JPWO2003033727A1 - 細胞死抑制剤スクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
PARPの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制する物質、特には、慢性関節リウマチ、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、あるいは、免疫細胞死による炎症反応の治療剤及び/又は予防剤として有用な物質をスクリーニングする方法を提供する。また、新規タンパク質及びそれをコードする新規遺伝子を提供する。前記スクリーニング方法は、LTRPC2タンパク質を発現している細胞に、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程と、LTRPC2タンパク質の活性化の阻害を分析する工程とを含む。前記の新規タンパク質はラット及びマウスLTRPC2タンパク質であり、前記の新規遺伝子はラット及びマウスLTRPC2遺伝子である。
Description
技術分野
本発明は、細胞死抑制剤スクリーニング法に関する。また、本発明は、新規ラットLTRPC2及びマウスLTRPC2に関する。
背景技術
核内に存在するポリ・ADPリボース・ポリメラーゼ(PARP;poly−ADP−ribose polymerase)は、誘導型一酸化窒素(NO)、活性酸素などによるDNA分解によって活性化し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)からADPリボース部分を核タンパク質、およびDNAに付加する酵素である。すなわち、DNA障害はPARPを活性化し、ATPを消費しながら大量のADPリボースをヒストンやPARP自身に付加する。その結果、細胞内のNAD量及びATP量が減少し、細胞内エネルギー枯渇による細胞死を来すものと考えられている(Zhang,J.及びSnyder,S.H.,Science,263,687−689,1995)。PARPタンパク質を構成する遺伝子は、これまでに5つ報告されており、これらの遺伝子が機能することでPARP活性を示すことが推測されている。それらの遺伝子の中で、PARP−1遺伝子が最も解析が進められている遺伝子であり、PARPタンパク質の活性化に伴う細胞死に最も貢献度が高い遺伝子であると推測されている。(Smith,S.,Trends Biochem.Sci.,26174−179,2001)
PARP遺伝子を欠損させたミュータントマウスにおいて、膵臓ランゲルハンス島細胞でDNA損傷によるNAD枯渇が生じないことが報告されている(Heller,B.ら,J.Biol.Chem.,270,11176−11180,1995)。また別文献によると、前記ミュータントマウスで大脳皮質ニューロンでも同様にDNA損傷によるNAD枯渇が生じないことが明らかになっており、さらにこのマウスでは一過性脳虚血に伴う脳梗塞範囲が著明に減少することが報告されている(Eliasson,M.J.ら,Nature Med.,3,1089−1095,1997)。このようにPARPの活性化によって引き起こされた細胞死は、生体組織において重篤な疾患を引き起こすことが知られている。PARPの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患として、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、1型糖尿病における膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、免疫細胞死による炎症反応、免疫機能に異常が起きることで発病する自己免疫疾患である慢性関節リウマチ(Eliasson,M.J.ら,Nature Med.,3,1089−1095,1997;Zingarelli,B.,Salzman,A.L.及びSzabo,C.,Circ.Res.,83,85−94,1998;Burkart,V.ら,Nature Med.,5,314−319,1999;Pieper,A.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,96,3059−3064,1997;Szabo,C.,Cuzzocrea,S.,Zingarelli,B.,O’Connor,M.及びSaltzman,A.L.,J.Clin.Invest.,100,723−735,1997;Oliver,F.J.ら,EMBO J.,18,4446−4454,1999、Szabo,C.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,95,3867−72,1998)も知られている。
一方、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(N−methyl−N’−nitro−N−nitrosoguanidine;MNNG)又はH2O2は、PARPを活性化することによって細胞死を引き起こすことが知られており(Halappanavar,S.S.ら,J.Biol.Chem.,274,37097−37104,1999;Watson,A.J.,Askew,J.N.及びBenson,R.S.,Gastroenterology,109,472−482,1995)、3,4−ジヒドロ−5−[4−(1−ピペリジニル)ブトキシ]−1(2H)−イソキノリノン[3,4−dihydro−5−[4−(1−piperidinyl)butox]−1(2H)−isoquinolinone;DPQ]、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドは、PARPの活性化を阻害することによって、PARPによる細胞死を抑制することが知られている(Takahashi,K.ら,Brain Res.,829,46−54,1999;Watson,A.J.,Askew,J.N.及びBenson,R.S.,Gastroenterology,109,472−482,1995)。
しかしながら、PARPの下流に存在している因子の存在は明確にはされておらず、どのような機序でPARPの活性化が細胞死を引き起こすかについては現在のところ不明である。
一方、ヒトLTRPC2(long transient receptor potential channel 2)遺伝子は1998年に取得された(Genomics,54,1,124−131,1998)。マウスLTRPC2遺伝子は取得したとの報告(Japanese Journal of Pharmacology 80,Suppl.1,83,2000、Molecular Cell 9,163−173,2002)はあるもののその具体的な塩基配列については開示されていない。また、ラットLTRPC2に関する情報は開示されていない。ヒトLTRPC2遺伝子は細胞内のADPリボース又はNADによって活性化し、カルシウム透過型非選択的陽イオンチャネルとして機能することが明らかになっている(Sano,Y.ら,Science,293,1327−1330,2001)。ADPRによるLTRPC2の制御機構は細胞機能において大きな役割を持つかもしれないことが示唆されてはいるものの(Nature,411,6837,595−599,2001)、どのような機序によって細胞内でLTRPC2が機能して、その結果、細胞にどのような影響を示すかは不明である。
また、これまでに免疫細胞をクローン化した細胞でのLTRPC2遺伝子の発現は明らかになっているが、実際のヒトの血液、特に免疫細胞が含まれているリンパ球での発現は不明である。
以上述べたように、PARPの活性化が細胞死を引き起こすこと自体は知られていたが、PARPの下流に存在している因子の存在は明確にはされておらず、その機序は不明であった。従って、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制する物質、特には、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患(例えば、慢性関節リウマチ、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、あるいは、免疫細胞死による炎症反応)の治療剤及び/又は予防剤として有用な物質をスクリーニングする方法が待望されている。
発明の開示
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、LTRPC2タンパク質の活性化がPARPの活性化によって制御されており、細胞死を引き起こす機能を有していることを、初めて見い出した。さらに、LTRPC2遺伝子がヒトリンパ球で発現しており、さらに、慢性関節リウマチ疾患において発現量が増加していることを、初めて見い出した。
より具体的には後述の実施例6に示すように、PARPを活性化することが知られている物質、すなわち、MNNG又はH2O2を、LTRPC2タンパク質を発現させた細胞に添加すると、LTRPC2タンパク質の活性化が観察された。更に、実施例7に示すように、PARPの活性化阻害剤であるDPQ、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドを、PARP活性化剤(例えば、MNNG又はH2O2)と共に添加すると、LTRPC2タンパク質の活性化は有意に阻害された。
さらに、実施例10に示すように、LTRPC2タンパク質を発現させた細胞で、PARP活性化剤であるH2O2による細胞死が促進された。
また、実施例2に示すように、LTRPC2遺伝子は免疫の機能を担うリンパ球で多く発現しており、さらに、実施例12に示すように免疫疾患の1つである慢性関節リウマチのモデル動物において、LTRPC2遺伝子の発現量が増加していた。
加えて、実施例17に示すように、LTRPC2タンパク質は1型糖尿病モデルであるストレプトゾトシン刺激による細胞死を促進することを見出した。
従って、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質を選択することにより、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制することができる物質を同定することができ、引いては、細胞死によって引き起こされる疾患治療薬、例えば、免疫疾患である慢性関節リウマチ、脳虚血後の神経細胞死、又は1型糖尿病における膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊の治療薬として有用な物質を見出すことができる。本発明は、このような知見に基づくスクリーニング系を提供するものである。
すなわち本発明は、
(1)配列番号2、配列番号4若しくは配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその機能的等価改変体を発現している細胞に、前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程、及び
前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体の活性化の阻害を分析する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法、
(2)(1)に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制用医薬組成物の製造方法、
(3)(i)配列番号4又は配列番号14で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド、あるいは、(ii)配列番号4又は配列番号14で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド(但し、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)、
(4)配列番号4又は配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(5)(3)又は(4)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(6)(5)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
(7)(6)に記載のベクターを含む細胞、
(8)(7)に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、(3)又は(4)に記載のポリペプチドを製造する方法
に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書における「細胞死」には、アポトーシス及びネクローシスの両方が含まれる。アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死である。一方、ネクローシスは生体の一部が死ぬことを示し、非生理的条件下で強制的に引き起こされる細胞死である。
[1]本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
配列番号4及び配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれラット、及びマウス由来の天然型LTRPC2タンパク質である。「配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」又はその機能的等価改変体(但し、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)は、それら自体、新規のポリペプチドであり、本発明のポリペプチドに包含される。
「配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体としては、例えば、
(1)配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(2)配列番号4で表されるアミノ酸配列の1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、更に好ましくは1個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(3)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示す部分断片;又は
(4)配列番号4で表されるアミノ酸配列との相同性が84%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上)であるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド
などを挙げることができる。
また、「配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体としては、例えば、
(1)配列番号14で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(2)配列番号14で表されるアミノ酸配列の1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、更に好ましくは1個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(3)配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示す部分断片;又は
(4)配列番号14で表されるアミノ酸配列との相同性が84%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上)であるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド
などを挙げることができる。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、BLASTパッケージ[sgi32bit版,バージョン2.0.12;National Center for Biotechnology Information(NCBI)より入手]のbl2seqプログラム(Tatiana A.Tatusova,Thomas L.Madden,FEMS Microbiol.Lett.,174,247−250,1999)を用いて得られた値を意味する。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、「プログラム名」として「blastp」を、「Gap挿入Cost値」を「0」で、「Gap伸長Cost値」を「0」で、「Matrix」として「BLOSUM62」をそれぞれ使用する。
本明細書において、或るポリペプチドが「LTRPC2タンパク質活性」を示すとは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる公知のヒト由来の天然型LTRPC2タンパク質と同様の活性を示すことを意味し、具体的には、例えば、PARP共発現下で、PARP活性化剤を作用させることにより、膜に存在する前記ポリペプチドそれ自体がイオンの通り道を生じ、その結果、イオンの透過を生じさせる活性を意味する。
本明細書において、或るポリペプチドが「LTRPC2タンパク質活性」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法(好ましくは実施例6に記載の方法)により確認することができる。すなわち、LTRPC2タンパク質をコードするポリペプチドを含む発現ベクターで、PARPを発現している細胞をトランスフェクションする。得られた細胞に予め86Rb+を取り込ませ、PARP活性化剤を添加する。その結果生じるLTRPC2タンパク質を介した細胞からの86Rb+の放出を、細胞外液又は細胞内の86Rb+の放射活性の変化を指標に確認することができる。
「配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体の1つである「配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド」には、例えば、配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド(但し、LTRPC2タンパク質活性を示すことが必要)を挙げることができる。前記マーカー配列としては、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、FLAGエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はmycエピトープなどを挙げることができる。
「配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体の起源は、ヒト、ラット又はマウスに限定されない。例えば、前記機能的等価改変体には、例えば、配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒト、ラット又はマウスにおける天然のアレル変異体(但し、LTRPC2タンパク質活性を示す)、あるいは、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism;SNP)などのアミノ酸置換で生じたポリペプチド(但し、LTRPC2タンパク質活性を示す)が含まれるだけでなく、ヒト、ラット又はマウス以外の生物[例えば、ヒト又はラット以外の哺乳動物(例えば、ハムスター、又はイヌ)]由来の天然に存在する機能的等価改変体が含まれる。また、これらの天然のポリペプチド、特には、配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列を基にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。
本発明の新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それら自体、新規物であり、本発明のポリヌクレオチドに包含される。本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号4若しくは配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号3で表される塩基配列における第84番〜第4610番の塩基からなる配列若しくは配列番号13で表される塩基配列における第36番〜第4559番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドがより好ましい。更に好ましくは、配列番号3で表される塩基配列における第84番〜第4610番の塩基からなる配列である。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、DNA及びRNAの両方が含まれる。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドは、細胞死抑制用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。
[2]スクリーニング用細胞、並びに、本発明の発現ベクター及び細胞
配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のヒト由来の天然型LTRPC2タンパク質である。配列番号2、配列番号4若しくは配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、その機能的等価改変体とを総称して、「LTRPC2タンパク質」と称する。
「配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体としては、例えば、
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列の1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、更に好ましくは1個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示す部分断片;又は
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が84%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上)であるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド
などを挙げることができ、配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能改変体と同様、その起源は限定されず、また、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも含まれる。
本発明のスクリーニング方法で用いる細胞(スクリーニング用細胞と称する)は、上記のLTRPC2タンパク質を発現している細胞である限り特に限定されるものではなく、遺伝子組換え技術により製造した細胞及び天然に存在する細胞の何れを用いることも出来るが、遺伝子組換え技術により製造した細胞を用いることが好ましい。また、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその機能的等価改変体を発現している細胞が好ましく、配列番号2、配列番号4、若しくは配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現している細胞が更に好ましい。スクリーニング用細胞は、細胞死抑制用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのベクターを含む細胞は、それぞれ、新規であり、本発明のベクター及び本発明の細胞に包含される。本発明の細胞は上記スクリーニング用細胞に包含され、本発明のスクリーニングに用いることが出来る。
[3]スクリーニング用細胞の製造方法
スクリーニング用細胞の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターDNAに組込み、宿主細胞(好ましくは真核生物、特に好ましくはCHO細胞)を形質転換させることにより取得することができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
スクリーニング用細胞の製造に用いることのできる、LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチド(本発明のポリヌクレオチドを含む)の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、(1)PCRを用いた方法、(2)常法の遺伝子工学的手法(すなわち、cDNAライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のcDNAを含む形質転換株を選択する方法)を用いる方法、又は(3)化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。なお、以下の説明は、本発明のポリヌクレオチドを例にとって説明するが、本発明のポリヌクレオチド以外の、LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチドについても、同様にして製造することができる。
PCRを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞又は組織からmRNAを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するmRNAの全長を挟むことのできる2個1組のプライマーセット、あるいは、その一部のmRNA領域を挟むことのできる2個1組のプライマーセットを作成する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長cDNA又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするmRNAを含む総RNAを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したmRNAを精製する。mRNAの精製は常法に従えばよく、例えば、mRNAをオリゴ(dT)セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりmRNAを更に分画することもできる。また、mRNAを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのmRNAを用いることもできる。
次に、精製されたmRNAを、例えば、ランダムプライマー、オリゴdTプライマー、及び/又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第1鎖cDNAを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第1鎖cDNAを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ2種類のプライマーを用いてPCRを実施し、目的とするcDNAを増幅することができる。得られたDNAをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記DNAを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするDNA断片を得ることもできる。また、ゲノムDNAから目的とするDNA断片を得ることもできる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、WO01/34785の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法b)第2製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法c)第3製造法、d)第4製造法に記載された方法によって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。より具体的には、化学合成法によって製造したヌクレオチド断片を結合することによっても製造できる。また、各ポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)は、DNA合成機(例えば、Oligo 1000M DNA Synthesizer(Beckman社)、あるいは、394 DNA/RNA Synthesizer(Applied Biosystems社)など)を用いて合成することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるDNAの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法(Maxam,A.M.及びGilbert,W.,“Methods in Enzymology”,65,499−559,1980)やジデオキシヌクレオチド鎖終結法(Messing,J.及びVieira,J.,Gene,19,269−276,1982)等により行なうことができる。
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターDNAに再び組込むことにより、宿主細胞(好ましくは真核生物)を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
スクリーニング用細胞の製造に用いることのできる、宿主細胞及び発現ベクターとしては、例えば、遺伝子工学において一般的に使用可能な公知の宿主細胞及び発現ベクターを用いることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるCOS細胞(Gluzman,Y.,Cell,23,175−182,1981)、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO)のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株であるCHO dhfr−細胞(Urlaub,G.及びChasin,L.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216−4220,1980)、ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞、及び前記HEK293細胞にエプスタイン・バーウイルスのEBNA−1遺伝子を導入した293−EBNA細胞(インビトロジェン社)等を挙げることができる。
宿主細胞としてCHO細胞を用いる場合には、LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、G418耐性マーカーとして機能するneo遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、pRSVneo(Sambrook,J.ら,“Molecular Cloning−A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1989)又はpSV2−neo(Southern,P.J.及びBerg,P.,J.Mol.Appl.Genet.,1,327−341,1982)等をコ・トランスフェクトし、G418耐性のコロニーを選択することにより、LTRPC2タンパク質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr(Subramani,S.ら,Mol.Cell.Biol.,1,854−864,1981)、ヒトの延長因子プロモーターを有するpEF−BOS(Mizushima,S.及びNagata,S.,Nucleic Acids Res.,18,5322,1990)、サイトメガロウイルスプロモーターを有するpCEP4(インビトロジェン社)又はpcDNA3.1(+)(インビトロジェン社)等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、DEAE−デキストラン法(Luthman,H.及びMagnusson,G.,Nucleic Acids Res.,11,1295−1308,1983)、リン酸カルシウム−DNA共沈殿法(Graham,F.L.及びvan der Ed,A.J.,Virology,52,456−457,1973)、市販のトランスフェクション試薬(例えば、FuGENETM6 Transfection Reagent;Roche Diagnostics社)を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法(Neumann,E.ら,EMBO J.,1,841−845,1982)等により、細胞に取り込ませることができる。
LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞表面にLTRPC2タンパク質が生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、CHO細胞の場合には、例えば、ダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清(FBS)等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、293細胞の場合には、牛胎仔血清(EBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地にG418を加えた培地を使用することができる。
[4]細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法
本発明の細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法は、(1)LTRPC2タンパク質を発現している細胞に、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程と、(2)LTRPC2タンパク質の活性化の阻害を分析する工程とを含む。
本発明のスクリーニング方法では、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下において、スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる。LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下としては、例えば、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下を挙げることができる。前記LTRPC2タンパク質活性化剤としては、例えば、ADPリボース若しくはNAD、又はPARP活性化剤(例えば、MNNG又はH2O2)を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法では、特に限定されるものでないが、例えば、LTRPC2タンパク質の活性化の後に、試験物質と接触させることもでき、あるいは、LTRPC2タンパク質の活性化と同時に、試験物質と接触させることもできる。前者の場合には、試験物質がLTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であれば、LTRPC2タンパク質の活性化が阻害され、逆に、試験物質がLTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質でなければ、LTRPC2タンパク質の活性化が維持される。一方、後者の場合には、試験物質がLTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であれば、LTRPC2タンパク質の活性化が起こらないか、あるいは、減弱される。逆に、試験物質がLTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質でなければ、LTRPC2タンパク質の活性化が起こる。
本発明のスクリーニング方法を用いると、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質(すなわち、アンタゴニスト)をスクリーニングすることができる。本発明者が今回初めて見出したように、LTRPC2タンパク質の活性化は、PARPの活性化によって制御されている。また、PARPの活性化により細胞死が引き起こされることが、既に公知である。従って、PARPの活性化により、LTRPC2タンパク質の活性化が引き起こされ、その結果、更に、細胞死が引き起こされることが、本発明者により今回初めて明らかになった。従って、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質は、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制することができ、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患の治療及び/又は予防剤の有効成分として有用である。
より具体的には、本発明のスクリーニング方法は、LTRPC2タンパク質の活性化を分析するのに用いる方法の違いに基づいて、例えば、
(a)パッチクランプ(patch−clamp)法を利用したスクリーニング方法、
(b)放射性同位元素イオンの流入又は放出を利用したスクリーニング方法、
(c)Rb+イオンの放出を利用したスクリーニング方法、又は
(d)細胞内Ca2+検出色素を利用したスクリーニング方法
などを挙げることができる。
前記(a)のパッチクランプ法を利用して、細胞死抑制剤として有用な、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする場合には、例えば、ホールセルパッチクランプ(whole−cell patch−clamp)法(Hille,B.,“Ionic Channels of Excitable Membranes”,2nd Ed.,1992,Sinauer AssociatesInc.,MA)を用いて、スクリーニング用細胞における全細胞電流を測定することにより、LTRPC2タンパク質の活性化が阻害されるか否かを分析することができる。すなわち、パッチクランプ法を利用する本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞をホールセルパッチクランプ法により膜電位固定し、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞における全細胞電流の変化を分析する工程を含む。
より具体的には、スクリーニング用細胞をホールセルパッチクランプ法により膜電位固定し、LTRPC2タンパク質を活性化する化合物(例えば、ADPリボース、NAD、H2O2、又はMNNG)を添加して、スクリーニング用細胞の全細胞電流を測定する。この場合、細胞外液としては、145mmol/L−NaCl、5mmol/L−KCl、2mmol/L−CaCl2、2mmol/L−MgCl2、及び10mmol/L−HEPES−Na(pH7.4)を含む溶液を使用し、細胞内液としては、150mmol/L−CsCl、5mmol/L−MgCl2、及び10mmol/L−HEPES−Cs(pH7.2)を含む溶液などを用いることができる。続いて、細胞外液又は細胞内液に試験物質を添加した場合の電流変化を測定することで、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。例えば、試験物質を添加した場合に、スクリーニング用細胞にLTRPC2タンパク質の活性化刺激の際に生じる全細胞電流の変化がなくなるか、あるいは、減弱されれば、前記試験物質は、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であると判定することができる。
前記(b)の放射性同位元素イオンの放出を利用して、細胞死抑制剤として有用な、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする場合には、例えば、Ca2+、Na+、又はK+イオンの各放射性同位元素を指標としてそのチャネル活性を測定することができる(Sidney P.Colowick及びNathan O.Kaplan,“Methods in ENZYMOLOGY”,88(1),1982,Academic Press社,346−347)。この分析方法は、LTRPC2タンパク質がCa2+、Na+、又はK+イオンを透過させる(Sano,Y.ら,Science,293,1327−1330,2001)との公知の知見に基づくものである。
放射性同位元素イオンの放出を利用する本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞に、放射性同位元素を取り込ませた後、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞の細胞外へ放出される放射活性、あるいは、細胞内に残存する放射活性の量を分析する工程を含む。
具体的には、各イオンの放射性同位元素である45Ca2+、22Na+、又は42K+を用いて測定することができる。K+を用いる場合には、K+を予め細胞に取り込ませた後、細胞外液に残ったK+を取り除く。その後、LTRPC2タンパク質活性化剤を用いてLTRPC2タンパク質を活性化させると、放射性同位体元素K+が透過することから、細胞外液中の放射活性(すなわち、細胞外へ放出された放射活性)、あるいは、細胞内に残存した放射活性をチャネル活性の指標とすることができる。45Ca2+又は22Na+を用いる場合には、45Ca2+又は22Na+を反応液中に入れておいた状態で、LTRPC2タンパク質活性化剤を用いてLTRPC2タンパク質を活性化させると、放射性同位体元素が透過することから、細胞外液中の放射活性(すなわち、細胞外液に残存した放射活性)、あるいは、細胞内に流入した放射性同位元素の放射活性をチャネル活性の指標とすることができる(黒木登志夫、許南浩、及び千田和広編、実験医学別冊「分子生物学研究のための培養細胞実験法」、1995年、羊土社;以下、文献1と称する)。この際、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下において、試験物質を添加して、細胞外液中の放射活性(すなわち、細胞外へ放出された放射活性)、あるいは、細胞内に残存した放射活性を測定することで、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、次に説明する「(c)Rb+イオンの放出を利用したスクリーニング方法」に準じて実施することができる。
一般的に、K+イオンを透過するイオンチャネルは、K+イオンと同様に、Rb+イオンを通すことができるので、放射性同位元素86Rb+の放出を指標としてそのチャネル活性を測定することができる(Sidney P.Colowick及びNathan O.Kaplan,“Methods in ENZYMOLOGY”,88(1),1982,Academic Press社,346−347;以下、文献2と称する)。
前記(c)のRb+イオンの放出を利用して、細胞死抑制剤として有用な、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞に放射性同位元素86Rb+イオンを取り込ませた後、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞の細胞外へ放出される86Rb+の放射活性、あるいは、細胞内に残存する86Rb+の放射活性の量を分析する工程を含む。
Rb+イオンの放出を利用する本発明のスクリーニング方法では、スクリーニング用細胞を、86RbClとインキュベート(例えば、37℃にて24時間)することにより、86Rb+を前記細胞内に取り込ませることができる(文献1)。細胞を通常の生理食塩水で洗浄し、取り込まれなかった86Rb+を取り除く。LTRPC2タンパク質が活性化すると、細胞外への86Rb+放出量が増加するので、細胞外液中の86Rb+の放射活性、あるいは、細胞内に残存した86Rb+の放射活性をチャネル活性の指標とすることができる。
