KR20230013021A - 온도-반응성 바이러스 저장 시스템 - Google Patents

온도-반응성 바이러스 저장 시스템 Download PDF

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KR20230013021A
KR20230013021A KR1020227036164A KR20227036164A KR20230013021A KR 20230013021 A KR20230013021 A KR 20230013021A KR 1020227036164 A KR1020227036164 A KR 1020227036164A KR 20227036164 A KR20227036164 A KR 20227036164A KR 20230013021 A KR20230013021 A KR 20230013021A
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tromethamine
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cyclodextrin
virus
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KR1020227036164A
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미나 하시넨
니겔 파커
로버트 쇼
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트리젤 엘티디.
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Abstract

동결되지 않은 액체와 같은, 바이러스를 저장시키고 감염력을 유지하는 온도-반응성 바이러스 저장 시스템이 기재된다.

Description

온도-반응성 바이러스 저장 시스템
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 19일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/991,671의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 참조로 본원에 포함된다.
감염성 바이러스는 예를 들어, 백신 및 유전자 요법 벡터로서 유용하다. 그러나, 바이러스는 시간이 지나면서 감염력을 상실한다.
바이러스 감염력을 보존하기 위해 당업계에서 교시하는 한 가지 방법은 동결시키는 것이다. 당업계는 동결된 저장 완충액에 현탁된 감염성 바이러스를 저장하거나, 또는 바이러스 현탁액을 동결시킨 다음 동결-건조에 의해 동결된 저장 완충액을 제거하여 건조된 동결건조된 생성물을 생산하는 것을 교시한다.
그러나, 동결이 후속 건조 / 동결건조를 수반하는지 여부와 관계없이, 동결은 바이러스를 손상시켜, 감염력을 감소시킬 수 있다. 당업계에서 이를 해결하는 한 가지 전통적인 방식은 동결보호제를 첨가하는 것이다. 예를 들어, 당업계는 동결보호제로서 10 내지 30%의 글리세롤을 함유하는 염수에 현탁시켜 감염성 바이러스를 동결시키는 것을 교시한다(Graham 등, 1991, Methods in Molecular Biology, vol. 7, chapter 11, p. 109-127; Ed Murrey The Human Press Inc.; Precious 및 Russel, Virology, a Practical Approach, 1985, chapter 9, p. 193-205; ed: BW Mahy, IRL Press, Washington DC; Kanegae 등, Jpn. J. Med. Sci. Biol., 47, 157-166, 1994 및 Green 등, Methods in Enzymology, vol. LVIII, p. 425-435), PCT 특허 공개 W098/02522. 글리세롤은 바이러스가 동결-해동 과정 동안 초래하는 손상을 감소시켜, 감염력을 어느 정도 보존한다. 그러나, 당업계는 글리세롤이 기관내 및 폐내 투여의 경우(예를 들어 낭포성 섬유증 또는 폐관의 암의 치료를 위해) 허용되지 않을 수 있는 폐 상피를 자극하는 단점이 있음을 교시한다.
염수에 대해 저농도(1 내지 5%)의 수크로스가 또한 동결된 바이러스 현탁액에 대한 동결보호제로서 사용되었다(Precious 등, 상기 참조; Huyghe 등, Human Gene Therapy 6: 1403-1416, November 1995, 및 Rehir, Process Development and Production Issues for Viral Vectors & Vaccines, The Williamsburg Bio Processing Conference, 2nd annual meeting, Nov. 6-9, 1995).
살아있는 바이러스의 동결보존을 위해 저농도(2.5-5%)의 락토스 또는 수크로스의 사용이 또한 권장되었다(JP88/555465 참조).
동결보호제는 동결 손상을 감소시킨다. 그러나, 그들은 이를 제거하지 않는다. 따라서 당업계는 바이러스가 상당한 양의 원래 감염력을 유지하는 동결되지 않은 형태로 바이러스를 보존하는 방식을 필요로 한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 감염성 바이러스 입자, 트로메타민 및 사이클로덱스트린을 포함하는 조성물을 특징으로 하며, 여기서 조성물은 바이러스 입자 당 약 1 x 109 내지 약 1 x 1012 개의 사이클로덱스트린 분자(예를 들어, 바이러스 입자 당 약 1 x 109, 약 1 x 1010, 약 1 x 1011, 또는 약 1 x 1012 개의 사이클로덱스트린 분자)를 포함한다. 또 다른 측면에서, 조성물은 감염성 바이러스 입자, 사이클로덱스트린, 트로메타민, 및 인산나트륨을 포함하며, 여기서 조성물은 인산나트륨의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트로메타민(예를 들어, 인산나트륨의 몰 당 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 또는 1.5 몰의 트로메타민)을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 동결보호제(예를 들어, 동결보호적 유효량의 글리세롤, 수크로스, 또는 둘 다)를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 트로메타민 양(w/w)의 약 500 배, 약 600 배, 또는 약 700 배의 상대량으로 글리세롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 트로메타민 양(w/w)의 약 90 배, 약 100 배, 약 110 배, 약 120 배, 또는 약 130 배의 상대량으로 수크로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 사이클로덱스트린은 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린이다. 일부 구현예에서, 트로메타민 양(w/w)의 약 5 배, 약 6 배, 또는 약 7 배의 상대량으로 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린.
