CN113747912A

CN113747912A - 重组ccn结构域蛋白和融合蛋白

Info

Publication number: CN113747912A
Application number: CN202080023396.5A
Authority: CN
Inventors: 阿瓦尔·阿特拉马达; 奥勒·约根·卡斯博尔
Original assignee: Oslo Universitetssykehus hf
Current assignee: Oslo Universitetssykehus hf
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-12-03
Also published as: SG11202109738QA; WO2020188081A1; JP2022525661A; EP3711772A1; IL285930A; US20220144903A1; CA3133740A1; MX2021011407A; EP3941507A1; BR112021017147A2; AU2020243073A1; KR20210142681A

Abstract

本发明涉及具有对应于CCN家族蛋白成员的血小板应答蛋白1型重复同源结构域或与其相关的氨基酸序列的重组蛋白及其用途。此外，本发明涉及这样的融合蛋白，其包含与融合配偶体和任选的接头区组合的对应于CCN家族蛋白成员的血小板应答蛋白1型重复同源结构域或与其相关的氨基酸序列。此外，本文中公开了新的蛋白酶抗性Fc片段。

Description

重组CCN结构域蛋白和融合蛋白

技术领域

本发明涉及具有对应于CCN家族蛋白成员的血小板应答蛋白1型重复同源结构域(结构域III)或与其相关的氨基酸序列的重组蛋白及其用途，特别地包括被截短和/或包含某些氨基酸修饰的这样的蛋白质。此外，本发明涉及这样的融合蛋白，其包含任选地通过接头肽与融合配偶体组合的对应于CCN家族蛋白成员的血小板应答蛋白1型重复同源结构域或与其相关的氨基酸序列。特别地，融合配偶体是单体蛋白，并且融合蛋白是单体的。

此外，本文中公开了新的蛋白酶抗性Fc片段。

背景技术

CCN蛋白是分泌糖蛋白家族之一。CCN最初是作为来源于基因家族前三个已确定成员的首字母缩写词而创造的；Cyr61、CTGF和NOV。然而，该首字母缩写词最近被改编为Cellular Communication Network(细胞通讯网络)因子的缩写，并由HUGO基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee)批准(Perbal B，Tweedie S and Bruford E，JCell Commun Signal.2019Sep；13(3)：435)。所述蛋白质通常被归类为与胞外基质(extracellular matrix，ECM)相关的基质细胞蛋白质。CCN蛋白不是将细胞组织成组织的支架功能的一部分，而是被认为是信号传导蛋白，并且可用作独立的自分泌或旁分泌的信号传导因子，或作为其他胞外信号传导蛋白的修饰物。连同三种Wnt可诱导信号传导途径蛋白(WISP1/CCN4、WISP2/CCN5和WISP3/CCN6)的组，它们包含哺乳动物中六种同源的富含半胱氨酸的蛋白质的家族，所述蛋白质已更名为CCN1至6。

CCN家族的初始成员共享模块化结构，具有用于分泌的N端肽信号，随后为四个保守结构域。第一结构域显示出与胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growthfactor binding protein，IGFBP)的序列同源性，并因此被称为IGF结合蛋白同源结构域，但是对IGF仅具有可忽略不计的亲和力。第二结构域被称为冯维勒布兰德因子C型重复(VWC)同源结构域，常见于胞外基质(ECM)蛋白中。第三结构域被称为血小板应答蛋白I型重复同源结构域(TSP-1)，其可参与CCN蛋白与整联蛋白的连接。第四结构域是富含半胱氨酸的C端重复或胱氨酸结(cystine knot)同源结构域，即被报道结合肝素的结构域。CCN蛋白家族的第5成员，WISP2(Wnt1可诱导信号传导途径蛋白2(Wnt1-inducible signalingpathway protein 2))(也称为CCN5)在缺失羧基端胱氨酸结结构域(结构域4)方面是非典型的。CCN蛋白家族的TSP-1同源结构域共享34％的氨基酸序列同一性和25％的序列相似性(如通过ClustalOmega所分析的，参见下文以供参考)。四结构域CCN蛋白在整个一级序列中包含38个保守的半胱氨酸，而CCN6除外，其中VWC同源结构域的4个半胱氨酸在其他家族成员中不保守。此外，对于缺失羧基端胱氨酸结同源结构域的CCN5，与其他CCN家族成员相比，IGFBP、VWC和TSP-1同源结构域的所有半胱氨酸均是保守的。

非保守的、蛋白酶敏感性中心区(通常称为铰链区)将蛋白质一分为二。CCN蛋白的表达响应于环境刺激的变化在转录、转录后和翻译水平上受到调节。

有关CCN蛋白家族结构域组织的信息见于例如Liu et al，2017，Journal ofDiabetes，9，pp.462-474中。

在细胞水平上，CCN蛋白在胞外基质与细胞表面的界面上可具有多种调节作用。CCN蛋白可调节细胞黏附、迁移、增殖、分化、凋亡、存活、衰老和基因表达。通过以细胞类型特异性方式调节这些细胞功能的一个或更多个方面，CCN协调复杂的生物过程，包括胚胎发生期间的心血管和骨发育，以及成体的炎症、伤口愈合以及组织损伤和修复。一般而言，4结构域CCN 1至4和CCN6(特别是CCN1、CCN2和CCN4)可发挥促纤维化活性，然而仅包含3结构域I至III的CCN5具有抗纤维化活性。

CCN蛋白还参与广泛多样的病理状况，例如由于进行性纤维化引起的器官衰竭，例如肝纤维化和特发性肺纤维化，以及参与癌症侵袭和转移。在这方面参考Jun和Lau，2011，Nat.Rev.Drug.Discovery，10(12)，pp.945-963。同样，一般而言，已表明4结构域CCN蛋白，特别是CCN2与多种纤维化疾病的机制有关，然而在这样的疾病的临床前疾病模型中，相反地表明，CCN5水平提高可以是有益的。

在

et al.，J.Biol.Chem，293：46，pp.17953-17970中，报道了结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)(也称为CCN2)作为需要蛋白水解切割来释放具有生物活性的CCN2的无活性的前蛋白原来合成和分泌，以及包含结构域III至IV的C端片段的同二聚体代表了CCN2的生物完全活性形式，以及最后，CCN2的所有主要报道的活性均可由C端结构域III至IV片段的同二聚体概括。

et al.报道的活性测定揭示了未经加工的全长CCN2和包含结构域I至II的N端片段均没有生物活性。此外，发现基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)活性对全长CCN2的蛋白水解加工释放了其潜在活性。总的来说，

et al.报道的发现意味着prepro-CCN2被N端结构域I和II自动抑制。还发现CCN1和CCN3的C端结构域III和IV片段足以激活快速细胞信号传导并引发细胞生理响应。然而，释放生物活性所需的CCN1和/或CCN3或任何其他CCN蛋白家族成员的铰链区的内肽酶切割为何种程度是未知的。

已知CCN2在发育期间、在涉及增强的纤维发生和组织纤维化的多种病理状况中以及在数种癌症中高度表达(Jun和Lau，2011，同上)。CCN蛋白参与广泛多样的病理状况的事实是胞外蛋白在机制上参与纤维化发展，并且在健康生物体中显示出表达有限，这使得它们成为有吸引力的治疗靶标。

Jeong et al.，2016，J.American College of Cardiology，67：13，pp.1557-1568报道了这样的研究，该研究在对心脏进行实验诱发的压力超负荷之后检查了腺相关病毒介导的CCN5基因转移至鼠心脏的作用。该研究得出以下结论：CCN5可通过在心肌中抑制肌成纤维细胞的产生和增强其凋亡来逆转已建立的心脏纤维化，表明CCN5可提供用于开发抗心脏纤维化治疗的平台。

在US2008/0207489中，公开了用于治疗基于平滑肌增殖的病症的方法，其包括CCN5的表达或将CCN5蛋白施用至平滑肌细胞。

在EP 2 556 839中，提供了包含含有编码全长CCN5或CCN2ΔCT的核苷酸序列的遗传载体的组合物，以及提出了其在治疗心力衰竭中的作用。EP 2 556 839中的CCN2ΔCT被限定为K251(uniprot编号)之后被截短的CCN2的氨基酸序列。

尽管在一些实验体系中已经报道了CCN5的过表达导致与CCN2过表达的表型相反的表型(Jeong et al.，同上，Yoon et al.，J Mol Cell Cardiol，49(2)，294-303 Aug2010)，但是据作者所知，尚未报道CCN5对四结构域CCN蛋白的直接拮抗作用。特别地，在本发明呈现的工作之前，CCN5/WISP2介导的其他CCN家族成员拮抗作用的结构基础是未知的。

本发明人在较早阶段已经表明全长CCN2(FL-CCN2)是前蛋白原，无活性前体，以及包含结构域III和IV的片段显示传达了CCN2的所有生物相关活性。一般CCN蛋白在何种程度上作为需要蛋白水解激活的无活性前蛋白原分泌仍然未知。然而，全长CCN蛋白对多种蛋白酶的易感性，如本发明人(

et al.，J.Biol.Chem.(2018)293(46)17953-17970)和其他人(Butler，G.S.et al.MatrixBiol 59，23-38(2017)和Guillon-Munos，A.et al.JBiol Chem 286，25505-25518(2011))所表明的，暗示未经修饰的全长CCN蛋白由于在重组蛋白制造期间和体内施用之后这两个阶段的稳定性的原因将非常不适合作为药物。使用未经修饰的全长CCN蛋白作为治疗性蛋白质的这种不适合性也适用于全长CCN蛋白的融合蛋白，例如如针对全长CCN1(Schutze，N.et al.(2005)Protein Expr Purif 42，219-225)和全长CCN6(Schutze，N et al.(2007)BMC Cell Biol 8，45)所述的。在CCN蛋白领域公知地，这些蛋白质对蛋白水解的易感性是很难产生重组CCN蛋白的原因之一。此外，基于

et al.(J Biol Chem 2018；293(46)：17953-17970)的新发现，重组全长CCN蛋白可以是远非理想的生物药物，因为其活性可取决于先前的蛋白水解加工，从而使得在药代动力学和药效学上不可预测。此外，在Fc融合蛋白的情况下，除了组分(例如肽接头、CCN片段和Fc片段)的蛋白水解易感性之外，组分的布置也已被表明对重组融合蛋白的效力和效能是重要的。其中一个实例是本发明人发表的论文(

et al.(2018))，其中发现含有CCN2的结构域III至IV的Fc融合蛋白的变体以预先不易预测的方式具有广泛变化的活性。

报道了CCN蛋白的作用对拮抗来源于CCN蛋白的一级序列的高浓度合成肽的作用易感。一个实例是来源于CCN2的结构域I(IGFBP同源结构域)的肽以及在较小程度上来源于CCN2的结构域III(TSP-1重复同源结构域)的肽在Rat2成纤维细胞中对通过重组CCN2刺激的AKT磷酸化的抑制(Moe et al.，J.CellCommun.Signal.(2013)7：31-47)。另一个实例是来源于CCN2的结构域IV(胱氨酸结同源结构域)的肽对肝星形细胞的经CCN2(结构域IV)刺激的黏附的抑制(Gao R和Brigstock DR.，J Biol Chem.2004 Mar 5；279(10)：8848-55)。此外，已报道了来自CCN1的结构域III的肽(Leu et al.J.Biol.Chem，2003，Vol.278，No.36，Issue of September 5，pp.33801-33808，2003)和CCN1、CCN2、CCN3、CCN5和CCN6的结构域III的肽(Karagiannis EG和Popel The International Journal ofBiochemistry&Cell Biology 39(2007)2314-2323)在用HUVEC细胞进行的体外测定中具有一些抗血管生成作用(Leu et al.J.Biol.Chem，2003和Karagiannis EG和Popel，Int JBiochem Cell Biol 39(2007))以及对1064SK人包皮成纤维细胞具有抗黏附作用(Leu etal.J.Biol.Chem，2003)，这些肽仅含有一个保守的半胱氨酸(Leu et al.J.Biol.Chem，2003)或两个保守的半胱氨酸(Karagiannis EG和Popel，Int J Biochem Cell Biol 39，2007)，其是本文件中描述的本发明的核心。已知CCN蛋白的结构域III中的半胱氨酸会产生二硫桥，如来自HUVEC细胞内源性表达的CCN2(Lu，S et al.(2015)Nat methods 12，329-331)和来自纯化的重组CCN2(

et al.，J.Biol.Chem.2018)中所显示的。CCN2中显示的跨C199至C228(uniprot编号)的二硫桥赋予其中氨基酸链向自身折叠的复杂的3D结构。这意味着不能预期CCN蛋白的完整结构域III由在结构上不受半胱氨酸之间的二硫桥限制的短肽复制，如在真核系统中产生的CCN蛋白的完整结构域III中。此外，来源于结构域I、III和IV的一级序列的肽对CCN2活性的抑制举例说明了本领域缺乏关于来源于CCN2的特定结构域的肽是否可赋予对四结构域CCN蛋白的抑制的知识。

本发明人现在基于对CCN家族蛋白的结构-活性分析和对CCN2需要进行蛋白水解加工以变得具有生物活性的观察发现，CCN5蛋白的生物活性部分是结构域III，即血小板应答蛋白I型重复同源结构域。这种新知识导致提供了基于CCN5的结构域III以及CCN蛋白家族其他成员的结构域III的生物活性结构。

发明概述

本发明人对CCN5和其他CCN蛋白的结构-活性关系的洞察导致提供了新的具有生物活性的重组蛋白，其概括了归因于CCN5信号传导的细胞信号传导和细胞生理功能，并且其还可对抗其他四结构域CCN蛋白(Cyr61(也称为CCN1)、CTGF(也称为CCN2)、NOV(也称为CCN3)、WISP1(也称为CCN4)和WISP3(也称为CCN6))。换言之，提供了包含基于CCN蛋白的结构域III(TSP-1同源结构域)的融合蛋白的形式的蛋白质，其概括了CCN5的生物活性或其具有CCN5的生物活性，并且其能够拮抗或抑制4结构域CCN蛋白CCN1至4或CCN6的作用。特别地，本文中的蛋白质具有抗纤维化活性并且还可具有直接的抗癌活性。

如上所述，其他CCN蛋白(即4结构域CCN蛋白)的结构域III(TSP-1同源结构域)当在不存在其他CCN结构域的情况下作为单独的结构域提供时，出乎意料地被发现足以概括CCN5所报道的活性。因此，换言之，4结构域CCN蛋白的结构域III当在不存在其他CCN结构域的情况下作为单独的结构域(即作为分离的结构域)提供时，具有与CCN5相同的活性，或者作为替代地，作为CNN5的结构域III/TSP-1同源结构域表达(其是与全长4结构域CCN蛋白的活性相反的活性)。因此，根据本文件中公开的实验，清楚地是任何CCN蛋白的分离的TSP-1同源结构域均可发挥与CCN5的TSP-1同源结构域的活性相同的活性。除了在CCN5的情况下，这可与由全长CCN蛋白发挥的活性不同。

已经发现，根据本发明和本文中的公开内容，其中CCN蛋白的结构域III与单体融合配偶体融合的单体融合蛋白具有特别的益处和效用。

根据第一方面，本发明提供了单体融合蛋白，其包含：

(i)对应于CCN家族蛋白的血小板应答蛋白1型重复(TSP-1)同源结构域的至少一部分的多肽；

(ii)在N端或C端与(i)的氨基酸序列融合的单体融合配偶体；以及

(iii)任选地在(i)的多肽与(ii)的单体融合配偶体之间的肽接头，

其中(i)的多肽的长度为40至60个氨基酸并且包含以下：选自SEQ ID NO：37或2至6的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：37或2至6的序列具有至少80％序列同一性的序列，其中选自SEQ ID NO：37或2至6的所述序列中的所有半胱氨酸残基均是保守的，

并且其中(ii)的所述单体融合配偶体和(iii)的所述肽接头不是以下或不包含以下：CCN家族蛋白的IGF结合蛋白同源结构域、冯维勒布兰德因子C型重复同源结构域或半胱氨酸结结构域。

如下文将更详细地描述的，SEQ ID NO.37和2至6分别表示CCN5、CCN3、CCN2、CCN1、CCN4和CCN6的结构域III的44个氨基酸截短片段，其包含该结构域的6个保守半胱氨酸残基。特别地，片段的侧翼是结构域的第一和最后一个半胱氨酸残基。已经发现这样的片段是特别有效的并且对蛋白水解降解具有抗性。

在一个实施方案中，(i)的所述多肽包含以下或由以下组成：

(a)选自SEQ ID NO：1或8至12的氨基酸序列；或者

(b)与选自SEQ ID NO：1或8至12的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；或者

(c)(a)或(b)的氨基酸序列的一部分，其中所述部分分别包含SEQ ID NO：37、6、2、3、4或5的至少44个氨基酸序列，或者分别包含与选自SEQ ID NO：37、6、2、3、4或5的序列具有至少80％序列同一性的序列。

SEQ ID NO.1和8至12分别表示CCN5、CCN6、CCN3、CCN2、CCN1和CCN4的结构域III的略微更长的N端截短片段。这些片段分别包含SEQ ID NO.37、6、2、3、4和5的对应序列，以及来自相应结构域III的一些另外的C端序列。

在另一个实施方案中，(i)的所述多肽在对应于选自SEQ ID NO：37或2至6、或SEQID NO：1或8至12的所述序列的第2位的位置处包含丙氨酸残基。在一些实施方案中，(i)的氨基酸序列包含以下：选自SEQ ID NO：38或42至46的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，(i)的氨基酸序列包含以下：选自SEQ IDNO：7、或47至51的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在这方面已经发现，在第2位处该残基的替换有益于促进蛋白质的稳定性。

根据本发明的另一个方面，单体融合蛋白具有以下：选自SEQ ID NO：84、85、88、89、97、98、102、103、106、107、110、111的氨基酸序列，或与其具有80％序列同一性的氨基酸序列。

在这些方面的一些实施方案中，单体融合配偶体选自血清白蛋白、转铁蛋白和单体Fc片段，特别是IgG的单体Fc片段，更特别是人IgG的单体Fc片段。

如上所述，本文中结构域III片段的第2位的替换提高了片段的稳定性，特别是对蛋白酶降解的抗性。本文中认为并提出，结构域III片段的这样的经序列修饰变体代表本身可用的蛋白质，而无需与融合配偶体连接。

因此，本发明的另一个方面还提供了长度为40至60个氨基酸的包含以下的蛋白质或者由以下组成的蛋白质：SEQ ID NO：7、38、42至46或47至51中所示的氨基酸序列或者与其具有至少80％序列同一性的序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO：7、38、42至46、47至51的所述序列的第2位的位置处包含丙氨酸残基，并且其中所述序列中的所有半胱氨酸残基均是保守的。

还提供了另一些蛋白质和融合蛋白作为本发明的另一些方面，如下详述。

根据本发明的另一个方面，提供了包含式(I)的重组蛋白

Cys-A-Cys-B-Cys-C-Cys-D-Cys-E-Cys-F(式(I))

其中：

A是式II的肽

A1-A2-A3-A5-A6-A7-A8-A9

其中A1选自P、A、V、I和L；A2选自E、D、A、I、L和V；A3选自G、Q、Y、S、N、W、F；A4选自A、I、L、V、S、T；A5是选自T、Y、N、G、Q和S的氨基酸；A6是选自A、V、I、L、P、S、E、D、K、R和H的氨基酸；A7是W；A8选自G、T、S、Q、Y、N、P、A、V、I和L；A9是选自A、P、L、I、V、Q的氨基酸；并且

B是式III的肽

B1-B2-B3

其中B1是选自G、Q、N、S、Y和T的氨基酸；B2是选自T、S、N、F、Q、H、R和K的氨基酸；B3是选自G、Q、N、S、Y、T的氨基酸；其中B1至B3之一不存在；并且

