KR0149001B1 - 플라스미노겐 활성인자 및 히루딘을 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

플라스미노겐 활성인자 및 히루딘을 포함하는 약제학적 조성물

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KR0149001B1 KR1019890013492A KR890013492A KR0149001B1 KR 0149001 B1 KR0149001 B1 KR 0149001B1 KR 1019890013492 A KR1019890013492 A KR 1019890013492A KR 890013492 A KR890013492 A KR 890013492A KR 0149001 B1 KR0149001 B1 KR 0149001B1
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Abstract

내용 없음.

Description

플라스미노겐 활성인자 및 히루딘을 포함하는 약제학적 조성물
제1도는 각각 헤파린 및 데설파토 히루딘의 존재하에 조직형 플라스미노겐 활성인자(tissue-type plasminogen activator : t-PA)에 의한 혈병 용해가 진행되는 동안 피브린 유착을 나타내는 도이다.
제2도는 다양한 농도의 데설파토 히루딘의 존재하에 t-PA에 의한 혈병 용해가 진행되는 동안 피브린 유착을 나타내는 도이다.
제3도는 플라스미드 pML 350의 작제 설명도이다.
제4도는 플라스미드 pJDB 207/GAPFL-HIR의 플라스미드 지도이다.
본 발명은 플라스미노겐 활성인자 및 트롬빈 억제인자의 배합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 응고 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
포유동물의 혈장은 동적 평형상태로 공존하는 두가지 효소 시스템을 함유한다: 혈병을 형성할 수 있는 응고 시스템 및 혈병을 용해시킬 수 있는 피브린용해 시스템. 이러한 동적 평형상태는 손상된 혈관으로부터의 혈액 손실을 방지하는 것이 요구되는 경우 및 부위에만 혈병이 정상적으로 형성되고, 손상부위가 자연 치유된후 여분의 혈병이 용해되도록 보장한다. 체내 피브린용해능이 예를들어, 혈관 색전증 또는 수술후 합병증을 앓고있는 환자의 혈관내 혈병(혈전)을 제거하기에 불충분한 경우, 피브린용해제(혈전 붕괴제)를 외부적으로 투여하는 것이 필수적일 수 있다.
피브린용해 시스템 성분중 하나는 효소원 플라스미노겐(plasminogen)을 단백질분해 효소 플라스민(plasmin)으로 전환시키는, 플라스미노겐 활성인자라 불리는 효소 그룹이다. 이어서, 플라스민은 혈병의 피브린 조직망(fibrin network)을 분해하여 가용성 생성물을 형성시킨다.
두가지 유형의 플라스미노겐 활성인자(이하에서 PA로 언급함)가 사람의 체액 또는 세포로부터 분리될 수 있다: 예를 들어, 뇨 및 신장 세포에 존재하는 세린 프로테아제인, 유로키나제 또는 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자(이하에서 u-PA로 언급함) 및 내피세포에 의해 생성되며 다수의 내분비 조직에서 발견되는 조직형 플라스미노겐 활성인자(이하에서 t-PA로 언급함).
t-PA 및 u-PA 둘다 두가지 분자 형태로 존재한다; 일본쇄 형(종종 sct-PA 및 scu-PA로 각각 표시됨) 및 이본쇄 형(tc). 일본쇄 또는 프로-효소 형(pro-enzyme form)은 폴리펩타이드 서열중의 잘 규정된 위치에서 단백질분해 효소의 작용에 의해 이본쇄 형으로 전환된다. 수득되는 프로쎄싱된 PA 단백질의 이본쇄는 황-황 브리지를 통하여 서로 결합된다. 카복시말단 단편 또는 B-쇄는 PA의 효소 활성을 중재하는 반면 아미노말단 A-쇄는 피브린 결합부위와 같은 조절단위를 포함한다.
일반적으로, 혈전 붕괴 요법에는 t-PA 및 u-PA(특히 scu-PA)가 가장 유용한 것으로 알려져 있지만, 그럼에도 불구하고 이들 약물만으로는 폐색된 혈관을 영구적으로 개방시키는데 충분하지 않다는 사실이 관찰되었다. 재폐색율이 매우 높기 때문에, 질환의 진행동안에 유리한 영향을 발휘하는 추가의 치료 수단이 강구되어야 한다.
최근에, 헤파린, 헤파린의 저분자량 분획 또는 아르기닌 유도체(예를들어, 아르기피딘)와 같은 트롬빈 억제인자가 혈전증 치료요법에서 플라스미노겐 활성인자와 함께 병용되어 사용되고 있다[참조문헌: Y. Tamao et al., Thromb. Haemost. 56, 28-34 (1986); J.M. Stassen et al., ibid. 58, 947-950 (1987); 유럽 특허원 제181,267호]. 트롬빈의 억제는 응고 시스템에 다음과 같은 영향을 미친다: (1) 피브리노겐의 단량체성 피브린으로의 전환이 억제된다; (2) 인자 XIII로부터 가용성 피브린을 불용성 피브린 매트릭스로 전환시키는 인자 XIIIa로의 성숙이 방해된다; 가용성 피브린은 불용성 피브린보다 플라스민에 의한 단백질성 분해에 더 민감하다; (3) 인자 Va 및 VIIIa (트롬빈 형성의 피드 백 촉진인자)의 형성이 억제된다; (4) 플라스미노겐 활성인자 억제인자 1 (PA I-1)이 단백질 분해적으로 분해된다; 반면 (5) 트롬보 모듈린-트롬빈 복합체(thrombomodulin-thrombin complex)중에 결합된 트롬빈은 트롬빈 억제인자에 의해 억제되지 않는다; 따라서 복합체는 단백질 S와 함께 인자 Va 및 VIIIa를 단백질 용해적으로 분해시키는 단백질 C의 활성인자로서 계속 작용할 수 있다. 플라스미노겐 활성인자 t-PA 자체의 작용으로 인하여 활성화된 혈소판에 의해 중재된 국부적인 과-응집성이 유도된다[참조문헌: R.J. Sheberski et al., Thromb. Res. 52, 381 (1988)]. 따라서 , 트롬빈 억제인자는 피브린의 연속적인 형성 및 새로이 형성된 피브린의 연속적인 침착에 의한 혈전의 성장을 방해하는 것으로 추측된다. 더욱이, scu-PA는 Arg156-Phe157결합에서 트롬빈에 의해 분해되어 두개의 불활성형 쇄를 생성하기 때문에 트롬빈 억제인자를 동시에 투여하지 않아도 불활성이다.
또한, 분해되는 동안, 상당량의 피브린이 순환중에서 생성된다[참조: Owen et al., Blood 72, 616-620 (1988); H.J. Rapold et al., Circulation 79, 980-988 (1988)]. 전체적으로, 플라스미노겐 활성인자를 통한 용해는 혈전생성력 및 혈전 붕괴력간의 불균형을 초래하여 국부적으로 및 전신적으로, 존재하는 혈병의 불완전한 용해, 동일부위에서의 신속한 재폐색 및 다른 가능성 부위에서 새로운 혈병의 형성을 초래한다. 헤파린에 의한 응고 억제는 용해의 이러한 부작용을 예방하지 못할 것이다(Rapold, 상기 문헌).
이용되는 첫번째 결과에 의해 나타난 바와 같이, 플라스미노겐 활성인자와 트롬빈 억제인자의 병용 투여는 통상의 피브린용해성 플라스미노겐 활성인자 치료 요법에서 발생하는 재폐색 문제를 해결하는데 도움을 줄 수 있다. 그러나, 헤파린 또는 아르기닌 유도체와 플라스미노겐 활성인자의 병용투여에 있어 관찰된 비교적 적은 항응고 효과의 견지에서, 응고 시스템에 더 뚜렷한 억제효과를 발휘하여 피브린용해 치료요법에서 발생하는 재폐색 문제를 최소화하는 플라스미노겐 활성인자와 강력한 트롬빈 억제인자의 배합물이 요구되고 있다. 강력한 트롬빈 억제인자와 병용함으로써 혈병을 용해시키는데 요구되는 플라스미노겐 활성인자의 양 및 추가로 혈병 용해에 요구되는 시간이 감소된다. 이러한 사실은 생명에 위협을 주는 증상을 다루는 경우에 특히 중요하다. 본 발명의 목적은 응고 질환의 병용된 항응고/피브린용해 치료시 사용하기 위한 개선된 배합물을 제공한다.
놀랍게도, 피브린용해성 플라스미노겐 활성인자를 혈전치료제 히루딘과 병용하여 적용하는 경우 혈전 붕괴가 현저히 촉진되고 재폐색 위험이 매우 감소된다는 사실이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 성분 A로서 플라스미노겐 활성인자와 성분 B로서 히루딘을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
적합한 플라스미노겐 활성인자는 천연 공급원으로부터 수득되거나, 또는 형질전환된 포유동물 세포 또는 이.콜라이(E. coli) 또는 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 형질전환된 미생물로부터 재조합 DNA 기술을 통하여 수득되는 당화, 부분당화 또는 비당화 형을 포함한 이본쇄 또는 바람직하게는 일본쇄형의 사람 t-PA 및 사람 u-PA이다. 이러한 플라스미노겐 활성인자의 예는 문헌[참조: M. Winkler et al. in Biochemistry 25, 4041-4045 (1986); B. Rotzkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3313-3317 (1981); D. Pennica et al., Nature 301, 214-221 (1983); 및 유럽 특허원 제41,766호, 제92,182호, 제93,619호 및 제143,081호]에 기술되어 있다.
플라스미노겐 활성인자라는 용어에는 사람 u-PA 및 사람 t-PA의 돌연변이체, u-PA/t-PA 하이브리드 플라스미노겐 활성인자 및 이의 돌연변이체, 특히 일본 쇄 돌연변이체 및 하이브리드, 또한 피브린용해 활성을 보유하는 이들의 단편도 포함된다.
돌연변이체는 특히 PA 프로테아제에 대해 내성을 갖게 되는 돌연변이체이다. 이러한 돌연변이체는 트롬빈 또는 플라스민과 같은 혈액중에 존재하는 프로테아제에 의해 단백질 분해 부위에서 공유결합적으로 변형되어, 이들 위치에서의 프로테아제 가수분해에 대하여 더이상 민감하지 않게 된다. u-PA의 타겟 부위에는 Lys135내지 Lys136(이 부위에서 분해되면 소위 저분자량 형태의 scu-PA 또는 LUK가 생성된다), Arg156내지 Phe157(트롬빈 공격에 민감한 부위) 및 Lys158내지 Ile159(플라스민에 의한 이 부위에서의 분해는 tcu-PA를 생성시킨다)가 포함된다. 적합한 u-PA 돌연변이체는 하나이상의 이들 타겟부위에서 아미노산 잔기가 부위 특이적 치환, 삽입 또는 결실되었다. 타겟 부위를 형성하는 하나의 아미노산 잔기 또는 두 아미노산 잔기 모두가 결실되거나 이들 아미노산 잔기중 하나 이상이 다른 아미노산 잔기로 대체되어 생성된 돌연변이체가 단백질 분해성 공격에 내성인 돌연변이체로 되는 것이 특히 바람직하다 (참조: 유럽 특허원 제200,451호, 제210,279호 및 제288,435호).
u-PA의 추가의 돌연변이체에 있어서, Asn302(Asn302-Ser-Thr)에서 존재하는 유일한 N-당화 부위는 이 부위에서 당화가 일어나지 않도록 변형된다.
scu-PA 및 바람직한 scu-PA 돌연변이체는 하기 서열식(I)을 갖는다.