일부 구현예에서, 조성물은 (3α,5β, 7α,12α)-N-[3-[(4-O-D-갈락토피라노실-D-글루코노일)아미노]프로필]-3,7,12-트리하이드록시-N-[3-[[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-트리하이드록시-24-옥소콜란-24-일]아미노] 프로필]-콜란-24-아미드(NODA)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 트로메타민 양(w/w)의 약 0.5 배, 약 0.6 배, 약 0.7 배, 약 0.8 배, 약 0.9 배, 또는 약 1 배의 상대량으로 NODA를 포함한다.
일부 구현예에서, 인산나트륨은 인산이수소나트륨 탈수화물이다. 일부 구현예에서, 조성물은 염화마그네슘, 폴리소르베이트 80, 시트르산나트륨, 및 시트르산을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스는 조성물의 밀리리터 당 약 1 x 1011 개의 바이러스 입자의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물은 제1 온도에서 제1 pH, 및 제2 온도에서 제2 pH를 가지며, 여기서 제1 온도는 제2 온도보다 더 낮고, 제1 pH는 제2 pH보다 더 높다. 일부 구현예에서, 제1 온도는 약 -60℃, 약 -20℃, 약 -0℃, 약 4℃이고, 제1 pH는 염기성 pH이다. 일부 구현예에서, 제2 온도는 약 20℃ 내지 약 25℃이고, 제2 pH는 산성 pH이다.
일부 구현예에서, 동결되지 않은 액체로서, 또는 동결된 상태로, 약 -60℃ 또는 약 -20℃에서, 약 3 개월, 6 개월, 9 개월, 12 개월, 15 개월, 18 개월, 21 개월, 24 개월 또는 그 이상 동안 저장 후, 바이러스 입자는 초기 총 바이러스 입자 농도의 적어도 약 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 유지하고/하거나, 그의 초기 감염 역가의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 유지한다. 일부 구현예에서, 감염 역가는 정규화되고 조정된 표준 - 감염 단위(NAS IU)로서 측정된다.
일부 구현예에서, 감염성 바이러스는 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스이다. 일부 구현예에서, 감염성 바이러스는 복제 결핍 아데노바이러스이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인산이수소나트륨 탈수화물, 트로메타민, 글리세롤, 수크로스, 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린, NODA, 및 감염성 복제 결핍 아데노바이러스를 포함하는 조성물을 특징으로 하며, 여기서 조성물은 인산이수소나트륨 탈수화물의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트로메타민 상대량의 트로메타민; 트로메타민 양(w/w)의 약 600 배의 상대량으로 글리세롤; 트로메타민 양(w/w)의 약 120 배의 상대량으로 수크로스; 트로메타민 양(w/w)의 약 6 배의 상대량으로 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린; 트로메타민 양(w/w)의 약 0.7 배의 상대량으로 NODA; 및 조성물의 밀리리터 당 약 1 x 1011 개의 복제 결핍 아데노바이러스 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 인산이수소나트륨 탈수화물, 트로메타민, 글리세롤, 수크로스, 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린, NODA, 및 감염성 복제 결핍 아데노바이러스를 포함하는 제1 제형을 포함하며, 여기서 조성물은 인산이수소나트륨 탈수화물의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트로메타민 상대량의 트로메타민; 트로메타민 양(w/w)의 약 600 배의 상대량으로 글리세롤; 트로메타민 양(w/w)의 약 120 배의 상대량으로 수크로스; 트로메타민 양(w/w)의 약 6 배의 상대량으로 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린; 트로메타민 양(w/w)의 약 0.7 배의 상대량으로 NODA; 및 조성물의 밀리리터 당 약 1 x 1011 개의 복제 결핍 아데노바이러스 입자를 포함하며, 여기서 조성물은 약 1 부의 제1 제형 및 약 10 부의 물을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 감염성 바이러스 입자, 트로메타민 및 사이클로덱스트린을 포함하는 조성물을 특징으로 하며, 사이클로덱스트린은 바이러스 입자 당 약 1 x 109 내지 약 1 x 1012 개의 사이클로덱스트린 분자의 상대량으로 존재하고, 트로메타민은 온도 변화에 반응하여 pH를 변화시킬 수 있고, 트로메타민은 조성물이 액체, 동결되지 않은 상태, 또는 동결된 상태에서, -20℃에서 1 년 동안 저장되는 경우, 바이러스 입자가 초기 총 바이러스 입자 농도의 적어도 약 95% 및 NAS IU로 측정된 그의 초기 감염 역가의 적어도 약 80%를 유지하는 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물은 인산나트륨의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트로메타민의 상대량으로 존재하는 인산나트륨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인산나트륨은 인산이수소나트륨 탈수화물이다.