C是式IV的肽

C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12-C13-C14

其中C1是选自G、Q、N、S、Y和T的氨基酸；C2是选自K、R、H、M、T、S、A、L、I和V的氨基酸；C3是选自G、Q、N、S、Y和T的氨基酸；C4是选自M、F、A、I、L、V和W的氨基酸；C5是选自G、Q、N、S、T、Y、A、I、L和V的氨基酸；C6是选自G、Q、N、S和T的氨基酸；C7是选自H、R和L的氨基酸；C8是选自A、L、I和V的氨基酸；C9是选自G、Q、N、S、T和Y的氨基酸；C10是选自G、Q、N、S、T、Y(优选N)的氨基酸；C11是选自V、P、A、I、L、G、Q、N、S、T、Y、R、K、D和E的氨基酸；C12是选自G、Q、N、S、Y和T的氨基酸；C13是选自H、K、R、A、L、I、V、P、G、Q、N、S、Y和T的氨基酸；C14是选自F、P、W、G、Q、N、S、Y、T、E和D的氨基酸；并且

D是式V的肽

D1-D2-D3-D4-D5-D6-D7-D8

其中D1是选自R、K、H、D、E、W、P的氨基酸；D2是选自P、A、L、I、V、M、W、D和E的氨基酸；D3是选自D、E、A、L、I、V、R、K和H的氨基酸；D4是选自G、Q、S、Y、T、R、L、K和H的氨基酸；D5是选自G、Q、N、S、Y、T、D和E的氨基酸；D6是选自H、R、K、G、Q、N、S、Y和T的氨基酸；D7是选自L、H和R的氨基酸；D8是选自A、L、I和V的氨基酸；并且

E是式VI的肽

E1-E2-E3-E4

其中E1是选自P、A、L、I、V、M、W、G、Q、N、S、T、Y、D和E的氨基酸；E2是选自P、A、L、I、V、M、W、G、Q、N、S、T、Y的氨基酸；E3是选自R、K、H、G、Q、N、S、T和Y的氨基酸；E4是选自P、A、L、I和V的氨基酸；F不存在或是多至约13个氨基酸的氨基酸序列，

其中重组蛋白包含40至60个氨基酸。

根据以上方面的一个实施方案，提供了式(I)的重组蛋白，其中：

A1选自P、I和L；A2选自E、V和A；A3选自W、Q和Y；A4选自S、T和A；A5是选自T和S的氨基酸；A6是选自A、E、P、S和K的氨基酸；A7是W；A8选自G、S和T；A9是选自P、Q和A的氨基酸；并且

B1是丝氨酸(S)；B2是选自T、K和R的氨基酸；B3是选自T和S的氨基酸；并且

C1是氨基酸G；C2是选自T、L和M的氨基酸；C3是G；C4是选自M、F、I和V的氨基酸；C5是选自S和A的氨基酸；C6是选自T和N的氨基酸；C7是R；C8是选自V和I的氨基酸；C9是选自S和T的氨基酸；C10是天冬酰胺N；C11是选自Q、R、D、V和E的氨基酸；C12是天冬酰胺N；C13是选自R、A、P和S的氨基酸；C14是选自F、Q、S、E和N的氨基酸；并且

D1是选自R、E和W的氨基酸；D2是选自L、M和P的氨基酸；D3是选自E、L、V和R的氨基酸；D4是选自T、K和Q的氨基酸；D5是选自Q和E的氨基酸；D6是选自R、T、S和K的氨基酸；D7是精氨酸(R)；D8是选自L和I的氨基酸；并且

E1是选自L、M、E、N和Y的氨基酸；E2是选自S、V、L和I的氨基酸；E3是选自Q和R的氨基酸；E4是P；F不存在或是多至13个氨基酸并目包含选自以下的氨基酸序列的肽：PPSRGRSPQNSAF，GQPVYSSL，EADLEEN，EQEPEQPTD，DVDIHTLI，和DSNILKTIKIP，

其中重组蛋白总共包含44至57个氨基酸。

根据以上方面的又一个实施方案，提供了式I的重组蛋白，其中F完全不存在、部分不存在或是包含PPSRGRSPQNSAF的氨基酸序列的约13个氨基酸的肽。

更特别地，提供了重组蛋白，其中所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.38；及其与以下氨基酸序列具有高于50％序列同一性的变体或片段：SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.38。

根据本发明的另一个方面，提供了如上限定的重组蛋白，其中所述蛋白质是聚乙二醇化的。

根据另一个方面，本发明提供了融合蛋白，其包含

(i)CCN家族蛋白的血小板应答蛋白1型重复(TSP-1)同源结构域；

(ii)在N端或C端与(i)的所述TSP-1重复同源结构域融合的融合配偶体，并且其中所述融合配偶体选自血清白蛋白、转铁蛋白和人IgG的Fc片段；

(iii)任选地在TSP-1重复同源结构域与Fc片段(在N端或C端与(i)的所述TSP-1重复同源结构域融合)之间的肽接头。

根据以上方面的一个实施方案，提供了包含如上所述的根据本发明的重组蛋白的融合蛋白作为本发明的另一个方面。

根据本发明的融合蛋白的融合配偶体根据一个实施方案选自IgG1、IgG2或IgG4的Fc片段、血清白蛋白和转铁蛋白。

根据另一个实施方案，提供了融合蛋白，其中融合配偶体(ii)是包含稳定性二硫桥的IgG1、IgG2或IgG4的Fc片段。这样的突变可提高蛋白质的热稳定性。稳定性突变是已知的并且在本领域中已有报道。

根据又一个实施方案，提供了融合蛋白，其中融合配偶体(ii)是IgG1、IgG2或IgG4的包含选自以下的一个或更多个突变的Fc片段：S228P(涉及IgG4)、E233P(涉及IgG1和IgG4)、F234A(涉及IgG4)、L234A(涉及IgG1)、L234V(涉及IgG1)、F234V(涉及IgG4)、L235A(涉及IgG1和IgG4)、ΔG236(涉及IgG1和IgG4))和ΔK447(涉及IgG1、IgG2和IgG4)。

根据另一个实施方案，融合蛋白可包含选自以下的Fc片段：SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和SEQ ID No.19。

根据另一个实施方案，融合蛋白包含选自以下的接头：SEQ ID No.20、SEQ IDNo.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25和SEQ ID No.39。

根据一个实施方案，接头包含氨基酸序列(EAAAK)n，其中n为至少4，优选n为8。

根据另一个实施方案，融合蛋白包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.40和SEQ ID No.41。

根据另一个实施方案，(ii)的融合配偶体是血清白蛋白。

根据本发明第二方面的另一个实施方案，(ii)的融合配偶体是转铁蛋白。

此外，根据又一个方面，本发明提供了编码根据本发明的重组蛋白、蛋白质或融合蛋白的核酸分子(例如DNA)。

根据该方面的一个实施方案，提供了包含以下的DNA序列：SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36或者SEQ ID NO：86、87、90、91、99、100、104、105、108、109、112或113中所示的核酸序列，和与SEQ ID NO.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36或者SEQ ID NO：86、87、90、91、99、100、104、105、108、109、112或113具有约80％序列同一性的核酸序列。

此外，根据本发明的另一个方面，提供了包含根据本发明的DNA序列的表达载体。还提供了包含根据本发明的表达载体的宿主细胞。

最后，提供了如上限定的CCN家族蛋白、蛋白质和融合蛋白的血小板应答蛋白1型重复(TSP-1)同源结构域，其用作通过抑制或对抗归因于四结构域CCN家族蛋白的细胞信号传导和细胞生理功能来治疗或预防病症而提供的药物。

在一个方面中，提供了本文中限定的融合蛋白或蛋白质，其用于治疗。

融合蛋白或蛋白质可用于治疗与4结构域CCN蛋白的活性，特别是4结构域CCN蛋白的不期望的或异常的活性相关的病症。该活性可与纤维化作用相关。该活性可以是促纤维化活性。

在另一个方面中，提供了本文中限定的融合蛋白或蛋白质，其用于治疗或预防纤维化或表现出纤维化的任何病症(即纤维化病症或疾病)。在另一个方面中，提供了本文中限定的融合蛋白或蛋白质，其用于治疗癌症。还提供了本文中限定的融合蛋白或蛋白质，其用于治疗炎性疾病或自身免疫病或代谢病。

根据本发明的这样的方面，还提供了本文中限定的蛋白质或融合蛋白用于制造用于治疗或预防本文中定义或描述的病症或疾病的药物的用途。

这样的方面还包括包含本文中限定的蛋白质或融合蛋白的组合物(例如药物组合物)，其用于治疗或预防本文中定义或描述的病症或疾病。

这样的方面还包括治疗或预防本文中定义或描述的病症或疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用本文中限定的蛋白质或融合蛋白，特别是有效量的所述蛋白质或融合蛋白。

附图

图1示出了CCN5(dIII)-Fcv2(序列SEQ ID No.28中限定的本发明的一个实施方案)的细胞生理学和细胞信号传导。

A)示出了SEQ ID No.28的CCN5(dIII)-Fcv2融合蛋白在A549肺癌细胞中导致对Akt(丝氨酸-473)磷酸化的浓度依赖性抑制。

B)示出了SEQ ID.No.28的CCN5(dIII)-Fcv2融合蛋白在人肺成纤维细胞细胞系IMR90中抑制增殖。

C)示出了SEQ ID No.28的CCN5(dIII)-Fcv2融合蛋白抑制雌激素受体阳性乳腺癌细胞系MCF-7和三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的球体形成能力(锚定非依赖性生长(archorage-independent growth))。

D)示出了SEQ ID No.28的CCN5(dIII)-Fcv2融合蛋白剂量依赖性地抑制TGF-β诱导的SMAD报道物活性(SMAD蛋白是典型的TGF-β调节性转录因子)。

所有误差棒均示出SD。通过单因素ANOVA和Dunnetts事后检验来计算统计学显著性(p＜0.05，由*表示)。

图2示出了Fc片段铰链区的不同变体对其中CCN5(dIII)与IgG的Fc片段融合的本发明一些实施方案的蛋白酶易感性的作用，其中受试融合蛋白包含SEQ ID No.28、SEQ IDNo.29和SEQ ID No.30中分别示出的序列，参见下文实施例6。

图3示出了本发明的一个实施方案的聚集倾向，其取决于连接CCN5(dIII)与IgG的Fc片段的肽接头的结构，其中受试融合蛋白包含SEQ ID No.30和SEQ ID No.31中所示的序列。

图4示出了根据本发明的融合蛋白，其包含在C端与肽接头连接并且经由Fc铰链与Fc片段连接的TSP-1重复同源结构域。

图5示出了相对于CCN5 TSP-1重复同源结构域的野生型P195变体(Fc-HLn8-CCN5(dIII)，SEQ ID No.40)，当本发明的实施方案并入SEQ ID No 7中所示的CCN5 TSP-1重复同源结构域的脯氨酸195的突变(Fc-HLn8-CCN5(dIII)-P195A，SEQ ID No.41)时对内肽酶切割的易感性降低。

图6示出了通过蛋白A捕获色谱纯化的对应于SEQ ID NO：58的蛋白质的产生。可以看出，在不存在还原剂β-巯基乙醇(-泳道)的情况下存在二聚体。然而，在存在β-巯基乙醇(+泳道)的情况下，可以看出初级产物是包含仅Fc片段的切割片段，而不是包含所有的由SEQ ID NO：58编码的部分的完整融合蛋白(TSP-1同源结构域片段、肽接头和Fc片段)。

图7示出了通过蛋白A捕获色谱纯化的具有截短的C端尾的对应于SEQ ID NO：27的蛋白质的产生。可以看出，与包含具有C端尾的对应于SEQ ID NO：58的蛋白质相比，所述蛋白质对蛋白酶降解具有显著更强的抗性。

图8示出了通过蛋白A捕获色谱纯化的类似于对应于SEQ ID NO：27的蛋白质之对应于SEQ ID NO：73的蛋白质的产生。再次，可以看出在存在β-巯基乙醇(+泳道)的情况下，与对应于SEQ ID NO：58的蛋白质相比，所述蛋白质对蛋白酶降解更具抗性。

图9示出了在施用不同浓度的在经稳定转染的细胞中产生的对应于SEQ ID NO：41的蛋白质之后在A549肺癌细胞中测量磷酸化AKT(Ser-473)水平的测定的结果。可以看出该蛋白质对AKT的磷酸化没有抑制作用。

图10示出了在施用不同浓度的在经稳定转染的细胞中产生的对应于SEQ ID NO：80的蛋白质之后在A549肺癌细胞中测量磷酸化AKT(Ser-473)水平的测定的结果。可以看出，该蛋白质对AKT的磷酸化未显示出显著的抑制作用，并且实际上甚至可导致在更高浓度下的磷酸化AKT提高。

图11示出了在施用不同浓度的在经瞬时转染的细胞中产生的对应于SEQ ID NO：80的蛋白质之后在A549肺癌细胞中测量磷酸化AKT(Ser-473)水平的测定的结果。可以看出，当在经瞬时转染的细胞中产生时，所述蛋白质对AKT的磷酸化具有浓度依赖性抑制活性。

图12示出了在施用不同浓度的对应于SEQ ID NO：84、94和106的蛋白质之后在A549肺癌细胞中测量磷酸化AKT(Ser-473)水平的测定的结果。可以看出这些蛋白质中的每一种对AKT的磷酸化均具有浓度依赖性抑制活性。

图13示出了在施用不同浓度的对应于SEQ ID NO：88的蛋白质之后在A549肺癌细胞中测量磷酸化AKT(Ser-473)水平的测定的结果。可以看出，该蛋白质能够以高于10ug/ml的浓度抑制AKT的磷酸化。

图14示出了在施用不同浓度的对应于SEQ ID NO：102和97的蛋白质之后在A549肺癌细胞中测量磷酸化AKT(Ser-473)水平的测定的结果。可以看出，这两种蛋白质对AKT的磷酸化均具有浓度依赖性抑制活性。

图15示出了在施用不同浓度的对应于SEQ ID NO：110的蛋白质之后在A549肺癌细胞中测量磷酸化AKT水平的测定的结果。可以看出，该蛋白质对AKT的磷酸化具有浓度依赖性抑制活性。

图16示出了涉及对应于SEQ ID NO：106的蛋白质的多个实验的结果。

A)示出了该蛋白质抑制由TGF-β和CCN2二者诱导的人肺成纤维细胞的迁移。

B)示出了该蛋白质抑制由TGF-β和CCN2二者诱导的划伤(scratch wound)的闭合。

C)示出了该蛋白质导致对TGF-β诱导的基因COL1A1表达的部分抑制，所述基因COL1A1已知是促纤维化的。

D)示出了该蛋白质导致对TGF-β诱导的基因FN1表达的部分抑制，所述基因FN1已知是促纤维化的。

E)示出了该蛋白质导致对TGF-β诱导的基因ACTA2表达的部分抑制，所述基因ACTA2已知是促纤维化的。

F)示出了该蛋白质导致对TGF-β诱导的基因CCN2表达的部分抑制，所述基因CCN2已知是促纤维化的。

发明详述

本发明是基于以下出乎意料的发现而陈述的：CCN5的血小板应答蛋白1型重复(TSP-1)同源结构域是赋予CCN5/WISP2的细胞信号传导功能的具有完全活性的结构。基于对CCN5的TSP-1重复同源结构域的活性的这一新见解，本发明人提供了根据本发明的蛋白质、重组蛋白和融合蛋白，其可用于抑制或对抗归因于四结构域CCN蛋白，即CCN1、CCN2、CCN3、CCN4和CCN6的细胞信号传导和细胞生理功能。这一新见解被认为对于允许形成基于CCN5的稳定、均质、类药物的分子至关重要，因为先前尚未揭示全长CCN5的哪一部分对于概括CCN5活性是必需的，以及因为全长CCN分子对蛋白水解高度易感，并且难以以活性、均质的形式来产生。此外，CCN5的特定部分可足以概括在例如全长蛋白质的瞬时过表达之后观察到的活性的这一含义，也与本领域的CCN蛋白作为基质细胞蛋白质发挥作用的流行观点不同。对于CCN蛋白和基质细胞蛋白质的一般作用机制的流行观点是，CCN蛋白的不同区段与多种其他ECM蛋白和细胞表面受体相互作用，从而调节它们的活性，而不是作为细胞信号传导的直接调节剂发挥作用。CCN5的TSP-1重复同源结构域活性的新知识，以及与CCN蛋白家族其他成员在结构上密切关系的知识还表明，其他CCN家族蛋白的TSP-1重复同源结构域也可用于抑制四结构域CCN家族蛋白的细胞信号传导功能。根据一个方面，本发明的重组蛋白和融合蛋白在A549细胞中抑制AKT(Ser473)的磷酸化。

所述细胞信号传导的抑制与多种病症的治疗相关。例如，CCN2与数种疾病有关，特别是其中增强的纤维发生和组织纤维化是特征性病理生理特征的疾病。

例如，已经表明单独CCN2过表达足以在肺中诱导纤维化(参见Sonnylal et al.，Arthritis Rheum 62，1523-1532(2010))。还发现CCN2对于以下是必需的：博来霉素(bleomycin)诱导的肺纤维化(Bonniaud，P.et al.Am J Respir Cell Mol Biol 31，510-516(2004))、辐射诱导的肺纤维化((Bickelhaupt，S.et al.J Natl Cancer Inst 109(2017))，以及由于缺失PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源物(Phosphatase And TensinHomolog)表达引起的肺纤维化(Parapuram，S.K.et al.Matrix Biol 43，35-41(2015))。此外，在不存在其他诱发剂的情况下，当CCN2从肺克拉拉细胞(pulmonary Clara cell)(Wu，S.et al.Am J Respir Cell Mol Biol 42，552-563(2010))、肺泡II型上皮细胞(Chen，S.et al.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 300，L330-340)表达和分泌时，当其由成纤维细胞特异性启动子表达时(Sonnylal et al(2010)，同上，Sonnylal，S.et al.，JCellSci 126，2164-2175(2013))或由腺病毒递送时(Bonniaud，P.et al.，Am JRespir CritCare Med 168，770-778(2003))，已发现CCN2诱导肺纤维化。因此，多项报道均支持了这样的结论：CCN2不仅足以在皮肤或肺中引起纤维化，而且对于数种疾病模型中完全成熟的纤维化表型也是必需的。肺纤维化是人疾病特发性肺纤维化(IPF)的标志，然而它也发生在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)(Jang，J.H.et al.，COPD14，228-237(2017))和系统性硬化病的情况下。事实上，报道了肺纤维化是高至40％的系统性硬化病患者的主要死亡原因(Tyndall AJ et al.，Ann Rheum Dis.2010 Oct；69(10)：1809-15)。CCN2和其他CCN蛋白，例如WISP1在人患者中也与IPF(Konigshoff，M.et al.，JClin Invest 119，772-787(2009))和COPD(Jang et al，同上)二者的病理生理有关。

另一个实例是肿瘤性病症。例如，在乳腺癌的情况下，已表明CCN2在三阴性乳腺癌模型(MDA-MB-231)中促进骨转移(Kang，Y.et al.，Cancer Cell 3，537-549(2003))。此外，在三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)(表达高水平CCN2的细胞系)中敲低CCN2(Chen，P.S.etal.，J Cell Sci 120，2053-2065(2007))降低了这些细胞的迁移能力，而CCN2在具有低内源性CCN2表达的激素受体阳性MCF-7乳腺癌细胞系中的过表达(Chen et al，同上)提高了后者细胞的迁移能力(Chen et al，同上，Chien，W.etal.，Iht J Oncol 38，1741-1747(2011))。后来的报道还发现，CCN2在MCF-7细胞中的过表达提高了化学抗性，而CCN2在MDA-MB-231细胞中的敲低降低了化学抗性(Wang，M.Y.et al.，Cancer Res 69，3482-3491(2009))。针对其他乳腺癌细胞也报道了由CCN2赋予的化学抗性提高(Lai，D et al.，Cancer Res 71，2728-2738(2011))。此外，通过过表达或敲低研究，还表明CCN2促进上皮向间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)以及乳腺癌细胞锚定非依赖性生长(乳腺球体形成(mammosphere formation))的能力提高(Chen et al，同上，Zhu，X.et al.，Oncotarget 6，25320-25338(2015))。通过CCN2诱导的化学抗性提高和EMT增强二者的发现与同样在其他癌症类型中的EMT与化学抗性之间存在的联系一致(Fischer，K.R.et al.，Nature 527，472-476(2015)，Zheng，X.et al.，Nature 527，525-530(2015))。

