JP7219256B2 - 薬剤の少なくとも1つのトリスルフィド結合を含むタンパク質中のチオール部分へのコンジュゲーション方法 - Google Patents
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- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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- A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、2014年7月24日出願の米国仮特
許出願第62/028,679号に対する優先権の利益を主張するものである。本開示で
言及される出願及び特許の各々、ならびにそれらの出願及び特許の各々で引用される各文
献または参考文献(各発行された特許の遂行中を含む、「出願引用文献」)、ならびにこ
れらの出願及び特許のうちのいずれかに対応し、かつ/またはその優先権を特許請求する
PCT及び外国出願または特許の各々、及びそれらの出願引用文献の各々で引用または参
照される文献の各々は、参照により明示的に本明細書に組み込まれ、本発明の実施におい
て用いられ得る。より一般的には、文献または参考文献は、特許請求の範囲の前の参考文
献一覧表または本文自体のいずれかにおいて本文で引用され、これらの文献または参考文
献(「本明細書引用文献」)の各々、ならびにこれらの本明細書引用文献の各々で引用さ
れる各文献または参考文献(任意の製造業者の説明書、指示等を含む)は、参照により明
示的に本明細書に組み込まれる。
ている。バイオテクノロジーの分野における近年の成功により、大量のかかるタンパク質
を産生する能力が改善されている。しかしながら、これらの産物の広範囲に及ぶ特徴付け
により、これらのタンパク質がかなりの不均一性を伴うことが実証されている。例えば、
分子の不均一性は、酸化、脱アミド化、及び糖化等の化学的に誘導された修飾、ならびに
タンパク質分解成熟、タンパク質折り畳み、グリコシル化、リン酸化、及びジスルフィド
結合形成等の翻訳後修飾に起因し得る。分子の不均一性は、治療薬が一連の洗練された分
析技法によって広範囲にわたって特徴付けられなければならず、かつ製品の品質及び一貫
性を確実にする許容基準を満たさなければならないため、望ましくない。
かかる構造的不均一性を特に伴いやすい。例えば、IgG抗体は、4つのポリペプチド鎖
:2つの軽鎖ポリペプチド(L)及び2つの重鎖ポリペプチド(H)から成る。これらの
4つの鎖は、典型的には、これらの重鎖及び軽鎖に存在するシステイン残基間に生じるジ
スルフィド結合によって連結されている。これらのジスルフィド連結が天然H2L2四量
体の全体構造を支配している。全体として、IgG1抗体は、H鎖を連結する2つのヒン
ジ領域ジスルフィド、ならびに重鎖H鎖とL鎖との間の各々1つのジスルフィド結合を含
む4つの鎖間ジスルフィド結合を含む。
化合物と組み合わせる、強力な薬物分子に結合したモノクローナル抗体(mAb)である
。リジンまたはシステイン指向性リンカー化学を使用して、薬物化合物を抗体に結合する
ことができる(Wu,A.M.,Nat.Biotechnol.23:1137-46
(2005))。システイン指向性化学を使用して、薬物は、鎖間ジスルフィド結合の還
元によって得られた天然システインまたは特異的に操作されたシステインのいずれかに連
結し得る。化学量論的に、1つの還元されたジスルフィド結合が、薬物コンジュゲーショ
ンのために2つの遊離チオールを曝露すべきである。コンジュゲーションがIgG1分子
の鎖間システインに対する場合、結果として生じるコンジュゲートは、1抗体分子当たり
0、2、4、6、または8つの薬物を有する種を主に含有する混合物から成る。1抗体当
たりコンジュゲートされる薬物分子の平均数(薬物抗体比、「DAR」)は、平均DAR
が1用量当たり送達される薬物の量を反映するため、ADC産物の重要な品質属性であり
、それ故に、ADCの安全性のみならず有効性にも影響を及ぼし得る。不完全なジスルフ
ィド結合形成、または酸化若しくはベータ排除による結合破損に続くジスルフィドスクラ
ンブリングはすべて、抗体の不均一性の発生源である可能性がある。さらに、ヒトIgG
2抗体の鎖間ヒンジ領域結合内でのトリスルフィド結合形成が報告されている(Pris
tatsky et al,Anal.Chem.81:6148(2009)、Gu
et al,Anal.Biochem.400:89-98(2010))。トリスル
フィド結合は、余分な硫黄原子がその分子内に「トリスルフィド架橋」(-CH2-S-
S-S-CH2-)を形成したときに生じ、ADC産生中にさらなる一貫性及び汚染問題
を引き起こし得る。
to et al.,Free Radical Bio.Med.41:1837(2
006))、インターロイキン-6の切断形態(Breton et al.,J.Ch
romatog.709:135(1995))、及び細菌で発現されたヒト成長ホルモ
ン(hGH)(Canova-Davis et al.,Anal.Chem.68:
4044(1996))で以前に検出されている。ジスルフィド結合を含む他のポリペプ
チド、例えば、インスリン、インターロイキン、及びある特定の凝固因子(第VII因子
等)も、トリスルフィド誘導体を形成する可能性があり得る。
され(PCT特許出願第WO96/02570号)、hGHのトリスルフィド含有量が溶
液中でのH2Sへの曝露によって増加した(米国特許第7,232,894号)ことが推
測された。hGHのトリスルフィド誘導体も、大腸菌での発現中に形成された組換えhG
Hにおいて説明されている(Andersson et al.,Int.J.Pept
ide Protein Res.47:311-321(1996)、A.Jespe
rson et al.,Eur.J.Biochem.219:365-373(19
94))。
合物、例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、若しくは亜硫酸アンモニウム、また
はアルカリ土類金属亜硫酸塩、例えば、亜硫酸マグネシウム若しくは亜硫酸カルシウムで
処理することによって、hGHトリスルフィド誘導体をhGHの天然形態に戻し変換する
ための別の方法を記載している。
塩(例えば、カリウム塩またはナトリウム塩)の添加を特徴とする、少量のトリスルフィ
ドを用いて組換えペプチドを産生するための方法を記載している。
ルモンアンタゴニストポリペプチド」の組換え産生において産生されたトリスルフィドア
イソフォーム不純物の量を減少させるための方法を開示しており、この不純物を、「メル
カプト化合物」(亜硫酸塩、グルタチオン、β-メルカプト-エタノール、ジチオスレイ
トール、システイン等)と接触させる。この出願は、形成されたトリスルフィドの量の低
減を達成するためにキレート剤または金属塩の使用も開示している。
亜硫酸塩化合物、金属塩等への曝露によるトリスルフィド結合の除去は、特に大規模処理
においていくつかの不利点を有する。例えば、これらの化合物が大量に必要とされる。さ
らに、これらの化学物質の多くが既知の毒性を有するため、かかる方法は、トリスルフィ
ド結合が除去された後にタンパク質から化学物質を除去するさらなる処理ステップ(複数
可)も必要とし、別の潜在的不純物源及びプロセス変動性を導入する。加えて、溶液中で
のかかる化学物質への曝露によるトリスルフィド結合の除去は、望ましくないジスルフィ
ド連結の形成による凝集を促進し得る。
れる産生及び精製手順中にトリスルフィド結合の存在によって引き起こされる変動性及び
汚染に対処するために、かかる変動性及び/または不純物を低減または排除するための効
率的かつ改善された手段が、本明細書に開示される方法によって提供される。
体-薬物コンジュゲート(ADC)が生成される。その後、新たに利用可能になった遊離
チオールが、薬物分子とコンジュゲートされる(この分子は、多くの場合、すでにより大
きいリンカー-薬物中間体の一部である)。部分的還元が非変性条件下で行われると、鎖
内ジスルフィド結合に関与するシステインへの連結は、典型的には観察されない。チオー
ル反応性部分(マレイミド等)を含有するリンカー-薬物が過剰に添加されて、すべての
利用可能な遊離チオールのコンジュゲーションを確実にする。トリス(2-カルボキシエ
チル)ホスフィン(TCEP)は、その好ましい反応速度、反応前の溶液安定性により、
及びそれが抗体チオールと混合ジスルフィドを形成することができないという理由により
、これらのプロセスにおいて好ましい還元剤である。TCEPの1つの分子が1つのジス
ルフィド結合を還元すると予想されており、薬物コンジュゲーションのために2つの遊離
チオールを曝露する。1モル当量のTCEP(1.0X TCEP:mAb)での還元後
、予想される平均DAR値は2.0である。同様に、目標とする平均DAR値4.0を達
成するために、2モル当量(2.0X TCEP:mAb)の予測TCEP添加が必要で
あろう。実際には、この還元ステップは、所定のTCEP:抗体(TCEP:mAb)モ
ル比を使用して行われる。
が観察され、報告されている(Cumnock,et al.Bioconjugate
Chem.24:1154-60(2013))。これらの場合、還元剤と抗体の必要
な比率は、所与のロットの抗体では再生可能であるが、抗体間、ならびに同じ抗体の異な
るロット間で異なった。いくつかの抗体ロットは理論的予測に非常に近い量のTCEPを
必要としたが、ほとんどのロットは、目標とする平均DAR値を達成するために増大した
TCEP:mAbモル比を必要とした。トリスルフィド結合の存在が、ADCの製造中に
観察されたこの変動性の潜在的な源として特定された。トリスルフィドが、これらのAD
Cの製造中に観察されたTCEP:mAb比変動性源である可能性があると特定された。
組成物中で予想外の不純物が特定された。ADC及び不純物の調査により、それらの抗体
中に存在するトリスルフィド結合の還元の結果として抗体と薬物分子との間のコンジュゲ
ーション反応に存在する反応性スルフィド部分が、これらの組成物中の不純物であると判