Figure kpo00002
상기 서열식에서,
X1및 X2는 각각 독립적으로 Lys, 염기성 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기 또는 화학결합을 나타내고,
Y1는 Arg, 염기성 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기 또는 화학결합을 나타내며,
Y2는 Phe, 산성 아미노산 잔기 또는 화학결합을 나타내고,
Y3는 Lys, 염기성 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기 또는 화학결합을 나타내며,
Z1은 바람직하게는 효모-특이적으로 당화된 Asn이거나, 다른 아미노산 잔기이고,
Z2는 Thr 또는 Ser과 상이한 다른 아미노산 잔기이다.
아미노산 잔기란 용어에는 산성 아미노산 잔기(예: 글루탐산 및 아스파르트산 잔기), 염기성 아미노산 잔기(예: 아르기닌, 리신 및 히스티딘 잔기) 및 중성 아미노산 잔기(예: 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 글리신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신 또는 프롤린 잔기)와 같은, 유전적으로 암호화된 아미노산 잔기 모두가 포함된다.
N-당화 부위에서의 당화를 방지하기 위하여, N-당화에 대한 시그날로서 인지되는 트리펩타이드 서열, -Asn-L-Thr (또는 Ser)- (여기에서, Asn는 수용체이고, L는 당화를 방해하는 프롤린 또는 아스파르트산을 제외한 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산중 하나일 수 있다)를 변형시켜야 한다. 상기 트리펩타이드 서열중의 Asn(Z1) 및/또는 Thr(Z2) 잔기를 기타의 아미노산으로 치환시킴으로써 이 부위에서는 배당결합이 형성되지 않는다. 편의를 위하여, N-당화 부위의 변형은 단백질 수준에서 수행하지 않는다. 대신, 숙주에 의한 상기 변형된 유전자의 발현시, N-당화 부위를 이 부위에서 당화가 일어날 수 없도록 변형시킨 돌연변이체 scu-PA가 생성되도록 하는 방식으로 scu-PA를 암호화하는 유전자를 변형시키는 것이 유리하다. 이들 아미노산을 치환하기 위해서는, 치환될 아미노산과 유사한 크기 및 극성을 갖는 아미노산들이 바람직하다. 가능한 치환체의 수는 상응하는 DNA 및 가능한 코돈 중의 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 제한된다. 특히, 아스파라긴은 발린, 루이신, 이소루이신, 알라닌, 세린, 트레오닌 또는, 특히 글루타민에 의해, 트레오닌은 발린, 메티오닌 또는, 특히 알라닌에 의해 치환된다(유럽 특허원 제288,435호 참조).
일반식(I)의 바람직한 scu-PA 화합물은 X1이 Lys, Gly 또는 Ser이고, X2가 Lys이며, Y1이 Arg이고, Y2가 Phe, Asp 또는 Glu이며, Y3가 Lys이고, Z1이, Asn 또는 Gln이며 Z2가 Thr인 화합물이다.
상응하는 scu-PA 돌연변이체는 [Gly135]-scu-PA, [Ser135]-scu-PA, [Asp157]-scu-PA, [Ser135, Asp157]-scu-PA 및 [Gly135, Asp157]-scu-PA (여기에서, Asn302는 효모 특이적으로 당화됨), 및 추가의 [Gln302]-scu-PA, [Gly135, Asp157, Gln302]-scu-PA 및 [Ser135, Asp157, Gln302]-scu-PA이다.
프로테아제에 의한 단백질 분해성 공격에 대한 t-PA의 타겟 부위는 서열 Phe274-Arg275-Ile276-Lys277내에 있다. 적합한 t-PA 돌연변이체는 이 부위에서 아미노산 잔기가 특이적으로 치환, 삽입 또는 결실되어 단백질 분해성 공격에 대해 내성을 갖는다(상기 참조). (유럽 특허원 제225,286호, 제227,462호 및 제233,013호 참조).
t-PA 분자중에는 3개의 N-배당결합 부위가 존재한다: -Asn117-Ser-Ser-, Asn184-Gly-Ser- 및 Asn448-Arg-Thr-.
T-PA 및 t-PA 당화 돌연변이체는 예를들어, 하기의 서열식(II)을 갖는다.
Figure kpo00003
상기 서열식에서,
X1, X2및 X3는 각각 Asn 또는 다른 유전적으로 암호화된 아미노산이고,
Y1및 Y2는 각각 Ser이거나 Thr 이외의 다른 유전적으로 암호화된 아미노산이며,
Y3는 Thr이거나 Ser 이외의 다른 유전적으로 암호화된 아미노산이다.
더욱 특히, t-PA 단백질은 X1, X2및 X3가 각각 Asn이고, Y1, Y2및 Y3가 전술한 바와 같은 서열식(II)로 나타낸다.
유전적으로 암호화된 아미노산은 상기 언급한 것들이다.
위치 X1, X2및/또는 X3중의 Asn을 치환하기 위해서는 아미노산 Gln, Thr 및 Ser이 바람직하다. Y1및/또는 Y2중의 Ser 및 Y3 중의 Thr을 치환하기 위해서는 아미노산 Ala 및 Asn이 바람직하다.
특히, 라디칼 X1및 Y1중 하나만 및/또는 라디칼 X2및 Y2중 하나만 및/또는 라디칼 X3및 Y3중 하나만이 다른 아미노산에 의해 치환된다.
특히, t-PA 돌연변이체는 라디칼 X1, X2및 X3중 1개, 2개 또는 3개가 Asn이고 나머지(들)가 Gln, Thr 및 Ser 중에서 선택된 아미노산 잔기이며, Y1및 Y2가 각각 Ser이고 Y3가 Thr이거나; X1, X2및 X3가 각각 Asn이고, 라디칼 Y1및 Y2중 1개 또는 2개가 Ser이고 나머지(들)가 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며 Y3이 Thr이거나; 또는 X1, X2, 및 X3가 각각 Asn이고, Y1및 Y2가 각각 Ser이며 Y3이 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 서열식(II)로 표시된다.
특히, t-PA 돌연변이체는 X1, X2및 X3가 각각 Asn이고, 라디칼 Y1, Y2및 Y3중 적어도 하나가 Ala 또는 Asn이며, 나머지(들)가 Ser(Y1및 Y2) 또는 Thr(Y3)인 서열식(II)로 표시된다.
이러한 t-PA 돌연변이체의 예는 [Asn119]-t-PA, [Ala186]-t-PA, [Ala450]-t-PA, [Asn119, Ala186]-t-PA, [Asn119, Ala186, Asn450]-t-PA 및 [Asn119, Ala186, Ala450]-t-PA이다.
u-PA 및 t-PA의 단편은 특히 피브린 용해 활성에 필수적이지 않은 천연 u-PA 또는 t-PA의 단편 또는 영역이 결실된 단편들이다. 이러한 단편 및 이들의 제조방법은 공지되어 있다.
u-PA/t-PA 하이브리드 플라스미노겐 활성인자는, 특히 유럽 특허원 제277,313호에 기술된 바와 같이, 사람 t-PA의 촉매영역에 연속적으로 연결되어 있는 사람 u-PA의 모든 A-쇄 영역 또는 분리된 A-쇄 영역, 또는 사람 u-PA와 사람 t-PA의 분리된 A-쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열을 포함한 일본쇄 하이브리드 PA, 및 사람 u-PA의 촉매 영역에 연속적으로 연결되어 있는 사람 t-PA의 모든 A-쇄 영역 또는 분리된 A-쇄 영역, 또는 사람 t-PA와 u-PA의 분리된 A-쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 일본쇄 하이브리드 PA이거나, 또는 u-PA 크링글(kringle)로부터 u-PA 활성화 부위까지의 아미노산 단편이 t-PA 크링글 2로부터 t-PA 활성화 부위까지의 아미노산 단편으로 치환된 점에서 u-PA와는 상이한 일본쇄 하이브리드 PA이다.
바람직한 하이브리드 PA는 사람 u-PA의 촉매 영역을 포함한다.
특히, 일본쇄 하이브리드 PA는 사람 t-PA의 모든 A-쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열, 사람 t-PA의 핑거 영역(finger domain) 또는 크링글, 특히 크링글2 영역과 같은 사람 t-PA의 분리된 A-쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열, 및 사람 t-PA 및/또는 사람 u-PA의 A-쇄 영역 2개, 3개 또는 4개, 특히 사람 t-PA의 핑거, 성장 인자 및 크링글2 영역, 사람 t-PA의 핑거 및 크링글2 영역 또는 u-PA 성장인자 및 t-PA 크링글2 영역과 같은, 사람 t-PA의 영역 2개 또는 3개, 또는 사람 u-PA와 사람 t-PA의 영역 2개 또는 3개를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 이 아미노산 서열은 사람 u-PA의 촉매영역, 및 사람 t-PA의 촉매 영역에 연속적으로 연결된, u-PA 성장인자 및 t-PA 크링글2 영역을 함유하는 아미노산 서열에 연속적으로 연결되어 있다.
바람직하게는, 하이브리드 PA 아미노산 서열은 t-PA의 N-말단 아미노산 1 내지 5개 또는 u-PA의 N-말단 아미노산 1 내지 12개로 개시되거나 하이브리드 PA의 제1영역에 천연적으로 N-말단 연결된 연접 서열(junction sequence) 또는 바람직하게는 5개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 연접 서열의 단편으로 개시된다.
하이브리드 PA에 있어서, A-쇄 영역은 천연 연접 서열, 융합된 연접 서열이나 하이브리드 연접 서열 또는 이의 단편을 통하여 연결된다. 즉, 제1영역은 제1영역의 C-말단에 천연적으로 존재하는 연접 서열, 제2 영역 N-말단에 천연적으로 존재하는 연접 서열, 이들 연접 서열들로 이루어진 융합된 연접 서열 또는 이의 단편에 의해 제2영역에 연결된다.
본 발명에 따른 하이브리드 PA의 A-쇄 영역은 크링글2 영역을 사람 t-PA중의 B-쇄에 연결하는 연접 서열, 크링글 영역을 사람 u-PA중의 B-쇄에 연결하는 연접 서열 및 이들 연접 서열의 아서열(subsequence)로 이루어진 하이브리드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 연접 서열에 의해 B-쇄 세린 프로테아제 영역에 연결되며, 언급된 연접 서열은 플라스민에 의해 N-말단적으로 분해될 수 있는 프로쎄싱 부위, 촉매성 B-쇄 영역에 대한 황-황 브리지에 관여할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하며, 연접 서열은 바람직하게는 40개 이상 및 60개 이하의 아미노산 잔기를 갖는다.
상응하는 DNA상에서 엑손(exon)-인트론(intron) 연접에 의해 규정된 위치에서 영역의 연접이 가장 바람직하다. B-쇄에 대한 A쇄의 연접은 가장 바람직하게는 활성화 부위에 있다.
특히 일본쇄 하이브리드 플라스미노겐 활성인자는 u-PA의 A쇄 또는 t-PA 촉매 영역(B-쇄)에 연속적으로 연결된 필수적으로 u-PA 성장인자 및 t-PA 크링글2 영역으로 이루어진 A-쇄를 포함하는 하이브리드 플라스미노겐 활성인자, 및 u-PA의 촉매 영역(B-쇄)에 연속적으로 연결된, t-PA의 A-쇄, 필수적으로 t-PA의 핑거 영역으로 이루어진 A-쇄, 필수적으로 u-PA 성장인자와 t-PA 크링글2 영역으로 이루어진 A-쇄, 필수적으로 t-PA 핑거 및 크링글2 영역으로 이루어진 A-쇄 또는 필수적으로 t-PA 핑거, 성장인자 및 크링글2 영역으로 이루어진 A쇄를 포함하는 하이브리드 플라스미노겐 활성인자로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 여기서, A-쇄는 활성화 부위 및 B-쇄에 대해 황-황 브릿지를 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하는 연접 서열을 통하여 B-쇄에 연결되거나 일본쇄 하이브리드 플라스미노겐 활성인자는 활성화 부위에서 u-PA의 촉매 영역(B-쇄)에 연결된 t-PA 크링글2 영역으로 필수적으로 이루어진 A-쇄를 포함한다.
