。このことはＩＬ−１活性の測定によ
って確認され、ＪＭ１０９(pTS2058) 由来の試料では、
ＩＰＴＧの添加の別なく、45,000-50,000units/ml と高
い活性を示した（図１９）。この活性値は先にラムダＰ
_R プロモータを用いて構築した発現系による場合よりも
約３倍高く、ｔａｃプロモータを用いた発現系の方が優
れていることを示している。

【０１０８】一方、ＪＭ１０９(pTS2059) から調製した
試料の蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるパターンから
は、前駆体と同定されるバンドは検出されなかった（図
１８ｃ）。またＩＬ−１活性も1200unit/ml とＰ_R プロ
モータを用いたときよりも増加したが、成熟体ｒＩＬ−
１βに比べると著しく低かった。（図１９）

【０１０９】以上の結果、各発現系についてのＩＬ−１
活性の発現量をまとめたものが第１表である。これまで
に構築したＩＬ−１βの発現系の中では、ｔａｃプロモ
ータを用いた成熟体ｒＩＬ−１β蛋白質の生産を達成す
ることができた。一般にラムダＰ_R プロモータを用いた
系よりもｔａｃプロモータを用いた系の方が高い生産性
を得ることができるようである。しかし、前駆体ｒＩＬ
−１βのようにプロモータの種類によらず低い発現でと
どまっているものも存在する。

【０１１０】

【表１】

【０１１１】３．マウスｒＩＬ−１β蛋白質の精製マウス・ｒＩＬ−１β蛋白質を精製する。精製は大きく
分けて、酸処理、Ｓ−セファロースＦＦとＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂのカラムクロマトグラフィーの３
段階からなり、ほぼ純粋なｒＩＬ−１β蛋白質を得るこ
とを目的とする。

【０１１２】［粗抽出液の分離］図２０はｒＩＬ−１β
蛋白質精製の手順を示す工程図である。2.7 リットルの
アンピシリン（ 100μl/ml) を含むＬＢＲ培地に27mlの
ＨＢ１０１(pTS2054) 一夜培養菌液を接種し、37℃で７
時間振とう培養した。

【０１１３】培養後菌体を集め、20mlの30％ショ糖/15m
MTris-HCl(pH8.0)/45mM NaCl に懸濁し、0.6 mlの10mg/
mg リゾチームを加えて -80℃で凍結した。これを融解
してブランソン（Branson ）社製超音波細胞破砕装置
（Sonifier) で菌体を破砕し、40mlの水と70μl の１mg
DNaseＩを加えて37℃で10分間インキュベートした後に
20,000×ｇで30分遠心した。こうして得た溶菌液を粗抽
出液として、精製に用いた。

【０１１４】［精製］図２０の手順に示す通り、まず、
粗抽出液から細胞膜等の不溶物を取り除くために、100,0
00×ｇ90分の超遠心を行ない、その上澄み液を分離し
た。残渣にはｒＩＬ−１β蛋白質はわずかしか検出され
なかった。このことは、ｒＩＬ−１β蛋白質はｒＩＬ−
１α蛋白質と異なり、細胞内でほぼ可溶化した状態で存
在していることを示唆している。次に上澄み液（57ml）
に６mlの0.2Mクエン酸緩衝液（pH4.0)を加え室温で20分
攪拌した。その結果、溶液が白濁して多量の不溶物が析
出した。10,000×10分の遠心で不溶物を除去し、その液
に75％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて全蛋
白質を集め、20mlの10mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8)
を溶かした。

【０１１５】これを次のクロマトグラフィーのために、
10mMクエン酸緩衝液（pH4.8)に対して透析した。その結
果、再び沈殿物が多量に析出してきたために、遠心によ
ってこれを除去した。以上までの過程の中で、pH4.0 の
クエン酸緩衝液の添加及びpH4.8 のクエン酸緩衝液に対
する透析によって析出した沈殿物には、多量のｒＩＬ−
１β蛋白質が含まれていることが判明した（図２２レー
ン４と６）。ゲルの染色像から判断する限り、40−50％
のｒＩＬ−１β蛋白質が沈殿として失われたと考えら
れ、これらの損失を防ぐ方法を検討する必要があること
を示している。

【０１１６】上記透析後の上清み液は、Ｓ−セファロー
スＦＦカラムクロマトグラフィーにかけた。10mMクエン
酸緩衝液（pH4.8)で平衡化したＳ−セファロースＦＦカ
ラム（2.6 ×20cm）に試料をのせ、０−0.5 Ｍ NaCl 直
線濃度勾配（総量４40ml）で溶出した。図２１はカラム
クロマトグラフィーの溶出パターンの結果を示す線図で
ある。