明した遊離薬物二量体の形成に関与したことが示された。
ではなく、本発明者らは、還元及び/またはコンジュゲーション反応中にこれらの組成物
から反応性スルフィド種を低減または排除することによって、トリスルフィド結合を含む
組換えタンパク質の還元において生じる遊離薬物二量体(及び他の不純物)の形成を低減
する方法を開発した。
フィド結合を還元して、反応性スルフィド及び少なくとも1つのチオール基を含有する還
元されたタンパク質を含む組成物を形成することと、結果として生じる組成物中の反応性
スルフィドの含有量を減少させることと、を含む、薬剤の、少なくとも1つのジスルフィ
ド結合及び少なくとも1つのトリスルフィド結合を含むタンパク質中のチオール部分への
コンジュゲーション方法を提供する。その後、薬剤が、還元されたタンパク質の少なくと
も1つのチオール基にコンジュゲートされて、タンパク質-薬剤コンジュゲートを形成す
る。
剤との接触による少なくとも1つのスルフィド結合の少なくとも部分的な還元を含み得る
。
リスルフィド結合である。還元ステップ前に、単離されたタンパク質中のスルフィド結合
の約5%~約7%がトリスルフィド結合であり得る。
ジチオスレイトール(DTT)、ベータ-メルカプトエタノール(βME)、トリス(2
-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、システイン、L-システイン、還元グル
タチオン(GSH)、及びL-GSHのうちの少なくとも1つであり得る。この還元剤は
TCEPであり得、TCEPは、単離されたタンパク質に対するTCEPの所定のモル比
で単離されたタンパク質と混合され得る。単離されたタンパク質に対するTCEPの所定
のモル比は、TCEPのモル過剰であり得る。
ンパク質を、約0.1~約8mM、約0.1~約5mM、約0.1~約3mM、約0.1
~約1mM、約8mM、約5mM、約3mM、約1mM、及び約0.5mMの濃度の化学
的還元剤と接触させることを含む。
8.0、約5.5~約7.5、約5.5、または約6.5のpHで行われ得る。
れ得る。
部分が、薬剤とのコンジュゲーションに利用可能であり得る。
.0のpHに調整することを含み得、これは、組成物のpHを約5.5のpHに低減する
ことを含み得る。
ことと、液体媒体を代替液体媒体と置き換えることとを含み得る。液体媒体は、緩衝液を
含み得る。
反応性スルフィドを欠く代替溶液と置き換える前に、組成物中の還元されたタンパク質を
固体支持体と会合させることを含み得る。固体支持体は、濾過膜、選択性透過膜、及びク
ロマトグラフィー樹脂のうちの少なくとも1つを含み得る。
含有量を低減するのに十分な速度で、還元ステップにおける組成物を混合することを含み
得る。この混合は、単離されたタンパク質中のスルフィド結合(複数可)の還元にとって
の最適混合速度を超える増大した速度で組成物を撹拌することを含み得る。増大した速度
でのこの混合は、還元ステップの全反応時間未満の期間にわたって、還元ステップにおけ
る混合速度を増大させることを含み得る。
を含み得る。窒素源は、組成物に通気し得る窒素ガスを含み得る。この接触は、組成物を
窒素ガス、空気、及びアルゴンガスのうちの少なくとも1つでスパージすることも含み得
る。この接触は、約1分間~約240分間の期間行われ得る。この接触は、約10立法セ
ンチメートル/分~約60立法センチメートル/分の速度で、組成物を窒素ガスでスパー
ジすることも含み得る。この接触は、還元ステップにとっての最適混合速度を少なくとも
200%超える速度で、組成物を窒素ガスの存在下で混合することも含み得る。
0℃の温度で行われ得る。この接触は、約15℃~約40℃の温度でも行われ得る。この
接触は、約20℃の温度でも行われ得る。この接触は、約30℃の温度でも行われ得る。
組成物の体積に対する表面積の比率は、約2であり得る。この接触は、組成物を含有する
反応容器の側面に対して窒素ガスをパイプ供給することを含み得る。この接触は、組成物
中にスパージストーンを浸すことを含み得、このスパージストーンは、約1cm~約1メ
ートルの直径を有する。
スを組成物に導入することを含み得る。この接触ステップは、閉鎖反応容器内で行われ得
る。この接触は、反応性スルフィド(複数可)が組成物から放出されるように、開放反応
容器内で行われ得る。
eenは、Tween20及びTween-80のうちの少なくとも一方であり得る。消
泡剤は、Antifoam-A、Antifoam-C、及びポリエチレンオキシド等の
ポロキサマーのうちの少なくとも1つであり得る。
Fab、Fab’、F(ab)2、Fv断片、ダイアボディ、一本鎖抗体、scFv断片
、またはscFv-Fc等の抗原結合抗体断片であり得る。
モノクローナル抗体でもあり得る。
、ヒトIgG定常領域であり得る。特定の実施形態では、IgG定常領域のアイソタイプ
は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である。
鎖間、または抗体重鎖と抗体軽鎖との間及び抗体重鎖間の両方に存在する。この抗体また
は抗体断片は、軽鎖定常ドメインを含み得る。この軽鎖定常ドメインは、カッパ定常ドメ
インであり得る。この抗体は、重鎖を連結するヒンジ領域内に2つのスルフィド結合、な
らびに軽鎖と重鎖との間に各々1つのスルフィド結合を含む4つの鎖間スルフィド結合を
有するIgG1モノクローナル抗体でもあり得る。
の還元をもたらし得、鎖内結合の還元はもたらさない。
び治療抗体から選択される少なくとも1つの治療薬であり得る。薬剤は、オーリスタチン
、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフ
ィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、及びドラスタチンから選択される少な
くとも1つの抗チューブリン剤であり得る。ドラスタチンは、オーリスタチンであり得る
。オーリスタチンは、モノメチルオーリスタチンE(MMAE)またはモノメチルオーリ
スタチンF(MMAF)でもあり得る。
、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド
、及びビンカアルカロイドのうちの少なくとも1つであり得る。
うに適合されたリンカー部分であり得る。このリンカー部分は、切断可能なリンカーまた
は切断不可能なリンカーであり得る。このリンカー部分は、細胞内条件下で切断されやす
いリンカーであり得る。このリンカー部分は、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペ
プチドリンカーであり得る。このリンカー部分は、ジペプチドリンカーであり得る。ジペ
プチドリンカーは、バリン-シトルリン(val-cit)またはフェニルアラニン-リ
ジン(phe-lys)リンカーであり得る。ジペプチドリンカーは、遊離チオールと反
応して共有結合を形成するマレイミド官能基であり得る。
22-val-cit-MMAF、aLy6E-val-cit-MMAE、aLy6E
-val-cit-MMAF、aCD79b-val-cit-MMAE、aCD79b
-val-cit-MMAF、aNaPi2b-val-cit-MMAE、aNaPi
2b-val-cit-MMAF、aMUC16-val-cit-MMAE、aMUC
16-val-cit-MMAF、aSTEAP1、及びaETBRのうちの1つであり
得る。
も1つの単離された抗体を、約5.5~約7.5のpHのTCEPと接触させることと、
その溶液を窒素ガスと接触させることとを含む、単離された抗体中のトリスルフィド結合
のジスルフィド結合への変換方法を提供する。その後、単離された抗体はオーリスタチン
またはその誘導体にコンジュゲートされて、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を形成
する。
記載されているか、その記述から理解され得るか、または本開示の方法及び組成物を実施
することによって習得され得る。前述の簡単な説明及び以下の発明を実施するための形態
は、例示及び説明するためのものであり、特許請求されるように本発明を限定するもので
はない。
形態とともに説明されているが、本発明がそれらの実施形態に限定されるようには意図さ
れていないことが理解されよう。それとは逆に、本発明は、特許請求の範囲によって定義
される本発明の範囲内に包含され得るすべての代替案、修正、及び等価物を網羅するよう
意図されている。
に記載のものと同様または同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記
載の方法及び材料に決して限定されない。
る当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有するものとする。本明細書に記載のものと
同様または同等のいずれの方法、デバイス、及び材料も本発明の実施または試験に使用す
ることができるが、好ましい方法、デバイス、及び材料についてこれから説明する。
「the」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数参照を含み、「少なくとも1つ」
及び「1つ以上」と同義に使用される。したがって、「ポリヌクレオチド(a poly
nucleotide)」という言及は、複数のポリヌクレオチドまたは遺伝子を含むと
いった具合である。
が変化しないような数値のわずかな変更または変動を表す。
includes」、「including」、「contains」、「contai
ning」、及びそれらの任意の変形は、ある要素または要素の一覧を備える、含む、ま
たは含有するプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物が、それらの要素のみ
ならず、明確に列記されていないか、またはかかるプロセス、方法、プロセスによる産物
、若しくは組成物に内在する他の要素も含み得るように、非排他的な包含を網羅するよう
意図されている。
される各数値(分数及び整数を含む)を明確に含む。例えば、本明細書における「x未満