在一个特定方面中，本发明提供了如上限定的单体融合蛋白，其包含对应于CCN家族蛋白的血小板应答蛋白1型重复(TSP-1)同源结构域的至少一部分的多肽，其中TSP-1同源结构域序列可以被截短和/或被修饰，但其中结构域的半胱氨酸残基是保守的。为方便起见，该多肽在本文中可称为“TSP-1多肽”，并因此该术语被理解为不传达或暗示仅对特定天然TSP-1同源结构域序列的任何限制。术语“TSP-1多肽”可与“TSP-1结构域蛋白”或“TSP-1结构域序列”同义或互换使用。

如以下实施例中所表明的，出乎意料地发现，与产生二聚体融合蛋白的二聚体融合配偶体例如来源于IgG蛋白的Fc片段相比，单体融合配偶体在产生具有活性且稳定的蛋白质方面是有利的。单体融合保留了它们所包含的TSP-1结构域多肽的活性。此外，该蛋白质是稳定的，包括在蛋白水解降解方面。如下文进一步描述的，对蛋白水解降解的抗性可通过对TSP-1多肽的氨基酸序列进行修饰来提高，特别地包括以上提及的Ala替换。

因此，相对于选自SEQ ID NO：37或2至6的所述序列，或选白SEQ ID NO：1或8至12的序列，融合蛋白的组分(i)的多肽可包含插入、缺失、替换、突变或其任何组合，前提是多肽与所述序列保持至少80％序列同一性并且所述序列中的所有半胱氨酸残基均是保守的。

在另一个方面中，本发明提供了蛋白质(例如重组蛋白)，其由以下组成或包含以下，但不为融合蛋白的情况下：对应于CCN家族蛋白的血小板应答蛋白1型重复(TSP-1)同源结构域的至少一部分的多肽，其中TSP-1结构域序列可以被截短和/或被修饰，并且在对应于SEQ ID NO：37或2至6或者SEQ ID NO：1或8至12的第2位的位置处包含Ala替换，但其中结构域的半胱氨酸残基是保守的。换言之，TSP-1结构域蛋白可在无或独立于另一组分例如融合配偶体的情况下提供。因此，TSP-1结构域蛋白不与另一蛋白质结构域或组分或者其他功能性或结构性蛋白质序列融合或连接。为方便起见，这样的蛋白质可称为“经Ala替换的蛋白质”。

本文中使用的术语“保守的”意指给定序列中的残基未缺失或替换。换言之，术语“保守的”与术语“保留的”同义地(并且可互换地)使用。它只是意味着没有从序列中去除半胱氨酸残基。因此，在以上语境中，其意指选自SEQ ID NO：37或2至6或1或8至12的序列中的半胱氨酸残基均未缺失或替换。应注意，在保守残基之间(例如在保守半胱氨酸之间)插入另外的残基，或使非保守(例如非半胱氨酸)残基缺失，相对于保守残基在原始参考序列(例如选自SEQ ID NO：37或2至6的序列)中的位置，可能会改变其在多肽序列中的位置。然而，这样的残基仍被认为是“保守的”，如本文中所限定。因此，术语“保守的”并不暗示对半胱氨酸残基的位置(或更特别地，位置号)的任何限定或限制。

在一些实施方案中，(i)的所述多肽包含以下或由以下组成：

(a)选自SEQ ID NO：1或8至12的氨基酸序列；或者

如上所述，(ii)的所述单体融合配偶体和(iii)的所述肽接头不是以下或不包含以下：CCN家族蛋白的IGF结合蛋白同源结构域、冯维勒布兰德因子C型重复同源结构域或半胱氨酸结结构域。或者，本发明的融合蛋白中可以存在的CCN家族蛋白的唯一结构域是TSP-1同源结构域。

类似地和近似地，在不是融合蛋白的经Ala替换的蛋白质的情况下，该蛋白质不包含任何其他CCN结构域(除了TSP-1结构域蛋白)。

在一些实施方案中，(i)的所述多肽或经Ala替换的蛋白质可仅包含如上限定的TSP-1同源结构域的一部分。本发明人已发现所需的TSP-1结构域的最小片段是SEQ ID NO：37、6、2、3、4或5的44个氨基酸的序列。因此，在一些实施方案中，(i)的所述多肽的长度为至少44个氨基酸。在一些实施方案中，(i)的所述多肽的长度为44至57个氨基酸。然而，如上所述，在位于半胱氨酸残基之间的44个氨基酸最小片段中可以存在一个或更多个氨基酸缺失。因此，在一些实施方案中，TSP-1多肽的长度可小于44个残基，即40至43个残基。

在一些实施方案中，(i)的所述多肽由以下组成：选自SEQ ID NO：37或2至6的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：37或2至6的序列具有至少80％序列同一性的序列。

如上所述，本发明的蛋白质，包括融合蛋白，表现出(或换言之，显示或具有)CCN5的活性，更特别地CCN5的生物活性。在一个实施方案中，蛋白质可保留或表现出或具有CCN5的TSP-1同源结构域的活性。或者，蛋白质可被限定为表现出(或显示或具有)CCN蛋白的分离的TSP-1同源结构域的活性，特别是其生物活性。前述可适用于该结构域的任何活性，并且特别地反映TSP-1同源结构域的抗纤维化作用的活性。基于结构域的任何特定生物作用，可使用任何方便的测定或方法来测定(或测试或检测)这样的活性。

值得注意的是，通过分析给定蛋白质对AKT磷酸化的作用，可方便地评估该蛋白质的活性。特别地，可测定给定蛋白质在A549人肺癌细胞中抑制AKT(Ser-473)的磷酸化的能力，如实施例2中所述。技术人员将理解可设计其他类似的测定以评估相同的活性，或评估其他相关的抗纤维化活性。

如上所述，在本发明的另一些方面中，提供了抑制或对抗归因于四结构域CCN蛋白的细胞信号传导和细胞生理功能的重组蛋白，其包含根据以上式I的氨基酸序列。

Cys-A-Cys-B-Cys-C-Cys-D-Cys-E-Cys-F

其中A、B、C、D、E和F如上文和所附权利要求书中所限定。

式I是结构相关CCN家族蛋白(CCN 1至CCN6)的TSP-1重复同源结构域比对的结果，其均包含6个保守的半胱氨酸，并考虑了可在不影响蛋白质活性的情况下被替换的氨基酸(保守替换，如下文进一步讨论)。不同CCN蛋白的TSP1重复同源结构域的第一保守半胱氨酸的位置限定为式I重组蛋白的位置#1。

保守半胱氨酸之间的五个区段分别是A、B、C、D和E。

第一区段A由式A1-A2-A3-A5-A6-A7-A8-A9限定，其中A1至A9如上限定。区段A的位置#7(A7)的氨基酸在CCN家族蛋白的所有成员中均是色氨酸(W)，并且被认为是保守的。

第二区段B由式B1-B2-B3限定，其中B1至B3如上限定。根据一个实施方案，B1和B3是丝氨酸或苏氨酸。

第三区段C由式C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12-C13-C14限定，其中氨基酸C1至C14如上限定。根据一个实施方案，氨基酸C1和C3是甘氨酸(G)。

根据另一个实施方案，C7是精氨酸(R)，C10和C12均是天冬酰胺(N)。

第四区段D由式D1-D2-D3-D4-D5-D6-D7-D8限定，其中氨基酸D1至D8如上限定。根据一个实施方案，D7是精氨酸(R)。

第五区段E由式E1-E2-E3-E4限定，其中氨基酸E1至E4如上限定。根据本发明的一个实施方案，E4是脯氨酸。

在最后一个半胱氨酸之后是包含0至13个氨基酸的可变长度的羧基末端肽区段(F)。

与CCN家族蛋白的TSP-1重复同源结构域的氨基酸序列相比，F可以缺失或缩短。根据一个实施方案，F不存在。根据另一个实施方案，F由选自以下的肽组成：

PPSRGRSPQNSAF，GQPVYSSL，EADLEEN，EQEPEQPTD，DVDIHTLI，和DSNILKTIKIP。

根据该实施方案的一个方面，重组蛋白可采用SEQ ID No.8至12中所示氨基酸序列的形式。

根据另一个方面，本发明提供了包含以下的重组蛋白：选自SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.37、SEQ IDNo.38的氨基酸序列；及其片段或与以下氨基酸序列具有至少50％序列同一性的变体：SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.38。

根据一个方面，提供了由以下组成的重组蛋白：选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38的氨基酸序列；及其片段或与以下氨基酸序列具有超过50％序列同一性的变体：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.37、SEQID No.38。

本文所用的“重组蛋白”是由重组核酸编码的蛋白质。它们由宿主细胞中的重组核酸表达，如下文进一步公开的。

“重组核酸”在本文中用于描述这样的核酸分子，该核酸分子由于其来源或操纵而不与与其天然缔合的所有或部分多核苷酸缔合和/或与除与其天然连接的多核苷酸之外的多核苷酸连接，如下文进一步公开的。

技术人员将承认，可以在不改变根据本发明的重组蛋白和融合蛋白活性的情况下引入对所述蛋白质的氨基酸序列的修饰。氨基酸通常以疏水性或亲水性和/或具有极性或非极性侧链来分类。用一种氨基酸替换具有相同生化特性的另一种氨基酸通常称为保守替换。

氨基酸的保守替换包括在以下组内氨基酸之间进行的替换：

·MILV

·FYW

·KRH

·AG

·ST

·QN

·ED

一般来说，保守氨基酸替换是指这样的氨基酸替换，其不改变在其中进行氨基酸替换的蛋白质的相对电荷或尺寸特征，并因此很少改变蛋白质的结构，这就是为什么生物活性都没有显著改变的原因。

技术人员将承认，如果一个或数个氨基酸被缺失、插入或添加至氨基酸序列，只要结构和化学物理性质是保守的，则蛋白质的生物活性也可以保留。

在本文中在氨基酸前面使用时的符号“Δ”是指指定氨基酸的缺失，例如，ΔK447应理解为其中不存在K447的蛋白质。或者，特定氨基酸的缺失在本文中用“-”表示，例如，K447-也应理解为其中不存在K447的蛋白质。

因此，应当理解，本发明涵盖如所附权利要求书中所公开的重组蛋白和融合蛋白，其中可以在基本上不改变其生物活性(即抑制或对抗归因于四结构域CCN家族蛋白CCN1、CCN2、CCN3、CCN4和CCN6的细胞信号传导和细胞生理功能的能力)的情况下引入如上所述的这样的修饰(氨基酸的替换、缺失、插入和添加)。

在本说明书通篇，提及了氨基酸序列。当在本文中提及氨基酸序列时，有时通过参照本说明书中的“uniprot编号”或Eu编号来提及所讨论的氨基酸序列或蛋白质的修饰。Uniprot编号是指Uniprot数据库中使用的编号(UniProt Consortium，Nucleic AcidsRes.2019Jan 8；47(D1)：D506-D515)。当提及CCN蛋白质的氨基酸计数时，使用Uniprot编号。Eu编号指Eu抗体的编号(Edelman et al.，1969，Proc Natl Acad Sci USA 63：78-85)，并且在提及具有或不具有与野生型不同的突变体或嵌合体的人IgG亚类Fc片段中的氨基酸时使用Eu编号。Eu编号系统可例如从IMGT科学图表中的国际ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)访问。在Lefranc M-P，Biomolecules.2014 Dec；4(4)：1102-1139中对IMGT进行了描述。

如本文所用，当提及“序列同一性”时，与第二序列具有至少x％同一性的序列意味着x％表示当两个序列通过全局比对进行最佳比对时，相对于第二氨基酸序列的总长度，第一序列中与第二序列的其匹配氨基酸相同的氨基酸的数量。当x为最大值时，两个序列都是最佳比对。可手动或自动进行比对和确定同一性百分比。

用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件例如ClustalOmega(Sievers F，Higgins DG(2018)Protein Sci 27：135-145)、Protein BLAST(来自美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))或可商购获得的软件例如Megalign(DNASTAR)软件来实现。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。NCBI BLAST是用于确定氨基酸序列同一性的软件的另一个实例(MacWilliam et al.，Nucleic Acids Res.2013 Jul；41(WebServer issue)：W597-W600)。

根据本发明的一个方面，提供了重组蛋白，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38及其片段或变体，其与氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38具有至少50％序列同一性。

根据另一方面，提供了重组蛋白，其包含与选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

生物活性蛋白和肽在人疾病的临床管理中具有重要地位。然而，许多蛋白质和肽由于具有不太理想的药代动力学特性，或者因为它们由于尺寸小和/或由于蛋白水解代谢而通过肾脏过滤被去除而面临挑战。这样的因素可能对需要治疗的对象的药物施用造成限制或挑战，例如必须持续输注施用或频繁皮下施用以将蛋白质或肽的循环浓度保持在有效治疗水平。由于对患者和医生二者的明显的挑战和不便，因此持续或非常频繁地施用药物的需要在临床上是不期望的。

延长生物活性肽或蛋白质半衰期的一种策略是通过称为聚乙二醇化的过程将聚乙二醇(PEG)基团与目的肽或蛋白质连接(参见例如Dozie et al.(2015)，Int.J.Mol Sci，16(10)25831-25864)。用于蛋白质聚乙二醇化的一般策略是使蛋白质上的官能团与PEG分子上的互补基团反应以形成蛋白质-PEG缀合物。PEG部分由于其灵活性、亲水性、可变的尺寸和低毒性为提高蛋白质的稳定性和循环半衰期提供了数种优势。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的重组蛋白，其中所述蛋白质是聚乙二醇化的。根据本发明的融合蛋白也可以是聚乙二醇化的。

融合蛋白

消除与肽和蛋白质的医学用途相关的挑战的另一种途径是通过制备融合蛋白来获得生物活性蛋白或肽的半衰期的延长(参见例如Valeria et al.(2017)，“A NewApproach to Drug Therapy：Fc-Fusion Technology)，Prim Health Care，7：255，doi：10.4172/2167-1079.1000255)。通过经由基因重组将蛋白质或肽共价融合到载体蛋白，可以将目的蛋白质的分子量提高到约60至70kDa，其是肾过滤的阈值。

本发明提供了融合蛋白，其包含：

(i)CCN家族蛋白的血小板应答蛋白1型重复(TSP-1)同源结构域；

(ii)与(i)的TSP-1重复同源结构域在N端或C端融合的融合配偶体，且其中所述融合配偶体选自血清白蛋白、转铁蛋白和免疫球蛋白Fc片段。

(iii)任选地，(i)的TSP-1重复同源结构域与Fc片段(与TSP-1重复同源结构域在N端或C端融合)之间的肽接头。

在本说明书通篇，TSP-1重复同源结构域也可表示为并指代结构域III，其是指CCN家族蛋白的第三结构域。

在一个优选方面中，融合配偶体是单体融合配偶体，并且导致为单体的融合蛋白。这样的融合蛋白，并且特别是其TSP-1结构域，在上文进行了定义并在下文进一步描述。

然而，本公开内容还包括关于TSP-1结构域蛋白质组分和融合配偶体组分二者的另一些实施方案。

根据一个这样的实施方案，TSP-1重复同源结构域是如上文所定义的式I的重组蛋白。

根据另一个实施方案，TSP-1重复同源结构域是具有如在SEQ ID No.1至12、37和38所示序列中任一序列中所限定的氨基酸序列的重组蛋白，或如上文所限定的式I重组蛋白。

根据一个实施方案，TSP-1重复同源结构域是重组蛋白，该重组蛋白包含与选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.37和SEQ ID No.38的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

蛋白质固有地对蛋白酶降解易感。为了防止根据本发明的重组蛋白和融合蛋白的蛋白酶降解，可以例如通过定点突变引入对氨基酸序列的修饰，以提供抗蛋白酶的重组蛋白和融合蛋白。例如，可在融合蛋白的如SEQ ID No.1至12、37或38中限定的CCN家族蛋白或更特别地，如SEQ ID No.1至6、8至12或37中的任一项中限定的蛋白质的血小板应答蛋白1型重复(TSP-1)同源结构域中引入点突变，或者在重组蛋白中引入点突变。根据一个实施方案，引入点突变降低蛋白水解降解的易感性。导致本发明的重组蛋白和融合蛋白的更少蛋白水解的点突变的一个非限制性实例是通过引入对应于在CCN5的结构域III的第195位用丙氨酸替换脯氨酸(P195A)的点突变，例如SEQ ID No.7所示。也可在源自另一些CCN家族成员结构域III的氨基酸序列中引入类似的突变。SEQ ID NO.38表示包含Ala替换的CCN5的TSP-1结构域的截短的44个氨基酸的序列。SEQ ID No.42至46分别表示包含Ala替换的CCN1、2、3、4和6的TSP-1同源结构域的截短的44个氨基酸的序列。SEQ ID No.47至51分别表示包含Ala替换的CCN1、2、3、4和6的较长TSP-1同源序列。根据本发明，可以使用任何这样的序列，或者与其具有至少80％序列同一性的序列。

如上所述，在一个优选实施方案中，根据本发明的融合蛋白的融合配偶体(ii)是单体的。可使用任何单体融合配偶体。因此，融合配偶体可以是当与TSP-1同源结构域蛋白质组分融合时以单体形式出现并保持的任何蛋白质或其部分(例如蛋白质结构域)。因此，包含单体融合配偶体和TSP-1同源结构域蛋白的融合蛋白保持为单体。也就是说，它不会与自身二聚或形成更高的多聚体。

多种蛋白质已知为可能的融合配偶体，并可包括天然蛋白质或者其片段或经氨基酸序列修饰的变体，以及合成蛋白质或氨基酸同聚物。这样的蛋白质尤其包括IgG的Fc片段、血清白蛋白或转铁蛋白。

在本文中将融合配偶体广泛地定义为第二多肽(或第二氨基酸序列)，其在天然情况下不与第一CCN TSP-1同源多肽组合(例如相邻或者直接或间接连接)存在，而是以合成或人工组合地与第一CCN TSP-1同源多肽连接。因此，融合蛋白包含连接或融合在一起的至少两个氨基酸序列或多肽的非天然组合。

融合配偶体可以是长度为至少6、8、9、10、15、20、25、30、40或50或更多个氨基酸的氨基酸序列。通常，融合配偶体是功能性多肽，或者换句话说，它是赋予融合蛋白以功能或性质(例如稳定融合蛋白(使第一多肽更稳定)或提高其血清半衰期)的多肽。因此，融合配偶体可以是结构蛋白或具有结构功能，或者其可赋予融合蛋白以活性或性质，例如结合活性(例如，融合配偶体可以是结合对的成员，或其可以是亲和力结合配偶体等)。在代表性实例中，融合配偶体可以是白蛋白(特别是血清白蛋白)、纤维蛋白原、谷胱甘肽S-转移酶、转铁蛋白、链霉亲和素或链霉亲和素样蛋白、或者免疫球蛋白或其部分，特别是免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc部分或者其部分或其修饰物。合适的血清白蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、小鼠血清白蛋白(MSA)，并且特别是人血清白蛋白(HSA)。其他可能的融合配偶体包括可用于改善融合蛋白药代动力学特性的多肽，例如合成多肽，例如同氨基酸聚合物、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物或弹性蛋白样肽，例如Strohl，2015，BioDrugs 29，215-239中描述的。可使用本领域已知的与治疗性蛋白质一起使用的任何融合配偶体。

在一个实施方案中，根据本发明的融合蛋白的融合配偶体(ii)可以是IgG(任何亚类或任何亚类的嵌合体)的Fc片段、血清白蛋白或转铁蛋白。

如本文所定义，融合配偶体可与融合蛋白的TSP-1同源结构域蛋白质组分N端或C端偶联，例如与CCN5或任何其他CCN蛋白质的TSP-1重复同源结构域偶联。它可以直接或通过接头间接连接，如下文进一步描述。

