DK164283B - Polypeptid med cystatin c aktivitet, dna-sekvens til udtrykkelse af 3-des-oh-cystatin c eller en modifikation deraf, fremgangsmaade til fremstilling af 3-des-hydroxy-cystatin c eller en modifikation deraf, plasmid og mikroorganisme til udoevelse af fremgangsmaaden og anvendelse af 3-des-oh-cystatin c eller en modifikation deraf til fremstilling af et terapeutisk praeparat - Google Patents

Description

DK 164283 B

Den foreliggende opfindelse angår et polypeptid med cystatin C aktivitet og en DNA-sekvens til udtrykkelse af 3-des-OH-cystatin C eller en modifikation deraf. Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af 5 3-des-hydroxy-cystatin C eller en modifikation deraf samt et plasmid og en mikroorganisme til udøvelse af fremgangsmåden. Endelig angår opfindelsen anvendelsen af 3-des-OH-cystatin C eller en modifikation deraf til fremstilling af et terapeutisk præparat.

10

Det omhandlede 3-des-OH-cystatin C er et protein med 120 aminosyrer.

Aminosyresekvensen er følgende: 15

Ser-Ser-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Leu-Val-Gly-Gly-Pro-Met-Asp-Ala-Ser-Val-Glu-Glu-Glu-Gly-Val-Arg-Arg-Ala-Leu-Asp-Phe-Ala-Val-Gly-Glu-Tyr-Asn-Lys-Ala-Ser-Asn-Asp-Met-Tyr-Mis-Ser-Arg-Ala-Leu-Gln-Val-Val-Arg-Ala-Arg-Lys-Gln-Ile-20 Val-Ala-Gly-Val-Asn-Tyr-Phe-Leu-Asp-Val-Glu-Leu-Gly-Arg-

Thr-Thr-Cys-Thr-Lys-Thr-Gln-Pro-Asn-Leu-Asp-Asn-Cys-Pro-Phe-His-Asp-Gln-Pro-Mis-Leu-Lys-Arg-Lys-Ala-Phe-Cys-Ser-Phe-Gln-ile-Tyr-Ala-Val-Pro-Trp-Gln-Gly-Thr-Met-Thr-Leu-Ser-Lys-Ser-Thr-Cys-Gln-Asp-Ala 25

Nativt humant cystatin C, der er isoleret fra urin og renset, er kendt, og aminosyresekvensen er bestemt (1) efter fragmentering af polypeptidkæden ved dels cyanogen-bromid-behandling dels trypsinspaltning. Ved bestemmelsen 30 blev det konstateret, at aminosyren i position 3 (Pro) er hydroxyleret i en grad på omkring 50%, men noget varierende. Cystatin C består således af to næsten lige store og meget nær ens komponenter, hvoraf den ene er hydroxyleret i position 3 (Pro) medens den anden (3-des-OH-35 cystatin) ikke er det. Dette forhold har hidtil ikke været tillagt nogen betydning, og cystatin C har derfor været brugt og studeret i den kendte form.

DK 164283 B

2

Ifølge den foreliggende opfindelse er de to komponenter blevet adskilt, og det har overraskende vist sig, at den biologiske effekt alene er knyttet til komponenten 3-des-OH-cystatin C.

5

Som det fremgår af litteraturen er cystatin C en effektiv inhibitor for cystein-proteinaser, bl.a. papain og cath-epsin B.

10 Således er cystatin C i form af human cystatin C, også kaldet human r-trace, beskrevet af Grubb et al., (1), som angiver aminosyresekvensen og beskriver nogle biologiske egenskaber.

15 Cystein-proteinaser deltager i den intracellulære catabo-lisme af proteiner og peptider, i den proteolytiske omsætning af prohormoner, i den ekstracellulære nedbrydning af collagen og i penetrering af normalt væv med maligne celler.

20

Da cystatin C og dermed også 3-des-OH-cystatin C hæmmer cystein-proteinaser, som fremmer cancervækst eller metastase-dannelse, er det et potentielt cancerhæmmende middel.

25

Endvidere har cystatin C og dermed også 3-des-OH-cystatin C vist sig i besiddelse af antiviral og muligvis antibak-teriel aktivitet. 1 2 3 4 5 6

Til behandling af diskusprolaps kan anvendes cystein-pro 2 teinaser, f.eks. chymopapain. Hvis disse cystein-protein 3 aser diffunderer ud i cerebrospinalvæsken, opstår hjerne 4 blødning som en alvorlig bivirkning i forbindelse med den 5

terapeutiske behandling af diskusprolaps. Da cystatin C

6 og dermed også 3-des-OH-cystatin C forebygger en sådan bivirkning, har det terapeutisk anvendelse til dette formål.

DK 164283B

3

Af særlig betydning er aktiviteten af cystatin C til behandling af axrvelig tilbøjelighed til hjerneblødning med amyloidosis. Ved visse typer af denne sygdom er fundet aflejringer af et såkaldt HCHWA amyloid protein (Proc.

5 Natl. Acad. Sci. Vol 83. pp 2974-2978, May 1986 og Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 1986, 136,548-554). Dette protein har vist sig at være en variant af cystatin C, idet det mangler de 10 første aminosyrer af cystatin C s sekvens medens cystatin C s aminosyre Leu i position 68, 10 i HCHWA proteinets tilsvarende position 58 er erstattet med aminosyren Gin. Det formodes at denne variant af cystatin C har forbindelse med og måske er ansvarlig for sygdommen. I så fald må det forventes at 3-des-OH-cysta-tin C vil være anvendelig til behandling af denne sygdom.