」の範囲への言及(ここで、xは特定の数である)は、整数x-1、x-2、x-3、x
-4、x-5、x-6等、及び分数x-0.1、x-0.2、x-0.3、x-0.4、
x-0.5、x-0.6等を含む。さらに別の実例では、本明細書における「x~y」の
範囲への言及(ここで、xは特定の数であり、yは特定の数である)は、各整数x、x+
1、x+2…~y-2、y-1、y、ならびにx+0.1、x+0.2、x+0.3…~
y-0.2、y-0.1等の各分数を含む。別の例では、「少なくとも95%」という用
語は、例えば、95%、96%、97%、98%、99%、及び100%等を含む、95
%~100%の各数値(分数及び整数を含む)を含む。
物を意味する。
え)起源のタンパク質が含まれ、本発明による方法は、任意の源、例えば、植物または動
物から抽出されたタンパク質に適用され得る。これらのタンパク質は、上で定義される治
療用タンパク質であり得、通常、1つ以上のジスルフィド結合及び1つ以上のトリスルフ
ィド結合を含む。例示のタンパク質は、スーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキ
ン、成長ホルモン、及び抗体または抗体断片を含む。
なわち、HS-及び/若しくはS2 -)を含み得る。
成され、それにより3つの連続した硫黄原子の共有結合がもたらされる。トリスルフィド
結合は、タンパク質中のシステイン残基間に生じ得、分子内(すなわち、同じタンパク質
中の2つのシステイン間)または分子間(すなわち、別個のタンパク質中の2つのシステ
イン間)に生じ得る。IgGl抗体等の抗体の場合、2つの分子間ジスルフィド結合が重
鎖を一緒に連結し、1つの分子間ジスルフィド結合が重鎖及び軽鎖も各々連結する。同様
に、IgG2分子は、重鎖を連結する3つの分子間ジスルフィド結合を含み、IgG3分
子は、重鎖を連結する6~16個の分子間ジスルフィド結合を含む。トリスルフィド修飾
は、これらのジスルフィド連結のいずれかで生じ得るが、重鎖-重鎖(HH)連結よりも
重鎖-軽鎖(HL)連結でより頻繁に生じる。
により薬物及びタンパク質二量体または他の望ましくない潜在的に危険な誘導体の形成が
誘導され得ると考えられている。多くの場合、トリスルフィド結合の形成を阻止すること
も、タンパク質中に存在するすべてのトリスルフィド結合を排除することも実現可能では
ないが、本発明者らは、コンジュゲーション反応におけるタンパク質還元中に薬物及び/
またはタンパク質不純物(すなわち、望ましくない化学反応生成物)の形成を低減または
排除することが可能であることを見出した。これらの望ましくない化学反応生成物を低減
または排除する方法は、化学反応の液体媒体からの反応性スルフィド種の除去を含む。
天然源からの単離(天然に存在するタンパク質の場合)、ポリペプチドをコードする、以
前に調製されたDNAの部位特異的(またはオリゴヌクレオチド媒介)変異生成及びカセ
ット変異生成を含み得る組換えタンパク質産生方法を含むが、これらに限定されない様々
な方法によって得ることができる。変異生成プロトコル、キット、及び試薬、例えば、Q
uikChange(商標)Multi Site-Direct Mutagenes
is Kit(Stratagene,La Jolla,Calif.)は、市販のも
のである。
合成され得るか、または組換え技術を使用して調製及び精製され得る。適切なアミノ酸配
列またはその部分は、固相技法を使用する直接ペプチド合成によって産生され得る(St
ewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthes
is,(1969)W.H.Freeman Co.,San Francisco,C
alif.、Merrifield,(1963)J.Am.Chem.Soc.,85
:2149-2154)。インビトロタンパク質合成は、手動技法を使用して、または自
動で行われ得る。自動固相合成は、例えば、t-BOCまたはFmoc保護アミノ酸を用
いて、かつ製造業者の指示を使用したApplied Biosystems Pept
ide Synthesizer(Foster City,Calif.)を使用して
達成され得る。単離されたタンパク質の様々な部分が別個に化学的に合成され、化学的ま
たは酵素的方法を使用して組み合わせられて、本発明の方法における使用のための所望の
単離されたタンパク質を産生することができる。
質として使用され得る。従来、抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によ
り得られていた(Morimoto et al(1992)Journal of B
iochemical and Biophysical Methods 24:10
7-117、及びBrennan et al(1985)Science,229:8
1)か、または組換え宿主細胞によって直接産生されていた。Fab、Fab’、F(a
b)2、Fv断片、ダイアボディ、一本鎖抗体、scFv断片、またはscFv-Fc抗
体断片はすべて、大腸菌で発現し、それから分泌され、それ故に、大量のこれらの断片の
容易な産生を可能にし得る。抗体断片は、抗体ファージライブラリから単離され得る。あ
るいは、Fab’-SH断片は、大腸菌から直接回収され、化学的に結合されて、F(a
b’)2断片を形成することができる(Carter et al(1992)Bio/
Technology 10:163-167)か、または組換え宿主細胞培養から直接
単離され得る。この抗体は、一本鎖Fv断片(scFv)であり得る。この抗体断片は、
「直鎖抗体」でもあり得る(米国特許第5,641,870号)。かかる直鎖抗体断片は
、単一特異的または二重特異的であり得る。この抗体または抗体断片は、IgG抗体であ
り得る。この抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。
ート(ADC)化合物等の化合物を薬物分子とコンジュゲートすることを可能にするシス
テイン操作抗体でもあり得る。抗体表面上の反応性システイン残基は、マレイミドまたは
ハロアセチル等のチオール反応基による薬物部分の特異的コンジュゲーションを可能にす
る。Cys残基のマレイミド基に対するチオール官能基の求核反応性は、リジン残基のア
ミノ基またはN末端アミノ基等のタンパク質中のいずれの他のアミノ酸官能基と比較して
、約1000倍高い。ヨードアセチル及びマレイミド試薬中のチオール特異的官能基は、
アミン基と反応することができるが、典型的には、より高いpH(9.0超)及びより長
い反応時間が必要である(Garman,1997,Non-Radioactive
Labelling:A Practical Approach,Academic
Press,London)。
は、薬物がコンジュゲートされ得る十分に反応性があるチオール基を形成するために還元
され得るスルフィド結合を1つのみまたはいくつか有し得る。このタンパク質は、重鎖を
連結するヒンジ領域内に2つ、ならびにFab領域付近の軽鎖と重鎖との間に各々1つの
合計4つの鎖間ジスルフィドを有するIgG1モノクローナル抗体であり得る。各還元さ
れた鎖間ジスルフィド結合は、2つの遊離チオールをもたらし、各々薬物とのコンジュゲ
ーションに利用可能である。非変性条件下でのかかる抗体中間体の還元は、典型的には、
鎖間ジスルフィド結合のみを還元し、鎖内結合は還元しない。したがって、鎖間ジスルフ
ィド結合の完全な還元により、IgG1抗体中間体1モルにつき合計8モルの遊離チオー
ルがもたらされる。
トIgG定常領域を含み得、IgG定常領域のアイソタイプは、IgG1、IgG2、I
gG3、またはIgG4であり得る。特定の実施形態では、IgG定常領域のアイソタイ
プは、IgG1である。
または抗体重鎖間、または抗体重鎖と抗体軽鎖との間及び抗体重鎖間の両方に存在する。
この抗体または抗体断片は、軽鎖定常ドメインを含み得る。この軽鎖定常ドメインは、カ
ッパ定常ドメインであり得る。この抗体は、重鎖を連結するヒンジ領域内に2つのスルフ
ィド結合、ならびに軽鎖と重鎖との間に各々1つのスルフィド結合を含む4つの鎖間スル
フィド結合を有するIgG1モノクローナル抗体であり得る。
して存在する。単離されたタンパク質中のスルフィド結合の約1%~約20%がトリスル
フィド結合であり得るか、あるいは、単離されたタンパク質中のスルフィド結合の約1%
~約18%、約2%~約16%、約3%~約12%、約4%~約10%、または約5%~
約7%がトリスルフィド結合である。単離されたタンパク質中のトリスルフィド結合の少
なくとも約80%が還元ステップで還元され得るか、あるいは、単離されたタンパク質中
のトリスルフィド結合の少なくとも約81%、82%、83%、84%、85%、86%
、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%
、97%、98%、99%、または100%が還元ステップで還元される。
性システインチオール基を生成する。還元剤としては、ジチオスレイトール(DTT)、
ベータ-メルカプトエタノール(βME)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
(TCEP)、システイン、L-システイン、還元グルタチオン(GSH)、及びL-G
SHのうちの少なくとも1つが挙げられ得る。抗体がこれらの方法で使用される場合、還
元剤は、好ましくは、ジチオスレイトール(DTT)及びトリカルボニルエチルホスフィ
ン(TCEP)のうちの一方または両方であり、還元反応は、非変性条件下で実行される
。TCEPは、典型的には、単離されたタンパク質に対するTCEPの所定のモル比で還
元反応において使用される。典型的には、TCEPは、単離されたタンパク質に対してモ
ル過剰でこの反応に添加される。TCEPは、約0.1~約8mM、約0.1~約5mM
、約0.1~約3mM、約0.1~約1mM、約8mM、約5mM、約3mM、約1mM
、または約0.5mMの濃度で還元反応に添加される。単離された抗体の使用時、還元ス
テップ後に、典型的には、単離されたタンパク質1モル還元につき約4~約8モルのチオ