필수적으로 u-PA 성장인자 영역 및 t-PA의 촉매 영역(B-쇄)에 연속적으로 연결된 t-PA 크링글2 영역으로 이루어진 A-쇄를 포함하는 하이브리드 PA, 및 필수적으로 t-PA 크링글2 영역이나 t-PA 핑거 및 u-PA의 촉매 영역(B-쇄)에 연속적으로 연결된 크링글2 영역으로 이루어진 A-쇄를 포함하는 하이브리드 PA로 이루어진 그룹중에서 선택된 일본쇄 하이브리드 플라스미노겐 활성인자가 특히 바람직하며, A-쇄 영역(들)과 B-쇄의 연접부위는 활성화 부위에 존재한다.
본 발명에 따른 바람직한 하이브리드 PA는 다음과 같다.
Figure kpo00004
특히 바람직한 하이브리드 플라스미노겐 활성인자는 [uPA(1-44)-tPA(176-527)], [tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)] 및 [tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411)]이다.
하이브리드 PA의 돌연변이체에 있어서, 하나 이상, 바람직하게는 모든 N-당화 부위는 이(들) 부위(들)에서 당화가 될 수 없도록 변형된다.
특히, 아스파라긴은 발린, 루이신, 이소루이신, 알라닌 또는 특히 글루타민에 의해, 및 세린 또는 트레오닌은 발린, 메티오닌 또는, 특히 알라닌에 의해 치환된다.
바람직한 변형된 하이브리드 PA는 다음과 같다.
Figure kpo00005
Figure kpo00006
히루딘이란 용어에는 거머리 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)와 같은 천연 공급원으로부터 수득된 히루딘, 재조합 DNA 기술을 통해 수득된 히루딘, 및 고유의 트롬빈 억제 활성을 보유하는 이들의 돌연변이체 및 단편이 포함된다. 이러한 다수의 히루딘은 문헌[참조: D. Tripier, Folia Haematol. 115, 30 (1988)]에 공개되어 있다.
본 발명에 따른 조성물의 히루딘 성분은 예를 들어, 하기의 서열식(III)을 갖는 히루딘 변이체 HV1[참조: D. Bagdy et al., Methods Enzymol. 45, 669-678 (1976); 미합중국 특허 제4,745,177호], 하기의 서열식(IV)을 갖는 히루딘 변이체 HV2[참조: R.P. Harvey et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83, 1084-1088 (1986)] 및 하기의 서열식(V)을 갖는 히루딘 변이체 PA[참조: J. Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986)] 또는 언급된 히루딘 변이체중 어느 하나의 단편 또는 돌연변이체이다.
Figure kpo00007
Figure kpo00008
Figure kpo00009
상기 서열식에서,
W는 Tyr의 페놀성 하이드록시 그룹(데설파토 히루딘 HV1) 또는 구조식-O-SO3H의 그룹(히루딘 HV1)이다.
특히 데설파토 히루딘 HV1이 바람직하다.
이러한 히루딘 변이체, 특히 히루딘 변이체 HV1의 적합한 단편은 예를들어, 문헌[참조: FEBS Lett. 211, 10 (1987), J. Med. Chem. 31, 1009 (1988), Biochemistry 27, 8170 (1988), J. Biol. Chem. 264, 8692 (1989)] 및 유럽 특허 제276014호에 공지되어 있으며, 이는 예를 들면 히루딘 HV1 또는 PA의 9 내지 30개 C-말단 아미노산으로 이루어져 있다. 또한, 단편에는 예를들면, C-말단 아미노산 Gln 또는 C-말단 디펩타이드 잔기 Leu-Gln이 결손된 히루딘 HV1이 포함된다.
본 발명에 따른 히루딘 돌연변이체에는 코어(core) 영역중의 N-말단에서, 또는 C-말단에서 부위 특이적 돌연변이된, 히루딘, 특히 히루딘 HV1이 포함된다. 히루딘 HV1의 이러한 N-말단 돌연변이체는 예를 들어, [Ile1,2]-데설파토 히루딘 HV1(여기서, N-말단 아미노산 Val-Val은 Ile-Ile로 치환됨) 또는 [Gly1]-데설파토 히루딘 HV1(여기서, N-말단 아미노산 Val은 Gly로 치환됨)이다. 히루딘 HV1의 상응하는 C-말단 돌연변이체에는 예를들어, [Gln57, 58, 61, 62]-데설파토 히루딘 HV1(여기서, 아미노산 57, 58, 61 및 62는 Gln으로 치환됨) 및 [Pro66]-데설파토 히루딘 HV1(C-말단에서 추가의 Pro 잔기를 포함함)이 포함된다. 데설파토 히루딘 HV1의 상응하는 코어 돌연변이체에는, 예를 들어, N-말단에 여분의 Met 잔기를 추가로 포함할 수 있는 [Gln27, Arg47]-데설파토 히루딘 HV1([Met0, Gln27, Arg47]-데설파토 히루딘 HV1) 및 [Gln27, Gln36Arg47]-데설파토 히루딘 HV1이 포함된다. 추가로 돌연변이체는 [des-Val1, Thr2]-데설파토 히루딘 HV1이다. 히루딘 HV2의 돌연변이체는 예를 들어, [Lys47]-히루딘 HV2이다. 이들 돌연변이체는 모두 공지되어 있거나 본 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 각각의 모(parent) 히루딘 암호화 유전자를 부위-특이적 돌연변이 유발시켜 돌연변이된 히루딘 유전자를 효모와 같은 적합한 숙주내에서 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
언급된 히루딘의 추가의 돌연변이체는 예를 들어, 유럽 특허원 제273,800호에 기술되어 있다.
특히, 본 발명은 성분 A로서
(1) scu-PA,
(2) t-PA,
(3) X1, X2및 X3가 각각 Asn이고, 라디칼 Y1, Y2및 Y3중 하나 이상이 Ala 또는 Asn이며 나머지(들)가 Ser(Y1및 Y2) 또는 Thr(Y3)인 일반식(II)의 sct-PA 돌연변이체, 및
(4) 필수적으로 t-PA의 촉매영역(B-쇄)에 연속적으로 연결된 u-PA 성장인자 영역 및 t-PA 크링글2 영역으로 이루어진 A-쇄를 포함하는 하이브리드 PA, 및 필수적으로 t-PA 크링글2 영역으로 또는 u-PA의 촉매영역(B-쇄)에 연속적으로 연결된 t-PA 핑거 및 크링글2 영역으로 이루어진 A-쇄를 포함하는 하이브리드 PA 중에서 선택된 일본쇄 u-PA/t-PA 하이브리드 플라스미노겐 활성인자(여기서, A-쇄(들)와 B-쇄간의 연접부위는 활성화 부위에 존재한다)와 성분 B로서 데설파토 히루딘 HV1을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 가장 바람직한 약제학적 조성물에 있어서 성분 A는 scu-PA, t-PA, [Ala 450]-t-PA, [Asn 119, Ala 186, Ala 450]-t-PA, [uPA(1-44)-tPA(176-527)], [tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA (159-411)] 및 [tPA(1-3)-tPA (176-275)-uPA(159-411)]로 이루어진 그룹중에서 선택되고, 성분 B는 데설파토 히루딘 HV1이다.
본 발명에 따른 플라스미노겐 활성인자 및 히루딘은 공지된 화합물이다. 특히 바람직한 화합물은 예를들어, 유럽 특허원 제143,081호, 제225,286호, 제200,655호, 제225,633호 및 제277,313호에 기술된 바와 같이 형질전환된 포유동물 세포 또는 효모 세포를 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 PA 및 히루딘이다.
본 발명에 따른 신규 배합물은 혈전증, 또는 혈전증, 동맥경화증, 심근경색 및 뇌경색, 정맥 혈전증, 혈전색전증, 수술후 혈전증 및 혈전증 정맥염등에 의해 유발된 질환의 예방 또는 치료를 위하여 포유류(사람 또는 동물)에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 정맥내 투여와 같이 비경구 투여하거나 히루딘으로서 피하투여하며 상기 언급한 증상을 치료하는데 사용될 수 있다.
적합한 주입 또는 주사액, 바람직하게는 등장성 수용액 또는 현탁액이 존재하며, 이들은 사용하기 전에 예를 들어, 활성성분(들)만을 함유하거나 활성성분과 만니톨, 락토스, 덱스트로스, 사람 혈청 알부민 등과 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 함께 함유하는 동결건조된 제제로부터 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균시키며, 경우에 따라, 보조제, 예를들어 방부제, 안정화제, 유화제, 가용화제, 완충제 및/또는 등장성 조절을 위한 염(예를들어, 0.9% 염화나트륨)과 혼합시킨다. 경우에 따라, 조성물을 동결건조시킨후에 작은 공극 크기(0.45㎛ 직경 또는 그 이하)의 필터를 통한 멸균 여과에 의해 멸균시킬 수 있다. 멸균성을 보존하기 위하여 항생물질을 또한 가할 수 있다. 예를들어, PA 투여를 위해 개발된 표준 제형 기술(즉, 유럽 특허원 제93,619호, 제41,766호, 제112,940호 및 기타) 또는 저 pH 완충된 매질중에서 PA에 대해 충분한 용해도를 부여하는 신규 조성물(예를들어, 유럽 특허원 제211,592호, 독일연방공화국 공개특허공보 제3,617,752호, 제3,617,753호, 제3,642,960호)이 사용될 수 있다. 히루딘은 수용액 중에서 매우 가용성이고 용해도를 증가시키기 위한 첨가제를 요하지 않는다. 안정성 문제를 위하여, 5% 덱스트로스 또는 5% 만니톨 또는 0.9% 염화나트륨 등에서 동결건조된 샘플을 재구성하도록 권장하고 있다.
본 발명에 따른 배합물은 활성성분(플라스미노겐 활성인자 및 히루딘)상태로 동시에 및 동일경로(즉, 캐뉼라)에 의해 투여(예: 주입)되거나 먼저 히루딘을 바람직하게는 거환주사에 의해 적용시킨 후, 이어서 적용시킨지 5 내지 10분내에, 제2성분, 특히 플라미스노겐 활성인자를, 바람직하게는 주입하거나 또는, 특히, 소량, 예를들어 5 내지 20%의 플라스미노겐 활성인자와 함께 총 용량의 히루딘을 거환주사에 의해 먼저 적용시킨 후, 이어서, 적용한지 5 내지 10분내에 주요량의 플라스미노겐 활성인자를 주입한다. 주입은 30분 내지 3시간 내에 수행한다.
질환의 유형 및 환자의 연령과 증상에 따라, 체중이 약 70kg인 환자를 치료하는데 1회 투여되는 일일 용량은 10 내지 200, 특히 20 내지 100mg범위의 플라스미노겐 활성인자 및 5 내지 100mg, 특히 10 내지 30mg의 히루딘이다[특히, 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간(aPTT)이 2배 연장되도록 하는 용량]. 따라서, 조성물중의 플라스미노겐 활성인자와 히루딘간의 중량비는 일반적으로 20:1 내지 2:1로 변할 수 있다. 바람직하게는 5:1 내지 2:1의 중량비로 사용된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단위용량형 중에, 예를들어, 치료학적 유효량의 2개 성분(플라스미노겐 활성인자 및 히루딘)을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 앰플중에, 또는 바람직하게는 치료학적 유효량의 성분을 별개로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 이중 앰플중에 분배된다.