Fc片段倾向于形成二聚体，并且当用于融合蛋白时，融合蛋白构建体倾向于包含融合蛋白的两个拷贝。然而，本领域已知可以制备单体Fc片段和包含它们的单体融合蛋白。

因此，在融合配偶体为Fc片段的情况下，该Fc片段优选为任何类别的单体Fc片段，例如人IgG的单体Fc片段。涵盖了包含来自不同类别的Fc区域的部分的嵌合Fc片段，以及具有经修饰序列的Fc片段。

Fc融合蛋白是基于嵌合蛋白的日益增长的蛋白质治疗剂类别，所述嵌合蛋白由与IgG同种型的Fc片段偶联的效应结构域组成。生物药物产品的典型实例是用于治疗例如类风湿性关节炎的依那西普(etanercept)(与Fc片段偶联的TNF-α受体)。Fc融合生物药物蛋白的另一个实例是阿柏西普(aflibercept)。阿柏西普是用于治疗湿性黄斑变性和转移性结直肠癌的VEGF受体Fc融合蛋白。制备Fc片段融合蛋白的主要原理是由于通过新生儿Fc受体提高足以排除肾排泄并增强肾近端小管重吸收的分子量而获得半衰期的延长。此外，Fc融合蛋白与内皮细胞上的新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合允许原本注定要内吞和随后溶酶体降解的基于Fc的融合蛋白得以再循环并释放回循环中。

根据一个实施方案，提供了融合蛋白，其中融合配偶体(ii)是来自人IgG(免疫球蛋白G，也称为免疫球蛋白γ)(包括人IgG的所有亚类)的Fc片段。根据本发明的又一实施方案，提供了融合蛋白，其中融合配偶体是IgG1、IgG2或IgG4的Fc片段。优选地，人IgG的Fc片段是亚类IgG4(SEQ ID.No 13)或IgG2(SEQ ID.No 14)的Fc片段。

IgG1、IgG2和IgG4由于其约3周的更长半衰期而往往优于IgG3。技术人员将承认，对特定亚类的IgG同种型作为Fc融合配偶体的选择将取决于最终化合物的期望的半衰期延长和细胞毒性活性水平。指定用于治疗癌症或自身免疫病的治疗性抗体大部分属于IgG1亚类，因为它们对Fc受体具有高亲和力并且具有发挥免疫效应功能的强大能力。另一方面，当期望缺乏免疫效应功能时，IgG2和IgG4是用作治疗性候选物的骨架的优选IgG亚类，因为免疫效应功能可导致不良作用。Fc片段激活免疫效应功能的倾向取决于Ig同种型和亚类，并因免疫效应功能的不同而不同。除了选择合适的IgG亚类的Fc片段外，IgG亚类的氨基酸序列可以例如通过定点突变进行修饰，以降低Fc片段激活免疫效应功能的能力。

可以选择这样的Fc片段，其形成单体或者更准确地说，其保留或具有单体形式，或者可以被修饰以引入允许或促进单体结构的突变。这样的突变在本文中称为“单体产生突变”。包含单体产生突变的Fc片段的实例为SEQ ID No.54和55。本领域技术人员知晓如何引入这样的突变并选择单体Fc突变体。

FC片段的免疫效应激活功能的避免

例如，在生物药物融合蛋白度拉糖肽(dulaglutide)(Trulicity^TM)(用于每周一次治疗2型糖尿病的GLP-1激动剂-Fc片段融合蛋白)中，在IgG4Fc片段的铰链区引入良好表征的突变F234A和L235A以降低激活免疫效应功能的能力。

根据本发明的一个实施方案，Fc融合配偶体是IgG4的Fc片段，其中IgG4Fc片段被修饰(例如包含以上F234A和L235A突变)以避免免疫效应功能。

蛋白酶抗性Fc片段

可降低制备中的产率和生物半衰期二者的另一个因素是融合蛋白的内肽酶切割。为了降低或消除蛋白水解降解的风险，可在Fc片段的氨基酸序列中引入修饰，特别是通过在对蛋白水解切割易感的位点中引入突变。在欧洲专利申请EP2654780B1中，通过将E233-L234-L235-G236替换为P233-V234-A235(缺失G236)(EU编号)来修饰IgG1恒定区的Fc结构域，以使所得包含经修饰Fc的蛋白质对蛋白水解降解具有抗性。

将EP2654780B1中公开的氨基酸修饰并入与CCN5结构域III偶联的IgG4的Fc片段被认为不提供对内肽酶的足够抗性。然而，根据本发明，通过进一步修饰用作融合配偶体的IgG亚型实现了蛋白酶抗性的改善。

更具体地，已经发现包含IgG2的整个铰链区以及IgG4的恒定重链2和3的融合蛋白展示出优越的蛋白水解抗性。

在Mueller JP et al.，Mol.Immunol.(1997)，34(6)，pp.441-452中，公开了IgG抗体中IgG2/IG4嵌合体的使用。用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿和非典型溶血性尿毒综合征的名为依库丽单抗(eculizumab)的另一种生物药物单克隆抗体已经显示出可用于例如避免IgG4激活FcγR依赖性免疫效应的能力。此外，这样的嵌合Fc片段的IgG4恒定结构域2和3也显示出避免IgG2激活补体依赖性免疫效应功能的能力。在这方面，参考Rother etal.，(2007)，参见Nat.Biotechnol.，25(11)，pp.1256-1264和Mueller JP et al.(同上)的报道。

此外，Borrok et al.(2017)，J.Pharm.Sci.106；1008-1017公开了在Fc片段中引入修饰以研究其对抗体免疫效应功能的作用(FQQ-YTE突变)。在WO2017158426A1中，公开了通过在Fc片段中引入突变来修饰抗体以改善抗体的半衰期。具体地，公开了在免疫球蛋白的Fc区中第311、434、428、438和435位中的一个或更多个的修饰。

此外，Kinder et al.J Biol Chem.2013 Oct 25；288(43)：30843-54报道了IgG1下铰链中的突变(即E233P、L234V、L235A、G236-，Eu编号)导致IgG1抗体的蛋白酶抗性。

根据一个实施方案，根据本发明的融合蛋白的Fc片段由并入以下突变的IgG4亚类的Fc片段组成：S228P、F234A、L235A、K447-，Eu编号，参见SEQ ID No.15。Jacobsen et al.JBiol Chem.2017 Feb 3；292(5)：1865-1875报道了Asn297的突变导致Fc片段无糖基化，这进一步导致缺乏IgG效应功能。Jacobsen还发现，与另一些变体(N297Q或N297A)相比，一些变体(N297G)导致抗体具有更好的稳定性和可开发性。此外还引入了其他修饰(二硫桥)，其导致比亲代IgG1更好的稳定性。

根据本发明，当融合配偶体是Fc片段时，其可在没有或具有稳定的二硫桥的情况下进行无糖基化，例如SEQ ID No.16中。

据本发明人所知，由IgG2的整个铰链区和IgG4的恒定重链2和3构成的Fc片段先前未曾用于通过将所述Fc片段与效应蛋白连接来制备融合蛋白。

根据一个实施方案，本发明融合蛋白的融合配偶体是无糖基化的IgG1的Fc片段，并且通过二硫桥进行稳定化，并且其中下铰链引入了以下突变：E233P、L234V、L235A、G236-(Eu编号)(SEQ ID NO.17)。

根据一个实施方案，包含CCN家族蛋白的TSP-1重复同源结构域的融合蛋白的融合配偶体是IgG4的Fc片段，并且其中除了S228P和K477-突变外，还将以下突变引入下铰链：E233P、L234V、L235A、G236-(Eu编号)(SEQ ID NO.18)。

在一个优选实施方案中，Fc片段是IgG2的铰链区(216ERKCCVECPPCPAPPVA-GP238，Eu编号)和任意其他IgG亚类的嵌合体。最优选地，如SEQ ID.No.19所示，Fc片段是IgG2的铰链区和IgG4的恒定重结构域2和3的嵌合体，其中羧基末端K477(Eu编号)缺失。本发明的此实施方案已经显示具有改善的蛋白酶抗性特征(参见实施例6)。

在一个实施方案中，本发明的单体融合蛋白的融合配偶体是IgG1的二硫桥稳定化(R292C、V302C)、无糖基化(N297G)且具有单体产生突变(C220Q、C226Q、C229Q、T366R、L368H、P395K、K409T、M428L)，Eu编号)的Fc片段，如SEQ ID NO：54中所提供。

在另一个实施方案中，本发明单体融合蛋白的融合配偶体是作为IgG2的铰链区与IgG4的恒定重结构域2和3的嵌合体的Fc片段，其具有羧基末端477-缺失并且具有单体产生突变(C219Q、C220Q、C226Q、C229Q、L351F、T366R、P395K、F405R、Y407E)和半衰期延长突变(M252Y、S254T、T256E)(Eu编号)，如SEQ ID NO：55中所提供。

尽管根据本发明的融合蛋白通过使用由IgG2的整个铰链区、IgG4的恒定重链2和3以及CCN蛋白家族成员的结构域III组成的Fc片段来示例，但认为如果这样的Fc片段嵌合体与其他效应分子(例如VEGFR、FGF-21或GLP1)偶联，则也可实现有利的蛋白酶抗性。效应分子是Fc融合蛋白的一部分，提供期望的药效学特性，而Fc片段对药代动力学特性有贡献。

血清白蛋白作为融合配偶体

延长肽和蛋白质半衰期的替代策略是使用血清白蛋白(SA)作为融合配偶体。与大多数其他循环蛋白的数天或更少的半衰期相比，IgG和SA共有约19天的延长的半衰期。SA还对新生儿Fc受体(FcRn)具有亲和力，并被从细胞内降解中挽救出来(参见Andersen et al.(2014)，J Biol Chem，289(19)；pp 13492-13502)。

在本发明的一个实施方案中，如上所述提供融合蛋白，其中融合配偶体为血清白蛋白，优选人血清白蛋白。

在一个实施方案中，如上所述提供单体融合蛋白，其中所述融合蛋白包含如SEQID NO：101中所提供的人血清白蛋白的氨基酸25至606。

在本发明的另一个实施方案中，白蛋白(例如人血清白蛋白)被修饰例如以通过在具有或不具有pH依赖性(其导致半衰期增加或减少)的情况下改变其FcRn亲和力来增加或减少半衰期。

转铁蛋白作为融合配偶体

另外，延长肽和蛋白质半衰期的替代策略是使用转铁蛋白作为融合配偶体，利用转铁蛋白天然的长半衰期。(Strohl W.BioDrugs.2015；29(4)：215-239)。转铁蛋白可以以其糖基化或非糖基化形式使用。

在本发明的一个实施方案中，如上所述提供融合蛋白，其中融合配偶体为转铁蛋白，优选人转铁蛋白。

在一个实施方案中，如上所述提供单体融合蛋白，其中所述融合蛋白包含如SEQID NO：53中所提供的人转铁蛋白的氨基酸20至698。

接头

根据另一实施方案，根据本发明的融合蛋白可任选地包含融合配偶体和效应分子之间的肽接头，即接头与CCN蛋白的TSP-1重复同源结构域(TSP-1结构域蛋白质/多肽)N端或C端融合。

可以使用任何肽接头(只要它不是CCN蛋白质序列)，其中许多是本领域已知和描述过的。接头可以是柔性接头序列(其可以包括柔性接头序列基序的重复)。本领域已知的典型接头富含小的非极性(例如甘氨酸)或极性(例如丝氨酸或苏氨酸)残基，并且通常由甘氨酸和丝氨酸残基(GS)或另一些氨基酸残基(例如丙氨酸、赖氨酸和/或谷氨酸(A、K和/或E))或者甚至任何氨基酸的段(stretch)组成。常用的接头是(GGGGS)接头(SEQ ID NO：121)，它可以作为接头中的重复单元提供(如(GGGGS)n，其中n的拷贝数可以调整，例如1至10、1至6、1至4等)。接头可以为1至50、1至45、1至40、1至30、1至25、1至20、1至15、1至12、1至10，例如1至8、1至6、1至5或1至4个氨基酸长。在下文的实施例中描述并使用了多种不同的接头，并且这些中的任何一种可用于本发明的任何融合蛋白中。

在一些实施方案中，接头包含不超过50个氨基酸。

肽接头的性质可进一步改善效应功能的维持。然而，肽接头可能对内肽酶切割和融合蛋白消除易感。通常使用有或没有丝氨酸残基散布的具有甘氨酸的肽接头，但是这种设计并不总是产生具有期望活性和内肽酶抗性的融合蛋白。在US20180273603中，公开了神经营养因子结合蛋白-Fc-融合蛋白，建议使用包含序列A(EAAAK)A(其中的SEQ ID No.14)的重复的α-螺旋接头。此外，US2018/0127478公开了建议在Fc融合蛋白中使用由序列EAAAK的一至三个重复组成的氨基酸接头。

根据本发明，由肽序列EAAAK(本文中的SEQ ID No.21)组成的接头也可并入TSP-1同源结构域和融合配偶体(Fc片段)之间。更优选地，接头由氨基酸序列EAAAK的重复构成。

如果本发明的融合蛋白中包含接头，则该接头位于融合配偶体和效应分子(即CCN蛋白的结构域III)之间。接头可在CCN蛋白质的结构域III的C端或N端引入。

此外，在悬浮CHO细胞中表达重组蛋白后，螺旋接头对内肽酶切割具有抗性。这对于制备目的和体内效力二者都很重要。此外，Fc融合蛋白中Fc片段和效应结构域之间的α-螺旋接头的并入显示出降低Fc融合蛋白的聚集趋势。

尽管这些发现是在包含CCN家族蛋白的结构域III作为效应蛋白的融合蛋白的情况下显示的，但认为如果将其他效应分子与根据本发明的Fc片段α-螺旋接头组合，也可获得有利的降低的聚集趋势和蛋白酶抗性效果。

因此，本发明提供了包含Fc片段的Fc融合蛋白，其在Fc片段和效应分子之间具有式aa1-aa2-(EAAAK)n-aa3-aa4-aa5的肽接头序列，其中n≥4，且其中aa1、aa2、aa3、aa4、aa5独立地不存在或为氨基酸。接头可以位于Fc片段的N端或C端。根据一个实施方案，n为8。根据另一个实施方案，aa1为苏氨酸(T)，aa1、aa2、aa3、aa4和aa5为Ala(A)。根据一个实施方案，以上Fc融合蛋白的接头选自SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ IDNO.25。特别地，已显示使用根据本发明的包含由(EAAAK)-重复组成的接头(即，例如(EAAAK)n，其中n为8)的融合蛋白有利地导致较少的聚集。

根据本发明可使用的替代接头是具有如SEQ ID No.20(TEGRMD)所示的氨基酸序列的接头。

因此，在一个实施方案中，本发明可包括在融合配偶体和CCN5上的结构域III(例如，SEQ ID.No 1-SEQ ID.No.12、37或38)之间并入接头肽。并入了SEQ ID No.20的接头的融合蛋白的非限制性实例分别显示在SEQ ID No.28、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30中。

在当本发明采用N端基因融合肽接头(如SEQ ID.No 20中)的CCN5的结构域III和并入以下突变(S228P、F234A、L235A、K447-，Eu编号)的IgG亚型IgG4的Fc片段(如SEQ ID.：No.15中)的实施方案的情况下，完整序列将如SEQ ID.No.28中，也称为CCN5(dIII)-Fcv2。

在当本发明采用N端基因融合肽接头(如SEQ ID.No.20中)的CCN5的结构域III和并入以下突变(S228P、E233P、F234V、L235A、G236-、K447-，Eu编号)的IgG亚型IgG4的Fc片段(如SEQ ID.No.18所示)的实施方案的情况下，所得序列将如SEQ ID.No.29中所示，也称为CCN5(dIII)-Fcv2.1。

在当本发明采用N端基因融合肽接头(如SEQ ID.No 20中)的CCN5的结构域III和IgG亚型IgG2/4亚型的嵌合Fc片段(如SEQ ID.No 19中所示)的实施方案的情况下，所得序列将如SEQ ID.No.30中所示，也称为CCN5(dIII)-Fcv2.3。

在当本发明采用N端基因融合肽接头(如SEQ ID.No 25中)的CCN5的结构域III(如SEQ ID.No 1中)和IgG亚型IgG2/4亚型的嵌合Fc片段(如SEQ ID.No 19中所示)的实施方案的情况下，所得序列将如SEQ ID.No 31中所示，也称为CCN5(dIII)-HLn8-Fcv2.3。

根据本发明的一个优选实施方案，提供了根据本发明的融合蛋白，其包含：

1)CCN家族蛋白(尤其是CCN5)的结构域III中的点突变(参见SEQ ID No.7，导致所述结构域III的蛋白水解易感性降低；

2)人IgG4和人IgG2的Fc片段的经改造嵌合体(SEQ ID No.19，其相对于先前描述的用于Fc融合蛋白的Fc片段骨架降低了蛋白水解易感性；以及

3)包含优化的肽接头的组合物(参见SEQ ID No.21至25)，其降低蛋白水解易感性，增强融合蛋白的生物活性并降低融合蛋白的聚集倾向。

在一些实施方案中，在(i)的氨基酸序列和单体融合配偶体之间的肽接头具有选自SEQ ID NO：20至25或39的氨基酸序列或者与其具有80％序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO：57、63、65、67和121中提供了根据本发明可使用的替代接头序列。

重组表达

根据本发明的重组蛋白和融合蛋白可通过培养能够表达编码所述蛋白质的核苷酸序列的宿主细胞来制备。技术人员非常熟悉多种可用的生物技术技术，这些技术使用通常可用的基因工程技术和重组DNA表达系统提供分离的核酸序列的表达以用于通过异源表达在多种宿主细胞系统中制备重组蛋白，参见例如“Recombinant Gene ExpressionProtocols，in Methods in Molecular Biology，1997，Ed.Rocky S Tuan，Human Press(ISSN 1064-3745)或Sambrook et al.，Molecular Cloning：A laboratory Manual(第三版)，2001，CSHL Press，(ISBN 978-087969577-4)。例如，编码根据本发明的重组蛋白的核酸序列可插入包含所有必要的转录和翻译调节序列的合适的表达载体中，所述转录和翻译调节序列特别适于指导编码期望蛋白质的核酸序列在合适宿主细胞中的表达。合适的表达载体是例如质粒、黏粒、病毒或人工酵母染色体(YAC’s)。

编码本发明重组蛋白的DNA序列可通过技术人员熟知的方法或技术人员熟知的商业供应者例如Genscript、Thermo Fisher Scientific等来合成。

根据该方面的一个实施方案，提供了DNA分子，其包含如SEQ ID NO：86、87、90、91、99、100、104、105、108、109、112或113所示的核酸序列，或与任意前述序列具有至少80％序列同一性的序列。还提供了包含这样的DNA分子的表达载体。根据该方面的另一个实施方案，还提供了包含这样的载体的宿主细胞。

可使用通路克隆系统(Gateway cloning system)将待表达并用于制备重组蛋白的DNA序列插入通常称为入门载体的载体中(Esposito et al，2009，“Gateway Cloningfor Protein Expression”，在Methods in Molecular Biology，498，pp.31-54中)。克隆到入门载体中的基因可以通过重组容易地引入到多种表达载体中。例如，编码根据本发明的重组蛋白或融合蛋白的合成序列可通过BP通路重组酶克隆进行重组，以生成可用于在合适的宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)中繁殖质粒的入门载体。在一个优选实施方案中，使用经突变以允许质粒有效繁殖的大肠杆菌细胞，例如One Shot Top10^TM细胞。

根据本发明的一个实施方案，制备包含DNA序列的表达载体，所述DNA序列编码与启动子可操作地连接的根据本发明的重组蛋白或融合蛋白。技术人员将承认，如本文所使用的“启动子”指控制和引起特定基因转录的DNA编码序列的DNA上游(5’-prime)区域。启动子控制RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以引起转录。“可操作地连接”指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列引起并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。一般来说，可操作地连接意味着所连接的核酸序列是连续的。