15

Ved nedbrydning af collagen i bindevæv deltager bl.a. cy-stein-proteinaser, og 3-des-0H-cystatin C kan derfor formentlig hæmme en sådan nedbrydning af bindevæv.

20 Aminosyresekvensen af cystatin C, isoleret fra human urin, er bestemt og har vist sig at have en vis homolog! med c-Ha-ras oncogenprodukter.

Opfindelsen er baseret på anvendelsen af en hidtil ukendt 25 DNA-sekvens, der indeholder kodoner, som koder for 3-des-OH-cystatin C eller modifikationer deraf. DNA-sekvensen kan være en cDNA-sekvens, som er dannet ud fra humane celler fra placenta, og som har den i krav 2 angivne struktur.

30

Endvidere angår opfindelsen modificeret 3-des-OH-cystatin C, hvori en eller flere aminosyrer i positionerne 5-17 og/eller 55-59 er skiftet ud med en anden aminosyre. Et eksempel på et sådant modificeret 3-des-OH-cystatin C er 35 et derivat, hvor Gly i position 11 er ændret til Arg.

DK 164283 B

4

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af 3-des-hydroxy-cystatin C eller et modificeret 3-des-OH-cystatin C benyttes en værtsorganisme, såsom en bakterie, en gærcelle eller en mammal cellelinie, hvori der er op-5 taget en vektor, såsom et plasmid, med den for udtrykkel-se af 3-des-OH-cystatin C eller et modificeret 3-des-OH-cystatin C egnede struktur.

Den omhandlede DNA-sekvens indsættes sammen med signalse-10 kvenser, promotorer m.m. i et plasmid, der inkorporeres i mikroorganismen, som derefter dyrkes på i og for sig kendt måde.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkes en værtsor-15 ganisme indeholdende en DNA-sekvens, der koder for 3-des-OH-cystatin C, i et substrat, hvorefter det dannede poly-peptid udvindes af dyrkningsmediet. Den foretrukne værtsorganisme er E. coli, men principielt kan en vilkårlig mikroorganisme anvendes, herunder gærceller, eller dyrk-20 ningen kan ske ved hjælp af mammale celler.

Det dannede 3-des-OH-cystatin C udvindes af dyrkningsmediet i ren tilstand på i og for sig kendt måde, såsom ved ekstraktion med opløsningsmidler og oprensning ved hjælp 25 af kromatografi. Affinitetskromatografi med monoklonale eller polyklonale antistoffer har vist sig særlig egnet til isolering af 3-des-OH-cystatin C i ren tilstand.

Isolering og analyse af cDNA kloner er sket ved screening 30 af rekombinant phager. Der er således benyttet xgtll cDNA bibliotek fra human placenta og lever mRNA. Der er udført screening ved en densitet på 50.000 plaques pr. 130 mm Petri-skåle med affinitet-renset antistof ved en fremgangsmåde ifølge Young og Davis. Bundet antistof blev på-35 vist med alkalisk phosphatase-konjugeret antistof (Promega Bioteknik).

5

DK 164283 B

λ-phager, fremstillet ved pladelysat-metoden, blev isoleret ved centrifugering i en CsCl gradient. DNA blev ekstraheret ved standard metodologi. En blandet oligonucleo-tid probe, som var specifik for 3-des-OH-cystatin C, blev 5 hybridiseret til det med EcoRI reagerede produkt af phag DNA ved et Southern blot eksperiment. Hybridiserende cDNA indsætning blev ligeret i EcoRI-lineariseret pUCC18 plasmid vektorer, som derefter blev anvendt til transformering af E. coli JM83 celler. Plasmider blev fremstillet 10 ved alkalisk lysis-metode. DNA-sekventering af indsætninger, subklonet i M13mp8, udførtes under anvendelse af en modificeret dideoxy-kæde terminatorteknik.

Opfindelsen beskrives i det følgende ved hjælp af tegnin-15 gen, hvor fig. 1 illustrerer en sekventeringsstrategi for human 3-des-OH-cystain C cDNA-indsætninger, 20 fig. 2 viser plasmidet pUC18/C6a, fig. 3 viser plasmiderne pHD162 og pHD262, fig. 4 viser plasmidet pH0313, og 25 fig. 5 er et diagram, som viser vækstkurver for herpes simplex vins type 1 i nærvær af rekombinant 3-des-OH-cy-stain C sammenlignet med kendte antivirale midler. 1 35

Endvidere er opfindelsen illustreret i det efterfølgende ved hjælp af nogle udførelseseksempler.

DK 164283 B

6 EKSEMPEL 1

Konstruktion af et cDNA, der koder for 3-des-OH-cystatin C

5 cDNA bibliotek fra humane celler af lever, prostata og placenta blev screenet for 3-des-OH-cystatin C kodende kloner. Ca. 1,2 x 10^ rekombinanter af lever-celler og 3 5 x 10 rekombinanter af prostataceller blev screenet med antistoffer og en blandet oligonucleotid probe. Resulta-10 tet af denne screening var negativt. Derimod gav scree- 5 ning af 6 x 10 rekombinanter af placentaceller ni kloner, der reagerede med antistoffet.

Tre af disse kloner, betegnet henholdsvis C5, C6a og C12, 15 blev benyttet i det følgende. Deres indsætninger af henholdsvis 800, 800 og 700 basepar, hybridiseredes specifikt ved Southern blot eksperimenter til et blandet oligonucleotid, konstrueret fra protein-sekvens-data.

20 Ved sekventering af indsætninger fra kloner C6a og C12, subklonet i EcoRI-skåret M13mp8, afsløredes at indsætningerne delte samme 3'-sekvens, indeholdende polyadenyle-ringssignalet AATAAA.