より具体的には、例えば、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下で、試験物質を含有する溶液(例えば、生理食塩水)中で、予め86Rb+を取り込ませたスクリーニング用細胞をインキュベート(例えば、37℃にて30分間)した後、細胞外液中の86Rb+の放射活性、あるいは、細胞内に残存した86Rb+の放射活性を測定する。この際、ネガティブコントロールとして、LTRPC2タンパク質活性化剤の不在下で、試験物質不含溶液中で、同様の操作を実施し、ポジティブコントロールとして、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下で、試験物質不含溶液中で、同様の操作を実施することが好ましい。前記ネガティブコントロールでは、LTRPC2タンパク質が活性化されないため、86Rb+が細胞外へ放出されないのに対して、前記ポジティブコントロールでは、LTRPC2タンパク質が活性化されるため、86Rb+が細胞外へ放出される。LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下において試験物質を添加した場合に、(1)前記ネガティブコントロールの場合と同様に、86Rb+の細胞外への放出が観察されないか、あるいは、(2)前記ポジティブコントロールに比べて、86Rb+の細胞外への放出量が減少すれば、前記試験物質は、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であると判定することができる。本発明による、Rb+イオンの放出を利用したスクリーニング方法は、後述の実施例7に記載の条件で実施することが好ましい。
前記(d)の細胞内Ca2+検出色素を利用して、細胞死抑制剤として有用な、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする場合には、細胞内Ca2+検出色素として、例えば、Fluo3−AMなどを用いることができる。細胞内Ca2+検出色素は、LTRPC2タンパク質の開口に伴う細胞内Ca2+濃度の変化を光学的に検出することが可能である(工藤佳久編、実験医学別冊「細胞内カルシウム実験プロトコール」、1996年、羊土社)。これらの色素を用いることによってLTRPC2タンパク質の活性を測定することができ、LTRPC2タンパク質活性化時の試験物質存在下と不在下とで変化量を比較することにより、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する化合物をスクリーニングすることが可能である。細胞内Ca2+検出色素を利用する本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞に細胞内Ca2+検出色素を取り込ませた後、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞における細胞内Ca2+検出色素の量変化を光学的に分析する工程を含む。
より具体的には、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下において、試験物質を添加した場合に、試験物質不在下の場合と比較して、細胞内に流入するCa2+量が減少するか、あるいは、なくなれば、前記試験物質は、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であると判定することができる。
本発明のスクリーニング方法によって選択対象とする試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物(ペプチドを含む)、コンビナトリアル・ケミストリー技術(Terrett,N.K.ら,Tetrahedron,51,8135−8137,1995)によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法(Felici,F.ら,J.Mol.Biol.,222,301−310,1991)などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物、植物、海洋生物、又は動物由来の天然成分(例えば、培養上清又は組織抽出物)などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物(ペプチドを含む)を、化学的又は生物学的に修飾した化合物(ペプチドを含む)を用いることができる。
[5]細胞死抑制用医薬組成物の製造方法
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、細胞死抑制用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び/又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、1又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(例えば、オリーブ油)、アルコール類(例えば、エタノール)、又はポリソルベート80等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質、あるいは、本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人(体重60kgとして)において、1日につき約0.1〜100mg、好ましくは0.1〜50mgである。非経口投与の場合、注射剤の形では、1日につき0.01〜50mg、好ましくは0.01〜10mgである。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、遺伝子工学的操作及びチャネル活性分析操作については、公知の方法(Maniatis,T.ら,“Molecular Cloning−A Laboratory Manual”,1982,Cold Spring Harbor Laboratory,NY;Hille,B.,“Ionic Channels of Excitable Membranes”,2nd Ed.,1992,Sinauer Associates Inc.,MA)に従って実施可能である。
本実施例のクローニングにおいては、逆転写反応用キットはインビトロジェン社のSUPERSCRIPT First−Strand Synthesis System for RT−PCRを、クローニングキットはインビトロジェン社のTOPO XL PCR Cloning Kitを用いた。
【実施例1】
《ヒトLTRPC2タンパク質をコードする遺伝子の単離及び発現ベクターの構築》
配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるヒトLTRPC2タンパク質(以下の各実施例において、単に「ヒトLTRPC2タンパク質」と称する)をコードする全長cDNAは、ヒト白血球由来のmRNAを鋳型とする逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により取得した。まず、ヒト白血球mRNA(10ng)を、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを合成した。この第一鎖cDNAを鋳型とし、Taq DNAポリメラーゼ(LA Taq DNA polymerase;宝酒造)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。前記PCRは、センスプライマーとして配列番号5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号6で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に98℃(1分間)で熱変性を行なった後、98℃(15秒間)/65℃(30秒間)/72℃(6分間)からなるサイクルを35回繰り返した。その結果、約4.7kbpのDNA断片が増幅された。
このDNA断片を、クローニングキットを用いて、pCR−TOPOベクターにクローニングを行なった。得られたプラスミドDNAを制限酵素EcoRIで消化して、LTRPC2−cDNAのみを単離した後、pcDNA3.1(+)プラスミド(インビトロジェン社)を用いてクローニングした。pcDNA3.1(+)プラスミドは、サイトメガロウイルス由来のプロモーター配列を持っており、動物細胞でLTRPC2タンパク質を発現させるために使用することができる。得られたクローンpcDNA3.1−LTRPC2の塩基配列を、ジデオキシターミネーター(dideoxy terminator)法により、DNAシークエンサー(ABI3700 DNA Sequencer;アプライドバイオシステムズ社)を用いて解析したところ、配列番号1で表される配列が得られた。
【実施例2】
《ヒトLTRPC2遺伝子の発現分布》
ヒト組織及びヒト血液におけるヒトLTRPC2遺伝子の発現分布をRT−PCR法により解析した。ヒト組織については、ヒトの各組織由来のmRNA(クロンテック社)5ngをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キット(Advantage RT−for−PCR Kit;クロンテック社)を用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、Taq DNAポリメラーゼ(LA Taq DNA polymerase;宝酒造社)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。
ヒト血液は、1名の匿名社内ボランティア(健常人)より、血液凝固を防ぐためにヘパリン・ナトリウムを添加したシリンジを用いて、100ml採取した。その血液をFicoll−Paque試薬(アマシャムファルマシア社)を用いて、好酸球、好中球、リンパ球、血小板に分画した後、それぞれからISOGEN試薬(ニッポンジーン社)を用いて、総RNAを抽出した。なお、実際の操作は、Ficoll−Paque試薬、及びISOGEN試薬に添付のプロトコールに従って行った。それぞれの総RNA20ngをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、Taq DNAポリメラーゼ(LA Taq DNA polymerase;宝酒造)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。
前記PCRは、センスプライマーとして配列番号7で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に98℃(1分間)で熱変性を行なった後、98℃(15秒間)/70℃(1分間)からなるサイクルを30回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号1で表される塩基配列における第22番目〜第4533番目の塩基からなる配列からなるヒトLTRPC2遺伝子に特異的な配列である。
ヒトの各組織(扁桃体、尾状核、海馬、脳梁、黒質、視床、小脳、前頭葉、視床下部、脊髄、下垂体、全脳、心臓、胎盤、肺、気管、肝臓、骨格筋、腎臓、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、甲状腺、唾液腺、副腎、乳腺、及び前立腺)についてRT−PCR解析を行なったところ、約660bpのDNA断片が、脳、脊髄、心臓、胎盤、肺、気管、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、及び白血球にて増幅された。このことから、ヒトLTRPC2のmRNAが、PARP活性化に伴う細胞死が原因となる疾患が報告されている組織で発現していることが明らかになった。
また、ヒト血液についてのRT−PCR解析を行ったところ、約660bpのDNA断片が主にリンパ球にて増幅された。このことから、ヒトLTRPC2は、ヒト血液において主にリンパ球にて発現していることが明らかになった。リンパ球は免疫機能を担っていることが明らかになっていることから、LTRPC2遺伝子が免疫機能において重要な役割を担っている事が示唆された。
【実施例3】
《ラットLTRPC2タンパク質をコードする遺伝子の単離》
配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるラットLTRPC2タンパク質(以下の各実施例において、単に「ラットLTRPC2タンパク質」と称する)をコードする全長cDNAは、ラット脳由来のmRNA(クロンテック社)10ngを鋳型とするRT−PCRにより実施例1と同様の手法で取得した。PCRは、センスプライマーとして配列番号9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号10で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に98℃(1分間)で熱変性を行なった後、98℃(15秒間)/60℃(30秒間)/72℃(5分間)からなるサイクルを35回繰り返した。その結果、約4.7kbpのDNA断片が増幅された。このDNA断片を、pCR−TOPOベクターにクローニングして得られたクローンpCR−TOPO−ratLTRPC2の塩基配列を解析したところ、配列番号3で表される配列が得られた。配列番号3で表される塩基配列は、4527塩基対からなるオープンリーディングフレーム(配列番号3で表される塩基配列における第84番〜第4610番の塩基からなる配列)を有する。前記オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、1508アミノ酸残基からなる配列番号4で表されるアミノ酸配列であった。
配列番号4で表されるアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアミノ酸配列(ヒトLTRPC2タンパク質)と84%のホモロジーを有する。なお、前記ホモロジーの数値は、前記BLAST検索により得られた値である。
【実施例4】
《ラットLTRPC2遺伝子の発現分布》
ラット組織におけるラットLTRPC2遺伝子の発現分布をRT−PCR法により解析した。ラットの各組織由来のmRNA(クロンテック社)5ngをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、Taq DNAポリメラーゼ(Platinum Taq DNA polymerase;インビトロジェン社)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。前記PCRは、センスプライマーとして配列番号11で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号12で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に95℃(1分間)で熱変性を行なった後、95℃(15秒間)/62℃(30秒間)/72℃(1分間)からなるサイクルを35回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号3で表される塩基配列における第84番目〜第4610番目の塩基からなる配列からなるラットLTRPC2遺伝子に特異的な配列である。
ラットの各組織(脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、網膜、骨格筋、脾臓、及び精巣)についてRT−PCR解析を行なったところ、約380bpのDNA断片が全ての組織にて増幅され、ラットLTRPC2のmRNAは、前記の各組織で発現していることが明らかになった。また、この結果から、PARP活性化に伴う細胞死が原因となる疾患が報告されている組織で、ラットLTRPC2のmRNAが発現していることが明らかになった。
【実施例5】
《ヒトLTRPC2タンパク質の動物細胞での発現》
ヒトLTRPC2タンパク質のチャネル活性を検出するために、動物細胞に前記タンパク質の発現を誘導した。実施例1で得られた発現ベクターpcDNA3.1−LTRPC2と、形質転換用試薬(LIPOFECTAMINE2000;インビトロジェン社)とを用いて、チャイニーズ・ハムスター卵巣由来のCHO dhfr−細胞の形質転換を行ない、ヒトLTRPC2タンパク質の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法(文献1)に従って実施した。
【実施例6】
《PARP活性化剤によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化検出》
以下で具体的に記載した操作以外は、公知の方法(文献1、文献2)に従って実施した。
実施例5で得られた形質転換細胞(1.6×105細胞)を、86RbCl(1μCi/mL)存在下、37℃で24時間インキュベートすることにより、86Rb+を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかった86Rb+を取り除いた。得られた細胞を、PARP活性化剤であるMNNG(最終濃度=1mmol/L)又はH2O2(最終濃度=0.06%)を添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、通常の生理食塩水(すなわち、MNNG又はH2O2のいずれも添加しない生理食塩水)中にて、同様の操作を実施した。
各細胞を生理食塩水で洗浄した後、細胞に残った86Rb+の放射活性を測定した。その結果、86Rb+の残存活性は、コントロールの細胞(MNNG又はH2O2を添加していない細胞)と比較して、MNNGを添加した細胞では35.6%に、H2O2を添加した細胞では8.9%に、それぞれ減少していた。これは、MNNG又はH2O2によりヒトLTRTPC2タンパク質が活性化し、細胞内の86Rb+が細胞外へ排出されたことを示している。この結果から、ヒトLTRPC2タンパク質は、PARP活性化剤であるMNNG又はH2O2で活性化することが明らかになった。
【実施例7】
《PARP活性阻害剤によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害》
以下で具体的に記載した操作以外は、公知の方法(文献1、文献2)に従って実施した。
実施例5で得られた形質転換細胞(1.6×105細胞)を、86RbCl(1μCi/mL)存在下、37℃で24時間インキュベートすることにより、86Rb+を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかった86Rb+を取り除いた。得られた細胞に対して、MNNG(最終濃度=1mmol/L)又はH2O2(最終濃度=0.06%)存在下で、PARP活性化阻害剤であるDPQ(最終濃度=100μmol/L)、3−アミノベンズアミド(最終濃度=1mmol/L)、又はニコチンアミド(最終濃度=1mmol/L)をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、MNNG及びH2O2不在下で、生理食塩水(すなわち、DPQ、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドのいずれも添加しない生理食塩水)中にて、同様の操作を実施した。
各細胞を生理食塩水で洗浄した後、細胞に残った86Rb+の放射活性を測定した。その結果、PARP活性化阻害剤を添加した各細胞における86Rb+の残存活性は、コントロールの細胞(MNNG又はH2O2を添加していない細胞)、すなわち、ヒトLTRPC2タンパク質の活性を誘導していない細胞と同等であった。より具体的には、DPQを添加した細胞では、コントロール細胞に対して、93.4%(H2O2存在下の場合)又は95.5%(MNNG存在下の場合)の86Rb+残存活性を示した。同様に、3−アミノベンズアミドを添加した細胞では、91.9%(H2O2存在下の場合)又は96.2%(MNNG存在下の場合)の86Rb+残存活性を示し、ニコチンアミドを添加した細胞では、57.8%(H2O2存在下の場合)又は95.9%(MNNG存在下の場合)の86Rb+残存活性を示した。
これは、DPQ、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドによってヒトLTRPC2タンパク質の活性化が阻害され、細胞内の86Rb+が細胞外へ排出されなかったか、あるいは、排出が減少したことを示している。この結果から、MNNG又はH2O2によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化は、PARP活性化阻害剤であるDPQ、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドによって阻害されることが明らかになった。
【実施例8】
《PARP活性阻害剤によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害とPARP活性化阻害との比較》
実施例7で示したPARP阻害剤によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害がPARPを介していることを確認するために、ヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害のIC50値とPARP活性化阻害のIC50値を比較、検討した。
前述のPARP活性化阻害剤であるDPQ、3−アミノベンズアミド、ニコチンアミドのLTRPC2の活性化阻害のIC50値を各濃度の阻害剤を添加することにより実施例7の方法で検討した。その結果、DPQ、3−アミノベンズアミド、ニコチンアミドのヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害のIC50値はそれぞれ、0.20μM、117μM、541μMであった。
PARP活性化阻害のIC50値は次の方法で検討した。実施例5で得られた形質転換細胞を、PARP活性化剤であるMNNG(最終濃度=1mmol/L)又はH2O2(最終濃度=0.06%)、及び前述で用いた各濃度のPARP阻害剤をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、通常の生理食塩水(すなわち、MNNG又はH2O2のいずれも添加しない生理食塩水)中にて、同様の操作を実施した。その後、活性剤、及び阻害剤を添加した生理食塩水を除いた細胞に3H−NADを最終濃度0.2nCi/μLになるように加え、37度で40分間インキュベートした。その後、この細胞にTCAを最終濃度10%になるように加えて4度で30分間インキュベートすることで反応を停止させた。その後、細胞を5%TCAで2回洗浄することで、取り込まれなかった3H−NADを除いた。洗浄した細胞を、2%SDS、0.1M−NaOHを含む溶液で溶解した後、細胞に含まれる3Hの放射活性を測定した。その結果、DPQ、3−アミノベンズアミド、ニコチンアミドのPARP活性化阻害のIC50値は、それぞれ0.26μM、71.7μM、335μMであった。