ール部分が、薬剤とのコンジュゲーションに利用可能である。
6~約pH7のpH、または約pH5.5、または約pH6.5を含み得る、pH7未満
のpHで実行され得る。
、約50分間、約60分間、約90分間、約2時間、約3時間、約4時間、または約5時
間の期間にわたって行われ得る。還元反応の期間は、約24時間未満、約20時間未満、
約12時間未満、または約6時間未満であり得る。還元反応は、約1時間行われる場合も
ある。
ク質を含有する組成物の産生をもたらす。さらに、トリスルフィド結合が単離されたタン
パク質中に存在した場合、還元ステップ前に、結果として生じる組成物は、反応性スルフ
ィド(複数可)も含有する。
約5.0~約6.0のpH若しくは約5.2~約5.8のpHに調整することによって、
または組成物のpHを約pH5.5のpHに調整することによって減少させることができ
る。還元反応を弱酸性pHで行うことにより、還元反応の全体的有効性が低減し得るが、
これらの弱酸性反応条件は、組成物中の反応性スルフィドの含有量も低減する。あるいは
、組成物のpHは、還元反応が完了した後に、約7.0の中性pHから約5.0~約6.
0の弱酸性pHに調整され得る。
(例えば、その二量体またはより高位のオリゴマー、その脱アミド化形態、そのスルホキ
シド化形態等)の形成に対する安定性、沈殿回避等の他の要因にも影響される一方で、組
成物中の反応性スルフィドの含有量の産生を最小限に抑えるよう努める。
のある特定の一部を、実質的に低減した反応性スルフィド含有量を有するか、または反応
性スルフィド含有量を有しない新鮮なまたは新たな液体と置き換え、それにより全組成物
中の反応性スルフィドの含有量を減らすことによっても減少し得る。これは、組成物中の
還元されたタンパク質を固体支持体と会合させ、その後、還元されたタンパク質を1つ以
上の洗浄ステップで洗浄することによって達成され得る。固体支持体と会合した組成物中
の還元されたタンパク質は、緩衝液、安定剤、pH調整剤、タンパク質変性剤等のうちの
1つ以上を含み得る水性媒体で洗浄され得る。例えば、還元されたタンパク質が固体支持
体と会合した後にPBS洗浄が適用され、それにより還元反応後に組成物中に存在する反
応性スルフィド種のいくらかまたはすべてを洗い流すことができる。この洗浄を使用して
、例えば、他の不純物を取り除くこともできる。例えば、還元されたタンパク質を含む組
成物が固体支持体と会合した後に、高塩濃度緩衝溶液での洗浄を使用して、不純物を取り
除くことを促進することもできる。各々異なる液体を含むいくつかの洗浄液を使用するこ
とも可能である。例えば、薬物を還元されたタンパク質にコンジュゲートするステップの
前に、高塩濃度洗浄を、組成物中に存在する緩衝液を置き換えるか、または組成物のpH
を調整するように設計された洗浄と組み合わせることができる。さらにまたはあるいは、
還元されたタンパク質が固体支持体と会合した後に洗浄が適用されて、還元反応が完了し
たと見なされたときに、タンパク質から還元剤を除去することができる。さらにまたはあ
るいは、別の洗浄、例えば、低塩濃度洗浄を適用して、固体支持体からの還元されたタン
パク質の効率的な解離、例えば、溶出を促進することができる。還元されたタンパク質を
含有する組成物の少なくとも90%が、反応性スルフィドを欠く代替溶液と置き換えられ
得る。
も1つを含み得る。例示の濾過膜としては、交差流濾過(別名、接線流濾過、TFF)膜
または全量濾過膜が挙げられ得る。例示の選択性透過膜としては、透析膜、脱塩膜、及び
緩衝液交換膜が挙げられ得る。
の混合速度を増大させることによって減少する。この増大した混合速度により、ガスが開
放反応器ポートを通して放出されるときに反応性スルフィド種が反応から逃げることが可
能になり得る。
質中に存在するトリスルフィド結合及びジスルフィド結合の完全または部分的還元が、薬
物分子へのその後のコンジュゲーションに利用可能なチオール部分の平均目標レベルまで
経済的かつ効率的に低減される。還元反応中に形成された組成物からの反応性スルフィド
種の排除を強化するために、混合速度が、還元反応時間のすべてまたは少なくとも一部に
わたって増大し得る。例えば、混合速度は、還元反応のために確立された最適混合速度を
少なくとも10%、20%、40%、80%、100%、150%、200%、250%
、300%、350%、400%、450%、500%、または550%超えて増大し得
る。別の例として、混合速度は、還元反応のために確立された最適混合速度を2倍、3倍
、4倍、または5倍超えて増大し得る。混合速度は、還元反応が行われる全時間未満にわ
たって、還元反応のために確立された最適な混合速度を超えて増大し得る。混合速度は、
還元反応が行われる時間の後半部分中にのみ増大し得る。例えば、混合速度は、還元反応
が行われる時間の後半中にのみ増大し得る。あるいは、混合速度は、還元反応が行われる
時間の最後の40%、30%、20%、10%、または5%中にのみ増大し得る。特定の
例では、還元反応が90分間行われ、混合速度は、還元反応の最後の5分間にわたって約
200%~約500%に増大する。混合速度は、還元反応が行われる最初の時間中にのみ
増大する場合もある。例えば、混合速度は、還元反応が行われる時間の前半中にのみ増大
し得る。例えば、混合速度は、還元反応が行われる時間の最初の40%、30%、20%
、10%、または5%中にのみ増大し得る。特定の例では、還元反応が90分間行われ、
混合速度は、還元反応の最初の5分間にわたって約200%~約500%に増大する。
反応中に形成された組成物と接触させることによって減少し得る。
窒素源としては、「希ガス」(ヘリウム(He)、ネオン(Ne)、アルゴン(Ar)、
クリプトン(Kr)、及びキセノン(Xe)等)、とりわけ、ヘリウム及びアルゴンも挙
げられ得る。
混合手段を用いてまたは用いずに、窒素含有ガスを液体組成物に通す(例えば、ガス泡流
を媒体に送る)ことによって、または相間のガス拡散が生じ得る大きい液相/ガス相界面
を作り出す他の手段によって行われ得る。
ガスと液体組成物との間の接触期間、窒素含有ガスの液体組成物への導入/通過速度、組
成物と窒素含有ガスの混合速度、液体媒体のpH、液体組成物及び/または窒素含有ガス
の温度、ガス相と液相との間の接触表面積、ならびに用いられる窒素含有ガスの体積を含
む。さらに、窒素含有ガスがスパージストーンを通して導入されて液体組成物と接触し、
この場合、スパージストーンの位置及び大きさも、組成物からの反応性窒素種の低減また
は排除において影響力のあるパラメータである。
ィド種の存在を低減または排除するのに十分な時間である。これは、例えば、約1分間~
約240分間であり得る。窒素含有ガスは、還元反応の全期間にわたって還元反応の組成
物と接触し得る。窒素含有ガスは、還元反応が行われる時間の一部のみにわたって還元反
応の組成物と接触する場合もある。窒素含有ガスは、還元反応が完了したと見なされたと
きに、または組成物中の還元剤を除去するための緩衝液交換等の他の手段によって停止さ
れたときに、または組成物に導入された薬剤でクエンチして還元反応を停止することによ
って、還元反応の組成物と接触する場合もある。窒素含有ガスは、還元反応が行われる時
間の最初の部分にわたって還元反応の組成物と接触する場合もある。例えば、窒素含有ガ
スは、還元反応が行われる時間の最初の40%、30%、20%、10%、または5%に
わたって還元反応の組成物と接触する場合もある。窒素含有ガスは、約30分間、約60
分間、または約90分間の期間にわたって還元反応の組成物と接触し得る。
の存在を実質的に低減または排除するのに十分な、窒素含有ガスの還元反応の組成物への
制御された導入速度を含み得る。窒素含有ガスは、約10立法センチメートル/分~約6
0立法センチメートル/分の速度で、組成物に導入され得る。窒素含有ガスは、約5リッ
トル/時間~約30リットル/時間、約10L/時間~約25L/時間、または約15L
/時間~約20L/時間の速度で、組成物に導入され得る。窒素含有ガスは、約0.25
~約1(ガス体積/液体体積/分)の速度で、組成物に導入され得る。
スと接触させ、それにより組成物中に存在する反応性スルフィド種を実質的に低減または
排除するのに十分な混合速度であり得る。組成物を窒素含有ガスと接触させるステップ中
の還元反応の混合速度は、還元反応にとっての最適混合速度を少なくとも10%、20%
、30%、40%、50%、100%、200%、300%、または400%超え得る。
組成物を窒素含有ガスと接触させるステップ中の還元反応の混合速度は、還元反応にとっ
ての最適混合速度を約200%超え得る。
ンパク質中に存在するスルフィド結合のいくらかの部分またはすべてを還元する所望の終
点に至らせるのに最適なpH範囲であり得る。このpH範囲は、組成物の窒素含有ガスと
の接触とともに、良好な還元反応収率を維持しながら、組成物中に存在する活性自己種を
実質的に低減または排除するように調整され得る。還元反応のpHは、窒素含有ガスが還
元反応の組成物と接触する間、約pH4.0~約pH9.0のpH範囲内に維持され得る
。還元反応のpHは、窒素含有ガスが組成物と接触する間、約pH5.0~約pH8.0
のpH範囲内に維持される場合もある。還元反応のpHは、窒素含有ガスが組成物と接触
する間、約pH5.0~約pH6.0の弱酸性pH範囲内に維持され得る。
れ得る。この温度範囲は、窒素含有ガスの組成物への導入とともに、還元反応にとって良
好な収率を維持しながら、還元反応の組成物中の反応性スルフィド種を実質的に低減また
は排除するように修正され得る。還元反応の液体組成物の温度は、窒素含有ガスが組成物
と接触する時間中約4℃~約40℃の温度で維持され得る。還元反応の液体組成物の温度
は、約15℃~約40℃の温度で維持される場合もある。還元反応の液体組成物の温度は
、約20℃または約30℃の温度で維持される場合もある。
と液体反応相との間の接触表面積を、反応組成物中に存在する反応性スルフィド種を実質
的に低減または排除する範囲内に維持するように調整され得る。組成物の体積に対する窒
素含有ガスの表面積の比率は、約0.1~約3である。組成物の体積に対する窒素含有ガ
スの表面積の比率は、約2であり得る。還元反応の液体組成物に導入される窒素含有ガス