25 Hele sekvensen af begge strenge af klonen C6a cDNA indsætning blev bestemt ved sekventering af tilfældigt overlappende fragmenter, subklonet i M13mp8. Data opnået ved sekventering af cDNA indsætninger af kloner C6a og C12 fra enderne afslørede, at sekvensen af C12 indsætninger 30 starter ved position 91 af den for C6a, se fig. 1.

C6a indsætningen indeholder 777 basepar, inklusiv 77 basepar af 5’-ikke-kodende sekvens, og 262 basepar af 3'-ikke-kodende sekvens. Polyadenyleringssignalet AATAAA ved 35 position 756-761 er efterfulgt af 15 nucleotider. En mulig translations-initiering i overensstemmelse med den af Kozak fundne sekvens findes 6 bp nedstrøms en stop-kodon.

DK 164283B

7

Initiering ved denne position og translationsstop ved TAG-koden i positionerne 516-518 vil resultere i et 120 aminosyrer langt 3-des-0H-cystatin C med en signalsekvens på 26 aminosyrerester. Det dannede polypeptid viste sig 5 at have højere aktivitet end et tilsvarende humant cysta-tin C isoleret fra urin.

Som det fremgår af fig. 1 blev i human 3-des-OH-cystatin C cDNA-indsætninger af klonerne C12 og C6a sekventeret 10 fra enderne ved kæde-terminator-metoden. En "shotgun" se-kventerings-analyseteknik blev anvendt til sekventering af begge DNA-strenge af C6a indsætninger. De vandrette pile angiver retningen og udstrækningen af hver sekvensanalyse. Protein-kodningsområdet for indsat C6a er ind-15 rammet, og den skraverede del viser området, som koder for modent protein.

DNA-strukturen, der koder for 3-des-OH-cystatin C, omfatter nucleotider afledt af aminosyre-sekvens for klonen 20 C6a og cDNA, der koder for humant precystatin C. Nummereringen af nucleotid-sekvensen begynder ved det første nu-cleotid og forløber i retning fra 5' til 3'. Amino-syre-nummereringen begynder med den første aminosyre i det modne protein. Kozak-initieringen og polyadenyleringssig-25 nalet er understreget.

EKSEMPEL 2

Cytoplasmatisk ekspression af methionin ekstenderet 3-30 des-OH-cystatin C i E. coli

Plasmidet pUC18/C6a, der indeholder cDNA sekvensen for 3-des-OH-cystatin C, blev skåret med restriktionsenzymerne Ncol/Hindlll, hvorefter plasmidfragmentet blev oprenset.

35 En syntetisk DNA linker indeholdende kodesekvensen for aminosyren methionin samt de første ca. 40 baser af modent cystatin C blev herefter indført mellem Ncol og 8

DK 164283 B

Hindlll stederne (fig. 2). I stedet for de i 3-des-OH-cy-statin C s cDNA forekommende kodoner blev der i linkeren anvendt kodoner, som giver højt udbytte af proteiner i E. coli. Dette plasmid blev skåret med restriktionsenzymerne 5 Clal/EcoRI, hvorefter et fragment på ca. 600 bp indeholdende kodesekvensen for methionin-ekstenderet 3-des-OH-cystatin C blev oprenset.

Plasmidet pHD162, der indeholder en syntetisk promotor og 10 Shine og Dalgarno sekvens, blev skåret med restriktionsenzymerne Clal/EcoRI, hvorefter plasmidfragmentet blev oprenset. Dette plasmidfragment blev herefter sammensat med ovennævnte 600 bp fragment til dannelse af 3-des-OH-cystatin C ekspressionsplasmidet pHD262 (kodende for me-15 thionin cystatin C) (fig. 3). E. coli MC1061 indeholdende ovennævnte ekspressionsplasmid blev dyrket som beskrevet nedenfor.

EKSEMPEL 3 20

Periplasmatisk ekspression af 3-des-OH-cystatin C i E. coli

Plasmidet pUC18/C6a nævnt i eksempel 2 blev skåret med 25 restriktionsenzymerne Ncol/Hindlll, hvorefter plasmidfragmentet blev oprenset. En syntetisk DNA linker indeholdende kodesekvensen for Outer membrane protein A (OmpA) fra E. coli samt de første ca. 40 baser af modent 3-des-OH-cystatin C blev herefter indført mellem Ncol og 30 Hindlll stederne. Der blev anvendt optimale E. coli kodoner. Dette plasmid blev herefter skåret med restriktionsenzymerne Clal/EcoRI, hvorefter et fragment på ca. 700 bp indeholdende kodesekvensen for OmpA signalpeptidet, og 3-des-OH-cystatin C blev oprenset.

Ovennævnte fragment blev herefter indført i et ekspressionsplasmid indeholdende λ PR promotoren, en optimal Shine 35 9

DK 164283 B

og Dalgarno sekvens, polylinkerregionen fra plasmidet pUCC18, og det temperatursensitive Cl repressorgen fra λ.

Det herved dannede plasmid pHD313 (fig. 4) blev herefter indført i E. coli MC1061. Ekspressionen af 3-des-0H-cy-5 statin C og oprensningen af polypeptidet blev foretaget som ovenfor beskrevet.

EKSEMPEL 4 10 Periplasmatisk ekspression af 3-des-OH-cystatin C i E. coli

Plasmidet pUC18 blev skåret med Apal/EcoRI, og et fragment på ca. 680 basepar blev oprenset og påligeret en 15 syntetisk Apal/Clal linker, indeholdende kodesekvensen for de ca. 3 første aminosyrer af pre-3-des-0H-cystatin C. Fragmentet blev herefter indført i det i eksempel 3 nævnte ekspressionsplasmid, indeholdende den temperatur-inducerbare λPR promotor.