それぞれのIC50値は、LTRPC2活性化阻害、及びPARP活性化阻害で近似していることから、LTRPC2活性化阻害はPARP活性化阻害によるものであることが確認された。
【実施例9】
《ヒトLTRPC2タンパク質の動物細胞での発現》
ヒトLTRPC2タンパク質の細胞での機能を明らかにするために、動物細胞に前記タンパク質の発現を誘導した。実施例1で得られた発現ベクターpcDNA3.1−LTRPC2と、形質転換用試薬(LIPOFECTAMINE2000;インビトロジェン社)とを用いて、ヒト胎児腎臓由来のHEK293細胞の形質転換を行ない、ヒトLTRPC2タンパク質の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法(文献1)に従って、実施した。
【実施例10】
《ヒトLTRPC2タンパク質による細胞死誘導》
実施例8で得られた形質転換細胞を96穴プレート(旭テクノグラス社)に4×104細胞/ウェルになるように蒔き一晩培養した後、、最終濃度0.001%H2O2を含む細胞培地で室温、2時間インキュベートした。生理食塩水で洗浄した後、細胞培地を添加し4時間培養した。培地を除いた後、細胞の生死を判定するためにアラマブルーアッセイ(alamaBlue Assay;バイオサイエンス社)を行った。本操作は、細胞における酸化還元反応によって蛍光を発する試薬を加え、その結果生じる蛍光強度を測定することによって、細胞の生死を判断することができる。なお、実験操作は、前記アラマブルーアッセイ用試薬に添付のプロトコールに従って実施した。刺激を加えた細胞にアラマブルーアッセイ用試薬を加え、さらに1時間インキュベーションした後、蛍光強度を測定した。なお、コントロールとして、LTRPC2を含まないpcDNA3.1ベクターのみを形質転換した細胞を用いて、同様の操作を実施した。その結果、LTRPC2を発現させた細胞はベクターのみを発現させた細胞に比較して、有意に蛍光強度が減少していた(47.5%の減少)。これは、H2O2刺激によってLTRPC2を介して細胞死が起き、その結果、生きている細胞が減少したことを示している。この結果から、ヒトLTRPC2タンパク質は、H2O2刺激による細胞死を促進することが確認できた。また、前記の結果よりLTRPC2はH2O2刺激によって活性化することが明らかになっているので、本実施例の結果からもLTRPC2タンパク質は細胞死を引き起こす機能を有していることが明らかである。
【実施例11】
《マウスLTRPC2タンパク質をコードする遺伝子の単離》
配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるマウスLTRPC2タンパク質(以下の各実施例において、単に「マウスLTRPC2タンパク質」と称する)をコードする全長cDNAは、マウス脳由来のmRNA(クロンテック社)10ngを鋳型とするRT−PCRにより実施例1及び実施例2と同様の手法で取得した。PCRは、センスプライマーとして配列番号15で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号16で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、PCRサイクルは実施例2と同様の条件で行った。その結果、約4.7kbpのDNA断片が増幅された。このDNA断片をpCR−TOPOベクターにクローニングして得られたクローンpCR−TOPO−mouseLTRPC2の塩基配列を解析したところ、配列番号13で表される配列が得られた。配列番号13で表される塩基配列は、4524塩基対からなるオープンリーディングフレーム(配列番号13で表される塩基配列における第36番〜第4559番の塩基からなる配列)を有する。前記オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、1507アミノ酸残基からなる配列番号14で表されるアミノ酸配列であった。配列番号14で表されるアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアミノ酸配列(ヒトLTRPC2タンパク質)、及び配列番号4で表されるアミノ酸配列(ラットLTRPC2タンパク質)とそれぞれ84%、94%のホモロジーを有する。なお、前記ホモロジーの数値は、前記BLAST検索により得られた値である。
【実施例12】
《マウスLTRPC2遺伝子の慢性関節リウマチモデル動物における発現解析》
慢性関節リウマチにおけるLTRPC2遺伝子の発現解析を行うために、慢性関節リウマチのモデルであるマウスコラーゲン誘発関節炎モデルを作製し、このマウスでのマウスLTRPC2遺伝子の発現変動を解析した。
マウスコラーゲン誘発関節炎モデルの作製は以下の方法で行った。マウス関節部分に150μgのタイプ2コラーゲンを注射し3週間飼育した後、再度同量のコラーゲンの注射を行った。その後、5週間飼育を行った後、解剖して関節部分を取り出した。この時、取り出したマウス関節は慢性関節リウマチ患者と同様の損傷(軟骨、骨破壊)がおきていることを確認した。このマウス関節を凍結粉砕後、ISOGEN試薬(ニッポンジーン社)を用いて、mRNAを抽出した。なお、コントロールとして、処理を行っていない正常マウスの関節からも同様にmRNAを抽出した。
得られたマウスコラーゲン誘発関節炎モデルの関節におけるマウスLTRPC2遺伝子の発現変動を解析するために、PRISM7900(アプライドバイオシステムズ社)を用いたリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRを行うことで、mRNA中に含まれるマウスLTRPC2遺伝子を定量化して測定することができる。
得られたmRNAをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、蛍光試薬SYBR Green PCR Core Reagents Kit(アプライドバイオシステムズ社)を用いて、PCRを行なった。前記PCRは、センスプライマーとして配列番号17で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号18で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に95℃(10分間)で熱変性を行なった後、95℃(15秒間)/59℃(1分間)からなるサイクルを45回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号13で表される塩基配列における第3763番目〜第3780番目、及び第3813番目〜第3830番目の塩基配列からなるマウスLTRPC2遺伝子に特異的な配列である。
その結果、マウスLTRPC2遺伝子はコラーゲン誘発関節炎モデルマウスにおいて、処理を行っていない正常マウスと比較して、発現量が約15倍増加していた。このことから、マウスLTRPC2遺伝子は、慢性関節リウマチにおいて重要な働きを担っていることが明らかになった。
【実施例13】
《マウスLTRPC2遺伝子の発現分布》
マウス組織におけるマウスLTRPC2遺伝子の発現分布を、実施例12と同様の方法で、PRISM7900(アプライドバイオシステムズ)を用いたリアルタイムPCRにより解析した。マウスの各組織(脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、平滑筋、脾臓、及び精巣)由来のmRNA(クロンテック社)5ngをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、PCRを行なった。その結果、脳、脾臓を中心に全ての組織にて増幅が検出された。このことから、マウスLTRPC2のmRNAは、前記の各組織で発現していることが明らかになった。また、この結果から、PARP活性化に伴う細胞死が原因となる疾患が報告されている組織で、マウスLTRPC2のmRNAが発現していることが明らかになった。
【実施例14】
《PARP−1ドミナントネガティブ変異体をコードする遺伝子の単離及び発現ベクターの構築》
ヒトPARP−1全長アミノ酸配列(Genebankアクセッション番号:XP_037273)の第1番目〜第374番目はDNA結合部位であり、このDNA結合部分のみを野生型PARP−1と共発現すると、DNAへの結合を競合することが知られている。その結果、野生型PARP−1のDNAへの結合の割合が減少することで、活性化したPARP−1のDNAへのポリADPリボース化の阻害、および細胞死の誘導が阻害されることが知られている(ドミナントネガティブ効果)。従って、PARP−1のDNA結合部位のみは、PARP−1に対してドミナントネガティブ効果を示すドミナントネガティブ変異体タンパク質として機能することが明らかなっている。(Kupper,J.H.,de,Murcia,G.及びBurkle,A.,J.Biol.Chem.,265,18721−18724,1990)。
上記部位、すなわち、配列番号20で表されるアミノ酸配列からなるヒトPARP−1ドミナントネガティブ変異体タンパク質(以下の各実施例において、単に「PARP−1ドミナントネガティブ変異体」と称する)をコードする全長cDNAは、ヒト脾臓由来のmRNAを鋳型とするRT−PCRにより取得した。まず、ヒト脾臓mRNA(10ng)を、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを合成した。この第一鎖cDNAを鋳型とし、Taq DNAポリメラーゼ(LA Taq DNA polymerase;宝酒造)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。前記PCRは、センスプライマーとして配列番号21で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号22で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に98℃(1分間)で熱変性を行なった後、98℃(15秒間)/65℃(30秒間)/72℃(6分間)からなるサイクルを35回繰り返した。その結果、約1.2kbpのDNA断片が増幅された。このDNA断片を、クローニングキットを用いて、pCR−TOPOベクターにクローニングを行なった。得られたプラスミドDNAを制限酵素EcoRIで消化して、インサート(PARP−1ドミナントネガティブ変異体をコードするcDNA)のみを単離した後、pcDNA3.1(+)プラスミド(インビトロジェン社)を用いてクローニングした。得られたクローンpcDNA3.1−PARPtの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法により、DNAシークエンサー(ABI3700 DNA Sequencer;アプライドバイオシステムズ社)を用いて解析したところ、配列番号19で表される配列が得られた。配列番号19で表される塩基配列は、PARP−1ドミナントネガティブ変異体をコードしていた。
【実施例15】
《PARP−1ドミナントネガティブ変異体によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害》
ヒトLTRPC2タンパク質のチャネル活性へのPARP−1ドミナントネガティブ変異体の影響を検討するために、動物細胞に前記タンパク質の発現を誘導した。実施例1、及び実施例14で得られた発現ベクターpcDNA3.1−LTRPC2及びpcDNA3.1−PARPtと、形質転換用試薬(LIPOFECTAMINE2000;インビトロジェン社)とを用いて、チャイニーズ・ハムスター卵巣由来のCHO dhfr−細胞の形質転換を行ない、ヒトLTRPC2タンパク質及びPARP−1ドミナントネガティブ変異体の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法(文献1)に従って、実施した。
得られた形質転換細胞(1.6×105細胞)におけるLTRPC2活性化を、Rb+イオンの放出を測定する方法を利用して測定した。方法は実施例6と同様に行った。ただし、PARP活性化剤としてはH2O2(最終濃度=0.06%)を用い、コントロールとして、実施例5で得られたLTRPC2タンパク質のみを発現させた細胞を用いた。
測定の結果、PARP−1ドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞における86Rb+の残存活性は、コントロールの細胞(PARP−1ドミナントネガティブ変異体を発現させていない細胞)と比較して有意に上昇していた。
これは、PARP−1ドミナントネガティブ変異体によってPARP活性が阻害されて、その結果、ヒトLTRPC2タンパク質の活性化が阻害され、細胞内の86Rb+の細胞外への排出が減少したことを示している。
また、この時のPARPの活性化を実施例8の手法を用いて検討した。ただし、PARP活性化剤としてはH2O2(最終濃度=0.06%)を用い、コントロールとして、実施例5で得られたLTRPC2タンパク質のみを発現させた細胞を用いた。測定の結果、PARP−1ドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞における3Hの放射活性は、コントロールの細胞と比較して、67%に減少していた。
これらの結果から、H2O2によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化は、PARP−1ドミナントネガティブ変異体によって阻害されることが明らかになった。PARP阻害化合物を用いた結果(実施例7)に加え、PARP−1ドミナントネガティブ変異体を用いた結果(本実施例)からも、PARP活性が減少することによりLTRPC2活性化が阻害され、LTRPC2はPARPによって活性が制御されていることが確認された。
【実施例16】
《ヒトLTRPC2タンパク質活性阻害剤のスクリーニング》
ヒトLTRPC2タンパク質のイオンチャネル活性を阻害する化合物のスクリーニングを行なった。
実施例5で得られた形質転換細胞を(1.6×105細胞)を、86RbCl(1μCi/mL)存在下、37℃で24時間インキュベートすることにより、86Rb+を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかった86Rb+を取り除いた。得られた細胞に対して、H2O2(最終濃度=0.06%)存在下で、さまざまな化合物(最終濃度=10μmol/L)をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、化合物を添加しないH2O2存在下で、同様の操作を実施した。
各細胞を生理食塩水で洗浄した後、細胞に残った86Rb+の放射活性を測定した。得られた放射活性がコントロールの細胞(H2O2のみを添加した細胞)の放射活性と比較して、有意に高い残存活性を示す化合物がヒトLTRPC2タンパク質のチャネル活性を阻害する化合物である。これは、添加した化合物によってヒトLTRPC2タンパク質の活性化が阻害され、細胞内の86Rb+が細胞外へ排出されなかったか、あるいは、排出が減少したことを示している。
上記で見出された化合物は、ヒトLTRPC2タンパク質の活性化に伴う86Rb+の細胞外への排出を指標にしたものであり、直接のヒトLTRPC2タンパク質の阻害活性を検出していない。より具体的には、細胞内に含まれるPARPの阻害活性を示す化合物もヒトLTRPC2タンパク質の活性化を阻害し、その結果86Rb+の細胞外への排出を阻害する。そのため、上記工程で得られた化合物について、更にPARP阻害活性の検討を行なった。
実施例5で得られた形質転換細胞に対して、H2O2(最終濃度=0.06%)存在下で、さまざまな化合物(最終濃度=10μmol/L)をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、化合物を添加しないH2O2存在下で、同様の操作を実施した。その後、反応液を除去した細胞に3H−NADを最終濃度0.2nCi/microLになるように加え、37度で40分間インキュベートとした。その後、この細胞にTCAを最終濃度10%になるように加えて4度で30分間インキュベートすることで反応を停止させた。その後、細胞を5%TCAで2回洗浄することで、取り込まれなかった3H−NADを除いた。洗浄した細胞を、2%SDS、0.1%NaOHを含む溶液で溶解した後、細胞に含まれる3Hの放射活性を測定した。
その結果、コントロールの細胞(H2O2のみを添加した細胞)の残存放射活性と同程度の残存活性を示す化合物を選択した。これは、添加した化合物が、PARP活性を阻害していないことを示している。
これらの検討の結果、ヒトLTRPC2タンパク質の活性化に伴う86Rb+の細胞外への排出を阻害し、同時に細胞内のPARP活性を阻害しない化合物を選択した。この化合物はヒトLTRPC2タンパク質の活性化を直接阻害していることが考えれる。
次に、見出された化合物がヒトLTRPC2タンパク質を直接阻害していることを確認するために、電気生理の手法を用いて、ヒトLTRPC2タンパク質のイオンチャネル活性への影響を検討した。具体的には、前記実施例5で得られた形質転換細胞を、ホールセル膜電位固定(whole−cell voltage−clamp)法により膜電位固定し、ADP−ribose(最終濃度500μM)を細胞内へ投与したときに生じる全細胞電流を測定した。細胞外液として、145mmol/L−NaCl、5mmol/L−KCl、2mmol/L−CaCl2、2mmol/L−MgCl2、及び10mmol/L−HEPES−Na(pH=7.4)を含む溶液を使用し、細胞内液として、150mmol/L−CsCl、5mmol/L−MgCl2、及び10mmol/L−HEPES−Cs(pH=7.2)を含む溶液を用いた。
この時、上記工程で見出された化合物をADP−ribose投与と同時に、あるいは前処理時から加え、ADP−riboseによって惹起される全電流変化を測定した。この時、全電流変化がADP−ribose単独を加えた時と比較して、減少、あるいは完全に惹起されなくなる化合物を選択する。これは、添加した化合物が直接ヒトLTRPC2タンパク質のチャネル活性を阻害したことを示している。
これらの検討を行なうことで、ヒトLTRPC2タンパク質を直接阻害する化合物を見出すことが可能である。
【実施例17】
《ヒトLTRPC2タンパク質のすい臓細胞での発現とヒトLTRPC2タンパク質による1型糖尿病の細胞死の促進》
ヒトLTRPC2タンパク質のすい臓での機能、及び1型糖尿病モデルにおける細胞死へのヒトLTRPC2タンパク質の関与を検討した。すい臓細胞の1型糖尿病の細胞死は、ストレプトゾトシン刺激による細胞死をモデルとすることができる。さらに、この細胞死の過程には、PARPが関与していることも明らかになっている(Pieper,A.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,96,3059−3064,1999)。
実施例1で得られた発現ベクターpcDNA3.1−LTRPC2と、形質転換用試薬(LIPOFECTAMINE2000;インビトロジェン社)とを用いて、マウスすい臓ランゲルハンス島ベータ細胞由来のMIN6B細胞の形質転換を行ない、ヒトLTRPC2タンパク質の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法(文献1)に従って、実施した。
得られた形質転換細胞を96穴プレート(旭テクノグラス社)に4×104細胞/ウェルになるように蒔き一晩培養した後、最終濃度1mMストレプトゾトシン(シグマ・アルドリッチ社)を含む細胞培地で室温、越夜でインキュベートした。細胞培地を除いた後、細胞の生死を判定するためにMTTアッセイを行った。本操作は、細胞内のミトコンドリアの呼吸酵素系によってMTTがホルマザンに還元されて青色を呈する反応を利用することによって、細胞の生死を判断することができる。刺激を加えた細胞にMTT試薬(和光純薬)を加え2時間培養した後、培養上清を抜き取った細胞にDMSOを加えてホルマザンを溶解した後、吸光光度計で吸光度を測定した。なお、コントロールとして、LTRPC2を含まないpcDNA3.1ベクターのみを形質転換した細胞を用いて、同様の操作を実施した。その結果、LTRPC2を発現させた細胞はベクターのみを発現させた細胞に比較して、有意に吸光度が減少していた(93%に減少)。これは、ストレプトゾトシン刺激によってLTRPC2を介して細胞死が起き、その結果、生きている細胞が減少したことを示している。この結果から、ヒトLTRPC2タンパク質は、ストレプトゾトシン刺激による細胞死を促進することが確認できた。さらに、ストレプトゾトシン刺激による細胞死は1型糖尿病のモデルであることから、ヒトLTRPC2は1型糖尿病による細胞死を誘導する機能を有していることが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明のスクリーニング方法によれば、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制する物質、特には、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患(例えば、慢性関節リウマチ、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、1型糖尿病における膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、あるいは、免疫細胞死による炎症反応)の治療剤及び/又は予防剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。本発明のLTRPC2、本発明の細胞を用いて、本発明のスクリーニング系を構築することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
本発明は、細胞死抑制剤スクリーニング法に関する。また、本発明は、新規ラットLTRPC2及びマウスLTRPC2に関する。
背景技術