본 약제학적 조성물은 통상적인 동결건조 또는 용해 공정을 적용하는 공지의 방법, 예를들어, 필요하다면 플라스미노겐 활성인자와 히루딘 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하고, 동결건조제제를 제조하기 위하여, 수득된 수용액을 동결건조시킴으로써 제조된다. 조성물은 약 0.1 내지 20%, 특히 약 1 내지 10%의 활성성분을 함유하고, 동결건조제제의 경우 100% 이하의 활성성분을 함유한다.
본 발명은 또한 사람 또는 동물의, 특히 상기 언급한 임상적 증상의 예방 및 치료, 특히 사람 또는 동물에 있어서 혈전증 또는 혈전증에 의해 유발된 질환의 예방 및 치료를 위한 본 발명에 따른 배합 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은 히루딘이 기계적인(PTCA) 또는 화학적인(용해) 수단에 의해 이미 개방된 혈관(정맥 또는 동맥)의 재폐색율(새로운 혈전의 형성)을 현저히 감소시킴으로써 응고 장해를 명확히 치유하는 가능성을 향상시키는 강력한 제제라는 놀라운 관찰에 근거한다. 따라서, 본 발명은 포유동물에게 치료학적 유효량의 히루딘을 투여하여, 포유동물에 있어 이전에 폐색되어 기계적으로나 화학적으로 재개방된 혈관의 재폐색을 예방하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 폐색된 혈관을 개방시킨 후, 예를들어, 플라스미노겐 활성인자를 임의로 혈전치료제와 병용하여 혈전용해 치료요법을 마친직후 히루딘을 투여한다. 질환의 유형 및 환자의 연령과 증상에 따라 체중이 약 70kg인 환자를 치료하는 경우 주입 또는 바람직하게는 2회의 거환주사에 의해 투여되는 히루딘의 1일 용량은 20 내지 100mg, 특히 약 50 내지 70mg 범위이다. 히루딘을 사용하는 재폐쇄 억제 치료요법은 재폐쇄될 위험이 최소가 될때까지, 예를들어 약 1 내지 3주, 특히 약 2주간 계속한다.
하기에 본 발명의 실험부의 다양한 양태를 첨부된 도면을 참조로 기술하였다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하며 이로써 제한되지는 않는다.
[실시예 1]
[시험관내 혈병 용해]
사람의 혈액을 3.8% 나트륨 시트레이트 용액중에 직접 취한다(혈액/시트레이트 용액비:9:1). 혼합물을 1,000rpm에서 10분간 원심분리하여 시트레이트화된 혈장을 수득한다.
0.9% 염화나트륨 중 150㎕의 시트레이트화된 혈장, 125㎕의 0.9% 염화나트륨 용액 및 100㎕의 데설파토 히루딘 HV1 또는 MCI-9038(하기 참조)로 이루어진 혼합물을 37℃에서 평형화시킨 1ml 큐벳중에서 직접 제조한다. 혼합물을 37℃에서 15분간 항온처리한다. 이어서 25㎕의 l㎍/ml t-PA 스톡액(American Diagnostica, New York) 및 300㎕의 0.0025M 염화칼슘 용액을 가하여 응고를 개시한다.
역학적 프로그램이 장착된 Uvikon 810P 분광 광도계 내에서 608nm에서의 흡광도 변화(응고)를 계속 측정한다.
CaCl2용액을 가한후부터 0.025 보다 큰 흡광도 변화에 이르는 시간(분)을 응고시간으로서 정의한다. 혈병 용해시간(분)은 혈병이 생성되기 시작한후부터 흡광도가 최대 흡광도의 10%로 감소하는 시간에 이르는 시간으로서 정의된다.
트롬빈 억제인자 MCI-9038 [(2R,4R)-4-메틸-1-[N2-[(3-메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-8-퀴놀릴)-설포닐]-L-아르기닐]-2-피페리딘-카복실산]은 문헌[참조: S. Okamoto et at., Biochem, Biophys. Res. Common. 101. 440-446 (1981)]에 기술된 바와 같이 화학적으로 합성한다. 이 화합물은 최종농도 0.07, 0.14, 0.28, 0.56 및 1.lμM로 사용된다. 사용된 데설파토 히루딘은 유럽 특허원 제225,633호에 기술된 공정에 따라 형질전환된 효모를 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 제조되어 왔다. 이 화합물은 최종농도 0.8, 1.6, 3.2, 8 및 16nM로 사용된다. MCI-9038 및 데설파토 히루딘의 선택된 농도는 혈병 생성시간(응고)의 연장 측면에 있어서 동일 효능 농도, 예를들어, aPTT(활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간)를 동일하게 연장시키는 1.2μM MCI-9038 및 16nM 데설파토 히루딘이다.
데설파토 히루딘에 있어서 특정 농도에 의해 발휘되는 바와같은 동일 효과를 달성하기 위하여는, 20배 농도의 MCI-9038이 사용되어야 함이 명백하다.
[실시예 2]
[토끼 경정맥 혈전증 모델]
30mg/kg 나트륨 펜토바비탈을 정맥내(가장자리의 귀정맥) 주사하여 마취시킨 뉴질랜드산 흰 토끼(체중 2.3 내지 3.5kg)를 사용하여 실험을 수행한다.
경부의 2차적인 의학적 절개를 통하여, 경정맥 및 우측 경동맥을 노출시킨다. 우측 경동맥에 혈액 샘플링을 위해 1.5mm 직경의 폴리에틸렌 캐뉼라를 삽관시킨다. 2개의 경정맥을 분리하여, 2cm 거리로 간격을 두어 작은 측분관을 결찰시킨다. 각각의 경정맥 단편에서 혈액을 제거하고 전반부와 말단 양쪽을 1.5cm 떨어진 거리에서 지혈하여 혈액을 일시적으로 폐색시킨다. 콜라겐 용액에 미리 침지시킨 10cm 길이의 3.0 TiCron 편조된 폴리에스테르 봉합선을 생성될 혈전의 색전증화를 피하기 위하여 4cm 거리에 대하여 분리된 경정맥의 관강증에 길이방향으로 도입시킨다. 이어서, 5㎕의 125I-피브리노겐(약 500,000cpm)을 함유하는 150㎕의 시트레이트화된 토끼 혈액을 50㎕(5 I.U.)의 트롬빈 및 10㎕의 CaCl2(0.25M)를 함유하는 1ml 튜베르콜린 주사기(tubercoline syringe)중에 흡입시킨다. 성분들을 신속히 혼합하고 25게이지 바늘을 통하여 경정맥의 분리된 단편내로 주사한다. 30분간 혈전이 형성되도록하고 이어서 양쪽의 혈관 클램프를 제거하여 혈액이 다시 흐르게 한다.
a) 데설파토 히루딘 HV1에 의해 t-PA 유도된 용해의 증진
일정 속도의 주입 펌프를 사용하여 정맥내 주입한다. 흑색종 세포 배양으로부터 유도된 t-PA는 BioResponse(USA)로부터 입수한다. 3시간에 걸쳐 가장자리의 귀정맥을 통하여 총용량 0.5mg의 t-PA를 주입한다. t-PA와 함께 생리식염수, 표준화된 헤파린(Kabivitrm, Sweden, 140 USP/mg; 0.75mg/kg) 또는 히루딘(1mg/kg)을 주입한다. 헤파린 및 히루딘의 용량은 대조실험에 있어, aPTT(활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간)에서의 동일한 연장, 예를들어 2배를 유도하는 용량을 사용한다.
대조군으로서, 동물그룹을 t-PA의 첨가없이 생리식염수와 함께 주입한다. 주입 마지막에, 혈관증에 잔류하는 혈전을 제거하고, 혈전증에 잔류하는125I-표지된 피브리노겐의 잔류량을 측정하고 생리식염수 대조군에서 측정한 결과와 비교함으로써 이들의 크기를 측정한다.
실험결과를 표1에 요약하였다.
Figure kpo00010
b) t-PA 처리한 토끼에 있어서 데설파토 히루딘 HV1에 의한 혈전 증가 억제
t-PA를 사용한 혈전붕괴중 혈전증가 방해에 있어서 표준 헤파린 및 재조합 데설파토 히루딘의 효과는 토끼 경정맥중에서 수행한 자기(autologous) 비-방사성 혈전상으로 I-피브리노겐 증가를 억제하는 능력에 의해 평가된다. 표준크기의 비 방사선 혈전이 상술한 바와 같이 생성되었다. 혈전이 형성된지 15분후, 각 동물에게 10μCi의 I-피브리노겐을 주사한다. 5분후에 t-PA를 표준 헤파린 또는 데설파토 히루딘과 함께 주입하기 시작한다(실시예 2a에서와 같은 농도). 3시간 걸친 주입의 마지막에 가서, 혈전을 함유하는 정맥 단편을 묶고, 세로방향으로 절개하여 잔류혈전을 제거한다. 주입을 통하여 매시간 간격으로 수집한 혈액샘플의 평균으로부터 전체 혈액 피브리노겐의 특이 활성을 평가한다. 혈전 방사능 대 순환 피브리노겐 방사능 비를 사용하여 혈전 크기를 정량한 후, ㎍ 또는 혈전상에 증가된 I-피브리노겐으로 나타낸다.
결과를 제1도 및 제2도에 요약하였다.
표1은 혈병이 용해되는 동안에도 새로운 I-피브리노겐으로부터의 피브린이 예비형성된 혈병의 표면상에 침착됨(예를들어 t-PA만으로 52㎍)을 나타낸다. 헤파린은 유용한 효과를 확실하게 발휘하지 않는 반면(49㎍ 대 52㎍, 통계학적으로 현저하지 않음), 데설파토 히루딘은 혈전증가를 현저히 감소시킨다(SH: 표준 헤파린; SD: 표준 편차; r-HIR: 재조합 데설파토 히루딘).
제2도는 데설파토 히루딘의 농도가 증가함에 따라 효과가 더욱 강화될 수 있음을 나타낸다.
scu-PA 또는 u-PA/t-PA 하이브리드 플라스미노겐 활성인자와 같이 t-PA와는 상이한 플라스미노겐 활성인자, 또는 데설파토 히루딘 PA 또는 히루딘 돌연변이체와 같은 다른 히루딘 화합물을 병용치료에 사용하는 경우에도 동일한 효과가 관찰된다. 상응하는 히루딘 돌연변이체는 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
[실시예 3]
[데설파토 히루딘 HV1 돌연변이체의 제조]
A. 플라스미드 pML 350의 작제(제3도)
a) 플라스미드 pIN-III-ompA-2 DNA의 분해
10㎍의 플라스미드 pIN-III-ompA-2[참조: J. Ghrayeb et al., EMBO-J. 3, 2437 (1984)]를 25㎕의 100mM 트리스-HCl (pH 7.5), 50mM NaCl 및 100㎍/ml 젤라틴중에 용해하고 제한 엔도뉴클레아제 EocRI 및 BamHI으로 분해한다. 용액을 TNE로 조절하고 페놀/클로포름으로 추출한다. DNA 에탄올로 침전시킨다. 겔 용출에 의해 아가로즈 중에서 전기영동한 후 벡터 DNA pIN-III-ompA-2/EocRI/BamHI을 분리한다.
b) 플라스미드 pML 310 DNA의 분해
20㎍의 플라스미드 pML 310(유럽 특허원 제168342호)을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 BamHI을 사용하여 50㎕의 100mM 트리스-HCl (pH 7.5), 50mM NaCl 및 100㎍/ml 젤라틴중에서 분해한다. 용액을 TNE로 조절하고 페놀/클로로포름으로 추출한다. DNA를 에탄올로 침전시킨다. 겔 용출에 의해 아가로스 중에서 겔 전기 영동한후 F-F-DNA (히루딘 유전자)를 분리한다.