20 EKSEMPEL 5

Ekspression af periplasmatisk modificeret 3-des-OH-cysta-tin C i E. coli 25

Fra ekspressionsplasmidet pHD313 (eksempel 3) blev isoleret et Hindlll/EcoRI fragment på ca. 700 bp. Fragmentet blev introduceret i M13 MP18 og udsat for in vitro muta-genisering, således at kodesekvensen for cystatin C blev 30 ændret til at indeholde en eller flere af nedenstående modifikationer, tabel 1. Efter in vitro mutagenisering blev en række kloner opdyrket og sekvensbestemt. Kloner med korrekt sekvens blev herefter skåret med Clal/EcoRI, hvorefter et fragment på ca. 700 bp blev isoleret og in-35 troduceret i ekspressionsplasmidet pHD313. De herved opnåede plasmider blev dyrket og produktet oprenset, som beskrevet ovenfor.

10

DK 164283 B

Tabel 1 3-des-OH-cystatin C-mutanter med modificeret DNA-sekvens 5 1. Gly11 -* pos. ladet, f.eks. Arg 2. Gly11 -* neg. ladet, f.eks. Glu 11 3. Gly -► kraftigt hydrofob, f.eks. Trp 10 11 11 11 11 4. 4.Gly -> Ala , 5Gly ->Ser 5. Substitution ved enkelte aminosyrer, f.eks.

O

a.) Arg -♦ Glu g 15 b. ) Leu -♦ Arg,Glu c. ) Val10 - Arg,Glu d. ) Gly12 -» Arg,Glu 13 e. ) Pro -* Arg,Glu,Trp 14 f. ) Arg -* Arg, Glu 20 6. Substitution af hele regionen f.eks.

Arg^-Met"*·^ -♦ Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly EKSEMPEL 6 25

Fremstilling af 3-des-OH-cystatin C i teknisk målestok ved portionsfermentering E. coli MC1061 pHD 313-1-1, der udtrykker 3-des-OH-cysta-30 tin C med korrekt N-terminal, dyrkes på LB petriplade indeholdende ampicillin. En enkeltkoloni overføres til en 100 ml rystekolbe indeholdende LB medium samt 50 m g/1 ampicillin. Denne inkuberes ved 30 °C, 200 rpm i 20 timer.

Ferménteringen udføres i 10 1 laboratoriefermentor ved følgende betingelser: pH = 7,2, beluftning = 1 WM, omrø- 35 11

DK 164283 B

ring = 1000 rpm og temperatur = 30 °C i den første fase.

Det benyttede medium består af gærekstrakt, casaminosyrer og forskellige salte.

5 Fermentoren podes med 100 ml kultur fra rystekolben, og glucosedoseringen starter, når biomassekoncentrationen er OD525 = 5. Doseringshastighed skal være 3,5 g gluco- se/l’h, og den fastholdes under det resterende forløb af processen. Dannelsen af 3-des-0H-cystatin C induceres ved 10 at hæve temperaturen i fermentoren til 40 °C i den sene vækstfase (OD-,,.- = 50). 3-des-OH-Cystatin C dannes 525 nm hurtigt, og - 2 timer efter at temperaturen er hævet afsluttes fermenteringen ved at sænke temperaturen til 20 °C og hæve pH til 9,0. Hele fermenteringsprocessen tager 15 ca. 12 timer.

Ved processen opnås slutkoncentrationer af 3-des-OH-cystatin C på ca. 1000 mg/1 (3-des-OH-cystatin C udgør ca. 10% af totalproteinet i cellen).

20

Ekstraktion I af 3-des-OH-cystatin C fra E. coli

Cellesuspension fra fermenteringen centrifugeres. Cellerne resuspenderes i 20-25% w/w saccharose, 0,1M EDTA, 0,2M 25 Tris pH 9,0 og henstår under omrøring i 20 minutter.

Supernatanten herfra indeholder 3-des-OH-cystatin C fra den periplasmatiske fase (70% af total ekstraktion ved mekanisk homogenisering).

30

Ekstraktion II af 3-des-OH-cystatin C fra E. coli

Cellesuspension fra fermentering justeres til pH = 10,5 med 5M NaOH. Efter omrøring i 20 minutter centrifugeres 35 suspensionen. Supernatanten herfra indeholder 3-des-OH-cyståtin C.

DK 164283 B

12

Ekstraktion III af 3-des-OH-cystatin C fra E. coli

Cellesuspension fra fermentering centrifugeres og resus-penderes i 0,5M Tris pH = 10,5. Efter omrøring i 20 mi-5 nutter centrifugeres supensionen. Supernatanten herfra indeholder 3-des-OH-cystatin C.

Ekstrakten dialyseres mod 20 mM ethanolamin, pH = 10,0 med en dialysemembran af typen Spectrapor© (mv-afskær 10 3500) og påføres dernæst en Q-Sepharosekoionne, som er ækvilibreret i 20 mM ethanolamin, pH = 10,0. Fraktioner indeholdende 3-des-OH-cystatin C forenes og koncentreres på et filter af typen Diaflo®YM2. Dernæst påføres materialet en kolonne af typen Bio-Gel®P60, som er ækvilibre-15 ret i 0,05 M ammoniumhydrogencarbonat. Fraktioner indeholdende 3-des-OH-cystatin C opsamles. Udbyttet er typisk 50-60% ved denne isoleringsprocedure.