の体積は、最適な速度及び液体反応成分の体積に対する表面積の比率を維持して、還元反
応の組成物中の反応性スルフィド種を実質的に低減または排除するように制御される。
に導入されて還元反応の液体組成物と接触し得る。例えば、窒素含有ガスは、空気若しく
は「スパージ」ストーンまたは穿孔濾過ディスクを通して導入され得る。不活性金属スパ
ージストーンは、繰り返し使用されても良く、酸/塩基洗浄によって取り除かれても良く
、オートクレーブによって滅菌されても良い。スパージストーンは、形成されたガス泡を
反応流体上に直接浮上させるような方法で、還元反応の流体組成物中に垂直に配向され得
る。スパージストーンは、約2ミクロンの穴を有するステンレス鋼スパージストーンであ
り得る。スパージストーンは、直径1mm未満の気泡を最大5L/分の流速で発生させる
細孔を有し得る。この流速は、スパージストーンの上流に設置された質量流量コントロー
ラによって制御され得る。
組成物中に泡が作り出される場合があり、これにより還元反応の効率及び/または程度が
低減され得る。したがって、窒素含有ガスが還元反応に導入される場合、この反応は、t
ween及び/または消泡剤の存在下で行われ得る。還元反応は、Tween-20及び
Tween-80のうちの少なくとも一方であるtweenの存在下で行われ得る。還元
反応は、Antifoam-A、Antifoam-C、及びポリエチレンオキシド等の
ポロキサマーのうちの少なくとも1つである消泡剤の存在下でも行われ得る。
パク質のアミノ酸側鎖、または活性化アミノ酸側鎖、またはタンパク質中の操作されたシ
ステイン等と間接的にコンジュゲートされ得る。例えば、部分的に還元された抗体は、ビ
オチンとコンジュゲートされ得、薬剤は、アビジンまたはストレプトアビジンとコンジュ
ゲートされ得るか、またはその逆も可能であり得る。ビオチンは、ストレプトアビジンに
選択的に結合し、それ故に、この薬剤は、この間接的方法で、抗体とコンジュゲートされ
得る。
PCT公開第WO2004/010957号、米国特許第7,659,241号、同第7
,829,531号、及び同第7,851,437号に開示されている。
らの循環半減期を延長させ得る薬剤への共有コンジュゲーションによって化学的に修飾さ
れる場合もある。例示のポリマー及びそれらをペプチドに結合させる方法は、参照により
本明細書に組み込まれる、米国特許第4,766,106号、同第4,179,337号
、同第4,495,285号、及び同第4,609,546号で例証されている。これら
のポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリエチレングリコール(PEG)(
例えば、約2,000~約20,000等の約1,000~約40,000の分子量を有
するPEG)を含み得る。
び治療抗体から選択される治療薬であり得る。治療薬は、化学療法剤であり得る。化学療
法剤は、オーリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカ
チン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、及びドラスタ
チンから選択される少なくとも1つの抗チューブリン剤であり得る。化学療法剤は、オー
リスタチン、DNA副溝結合剤、DNA副溝アルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシ
ン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイ
ド、及びビンカアルカロイドのうちの少なくとも1つであり得る。化学療法剤は、ドラス
タチン、具体的には、オーリスタチン、特定の例では、モノメチルオーリスタチンE(M
MAE)またはモノメチルオーリスタチンF(MMAF)であり得る。
抗体薬物コンジュゲート(ADC)を形成し得、それ故に、抗体及び薬物の両方を含み、
これらはリンカーを介して互いにコンジュゲートされ得る。
おける使用に好適なリンカーとしては、リンカーの切断により薬物単位が細胞内環境下で
抗体から放出されるように細胞内条件下で切断可能なリンカーが挙げられる。あるいは、
このリンカーは、切断不可能である場合があり、薬物は、例えば、抗体分解によって放出
される。あるいは、このリンカーは、細胞内環境下(例えば、リソソームまたはエンドソ
ーム内)に存在する切断剤によって切断可能である。したがって、このリンカーは、リソ
ソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むが、これらに限定されない細胞内ペプチダ
ーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。ペプチ
ジルリンカーは、少なくとも2アミノ酸長または少なくとも3アミノ酸長であり得る。切
断剤は、カテプシンB及びDならびにプラスミンを含み得、これらのすべてがジペプチド
薬物誘導体を加水分解して、標的細胞内での活性薬物の放出をもたらすことが知られてい
る(例えば、Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Th
erapeutics 83:67-123を参照のこと)。細胞内プロテアーゼによっ
て切断可能なペプチジルリンカーは、Val-Cit(バリン-シトルリン)リンカーま
たはPhe-Lys(フェニルアラニン-リジン)リンカーであり得る(例えば、ドキソ
ルビシンと、Val-Citリンカー及びPhe-Lysリンカーの異なる例の合成につ
いて説明する、米国特許第6,214,345号を参照のこと)。このリンカーは、遊離
チオールと反応して共有結合を形成するマレイミド官能基であり得る。
ップを使用して、抗癌治療薬を抗体にコンジュゲートして、aCD22-val-cit
-MMAE、aCD22-val-cit-MMAF、aLy6E-val-cit-M
MAE、aLy6E-val-cit-MMAF、aCD79b-val-cit-MM
AE、aCD79b-val-cit-MMAF、aNaPi2b-val-cit-M
MAE、aNaPi2b-val-cit-MMAF、aMUC16-val-cit-
MMAE、MUC16-val-cit-MMAF、sSTEAP1、及びaETBRの
うちの少なくとも1つを形成することができる。
及び少なくとも1つのジスルフィド結合を含む少なくとも1つの単離された抗体を、約p
H5.5~約pH7.5のpHのTCEPと接触させることと、この溶液を窒素ガスと接
触させることと、オーリスタチンまたはその誘導体を還元された抗体にコンジュゲートし
て、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を形成することとによる、単離された抗体中の
トリスルフィド結合のジスルフィド結合への変換方法を提供する。
には意図されていない。
2)の還元、及びVal-Cit(バリン-シトルリン)リンカーを介した抗癌ドラスタ
チン(MMAE)へのそのコンジュゲーション中の薬物二量体の形成について説明する。
これらのデータは、薬物二量体形成がこのモデル系中のmAbバルク中間体のトリスルフ
ィド含有量に関連していることを実証する。
bまたは抗CD22)を部分的に還元し、その後のコンジュゲーション反応を薬物-リン
カーvcMMAEで行った。
した。タンパク質濃度の決定後、所定のTCEP:mAb比(水中TCEPの10mMス
トック溶液から)を使用して、pH調整した試料を室温で90分間の目標還元時間にわた
って還元した。過剰な所望のマレイミド含有リンカー-薬物を使用して、部分的に還元さ
れたmAbを即座にコンジュゲートした。未反応リンカー-薬物を過剰なN-アセチルシ
ステイン(NAC):リンカー薬物比(水中NACの10mMストック溶液から)でクエ
ンチし、pHを製剤pH条件と一致するように調整した。必要に応じて、コンジュゲート
された試料を製剤緩衝液に緩衝液交換して、その後の試料分析を妨害する可能性のあり得
る残留溶媒及び遊離薬物種を除去した。還元及びコンジュゲートされた組成物中の遊離薬
物の含有量をRP-HPLCによって分析した。
有しないバルクmAb供給原料から形成されたaCD79b-vcMMAEコンジュゲー
トについてのインプロセスコンジュゲーションプールのRP-HPLC分析からは検出さ
れていない。図1Bに示されるように、出発mAb中間体中に約5~6%の測定されたト
リスルフィドを含有するaCD22-vcMMAEについてのインプロセスコンジュゲー
ションプールの分析中に薬物二量体(vcMMAE二量体)が検出されている。
は排除する手段として部分的に還元されたタンパク質の還元後の緩衝液交換の分析につい
て説明する。これらのデータは、vcMMAEコンジュゲーション前の部分的に還元され
たmAb中間体の緩衝液交換がこのモデル系における薬物二量体の形成を低減することを
実証する。
ENTIRCON(商標))を使用して、還元されたタンパク質プールを緩衝液交換した
。Centriconを使用した緩衝液交換中、水(緩衝液)及び低分子量溶質の両方を
名目分子量カットオフ膜フィルターに通過させ、もう一方の側(濾液)に収集する。還元
されたタンパク質が膜の試料側(保持液)に残り、ここで、膜を横断して水を反対側に移
動させたときにそれをより小さい体積に濃縮する。10~30kDaの名目分子量カット
オフを有するCentricon遠心分離濾過デバイスを製造業者の指示に従って使用し
た。実施例1に記載のTCEP(約1~3mL)で部分的に還元されたタンパク質を単一
のCentriconデバイスに添加し、10mM Tris(pH7.5)で希釈して
、デバイス中10mLの最終体積にした。Centriconデバイスを4500gで2
0分間遠心分離した。緩衝液交換されたタンパク質の回収前に、10mLの10mM T
ris(pH7.5)にさらに2回通過させて、Centriconデバイスの保持液試
料をさらに緩衝液交換した。緩衝液交換された部分的に還元されたタンパク質をCent
riconデバイスから回収し、その後の下流コンジュゲーションで使用した。
遊離薬物二量体の含有量を実施例1に記載されるようにRP-HPLCによって測定した