入门载体以及表达载体(例如，从下述目的载体生成的)可使用技术人员熟知的标准质粒分离技术(例如，使用来自Qiagen^TM或QIAGEN^TM Plasmid Plus Maxi试剂盒的QIAprep^TM Spin Miniprep试剂盒)分离。

如果使用含有编码根据本发明的重组蛋白或融合蛋白的DNA序列的入门载体，则所述入门载体可使用LR通路重组酶与目的载体进一步重组以生成表达载体。然后可使用表达载体在适当的宿主细胞中表达编码蛋白质的DNA序列。适用的目的载体的非限制性实例例如pUCOE-DHFR-DEST，如

et al.，J.Biol.Chem，293：46，pp.17953-17970中所述。

此外，所得表达载体可通过标准限制酶消化和DNA凝胶电泳进行验证。

根据本发明的一个方面，提供了表达载体，其包含编码式(I)重组蛋白的核酸序列。根据本发明的又一方面，提供了表达载体，其包含编码蛋白质的核酸序列，该蛋白质包含选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8至12、37、38、84、85、88、89、97、98、102、103、106、107、110和111的氨基酸序列；以及与氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38以及SEQ ID No.84、85、88、89、97、98、102、103、106、107、110和111具有至少50％序列同一性的其片段或变体。

根据另一方面，提供了表达载体，其编码重组蛋白，所述重组蛋白包含与选自SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.37和SEQ ID No.38以及SEQ ID No：84、85、88、89、97、98、102、103、106、107、110和111的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。

根据本发明的又一实施方案，提供了编码根据本发明的融合蛋白的表达载体。

技术人员将知晓遗传密码的简并，以及多种生物体中对特定密码子的偏好。因此，根据宿主细胞的选择，编码本发明的重组蛋白和融合蛋白的核酸序列可适于宿主细胞的优选密码子。因此，本发明蛋白质的氨基酸可由下表所示密码子的任意组合编码：

优选地，根据所选宿主细胞进一步优化密码子以实现高表达。

对于通过重组DNA技术表达蛋白质，除了本发明的具体实施方案之外，优选将编码信号肽的DNA序列附加到蛋白质序列的N末端。信号肽可用于在宿主细胞中合成期间和/或之后指导融合蛋白的定位。因此，它可以是指导融合蛋白分泌的序列。这样的信号肽序列的使用在本领域中是众所周知的。信号肽可以采用任何形式，例如，它可以构成IgGk链信号肽，或者它可以构成来自人血清白蛋白的信号肽(SEQ ID.No 32)。

在当将来自人血清白蛋白的信号肽(SEQ ID.No 32)附加到SEQ ID.No 28的N端的情况下，待表达的蛋白质序列可以如SEQ ID.No 33或SEQ ID No：85、89、98、103、107或111所示。

此外，对于通过重组DNA技术表达蛋白质，根据本发明的一个具体实施方案，可使用具有如SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列的蛋白质，如SEQ ID NO 34或SEQ ID NO：86、90、99、104、108或112所示的核苷酸序列，其中将翻译终止密码子附加到编码序列的3’端。

在当本发明通过SEQ ID.No.34中的核苷酸序列体现的情况下，核苷酸序列优选地通过Kozak序列(例如GCCACC)附加到编码序列的直接5’端，如SEQ ID No.35或SEQ ID No：86、90、99、104、108或112中。DNA序列可进一步通过DNA元件侧接以实现亚克隆，例如通路重组酶attB位点。然而，可以使用任何克隆或合成策略来生成DNA序列并有助于亚克隆到表达载体中。在当DNA序列并入通路重组酶位点以实现亚克隆的情况下，核苷酸序列可如SEQID.No 36或SEQ ID No：87、91、100、105、109或113所示。

可将获得的包含编码本发明融合蛋白的重组蛋白的核酸序列的表达载体引入合适的宿主细胞中以产生期望的蛋白质。可以使用多种可商购获得或专有的(proprietary)宿主细胞。例如，表达载体可转移到真核宿主细胞，例如CHO细胞，例如CHO DG44 DHFR(二氢叶酸还原酶^-/-)适应悬浮培养CHO细胞。用表达载体转染宿主细胞可通过技术人员熟知的方法进行，例如使用电穿孔进行。

在合适的培养基中培养宿主细胞后，在宿主细胞中将产生由表达载体编码的根据本发明的重组蛋白或融合蛋白，并且可通过技术人员熟知的方法收集和纯化所得蛋白质。

表达载体可包括信号序列，通常称为“信号肽”，用于将表达的蛋白质或融合蛋白分泌到培养基中。

为了从细胞培养基中分离和纯化分泌的重组蛋白，通常首先使用一个或更多个预处理或澄清步骤以去除大颗粒和生物质。适用的预处理步骤的非限制性实例是例如反渗透、离心、过滤方法和渗滤，或其组合。然后，所获得的蛋白质通常通过技术人员熟知的多种色谱法中的一种或更多种来纯化，例如通过亲和色谱法、离子交换色谱法、混合模式色谱法、疏水相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法或其他色谱法技术，或其组合。

例如，由合适的宿主细胞表达的重组蛋白或融合蛋白可使用亲和色谱方法纯化，例如使用MabSelect^TM SuRe^TM介质，例如安装在FPLC色谱系统上的5ml HiTrap MabSelect^TMSuRe^TM柱，例如配备有5mm UV流动池的BioRad NGC Discover^TM 10 Pro系统。上样包含待纯化蛋白质的样品后，通常使用一种或更多种适用的洗涤缓冲液洗涤柱一次或更多次，然后使用适用的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。所获得的蛋白质可使用上文列出的色谱方法中的一种或更多种进一步纯化。

应当理解，可以利用技术人员熟知的技术在编码本发明的重组蛋白的核酸序列中引入多种修饰例如以促进表达。通过使用定点突变，可以引入修饰以使编码序列适于用于表达序列的期望宿主，并从而产生重组蛋白。技术人员将知晓宿主特异性密码子的存在以及如上文所述使异源核酸序列适应宿主特异性密码子提高了表达效率的事实。还可以引入其他修饰，例如，以促进分离和纯化，即通过添加编码可用于这样的目的的肽或蛋白质的序列。此外，编码提供用于从宿主细胞分泌期望的重组蛋白的信号肽的核酸序列也可与本发明的核酸序列连接。

本发明还提供了适用于产生根据本发明的重组蛋白或融合蛋白的宿主细胞。可使用特别地适于产生重组蛋白的多种可商购获得的宿主细胞，原核宿主细胞和真核宿主细胞二者。合适宿主细胞的非限制性实例为例如CHO细胞、HEK293细胞、毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞、NS0细胞或大肠杆菌细胞。

最后，本发明还涉及CCN家族蛋白的血小板应答蛋白1型重复(TSP-1)同源结构域和包含所述TSP-1重复同源结构域的融合蛋白，其用作通过抑制或对抗归因于CCN家族蛋白的细胞信号传导和细胞生理功能来治疗或预防病症的药物。

在一个方面，本发明提供如本文所定义的蛋白质，例如融合蛋白，其用于治疗。

在一些方面，所述蛋白质，例如融合蛋白，可用于治疗或预防纤维化，或用于治疗或预防表现出纤维化的任何病症(即任何纤维化病症或障碍)。纤维化可影响任何组织或器官，包括例如肺、眼、心脏、骨骼肌、腹膜、肾、肝、胰、胆管、皮肤、血管或更多全身性系统。特别地，表现出纤维化的病症可选自可能具有任何病因的肺纤维化(包括特发性肺纤维化)、支气管肺发育不良、视网膜纤维化、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、视网膜脱离、氧诱导的视网膜病变、青光眼、心脏纤维化、移植后移植物纤维化、心肌病相关纤维化、肌肉纤维化、杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)、腹膜纤维化、糖尿病肾病、慢性肾病(肾纤维化)、急性肾损伤、肾小管间质纤维化、慢性同种异体移植肾病、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎、脂肪性肝病、慢性胰腺炎、胆纤维化、瘢痕疙瘩、瘢痕形成、全身性硬化、动脉粥样硬化、硬膜外纤维化。

在心脏纤维化的情况下，待治疗或预防的病症可包括射血分数保留或未保留的心脏肥大和心力衰竭。

在另一方面，本发明提供如本文所定义的蛋白质，例如融合蛋白，其用于治疗炎性疾病或自身免疫病。在一些实施方案中，炎性疾病选自类风湿性关节炎、肌萎缩侧索硬化(ALS)、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn’s disease)。

在另一方面，本发明提供了蛋白质，例如本文所定义的融合蛋白，其用于治疗癌症。在这方面，已知4-结构域CCN蛋白既可在分离的癌细胞中引发致癌响应，也可通过直接作用于癌细胞或肿瘤基质而有助于转移、化学抗性和免疫治疗抗性。因此，本文中的蛋白质在抑制4-结构域CCN蛋白质的作用或活性方面的活性提供了治疗癌症的基本原理。癌症可以是任何恶性或恶性前肿瘤病症。它可以属于任何组织或器官。在一个实施方案中，癌症可表现为实体瘤。在另一个实施方案中，癌症可属于或位于造血系统中。它可以是原发癌或继发癌或者转移癌。因此，癌症可以是胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、脑癌、血癌、骨癌、皮肤癌、肺癌或胃癌。在一些实施方案中，癌症选自胰腺癌、胰腺导管腺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、肝细胞癌、尿路上皮膀胱癌、脑癌、胶质母细胞瘤、急性淋巴母细胞白血病、骨肉瘤、黑素瘤、间皮瘤、胃癌、口腔鳞状细胞癌、食道癌、结直肠癌、肺癌。

在另一方面，本发明提供了如本文所定义的蛋白质，例如融合蛋白，其用于治疗代谢性疾病。代谢性疾病可以是胰岛素抗性或葡萄糖不耐受或者可以与其相关。在一些实施方案中，代谢性疾病选自2型糖尿病和代谢综合征。

本发明的融合蛋白也可用于上述病症的治疗方法中。类似地，本发明的融合蛋白可用于制备用于治疗上述病症的药物的方法中。

实施例

实施例1

根据本发明的融合蛋白的表达

在该实施例中，描述了提供包含N端融合肽接头(SEQ ID No.20)的CCN5的氨基酸194至246(SEQ ID No.1)和SEQ ID No.15的IgG亚类IgG4的Fc片段(S228P、F234A、L235A、K447-，Eu编号)的融合蛋白(CCN5(dIII)-Fcv2)(即根据SEQ ID No.28的融合蛋白)。该融合蛋白还附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的N端信号序列，并如下文所公开的在哺乳动物细胞中表达。

序列SEQ ID NO.36所示的DNA序列由商业供应者合成并进行序列验证。通过BP通路重组酶克隆将合成的序列与pDonrZeo重组以产生入门载体。在转染经突变以允许质粒的有效繁殖的感受态大肠杆菌(One Shot Top10^TM细胞)后，用标准质粒分离技术通过使用来自Qiagen^TM的QIAprep^TM Spin Miniprep试剂盒分离入门载体。在质粒分离之后，根据技术人员熟知的标准技术，通过限制酶消化随后通过DNA凝胶电泳验证入门载体。

使用LR通路重组酶将含有序列SEQ ID NO.35的入门载体进一步与目的载体重组。使用的目的载体是pUCOE-DHFR-DEST，如

et al.，2018(同上)所述。

在转染经突变以允许质粒的有效繁殖的感受态大肠杆菌(One Shot Top10^TM细胞)后，用标准质粒分离技术使用QIAGEN^TM Plasmid Plus Maxi试剂盒分离表达载体。根据技术人员熟知的标准技术，通过标准限制酶消化和DNA凝胶电泳验证所得表达载体。然后根据Expifectamine^TM CHO转染试剂盒(Gibco目录号：A29129)制造商提供的“最大滴度”方案并且如

et al.，2018(同上)所简述的，将所得表达载体转移到ExpiCHO适应悬浮培养的CHO细胞中。转染之后6天，通过在4℃下以4750g离心20分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至1mM浓度，并添加0.5M EDTA至2mM浓度。然后，添加96％乙醇至约3％的最终浓度。添加1M TrisHCl pH 7.4至25mM的最终浓度，然后进行色谱纯化。

纯化的捕获步骤通过具有蛋白A色谱介质的亲和色谱法进行。本实验中使用的介质是rProtein A FF(GE Healthcare)。使用5mL的HiTrap^TM rProtein A FF柱(GEHealthcare)从如上所述收获和补充的60mL细胞培养基中纯化表达的重组蛋白。HiTrap^TMrProtein A FF柱安装在配备有5mm UV流动池的FPLC色谱系统(BioRad NGC Discover^TM 10Pro系统)上，并用含有25mM TrisHCl pH 7.4、25mM NaCl和3％乙醇的缓冲液进行平衡。用样品泵以2.5ml/分钟的速度上样含有重组蛋白的收获的细胞培养基，然后用6个柱体积的洗涤缓冲液(25mM TrisHCl pH 7.4、25mM NaCl和3％乙醇)洗涤，然后用3％乙醇中的0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)洗脱。将UV 280Bm吸光度超过100mAU的洗脱液以3mL的级分收集在预填充有1mL 1M TrisHCl pH 9.0的低蛋白结合管中。使用

20mL、30kDA MWCO浓缩装置将含有UV吸收峰的级分浓缩至500μL。浓缩后，将样品上样到FPLC色谱系统(BioRadNGC Discover^TM 10 Pro系统)上的样品上样环中。FPLC色谱系统配备有用50mM NaCl、20mMHEPES pH7.0进行平衡的

200Increase 10/300GL柱(GE Healthcare)。注入样品，并将柱用预平衡缓冲液(50mM NaCl，20mM HEPES pH 7.0)以0.25mL/分钟的流量灌注。发现主要的UV 280nm吸收峰含有经纯化的重组蛋白(CCN5(dIII)-Fcv2，SEQ ID No.28)。使用

TGX Stain-Free^TM预制凝胶对10μL收集的级分样品进行SDS-PAGE，并利用ChemiDoc^TM成像系统(BioRad)使分离的重组蛋白显现。

技术人员众所周知，重组蛋白可在多种表达系统中产生并通过多种色谱方法纯化，结果类似。

实施例2

表达了编码融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白包含N端融合肽接头(SEQ IDNo.20)的CCN5的氨基酸194至246(SEQ ID No.1)和SEQ ID No.15的IgG亚类IgG4的Fc片段(S228P、F234A、L235A、K447-，Eu编号)(CCN5(dII｀-Fcv2)，以产生根据SEQ ID NO.28的重组蛋白。

测试获得的蛋白质在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力(图1A)。用纤连蛋白(Sigma目录号F1141，在

Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(Lonza目录号17-512F，以下称为PBS)中稀释至10μg/mL)包被经组织培养处理的Corning Incorporated

96孔无菌聚苯乙烯板。将含有纤连蛋白的包被溶液以100μL/孔的体积分配到孔中，在室温下孵育1小时，然后倾析包被溶液，还将100μL PBS分配到同样倾析的纤连蛋白包被的孔中。将传代培养以保持最大80％汇合的密度的A549细胞通过酶处理(来自

的

目录号L0950-100)分离，在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)(平衡至室温的具有FBS(来自Gibco，目录号16000-044)的500mL烧瓶在60℃温度的水浴中振荡孵育30分钟)和50μg/ml gensumycin(Sanofi)的含有高葡萄糖的Dulbecco’s改良Eagle培养基(Gibco目录号：41965-039)中稀释至浓度为110000个细胞/mL，并将100μL细胞溶液分配至纤连蛋白包被的孔中。所有细胞孵育均在维持37℃的温度、湿润室内空气气氛和5％CO2的细胞培养箱中进行。过夜孵育后，将A549细胞在PBS中洗涤两次，并将含有高葡萄糖和50μg/ml gensumycin(Sanofi)不含FBS的90μL Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM，Gibco目录号：41965-039)分配至孔中。在不含FBS的培养基中孵育18小时之后，用10μL所讨论重组蛋白的溶液刺激细胞。刺激60分钟之后，倾析培养基，并通过添加50μL裂解缓冲液以及根据Cisbio磷酸化AKT(Ser473)试剂盒(Cisbio Inc，目录号：64AKSPEG)提供的封闭试剂收获细胞。添加裂解缓冲液以及封闭试剂后，将96孔板在PST-60HL plus(ThermoFisher)板摇动器上以500rpm孵育60分钟。摇动后，将裂解的样品磨碎(tritrurate)，然后将16μL从每个孔转移到白壁HTRF 96孔低容量板(Cisbio Inc.，目录号：66PL96025)。为了测定磷酸化AKT(Ser473)的量，将4μL标记的抗体的混合物(来自Cisbio Inc的磷酸化AKT d2和磷酸化AKT穴合物的50/50体积/体积混合物，目录号：64AKSPEG)添加到每个孔(对阴性对照孔仅使用穴合物抗体)，将板用粘合塑料膜密封并在4℃下孵育过夜，然后在配备有TR-FRET记录头和337nm发射以及615nm和665nm激发滤波器的PolarStar Omega读板仪(BMG Labtech，Germany)上读取。空白校正665nm和615nm激发记录之间的比率，重组蛋白刺激的孔的值表示为载剂刺激的孔的百分比。

实施例3

表达了编码融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白包含N端融合肽接头(SEQ IDNo.20)的CCN5的氨基酸194至246(SEQ ID No.1)和SEQ ID No.15的IgG亚类IgG4的Fc片段(S228P、F234A、L235A、K447-，Eu编号)(CCN5(dIII)-Fcv2)，以产生根据SEQ ID NO.28的重组蛋白。

测试获得的蛋白质在IMR90人肺成纤维细胞中抑制促纤维化TGF-β刺激的转录(来自SMAD2/3结合顺式元件)的能力(图1D)。测定在技术上如

et al.(2018)(同上)中所述进行，不同之处在于使用2500个IMR90肺成纤维细胞/孔代替Rat2细胞。用于刺激的蛋白质如图1D中所示。IMR90细胞在使用前如上文针对A549细胞所述进行传代培养。IMR90细胞在第20代之前，即在达到复制性衰老之前使用。

实施例4

测试获得的蛋白质抑制人肺成纤维细胞系IMR90增殖的能力(图1B)。IMR90细胞在使用前如上文针对A549细胞所述进行传代培养。IMR90细胞在第20代之前，即在达到复制性衰老之前使用。对于实验，如上文针对A549细胞所述收获IMR90细胞，在PBS中洗涤，在含有1％FBS和gensumycin的DMEM中稀释，如上述实验2所述，并以12000/孔的密度接种在xCELLigence阻抗板中。2小时之后，用10μL的所讨论重组蛋白的溶液或FBS刺激细胞，并再孵育72小时，然后用

(Promega Inc.)收获，如

et al.(2018)(同上)中所述。

实施例5

测试获得的蛋白质抑制雌激素受体阳性乳腺癌细胞系MCF-7和三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的球体形成能力(锚定非依赖性生长)的能力(图1C)，如

et al.(同上)中所述。与如

et al.(同上)中针对MCF-7细胞系所述相同地对MDA-MB-231细胞进行处理。MCF-7和MDA-MB-231细胞系如上文针对A549细胞系所述进行传代培养。

实施例6

表达了编码融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白包含N端融合肽接头(SEQ IDNo.20)的CCN5的氨基酸194至246(SEQ ID No.1)和SEQ ID No.15的IgG亚类IgG4的Fc片段(S228P、F234A、L235A、K447-，Eu编号)(CCN5(dIII)-Fcv2)、SEQ ID No.18的IgG亚类IgG4的Fc片段(S228P、E233P、F234V、L235A、G236-、K447-，Eu编号)(CCN5(dIII)-Fcv2.1)或IgG2/4亚类的嵌合Fc片段(SEQ ID No.19)(CCN5(dIII)-Fcv2.3)，以产生根据SEQ ID NO.28(CCN5(dIII)-Fcv2)、SEQ ID No.29(CCN5(dIII)-Fcv2.1)和SEQ ID No.30(CCN5(dIII)-Fcv2.3)的重组蛋白。