EKSEMPEL 7 20

Konstruktion af et syntetisk gen, der koder for 3-des-OH-cystatin C under anvendelse af optimale E. coli kodoner

Fra litteraturen er det kendt, at højt udtrykte E. coli 25 proteiner forudsætter anvendelse af bestemte kodoner for de enkelte aminosyrer. Samtidig med fremstilling af cDNA for 3-des-OH-cystatin C blev der på basis af den publicerede aminosyresekvens syntetiseret et 3-des-OH-cystatin C gen, indeholdende de kodoner, der foretrækkes for højt 30 udtrykte E. coli proteiner. Genet var samtidig modificeret på en sådan måde, at det tillod en fusion med signalsekvensen fra enten outer membrane protein A fra E. coli eller signalsekvensen fra fibria-proteinet K88/99 fra E. coli. Efter syntese blev ovennævnte gen klonet trinvis i 35 plasmidet pUC18. Genet blev herefter isoleret og indført i det i eksempel 3 nævnte ekspressionsplasmid i kombination med een af ovennævnte signalsekvenser. Plasmidet

DK 164283B

13 blev indført i E. coli MC1061 og dyrket som beskrevet ovenfor.

OmpA-3-des-OH-cystatin c genet med optimale kodoner for 5 E. coli har følgende struktur: CG-ATG-AAA-AAA-ACT-GCT-ATC-GCT-ATC-GCT-GTT-GCT-CTG-GCT-GGT-TTC-GCT-ACT-GTT-GCT-CAG-GCT-TCT-TCT-CCT-GGT-AAA-CCG-10 CCT-CGT-CTG-GTT-GGT-GGT-CCG-ATG-GAC-GCT-TCT-GTT-GAA-GAA- GAA-GGT-GTT—CGT-CGT-GCT-CTG-GAC-TTC-GCT-GTT-GGT-GAA-TAO AAC-AAA-GCT-GTT-AAC-GAC-ATG-TAC-CAC-TCT-CGT-GCT-CTG-CAG-GTT-GTT-CGT-GCT-CGT-AAA-CAG-ATC-GTT-GCT-GGT-GTT-AAC-TAC-TTC-CTG-GAC-GTT-GAA-CTG-GGT-CGT-ACC-ACC-TGC-ACC-AAA-ACC-χ 5 CAG-CCG-AAC-CTG-GAC-AAC-TGC-CCG-TTC-CAC-GAC-CAG-CCG-CAC-

CTG-AAA-CGT-AAA-GCT-TTC-TGC-TCT-TTC-CAG-ATC-TAC-GCT-GTT-CCG-TGG-CAG-GGT-ACC-A'TG-ACC-CTG-TCT-AAA-TCT-ACC-TGC-CAG-GAC-GCT-TAA-TAG

20 EKSEMPEL 8

Fremstilling og isolation af 3-des-OH-cystatin C 25

Bakterie-medier indeholdende 3-des-OH-cystatin c blev centrifugeret, og bakteriefrit medium blev koncentreret på et Diaflo™YM2 filter. Koncentratet blev dialyseret

TM

overfor 20 mM ethanolamin, pH = 10,0 i en Spectrapor 1 2 3 4 5 6 dialysemembran (mol vægt af skæring 3500) og derefter påført 2

TM

3 en Q-Sepharose kolonne, ækvilibreret i 20 mM ethanolamin, pH = 10,0. Fraktioner indeholdende 3-des-OH-cystatin C blev samlet og koncentreret på et Diaflo™YM2 fil- 4

TM

5 ter. Materialet blev påført en Bio-Gel kolonne, ækvili- 6 breret i 0,05 M ammoniumbicarbonat. Fraktioner indeholdende 3-des-OH-cystatin blev forenet. Ved denne isolationsprocedure er udbyttet af 3-des-OH-cystatin C typisk

DK 164283 B

14 50-60%.

EKSEMPEL 9

5 Karakterisering af 3-des-OH-cystatin C

3-des-OH-cystatin C, der er isoleret som ovenfor beskrevet udfra en kultur af pHD 313-tranformeret E. coli, blev fysisk-kemisk karakteriseret i henseende til biologisk 10 aktivitet. Resultaterne af karakteriseringen blev sammenlignet med resultater fra tilsvarende analyser af human cystatin C.

En analyse ifølge Ouchterlony baseret på dobbelt immun 15 diffusionsteknik viste, at alle cystatin C-epitoper, som genkendes ved et polyklonal anti-serum, der er dyrket over for human cystatin C, også er tilstede i 3-des-OH-cystatin C. Agarosegel elektroforese ved pH-8,6 og SDS-PAGE under reducerende eller ikke-reducerende betingelser 20 viste, at 3-des-OH-cystatin C og human cystatin C er identiske med henseende til ladning og molekylvægt. En aminosyreanalyse viste, at aminosyresammensætningen i 3-des-OH-cystatin C er næsten identisk med sammensætningen i human cystatin C. Automatisk sekvensbestemmelse viste, 25 at 3-des-OH-cystatin C har N-terminalsekvensen: SSPGKPPRLVGGPMDASVEEEGV—ALDFAVGEYNKASNDMY ved hver position, hvilket er identisk med sekvensen i human cystatin C (jf. ref. 1), og at desuden 100% af prolin-remanensen ved position 3 i 3-des-OH-cystatin C manglede en hydrox-30 ylgruppe. Aminosyreanalyse af disulfidbundet polypeptider viste, at 3-des-OH-cystatin C har disulfidbroer mellem Cys^-Cys^ og Cys^-Cys^, dvs. det samme som er tilfældet for human cystatin C (jf. ref. 15).