。図2Aに示されるように、aCD79b-vcMMAE抗体-薬物コンジュゲート(A
DC)についてのインプロセスコンジュゲーションプールのRP-HPLC分析は、遊離
薬物二量体(vcMMAE二量体)の形成をもたらす。しかしながら、図2Bに示される
ように、部分的に還元されたmAbタンパク質中間体の緩衝液交換後に、同じaCD22
-vcMMAE ADCについてのインプロセスコンジュゲーションプールのRP-HP
LC分析中に遊離薬物二量体は検出されていない。
は排除する手段としてタンパク質の部分的還元中の増大した反応混合速度の分析について
説明する。これらのデータは、vcMMAEコンジュゲーション前にmAb中間体の還元
反応時間の少なくとも一部にわたって混合速度を増大させることにより、このモデル系に
おける薬物二量体の形成を低減することができることを実証する。
オーバーヘッド撹拌装置の混合速度を、aMUC16タンパク質の部分的還元に最適にな
るように事前に決定された目標混合速度から増大させた。混合速度を、100mLの反応
器内で磁気撹拌棒によって、または100mLのEASYMAX(商標)反応器内でモー
ター式ガラス撹拌器によって制御した。磁気撹拌棒の混合速度を磁気撹拌プレート上の設
定によって決定し、rpmを手動で調整して、還元中の混合速度を変化させた。EASY
MAXのガラス撹拌器を器具ソフトウェアによって制御し、混合速度を添付のソフトウェ
ア上の実験処方における器具タッチパッドまたは所定の設定を用いて手動で変化させた。
開始し、実施例1に記載されるようにRP-HPLC分析を行った。図3を参照して、R
P-HPLC分析を、バックグラウンド対照(別個の下の線)として製剤緩衝液ブランク
上で行った。
、aMUC16-vcMMAEについてのインプロセスコンジュゲーションプールのRP
-HPLC分析は、遊離薬物二量体の形成を示す。
aMUC16-vcMMAEについてのインプロセスコンジュゲーションプールのRP-
HPLC分析は、遊離薬物二量体が検出されていないことを示す。
分間にわたる混合速度の400RPMへの増大を含む組み合わせられた混合速度の場合(
5分間の高速混合、合計還元時間:90分間)、aMUC16-vcMMAEについての
インプロセスコンジュゲーションプールのRP-HPLC分析は、遊離薬物二量体の形成
の実質的な低減を示す。
は排除する手段としてタンパク質の部分的還元反応を窒素ガスでスパージする分析につい
て説明する。これらのデータは、vcMMAEコンジュゲーション前にmAb中間体の還
元反応時間の少なくとも一部にわたって反応をスパージすることにより、このモデル系に
おける薬物二量体の形成を低減または排除することができることを実証する。
Ly6E)の部分的還元を行い、(実施例1に記載されるようにvcMMAE薬物を使用
して)窒素ガスを下流コンジュゲーション反応の直前に還元プールに通気させることをさ
らに含んだ。管類を介して窒素タップに取り付けられたポリプロピレン血清学的ピペット
を通して窒素ガスを反応混合物に通気した。反応混合物をスパージする前に、ガス流量計
を使用して流速を測定する。流速が判明すると、窒素ガスラインを反応に追加し、還元中
の指定された開始時間までラインをクランプする。所定の終了時間まで反応をスパージし
、それらのラインを再クランプし、ピペットを反応器から除去する。実施例1に記載され
るように、ADCの結果として生じる組成物におけるRP-HPLC分析をRP-HPL
Cを使用して行った。
0分間)のN2ガススパージを伴う(下の線)及び伴わない(上の線)aCD22-vc
MMAE ADCについてのインプロセスコンジュゲーションプールのRP-HPLC分
析は、窒素スパージにより遊離vcMMAE薬物二量体の形成が排除されたことを実証す
る。同様に、図4Bに示されるように、TCEP部分的還元反応の最後の5分間(合計還
元時間:90分間)のN2ガススパージを伴う(下の線)及び伴わない(上の線)aLy
6E-vcMMAE ADCについてのインプロセスコンジュゲーションプールのRP-
HPLC分析も、窒素スパージにより遊離vcMMAE薬物二量体の形成が排除されたこ
とを実証する。
は排除する手段としてタンパク質の部分的還元反応を空気でスパージする分析について説
明する。
中間体抗体(抗MUC16)の2つの21mL低減還元(reduction redu
ction)を、還元剤TCEPまたはDTTで行った。還元後、各反応(TCEP及び
DTT)を3つのプール、1)窒素ガスでの5分間のスパージを受けたプール、2)空気
での5分間のスパージを受けたプール、及び3)いずれのガスでのスパージも受けなかっ
た対照反応に分けた。具体的には、85分間の抗体還元後、TCEP還元及びDTT還元
抗体プールを各々、2つの10mL試料(試料1~2)及び1つの1mL試料(試料3)
に分けた。試料1を、下流コンジュゲーションのために薬物を添加する前に窒素で5分間
スパージした。試料2を、下流コンジュゲーションのために薬物を添加する前に空気で5
分間スパージした。試料3(対照)をスパージせず、下流コンジュゲーションのために薬
物を添加する前に5分間保持した。これらの還元反応後、還元されたタンパク質をvcM
MAEとコンジュゲートし、vcMMAE遊離薬物二量体の存在についてRP-HPLC
によって分析した。
離薬物二量体の存在、低減、または排除について分析した。図5Aに示されるように、T
CEPで還元した反応の場合、vcMMAE遊離薬物二量体不純物は、いずれのガスでの
スパージも受けなかった対照反応に存在し、窒素ガスでスパージした反応及び空気でスパ
ージした反応の両方では不在であった。
物二量体不純物は、いずれのガスでのスパージも受けなかった対照反応に存在し、窒素ガ
スでスパージした反応及び空気でスパージした反応の両方では不在であった。これらの反
応の曲線下面積データを表1に示す。下流コンジュゲーション前の5分間の窒素または空
気でのスパージが、スパージなしの対照試料に対して、遊離薬物二量体種の形成を排除し
た。
ール還元剤DTT及びTCEPの使用を実証する。さらに、このデータは、窒素等の不活
性ガスを使用して得られた結果と同様に、還元反応を空気でスパージすることにより、コ
ンジュゲーション中の遊離薬物二量体の形成が阻止されることを実証する。
または阻止についてのタンパク質の還元反応中のスパージのタイミングの分析について説
明する。
変化させ、遊離薬物二量体ピーク面積をRP-HPLCアッセイによって監視した。バル
ク中間体抗体(抗Ly6E抗体)で単一の90mL還元を行った。開始還元反応へのTC
EPの添加後、このプールを全90分間の還元反応にわたって窒素でスパージした。還元
反応生成物の試料をスパージ開始前ならびにスパージ中に採取し、次いで、各試料をスパ
ージ後にコンジュゲートした。各コンジュゲートされた試料をRP-HPLCアッセイに
よって分析して、形成された遊離薬物(vcMMAE)二量体の量を監視した。図6に示
され、かつ表2に示されるように、遊離薬物二量体ピーク面積は、スパージ時間が増加す
るにつれて減少する。
。これらのデータは、還元開始時のスパージが遊離薬物二量体の形成を有効に低減し、そ
れ故に、このスパージが、同様の結果で、還元反応の最初に、またはその終わり頃に生じ
得ることも実証する。
らの実施例は、本発明を本明細書に開示される形態に限定するようには意図されていない
。その結果、変形及び修正は、本発明の説明の教示に相応するものであり、関連技術の技
能または知識は、本発明の範囲内である。本明細書に提供される実施例に記載の特定の実
施形態は、本発明を実施するために既知の最良の形態をさらに説明するよう、かつ他の当
業者が、かかるまたは他の実施形態において、本発明の特定の用途または使用に必要な様
々な修正を伴って、本発明を利用することを可能にするよう意図されている。添付の特許
請求の範囲が先行技術で認められている範囲内で代替の実施形態を包含するよう解釈され
ることが意図されている。
Claims (121)
- 薬剤の、少なくとも1つのジスルフィド結合及び少なくとも1つのトリスルフィド結合を含むタンパク質中のチオール部分へのコンジュゲーション方法であって、
(a)単離されたタンパク質中の少なくとも1つのスルフィド結合を還元して、反応性スルフィド及び少なくとも1つのチオール基を含む還元されたタンパク質を含む組成物を形成するステップと、
(b)前記組成物中の前記反応性スルフィドの含有量を減少させるステップであって、
(i)ステップ(a)における前記組成物を、前記組成物中の前記反応性スルフィドの含有量を減少させるのに十分な速度で混合すること、又は
(ii)前記組成物を、空気又は窒素ガスの少なくとも1つを含む窒素源と接触させること
を含むステップと、
(c)薬剤を前記還元されたタンパク質の前記少なくとも1つのチオール基にコンジュゲートして、タンパク質-薬剤コンジュゲートを形成するステップと、
を含む、前記方法。 - ステップ(a)が、前記単離されたタンパク質の還元剤との接触による前記少なくとも1つのスルフィド結合の少なくとも部分的な還元を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記単離されたタンパク質が少なくとも4つのジスルフィド結合を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記単離されたタンパク質が少なくとも2つのトリスルフィド結合を含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)前に、前記単離されたタンパク質中の前記スルフィド結合の1%~20%がトリスルフィド結合である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)前に、前記単離されたタンパク質中の前記スルフィド結合の5%~7%がトリスルフィド結合である、請求項5に記載の方法。