具体地，根据Expifectamine^TM CHO转染试剂盒(Gibco目录号：A29129)制造商提供的“最大滴度”方案并且如

et al.，2018(同上)所简述的，将编码用于表达SEQ IDNO.28(CCN5(dIII)-Fcv2)、SEQ ID NO.29(CCN5(dIII)-Fcv2.1)和SEQ ID NO.30(CCN5(dIII)-Fcv2.3)的表达载体转染到ExpiCHO适应悬浮培养的CHO细胞中。在转染之后6天，通过在Heraeus biofuge pico台式离心机中以13000rpm离心5分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。利用

TGX Stain-Free^TM预制凝胶通过SDS-PAGE分离收获的细胞培养上清液样品，并利用ChemiDoc^TM成像系统(BioRad)使重组蛋白显现。然后使用Trans-Blot-Turbo半干印迹系统(Bio-Rad)将分离的蛋白质转移到PVDF膜，以进行Western印迹分析。使用与辣根过氧化物酶(Invitrogen目录号：A10654)缀合的抗人IgG4抗体探测印迹，所述抗体与SuperSignal^TM West Femto最大灵敏度底物(ThermoFisherScientific)和ChemiDoc^TM成像系统(BioRad)结合使用以进行可视化。

在图2中，显示了证明由IgG2/4嵌合体构成的Fc片段骨架(SEQ ID No.19所示)的蛋白酶抗性改善的数据。

在ExpiCHO系统中表达了与具有以下的IgG4Fc片段融合的CCN5/WISP2(结构域III)：免疫效应沉默的IgG4铰链(如SEQ ID No.28所限定)，CCN5(结构域III)-Fcv2；并入基于IgG2的突变的相同的IgG4骨架(如SEQ ID No.29所限定)，CCN5(结构域III)-Fcv2.1；或具有来自IgG2的完整铰链区的相同IgG4骨架(如SEQ ID No.30所限定)，CCN5(结构域III)-Fcv2.3，并且在6天之后收获条件培养基(CM)。SDS-PAGE凝胶的Western印迹和总蛋白染色揭示CCN5(结构域III)-Fcv2.3变体对培养过程中存在的蛋白酶最不易感。注意随着来自IgG2序列的替换，抗IgG4抗体对Fc片段的免疫反应性部分丧失，并因此低估了相对于一般蛋白质染色的蛋白质水平。

实施例7

表达了编码融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白包含N端融合SEQ ID No.20中所示的肽接头的CCN5的氨基酸194至246(SEQ ID No.1)和IgG2/4亚类的嵌合Fc片段(SEQ IDNo.19)(CCN5(dIII)-Fcv2.3)或者SEQ ID No.25所示的肽接头和IgG2/4亚类的嵌合Fc片段(SEQ ID No.19)(CCN5(dIII)-HLn8-Fcv2.3)，以产生根据SEQ ID NO.30(CCN5(dIII)-Fcv2.3和SEQ ID No.31(CCN5(dIII)-HLn8-Fcv2.3)的重组蛋白。

et al.，2018(同上)所简述的，将编码用于表达SEQ IDNO.30(CCN5(dIII)-Fcv2.3)和SEQ ID NO.31(CCN5(dIII)-HLn8-Fcv2.3)的表达载体转染到ExpiCHO适应悬浮培养的CHO细胞中。在转染之后4天，通过在Heraeus biofuge pico台式离心机中以13000rpm离心5分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。利用

Stain-Free^TM预制凝胶通过SDS-PAGE分离收获的细胞培养上清液样品。使用Trans-Blot-Turbo半干印迹系统(Bio-Rad)将分离的蛋白质转移到PVDF膜，以进行Western印迹分析。使用与辣根过氧化物酶(Invitrogen目录号：A10654)缀合的抗人IgG4抗体探测印迹，所述抗体与SuperSignal^TM West Femto最大灵敏度底物(ThermoFisherScientific)和ChemiDoc^TM成像系统(BioRad)结合使用以进行可视化。

在图3中，提供了显示当本发明实施方案并入如SEQ ID NO.25所示的肽接头时聚集趋势降低的数据。

来自表达CCN5(结构域III)的瞬时转染CHO悬浮细胞的CM的非还原性SDS-PAGE，所述CCN5(结构域III)通过多种肽接头与嵌合的IgG2/4Fc片段的氨基末端融合。Western印迹揭示了具有如SEQ ID No.31所示的氨基酸序列的融合蛋白(dIII)-HLn8-Fcv2.3具有比具有如SEQ ID No.30所示氨基酸序列的本发明融合蛋白CCN5(结构域III)-Fcv2.3更低的聚集倾向。该发现表明，与含有序列SEQ ID No.20中限定的肽接头的融合蛋白相比，序列SEQID No.25中限定的肽接头提供了更低的融合蛋白聚集趋势。

实施例8

表达了编码融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白包含C端融合肽接头(SEQ IDNo.39)的CCN5的氨基酸194至246(SEQ ID No.1)或CCN5的氨基酸194至246(SEQ ID No.7)(其中第195位的氨基酸(脯氨酸)替换为丙氨酸)和SEQ ID No.15的IgG亚型IgG4的Fc片段(S228P、F234A、L235A、K447-，Eu编号)，以产生根据SEQ ID NO.：40(Fc-HLn8-CCN5(dIII))或SEQ ID No.41(Fc-HLn8-CCN5(dIII)-P195A)的重组蛋白。

et al.，2018(同上)所简述的，将编码用于表达SEQ IDNO.：40(Fc-HLn8-CCN5(dIII))和SEQ ID NO.：41(Fc-HLn8-CCN5(dIII)-P195A)的表达载体转染到ExpiCHO适应悬浮培养的CHO细胞中。在转染之后3天，通过在Heraeus biofuge pico台式离心机中以13000rpm离心5分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。利用

在图5中，提供了显示当本发明实施方案并入CCN5 TSP-1重复同源结构域的脯氨酸195突变(如SEQ ID No 7所示)时，对内肽酶切割的易感性降低的数据。

来自表达CCN5(结构域III)的瞬时转染CHO悬浮细胞的CM的还原性SDS-PAGE，所述CCN5(结构域III)与并入P195A突变(Fc-HLn8-CCN5(dIII)-P195A)或表达CCN5 TSP-1重复同源结构域的野生型P195变体(Fc-HLn8-CCN5(dIII))的如SEQ ID No.15中所示的IgG4Fc片段的羧基末端融合。该印迹表明P195A突变对CCN5的TSP-1重复同源结构域提供蛋白水解抗性。

实施例9

公开了包含N端融合肽接头(SEQ ID No.57)的人CCN5的氨基酸194至250(SEQ IDNo.56)和SEQ ID No.15的人IgG亚类IgG4的Fc片段(S228P、F234A、L235A、K447-，Eu编号)导致对应于SEQ ID No.58(CCN5(dIII)-SL-Fcv0)的蛋白质序列的融合蛋白。该融合蛋白还附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，以产生对应于SEQ ID No.59的融合蛋白，并如下文所公开在哺乳动物细胞中表达。

编码SEQ ID No.59的融合蛋白的DNA序列是对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端处附加用于翻译的KOZAK序列，并且在3’端处引入终止密码子，得到SEQ ID.No.60的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.61的DNA序列。SEQ ID No.61的序列由商业供应者合成并验证。通过BP通路重组酶克隆将合成的序列与pDonrZeo重组以产生入门载体。在转染经突变以允许质粒的有效繁殖的感受态大肠杆菌(One Shot Top10^TM细胞)后，用标准质粒分离技术通过使用来自Qiagen^TM的QIAprep^TMSpin Miniprep试剂盒分离入门载体。在质粒分离之后，根据技术人员熟知的标准技术，通过限制酶消化随后通过DNA凝胶电泳验证入门载体。

使用LR通路重组酶将含有序列SEQ ID NO.60的入门载体进一步与目的载体重组。使用的目的载体是pUCOE-DHFR-DEST，如

et al.，2018，J.Biol.Chem，293：46，pp.17953-17970所述。

在转染经突变以允许质粒的有效繁殖的感受态大肠杆菌(One Shot Top10^TM细胞)后，用标准质粒分离技术使用QIAGEN^TM Plasmid Plus Maxi试剂盒分离表达载体。根据技术人员熟知的标准技术，通过标准限制酶消化和DNA凝胶电泳验证所得表达载体。然后根据Expifectamine^TMCHO转染试剂盒(Gibco目录号：A29129)制造商提供的“最大滴度”方案并且如

et al.，2018(同上)所简述的，将所得表达载体转染到适应悬浮培养的ExpiCHO细胞中。转染之后4天，通过在4℃下以4750xg离心20分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至1mM浓度，并添加0.5M EDTA至2mM浓度。然后，添加96％乙醇至约3％的最终浓度。添加1M TrisHCl pH 7.4至25mM的最终浓度，然后进行色谱纯化。

将蛋白质通过利用蛋白A色谱介质的亲和色谱法进行纯化。本实验中使用的色谱介质是rProtein A FF(GE Healthcare)。使用5mL的HiTrap^TM rProtein A FF柱(GEHealthcare)从如上所述收获和补充的120mL细胞培养基中纯化表达的重组蛋白。HiTrap ^TMrProtein A FF柱安装在配备有5mmUV流动池的FPLC色谱系统(BioRad NGC Discover^TM 10Pro系统)上，并用含有25mM TrisHCl pH 7.4、25mM NaCl和3％乙醇的缓冲液进行平衡。用样品泵以2.5ml/分钟的速度上样含有重组蛋白的收获的细胞培养基，然后用10个柱体积的洗涤缓冲液(25mM TrisHCl pH 7.4、25mM NaCl和3％乙醇)洗涤，然后用3％乙醇中的0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)洗脱。将3mL洗脱的级分收集在预填充有1mL 1M TrisHCl pH 9.0的低蛋白结合管中。用280nm UV吸光度监测蛋白质洗脱，并在存在或不存在还原剂β-巯基乙醇的情况下利用

Stain-Free^TM预制凝胶对含有UV 280nm吸收峰的10μL合并级分样品进行SDS-PAGE，并利用ChemiDoc^TM成像系统(BioRad)使分离的重组蛋白显现。

在图6中，显示在没有还原剂β-巯基乙醇的情况下，对应于SEQ ID No.58的蛋白质的表达和纯化确实导致比预期迁移更高的蛋白质，从而表明二聚体的形成。然而，如从含有在存在还原剂β-巯基乙醇的情况下纯化的蛋白质的泳道中可以看出的，对应于SEQ IDNo.58的蛋白质的表达和纯化主要导致切割片段而不是完整的蛋白质。

实施例10

为了试图提高对应于SEQ ID No.58的蛋白质的蛋白水解抗性，产生了SEQ IDNo.58序列的多个变体。DNA序列由商业供应者合成并进行验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所述的质粒和如实施例9中所述的表达的蛋白质。变体包括具有如下所列的修饰的蛋白质：

1)SEQ ID NO.32的源自白蛋白的N端信号序列氨基端至由与对应于SEQ ID NO.63的截短肽接头组合的对应于SEQ ID NO.62的并入突变(P245L)的氨基酸194至249和SEQ IDNO.15的Fc片段构成的CCN5的片段，导致对应于SEQ ID No.64的序列，

2)SEQ ID NO.32的源自白蛋白的N端信号序列氨基端至由与对应于SEQ ID NO.65的肽接头变化形式组合的对应于SEQ ID NO.1的氨基酸194至246和SEQ ID NO.15的Fc片段构成的CCN5的片段，导致对应于SEQ ID No.66的序列，

3)SEQ ID NO.32的源自白蛋白的N端信号序列氨基端至由与对应于SEQ ID NO.67的肽接头变化形式组合的对应于SEQ ID NO.1的氨基酸194至246和SEQ ID NO.15的Fc片段构成的CCN5的片段，导致对应于SEQ ID No.68的序列，

4)SEQ ID NO.32的源自白蛋白的N端信号序列氨基端至由与对应于SEQ ID NO.65的肽接头变化形式组合的对应于SEQ ID NO.1的氨基酸194至246和SEQ ID NO.19的Fc片段构成的CCN5的片段，导致对应于SEQ ID No.69的序列。

如实施例9中所述进行的，实施例12中公开的这些蛋白质的迭代(1至4，上文)确实显示出在ExpiCHO系统中表达期间其对蛋白水解切割的抗性的一些改善。然而，对应于SEQID No.64、SEQ ID No.66、SEQ ID No.68和SEQ ID 69的蛋白质的表达揭示了蛋白水解抗性的程度仍然不足以允许产生完整的纯化的蛋白质。

实施例11

产生了包含N端融合肽接头(SEQ ID No.21)的CCN5的氨基酸194至237(其中第195位的氨基酸(脯氨酸)替换为丙氨酸)(SEQ ID No.38)和具有羧基端K477-(Eu编号)缺失的IgG亚型IgG2/4的嵌合Fc片段(SEQ ID No.19)导致SEQ ID No.27的融合蛋白。该融合蛋白还附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，以产生对应于SEQ IDNo.70的融合蛋白。编码SEQ ID No.70的融合蛋白的DNA序列是对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端处附加用于翻译的KOZAK序列，并且在3’端处引入终止密码子，得到SEQ ID.No.71的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.72的DNA序列。

DNA序列由商业供应者合成并进行验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所述的质粒和通过瞬时转染如实施例9中所述的ExpiCHO细胞而表达的对应于SEQ ID No.70的蛋白质。

转染之后6天，通过在4℃下以4750xg离心20分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至0.1mM浓度。添加1M柠檬酸钠pH5.5至30mM的最终浓度，然后进行色谱纯化。

将蛋白质通过串联色谱法纯化，该色谱法由以下构成：用1mL HiTrap ^TMMabSelectSuRe^TM柱(GE Healthcare)的捕获步骤，紧接着是用BioScale^TM Mini

10mL柱(BioRad)进行脱盐。柱安装在配备有5mm UV流动池的FPLC色谱系统(BioRad NGC Discover^TM 10 Pro系统)上。MabSelectSuRe^TM柱安装在第一柱切换阀上，并用由30mM柠檬酸钠pH 5.5构成的缓冲液进行平衡，而

柱安装在第二柱切换阀上，并用缓冲液A2(100mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄pH 6.5)进行平衡。通过将含有

柱的第二柱切换阀设置为旁通，将140mL含有重组蛋白的收获的细胞培养基用样品泵以2.0ml/分钟的速度上样到MabSelectSuRe^TM柱上，随后用5个柱体积的洗涤缓冲液A1(30mM柠檬酸钠pH 5.5)进行洗涤，随后用5个柱体积的洗涤缓冲液A3(30mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH 5.5)进行洗涤，随后用3个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤。将安装在第二柱切换阀上的

柱切换至进入流道，然后使用洗脱缓冲液(30mM柠檬酸pH 3.4)进行洗脱。用2mL洗脱缓冲液洗脱后，将MabSelectSuRe^TM柱从流道中切换出来，并用缓冲液A2从

柱中洗脱经纯化的蛋白质。用280nm UV吸光度监测蛋白质洗脱，并且一旦吸光度超过100mAU就会触发收集。合并收集的级分，并在存在还原剂β-巯基乙醇的情况下利用

TGX Stain-Free^TM预制凝胶对10μL样品进行SDS-PAGE，并利用ChemiDoc^TM成像系统(BioRad)使分离的重组蛋白显现。

在图7中，显示与其中包含CCN5的所有羧基端氨基酸的变体(如SEQ ID NO.58、64、66、68和69)相比，对应于SEQ ID NO.27(其中CCN5的羧基端尾被截短)的蛋白质的表达和纯化具有显著更大的蛋白质水解抗性，即使相对于实施例9在传代培养之后另外2天收获细胞培养基(图6)。

实施例12

产生了包含N端融合肽接头(SEQ ID No.21)的CCN3的氨基酸206至249(其中第207位的氨基酸(异亮氨酸)替换为丙氨酸)(SEQ ID No.44)和具有羧基端K477-(Eu编号)缺失的IgG亚型IgG2/4的嵌合Fc片段(SEQ ID No.19)的融合蛋白，导致SEQ ID No.73的融合蛋白。该融合蛋白还附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，以产生对应于SEQ ID No.74的融合蛋白。编码SEQ ID No.74的融合蛋白的DNA序列是对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端处附加用于翻译的KOZAK序列，并且在3’端处引入终止密码子，得到SEQ ID.No.75的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.76的DNA序列。

DNA序列由商业供应者合成并进行验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所述的质粒并通过瞬时转染如实施例9中所述的ExpiCHO细胞表达对应于SEQ ID No.74的蛋白质。

转染之后5天，通过在4℃下以4750xg离心20分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至0.1mM浓度。添加1M柠檬酸钠pH 5.5至30mM的最终浓度，然后进行色谱纯化。

将蛋白质通过串联色谱法纯化，该色谱法由以下构成：用5mL HiTrap^TMMabSelectSuRe ^TM柱(GE Healthcare)的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行脱盐。柱安装在配备有5mm UV流动池的FPLC色谱系统(BioRad NGCDiscover^TM 10 Pro系统)上。MabSelectSuRe^TM柱安装在第一柱切换阀上，并用由30mM柠檬酸钠pH 5.5构成的缓冲液进行平衡，而HiPrep^TM柱安装在第二柱切换阀上，并用缓冲液A2(100mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄pH 6.5)进行平衡。通过将含有HiPrep^TM柱的第二柱切换阀设置为旁通，将260mL含有重组蛋白的收获的细胞培养基用样品泵以3.5ml/分钟的速度上样到MabSelectSuRe^TM柱上，随后用5个柱体积的洗涤缓冲液A1(30mM柠檬酸钠pH 5.5)进行洗涤，随后用5个柱体积的洗涤缓冲液A3(30mM柠檬酸钠，0.5M NaCl，pH 5.5)进行洗涤，随后用2个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤。将安装在第二柱切换阀上的HiPrep^TM柱设置为进入流道，然后使用洗脱缓冲液(30mM柠檬酸pH 3.4)进行洗脱。用10mL洗脱缓冲液洗脱后，将MabSelectSuRe^TM柱从流道中切换出来，并用缓冲液A2从HiPrep^TM柱中洗脱经纯化的蛋白质。通过在280nm处的UV吸光度监测蛋白质洗脱，并且一旦吸光度超过100mAU就会触发收集。合并收集的级分，并在存在或不存在还原剂β-巯基乙醇的情况下利用

在图8中可以看出，如SEQ ID No 73所公开的含有来源于CCN3/Nov(结构域III/TSP-1同源结构域)的氨基酸的融合蛋白，类似于如SEQ ID No.27所公开的含有来源于同源CCN5(结构域III/TSP-1同源结构域)的氨基酸的融合蛋白，具有与如实施例11中所述和图7中所示的含有来源于CCN5的氨基酸的融合蛋白类似或比其更好的蛋白水解抗性。

实施例13

包含C端融合肽接头(SEQ ID No.39)的CCN5的氨基酸194至246(其中第195位的氨基酸(脯氨酸)替换为丙氨酸)(SEQ ID No.7)和SEQ ID NO.15的IgG亚类IgG4的Fc片段(S228P、F234A、L235A、K447-，Eu编号)导致对应于SEQ ID No.41的蛋白质序列的融合蛋白附加SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，导致对应于SEQ ID No.77的融合蛋白。编码SEQ ID No.77的融合蛋白的DNA序列是对仓鼠细胞中的蛋白表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端处附加用于翻译的KOZAK序列，在3’端处引入终止密码子，得到SEQ ID.No.78的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.79的DNA序列。

SEQ ID No.79的序列由商业供应者合成并进行序列验证。通过BP通路重组酶克隆将合成的序列与pDonrZeo重组以产生入门载体。在转染经突变以允许质粒的有效繁殖的感受态大肠杆菌(One Shot Top10^TM细胞)后，用标准质粒分离技术通过使用来自Qiagen^TM的QIAprep^TM Spin Miniprep试剂盒分离入门载体。在质粒分离之后，根据技术人员熟知的标准技术，通过限制酶消化随后通过DNA凝胶电泳验证入门载体。