35 Biologisk aktivitet af 3-des-OH-cystatin C er bestemt ved titrering overfor koncentreret determineret papain. 3-des-OH-cystatin C var 83% aktiv, hvilket er højere end de 15 tilsvarende tal for human cystatin C (55%). Styrken af bindingen 3-des-OH-cystatin C på cysteinproteinaserne papain (EC 3.4.22.2), cathepsin B (EC 3.4.22.1) og dipepti-dylpeptidase I (EC 3.4.14.1) blev bestemt. Ligevægtkon-5 stanten for dissociation af 3-des-OH-cystatin C enzymkom-pleks (<0,005 nM, 0,50 nM og 3,5 nM) lå indenfor den eksperimentelle fejlgrænse, identisk med ligevægtskonstanten for human cystatin C enzymkompleks (<0,005 nM, 0,27 nM og 3,5 nM). Således udviste fysisk-kemisk karakterisation og 10 analyser, udført ved indvirkning af 3-des-OH-cystatin med cysteinproteinaser, at 3-des-OH-cystatin C har fuldt biologisk aktivitet og er identisk med human cystatin C med den undtagelse, at hydroxylgruppen i position 3 helt mangler.

15 EKSEMPEL 10

Sammenligning af den biologiske aktivitet af 3-des-OH-cystatin C med cystatin C af human oprindelse 20

Den papain-inhiberende kapacitet af rekombinant 3-des-OH-cystatin C blev sammenlignet med den tilsvarende aktivitet af human cystatin C. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Human cystatin C blev isoleret af urin fra patienter med 2 blandet glomerulær-tubulær proteinuri ved ultrafiltre 3 ring, ionbytningskromatografi og gelfiltrering som be 4 skrevet i litteraturen (ref. 2,3) og lyofiliseret. Ialt 5 10 forskellige præparater af dels human cystatin C dels 6 3-des-OH-cystatin C blev testet for deres cystein-protei- 7 nase-inhibitoriske kapacitet. Cystatin C og 3-des-0H-Cy- 8 statin C præparaterne udvundet henholdsvis af human urin 9 og fremstillet ved rekombinant teknik blev hver for sig 10

opløst i 0,15 mol/liter ammoniumbicarbonat. Cystatin C

11 koncentrationer af de resulterende opløsninger blev bestemt fysisk kemisk og ved immun-diffusion og kvantificering af aminosyrer frigivet ved hydrolyse i 6 mol/liter 16

DK 164283 B

HCIJ Cystein-proteinase-inhiberingskapaciteten af disse opløsninger blev bestemt ved tilsætning af en opløsning af isoleret papain (ref. 4), der er en plantecystein-pro-teinase, som generelt anvendes som en model for cystein-5 proteinase, og derpå bestemtes den resterende proteoly-tiske aktivitet af de dannede blandinger.

Cystein-proteinase-aktiviteterne af papainopløsningen og cystatin C-papainblandingerne blev bestemt under anven-10 delse af substratet Z-Phe-Arg-NHMec (ref. 5). Den molære koncentration af aktivt enzym i papain-opløsningerne bestemtes ved hjælp af den irreversible papain-inhibitor E-64 (ref. 6).

15 De molære inhibitor-kapaciteter af de forskellige præparater af cystatin C blev beregnet som forholdet mellem papain-inhibitor-kapaciteten af cystatin C opløsningerne, idet 1 mol cystatin C antages at inhibere 1 mol papain, hvorved den molære koncentration af cystatin C i opløs-20 ningerne er målt ved fysisk-kemiske eller immunokemiske metoder under forudsætning af en molvægt på 13343 for cystatin C. Målt på denne måde opnåedes molær inhibitorisk kapacitet af cystatin C isoleret fra human urin til 5-55%, medens den inhibitoriske kapacitet af flere prøver 25 af rekombinant 3-des-OH-cystatin C lå i området 83-98%.

Det fremgår heraf, at den biologiske potens af alle undersøgte præparater af rekombinant 3-des-OH-cystatin C væsentlig overstiger den biologiske potens af alle cystatin C præparater, der er isoleret fra humane biologiske 30 væsker.

EKSEMPEL 11

Terapeutisk anvendelse af rekombinant 3-des-OH-cystatin C 35 som et CNS-beskyttende middel ved chymopapin-behandling af sciatica 17

Umiddelbart før chymopapinbehandling af patienter med sciatica blev en molær mængde 3-des-OH-cystatin C, 3 gange højere end den anvendte molære mængde chymopapin, injiceret i den cerebrospinale væske. Hvis f.eks. 8 mg chy-5 mopapin (den aktive komponent af de for tiden tilgængelige lægemidler: Disease®; Travenol Laboratories Ltd.,

Thetford, UK and Chymodiactin®; Smith Laboratories, Inc., Rosemont, IL, U.S.A.) skal anvendes til intradiscal injektion, injiceres 12 mg 3-des-OH-cystatin C i den cere-10 brospinale væske. Injektionspræparatet kunne være sammensat af 5 mg 3-des-OH-cystatin C pr. ml steril fysiologisk saltopløsning. Dette vil beskytte over for enhver sidevirkning, der skyldes proteolytisk nedbrydning af nervevæv, forårsaget af fejlagtig injektion af chymopapain i 15 den cerebrospinale væske.