核内に存在するポリ・ADPリボース・ポリメラーゼ(PARP;poly−ADP−ribose polymerase)は、誘導型一酸化窒素(NO)、活性酸素などによるDNA分解によって活性化し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)からADPリボース部分を核タンパク質、およびDNAに付加する酵素である。すなわち、DNA障害はPARPを活性化し、ATPを消費しながら大量のADPリボースをヒストンやPARP自身に付加する。その結果、細胞内のNAD量及びATP量が減少し、細胞内エネルギー枯渇による細胞死を来すものと考えられている(Zhang,J.及びSnyder,S.H.,Science,263,687−689,1995)。PARPタンパク質を構成する遺伝子は、これまでに5つ報告されており、これらの遺伝子が機能することでPARP活性を示すことが推測されている。それらの遺伝子の中で、PARP−1遺伝子が最も解析が進められている遺伝子であり、PARPタンパク質の活性化に伴う細胞死に最も貢献度が高い遺伝子であると推測されている。(Smith,S.,Trends Biochem.Sci.,26174−179,2001)
PARP遺伝子を欠損させたミュータントマウスにおいて、膵臓ランゲルハンス島細胞でDNA損傷によるNAD枯渇が生じないことが報告されている(Heller,B.ら,J.Biol.Chem.,270,11176−11180,1995)。また別文献によると、前記ミュータントマウスで大脳皮質ニューロンでも同様にDNA損傷によるNAD枯渇が生じないことが明らかになっており、さらにこのマウスでは一過性脳虚血に伴う脳梗塞範囲が著明に減少することが報告されている(Eliasson,M.J.ら,Nature Med.,3,1089−1095,1997)。このようにPARPの活性化によって引き起こされた細胞死は、生体組織において重篤な疾患を引き起こすことが知られている。PARPの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患として、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、1型糖尿病における膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、免疫細胞死による炎症反応、免疫機能に異常が起きることで発病する自己免疫疾患である慢性関節リウマチ(Eliasson,M.J.ら,Nature Med.,3,1089−1095,1997;Zingarelli,B.,Salzman,A.L.及びSzabo,C.,Circ.Res.,83,85−94,1998;Burkart,V.ら,Nature Med.,5,314−319,1999;Pieper,A.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,96,3059−3064,1997;Szabo,C.,Cuzzocrea,S.,Zingarelli,B.,O’Connor,M.及びSaltzman,A.L.,J.Clin.Invest.,100,723−735,1997;Oliver,F.J.ら,EMBO J.,18,4446−4454,1999、Szabo,C.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,95,3867−72,1998)も知られている。
一方、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(N−methyl−N’−nitro−N−nitrosoguanidine;MNNG)又はH2O2は、PARPを活性化することによって細胞死を引き起こすことが知られており(Halappanavar,S.S.ら,J.Biol.Chem.,274,37097−37104,1999;Watson,A.J.,Askew,J.N.及びBenson,R.S.,Gastroenterology,109,472−482,1995)、3,4−ジヒドロ−5−[4−(1−ピペリジニル)ブトキシ]−1(2H)−イソキノリノン[3,4−dihydro−5−[4−(1−piperidinyl)butox]−1(2H)−isoquinolinone;DPQ]、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドは、PARPの活性化を阻害することによって、PARPによる細胞死を抑制することが知られている(Takahashi,K.ら,Brain Res.,829,46−54,1999;Watson,A.J.,Askew,J.N.及びBenson,R.S.,Gastroenterology,109,472−482,1995)。
しかしながら、PARPの下流に存在している因子の存在は明確にはされておらず、どのような機序でPARPの活性化が細胞死を引き起こすかについては現在のところ不明である。
一方、ヒトLTRPC2(long transient receptor potential channel 2)遺伝子は1998年に取得された(Genomics,54,1,124−131,1998)。マウスLTRPC2遺伝子は取得したとの報告(Japanese Journal of Pharmacology 80,Suppl.1,83,2000、Molecular Cell 9,163−173,2002)はあるもののその具体的な塩基配列については開示されていない。また、ラットLTRPC2に関する情報は開示されていない。ヒトLTRPC2遺伝子は細胞内のADPリボース又はNADによって活性化し、カルシウム透過型非選択的陽イオンチャネルとして機能することが明らかになっている(Sano,Y.ら,Science,293,1327−1330,2001)。ADPRによるLTRPC2の制御機構は細胞機能において大きな役割を持つかもしれないことが示唆されてはいるものの(Nature,411,6837,595−599,2001)、どのような機序によって細胞内でLTRPC2が機能して、その結果、細胞にどのような影響を示すかは不明である。
また、これまでに免疫細胞をクローン化した細胞でのLTRPC2遺伝子の発現は明らかになっているが、実際のヒトの血液、特に免疫細胞が含まれているリンパ球での発現は不明である。
以上述べたように、PARPの活性化が細胞死を引き起こすこと自体は知られていたが、PARPの下流に存在している因子の存在は明確にはされておらず、その機序は不明であった。従って、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制する物質、特には、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患(例えば、慢性関節リウマチ、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、あるいは、免疫細胞死による炎症反応)の治療剤及び/又は予防剤として有用な物質をスクリーニングする方法が待望されている。
発明の開示
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、LTRPC2タンパク質の活性化がPARPの活性化によって制御されており、細胞死を引き起こす機能を有していることを、初めて見い出した。さらに、LTRPC2遺伝子がヒトリンパ球で発現しており、さらに、慢性関節リウマチ疾患において発現量が増加していることを、初めて見い出した。
より具体的には後述の実施例6に示すように、PARPを活性化することが知られている物質、すなわち、MNNG又はH2O2を、LTRPC2タンパク質を発現させた細胞に添加すると、LTRPC2タンパク質の活性化が観察された。更に、実施例7に示すように、PARPの活性化阻害剤であるDPQ、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドを、PARP活性化剤(例えば、MNNG又はH2O2)と共に添加すると、LTRPC2タンパク質の活性化は有意に阻害された。
さらに、実施例10に示すように、LTRPC2タンパク質を発現させた細胞で、PARP活性化剤であるH2O2による細胞死が促進された。
また、実施例2に示すように、LTRPC2遺伝子は免疫の機能を担うリンパ球で多く発現しており、さらに、実施例12に示すように免疫疾患の1つである慢性関節リウマチのモデル動物において、LTRPC2遺伝子の発現量が増加していた。
加えて、実施例17に示すように、LTRPC2タンパク質は1型糖尿病モデルであるストレプトゾトシン刺激による細胞死を促進することを見出した。
従って、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質を選択することにより、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制することができる物質を同定することができ、引いては、細胞死によって引き起こされる疾患治療薬、例えば、免疫疾患である慢性関節リウマチ、脳虚血後の神経細胞死、又は1型糖尿病における膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊の治療薬として有用な物質を見出すことができる。本発明は、このような知見に基づくスクリーニング系を提供するものである。
すなわち本発明は、
(1)配列番号2、配列番号4若しくは配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその機能的等価改変体を発現している細胞に、前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程、及び
前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体の活性化の阻害を分析する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法、
(2)(1)に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制用医薬組成物の製造方法、
(3)(i)配列番号4又は配列番号14で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド、あるいは、(ii)配列番号4又は配列番号14で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド(但し、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)、
(4)配列番号4又は配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(5)(3)又は(4)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(6)(5)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
(7)(6)に記載のベクターを含む細胞、
(8)(7)に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、(3)又は(4)に記載のポリペプチドを製造する方法
に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書における「細胞死」には、アポトーシス及びネクローシスの両方が含まれる。アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死である。一方、ネクローシスは生体の一部が死ぬことを示し、非生理的条件下で強制的に引き起こされる細胞死である。
[1]本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
配列番号4及び配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれラット、及びマウス由来の天然型LTRPC2タンパク質である。「配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」又はその機能的等価改変体(但し、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)は、それら自体、新規のポリペプチドであり、本発明のポリペプチドに包含される。
「配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体としては、例えば、
(1)配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(2)配列番号4で表されるアミノ酸配列の1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、更に好ましくは1個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(3)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示す部分断片;又は
(4)配列番号4で表されるアミノ酸配列との相同性が84%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上)であるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド
などを挙げることができる。
また、「配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体としては、例えば、
(1)配列番号14で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(2)配列番号14で表されるアミノ酸配列の1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、更に好ましくは1個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(3)配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示す部分断片;又は
(4)配列番号14で表されるアミノ酸配列との相同性が84%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上)であるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド
などを挙げることができる。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、BLASTパッケージ[sgi32bit版,バージョン2.0.12;National Center for Biotechnology Information(NCBI)より入手]のbl2seqプログラム(Tatiana A.Tatusova,Thomas L.Madden,FEMS Microbiol.Lett.,174,247−250,1999)を用いて得られた値を意味する。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、「プログラム名」として「blastp」を、「Gap挿入Cost値」を「0」で、「Gap伸長Cost値」を「0」で、「Matrix」として「BLOSUM62」をそれぞれ使用する。
本明細書において、或るポリペプチドが「LTRPC2タンパク質活性」を示すとは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる公知のヒト由来の天然型LTRPC2タンパク質と同様の活性を示すことを意味し、具体的には、例えば、PARP共発現下で、PARP活性化剤を作用させることにより、膜に存在する前記ポリペプチドそれ自体がイオンの通り道を生じ、その結果、イオンの透過を生じさせる活性を意味する。
本明細書において、或るポリペプチドが「LTRPC2タンパク質活性」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法(好ましくは実施例6に記載の方法)により確認することができる。すなわち、LTRPC2タンパク質をコードするポリペプチドを含む発現ベクターで、PARPを発現している細胞をトランスフェクションする。得られた細胞に予め86Rb+を取り込ませ、PARP活性化剤を添加する。その結果生じるLTRPC2タンパク質を介した細胞からの86Rb+の放出を、細胞外液又は細胞内の86Rb+の放射活性の変化を指標に確認することができる。
「配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体の1つである「配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド」には、例えば、配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド(但し、LTRPC2タンパク質活性を示すことが必要)を挙げることができる。前記マーカー配列としては、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、FLAGエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はmycエピトープなどを挙げることができる。
「配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体の起源は、ヒト、ラット又はマウスに限定されない。例えば、前記機能的等価改変体には、例えば、配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒト、ラット又はマウスにおける天然のアレル変異体(但し、LTRPC2タンパク質活性を示す)、あるいは、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism;SNP)などのアミノ酸置換で生じたポリペプチド(但し、LTRPC2タンパク質活性を示す)が含まれるだけでなく、ヒト、ラット又はマウス以外の生物[例えば、ヒト又はラット以外の哺乳動物(例えば、ハムスター、又はイヌ)]由来の天然に存在する機能的等価改変体が含まれる。また、これらの天然のポリペプチド、特には、配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列を基にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。
本発明の新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それら自体、新規物であり、本発明のポリヌクレオチドに包含される。本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号4若しくは配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号3で表される塩基配列における第84番〜第4610番の塩基からなる配列若しくは配列番号13で表される塩基配列における第36番〜第4559番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドがより好ましい。更に好ましくは、配列番号3で表される塩基配列における第84番〜第4610番の塩基からなる配列である。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、DNA及びRNAの両方が含まれる。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドは、細胞死抑制用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。
[2]スクリーニング用細胞、並びに、本発明の発現ベクター及び細胞
配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のヒト由来の天然型LTRPC2タンパク質である。配列番号2、配列番号4若しくは配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、その機能的等価改変体とを総称して、「LTRPC2タンパク質」と称する。
「配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」の機能的等価改変体としては、例えば、
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列の1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、更に好ましくは1個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド;
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示す部分断片;又は
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が84%以上(好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上)であるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド
などを挙げることができ、配列番号4又は14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能改変体と同様、その起源は限定されず、また、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも含まれる。
本発明のスクリーニング方法で用いる細胞(スクリーニング用細胞と称する)は、上記のLTRPC2タンパク質を発現している細胞である限り特に限定されるものではなく、遺伝子組換え技術により製造した細胞及び天然に存在する細胞の何れを用いることも出来るが、遺伝子組換え技術により製造した細胞を用いることが好ましい。また、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその機能的等価改変体を発現している細胞が好ましく、配列番号2、配列番号4、若しくは配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現している細胞が更に好ましい。スクリーニング用細胞は、細胞死抑制用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのベクターを含む細胞は、それぞれ、新規であり、本発明のベクター及び本発明の細胞に包含される。本発明の細胞は上記スクリーニング用細胞に包含され、本発明のスクリーニングに用いることが出来る。