【０１１７】ｒＩＬ−１β蛋白質は約0.4M NaCl のとこ
ろにピークを作って溶出してきた。事実、このピークの
画分には高いＩＬ−１活性が検出された。この領域の画
分を集めて75％飽和硫酸アンモニウムによる塩析で濃縮
し、２mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8)に対して透析し
た。この透析液に１Ｍ Tris-HCl(pH8)及び0.25M EDTA
（pH8)をそれぞれ10mM, １mMとなるように加えてＤＥＡ
Ｅ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィー
にかけた。

【０１１８】ＴＥで平衡化したＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂカラム（1.6 ×30cm）に試料を載せ、ＴＥカ
ラムを洗浄したところ、素通り画分からしばらくの後に
蛋白質のなだらかなピークが現われた。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで解析したところ、このピークにあるのがｒＩＬ−１
β蛋白質であり、他の夾雑蛋白質はこの中にはほとんど
認められなかった。ｒＩＬ−１β蛋白質は、このカラム
を完全に素通りするのではないが、非常に弱い相互作用
しかしないものと思われる。

【０１１９】およそ0.05Ｍ NaCl 濃度のところまでにす
べてのｒＩＬ−１βが溶出したので、その部分を集めて
精製標品とした。精製ｒＩＬ−１βは総量 820μg であ
った。これまでの各精製ステップでの標品をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで解析したものが図２２である。図２２レーン８
に示すように最終精製標品には夾雑蛋白質は検出されな
かった。

【０１２０】［ＩＬ−１活性］図２３は精製したｒＩＬ
−１β蛋白質を用いてＩＬ−１活性を測定した結果を示
す線図である。ｒＩＬ−１βは、ｒＩＬ−１αに比べて
比活性が低く、このグラフから約８×10⁶ units/mg pro
teinと計算された。

【０１２１】この値は天然型ＩＬ−１βの約1/10であ
る。ｒＩＬ−１αでもそうであったように、大腸菌で合
成されたｒＩＬ−１βは天然型のものとその高次構造が
異なっている可能性がある。また、ヒトＩＬ−１βの場
合、Ｎ末端数残基のアミノ酸残基がその活性や安定性に
重要な働きをしていることが示されている。今回精製し
たｒＩＬ−１β蛋白質のＮ末端からのアミノ酸配列はNH
₂-Met-Asp-Val-Pro-Ile-Arg-Gln-His-Try-…と少なくと
も18番目までＤＮＡ配列から予想される配列と一致した
結果が得られ、Ｎ末端にはMet-残基が付いたままであっ
た。このことから大腸菌で合成された場合に、本来なら
ついていないＮ末端のMet-残基がその活性に影響してい
る可能性も考えられる。

【０１２２】

【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、遺伝子組
換え技術を用いて、高産生能を有するマウス・ＩＬ−１
産生プラスミド及びそれを用いたマウス・ＩＬ−１の製
造法を得ることができる。