使用LR通路重组酶将含有序列SEQ ID No.78的入门载体进一步与目的载体重组。使用的目的载体是pUCOE-DHFR-DEST，如

et al.，2018，J.Biol.Chem，293：46，pp.17953-17970所述。

在转染经突变以允许质粒的有效繁殖的感受态大肠杆菌(One Shot Top10^TM细胞)后，用标准质粒分离技术使用QIAGEN^TM Plasmid Plus Maxi试剂盒分离表达载体。根据技术人员熟知的标准技术，通过标准限制酶消化和DNA凝胶电泳验证所得表达载体。然后利用Neon转染系统(ThermoFisherScientific)通过电穿孔将所得表达载体转移到适应悬浮培养的DG44CHO细胞中。

将细胞维持在保持37℃和8％CO₂的细胞培养箱中摇动平台上的开口型锥形瓶(Erlenmeyer flask)中(如

al.，(同上)所述)。经转染的细胞在CD DG44细胞培养基(Gibco，目录号12610-010)中保持过夜，然后转移至HyClone^TM ActiPro^TM培养基(不含次黄嘌呤和胸苷，GE Healthcare)并传代培养，直到生存力接近80％，此时向培养基补充0.1μM氨甲蝶呤。添加0.1μM氨甲蝶呤后，将细胞进行传代培养，直到生存力再次接近80％，此时向培养基补充1μM氨甲蝶呤。将细胞再次传代培养，直到生存力超过98％且倍增时间降低至小于26小时，此时认为细胞合并物是稳定转染的。一旦建立了稳定的细胞合并物，则扩大细胞培养体积，以允许以1×10^6个细胞/mL的密度接种稳定转染的细胞以用于生产。自传代培养之后第3天起每天向细胞培养物补充4/0.4％v/v HyClone^TM Cell Boost^TM 7a/7b。10天之后，通过在4℃下以4750xg离心20分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至0.1mM浓度。添加1M柠檬酸钠pH 5.5至30mM的最终浓度，然后进行色谱纯化。

蛋白质通过串联色谱法纯化，该色谱法由以下构成：用5mL HiTrap^TMMabSelectSuRe ^TM柱(GE Healthcare)的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行脱盐，如实施例15中所述。随后测试经纯化的蛋白制剂(未显示蛋白水解加工的迹象)在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力，如实施例2中所述。从图9可以看出，从稳定转染的CHO悬浮细胞合并物中产生的对应于SEQ ID No.41的经纯化的蛋白质出人意料地没有显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的能力的迹象。

产生了包含N端融合肽接头(SEQ ID No.22)的CCN3的氨基酸氨基酸206至249(SEQID No.44)(其中第207位的氨基酸(异亮氨酸)被替换为丙氨酸)和IgG亚型IgG2/4的嵌合Fc片段(SEQ ID No.19)得到对应于SEQ ID No.80的蛋白质序列的融合蛋白，该融合蛋白附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，得到对应于SEQ ID No.81的融合蛋白。编码SEQ ID No.81的融合蛋白的DNA序列是针对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端附加用于翻译的KOZAK序列以及在3’端引入终止密码子，得到SEQ ID No.82的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.83的DNA序列。

SEQ ID No.83的序列由商业供应者合成并进行序列验证。通过BP通路重组酶克隆将合成的序列与pDonrZeo重组以产生入门载体。在转染经突变以允许质粒的有效繁殖的感受态大肠杆菌(One Shot Top10^TM细胞)之后，用标准质粒分离技术通过使用来自Qiagen^TM的QIAprep^TM Spin Miniprep试剂盒分离入门载体。在质粒分离之后，根据技术人员熟知的标准技术，通过限制酶消化随后通过DNA凝胶电泳验证入门载体。

使用LR通路重组酶将含有序列SEQ ID No.82的入门载体进一步与目的载体重组。使用的目的载体是pUCOE-DHFR-DEST，如

et al.，2018，J.Biol.Chem，293：46，pp.17953-17970所述。

在转染经突变以允许质粒的有效繁殖的感受态大肠杆菌(One Shot Top10^TM细胞)之后，用标准质粒分离技术使用QIAGEN^TM Plasmid Plus Maxi试剂盒分离表达载体。根据技术人员熟知的标准技术，通过标准限制酶消化和DNA凝胶电泳验证所得表达载体。随后根据ExpiCHO^TM稳定生产培养基(Gibco目录号：A3711001)的制造商提供的“使用ExpiCHO^TM产品创建和放大稳定细胞系(Creation and Scale up of a Stable Cell Line UsingExpiCHO^TM Products)”方案，将所得表达载体转移到适应ExpiCHO悬浮培养的CHO细胞中。将细胞维持在保持37℃和8％CO₂的细胞培养箱中摇动平台上的开口型锥形瓶中(如

al.，(同上)所述)。将经转染的细胞在ExpiCHO^TM表达培养基中保持过夜，然后转移到补充有0.1μM氨甲蝶呤的ExpiCHO^TM表达培养基中。然后将细胞传代培养，直到生存力再次接近80％，此时向培养基中补充1μM氨甲蝶呤。将细胞再次传代培养，直到生存力超过95％且倍增时间降低至小于20小时，此时认为细胞合并物是稳定转染的。一旦建立了稳定的细胞合并物就扩大细胞培养体积，以允许以1×10⁶个细胞/mL的密度接种稳定转染的细胞以用于生产。5天之后，通过在4℃下以4750xg离心20分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至0.1mM的浓度。添加1M柠檬酸钠pH5.5至30mM的最终浓度，并添加2M L-精氨酸pH4.0至100mM的最终浓度，然后进行色谱纯化。

使用与实施例12中所描述的相同的方案，将蛋白质通过串联色谱法纯化，该串联色谱法由以下构成：用5mL HiTrap^TM MabSelect PrismA^TM柱(GE Healthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行的脱盐，不同之处在于向缓冲液A1、A2、A3和B1添加100mM L-精氨酸。随后如实施例2中所描述的，测试了经纯化蛋白质制剂(未显示蛋白水解加工的迹象)在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力。从图10中可以看出，从稳定转染的CHO悬浮细胞合并物中产生的对应于SEQ ID No.80的经纯化蛋白出人意料地没有显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的能力的迹象，这表明含有来源于CCN5(SEQ ID No.41，实施例13，图9)的氨基酸或来源于CCN3(SEQ ID No.80)的氨基酸的完整的二聚体Fc融合蛋白制剂均不具有生物活性。

实施例15

通过如实施例9中所描述的ExpiCHO^TM细胞的瞬时转染来表达含有编码以下融合蛋白的SEQ ID No.82的实施例14中所描述的表达质粒：该融合蛋白包含N端融合肽接头(SEQID No.22)的CCN3的氨基酸氨基酸206至249(SEQ ID No.44)(其中第207位的氨基酸(异亮氨酸)被替换为丙氨酸)和IgG亚型IgG2/4的嵌合Fc片段(SEQ ID No.19)得到对应于SEQ IDNo.80的蛋白质序列，该融合蛋白还附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，以对应于SEQ ID No.81。在转染之后6天，如实施例14中所描述的将细胞沉淀，并如实施例14中所描述的补充培养基。如实施例14中所描述的，将蛋白质通过串联色谱法纯化，该串联色谱法由以下构成：用5mL HiTrap^TM MabSelect PrismA^TM柱(GE Healthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行的脱盐。

随后如实施例2中所描述的，测试了经纯化蛋白质制剂(其是部分蛋白水解加工的)在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力。从图11可以看出，从瞬时转染的ExpiCHO^TM细胞产生的对应于SEQ ID No.80的经纯化蛋白显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的浓度依赖性能力，这表明用于产生对应于SEQ ID No.80的融合蛋白的表达系统以及因此所观察到的蛋白水解加工水平显著影响所得蛋白质制剂的活性或其缺乏。

实施例16

包含N端融合肽接头(SEQ ID No.21)的CCN3的氨基酸氨基酸206至249(SEQID.No.44)(其中第207位的氨基酸(异亮氨酸)被替换为丙氨酸)和具有单体诱导和半衰期延长突变的Fc片段(SEQ ID No.55)得到对应于SEQ ID No.84的蛋白质序列的融合蛋白附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，得到对应于SEQ ID No.85的融合蛋白。编码SEQ ID No.85的融合蛋白的DNA序列是针对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端附加用于翻译的KOZAK序列以及在3’端引入终止密码子，得到SEQ ID No.86的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.86的DNA序列。DNA序列由商业供应者合成并验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所描述的质粒并通过如实施例9中所描述的ExpiCHO^TM细胞的瞬时转染来表达。在转染之后5天，如实施例14中所描述的将细胞沉淀，并如实施例14中所描述的补充培养基。如实施例14中所描述的，将蛋白质通过串联色谱法纯化，该串联色谱法由以下构成：用5mL HiTrap^TM MabSelect PrismA^TM柱(GE Healthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行的脱盐。

随后如实施例2中所描述的，测试了表现出预期单体形式的经纯化蛋白质制剂在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力。从图12可以看出，对应于SEQ ID No.84的经纯化蛋白质显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的浓度依赖性能力，这表明包含来自CCN蛋白质的结构域III/TSP-1同源结构域的氨基酸的另一种单体融合蛋白具有在A549人肺癌细胞中抑制AKT(丝氨酸-473)磷酸化的能力。

实施例17

包含N端融合肽接头(SEQ ID No.21)的CCN3的氨基酸氨基酸206至249(SEQID.No.44)(其中第207位的氨基酸(异亮氨酸)被替换为丙氨酸)和具有单体诱导和稳定诱导突变的Fc片段(SEQ ID No.54)得到对应于SEQ ID No.88的蛋白质序列的融合蛋白附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，得到对应于SEQ ID No.89的融合蛋白。编码SEQ ID No.89的融合蛋白的DNA序列是针对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端附加用于翻译的KOZAK序列以及在3’端引入终止密码子，得到SEQ ID No.90的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.91的DNA序列。DNA序列由商业供应者合成并验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所描述的质粒并通过如实施例9中所描述的ExpiCHO^TM细胞的瞬时转染来表达。在转染之后6天，如实施例14中所描述的将细胞沉淀，并如实施例14中所描述的补充培养基。如实施例14中所描述的，将蛋白质通过串联色谱法纯化，该串联色谱法由以下构成：用5mL HiTrap^TM MabSelect PrismA^TM柱(GE Healthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行的脱盐。

随后如实施例2中所描述的，测试了主要表现出预期单体形式的经纯化蛋白质制剂在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力。从图13可以看出，对应于SEQ ID No.88的经纯化蛋白质显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的浓度依赖性能力，这表明包含来自CCN蛋白质的结构域III/TSP-1同源结构域的氨基酸的另一种单体融合蛋白具有在A549人肺癌细胞中抑制AKT(丝氨酸-473)磷酸化的能力。

实施例18

包含N端融合肽接头(SEQ ID No.93)的CCN3的氨基酸氨基酸206至249(SEQID.No.44)(其中第207位的氨基酸(异亮氨酸)被替换为丙氨酸)和含有6xHis标签、Halo标签和Sumo*元件(Sumo*element)的多功能标签(SEQ ID No.92)得到对应于SEQ ID No.94的蛋白质序列的融合蛋白附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，得到对应于SEQ ID No.114的融合蛋白。编码SEQ ID No.114的融合蛋白的DNA序列是针对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端附加用于翻译的KOZAK序列以及在3’端引入终止密码子，得到SEQ ID No.95的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.96的DNA序列。DNA序列由商业供应者合成并验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所描述的质粒并通过如实施例15中所描述ExpiCHO^TM细胞的瞬时转染来表达。在转染5天之后，如实施例14中所描述的将细胞沉淀。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至0.1mM的浓度，添加1M柠檬酸钠pH5.5至30mM的最终浓度，并添加2M L-精氨酸pH4.0至0.1M的最终浓度，并添加咪唑至5mM的最终浓度，然后进行色谱纯化。

将蛋白质通过串联色谱法纯化，该串联色谱法由以下构成：用5mL HiTrap^TMHisTrap^TM excel柱(GE Healthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行的脱盐。将柱安装在配备有5mm UV流动池的FPLC色谱系统(BioRad NGC Discover^TM 10Pro系统)上。将HisTrap^TM柱安装在第一柱切换阀上，并用由5mM咪唑、50mM NaCl、100mM L-精氨酸构成的A1缓冲液进行平衡，而将HiPrep^TM柱安装在第二柱切换阀上，并用缓冲液A2(100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸pH6.5)进行平衡。通过将含有HiPrep^TM柱的第二柱切换阀设置为旁通，将250mL含有重组蛋白的收获的细胞培养基用样品泵以3.5ml/分钟的速度上样到HisTrap^TM柱上，随后用5个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤，随后用5个柱体积的洗涤缓冲液A3(5mM咪唑、0.5M NaCl、100mM L-精氨酸)进行洗涤，随后用2个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤。将安装在第二柱切换阀上的HiPrep^TM柱设置为进入流道，然后用洗脱缓冲液(250mM咪唑、50mM NaCl、100mM L-精氨酸)进行洗脱。用10mL洗脱缓冲液进行洗脱之后，将HisTrap^TM柱从流道中切换出来，并用缓冲液A2从HiPrep^TM柱洗脱经纯化的蛋白质。通过在280nm处的UV吸光度监测蛋白质洗脱，并且一旦吸光度超过60mAU就会触发收集。

随后如实施例2中所描述的，测试了表现出预期单体形式的经纯化蛋白质制剂在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力。从图12可以看出，对应于SEQ ID No.94的经纯化蛋白质显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的浓度依赖性能力，这表明包含来自CCN蛋白质的结构域III/TSP-1同源结构域的氨基酸的另一种单体融合蛋白具有在A549人肺癌细胞中抑制AKT(丝氨酸-473)磷酸化的能力。

实施例19

包含N端融合肽接头(SEQ ID No.21)的CCN5的氨基酸194至237(其中第195位的氨基酸(脯氨酸)被替换为丙氨酸)(SEQ ID No.38)和人血清白蛋白的氨基酸25至609(SEQ IDNo.52)得到SEQ ID No.97的融合蛋白附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，得到对应于SEQ ID No.98的融合蛋白。编码SEQ ID No.98的融合蛋白的DNA序列是针对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端附加用于翻译的KOZAK序列以及在3’端引入终止密码子，得到SEQ ID No.99的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.100的DNA序列。

DNA序列由商业供应者合成并验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所描述的质粒，并且如实施例13中所描述的使用经改造以表达组成活性形式的AKT的DG44CHO悬浮细胞来产生表达SEQ ID No.98的蛋白质的CHO悬浮细胞的稳定合并物。一旦建立了稳定的细胞合并物就扩大细胞培养体积，以允许以1×10⁶个细胞/mL的密度接种稳定转染的细胞以用于生产。6天之后，通过在4℃下以4750xg离心20分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至0.1mM的浓度，添加0.5M EDTA至2mM的最终浓度，添加1M柠檬酸钠pH5.5至30mM的最终浓度，并添加2M L-精氨酸pH4.0至0.1M的最终浓度，然后进行色谱纯化。

将蛋白质通过串联色谱法纯化，该串联色谱法由以下构成：用装有3mLCaptureSelect^TM人白蛋白亲和基质(ThermoFisherScientific)的Tricorn柱(GEHealthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行的脱盐。将柱安装在配备有5mm UV流动池的FPLC色谱系统(BioRad NGC Discover^TM 10Pro系统)上。将含有CaptureSelect^TM的柱安装在第一柱切换阀上，并用由100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸pH6.5构成的A1缓冲液进行平衡，而将HiPrep^TM柱安装在第二柱切换阀上，并用缓冲液A1(100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸pH6.5)进行平衡。通过将含有HiPrep^TM柱的第二柱切换阀设置为旁通，将500mL含有重组蛋白的收获的细胞培养基用样品泵以2.0ml/分钟的速度上样到含有CaptureSelect^TM的柱上，随后用5个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤，随后用5个柱体积的洗涤缓冲液A2(100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸、0.25M NaCl，pH6.5)进行洗涤，随后用5个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤。将安装在第二柱切换阀上的HiPrep^TM柱设置为进入流道，然后用洗脱缓冲液(30mM柠檬酸、pH3.5+0.5M L-精氨酸)进行洗脱。在用10mL洗脱缓冲液洗脱之后，将含有CaptureSelect^TM的柱从流道中切换出来，并用缓冲液A1从HiPrep^TM柱洗脱经纯化的蛋白质。通过在280nm处的UV吸光度监测蛋白质洗脱，并且一旦吸光度超过100mAU就会触发收集。

随后如实施例2中所描述的，测试了表现出预期单体形式的经纯化蛋白质制剂在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力。从图14可以看出，对应于SEQ ID No.97的经纯化蛋白质显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的浓度依赖性能力，这表明包含来自CCN蛋白质的结构域III/TSP-1同源结构域的氨基酸的另一种单体融合蛋白具有在A549人肺癌细胞中抑制AKT(丝氨酸-473)磷酸化的能力。

实施例20

人血清白蛋白(氨基酸25至606，SEQ ID No.101)的融合蛋白C端融合肽接头(SEQID NO.22)，所述接头连接人CCN5的氨基酸194至246(其中第195位的氨基酸(脯氨酸)被替换为丙氨酸)(SEQ ID No.7)，得到SEQ ID No.103。对应于SEQ ID No.102的融合蛋白附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，得到对应于SEQ ID No.103的融合蛋白。编码SEQ ID No.103的融合蛋白的DNA序列是针对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端附加用于翻译的KOZAK序列以及在3’端引入终止密码子，得到SEQ ID No.104的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.105的DNA序列。

DNA序列由商业供应者合成并验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所描述的质粒，并且如实施例13中所描述的使用经改造以表达组成活性形式的AKT的DG44CHO悬浮细胞来产生表达SEQ ID No.104的蛋白质的CHO悬浮细胞的稳定合并物。一旦建立了稳定的细胞合并物就扩大细胞培养体积，以允许以1×10⁶个细胞/mL的密度接种稳定转染的细胞以用于生产。6天之后，通过在4℃下以4750xg离心20分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至0.1mM的浓度，添加0.5M EDTA至2mM的最终浓度，添加1M柠檬酸钠pH5.5至30mM的最终浓度，并添加2M L-精氨酸pH4.0至0.1M的最终浓度，然后进行色谱纯化。

如实施例19中所描述的，将蛋白质通过串联色谱法纯化，该串联色谱法由以下构成：用装有3mL CaptureSelect^TM人白蛋白亲和基质(ThermoFisherScientific)的Tricorn柱(GE Healthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GEHealthcare)进行的脱盐，不同之处在于样品上样流量为0.37ml/分钟，而非2.0ml/分钟。

随后如实施例2中所描述的，测试了表现出预期单体形式的经纯化蛋白质制剂在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力。从图14可以看出，对应于SEQ ID No.102的经纯化蛋白质显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的浓度依赖性能力，这表明包含来自CCN蛋白质的结构域III/TSP-1同源结构域的氨基酸的另一种单体融合蛋白具有在A549人肺癌细胞中抑制AKT(丝氨酸-473)磷酸化的能力。

实施例21

包含N端融合肽接头(SEQ ID No.21)的CCN3的氨基酸206至249(其中第207位的氨基酸(异亮氨酸)被替换为丙氨酸)(SEQ ID No.44)和人血清白蛋白的氨基酸25至609(SEQID No.52)得到SEQ ID No.106的融合蛋白附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，得到对应于SEQ ID No.107的融合蛋白。编码SEQ ID No.107的融合蛋白的DNA序列是针对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端附加用于翻译的KOZAK序列以及在3’端引入终止密码子，得到SEQ ID No.108的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.109的DNA序列。