- ステップ(a)が非変性条件下で行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)が前記単離されたタンパク質の還元剤との接触を含み、前記還元剤が、ジチオスレイトール(DTT)、ベータ-メルカプトエタノール(βME)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、システイン、L-システイン、還元グルタチオン(GSH)、及びL-GSHのうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記還元剤がTCEPである、請求項8に記載の方法。
- 前記TCEPが、前記単離されたタンパク質に対するTCEPの所定のモル比で前記単離されたタンパク質と混合される、請求項9に記載の方法。
- 前記単離されたタンパク質に対するTCEPの前記所定のモル比が、TCEPのモル過剰を含む、請求項10に記載の方法。
- ステップ(a)が、前記単離されたタンパク質を0.1~8mMの濃度の化学的還元剤と接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)が、pH7.0未満のpHで行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)が、4.5~6.5のpHで行われる、請求項13に記載の方法。
- ステップ(a)が、5.5のpHで行われる、請求項14に記載の方法。
- ステップ(a)が、6.5のpHで行われる、請求項14に記載の方法。
- ステップ(a)前に、前記単離されたタンパク質のpHが、pH5.0~pH8.0のpHに調整される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質中の前記トリスルフィド結合の100%が還元される、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)後に、単離されたタンパク質1モル還元につき4~8モルのチオール部分が、前記薬剤とのコンジュゲーションに利用可能である、請求項1に記載の方法。
- 前記減少ステップが、前記組成物のpHを5.0~6.0のpHに調整することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物のpHがpH5.5に調整される、請求項20に記載の方法。
- 前記減少ステップが、ステップ(a)における前記組成物を、前記組成物中の前記反応性スルフィドの含有量を減少させるのに十分な速度で混合することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記混合が、前記単離されたタンパク質中のスルフィド結合(複数可)の還元にとっての最適混合速度を超える増大した速度で前記組成物を撹拌することを含む、請求項22に記載の方法。
- 増大した速度での前記混合が、ステップ(a)の全反応時間未満の期間にわたってステップ(a)における前記混合速度を増大させることを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記減少ステップが、前記組成物を、空気又は窒素ガスの少なくとも1つを含む窒素源と接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、空気又は窒素ガスを前記組成物に通気させることを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、前記組成物を、空気又は窒素ガスでスパージすることを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、1分間~240分間の期間行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、10立法センチメートル/分~60立法センチメートル/分の速度で、前記組成物を空気又は窒素ガスでスパージすることを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、ステップ(a)にとっての前記最適混合速度を少なくとも200%超える速度で、空気又は窒素ガスの存在下で前記組成物を混合することを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、5.0~8.0のpHで行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、4℃~40℃の温度で行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、15℃~40℃の温度で行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、20℃の温度で行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、30℃の温度で行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記組成物の体積に対する表面積の比率が2である、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、前記組成物を含有する反応容器の側面に対して空気又は窒素ガスをパイプ供給することを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、前記組成物中にスパージストーンを浸すことを含み、前記スパージストーンが、1cm~1メートルの直径を有する、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、ステップ(a)中に、ステップ(a)を行う時間未満の時間にわたって空気又は窒素ガスを前記組成物に導入することを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が閉鎖反応容器内で行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が開放反応容器内で行われ、反応性スルフィドが前記組成物から放出される、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、前記組成物を含有する容器を、空気又は窒素ガスでスパージすることを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記接触が、Tween(登録商標)及び消泡剤のうちの少なくとも1つの存在下で行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記Tween(登録商標)が、Tween(登録商標)-20及びTween(登録商標)-80のうちの少なくとも1つである、請求項43に記載の方法。
- 前記消泡剤が、Antifoam-A、Antifoam-C、及びポロキサマーのうちの少なくとも1つである、請求項43に記載の方法。
- 前記単離されたタンパク質が抗体又は抗体断片である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体断片が抗原結合抗体断片である、請求項46に記載の方法。
- 前記抗体断片が、Fab、Fab’、F(ab)2、Fv断片、ダイアボディ、一本鎖抗体、scFv断片、又はscFv-Fcである、請求項46に記載の方法。
- 前記抗体又は前記抗体断片がIgG抗体である、請求項46に記載の方法。
- 前記抗体又は前記抗体断片がヒトモノクローナル抗体である、請求項46に記載の方法。
- 前記抗体又は前記抗体断片がヒト免疫グロブリン定常領域を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記抗体又は前記抗体断片がヒトIgG定常領域を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記IgG定常領域のアイソタイプが、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4である、請求項52に記載の方法。
- 前記IgG定常領域のアイソタイプがIgG1である、請求項53に記載の方法。
- 前記抗体又は前記抗体断片中のスルフィド結合が、抗体重鎖と抗体軽鎖との間、又は抗体重鎖間、又は抗体重鎖と抗体軽鎖との間及び抗体重鎖間の両方に存在する、請求項46に記載の方法。
- 前記抗体又は前記抗体断片が軽鎖定常ドメインを含む、請求項46に記載の方法。
- 前記軽鎖定常ドメインがカッパ定常ドメインである、請求項56に記載の方法。
- 前記抗体が、重鎖を連結するヒンジ領域内に2つのスルフィド結合、並びに軽鎖と重鎖との間に各々1つのスルフィド結合を含む4つの鎖間スルフィド結合を有するIgG1モノクローナル抗体である、請求項46に記載の方法。
- 前記単離されたタンパク質が抗体であり、ステップ(a)が鎖間ジスルフィド結合のみの還元をもたらし、鎖内結合の還元はもたらさない、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤が、化学療法剤、核酸、サイトカイン、免疫抑制剤、放射性同位体、抗生物質、及び治療抗体から選択される少なくとも1つの治療薬である、請求項1に記載の方法。
- 前記治療薬が化学療法剤である、請求項60に記載の方法。
- 前記化学療法剤が、オーリスタチン、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、及びドラスタチンから選択される少なくとも1つの抗チューブリン剤である、請求項61に記載の方法。
- 前記化学療法剤が、オーリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA副溝アルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、及びビンカアルカロイドのうちの少なくとも1つである、請求項61に記載の方法。
- 前記化学療法剤がドラスタチンである、請求項61に記載の方法。
- 前記ドラスタチンがオーリスタチンである、請求項64に記載の方法。
- 前記オーリスタチンがMMAE又はMMAFである、請求項65に記載の方法。