【０１２３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１３３０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直線状配列の種類：complementary DNA 配列の特徴存在位置：70..879 特徴を決定した方法：Ｓ配列 TCGAGGCCTA ATAGGCTCAT CTGGGATCCT CTCCAGCCAA GCTTCCTTGT GCAAGTGTCT 60 GAAGCAGCT ATG GCA ACT GTT CCT GAA CTC AAC TGT GAA ATG CCA CCT 108 Met Ala Thr Val Pro Glu Leu Asn Cys Glu Met Pro Pro 1 5 10 TTT GAC AGT GAT GAG AAT GAC CTG TTC TTT GAA GTT GAC GGA CCC CAA 156 Phe Asp Ser Asp Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Gln 15 20 25 AAG ATG AAG GGC TGC TTC CAA ACC TTT GAC CTG GGC TGT CCA GAT GAG 204 Lys Met Lys Gly Cys Phe Gln Thr Phe Asp Leu Gly Cys Pro Asp Glu 30 35 40 45 AGC ATC CAG CTT CAA ATC TCA CAG CAG CAC ATC AAC AAG AGC TTC AGG 252 Ser Ile Gln Leu Gln Ile Ser Gln Gln His Ile Asn Lys Ser Phe Arg 50 55 60 CAG GCA GTA TCA CTC ATT GTG GCT GTG GAG AAG CTG TGG CAG CTA CCT 300 Gln Ala Val Ser Leu Ile Val Ala Val Glu Lys Leu Trp Gln Leu Pro 65 70 75 GTG TCT TTC CCG TGG ACC TTC CAG GAT GAG GAC ATG AGC ACC TTC TTT 348 Val Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gln Asp Glu Asp Met Ser Thr Phe Phe 80 85 90 TCC TTC ATC TTT GAA GAA GAG CCC ATC CTC TGT GAC TCA TGG GAT GAT 396 Ser Phe Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Leu Cys Asp Ser Trp Asp Asp 95 100 105 GAT GAT AAC CTG CTG GTG TGT GAC GTT CCC ATT AGA CAG CTG CAC TAC 444 Asp Asp Asn Leu Leu Val Cys Asp Val Pro Ile Arg Gln Leu His Tyr 110 115 120 125 AGG CTC CGA GAT GAA CAA CAA AAA AGC CTC GTG CTG TCG GAC CCA TAT 492 Arg Leu Arg Asp Glu Gln Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser Asp Pro Tyr 130 135 140 GAG CTG AAA GCT CTC CAC CTC AAT GGA CAG AAT ATC AAC CAA CAA GTG 540 Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Asn Gly Gln Asn Ile Asn Gln Gln Val 145 150 155 ATA TTC TCC ATG AGC TTT GTA CAA GGA GAA CCA AGC AAC GAC AAA ATA 588 Ile Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Pro Ser Asn Asp Lys Ile 160 165 170 CCT GTG GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT CTA TAC CTG TCC TGT GTA 636 Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val 175 180 185 ATG AAA GAC GGC ACA CCC ACC CTG CAG CTG GAG AGT GTG GAT CCC AAG 684 Met Lys Asp Gly Thr Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys 190 198 200 205 CAA TAC CCA AAG AAG AAG ATG GAA AAG CGG TTT GTC TTC AAC AAG ATA 732 Gln Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile 210 215 220 GAA GTC AAG AGC AAA GTG GAG TTT GAG TCT GCA GAG TTC CCC AAC TGG 780 Glu Val Lys Ser Lys Val Glu Phe Glu Ser Ala Glu Phe Pro Asn Trp 225 230 235 TAC ATC AGC ACC TCA CAA GCA GAG CAC AAG CCT GTC TTC CTG GGA AAC 828 Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu His Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn 240 245 250 AAC AGT GGT CAG GAC ATA ATT GAC TTC ACC ATG GAA TCT GTG TCT TCC 876 Asn Ser Gly Gln Asp Ile Ile Asp Phe Thr Met Glu Ser Val Ser Ser 255 260 265 TAA AGTATGGGCT GGACTGTTTC TAATGCCTTC CCCAGGGCAT GTGAAGGAGC 929 *** 270 TCCCTTGTCA TGAATGAGCA GACAGCTCAA TCTCTAGGAC ACTCCTTAGT CCTCGGCCAA 989 GACAGGTCGC TCAGGGTCAC AAGAAACCAT GGCACATTCT GTTCAAAGAG AGCCTGTGTT 1049 TTCCTCCTTG CCTCTGATGG GCAACCACTT ACCTATTTAT TTATGTATTT ATTGATTGGT 1109 TGATCTATTT AAGTTGATTC AAGGGGACAT TAGGCAGCAC TCTCTAGAAC AGAACCTAGC 1169 TGTCAACGTG TGGGGGATGA ATTGGTCATA GCCTGCACTG AGGTCTTTCA TTGAAGCTGA 1229 GAATAAATAG GTTCCTATAA TATGGATGAG AATTTTTATG AATGAAGCAC AGACACTTGC 1289 TTTGATGAGT ATGAAATAAA TTTCATTAAA ACAAACAAAC A 1330

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｎ末端にわずかな変異を持つ前駆体ＩＬ−１α
蛋白質をコードする発現プラスミドpIL1-27 の作成を示
す工程図である。

【図２】完全な前駆体ＩＬ−１αをコードする発現プラ
スミドpIL1-274の模式図である。

【図３】前駆体及び成熟体ＩＬ−１αの活性を測定した
結果を示す線図である。

【図４】発現プラスミドpTS2027 及びpTS2028 の構築を
示す工程図である。

【図５】pTS2027 をもつ大腸菌ＨＢ１０１が産生するｒ
ＩＬ−１α蛋白質の活性を示す線図である。

【図６】ＨＢ１０１（pTS2027 ）の増殖を示す線図であ
る。

【図７】図６の各時間におけるｒＩＬ−１α蛋白質の量
を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの模式図である。

【図８】ＨＢ１０１（pTS2027 ）の細胞抽出液を幾つか
の画分に分けた時の各画分中の蛋白質の量を示すＳＤＳ
−ＰＡＧＥの模式図である。

【図９】ｔａｃプロモータを有するベクターpKK223-3の
制限酵素地図である。

【図１０】発現プラスミドを持つ大腸菌ＪＭ１０９より
得られた蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図である。