[3]スクリーニング用細胞の製造方法
スクリーニング用細胞の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターDNAに組込み、宿主細胞(好ましくは真核生物、特に好ましくはCHO細胞)を形質転換させることにより取得することができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
スクリーニング用細胞の製造に用いることのできる、LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチド(本発明のポリヌクレオチドを含む)の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、(1)PCRを用いた方法、(2)常法の遺伝子工学的手法(すなわち、cDNAライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のcDNAを含む形質転換株を選択する方法)を用いる方法、又は(3)化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。なお、以下の説明は、本発明のポリヌクレオチドを例にとって説明するが、本発明のポリヌクレオチド以外の、LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチドについても、同様にして製造することができる。
PCRを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞又は組織からmRNAを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するmRNAの全長を挟むことのできる2個1組のプライマーセット、あるいは、その一部のmRNA領域を挟むことのできる2個1組のプライマーセットを作成する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長cDNA又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするmRNAを含む総RNAを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したmRNAを精製する。mRNAの精製は常法に従えばよく、例えば、mRNAをオリゴ(dT)セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりmRNAを更に分画することもできる。また、mRNAを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのmRNAを用いることもできる。
次に、精製されたmRNAを、例えば、ランダムプライマー、オリゴdTプライマー、及び/又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第1鎖cDNAを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第1鎖cDNAを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ2種類のプライマーを用いてPCRを実施し、目的とするcDNAを増幅することができる。得られたDNAをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記DNAを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするDNA断片を得ることもできる。また、ゲノムDNAから目的とするDNA断片を得ることもできる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、WO01/34785の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法b)第2製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法c)第3製造法、d)第4製造法に記載された方法によって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。より具体的には、化学合成法によって製造したヌクレオチド断片を結合することによっても製造できる。また、各ポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)は、DNA合成機(例えば、Oligo 1000M DNA Synthesizer(Beckman社)、あるいは、394 DNA/RNA Synthesizer(Applied Biosystems社)など)を用いて合成することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるDNAの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法(Maxam,A.M.及びGilbert,W.,“Methods in Enzymology”,65,499−559,1980)やジデオキシヌクレオチド鎖終結法(Messing,J.及びVieira,J.,Gene,19,269−276,1982)等により行なうことができる。
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターDNAに再び組込むことにより、宿主細胞(好ましくは真核生物)を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
スクリーニング用細胞の製造に用いることのできる、宿主細胞及び発現ベクターとしては、例えば、遺伝子工学において一般的に使用可能な公知の宿主細胞及び発現ベクターを用いることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるCOS細胞(Gluzman,Y.,Cell,23,175−182,1981)、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO)のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株であるCHO dhfr−細胞(Urlaub,G.及びChasin,L.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216−4220,1980)、ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞、及び前記HEK293細胞にエプスタイン・バーウイルスのEBNA−1遺伝子を導入した293−EBNA細胞(インビトロジェン社)等を挙げることができる。
宿主細胞としてCHO細胞を用いる場合には、LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、G418耐性マーカーとして機能するneo遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、pRSVneo(Sambrook,J.ら,“Molecular Cloning−A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1989)又はpSV2−neo(Southern,P.J.及びBerg,P.,J.Mol.Appl.Genet.,1,327−341,1982)等をコ・トランスフェクトし、G418耐性のコロニーを選択することにより、LTRPC2タンパク質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr(Subramani,S.ら,Mol.Cell.Biol.,1,854−864,1981)、ヒトの延長因子プロモーターを有するpEF−BOS(Mizushima,S.及びNagata,S.,Nucleic Acids Res.,18,5322,1990)、サイトメガロウイルスプロモーターを有するpCEP4(インビトロジェン社)又はpcDNA3.1(+)(インビトロジェン社)等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、DEAE−デキストラン法(Luthman,H.及びMagnusson,G.,Nucleic Acids Res.,11,1295−1308,1983)、リン酸カルシウム−DNA共沈殿法(Graham,F.L.及びvan der Ed,A.J.,Virology,52,456−457,1973)、市販のトランスフェクション試薬(例えば、FuGENETM6 Transfection Reagent;Roche Diagnostics社)を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法(Neumann,E.ら,EMBO J.,1,841−845,1982)等により、細胞に取り込ませることができる。
LTRPC2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞表面にLTRPC2タンパク質が生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、CHO細胞の場合には、例えば、ダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清(FBS)等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、293細胞の場合には、牛胎仔血清(EBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地にG418を加えた培地を使用することができる。
[4]細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法
本発明の細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法は、(1)LTRPC2タンパク質を発現している細胞に、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程と、(2)LTRPC2タンパク質の活性化の阻害を分析する工程とを含む。
本発明のスクリーニング方法では、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下において、スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる。LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下としては、例えば、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下を挙げることができる。前記LTRPC2タンパク質活性化剤としては、例えば、ADPリボース若しくはNAD、又はPARP活性化剤(例えば、MNNG又はH2O2)を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法では、特に限定されるものでないが、例えば、LTRPC2タンパク質の活性化の後に、試験物質と接触させることもでき、あるいは、LTRPC2タンパク質の活性化と同時に、試験物質と接触させることもできる。前者の場合には、試験物質がLTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であれば、LTRPC2タンパク質の活性化が阻害され、逆に、試験物質がLTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質でなければ、LTRPC2タンパク質の活性化が維持される。一方、後者の場合には、試験物質がLTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であれば、LTRPC2タンパク質の活性化が起こらないか、あるいは、減弱される。逆に、試験物質がLTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質でなければ、LTRPC2タンパク質の活性化が起こる。
本発明のスクリーニング方法を用いると、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質(すなわち、アンタゴニスト)をスクリーニングすることができる。本発明者が今回初めて見出したように、LTRPC2タンパク質の活性化は、PARPの活性化によって制御されている。また、PARPの活性化により細胞死が引き起こされることが、既に公知である。従って、PARPの活性化により、LTRPC2タンパク質の活性化が引き起こされ、その結果、更に、細胞死が引き起こされることが、本発明者により今回初めて明らかになった。従って、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質は、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制することができ、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患の治療及び/又は予防剤の有効成分として有用である。
より具体的には、本発明のスクリーニング方法は、LTRPC2タンパク質の活性化を分析するのに用いる方法の違いに基づいて、例えば、
(a)パッチクランプ(patch−clamp)法を利用したスクリーニング方法、
(b)放射性同位元素イオンの流入又は放出を利用したスクリーニング方法、
(c)Rb+イオンの放出を利用したスクリーニング方法、又は
(d)細胞内Ca2+検出色素を利用したスクリーニング方法
などを挙げることができる。
前記(a)のパッチクランプ法を利用して、細胞死抑制剤として有用な、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする場合には、例えば、ホールセルパッチクランプ(whole−cell patch−clamp)法(Hille,B.,“Ionic Channels of Excitable Membranes”,2nd Ed.,1992,Sinauer AssociatesInc.,MA)を用いて、スクリーニング用細胞における全細胞電流を測定することにより、LTRPC2タンパク質の活性化が阻害されるか否かを分析することができる。すなわち、パッチクランプ法を利用する本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞をホールセルパッチクランプ法により膜電位固定し、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞における全細胞電流の変化を分析する工程を含む。
より具体的には、スクリーニング用細胞をホールセルパッチクランプ法により膜電位固定し、LTRPC2タンパク質を活性化する化合物(例えば、ADPリボース、NAD、H2O2、又はMNNG)を添加して、スクリーニング用細胞の全細胞電流を測定する。この場合、細胞外液としては、145mmol/L−NaCl、5mmol/L−KCl、2mmol/L−CaCl2、2mmol/L−MgCl2、及び10mmol/L−HEPES−Na(pH7.4)を含む溶液を使用し、細胞内液としては、150mmol/L−CsCl、5mmol/L−MgCl2、及び10mmol/L−HEPES−Cs(pH7.2)を含む溶液などを用いることができる。続いて、細胞外液又は細胞内液に試験物質を添加した場合の電流変化を測定することで、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。例えば、試験物質を添加した場合に、スクリーニング用細胞にLTRPC2タンパク質の活性化刺激の際に生じる全細胞電流の変化がなくなるか、あるいは、減弱されれば、前記試験物質は、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であると判定することができる。
前記(b)の放射性同位元素イオンの放出を利用して、細胞死抑制剤として有用な、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする場合には、例えば、Ca2+、Na+、又はK+イオンの各放射性同位元素を指標としてそのチャネル活性を測定することができる(Sidney P.Colowick及びNathan O.Kaplan,“Methods in ENZYMOLOGY”,88(1),1982,Academic Press社,346−347)。この分析方法は、LTRPC2タンパク質がCa2+、Na+、又はK+イオンを透過させる(Sano,Y.ら,Science,293,1327−1330,2001)との公知の知見に基づくものである。
放射性同位元素イオンの放出を利用する本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞に、放射性同位元素を取り込ませた後、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞の細胞外へ放出される放射活性、あるいは、細胞内に残存する放射活性の量を分析する工程を含む。
具体的には、各イオンの放射性同位元素である45Ca2+、22Na+、又は42K+を用いて測定することができる。K+を用いる場合には、K+を予め細胞に取り込ませた後、細胞外液に残ったK+を取り除く。その後、LTRPC2タンパク質活性化剤を用いてLTRPC2タンパク質を活性化させると、放射性同位体元素K+が透過することから、細胞外液中の放射活性(すなわち、細胞外へ放出された放射活性)、あるいは、細胞内に残存した放射活性をチャネル活性の指標とすることができる。45Ca2+又は22Na+を用いる場合には、45Ca2+又は22Na+を反応液中に入れておいた状態で、LTRPC2タンパク質活性化剤を用いてLTRPC2タンパク質を活性化させると、放射性同位体元素が透過することから、細胞外液中の放射活性(すなわち、細胞外液に残存した放射活性)、あるいは、細胞内に流入した放射性同位元素の放射活性をチャネル活性の指標とすることができる(黒木登志夫、許南浩、及び千田和広編、実験医学別冊「分子生物学研究のための培養細胞実験法」、1995年、羊土社;以下、文献1と称する)。この際、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下において、試験物質を添加して、細胞外液中の放射活性(すなわち、細胞外へ放出された放射活性)、あるいは、細胞内に残存した放射活性を測定することで、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、次に説明する「(c)Rb+イオンの放出を利用したスクリーニング方法」に準じて実施することができる。
一般的に、K+イオンを透過するイオンチャネルは、K+イオンと同様に、Rb+イオンを通すことができるので、放射性同位元素86Rb+の放出を指標としてそのチャネル活性を測定することができる(Sidney P.Colowick及びNathan O.Kaplan,“Methods in ENZYMOLOGY”,88(1),1982,Academic Press社,346−347;以下、文献2と称する)。
前記(c)のRb+イオンの放出を利用して、細胞死抑制剤として有用な、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞に放射性同位元素86Rb+イオンを取り込ませた後、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞の細胞外へ放出される86Rb+の放射活性、あるいは、細胞内に残存する86Rb+の放射活性の量を分析する工程を含む。
Rb+イオンの放出を利用する本発明のスクリーニング方法では、スクリーニング用細胞を、86RbClとインキュベート(例えば、37℃にて24時間)することにより、86Rb+を前記細胞内に取り込ませることができる(文献1)。細胞を通常の生理食塩水で洗浄し、取り込まれなかった86Rb+を取り除く。LTRPC2タンパク質が活性化すると、細胞外への86Rb+放出量が増加するので、細胞外液中の86Rb+の放射活性、あるいは、細胞内に残存した86Rb+の放射活性をチャネル活性の指標とすることができる。
より具体的には、例えば、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下で、試験物質を含有する溶液(例えば、生理食塩水)中で、予め86Rb+を取り込ませたスクリーニング用細胞をインキュベート(例えば、37℃にて30分間)した後、細胞外液中の86Rb+の放射活性、あるいは、細胞内に残存した86Rb+の放射活性を測定する。この際、ネガティブコントロールとして、LTRPC2タンパク質活性化剤の不在下で、試験物質不含溶液中で、同様の操作を実施し、ポジティブコントロールとして、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下で、試験物質不含溶液中で、同様の操作を実施することが好ましい。前記ネガティブコントロールでは、LTRPC2タンパク質が活性化されないため、86Rb+が細胞外へ放出されないのに対して、前記ポジティブコントロールでは、LTRPC2タンパク質が活性化されるため、86Rb+が細胞外へ放出される。LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下において試験物質を添加した場合に、(1)前記ネガティブコントロールの場合と同様に、86Rb+の細胞外への放出が観察されないか、あるいは、(2)前記ポジティブコントロールに比べて、86Rb+の細胞外への放出量が減少すれば、前記試験物質は、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であると判定することができる。本発明による、Rb+イオンの放出を利用したスクリーニング方法は、後述の実施例7に記載の条件で実施することが好ましい。