C) pML 310으로부터의 F1-F2-DNA (히루딘 유전자)와 벡터 DNA pIN-III-ompA-2-EocRI/BamHI의 연결
1㎍의 F-F-DNA (히루딘 유전자)/EocRI/BamHI 및 30㎍의 벡터 DNA pIN-III-ompA-2/EocRI/BamHI을 50㎕의 100mM 트리스-HI1 (pH 7.5), 50mM NaCl 및 100㎍/ml 젤라틴중에 용해시키고, TNE로 조절한다. 용액을 페놀/클로로포름으로 추출하고 DNA를 에탄올로 침전시킨다. DNA 침전물을 50mM 트리스-HCl (pH 7.8), 10mM MgCl, 10mM DTT, 0.5mM ATP 및 100㎍/ℓ 젤라틴의 용액 20㎕중에 용해시키고 15℃에서 25단위/㎕ TDNA 리가제(Biolabs)로 3시간 동안 처리한다. 이렇게 수행함으로써 재조합 플라스미드 pML 350을 제조하며, 이는 삽입된 F-F-DNA (히루딘 유전자)를 함유한다.
d) 플라스미드 pML 350을 사용한 이 콜라이 HB101의 형질전환
문헌[참조: Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159(1970)]에 기술된 바와같이 제조된 이.콜라이 HB101 세포를 칼슘으로 예비처리한다.
재조합 플라스미드 pML 350을 함유하는, c)에서 수득한 용액을 65℃에서 10분간 가열하여 T DNA 리가제를 불활성화시키고, 이어서 37℃로 냉각시킨다. 10μ의 수득된 반응 혼합물을 총용적 200㎕의 10mM MgCl및 10mM 트리스·HCl(pH 7.5) 중의 150㎕의 칼슘 처리된 이.콜라이 HB101 세포에 가한다.
계속하여, 이 혼합물을 얼음중에서 30분간 냉각시키고, 42℃에서 2분간 가열한 후, 37℃에서 1ml L-배지(Bacto 트립톤 10g/ℓ ; Bacto 효모 추출물 5g/ℓ : NaCl 5g/ ; 글루코스 5g/ℓ ; 암피실린 0.1g/ℓ)중에 50분간 방치한다. 이어서, 혼합물을 60㎍/ml 암피실린(Serva 제조원)을 함유하는 5한천 평판(McConkey Agar, Difco 제조원)상에 0.2ml 분취량으로 분산시킨다. 이어서, 한천 평판을 37℃에서 16 내지 18시간 유지시킨다. 형질전환된 이.콜라이 HB101 세포중 185개의 암피실린 내성 콜로니가 수득된다.
e) F-F-DNA를 함유하는 콜로니의 선별
6개의 형질전환된 콜로니를 니트로셀룰로스 필터 B85(Schleicher and Schull)상에 압착한다. 문헌[참조: Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1979)]에 따라, 콜로니를 용해시키고 이들의 변성된 DNA를 필터상에 고정시킨다. 계속해서 64℃에서 20ml(필터 1개당)의 4xSET[= 30mM 트리스·HCl(pH 8), 150mM NaCl, 1mM EDTA], 0.1% (w/v) Ficoll 400 (Pharmacia 제조원), 0.5% SDS, 50㎍/ml의 변성된 송아지 흉선 DNA 중에서 4시간동안 필터를 예비 하이브리드화시킨다. 계속하여 니트로 셀룰로스 필터를 64℃에서 16시간동안 20ml(필터 1개당)의 5xSET(w/v), 0.1%(w/v) Ficoll 400, 0.2% SDS 및 50㎍/ml 변성된 송아지 흉선 DNA중에 32p 방사 표지된 프로브(필터 1개당 약 10 내지 10 Carencov cpm)으로 처리한다. 올리고뉴클레오티드 46/64 상보체, 1/58, 96/67, 154/64 상보체로 이루어진 혼합물(유럽 특허원 제168 342호 참조)을 프로브로서 사용한다.
계속하여, 필터를 실온에서 2xSET, 0.2% SDS중에서 2회 세척하고, 이어서 60℃에서 2xSET, 0.5% SDS중에서 2회 세척한다(처음 30분, 그 다음 60분). 이어서, 필터를 3MM 페이터(Whatman 제조원) 사이에서 건조시키고 X-선 필름(Fuji)상에 -80℃에서 1 내지 2일간 강화 스크린(intensifying screen)과 함께 둔다.
수득된 방사선 사진은 추가의 프로쎄싱에 사용될 수 있는 5개의 양성 콜로니(클론)를 보여주며 이중 하나를 pML 350으로 나타낸다.
B. 플라스미드 pBH 109의 작제
플라스미드 pML 350은 다중-클로닝 링커(EcoRI, HindIII, BamHI 부위)를 포함한 pIN-III-ompA-2로부터 기원하므로, Ala, Gln, Phe, Met를 암호화하는 완전한 히루딘 유전자 앞쪽에 12개의 추가 염기쌍을 포함한다. 발현된 완전한 데설파토 히루딘을 수득하기 위하여, 27량체 올리고뉴클레오티드를 사용하여 시험관내 돌연변이 유발에 의해 이들 12개 염기쌍을 루프 아웃(loop out)한다.
a) pML 350/XbaI/BamHI(SI)의 제조
5㎍의 플라스미드 pML 350을 엔도뉴클레아제 XbaI 및 BamHI으로 분해한다. 아가로스상에서 전기영동한 후 겔 용출에 의해 2개의 XbaI-BamHI 단편(SI)중 더 큰 단편을 분리하고 1mM 트리스-HCl (pH 7.5) 0.1mM EDTA중에 용해시킨다.
b) pML 350/PvuI (sII)의 제조
5㎍의 플라스미드 pML 350을 엔도뉴클레아제 PvuI로 분해시킨다. 선형화된 DNA pML 350/PvuI을 37℃에서 30분간 3단위의 장 알칼리성 포스파타제(Boehringer 제조원)로 계속 분해한다. 효소를 65℃에서 60분간 용액을 가열함으로써 불활성화시킨다. 아가로스상에서 전기 영동한후 겔 용출에 의해 선형 pML 350/PvuI(SII) DNA를 분리하여 1mM 트리스-HCl (pH 7.5), 0.1mM EDTA중에 용해시킨다.
c) 올리고뉴클레오티드(27량체) I27의 제조
유럽 특허원 제168342호에 기술된 방법과 유사하게 하기의 DNA 단편(I27로 지정)을 합성한다.
Figure kpo00011
문헌[참조: Molecular Cloning, A Laboratory Manual(ed. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab. (1982), p. 125]에 기술된 바와 같이 (γ-32P)-ATP 및 T4폴리뉴클레오티드 키나제(Boehringer 제조원)를 사용하여 5'말단을 부인산화 반응시킨다.
d) 플라스미드 pBH 109의 작제
SI DNA 및 SII DNA 각각 0.3㎍을 27㎕의 1mM 트리스-HCl(pH 7.5), 0.1mM EDTA 중의 40pmol의 부인산화반응시킨 DNA 단편 I27과 혼합한다. 이 혼합물에 3㎕의 10x 폴리머라제-리가제 완충액(1M NaCl, 65mM 트라스-HCl pH 7.5, 80mM MgCl2및 10mM β-머캅토에탄올)을 가한다. 이 혼합물을 비등수욕중에서 3분간 가열하여 DNA 단편을 변성시킨다. 계속해서, 혼합물을 30℃로 점차 냉각시키고(약 1℃/분) 이 온도에서 30분간 항온처리한다. 추가로 혼합물을 4℃에서 30분, 이어서 얼음중에서 10분간 항온처리한다.
12㎕의 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 포스페이트(각각 7.5mM), 6㎕의 10mM ATP, 6㎕의 T4DNA 리가제(2.5U/㎕) 및 1.2㎕의 클레노우 DNA 폴리머라제(Boehringer 제조원, 5U/㎕)를 가하고 DNA 혼합물(총 용적 55㎕)을 12.5℃에서 16시간동안 항온처리한다.
변화되지 않은 출발 플라스미드 pML 350을 파괴하기 위하여 DNA 혼합물을 2단위의 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 37℃에서 1시간동안 분해한다. 이렇게 수행함으로써, 플라스미드 pBH 109가 형성된다. 플라스미드 pBH 109는 완전한 데설파토 히루딘 암호화 유전자에 대해 프레임 방향으로(in frame) 연결된 ompA-2 시그날 서열에 작동적으로 연결된 1pp 프로모터 및 1pp 프로모터/오퍼레이터를 함유한다.
e) 플라스미드 pBH 109를 사용한 이.콜라이 HB101의 형질전환
전술한 바와같이 칼슘 처리된 이.콜라이 HB101 세포를 사용하여 형질전환시킨다. 사용된 총 반응 혼합물은 55㎕이다.
f) 플라스미드 pBH 109를 함유하는 콜로니의 선별
100개의 형질전환된 콜로니를 배양하여 각 클로니로부터 플라스미드 DNA를 제조하고 EcoRI으로 분해한다. EcoRI으로 분해할 수 없는 모든 플라스미드 DNA는 EcoRI 부위가 결실된 강력한 플라스미드 pBH 109이다.
2개의 동일한 양성 콜로니를 동정한다. 이들중 하나를 선택하여 pBH 109로 지정한다.
ompA-2 리더 서열을 수반하는 F1-F2-DNA의 정확한 서열을 서열분석에 의해 확인한다.
C. 일본쇄 M13mp 19/히루딘을 사용한 히루딘 잔기 Lys 27의 Asn 27로의 돌연변이
Figure kpo00012
포스포르아미다이트법(phosphoramidite)[참조: M. H. Caruthers, in Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (H. G. Gassen and A. Lang, Eds.) Verlag Chemie, Weinheim, Federal Republic of Germany]을 사용하여 Applied Biosystems(Model 380B) 합성기상에서 돌연변이원성 프라이머를 합성한다.
I. M13mp 19/히루딘의 제조
XbaI-BamHI에 의한 M13mp 19 DNA의 절단
5㎕ M/3mp 19 이본쇄 DNA (ds-DNA; 0.1㎍/ml BRL)에 2㎍ 반응물 2 (500mM 트리스-HCl, pH 8.0; 100mM MgCl2, 500mM NaCl) (BRL), l㎕, XbaI (10U/㎕), 0.5㎕ BamHI (10U/㎕) 및 12㎕ H2O를 가한다. 37℃에서 1.5시간동안 항온처리한 후, 0.5㎕, BamHI, 2.5㎕ 반응물 3 (500mM 트리스-HCl, pH 8.0; 100mM MgCl2; 1000mM NaCl)(BRL) 및 2㎕ H2O를 가하고 37℃에서 1시간동안 계속 항온처리한다. H2O를 가하여 용량이 100㎕가 되게 한다. 페놀 추출 및 에탄을 침전에 의해 ds-DNA를 분리하고, 30㎕의 TE 완충액(트리스-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH 8.0)중에 용해시킨다.
DNA 삽입
5㎕의 플라스미드 pBH 109를 전술한 바와 같이 Xbal 및 BamHI으로 절단하고 1x TBE 완충액 (10x TBE 완충액: 108g 트리스, 55g 붕산, 9.3g EDTA·2H2O/ℓ)을 함유하는 3.5% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분해물을 150 볼트(volt)에서 3시간 동안 전기영동한다. 히루딘 유전자(250bp)를 함유하는 XbaI-BamHI 단편을 10㎕에 티디움 브로마이드 용액(물중에 10㎍/ml)을 함유하는 400ml 1x TBE 완충액중에 겔을 침지시킨후 UV광하에 가시화한다. 제한 단편을 함유하는 겔 부분을 겔로부터 절단하여 500㎕의 0.5x TBE와 함께 투석백중에 넣고, DNA를 시행 완충액으로서 0.5x TBE를 사용하여 BIO-RAD 미니겔 전기영동 장치중 170볼트에서 30분간 전기용출시킨다. DNA를 0.5x TBE로 평형화시킨 Elutip-d 컬럼(Schleicher Schull)상에 로드한다. 컬럼을 2ml의 0.5x TBE로 세척하고 DNA를 0.5x TBE(1ml)중의 1MNaCl로 용출시킨다. DNA를 에탄올로 침전시키고 10㎕ TE 완충액중에 재용해시킨다.