【図１１】pTS2049 及びpTS2051 のＩＬ−１活性を示す
線図である。

【図１２】ｒＩＬ−１αの精製のステップの概略を示す
工程図である。

【図１３】ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムで
の溶出パターンを示した線図である。

【図１４】疎水クロマトクラフィーでの溶出パターンを
示した線図である。

【図１５】各ステップごとの蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示す模式図である。

【図１６】精製したｒＩＬ−１α蛋白質標品のＩＬ−１
活性の結果を示す線図である。

【図１７】発現プラスミドpTS2059 及びpTS2058 の構築
を示す工程図である。

【図１８】得られた組換え体の菌体蛋白質のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる解析結果を示す模式図であり、ａはＰ_R プ
ロモータを用いた発現系、ｂはｔａｃプロモータを用い
た発現系(pTS2058) 、ｃはｔａｃプロモータを用いた発
現系(pTS2059) である。

【図１９】各プラスミドが産生するｒＩＬ−１βの活性
を示す線図である。

【図２０】ｒＩＬ−１βの精製のステップの概略を示す
工程図である。

【図２１】カラムクロマトグラフィーの溶出パターンの
結果を示す線図である。

【図２２】各精製段階での蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの
結果を示す模式図である。

【図２３】精製したｒＩＬ−１β蛋白質を用いてＩＬ−
１活性を測定した結果を示す線図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マウス・マクロファージ由来のマウス・
インターロイキン−１ｃＤＮＡ断片を備えたことを特徴
とするマウス・インターロイキン−１産生プラスミド。
【請求項２】前記マウス・インターロイキン−１ｃＤ
ＮＡ断片を成熟体又は前駆体マウス・インターロイキン
−１αｃＤＮＡ断片としたことを特徴とする請求項１に
記載のマウス・インターロイキン−１産生プラスミド。
【請求項３】前記マウス・インターロイキン−１産生
プラスミドが、ｓａｋ（スタフィロキナーゼ）産生遺伝
子のリボゾーム結合部位及び翻訳開始コドンを前記ｃＤ
ＮＡ断片の上流に備えたことを特徴とする請求項１又は
２に記載のマウスインターロイキン−１産生プラスミ
ド。
【請求項４】前記マウス・インターロイキン−１αｃ
ＤＮＡ断片を備えたマウス・インターロイキン−１産生
プラスミドが、ｔａｃプロモータを前記ｓａｋ遺伝子の
リボゾーム結合部位及び翻訳開始コドンとそれに続くｃ
ＤＮＡ断片の上流に備えたことを特徴とする請求項２又
は３に記載のマウス・インターロイキン−１産生プラス
ミド。
【請求項５】前記マウス・インターロイキン−１産生
プラスミドが、ｔａｃプロモータを備えたpKK223-3の S
maＩ切断部位に前記ｓａｋ遺伝子のリボゾーム結合部位
及び翻訳開始コドンとそれに続く成熟体マウス・インタ
ーロイキン−１αｃＤＮＡ断片を融合したＤＮＡ断片を
挿入したことを特徴とするマウス・インターロイキン−
１α産生プラスミドpTS2051 。
【請求項６】前記マウス・インターロイキン−１ｃＤ
ＮＡ断片を成熟体又は前駆体インターロイキン−１βｃ
ＤＮＡ断片としたことを特徴とする請求項１に記載のマ
ウス・インターロイキン−１産生プラスミド。
【請求項７】前記マウス・インターロイキン−１ｃＤ
ＮＡ断片が、ｓａｋ（スタフィロキナーゼ）遺伝子のリ
ボゾーム結合部位及び翻訳開始コドンを前記ｃＤＮＡ断
片の上流に備えたことを特徴とする請求項６に記載のマ
ウス・インターロイキン−１産生プラスミド。
【請求項８】前記マウス・インターロイキン−１βｃ
ＤＮＡ断片を備えたマウス・インターロイキン−１産生
プラスミドが、ｔａｃプロモータを前記ｓａｋ遺伝子の
リボゾーム結合部位及び翻訳開始コドンと前記ｃＤＮＡ
断片との上流に備えたことを特徴とする請求項６又は７
に記載のマウス・インターロイキン−１産生プラスミ
ド。
【請求項９】前記マウス・インターロイキン−１産生
プラスミドがｔａｃプロモータを備えたpKK223-3の Sma
Ｉ切断部位に前記ｓａｋ遺伝子のリボゾーム結合部位及
び翻訳開始コドンと成熟体マウス・インターロイキン−
１βｃＤＮＡ断片を融合したＤＮＡ断片を挿入したこと
を特徴とするマウス・インターロイキン−１β産生プラ
スミドpTS2058 。
【請求項１０】前記請求項１〜９のいずれかに記載の
マウス・インターロイキン−１産生プラスミドを宿主細
菌に導入し、該宿主細菌を培養して、該培養液又は培養
菌体よりマウス・インターロイキン−１を回収すること
を特徴とするマウス・インターロイキン−１の製造法。