- 前記薬剤が、前記還元されたタンパク質の前記少なくとも1つのチオール基を前記薬剤に連結するように適合されたリンカー部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、切断可能なリンカーである、請求項67に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、切断不可能なリンカーである、請求項67に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、細胞内条件下で切断可能なリンカーである、請求項67に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーである、請求項67に記載の方法。
- 前記細胞内プロテアーゼが、リソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼである、請求項71に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、ジペプチドリンカーである、請求項67に記載の方法。
- 前記ジペプチドリンカーが、バリン-シトルリン(val-cit)又はフェニルアラニン-リジン(phe-lys)リンカーである、請求項73に記載の方法。
- 前記ジペプチドリンカーが、遊離チオールと反応して共有結合を形成するマレイミド官能基である、請求項73に記載の方法。
- 前記タンパク質-薬剤コンジュゲートが、aCD22-val-cit-MMAE、aCD22-val-cit-MMAF、aLy6E-val-cit-MMAE、aLy6E-val-cit-MMAF、aCD79b-val-cit-MMAE、aCD79b-val-cit-MMAF、aNaPi2b-val-cit-MMAE、aNaPi2b-val-cit-MMAF、aMUC16-val-cit-MMAE、aMUC16-val-cit-MMAF、sSTEAP1、及びaETBRのうちの1つである、請求項1に記載の方法。
- 単離された抗体中のトリスルフィド結合のジスルフィド結合への変換方法であって、
(a)溶液中で、少なくとも1つのトリスルフィド結合を含む少なくとも1つの単離された抗体を、pH5.0~pH8のpHのTCEPで還元するステップであって、前記溶液中で反応性スルフィドが形成されるステップと、
(b)前記溶液を空気又は窒素ガスと接触させるステップであって、前記溶液中の反応性スルフィド含有量を減少させるステップと、
(c)オーリスタチン又はその誘導体を前記還元された抗体にコンジュゲートして、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を形成するステップと、
を含む、前記方法。 - ステップ(a)が、前記単離されたタンパク質を0.5~8mMの濃度の化学的還元剤と接触させることを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記単離されたタンパク質に対するTCEPのモル比が3:1である、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、空気又は窒素ガスを前記溶液に通気させることを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、少なくとも30分間行われる、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、50立法センチメートル/分の速度で、前記溶液を空気又は窒素ガスでスパージすることを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、ステップ(a)にとっての前記最適混合速度を300%超える速度で、前記溶液を空気又は窒素ガスの存在下で混合することを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、5.5~7.5のpHで行われる、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、20℃~30℃の温度で行われる、請求項77に記載の方法。
- 前記溶液の体積に対する表面積の比率が2である、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、前記溶液を含有する反応容器の側面に対して空気又は窒素ガスをパイプ供給することを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、前記溶液中にスパージストーンを浸すことを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、空気又は窒素ガスを前記溶液に30分間導入することを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が閉鎖反応容器内で行われる、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が開放反応容器内で行われ、硫化水素が前記溶液から放出される、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、前記溶液を含有する容器を空気又は窒素ガスでスパージすることを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記接触が、Tween(登録商標)及び消泡剤のうちの少なくとも1つの存在下で行われる、請求項77に記載の方法。
- 前記Tween(登録商標)が、Tween(登録商標)-20及びTween(登録商標)-80のうちの少なくとも1つである、請求項93に記載の方法。
- 前記消泡剤が、Antifoam-A、Antifoam-C、及びポロキサマーのうちの少なくとも1つである、請求項93に記載の方法。
- 前記抗体が抗体断片である、請求項77に記載の方法。
- 前記抗体断片が抗原結合抗体断片である、請求項96に記載の方法。
- 前記抗体断片が、Fab、Fab’、F(ab)2、Fv断片、ダイアボディ、一本鎖抗体、scFv断片、又はscFv-Fcである、請求項96に記載の方法。
- 前記抗体がIgG抗体である、請求項77に記載の方法。
- 前記抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項77に記載の方法。
- 前記抗体がヒト免疫グロブリン定常領域を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記抗体がヒトIgG定常領域を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記IgG定常領域のアイソタイプが、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4である、請求項102に記載の方法。
- 前記IgG定常領域のアイソタイプがIgG1である、請求項102に記載の方法。
- 前記抗体中のスルフィド結合が、抗体重鎖と抗体軽鎖との間、又は抗体重鎖間、又は抗体重鎖と軽鎖抗体との間及び抗体重鎖間の両方に存在する、請求項77に記載の方法。
- 前記抗体が軽鎖定常ドメインを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記軽鎖定常ドメインがカッパ定常ドメインである、請求項106に記載の方法。
- 前記抗体が、重鎖を連結するヒンジ領域内に2つのスルフィド結合、並びに軽鎖と重鎖との間に各々1つのスルフィド結合を含む4つの鎖間スルフィド結合を有するIgG1モノクローナル抗体である、請求項77に記載の方法。
- ステップ(a)が鎖間ジスルフィド結合のみを還元し、鎖内結合は還元しない、請求項77に記載の方法。
- 前記オーリスタチンがMMAE又はMMAFである、請求項77に記載の方法。
- 前記薬物が、前記抗体の前記少なくとも1つのチオール基を前記薬物に連結するように適合されたリンカー部分を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、切断可能なリンカーである、請求項111に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、切断不可能なリンカーである、請求項111に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、細胞内条件下で切断可能なリンカーである、請求項111に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーである、請求項111に記載の方法。
- 前記細胞内プロテアーゼが、リソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼである、請求項115に記載の方法。
- 前記リンカー部分が、ジペプチドリンカーである、請求項111に記載の方法。
- 前記ジペプチドリンカーが、バリン-シトルリン(val-cit)又はフェニルアラニン-リジン(phe-lys)リンカーである、請求項117に記載の方法。
- 前記ジペプチドリンカーが、遊離チオールと反応して共有結合を形成するマレイミド官能基である、請求項117に記載の方法。
- 前記オーリスタチンの二量体又はその誘導体が、前記コンジュゲートステップで形成され、前記方法が、前記ADCを前記二量体から分離して、精製されたADCを形成することをさらに含む、請求項77に記載の方法。
- 前記ADCが、aCD22-val-cit-MMAE、aCD22-val-cit-MMAF、aLy6E-val-cit-MMAE、aLy6E-val-cit-MMAF、aCD79b-val-cit-MMAE、aCD79b-val-cit-MMAF、aNaPi2b-val-cit-MMAE、aNaPi2b-val-cit-MMAF、aMUC16-val-cit-MMAE、aMUC16-val-cit-MMAF、sSTEAP1、及びaETBRのうちの1つである、請求項77に記載の方法。
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