前記(d)の細胞内Ca2+検出色素を利用して、細胞死抑制剤として有用な、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質をスクリーニングする場合には、細胞内Ca2+検出色素として、例えば、Fluo3−AMなどを用いることができる。細胞内Ca2+検出色素は、LTRPC2タンパク質の開口に伴う細胞内Ca2+濃度の変化を光学的に検出することが可能である(工藤佳久編、実験医学別冊「細胞内カルシウム実験プロトコール」、1996年、羊土社)。これらの色素を用いることによってLTRPC2タンパク質の活性を測定することができ、LTRPC2タンパク質活性化時の試験物質存在下と不在下とで変化量を比較することにより、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する化合物をスクリーニングすることが可能である。細胞内Ca2+検出色素を利用する本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、例えば、スクリーニング用細胞に細胞内Ca2+検出色素を取り込ませた後、LTRPC2タンパク質を活性化させることのできる条件下で、前記スクリーニング用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記スクリーニング用細胞における細胞内Ca2+検出色素の量変化を光学的に分析する工程を含む。
より具体的には、LTRPC2タンパク質活性化剤の存在下において、試験物質を添加した場合に、試験物質不在下の場合と比較して、細胞内に流入するCa2+量が減少するか、あるいは、なくなれば、前記試験物質は、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質であると判定することができる。
本発明のスクリーニング方法によって選択対象とする試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物(ペプチドを含む)、コンビナトリアル・ケミストリー技術(Terrett,N.K.ら,Tetrahedron,51,8135−8137,1995)によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法(Felici,F.ら,J.Mol.Biol.,222,301−310,1991)などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物、植物、海洋生物、又は動物由来の天然成分(例えば、培養上清又は組織抽出物)などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物(ペプチドを含む)を、化学的又は生物学的に修飾した化合物(ペプチドを含む)を用いることができる。
[5]細胞死抑制用医薬組成物の製造方法
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、細胞死抑制用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び/又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、1又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(例えば、オリーブ油)、アルコール類(例えば、エタノール)、又はポリソルベート80等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち、LTRPC2タンパク質の活性化を阻害する物質、あるいは、本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人(体重60kgとして)において、1日につき約0.1〜100mg、好ましくは0.1〜50mgである。非経口投与の場合、注射剤の形では、1日につき0.01〜50mg、好ましくは0.01〜10mgである。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、遺伝子工学的操作及びチャネル活性分析操作については、公知の方法(Maniatis,T.ら,“Molecular Cloning−A Laboratory Manual”,1982,Cold Spring Harbor Laboratory,NY;Hille,B.,“Ionic Channels of Excitable Membranes”,2nd Ed.,1992,Sinauer Associates Inc.,MA)に従って実施可能である。
本実施例のクローニングにおいては、逆転写反応用キットはインビトロジェン社のSUPERSCRIPT First−Strand Synthesis System for RT−PCRを、クローニングキットはインビトロジェン社のTOPO XL PCR Cloning Kitを用いた。
【実施例1】
《ヒトLTRPC2タンパク質をコードする遺伝子の単離及び発現ベクターの構築》
配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるヒトLTRPC2タンパク質(以下の各実施例において、単に「ヒトLTRPC2タンパク質」と称する)をコードする全長cDNAは、ヒト白血球由来のmRNAを鋳型とする逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により取得した。まず、ヒト白血球mRNA(10ng)を、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを合成した。この第一鎖cDNAを鋳型とし、Taq DNAポリメラーゼ(LA Taq DNA polymerase;宝酒造)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。前記PCRは、センスプライマーとして配列番号5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号6で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に98℃(1分間)で熱変性を行なった後、98℃(15秒間)/65℃(30秒間)/72℃(6分間)からなるサイクルを35回繰り返した。その結果、約4.7kbpのDNA断片が増幅された。
このDNA断片を、クローニングキットを用いて、pCR−TOPOベクターにクローニングを行なった。得られたプラスミドDNAを制限酵素EcoRIで消化して、LTRPC2−cDNAのみを単離した後、pcDNA3.1(+)プラスミド(インビトロジェン社)を用いてクローニングした。pcDNA3.1(+)プラスミドは、サイトメガロウイルス由来のプロモーター配列を持っており、動物細胞でLTRPC2タンパク質を発現させるために使用することができる。得られたクローンpcDNA3.1−LTRPC2の塩基配列を、ジデオキシターミネーター(dideoxy terminator)法により、DNAシークエンサー(ABI3700 DNA Sequencer;アプライドバイオシステムズ社)を用いて解析したところ、配列番号1で表される配列が得られた。
【実施例2】
《ヒトLTRPC2遺伝子の発現分布》
ヒト組織及びヒト血液におけるヒトLTRPC2遺伝子の発現分布をRT−PCR法により解析した。ヒト組織については、ヒトの各組織由来のmRNA(クロンテック社)5ngをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キット(Advantage RT−for−PCR Kit;クロンテック社)を用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、Taq DNAポリメラーゼ(LA Taq DNA polymerase;宝酒造社)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。
ヒト血液は、1名の匿名社内ボランティア(健常人)より、血液凝固を防ぐためにヘパリン・ナトリウムを添加したシリンジを用いて、100ml採取した。その血液をFicoll−Paque試薬(アマシャムファルマシア社)を用いて、好酸球、好中球、リンパ球、血小板に分画した後、それぞれからISOGEN試薬(ニッポンジーン社)を用いて、総RNAを抽出した。なお、実際の操作は、Ficoll−Paque試薬、及びISOGEN試薬に添付のプロトコールに従って行った。それぞれの総RNA20ngをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、Taq DNAポリメラーゼ(LA Taq DNA polymerase;宝酒造)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。
前記PCRは、センスプライマーとして配列番号7で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に98℃(1分間)で熱変性を行なった後、98℃(15秒間)/70℃(1分間)からなるサイクルを30回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号1で表される塩基配列における第22番目〜第4533番目の塩基からなる配列からなるヒトLTRPC2遺伝子に特異的な配列である。
ヒトの各組織(扁桃体、尾状核、海馬、脳梁、黒質、視床、小脳、前頭葉、視床下部、脊髄、下垂体、全脳、心臓、胎盤、肺、気管、肝臓、骨格筋、腎臓、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、甲状腺、唾液腺、副腎、乳腺、及び前立腺)についてRT−PCR解析を行なったところ、約660bpのDNA断片が、脳、脊髄、心臓、胎盤、肺、気管、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、及び白血球にて増幅された。このことから、ヒトLTRPC2のmRNAが、PARP活性化に伴う細胞死が原因となる疾患が報告されている組織で発現していることが明らかになった。
また、ヒト血液についてのRT−PCR解析を行ったところ、約660bpのDNA断片が主にリンパ球にて増幅された。このことから、ヒトLTRPC2は、ヒト血液において主にリンパ球にて発現していることが明らかになった。リンパ球は免疫機能を担っていることが明らかになっていることから、LTRPC2遺伝子が免疫機能において重要な役割を担っている事が示唆された。
【実施例3】
《ラットLTRPC2タンパク質をコードする遺伝子の単離》
配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるラットLTRPC2タンパク質(以下の各実施例において、単に「ラットLTRPC2タンパク質」と称する)をコードする全長cDNAは、ラット脳由来のmRNA(クロンテック社)10ngを鋳型とするRT−PCRにより実施例1と同様の手法で取得した。PCRは、センスプライマーとして配列番号9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号10で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に98℃(1分間)で熱変性を行なった後、98℃(15秒間)/60℃(30秒間)/72℃(5分間)からなるサイクルを35回繰り返した。その結果、約4.7kbpのDNA断片が増幅された。このDNA断片を、pCR−TOPOベクターにクローニングして得られたクローンpCR−TOPO−ratLTRPC2の塩基配列を解析したところ、配列番号3で表される配列が得られた。配列番号3で表される塩基配列は、4527塩基対からなるオープンリーディングフレーム(配列番号3で表される塩基配列における第84番〜第4610番の塩基からなる配列)を有する。前記オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、1508アミノ酸残基からなる配列番号4で表されるアミノ酸配列であった。
配列番号4で表されるアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアミノ酸配列(ヒトLTRPC2タンパク質)と84%のホモロジーを有する。なお、前記ホモロジーの数値は、前記BLAST検索により得られた値である。
【実施例4】
《ラットLTRPC2遺伝子の発現分布》
ラット組織におけるラットLTRPC2遺伝子の発現分布をRT−PCR法により解析した。ラットの各組織由来のmRNA(クロンテック社)5ngをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、Taq DNAポリメラーゼ(Platinum Taq DNA polymerase;インビトロジェン社)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。前記PCRは、センスプライマーとして配列番号11で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号12で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に95℃(1分間)で熱変性を行なった後、95℃(15秒間)/62℃(30秒間)/72℃(1分間)からなるサイクルを35回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号3で表される塩基配列における第84番目〜第4610番目の塩基からなる配列からなるラットLTRPC2遺伝子に特異的な配列である。
ラットの各組織(脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、網膜、骨格筋、脾臓、及び精巣)についてRT−PCR解析を行なったところ、約380bpのDNA断片が全ての組織にて増幅され、ラットLTRPC2のmRNAは、前記の各組織で発現していることが明らかになった。また、この結果から、PARP活性化に伴う細胞死が原因となる疾患が報告されている組織で、ラットLTRPC2のmRNAが発現していることが明らかになった。
【実施例5】
《ヒトLTRPC2タンパク質の動物細胞での発現》
ヒトLTRPC2タンパク質のチャネル活性を検出するために、動物細胞に前記タンパク質の発現を誘導した。実施例1で得られた発現ベクターpcDNA3.1−LTRPC2と、形質転換用試薬(LIPOFECTAMINE2000;インビトロジェン社)とを用いて、チャイニーズ・ハムスター卵巣由来のCHO dhfr−細胞の形質転換を行ない、ヒトLTRPC2タンパク質の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法(文献1)に従って実施した。
【実施例6】
《PARP活性化剤によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化検出》
以下で具体的に記載した操作以外は、公知の方法(文献1、文献2)に従って実施した。
実施例5で得られた形質転換細胞(1.6×105細胞)を、86RbCl(1μCi/mL)存在下、37℃で24時間インキュベートすることにより、86Rb+を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかった86Rb+を取り除いた。得られた細胞を、PARP活性化剤であるMNNG(最終濃度=1mmol/L)又はH2O2(最終濃度=0.06%)を添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、通常の生理食塩水(すなわち、MNNG又はH2O2のいずれも添加しない生理食塩水)中にて、同様の操作を実施した。
各細胞を生理食塩水で洗浄した後、細胞に残った86Rb+の放射活性を測定した。その結果、86Rb+の残存活性は、コントロールの細胞(MNNG又はH2O2を添加していない細胞)と比較して、MNNGを添加した細胞では35.6%に、H2O2を添加した細胞では8.9%に、それぞれ減少していた。これは、MNNG又はH2O2によりヒトLTRTPC2タンパク質が活性化し、細胞内の86Rb+が細胞外へ排出されたことを示している。この結果から、ヒトLTRPC2タンパク質は、PARP活性化剤であるMNNG又はH2O2で活性化することが明らかになった。
【実施例7】
《PARP活性阻害剤によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害》
以下で具体的に記載した操作以外は、公知の方法(文献1、文献2)に従って実施した。
実施例5で得られた形質転換細胞(1.6×105細胞)を、86RbCl(1μCi/mL)存在下、37℃で24時間インキュベートすることにより、86Rb+を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかった86Rb+を取り除いた。得られた細胞に対して、MNNG(最終濃度=1mmol/L)又はH2O2(最終濃度=0.06%)存在下で、PARP活性化阻害剤であるDPQ(最終濃度=100μmol/L)、3−アミノベンズアミド(最終濃度=1mmol/L)、又はニコチンアミド(最終濃度=1mmol/L)をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、MNNG及びH2O2不在下で、生理食塩水(すなわち、DPQ、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドのいずれも添加しない生理食塩水)中にて、同様の操作を実施した。
各細胞を生理食塩水で洗浄した後、細胞に残った86Rb+の放射活性を測定した。その結果、PARP活性化阻害剤を添加した各細胞における86Rb+の残存活性は、コントロールの細胞(MNNG又はH2O2を添加していない細胞)、すなわち、ヒトLTRPC2タンパク質の活性を誘導していない細胞と同等であった。より具体的には、DPQを添加した細胞では、コントロール細胞に対して、93.4%(H2O2存在下の場合)又は95.5%(MNNG存在下の場合)の86Rb+残存活性を示した。同様に、3−アミノベンズアミドを添加した細胞では、91.9%(H2O2存在下の場合)又は96.2%(MNNG存在下の場合)の86Rb+残存活性を示し、ニコチンアミドを添加した細胞では、57.8%(H2O2存在下の場合)又は95.9%(MNNG存在下の場合)の86Rb+残存活性を示した。
これは、DPQ、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドによってヒトLTRPC2タンパク質の活性化が阻害され、細胞内の86Rb+が細胞外へ排出されなかったか、あるいは、排出が減少したことを示している。この結果から、MNNG又はH2O2によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化は、PARP活性化阻害剤であるDPQ、3−アミノベンズアミド、又はニコチンアミドによって阻害されることが明らかになった。
【実施例8】
《PARP活性阻害剤によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害とPARP活性化阻害との比較》
実施例7で示したPARP阻害剤によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害がPARPを介していることを確認するために、ヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害のIC50値とPARP活性化阻害のIC50値を比較、検討した。
前述のPARP活性化阻害剤であるDPQ、3−アミノベンズアミド、ニコチンアミドのLTRPC2の活性化阻害のIC50値を各濃度の阻害剤を添加することにより実施例7の方法で検討した。その結果、DPQ、3−アミノベンズアミド、ニコチンアミドのヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害のIC50値はそれぞれ、0.20μM、117μM、541μMであった。
PARP活性化阻害のIC50値は次の方法で検討した。実施例5で得られた形質転換細胞を、PARP活性化剤であるMNNG(最終濃度=1mmol/L)又はH2O2(最終濃度=0.06%)、及び前述で用いた各濃度のPARP阻害剤をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、通常の生理食塩水(すなわち、MNNG又はH2O2のいずれも添加しない生理食塩水)中にて、同様の操作を実施した。その後、活性剤、及び阻害剤を添加した生理食塩水を除いた細胞に3H−NADを最終濃度0.2nCi/μLになるように加え、37度で40分間インキュベートした。その後、この細胞にTCAを最終濃度10%になるように加えて4度で30分間インキュベートすることで反応を停止させた。その後、細胞を5%TCAで2回洗浄することで、取り込まれなかった3H−NADを除いた。洗浄した細胞を、2%SDS、0.1M−NaOHを含む溶液で溶解した後、細胞に含まれる3Hの放射活性を測定した。その結果、DPQ、3−アミノベンズアミド、ニコチンアミドのPARP活性化阻害のIC50値は、それぞれ0.26μM、71.7μM、335μMであった。
それぞれのIC50値は、LTRPC2活性化阻害、及びPARP活性化阻害で近似していることから、LTRPC2活性化阻害はPARP活性化阻害によるものであることが確認された。
【実施例9】
《ヒトLTRPC2タンパク質の動物細胞での発現》
ヒトLTRPC2タンパク質の細胞での機能を明らかにするために、動物細胞に前記タンパク質の発現を誘導した。実施例1で得られた発現ベクターpcDNA3.1−LTRPC2と、形質転換用試薬(LIPOFECTAMINE2000;インビトロジェン社)とを用いて、ヒト胎児腎臓由来のHEK293細胞の形質転換を行ない、ヒトLTRPC2タンパク質の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法(文献1)に従って、実施した。
【実施例10】
《ヒトLTRPC2タンパク質による細胞死誘導》