XbaI-BamHI 히루딘 삽입물과 M13mp 19의 연결 및 일본쇄 DNA의 제조
5㎕의 XbaI-BamHI 히루딘 삽입물, 2㎕ XbaI-BamHI으로 절단된 M13mp 19, 1㎕의 10x 리가제 완충액 (50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨), 1㎕ ATP, 1.5㎕ T4DNA 리가제 (BRL; 1U/㎕)를 혼합하고 14℃에서 밤새 항온처리한다. 5㎕의 연결 혼합물을 사용하여 문헌[참조: J. Messing. Methods in Enzymology 101, 21-78 (1983)]의 방법에 따라 이.콜라이 JM101컴피턴트 세포(competent cell)를 형질전환시킨다. 12개의 투명한 플라크를 선택하고 상기 문헌에 기술된 바와 같이 각 플라크로부터 일본쇄 DNA (ss-DNA)를 제조한다. DNA 분해된 M13mp 19/히루딘 50㎕의 TE 완충액 (0.1 내지 0.5㎕/㎕)중에 재용해시킨다.
II. 부위-지시된 돌연변이 유발
돌연변이원성 프라이머의 부인산화 반응
3㎕ 10x 키나제 완충액(1M 트리스-HCl, 0.1M MgCl2, 0.1M 디티오트레이톨, pH 8.3), 3㎕ 10mM ATP 및 1㎕ T4폴리뉴클레오티드 키나제(BRL, 10U/㎕)를 가하여 200pmol(23㎕)의 돌연변이원성 프라이머 1 (상기 참조)를 부인산화반응시킨다. 37℃에서 1시간동안 항온처리한후, 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 정지한다.
일본쇄 M13mp 19/히루딘 주형에 대한 돌연변이원성 프라이머 1의 어닐렁
6㎕(0.5㎍)의 일본쇄 M13mp 19/히루딘을 3㎕(20pmol)의 부인산반응시킨 돌연 변이원성 올리고데옥시리보뉴클레오티드(6.6pmol/10) 및 l㎕ 완충액 A (0.2M 트리스-HCl, pH 7.5, 0.1M MgCl2, 0.5M NaCl, 0.01M DTT)와 함께 70℃에서 5분간 항온처리하고, 30분간 서서히 실온으로 냉각시킨다.
연장-연결 반응
상기 어닐링된 혼합물에 1㎕의 완충액 B (0.2M 트리스-HCl, pH 7.5, 0.1M MgCl2, 0.01M DTT), 1㎕ 10mM ATP, 4㎕ 2mM dNTP 혼합물, 5㎕ T4DNA 폴리머라제(Boehringer 제조원, 1U/㎕), 5㎕ T4DNA 리가제(BRL 제조원, 1U/㎕)를 가한다. 이 혼합물을 16℃에서 3시간동안 항온처리한다. 65℃에서 10분간 항온처리하여 반응을 정지시킨다.
일본쇄 돌연변이체 DNA의 형질전환 및 제조
연결 혼합물을 멸균 H2O로 1:20으로 희석하고, 1㎕, 5㎕ 및 1㎕ 비희석된 연결 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 BMH 71-81 돌연변이체 S세포를 형질 전환시킨다[B. Kramer, W. Kramer and H. -J. Fritz, Cell 38, 879-887 (1984)]. 세포를 문헌[참조: M 13 cloning and sequencing Handbook published by Amersham]에 기술된 바와 같이 플레이팅한다. 12개의 무색 플라크를 선택하여 전술한 바와 같이 일본쇄-DNA를 제조한다.
돌연변이체에 대한 일본쇄 DNA의 선별
돌연변이된 일본쇄 DNA를 선별하기 위하여, 12개의 ss-DNA 샘플 각각을 데옥시리보뉴클레이티드 쇄 종결법[참조: F. Sanger, S. Nickler and A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)]에 의해 서열분석한다. 초기에, 예상된 돌연변이 염기에 대해 상보적인 디데옥시뉴클레오티드만을 이 반응에 사용한다. 계속하여, 문헌[참조: Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987)]의 방법에 따라 T7 DNA 폴리머라제(Sequenace, USB)를 사용하여 돌연변이체의 완전한 DNA 서열을 확립하기 위하여 수개의 양성 돌연변이체로부터의 일본쇄-DNA를 서열분석한다. 재조합 히루딘의 27번 위치에서 Lys→Asn 돌연변이를 암호화하는 예상된 염기 변화가 DNA 서열중에 관찰된다. 예상된 서열을 갖는 파아지 DNA를 M13mp 19/히루딘 K27N으로 지정한다.
일본쇄 M13mp 19/히루딘 K27N 파아지 DNA로부터 복제형 (RF) DNA의 제조
컴피턴트 이.콜라이 JM101 세포를 10 내지 20ng의 일본쇄 히루딘 K27N 돌연변이체 DNA로 형질전환시키고 문헌[참조: N13 cloning and sequencing Handbook published by Amersham]에 기술된 바와 같이 이본쇄-DNA를 제조한다. 100ml의 배양액으로부터 수율 40 내지 50㎍의 이본쇄-DNA가 수득된다.
돌연변이체 히루딘 XbaI-BamHI 삽입물의 분리
25㎍의 이본쇄-DNA인 돌연변이된 히루딘 XbaI-BamHI 삽입물을 절단하고 단락 IB에 기술된 바와 같이 정제한다. DNA를 20㎕의 멸균수중에 용해시킨다.
XbaI-BamHI로 절단된 pIN-III-ompA-2 벡터 DNA의 제조
6㎕ 반응물 2 완충액 (BRL 제조원), 2㎕ (20 단위) XbaI, 1㎕ BamHI (10 단위), 1㎕ EcoRI (10 단위) 및 37㎕ H2O(총 용적 50㎕)를 가하여 약 1.5㎕ pIN-III-ompA-2 플라스미드의 분해물을 제조하고, 37℃에서 3시간동안 항온처리한다. 1㎕ (10 단위) BamHI, 1㎕ (10 단위) EcoRI, 5㎕ 반응물 3 (BRL) 및 12㎕ H2O를 가하고 37℃에서 1시간 동안 계속 항온처리한다.
XbaI-BamHI로 절단된 pIN-III-ompA-2 플라스미드내로 돌연변이체 히루딘 K27N XbaI-BamHI 삽입물 DNA의 연결
9㎕ 히루딘 K27N XbaI-BamHI 삽입체 DNA, 2㎕ XbaI-BamHI로 절단된 pIN-III-ompA-2 벡터 DNA, 3㎕ 10x 연결 완충액(BRL) 및 1㎕ (1U/㎕) T4DNA 리가제(BRL 제조원)를 혼합하고 14℃에서 16 내지 20시간 동안 항온처리한다.
III. 이.콜라이 JM101내에서 돌연변이체 [Asn27]-데설파토 히루딘의 발현
이 콜라이 균주 JM101내로의 형질감염
상기 언급한 제이 메싱(J. Messing)의 방법에 따라 5㎕의 연결 혼합물을 사용하여 0.3ml의 이.콜라이 JM101 컴피턴트 세포를 형질전환시킨다. 샘플에 3ml의 2xYT/암피실린 (50㎍ 암피실린/ml 2xYT)를 가하고 세포를 실온에서 1시간 동안 생장시킨다. 이어서, 1ml 배양액 샘플을 취하여 LB/암피실린 (50㎍ 암피실린/ml LB-한천)평판상에 붓고 37℃에서 밤새 생장시킨다. 형질전환되는 플라스미드 DNA를 pIN-III-ompA-2/HIR-K27N으로 언급한다.
[Asn27]-데설파토 히루딘 발현 콜로니의 선별
LB/암피실린 평판으로부터 10개의 세균 콜로니를 선택하여 37℃에서 5ml LB/암피실린 (50㎍ 암피실린/ml LB)중에 개별적으로 5시간 동안 생장시킨다. 각 배양 튜브에서 1ml 샘플을 취하고 원심분리(3000xg, 5분)하여 세포를 회수한다. 세포의 각 샘플을 0℃에서 30분간 100㎕의 10mM 트리스-HCl(pH 8.1)로 처리하여 삼투적 충격을 가함으로써 세균의 주변세포질 공간내 물질을 방출시킨다. 전술한 바와 같이 원심분리하여 세포를 제거하고, 상등액을 히루딘 활성에 대하여 시험한다. 가장 높은 억제효과를 나타내는 샘플을 뱃치 배양(batch culture)을 위하여 선택한다.
[Asn27]-데설파토 히루딘의 벳치 배양 및 분리
대부분의 활성 샘플로부터의 잔류 세포량(4ml)을 사용하여 1ℓ LB/암피실린 (50㎍ 암피실린/ml LB)를 접종한다. 배양물을 37℃에서 밤새 생장시키고, 원심분리(3000xg, 15분)하여 세포를 회수한다. 0℃에서 50ml의 10mM 트리스-HCl(pH 8.1) 중에 1시간 동안 재현탁시킴으로써 세포 펠렛에 삼투적 충격을 가한다. 6000xg에서 10분간 원심분리하여 주변세포질 분획으로부터 세포를 제거한다.
[Asn27]-데설파토 히루딘의 정제
0.1M HCl을 사용하여 주변세포질 분획의 pH를 6.5로 조절하고 0.45㎛ 필터 (Nalgene 제조원)를 통하여 여과한다. 50mM 비스-트리스-HCl 완충액(pH 6.5)으로 평형화시킨 Mono-Q 컬럼 FPLC 시스템(Fast Protein Liquid Chromatography, Pharmacia-LKB)상에 단백질을 로드한다. 45분에 걸쳐 비스-트리스-HCl(pH 6.5)중의 0 내지 300mM NaCl의 선형 염 구배를 사용하여 컬럼으로부터 데설파토 히루딘 돌연변이체를 용출시킨다. 컬럼 용출액의 0.8ml 분획을 수집하여 전술한 바와 같이 히루딘 활성에 대하여 시험한다. 데설파토 히루딘 돌연변이체-함유 분획을 모아서, 전술한 바와 같이 여과하고 H2O 중의 0.09%(v/v) 트리플루오로아세트산으로 평형화시킨 Brownlee Labs C8 역상 HPLC 컬럼을 사용하여 Millipore-Waters HPLC 시스템상에 크로마토그래피한다. H2O 중의 0.09%(v/v) 트리플루오로아세트산중 7 내지 28%(v/v) 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 컬럼으로부터 히루딘 돌연변이체를 용출시킨다. 약 98% 이상의 순도를 갖는 [Asn27]-데설파토 히루딘이 28분째에 단일 피크로서 용출된다.
D. 히루딘의 잔기 Lys 27에서 Gln 27로, 및 잔기 Lys 47에서 Arg 47로의 돌연변이
A: Lsy 27에서 Gln 27로의 돌연변이
Figure kpo00013
B: Lsy47에서 Arg 47로의 돌연변이
Figure kpo00014
돌연변이원성 프라이머 2A 및 B를 사용하여 전술한 공정을 반복함으로써 Lys 27이 Gln 27로, Lys 47이 Arg 47로 치환된 바람직한 돌연변이체 단백질을 수득하여 특성화한다. 형질전환된 플라스미드 DNA를 pIN-III-ompA-2/HIR-K27Q, K47R로 언급한다. 이 돌연변이체를 [Gln27, Arg47]-데설파토 히루딘으로 표시한다.