DNA序列由商业供应者合成并验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所描述的质粒并通过如实施例9中所描述的ExpiCHO^TM细胞的瞬时转染来表达。在转染之后6天，如实施例14中所描述的将细胞沉淀，并如实施例19中所描述的补充培养基。将蛋白质通过串联色谱法纯化，该串联色谱法由以下构成：用装有10mL CaptureSelect^TM人白蛋白亲和基质(ThermoFisherScientific)的Tricorn柱(GE Healthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行的脱盐。将柱安装在配备有5mm UV流动池的FPLC色谱系统(BioRad NGC Discover^TM 10 Pro系统)上。将含有CaptureSelect^TM的柱安装在第一柱切换阀上，并用由100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸pH6.5构成的A1缓冲液进行平衡，而将HiPrep^TM柱安装在第二柱切换阀上，并用缓冲液A1(100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸pH6.5)进行平衡。通过将含有HiPrep^TM柱的第二柱切换阀设置为旁通，将500mL含有重组蛋白的收获的细胞培养基用样品泵以1.0ml/分钟的速度上样到含有CaptureSelect^TM的柱上，随后用3个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤，随后用2个柱体积的洗涤缓冲液A2(100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸、0.25M NaCl，pH6.5)进行洗涤，随后用3个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤。将安装在第二柱切换阀上的HiPrep^TM柱设置为进入流道，然后用洗脱缓冲液(30mM柠檬酸、pH3.5+0.1M L-精氨酸)进行洗脱。在用15mL洗脱缓冲液进行洗脱之后，将含有CaptureSelect^TM的柱从流道中切换出来，并用缓冲液A1从HiPrep^TM柱洗脱经纯化的蛋白质。通过在280nm处的UV吸光度监测蛋白质洗脱，并且一旦吸光度超过100mAU就会触发收集。

随后如实施例2中所描述的，测试了含有预期单体形式的经纯化蛋白质制剂在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力。从图12可以看出，对应于SEQ ID No.106的经纯化蛋白质显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的浓度依赖性能力，这表明包含来自CCN蛋白质的结构域III/TSP-1同源结构域的氨基酸的另一种单体融合蛋白具有在A549人肺癌细胞中抑制AKT(丝氨酸-473)磷酸化的能力。

实施例22

包含N端融合肽接头(SEQ ID No.22)的CCN3的氨基酸206至249(其中第207位的氨基酸(异亮氨酸)被替换为丙氨酸)(SEQ ID No.44)和人血清白蛋白的氨基酸25至609(SEQID No.52)得到SEQ ID No.110的融合蛋白附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，得到对应于SEQ ID No.111的融合蛋白。编码SEQ ID No.111的融合蛋白的DNA序列是针对仓鼠细胞中的蛋白质表达进行密码子优化的(通过商业供应者的算法)，并且在5’端附加用于翻译的KOZAK序列以及在3’端引入终止密码子，得到SEQ ID No.112的DNA序列。该DNA序列在两端进一步附加通路attB位点，得到SEQ ID No.113的DNA序列。

DNA序列由商业供应者合成并验证，然后进行亚克隆以产生如实施例9中所描述的质粒并通过如实施例9中所描述的ExpiCHO^TM细胞的瞬时转染来表达。在转染之后6天，如实施例14中所描述的将细胞沉淀，并如实施例19中所描述的补充培养基。将蛋白质通过串联色谱法纯化，该串联色谱法由以下构成：用装有10mL CaptureSelect^TM人白蛋白亲和基质(ThermoFisherScientific)的Tricorn柱(GE Healthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用53mL HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE Healthcare)进行的脱盐。将柱安装在配备有5mm UV流动池的FPLC色谱系统(BioRad NGC Discover^TM 10 Pro系统)上。将含有CaptureSelect^TM的柱安装在第一柱切换阀上，并用由100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸pH6.5构成的A1缓冲液进行平衡，而将HiPrep^TM柱安装在第二柱切换阀上，并用缓冲液A1(100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸pH6.5)进行平衡。通过将含有HiPrep^TM柱的第二柱切换阀设置为旁通，将300mL含有重组蛋白的收获的细胞培养基用样品泵以1.0ml/分钟的速度上样到含有CaptureSelect^TM的柱上，随后用3个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤，随后用2个柱体积的洗涤缓冲液A2(100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸、0.25M NaCl，pH6.5)进行洗涤，随后用3个柱体积的洗涤缓冲液A1进行洗涤。将安装在第二柱切换阀上的HiPrep^TM柱设置为进入流道，然后用洗脱缓冲液(30mM柠檬酸、pH3.5+0.5M L-精氨酸)进行洗脱。在用15mL洗脱缓冲液进行洗脱之后，将含有CaptureSelect^TM的柱从流道中切换出来，并用缓冲液A1从HiPrep^TM柱洗脱经纯化的蛋白质。通过在280nm处的UV吸光度监测蛋白质洗脱，并且一旦吸光度超过100mAU就会触发收集。

随后如实施例2中所描述的，测试了含有预期单体形式的经纯化蛋白质制剂在A549人肺癌细胞中抑制促存活信号传导(AKT的丝氨酸-473磷酸化)的能力。从图15可以看出，对应于SEQ ID No.110的经纯化蛋白质显示出抑制AKT(丝氨酸473)磷酸化的浓度依赖性能力，这表明包含来自CCN蛋白质的结构域III/TSP-1同源结构域的氨基酸的另一种单体融合蛋白具有在A549人肺癌细胞中抑制AKT(丝氨酸-473)磷酸化的能力。

实施例23

使用含有编码以下融合蛋白的SEQ ID No.108的实施例21中所描述的表达质粒来产生如实施例14中所描述的稳定转染的ExpiCHO^TM细胞的合并物：该融合蛋白包含N端融合肽接头(SEQ ID No.21)的CCN3的氨基酸206至249(其中第207位的氨基酸(异亮氨酸)被替换为丙氨酸)(SEQ ID No.44)和人血清白蛋白的氨基酸25至609(SEQ ID No.52)，该融合蛋白还附加有SEQ ID No.32的源自白蛋白的用于分泌的N端信号序列，以对应于SEQ IDNo.107。为了产生一批含有对应于SEQ ID NO.106的所分泌蛋白质的条件培养基，将稳定转染的细胞的合并物扩大以允许以1×106个细胞/mL的密度接种250mL体积的稳定转染的细胞。从传代培养之后的第2天开始，每隔一天向细胞培养物补充5％v/v 2XEfficientFeed^TMC+(Gibco^TM)，并在传代培养之后的第2天补充3％葡萄糖(10％w/v)，并在传代培养之后第6天补充5％葡萄糖(10％w/v)。9天之后，通过在4℃下以4750xg离心20分钟来沉淀细胞，并收获上清液细胞培养基。添加100％异丙醇中的0.1M PMSF至0.1mM的浓度，添加1M柠檬酸钠pH5.5至30mM的最终浓度，并添加2M L-精氨酸pH4.0至100mM的最终浓度，然后进行色谱纯化。

将蛋白质通过二维色谱法进行纯化，该二维色谱法由以下构成：用装有10mLCaptureSelect^TM人白蛋白亲和基质(ThermoFisherScientific)的Tricorn柱(GEHealthcare)进行的捕获步骤，紧接着是用有两个串联连接的Superdex 200Increase 10/300GL(GE Healthcare)柱进行的尺寸排阻色谱法。将柱安装在配备有5mm UV流动池和连接至5mL样品环的出口阀的FPLC色谱系统(BioRad NGC Discover^TM 10 Pro系统)上。将含有CaptureSelect^TM的柱安装在第一柱切换阀上，并用由100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸pH6.5构成的A1缓冲液进行平衡，而将Superdex 200Increase柱安装在第二柱切换阀上，并用缓冲液A1(100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸pH6.5)进行平衡。通过将含有Superdex 200Increase柱的第二柱切换阀设置为旁通，将120mL含有重组蛋白的收获的细胞培养基用样品泵以3.9ml/分钟的速度上样到含有CaptureSelect^TM的柱上。在将含有重组蛋白的收获的细胞培养基上样到含有CaptureSelect^TM的柱上之后，将其用3个柱体积的缓冲液A1进行洗涤，随后用2个柱体积的缓冲液A2(100mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM L-精氨酸、0.25M NaCl，pH6.5)进行洗涤，随后用3个柱体积的缓冲液A1进行洗涤。将含有CaptureSelect^TM的柱用15mL缓冲液B1(30mM柠檬酸、0.5M L-精氨酸，pH 3.5)进行洗脱，在此期间，将系统设置为将吸光度超过1200mAU的洗脱物收集到样品环中。在对含有CaptureSelect^TM的柱进行洗脱之后，将连接至第一柱切换阀的含有CaptureSelect^TM的柱从流道中切换出来，并将第二柱切换阀设置为将含有Superdex 200Increase的柱切换到流道中。然后，将来自含有CaptureSelect^TM的柱的含有洗脱蛋白质的洗脱物用缓冲液A1以0.5ml/分钟的速度上样到含有Superdex 200 Increase的柱上。通过在280nm处的UV吸光度监测蛋白质洗脱，并且一旦吸光度超过200mAU就会触发收集。

随后，测试了含有预期单体形式的经纯化蛋白质制剂抑制正常人肺成纤维细胞(normal human lung fibroblast，NHLF)(Lonza Bioscience，目录号：CC-2512)的TGFβ诱导的和活性CCN2诱导的活性的能力。将NHLF在完全生长培养基(Lonza Bioscience bullet试剂盒(目录号：CC-3132)具有所有添加物(2％胎牛血清、胰岛素、hFGF-B、庆大霉素/两性霉素B))中根据商业供应者(Lonza Bioscience)的说明进行传代培养，以维持最大80％汇合(confluency)的密度。活性CCN2由CCN2的结构域3至4构成，并按照Kaasb0ll et al.，2018(同上)所描述的产生和纯化。

为了测试对应于SEQ ID No.106的蛋白质对活性CCN2和TGFβ诱导的NHLF细胞迁移的作用(transwell测定/改进的Boyden小室测定(chamber assay))，将细胞首先用胰蛋白酶/EDTA分离，用胰蛋白酶中和试剂(Lonza Bioscience，目录号CC-5034)中和，并重悬于基础生长培养基(成纤维细胞基础培养基(Lonza Bioscience目录号：CC-3131，不含除庆大霉素(50μg/mL)之外的其他添加物)中，随后以每孔100μL的体积在孔径为5μm的transwell插入物的上侧接种30000个细胞(24孔板，

目录号CLS3402-48EA，来自SigmaAldrich(Merck KGaA))。孔的下侧室含有溶解在500μL基础生长培养基(不含除庆大霉素之外的其他添加物)中的受试物质或载剂对照。在孵育20小时之后，将插入物从孔中移出，通过浸入磷酸盐缓冲盐水(PBS，Lonza Bioscience，目录号：17-512F)中洗涤两次，随后在4％甲醛(Solveco，Swe.，目录号：621092)中在37℃下固定15分钟。将细胞通过用在PBS中的0.1％Triton X-100进行的处理透化10分钟，随后用PBS洗涤两次。位于插入物上侧的未迁移的细胞通过用棉棒刮擦移除，随后使膜干燥。在黑暗中，将插入物下侧的迁移细胞的核用Hoechst 33342 20mM(在PBS中1∶5000稀释，ThermoFisherScientific，目录号：62249)染色15分钟，随后通过浸入PBS中洗涤两次。将膜从transwell插入物切掉，并安装在载玻片上(其中迁移的细胞朝向玻璃)，覆盖一滴ProLong^TM Gold Antifade(ThermoFisherScientific，目录号：P36934)，安装盖玻片，并在Zeiss Axio Observer Z.1成像系统上对每个孔捕获5至10张图像。图像可使用以下进行半自动分析：ImageJ软件vl.5lk，Rasband，W.S.，ImageJ，美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes ofHealth)，Bethesda，Maryland，USA，https：//imagej.nih.gov/ij/，1997-2018.)。从图16A可以看出，对应于SEQ ID No.106的蛋白质抑制由TGFβ和活性CCN2二者诱导的迁移。

为了测试对应于SEQ ID No.106的蛋白质对活性CCN2和TGFβ诱导的划伤测定(scratch-wound assay)的作用，将NHLF用胰蛋白酶/EDTA分离，用胰蛋白酶中和试剂(Lonza Bioscience，目录号CC-5034)中和，随后将100000个细胞以1mL的体积接种到经组织培养物处理的12孔板(Corning

目录号3513)中。接种之后第二天，将细胞用0.9％NaCl洗涤两次，并将完全生长培养基更换为基础生长培养基。在于基础生长培养基中孵育16至20小时之后，用无菌的12.5μL移液管吸头(ThermoFisherScientific，目录号：94420053)在细胞单层上制造划痕，将细胞用PBS洗涤一次，随后将细胞与受试物质或载剂一起在1mL基础生长培养基中孵育。将细胞再孵育24小时，随后在PBS中洗涤3次，随后在37℃下在4％甲醛中固定15分钟。固定之后，将细胞再次在PBS中在轻轻振荡情况下洗涤3×3分钟，用在PBS中的0.1％Triton X-100在轻轻振荡情况下透化10分钟。在黑暗中，将细胞核用Hoechst 33342 20mM(在PBS中1∶5000稀释，ThermoFisherScientific，目录号：62249)染色15分钟，随后在PBS中在轻轻振荡情况下洗涤3×5分钟。使用1滴ProLong^TM GoldAntifade(ThermoFisherScientific，目录号：P36934)，随后进行安装，并且用Zeiss AxioObserver Z.1成像系统从每个孔中捕获以剩余间隙(remaining gap)为中心的5张图像，通过以3个固定间隔制造划痕之后沿划伤的长度测量剩余间隙距离来分析图像。计算来自每个孔的所有图像的所有测量结果的平均值，并将其计为一个生物重复。从图16B可以看出，对应于SEQ ID No.106的蛋白质抑制由TGFβ和活性CCN2二者诱导的划伤的闭合。

为了测试对应于SEQ ID No.106的蛋白质对TGFβ诱导的基因调节的作用，将NHLF用胰蛋白酶/EDTA分离，用胰蛋白酶中和试剂(Lonza Bioscience，目录号CC-5034)中和，随后将100000个细胞以1mL的体积接种到经组织培养物处理的12孔板(Corning

目录号3513)中。接种之后第二天，将细胞用0.9％NaCl洗涤两次，并将完全生长培养基更换为补充有0.1％热灭活胎牛血清(来自Gibco^TM，目录号16000-044，如实施例2中所描述的进行热灭活)的基础生长培养基。在于含有0.1％胎牛血清的基础生长培养基中孵育6小时之后，向孔中添加受试物质或载剂对照。96小时之后，将孔在PBS中洗涤两次，并使用QiagenRNeasy RNA提取试剂盒(目录号74106)根据制造商的方案提取RNA。RNA浓度用

分光光度计((NanoDrop Technologies，US)进行定量，用无核酸酶的水稀释至最终RNA浓度为50ng/μL，随后通过使用TaqMan^TM逆转录试剂盒(目录号N8080234)根据制造商的方案使用来自每个重复的200ng RNA产生cDNA。通过相应的TaqMan^TM测定和TaqMan快速高级预混液(TaqMan Fast Advanced Master Mix)(ThermoFisherScientific，目录号4444557)从所得的cDNA样品分析差异基因表达分析。使用Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统根据制造商的方案运行TaqMan^TM实时PCR反应，每个样品技术重复三次。从标准曲线计算不同转录物的相对量，随后取三次技术重复的平均值以产生来自每个样品的单值。所有基因表达结果都与GAPDH(ThermoFisherScientific，目录号Hs02786624_g1)mRNA水平相关，并归一化为表示为载剂对照刺激的孔的平均值的倍数。从图19C-F可以看出，对应于SEQ ID No.107的蛋白质提供了对TGFβ诱导的基因的部分抑制；COL1A1(“胶原蛋白类型1α-1”，ThermoFisherScientific，目录号Hs00164004_m1)，FN1(“纤连蛋白1”，ThermoFisherScientific，目录号Hs01549976_m1)，ACTA2(“平滑肌肌动蛋白α-2”，ThermoFisherScientific，目录号Hs00426835_g1)和CCN2(ThermoFisherScientific，目录号Hs00170014_m1)，通常被认为是促纤维化的基因。

说明书和序列表中提及的序列号概述

根据uniprot数据库对CCN蛋白质进行编号，如上文“发明详述”中所描述的。根据上文“发明详述”中所述的Eu编号系统对Fc片段进行编号。

Claims

1.单体融合蛋白，其包含：

(iii)任选地在(i)的所述多肽与(ii)的所述单体融合配偶体之间的肽接头，

其中(i)的所述多肽的长度为40至60个氨基酸并且包含以下：选自SEQ ID NO：37或2至6的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：37或2至6的序列具有至少80％序列同一性的序列，其中选自SEQ ID NO：37或2至6的所述序列中的所有半胱氨酸残基均是保守的，

2.权利要求1所述的融合蛋白，其中(i)的所述多肽的长度为44至57个氨基酸。

3.权利要求1或权利要求2所述的融合蛋白，其中(i)的所述多肽包含以下或由以下组成：

(a)选自SEQ ID NO：1或8至12的氨基酸序列；或者

(c)(a)或(b)的氨基酸序列的一部分，其中所述部分分别包含SEQ ID NO：37、6、2、3、4或5的至少44个氨基酸序列，或者分别与选自SEQ ID NO：37、6、2、3、4或5的序列具有至少80％序列同一性的序列。

4.权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽由以下组成：选自SEQ IDNO：37或2至6的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：37或2至6的序列具有至少80％序列同一性的序列。

5.权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中(iii)的所述肽接头包含不超过50个氨基酸。

6.权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中(i)的所述多肽在对应于选自SEQ IDNO：37或2至6、或者SEQ ID NO：1或8至12的所述序列的第2位的位置处包含丙氨酸残基。

7.权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中(i)的所述氨基酸序列包含以下：选自SEQ ID NO：7、38、42至46或47至51的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO：7、38、42至46或47至51的所述序列的第2位的位置处包含丙氨酸残基。

8.权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中所述单体融合配偶体选自血清白蛋白、转铁蛋白和人IgG的单体Fc片段。

9.权利要求8所述的融合蛋白，其中所述人IgG的单体Fc片段是IgG1、IgG2或IgG4的单体Fc片段。

10.权利要求8或权利要求9所述的融合蛋白，其中所述单体Fc片段是无糖基化的。

11.权利要求8至10中任一项所述的融合蛋白，其中所述单体Fc片段包含稳定性二硫桥和/或蛋白酶稳定性突变。

12.权利要求8至11中任一项所述的融合蛋白，其中所述单体Fc片段不具有免疫效应物功能。

13.权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白，其中在(i)的所述氨基酸序列与所述单体融合配偶体之间的所述肽接头具有以下：选自SEQ ID NO：20至25、39、57、63、65或67的氨基酸序列，或与其具有80％序列同一性的氨基酸序列。

14.权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有以下：选自SEQ IDNO：84、85、88、89、97、98、102、103、106、107、110和111的氨基酸序列，或与其具有80％序列同一性的氨基酸序列。

15.DNA分子，其编码权利要求1至14中任一项所限定的单体融合蛋白。

16.权利要求15所述的DNA分子，其中所述分子还包含编码信号序列的核苷酸序列。

17.权利要求15或16所述的DNA分子，其中所述分子包含SEQ ID NO：34、35、36、86、87、90、91、99、100、104、105、108、109、112或113中所示的核苷酸序列或者与任何前述序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。

18.表达载体，其包含根据权利要求15至17中任一项所限定的DNA分子。

19.宿主细胞，其包含权利要求18中所限定的载体。

20.根据权利要求1至14中任一项所述的融合蛋白，其用于治疗。

21.根据权利要求1至14中任一项所述的融合蛋白，其用于通过抑制或对抗归因于4结构域CCN家族蛋白的细胞信号传导和细胞生理功能来治疗或预防病症。

22.根据权利要求1至14、20或21中任一项所述的融合蛋白，其用于治疗或预防纤维化或表现出纤维化的任何病症。

23.根据权利要求1至14或20至22中任一项所述的融合蛋白，其用于治疗癌症。

24.蛋白质，其长度为40至60个氨基酸，所述蛋白质包含以下或由以下组成：SEQ IDNO：7、38、42至46、47至51中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列同一性的序列，其中所述蛋白质在对应于SEQ ID NO：7、38、42至46、47至51的所述序列的第2位的位置处包含丙氨酸残基，并且其中所述序列中的所有半胱氨酸残基均是保守的。