実施例8で得られた形質転換細胞を96穴プレート(旭テクノグラス社)に4×104細胞/ウェルになるように蒔き一晩培養した後、、最終濃度0.001%H2O2を含む細胞培地で室温、2時間インキュベートした。生理食塩水で洗浄した後、細胞培地を添加し4時間培養した。培地を除いた後、細胞の生死を判定するためにアラマブルーアッセイ(alamaBlue Assay;バイオサイエンス社)を行った。本操作は、細胞における酸化還元反応によって蛍光を発する試薬を加え、その結果生じる蛍光強度を測定することによって、細胞の生死を判断することができる。なお、実験操作は、前記アラマブルーアッセイ用試薬に添付のプロトコールに従って実施した。刺激を加えた細胞にアラマブルーアッセイ用試薬を加え、さらに1時間インキュベーションした後、蛍光強度を測定した。なお、コントロールとして、LTRPC2を含まないpcDNA3.1ベクターのみを形質転換した細胞を用いて、同様の操作を実施した。その結果、LTRPC2を発現させた細胞はベクターのみを発現させた細胞に比較して、有意に蛍光強度が減少していた(47.5%の減少)。これは、H2O2刺激によってLTRPC2を介して細胞死が起き、その結果、生きている細胞が減少したことを示している。この結果から、ヒトLTRPC2タンパク質は、H2O2刺激による細胞死を促進することが確認できた。また、前記の結果よりLTRPC2はH2O2刺激によって活性化することが明らかになっているので、本実施例の結果からもLTRPC2タンパク質は細胞死を引き起こす機能を有していることが明らかである。
【実施例11】
《マウスLTRPC2タンパク質をコードする遺伝子の単離》
配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるマウスLTRPC2タンパク質(以下の各実施例において、単に「マウスLTRPC2タンパク質」と称する)をコードする全長cDNAは、マウス脳由来のmRNA(クロンテック社)10ngを鋳型とするRT−PCRにより実施例1及び実施例2と同様の手法で取得した。PCRは、センスプライマーとして配列番号15で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号16で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、PCRサイクルは実施例2と同様の条件で行った。その結果、約4.7kbpのDNA断片が増幅された。このDNA断片をpCR−TOPOベクターにクローニングして得られたクローンpCR−TOPO−mouseLTRPC2の塩基配列を解析したところ、配列番号13で表される配列が得られた。配列番号13で表される塩基配列は、4524塩基対からなるオープンリーディングフレーム(配列番号13で表される塩基配列における第36番〜第4559番の塩基からなる配列)を有する。前記オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、1507アミノ酸残基からなる配列番号14で表されるアミノ酸配列であった。配列番号14で表されるアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアミノ酸配列(ヒトLTRPC2タンパク質)、及び配列番号4で表されるアミノ酸配列(ラットLTRPC2タンパク質)とそれぞれ84%、94%のホモロジーを有する。なお、前記ホモロジーの数値は、前記BLAST検索により得られた値である。
【実施例12】
《マウスLTRPC2遺伝子の慢性関節リウマチモデル動物における発現解析》
慢性関節リウマチにおけるLTRPC2遺伝子の発現解析を行うために、慢性関節リウマチのモデルであるマウスコラーゲン誘発関節炎モデルを作製し、このマウスでのマウスLTRPC2遺伝子の発現変動を解析した。
マウスコラーゲン誘発関節炎モデルの作製は以下の方法で行った。マウス関節部分に150μgのタイプ2コラーゲンを注射し3週間飼育した後、再度同量のコラーゲンの注射を行った。その後、5週間飼育を行った後、解剖して関節部分を取り出した。この時、取り出したマウス関節は慢性関節リウマチ患者と同様の損傷(軟骨、骨破壊)がおきていることを確認した。このマウス関節を凍結粉砕後、ISOGEN試薬(ニッポンジーン社)を用いて、mRNAを抽出した。なお、コントロールとして、処理を行っていない正常マウスの関節からも同様にmRNAを抽出した。
得られたマウスコラーゲン誘発関節炎モデルの関節におけるマウスLTRPC2遺伝子の発現変動を解析するために、PRISM7900(アプライドバイオシステムズ社)を用いたリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRを行うことで、mRNA中に含まれるマウスLTRPC2遺伝子を定量化して測定することができる。
得られたmRNAをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、蛍光試薬SYBR Green PCR Core Reagents Kit(アプライドバイオシステムズ社)を用いて、PCRを行なった。前記PCRは、センスプライマーとして配列番号17で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号18で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に95℃(10分間)で熱変性を行なった後、95℃(15秒間)/59℃(1分間)からなるサイクルを45回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号13で表される塩基配列における第3763番目〜第3780番目、及び第3813番目〜第3830番目の塩基配列からなるマウスLTRPC2遺伝子に特異的な配列である。
その結果、マウスLTRPC2遺伝子はコラーゲン誘発関節炎モデルマウスにおいて、処理を行っていない正常マウスと比較して、発現量が約15倍増加していた。このことから、マウスLTRPC2遺伝子は、慢性関節リウマチにおいて重要な働きを担っていることが明らかになった。
【実施例13】
《マウスLTRPC2遺伝子の発現分布》
マウス組織におけるマウスLTRPC2遺伝子の発現分布を、実施例12と同様の方法で、PRISM7900(アプライドバイオシステムズ)を用いたリアルタイムPCRにより解析した。マウスの各組織(脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、平滑筋、脾臓、及び精巣)由来のmRNA(クロンテック社)5ngをDNアーゼ処理を行なった後、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを得た。この第一鎖cDNAを鋳型として、PCRを行なった。その結果、脳、脾臓を中心に全ての組織にて増幅が検出された。このことから、マウスLTRPC2のmRNAは、前記の各組織で発現していることが明らかになった。また、この結果から、PARP活性化に伴う細胞死が原因となる疾患が報告されている組織で、マウスLTRPC2のmRNAが発現していることが明らかになった。
【実施例14】
《PARP−1ドミナントネガティブ変異体をコードする遺伝子の単離及び発現ベクターの構築》
ヒトPARP−1全長アミノ酸配列(Genebankアクセッション番号:XP_037273)の第1番目〜第374番目はDNA結合部位であり、このDNA結合部分のみを野生型PARP−1と共発現すると、DNAへの結合を競合することが知られている。その結果、野生型PARP−1のDNAへの結合の割合が減少することで、活性化したPARP−1のDNAへのポリADPリボース化の阻害、および細胞死の誘導が阻害されることが知られている(ドミナントネガティブ効果)。従って、PARP−1のDNA結合部位のみは、PARP−1に対してドミナントネガティブ効果を示すドミナントネガティブ変異体タンパク質として機能することが明らかなっている。(Kupper,J.H.,de,Murcia,G.及びBurkle,A.,J.Biol.Chem.,265,18721−18724,1990)。
上記部位、すなわち、配列番号20で表されるアミノ酸配列からなるヒトPARP−1ドミナントネガティブ変異体タンパク質(以下の各実施例において、単に「PARP−1ドミナントネガティブ変異体」と称する)をコードする全長cDNAは、ヒト脾臓由来のmRNAを鋳型とするRT−PCRにより取得した。まず、ヒト脾臓mRNA(10ng)を、逆転写反応用キットを用いて逆転写させ、第一鎖cDNAを合成した。この第一鎖cDNAを鋳型とし、Taq DNAポリメラーゼ(LA Taq DNA polymerase;宝酒造)を用いて、ホットスタート法によるPCRを行なった。前記PCRは、センスプライマーとして配列番号21で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号22で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に98℃(1分間)で熱変性を行なった後、98℃(15秒間)/65℃(30秒間)/72℃(6分間)からなるサイクルを35回繰り返した。その結果、約1.2kbpのDNA断片が増幅された。このDNA断片を、クローニングキットを用いて、pCR−TOPOベクターにクローニングを行なった。得られたプラスミドDNAを制限酵素EcoRIで消化して、インサート(PARP−1ドミナントネガティブ変異体をコードするcDNA)のみを単離した後、pcDNA3.1(+)プラスミド(インビトロジェン社)を用いてクローニングした。得られたクローンpcDNA3.1−PARPtの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法により、DNAシークエンサー(ABI3700 DNA Sequencer;アプライドバイオシステムズ社)を用いて解析したところ、配列番号19で表される配列が得られた。配列番号19で表される塩基配列は、PARP−1ドミナントネガティブ変異体をコードしていた。
【実施例15】
《PARP−1ドミナントネガティブ変異体によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化阻害》
ヒトLTRPC2タンパク質のチャネル活性へのPARP−1ドミナントネガティブ変異体の影響を検討するために、動物細胞に前記タンパク質の発現を誘導した。実施例1、及び実施例14で得られた発現ベクターpcDNA3.1−LTRPC2及びpcDNA3.1−PARPtと、形質転換用試薬(LIPOFECTAMINE2000;インビトロジェン社)とを用いて、チャイニーズ・ハムスター卵巣由来のCHO dhfr−細胞の形質転換を行ない、ヒトLTRPC2タンパク質及びPARP−1ドミナントネガティブ変異体の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法(文献1)に従って、実施した。
得られた形質転換細胞(1.6×105細胞)におけるLTRPC2活性化を、Rb+イオンの放出を測定する方法を利用して測定した。方法は実施例6と同様に行った。ただし、PARP活性化剤としてはH2O2(最終濃度=0.06%)を用い、コントロールとして、実施例5で得られたLTRPC2タンパク質のみを発現させた細胞を用いた。
測定の結果、PARP−1ドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞における86Rb+の残存活性は、コントロールの細胞(PARP−1ドミナントネガティブ変異体を発現させていない細胞)と比較して有意に上昇していた。
これは、PARP−1ドミナントネガティブ変異体によってPARP活性が阻害されて、その結果、ヒトLTRPC2タンパク質の活性化が阻害され、細胞内の86Rb+の細胞外への排出が減少したことを示している。
また、この時のPARPの活性化を実施例8の手法を用いて検討した。ただし、PARP活性化剤としてはH2O2(最終濃度=0.06%)を用い、コントロールとして、実施例5で得られたLTRPC2タンパク質のみを発現させた細胞を用いた。測定の結果、PARP−1ドミナントネガティブ変異体を発現させた細胞における3Hの放射活性は、コントロールの細胞と比較して、67%に減少していた。
これらの結果から、H2O2によるヒトLTRPC2タンパク質の活性化は、PARP−1ドミナントネガティブ変異体によって阻害されることが明らかになった。PARP阻害化合物を用いた結果(実施例7)に加え、PARP−1ドミナントネガティブ変異体を用いた結果(本実施例)からも、PARP活性が減少することによりLTRPC2活性化が阻害され、LTRPC2はPARPによって活性が制御されていることが確認された。
【実施例16】
《ヒトLTRPC2タンパク質活性阻害剤のスクリーニング》
ヒトLTRPC2タンパク質のイオンチャネル活性を阻害する化合物のスクリーニングを行なった。
実施例5で得られた形質転換細胞を(1.6×105細胞)を、86RbCl(1μCi/mL)存在下、37℃で24時間インキュベートすることにより、86Rb+を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかった86Rb+を取り除いた。得られた細胞に対して、H2O2(最終濃度=0.06%)存在下で、さまざまな化合物(最終濃度=10μmol/L)をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、化合物を添加しないH2O2存在下で、同様の操作を実施した。
各細胞を生理食塩水で洗浄した後、細胞に残った86Rb+の放射活性を測定した。得られた放射活性がコントロールの細胞(H2O2のみを添加した細胞)の放射活性と比較して、有意に高い残存活性を示す化合物がヒトLTRPC2タンパク質のチャネル活性を阻害する化合物である。これは、添加した化合物によってヒトLTRPC2タンパク質の活性化が阻害され、細胞内の86Rb+が細胞外へ排出されなかったか、あるいは、排出が減少したことを示している。
上記で見出された化合物は、ヒトLTRPC2タンパク質の活性化に伴う86Rb+の細胞外への排出を指標にしたものであり、直接のヒトLTRPC2タンパク質の阻害活性を検出していない。より具体的には、細胞内に含まれるPARPの阻害活性を示す化合物もヒトLTRPC2タンパク質の活性化を阻害し、その結果86Rb+の細胞外への排出を阻害する。そのため、上記工程で得られた化合物について、更にPARP阻害活性の検討を行なった。
実施例5で得られた形質転換細胞に対して、H2O2(最終濃度=0.06%)存在下で、さまざまな化合物(最終濃度=10μmol/L)をそれぞれ添加した生理食塩水中にて、室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとして、化合物を添加しないH2O2存在下で、同様の操作を実施した。その後、反応液を除去した細胞に3H−NADを最終濃度0.2nCi/microLになるように加え、37度で40分間インキュベートとした。その後、この細胞にTCAを最終濃度10%になるように加えて4度で30分間インキュベートすることで反応を停止させた。その後、細胞を5%TCAで2回洗浄することで、取り込まれなかった3H−NADを除いた。洗浄した細胞を、2%SDS、0.1%NaOHを含む溶液で溶解した後、細胞に含まれる3Hの放射活性を測定した。
その結果、コントロールの細胞(H2O2のみを添加した細胞)の残存放射活性と同程度の残存活性を示す化合物を選択した。これは、添加した化合物が、PARP活性を阻害していないことを示している。
これらの検討の結果、ヒトLTRPC2タンパク質の活性化に伴う86Rb+の細胞外への排出を阻害し、同時に細胞内のPARP活性を阻害しない化合物を選択した。この化合物はヒトLTRPC2タンパク質の活性化を直接阻害していることが考えれる。
次に、見出された化合物がヒトLTRPC2タンパク質を直接阻害していることを確認するために、電気生理の手法を用いて、ヒトLTRPC2タンパク質のイオンチャネル活性への影響を検討した。具体的には、前記実施例5で得られた形質転換細胞を、ホールセル膜電位固定(whole−cell voltage−clamp)法により膜電位固定し、ADP−ribose(最終濃度500μM)を細胞内へ投与したときに生じる全細胞電流を測定した。細胞外液として、145mmol/L−NaCl、5mmol/L−KCl、2mmol/L−CaCl2、2mmol/L−MgCl2、及び10mmol/L−HEPES−Na(pH=7.4)を含む溶液を使用し、細胞内液として、150mmol/L−CsCl、5mmol/L−MgCl2、及び10mmol/L−HEPES−Cs(pH=7.2)を含む溶液を用いた。
この時、上記工程で見出された化合物をADP−ribose投与と同時に、あるいは前処理時から加え、ADP−riboseによって惹起される全電流変化を測定した。この時、全電流変化がADP−ribose単独を加えた時と比較して、減少、あるいは完全に惹起されなくなる化合物を選択する。これは、添加した化合物が直接ヒトLTRPC2タンパク質のチャネル活性を阻害したことを示している。
これらの検討を行なうことで、ヒトLTRPC2タンパク質を直接阻害する化合物を見出すことが可能である。
【実施例17】
《ヒトLTRPC2タンパク質のすい臓細胞での発現とヒトLTRPC2タンパク質による1型糖尿病の細胞死の促進》
ヒトLTRPC2タンパク質のすい臓での機能、及び1型糖尿病モデルにおける細胞死へのヒトLTRPC2タンパク質の関与を検討した。すい臓細胞の1型糖尿病の細胞死は、ストレプトゾトシン刺激による細胞死をモデルとすることができる。さらに、この細胞死の過程には、PARPが関与していることも明らかになっている(Pieper,A.A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,96,3059−3064,1999)。
実施例1で得られた発現ベクターpcDNA3.1−LTRPC2と、形質転換用試薬(LIPOFECTAMINE2000;インビトロジェン社)とを用いて、マウスすい臓ランゲルハンス島ベータ細胞由来のMIN6B細胞の形質転換を行ない、ヒトLTRPC2タンパク質の発現を誘導した。なお、前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法(文献1)に従って、実施した。
得られた形質転換細胞を96穴プレート(旭テクノグラス社)に4×104細胞/ウェルになるように蒔き一晩培養した後、最終濃度1mMストレプトゾトシン(シグマ・アルドリッチ社)を含む細胞培地で室温、越夜でインキュベートした。細胞培地を除いた後、細胞の生死を判定するためにMTTアッセイを行った。本操作は、細胞内のミトコンドリアの呼吸酵素系によってMTTがホルマザンに還元されて青色を呈する反応を利用することによって、細胞の生死を判断することができる。刺激を加えた細胞にMTT試薬(和光純薬)を加え2時間培養した後、培養上清を抜き取った細胞にDMSOを加えてホルマザンを溶解した後、吸光光度計で吸光度を測定した。なお、コントロールとして、LTRPC2を含まないpcDNA3.1ベクターのみを形質転換した細胞を用いて、同様の操作を実施した。その結果、LTRPC2を発現させた細胞はベクターのみを発現させた細胞に比較して、有意に吸光度が減少していた(93%に減少)。これは、ストレプトゾトシン刺激によってLTRPC2を介して細胞死が起き、その結果、生きている細胞が減少したことを示している。この結果から、ヒトLTRPC2タンパク質は、ストレプトゾトシン刺激による細胞死を促進することが確認できた。さらに、ストレプトゾトシン刺激による細胞死は1型糖尿病のモデルであることから、ヒトLTRPC2は1型糖尿病による細胞死を誘導する機能を有していることが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明のスクリーニング方法によれば、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死を抑制する物質、特には、PARPの活性化によって引き起こされる細胞死が関与する疾患(例えば、慢性関節リウマチ、脳虚血時の神経細胞死、心筋梗塞再灌流後の心臓の細胞死、1型糖尿病における膵臓ランゲルハンス島ベーター細胞の自己免疫破壊、ショック後の細胞死、あるいは、免疫細胞死による炎症反応)の治療剤及び/又は予防剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。本発明のLTRPC2、本発明の細胞を用いて、本発明のスクリーニング系を構築することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
Claims (8)
- 配列番号2、配列番号4若しくは配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその機能的等価改変体を発現している細胞に、前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体を活性化させることのできる条件下で、試験物質を接触させる工程、及び
前記ポリペプチド又はその機能的等価改変体の活性化の阻害を分析する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制に有用な物質をスクリーニングする方法。 - 請求の範囲1に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、細胞死抑制用医薬組成物の製造方法。 - (1)配列番号4又は配列番号14で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド、あるいは、(2)配列番号4又は配列番号14で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、LTRPC2タンパク質活性を示すポリペプチド(但し、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)。
- 配列番号4又は配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 請求の範囲3又は4に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求の範囲5に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求の範囲6に記載のベクターを含む細胞。
- 請求の範囲7に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、請求の範囲3又は4に記載のポリペプチドを製造する方法。
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