Hvis kliniske eller radiografiske tegn på fejlagtig chy-mopapininjektion i den cerebrospinale væske i stedet iagttages ved eller efter udførelse af den tilsigtede in-20 tradiscale chymopapaininjektion, anvendes en molær mængde 3-des-OH-cystatin C, som er tre gange højere end den molære mængde af det anvendte chymopapain, og det injiceres straks i den cerebrospinale væske for at inhibere den vævsbeskadigende effekt af chymopapain. Umiddelbart efter 25 injektion af 3-des-OH-cystatin C bliver patienten udsat for en vis bevægelse for at sikre en hurtig fordeling af den injicerede opløsning af 3-des-OH-cystatin C med den cerebrospinale væske på patienten.

30 EKSEMPEL 12

Terapeutisk anvendelse af 3-des-OH-cystatin C ved behandling af Herpes simplex 35 Præparater indeholdende rekombinant 3-des-OH-cystatin C, fremstillet ifølge opfindelsen, blev sammenlignet for antiviral aktivitet med de kendte antivirale medikamenter 18

DK 164283 B

Cyclovir® og Z-LVG-CNH^.

I den første serie eksperimenter blev papirskiver imprægneret med Z-LVG-CNH2 (24 ug pr. skive) og placeret på mo-5 nolag af nyreceller fra grønne aber inficeret med poliovirus 1 eller herpes simplex virus type 1 (HSV).

Ved denne screening for antiviral aktivitet blev der ikke observeret nogen plaque-dannelse med poliovirus. Markante 10 inhiberingszoner opstod dog omkring disse skiver, når celler blev inficeret med HSV. Derpå undersøgtes, hvorvidt tilsætning af Z-LVG-CNH2 til dyrkningsmediet kunne påvirke væksten af poliovirus eller HSV i cellekulturer.

Også i dette tilfælde blev HSV-replikationen blokeret 15 (>99,9% inhibering) medens effekten på poliovirus-repli- kation næppe var mærkbar (jævnfør tabel 2).

TABEL 2

Anti-virale aktiviteter af 3-des-OH-cystatin C og Z-LVG-CNH« 20 Δ

Virus udbytte (pfu/ml) 3-des-OH- Medium Z-LVG-CNH2 cysta- med 1% i 1%

Virus Medium tin C DMSO DMSO

Poliovirus a η n 7 type 1 1,2 x 10° 1,1 x 10° 1,5 x 10° 4,8 x 10 HVS type 1 8,8 x 107 2,4 x 103 6,4 x 106 1,4 x 103 METODE: Celler på grønne aber (stamme GMK-AH1) blev infi-30 ceret med poliovirus (Mahoney-stamme) eller HSV- 35 19 type 1 (F-stamme) med en multiplicitet på henholdsvis 1 og 10). Efter 2 timer blev tilsat serum-frit medium (MEM, Flow Laboratories) indstillet til at indeholde 0,10 mM cystatin C eller 0,4 5 mM Z-LVG-CNH2. Z-LVG-CNH2blev opløst i MEM medium indeholdende 1% dimethylsulfoxid (DMSO) for at holde peptidderivatet i opløsning. Plaque-titreringer (pfu: plaque-dannende enheder) blev udført på GMK-celler som tidligere beskrevet. Ved alle 10 forsøg blev anvendt 3 Petri-skåle (Falcon 6 cm diameter) i hvert fortyndingstrin. Værdier bestemt ved tælling ved mindst 40 pfu og værdierne angivet i tabellen er fra typiske og reproducerbare forsøg.

15

Fig. 5 illustrerer vækstkurverne for herpes simplex virus type 1 i nærvær af forskellige koncentrationer af rekom-binant 3-des-0H-cystatin C, Z-LVG-CNH^ og Acyclovir®. Ved undersøgelsen blev CMK-AH1 celler podet med 10 pfu 20 (plaque-dannende enheder) pr. celle svarende til 5 x 10^ pfu pr. ml i 1 time ved 37 °C. Efter vask blev målt en 3 rest-infektivitet på ca. 10 pfu, og denne værdi repræsenterer således baggrundsniveauer ved begyndelsestidspunktet for vækstkurverne. På dette tidspunkt blev serum-25 frit medium (MEM) indeholdende forskellige koncentrationer af inhibitorerne tilsat til de HSV-inficerede celler efterfulgt af dyrkning ved 37 °C i 48 timer. Til slut blev cellerne frosset og tøet, og der udførtes plaque-ti-treringer. Koncentrationen af 3-des-OH-cystatin C, som 30 var nødvendig for inhibering af viral replikation til baggrunds-niveauet var ca. 0,13 mM, medens de tilsvarende koncentrationer af Z-LVG~CNH2 og Acyclovir var henholdsvis 0,44 mM og 0,22 mM. Anti-HSV-potensen af rekombinant cystatin C og af peptid-derivatet, Z-LVG-CNH2, svarende 35 til en del af dets proteinase-bindende center, er af samme størrelsesorden som for Acyclovir.

20

DK 164283 B

Ved de ovenfor beskrevne forsøg blev 3-des-0H-cystatin C og Z-LVG-CNH2 sat til mediet efter at cellerne var podet med virus og derpå grundigt vasket. Da inhibitorerne ikke var til stede i det første trin, indvirker de åbenbart på 5 de senere trin af HSV-replikation. Dette blev også vist, når Z-LVG-CNH2 (0,40 mM) blev blandet med en fortyndet HSV suspension og kun var til stede under den 2 timer lange virale adsorption til cellerne. I dette tilfælde blev antallet af plague ikke reduceret. Inhibering af 10 HSV-replikation var iøvrigt ikke begrænset til celler fra abe-nyrer.