E. 히루딘의 잔기 Lys 27에서 Gln 27로, 잔기 Lys 36에서 Gln 36으로, 및 잔기 Lys 47에서 Arg 47로의 돌연변이
a: Lsy 36에서 Gln 36으로의 돌연변이
Figure kpo00015
b: Lys 27에서 Gln 27로의 돌연변이
D(상술)에 따라 Lys 27을 Gln 27로 돌연변이시킨다.
c: Lys 47에서 Arg 47로의 돌연변이
D(상술)에 따라 Lys 47을 Arg 47로 돌연변이시킨다.
돌연변이원성 프라이머 2A, 3 및 2B를 사용하여 상술한 공정을 반복함으로써 Lys 27이 Gln 27로, Lys 36이 Gln 36으로 및 Lys 47이 Arg 47로 치환된 바람직한 돌연변이체 단백질을 수득하여 특성화한다. 형질전환된 플라스미드 DNA를 pIN-III-ompA-2/HIR-K27Q, K36Q, K47R로 언급한다. 이 돌연변이체를 [Gln27, Gln36, Arg47]-데설파토 히루딘으로 나타낸다.
F. 메티오닌 잔기를 사용한 [Gln27, Arg47]-데설파토 히루딘의 N-말단의 연장
Figure kpo00016
돌연변이성 프라이머 2A, 2B 및 4를 사용하여 상기의 공정을 반복함으로써 [Gln27, Arg47]-데설파토 히루딘의 N-말단이 Met에 의해 연장된 바람직한 돌연변이 단백질을 수득하여 특성화한다. 이 단백질을 메티오닐-[Gln27, Arg47]-데설파토 히루딘으로 표시한다.
G. 히루딘의 잔기 Glu 57, 58, 61, 62의 Gln 57, 58, 61, 62로의 돌연변이
Figure kpo00017
돌연변이원성 프라이머 5를 사용하여 상기 공정을 반복함으로써 Glu 57, 58, 61, 62가 Gln 57, 58, 61, 62로 치환된 바람직한 돌연변이 단백질을 수득하여 특성화한다. 이 돌연변이체를 [Gln57, 58, 61, 62]-데설파토 히루딘으로 표시한다.
H. [Pro66]-데설파토 히루딘을 암호화하는 효모 발현 플라스미드의 작제
데설파토 히루딘을 암호화하는 DNA 서열을 프롤린을 암호화하는 올리고뉴클레오티드 CCA로 연장시킨다. 수득되는 새로운 데설파토 히루딘을 효모내에서 발현시킨다. 이 새로운 히루딘은 C-말단에 프롤린을 갖는 66개의 아미노산을 함유한다. 이 폴리펩타이드를 [Pro66]-데설파토 히루딘으로 언급한다.
효모 발현 플라스미드 pJDB207/GAPFL-HIR(제4도 참조: 유럽 특허원 제225633호)를 제한 엔도뉴클레아제 SalI 및 EcoRI으로 분해한다. 478bp의 SalI-EcoRI 단편을 TBE 완충액(90mM 트리스-염기, 90mM 붕산, 2.5mM EDTA, pH 8.3) 중의 0.8% 예비 아가로스 겔 상에서 분리한다. 겔로부터 에티디움 브로마이드-염색된 단편을 분리한다. DNA를 100mA에서 45분간 0.2xTBE 완충액중에서 전기용출시키고 DE52(Whatman 제조원) 이온 교환 크로마토그래피로 정제한다. 고 염 완충액(1.5M NaCl, 10mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)을 사용하여 DE52 컬럼으로부터 DNA를 용출시키고, 에탄올로 침전시키며 0.1pmol/㎕ 농도로 H2O 중에 재용해시킨다. 478bp SalI-EcoRI 단편은 BglII-EcoRI GAPFL 프로모터 단편과 융합된 pBR 322의 SalI-BamHI 서열을 포함한다.
플라스미드 PJDB207/GAPFL-HIR을 BamHI 및 SalI으로 분해한다. 큰, 6.7kb 벡터 단편을 전술한 바와 같이 분리한다. 작은, 740bp SalI-BamHI 단편도 또한 분리한다. 이는 데설파토 히루딘의 암호화 서열에 대해 프레임 방향으로 융합된 PH05 시그날 서열외에 478bp SalI-EcoRI 단편의 서열(상기)도 함유한다. 740bp 단편을 AsuII로 분해한다. DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨 후 H2O 중에 재용해시킨다.
하기 서열의 합성 올리고데옥시뉴클레오티드를 37℃에서 45분간 40㎕의 60mM 트리스 HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 5mM DTT, 0.5mM ATP 및 27U의 T4폴리뉴클레오티드 키나제(Boehringer 제조원) 중에서 키나제로 처리한다.
Figure kpo00018
올리고뉴클레오티드(1) 및 (2)에 대한 반응 혼합물을 합한다. 이 혼합물을 75℃에서 10분간 가열하고 실온으로 냉각시킨다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 링커(1+2)를 -20℃에서 저장한다.
0.85㎍(3.8pmol)의 AsuII 분해된 DNA를 150㎕의 60mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 5mM DTT, 3.5mM ATP 및 1200U의 T4DNA 리가제(Biolabs 제조원) 중의 DNA 말단상에 키나제 처리되고 어닐링된 10배 과량의 올리고-뉴클레오티드 링커와 함께 15℃에서 16시간 동안 항온처리한다. 85℃에서 10분간 T4DNA 리가제를 불활성화시킨후 10mM EDTA, 300mM 나트륨 아세테이트(pH 6.0) 및 0.54 용량의 이소프로판올의 존재하에 DNA를 침전시켜 과량의 링커를 제거한다. DNA를 EcoRI 및 BamHI으로 분해한다. 수득되는 단편을 TBE 완충액중 2% 예비 아가로스 겔상에서 분리한다. 262bp 단편을 전기용출 및 에탄올 침전에 의해 겔로부터 회수한다. DNA를 0.1pmol/㎕ 농도로 재현탁시킨다. EcoRI-BamHI 단편은 Pro 66을 암호화하는 추가의 CCA 트리플릿(triplet)을 갖는 데설파토 히루딘의 암호화 서열을 함유한다.
전술한 바와 같이 분리한 3개의 DNA 단편을 다음 반응물 중에서 연결시킨다: 0.2pmol의 478bp SalI-EcoRI 단편, 0.2pmol의 262bp EcoRI-BamHI 단편 및 0.1pmol의 6.7kb 벡터 단편을 15℃에서 6시간 동안 10㎕의 60mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM ATP 및 200U의 T4DNA 리가제 중에서 연결한다. 1㎕ 분취량의 연결 혼합물을 100㎕의 칼슘-처리된, 형질전환 컴피턴트 이.콜라이 HB101 세포에 가한다.
12개의 형질전환된, 암피실린-내성 콜로니를 100mg/ℓ의 암피실린을 함유하는 LB 배지중에서 생장시킨다. 문헌[참조: Holmes et al., Anal. Biochem. 114 (1981), 193]에 따라 플라스미드 DNA를 제조하고 BamHI, EcoRI 이중 분해로 분석한다. DNA내 돌연변이의 존재를 DNA 서열분석에 의해 확인한다[참조: Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463]. 히루딘 구조유전자내에 CCA 코돈을 갖는 하나의 클론을 pJDB207/GAPFL-HIR(Pro 66)로서 언급한다.
I. 히루딘의 잔기 Val 1, 2에서 Ile 1, 2로의 돌연변이
Figure kpo00019
돌연변이원성 프라이머 6을 사용하여 상기 공정을 반복함으로써 N-말단 아미노산 Val 1, 2가 Ile 1, 2로 치환된 바람직한 돌연변이체 단백질을 수득하여 특성화한다. 이 돌연변이체를 [Ile1,2]-데설파토 히루딘으로 표시한다.
J. 히루딘의 잔기 Val 1에서 Gly 1으로의 돌연변이
Figure kpo00020
돌연변이원성 프라이머 7을 사용하여 상기 공정을 반복함으로써 N-말단 아미노산 Val 1이 Gly 1으로 치환된 바람직한 돌연변이체 단백질을 수득하여 특성화한다. 이 돌연변이체를 [Gly1]-데설파토 히루딘으로 표시한다.
실시예 3에 기술된 공정을 적용하는 유사한 방법으로, 데설파토 히루딘 HV1, 히루딘 HV2 및 히루딘 PA의 다른 바람직한 돌연변이체도 수득할 수 있다.
[실시예 4]
[비경구 투여 및 적용을 위한 약제학적 조성물]
약제학적 조성물은 각각 10mg의 동결건조된 활성인자 t-PA 및 300mg의 덱스트로스를 함유하는 7개의 바이알 및 30mg의 동결건조된 데설파토 히루딘 HV1 및 100mg의 덱스트로스를 함유하는 8번째 바이알로 구성된다.
7개의 바이알의 각각의 내용물을 아세트산에 의해 pH4로 조절된 100mM 암모늄 아세테이트 완충액을 함유하는 멸균된 발열물질-유리 용매가 들어 있는 10ml짜리 앰플 하나에 용해시킴으로써 t-PA의 비경구투여용 용액을 제조한다.
바이알의 내용물을 3ml의 0.9% 염화나트륨 멸균 용액중에 용해시킴으로써 데설파토 히루딘의 비경구 투여용 용액을 제조한다.
7ml 완충액중 총 플라스미노겐 활성인자 용량(즉, 7mg의 t-PA)의 10% 및 3ml의 완충액중 30mg의 데설파토 히루딘을 10ml의 0.9% 염화나트륨 멸균 용액을 함유하는 멸균 주사기내로 혼입시키고 5분간에 걸쳐서 초기 부하 용량으로서 정맥내 투여한다. 나머지 63mg의 t-PA를 0.9% 염화나트륨 멸균 용액이 들어 있는 250ml짜리 병내로 주입한후 이어서, 폐색된 혈관을 개방시키기 위해 90분간에 걸쳐 정맥내 주입한다.
다른 방법으로서는, 상기에서 기술한 바와 같이 용해시킨 7mg의 t-PA(7ml) 및 10mg의 데설파토 히루딘(1ml)을 5분간에 걸쳐서 거환 용량으로 투여한다. 나머지 63mg의 t-PA 및 20mg의 데설파토 히루딘을 90분간에 걸쳐 총 315ml 용량의 0.9% 염화나트륨 용액중에 주입한다.
t-PA 대신에 scu-PA 또는 u-PA/t-PA 하이브리드 플라스미노겐 활성인자와 같은, 동량의 전술한 다른 플라스미노겐 활성인자도 사용할 수 있다. 이와 유사하게, 데설파토 히루딘 HV1 대신에 히루딘 PA 또는 데설파토 히루딘 HV1의 돌연변이체와 같은 동량의 전술한 다른 히루딘도 사용 가능하다.

Claims (23)

  1. 성분 A로서 플라스미노겐 활성인자 및 성분 B로서 히루딘을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 혈전증을 예방 또는 치료하거나 혈전증, 동맥경화증, 심근경색, 뇌경색, 정맥 혈전증, 혈전색전증, 수술후 혈전증 및 혈전성정맥염에 의해 야기된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 성분 A로서 일본쇄 형태의 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 성분 A로서 당화, 부분당화 또는 비당화 형을 포함한 u-PA 및 t-PA로 이루어진 그룹중에서 선택된 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 성분 A로서 하기 서열식(I)의 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 약제학적 조성물.