15 20 " 25 30 35 21

Litteraturliste 1. Grubb, A. & Ldfberg, H., Lt: Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 3024-3027, 2982., 5 2. Ldfberg H & Grubb A (1979) Scand J. Clin Lab Invest 39, 619-626.

3. Løfberg H. Grubb A & Brun A (1981) Biomed Res, 298- 10 306.

4. Lindahl P, ALriksson E, Jornvall H & Bj5rk I (1988) Biochemistry 28: 5074-5082).

15 5. Barrett AJ & Kirschke H (1982) Methods Enzymol 80, 535-561.

6. Barret AJ, Kembhavi AA; Brown MA, Kirschke H, Knight CG, Tamai M & Hanada K (1982) Biochem J 201, 189- 20 198).

7. Ghiso et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Vol 83 (May 1986), p. 2974-2978.

25 8. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1986), 136, 548-554. 1 35

Claims (8)

1. Polypeptid med cystatin C aktivitet, kendeteg-5 net ved, at det består af ved rekombinant teknik fremstillet 3-des-OH-cystatin C eller en modifikation deraf.

2. DNA-sekvens til udtrykkelse af 3-des-OH-cystatin C, kendetegnet ved, at den er en DNA-kopi eller 10 cDNA med strukturen: GGGCGCAGOGGGTCCTCrCTAT 95 CTAGCTOCAGCCTCTGGCCTGOGOCCCACTCCCGGCGTCCCGCrCCrAGCOGACC ATG GCC GGG CCC CTG CGC 15 Met Ala Gly Pro Leu Arg -26 -21 155 GCC COG CTG CTC CTG CTG GCC ATC CTG GCC GIG GCC CTG GCC GIG AGO CCC GCG GCC GGC Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ala Ile Leu Ala Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Ala Ala Gly -1 20 - 215 ICC AGT CCC GGC AAG CCG CCG CGC CTG GIG GGA GGC CCC ATG GAC GCC AGC GTG GAG GAG Ser Ser Pro Gly Lys Pro Pro Arg Leu Val Gly Gly Pro Met Asp Ala Ser Val GLu Glu 1 20 275 GAG GGT GTG CGG CGT GCA CTG GAC TTT GCC GTC GGC GAG TAC AAC AAA GCC AGC AAC GAC

25 Glu Gly Val Arg Arg Ala Leu Asp Phe Ala Val Gly Glu Tyr Asn Lys Ala Ser Asn Asp 40 335 ATG TAC CAC AGC CGC GCG CTG CAG GTG GTG CGC GCC CGC AAG CAG ATC GTA GCT GGG GTG Met Tyr His Ser Arg Ala Leu Gin Val Val Arg Ala Arg Lys Gin Ile Val Ala Gly Val 60 30 395 AAC TAC TTC TTG GAC GTG GAG CTG GGC CGA ACC ACG TGT ACC AAG ACC CAG CCC AAC TIG Asn Tyr Phe Leu Asp Val Glu Leu Gly Arg Thr Thr Pys Thr Lys Thr Gin Pro Asn .Leu 80 455 GAC AAC TGC CCC TTC CAT GAC CAG CCA CAT CTG AAA AGG AAA GCA TTC TGC TCT TTC CAG

35 Asp Asn Cys Pro Phe His Asp Gin Pro His Leu Lys Arg Lys Ala Phe Cys Ser Phe Gin 100 515 ATC TAC GCT GTC (XT TGG CAG GGC ACA ATG ACC TTG TCG AAA TCC ACC TGT CAG GAC GCC Ile Tyr Ala Val Pro Trp Gin Gly Thr Met Thr Leu Ser Lys Ser Thr Cys Gin Asp Ala 120 593

3. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, 15 at det har sanune struktur som 3-des-hydroxy-cystatin C med den ændring, at en eller flere aminosyrer i positionerne 5-17 og/eller 55-59 er erstattet med en anden aminosyre.

4. DNA-sekvens ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den har en struktur som angivet i krav 2, men med den ændring, at den omfatter kodoner, som koder for et modificeret 3-des-OH-cystatin C som angivet i krav 3.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af 3-des-hydroxy-cysta tin C eller en modifikation deraf, kendetegnet ved, at en værtsorganisme indeholdende en DNA-sekvens som angivet i krav 2 eller 4 dyrkes i et substrat, og at det dannede 3-des-hydroxy-cystatin C eller modifikationen 30 deraf derefter udvindes fra kulturen.

5 TAG GGGTnnCTACCGGGOGGCCltJIXJCCTATCAttnxnTATCCAC^CCTCXX^CXXXXrrCTATrCCX^CXXXnGGAC 672 TOTIGGCCOTrGCCTTGGGGAAGGTCIXXXX^TGTGCCnXACCAGGAGACAGACAGAGAAGGCAGCAGGCC^CCTrrG 751 TTGCTCAGCAAGGGGCTCIXXXXritXXnXX7rTCCTTCTTGCITCTCATAGCCXX3SGlX7nXG5GTGCATACACCCCCACC 10 777 TCCTGCAATAAAATAGTAGCATCOCC

6. Plasmid til indføring i en værtsorganisme, der anvendes til biosyntetisk fremstilling af 3-des-hydroxy-cystatin C eller en modifikation deraf, kendetegnet 35 ved, at det indeholder DNA-strukturen angivet i krav 2 eller 4 samt en promotor og signalsekvens etc. DK 164283 B

7. Mikroorganisme, kendetegnet ved, at den indeholder et plasmid som angivet i krav 6.

8. Anvendelse af 3-des-hydroxy-cystatin C eller en modi-5 fikation deraf som defineret i krav 1 eller 3 til fremstilling af et terapeutisk præparat. 10 15 20 25 30 35