    Figure kpo00021
    상기 서열식에서, X1및 X2는 각각 서로 독립적으로 Lys, 염기성 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기 또는 화학결합을 나타내고, Y1는 Arg, 염기성 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기 또는 화학결합을 나타내며, Y2는 Phe, 산성 아미노산 잔기 또는 화학결합을 나타내고, Y3는 Lys, 염기성 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기 또는 화학결합을 나타내며, Z1은 Asn 또는 다른 아미노산 잔기를 나타내고, Z2는 Thr 이거나 Ser과는 상이한 다른 아미노산 잔기이다.
  5. 제4항에 있어서, 성분 A로서 X1이 Lys, Gly 또는 Ser이고, X2가 Lys이며, Y1이 Arg이고, Y2가 Phe, Asp 또는 Glu이며, Y3이 Lys이고, Z1이 Asn 또는 Gln이고, Z2가 Thr인 서열식(I)의 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 약제학적 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 성분 A로서 scu-PA, [Gly135]-scu-PA, [Ser135]-scu-PA, [Asp157]-scu-PA, [Ser135, Asp157]-scu-PA 및 [Gly135, Asp157]-scu-PA(여기서, Asn302는 효모 특이적으로 당화됨), 및 [Gln302]-scu-PA, [Gly135, Asp157, Gln302]-scu-PA 및 [Ser135, Asp157, Gln302]-scu-PA로 이루어진 그룹 중에서 선택된 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 성분 A로서 scu-PA를 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 성분 A로서 하기 서열식(II)의 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 약제학적 조성물.
    Figure kpo00022
    Figure kpo00023
    상기 서열식에서, X1, X2및 X3는 각각 Asn 또는 유전적으로 암호화된 다른 아미노산이고, Y1및 Y2는 각각 Ser이거나 Thr 이외의 유전적으로 암호화된 다른 아미노산이며, Y3는 Thr이거나 Ser 이외의 유전적으로 암호화된 다른 아미노산이다.
  9. 제8항에 있어서, 성분 A로서 라디칼 X1, X2및 X3중 1개, 2개 또는 3개가 Asn이고 나머지(들)는 Gln, Thr 및 Ser 중에서 선택된 아미노산 잔기이며 Y1및 Y2가 각각 Ser이고, Y3이 Thr이거나; X1, X2및 X3가 각각 Asn이고, 라디칼 Y1및 Y2중 1개 또는 2개가 Ser이며 나머지(들)는 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, Y3가 Thr이거나; 또는 X1, X2및 X3가 각각 Asn이고, Y1및 Y2가 각각 Ser이며 Y3가 Ala 및 Asn으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열식(II)의 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 약제학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 성분 A로서 t-PA, [Asn119]-t-PA, [Ala186]-t-PA, [Ala450]-t-PA, [Asn119, Ala186]-t-PA, [Asn119, Ala186, Ala450]-t-PA, 및 [Asn119, Ala186, Ala450]-t-PA로 이루어진 그룹 중에서 선택된 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 성분 A로서 t-PA를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 성분 A로서 서열식
    Figure kpo00024
    Figure kpo00025
  13. 12항에 있어서, 성분 A로서 서열식 [uPA(1-44)-tPA(176-527)], [tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)] 및 [tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411)]로 이루어진 그룹중에서 선택된 일본쇄 하이브리드 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 성분 A로서 서열식
    Figure kpo00026
    Figure kpo00027
    로 이루어진 그룹중에서 선택된 u-PA/t-PA 하이브리드 플라스미노겐 활성인자의 돌연변이체를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 성분 B로서 하기 서열식(III)의 히루딘 변이체 HV1, 하기 서열식(IV)의 히루딘 변이체 HV2 및 하기 서열식(V)의 히루딘 변이체 PA 또는 항혈전 활성을 지닌 이들 히루딘 변이체의 돌연변이체 또는 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 히루딘을 포함하는 약제학적 조성물.
    Figure kpo00028
    Figure kpo00029
    Figure kpo00030
    상기 서열식에서, W는 Tyr의 페놀성 하이드록시 그룹(데설파토 히루딘 HV1) 또는 구조식-O-SO3H의 그룹(히루딘 HV1)이다.
  16. 제15항에 있어서, 성분 B로서 데설파토 히루딘 HV1, 히루딘 HV1, 히루딘 HV2 및 히루딘 PA로 이루어진 그룹중에서 선택된 히루딘을 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 성분 B로서 데설파토 히루딘 HV1을 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 성분 B로서 [Ile1,2]-데설파토 히루딘 HV1, [Gly1]-데설파토 히루딘 HV1, [Gln57, 58, 61, 62]-데설파토 히루딘 HV1, [Pro66]-데설파토 히루딘 HV1, [Gln27, Arg47]-데설파토 히루딘 HV1, [Met0, Gln27, Arg47]-데설파토 히루딘 HV1, [Gln27, Gln36, Arg47]-데설파토 히루딘 HV1, [des-Val1, Thr2]-데설파토 히루딘 HV1 및 [Lys47]-히루딘 HV2로 이루어진 그룹중에서 선택된 히루딘을 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 성분 A로서 scu-PA, t-PA, [Ala450]-t-PA [Asn119, Ala186, Ala450]-t-PA, [uPA(1-44)-tPA(176-527)], [tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)] 및 [tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411)]로 이루어진 그룹중에서 선택된 플라스미노겐 활성인자 및 성분 B로서 데설파토 히루딘 HV1을 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서 심근경색을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서 성분 A 대 성분 B의 중량비가 20:1 내지 2:1인 약제학적 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 성분 A 대 성분 B의 중량비가 5:1 내지 2:1인 약제학적 조성물.
  23. 피브린용해 유효량의 플라스미노겐 활성인자를 항혈전 유효량의 히루딘과 함께 사람을 제외한 포유동물에 투여하고, 필요하다면 제2단계로 개방된 혈관의 재폐색을 예방하기 위하여 항혈전 유효량의 히루딘을 투여함을 특징으로 하여, 사람을 제외한 포유동물의 혈전증을 치료하거나 또는 혈전증에 의해 야기된 질환을 치료하는 방법.
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
US5837808A (en) * 1991-08-20 1998-11-17 Baxter International Inc. Analogs of hirudin
WO1993014199A1 (en) * 1992-01-13 1993-07-22 Abbott Laboratories A pump-1 catalyzed method of making low molecular weight urokinase-type plasminogen activator
AU5125693A (en) * 1992-09-03 1994-03-29 Regents Of The University Of California, The Dorsal tissue affecting factor and compositions
WO1994008034A1 (en) * 1992-09-28 1994-04-14 Japan Energy Corporation Novel hirudine variant, process for producing the same, and anticoagulant containing the same as active ingredient
DE4323754C1 (de) * 1993-07-15 1994-12-01 Gruenenthal Gmbh Bifunktionelle Urokinasevarianten mit verbesserten fibrinolytischen Eigenschaften und thrombinhemmender Wirkung
US5972648A (en) * 1993-09-28 1999-10-26 Japan Energy Corporation Hirudin analogs, methods of manufacture thereof and anticoagulant compositions having these as active ingredients
US5510330A (en) * 1994-03-25 1996-04-23 Boehringer Mannheim Gmbh Combinations of thrombolytically active proteins and non-heparin anticoagulants, and uses thereof.
US5759542A (en) * 1994-08-05 1998-06-02 New England Deaconess Hospital Corporation Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
DE4440892A1 (de) * 1994-11-17 1996-05-23 Gruenenthal Gmbh Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften
US7759506B2 (en) 2002-02-25 2010-07-20 Diffusion Pharmaceuticals Llc Bipolar trans carotenoid salts and their uses
GB2394498B (en) * 2002-10-23 2006-08-09 Engineering Business Ltd Mounting of offshore structures
GB0306547D0 (en) * 2003-03-21 2003-04-23 Engineering Business Ltd Apparatus for creating a local reduction in wave height
US20050036984A1 (en) * 2003-06-17 2005-02-17 Harrison Roger G. Conjugate for the specific targeting of anticancer agents to cancer cells and production thereof
US20110002978A1 (en) 2003-06-17 2011-01-06 Harrison Roger G Enzyme prodrug cancer therapy selectively targeted to tumor cells or tumor vasculature and methods of production and use thereof
WO2005067890A2 (en) * 2004-01-13 2005-07-28 Vasogenix Pharmaceuticals, Inc. Controlled release cgrp delivery composition for cardiovascular and renal indications
US20090023644A1 (en) * 2004-01-13 2009-01-22 Southard Jeffery L Methods of using cgrp for cardiovascular and renal indications
TW200538148A (en) * 2004-01-13 2005-12-01 Vasogenix Pharmaceuticals Inc Methods for treating acute myocardial infarction by administering calcitonin gene related peptide and compositions containing the same
US7984525B2 (en) * 2004-08-03 2011-07-26 Ihc Engineering Business Limited Access method between marine structures and apparatus
GB0503083D0 (en) * 2005-02-15 2005-03-23 Engineering Business Ltd Launch and recovery apparatus and method
AU2006229688B2 (en) 2005-02-24 2012-07-26 Diffusion Pharmaceuticals Llc Trans carotenoids, their synthesis, formulation and uses
GB2428656B (en) 2005-08-01 2009-08-05 Engineering Business Ltd Gangway apparatus
GB2434823A (en) * 2006-02-06 2007-08-08 Engineering Business Ltd Transport and installation of offshore structures
CN101687757A (zh) 2007-04-13 2010-03-31 扩散药品有限公司 双极性反式类胡萝卜素作为预治疗及其在周围血管疾病的治疗中的应用
US20090214469A1 (en) * 2008-02-25 2009-08-27 Jeffrey Gold Methods and Compositions for the Treatment of Sepsis
AU2010263245A1 (en) 2009-06-22 2012-01-19 Diffusion Pharmaceuticals Llc Diffusion enhancing compounds and their use alone or with thrombolytics
CA2801292C (en) 2010-06-02 2019-01-22 Diffusion Pharmaceuticals Llc Oral formulations of bipolar trans carotenoids
US9987241B2 (en) 2014-09-25 2018-06-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Enzyme conjugate and prodrug cancer therapy
JP7032320B2 (ja) 2016-03-24 2022-03-08 ディフュージョン・ファーマシューティカルズ・エルエルシー 癌を処置するための、化学療法及び放射線療法を伴う二極性トランスカロテノイドの使用
WO2020032951A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Antimalarial enzyme conjugates, kits containing same, and methods of producing and using same
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
CN113661239A (zh) 2018-12-28 2021-11-16 催化剂生物科学公司 经修饰的尿激酶型纤溶酶原激活物多肽和使用方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8003402A (nl) * 1980-06-11 1982-01-04 Leuven Res & Dev Vzw Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking.
DE3342139A1 (de) * 1983-11-22 1985-05-30 Ciba-Geigy Ag, Basel Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel
JPS61112018A (ja) * 1984-11-06 1986-05-30 Mitsubishi Chem Ind Ltd 線溶増強剤
DE3544318A1 (de) * 1985-12-14 1987-06-19 Behringwerke Ag Mittel aus einem plasmin-inhibitor und einem plasminogen-aktivator zur behandlung von thrombosen
JP2739050B2 (ja) * 1988-01-28 1998-04-08 ヘキスト薬品工業株式会社 抗血液凝固剤
DE3804600A1 (de) * 1988-02-13 1989-08-24 Basf Ag Mischung aus einer thrombolytisch wirkenden und einer antithrombotischen substanz

Also Published As

Publication number Publication date
AU4135289A (en) 1990-03-29
DK463989A (da) 1990-03-22
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IE62434B1 (en) 1995-02-08
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IE893015L (en) 1990-03-21
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DE68913132T2 (de) 1994-07-07
US5126134A (en) 1992-06-30
EP0365468A1 (en) 1990-04-25
IL91706A (en) 1997-07-13

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