일부 구현예에서, 조성물은 동결보호적 유효량의 글리세롤, 수크로스, 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 트로메타민 양(w/w)의 약 600 배의 상대량으로 글리세롤을 포함하고, 조성물은 트로메타민 양(w/w)의 약 120 배의 상대량으로 수크로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 사이클로덱스트린은 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린이다. 일부 구현예에서, 조성물은 트로메타민 양(w/w)의 약 6 배의 상대량으로 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린을 포함한다.
일부 구현예에서, 감염성 바이러스는 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스이다. 일부 구현예에서, 감염성 바이러스는 복제 결핍 아데노바이러스이다.
일부 구현예에서, 조성물은 트로메타민 양(w/w)의 약 0.7 배의 상대량으로 NODA를 추가로 포함하고, 여기서 바이러스는 조성물의 밀리리터 당 약 1 x 1011 개의 바이러스 입자의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물은 인산이수소나트륨 탈수화물의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트로메타민의 상대량으로 존재하는 인산이수소나트륨 탈수화물을 추가로 포함하고, 글리세롤 및 수크로스를 추가로 포함하되, 글리세롤은 트로메타민 양(w/w)의 약 600 배의 상대량으로 존재하고 수크로스는 트로메타민 양(w/w)의 약 120 배의 상대량으로 존재하며, 여기서 사이클로덱스트린은 트로메타민 양(w/w)의 약 6 배의 상대량으로 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린을 포함하고, 여기서 감염성 바이러스는 복제 결핍 아데노바이러스를 포함하고, 트로메타민 양(w/w)의 약 1 배의 상대량으로 NODA를 추가로 포함하되, 여기서 바이러스는 조성물의 밀리리터 당 약 1 x 1011 개의 바이러스 입자의 양으로 존재한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 감염성 바이러스의 감염력 수준을 보존하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 방법은 액체, 동결되지 않은 상태, 또는 동결된 상태로, 약 -60℃ 또는 약 -20℃에서, 약 3 개월, 6 개월, 9 개월, 12 개월, 15 개월, 18 개월, 21 개월, 24 개월 또는 그 이상 동안 본원에 기재된 임의의 측면의 조성물을 저장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 초기 총 바이러스 입자 농도의 적어도 약 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 유지하고/하거나, 그의 초기 감염 역가의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 유지한다. 일부 구현예에서, 감염 역가는 정규화되고 조정된 표준 - 감염 단위(NAS IU)로 측정된다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 측면 중 임의의 하나의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 인간 인터페론 α-2b를 암호화하는 재조합 아데노바이러스 입자이다.
정의
본 출원에서, 문맥상 달리 명백하지 않는 한, (i) 단수 용어는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (ii) 용어 "또는"은 "및/또는"을 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (iii) 용어 "포함하는" 및 "포함한"은 그 자체로 또는 하나 이상의 추가 구성요소 또는 단계와 함께 제시되든 항목화된 구성요소 또는 단계를 포함하는 것으로 이해될 수 있고; (iv) 용어 "약" 및 "대략적으로"는 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이 표준 변이를 허용하는 것으로 이해될 수 있고; (v) 범위가 제공되는 경우, 종료점이 포함된다.
단수 용어: 단수 용어는 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
투여: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여"는 전형적으로 대상체 또는 시스템에 조성물의 투여를 지칭한다. 당업자는 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하기 위해 활용될 수 있는 다양한 경로를 인지할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 투여는 안구, 경구, 비경구, 또는 국소일 수 있다. 비경구 경로의 예는 제한 없이, 방광내, 복강내, 양막내, 동맥내, 관절내, 담도내, 기관지내, 낭내, 심장내, 연골내, 미추내, 해면내, 강내, 대뇌내, 수조내, 각막내, 치관내, 관상동맥내, 체내, 두개내, 피내, 추간판내, 관내, 십이지장내, 경막내, 표피내, 식도내, 위내, 치은내, 회장내, 병변내, 관강내, 림프내, 골수강내, 뇌막내, 근육내, 안구내, 난소내, 심막내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 안구내, 동강내, 척수내, 활액내, 힘줄내, 고환내, 척추강내, 흉곽내, 관내, 고막내, 자궁내, 혈관내, 정맥내(예를 들어, 볼루스 또는 점적), 심실내, 및 피하를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 방광내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 시간에 맞춰 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적(예를 들어, 공통 기간에 의해 분리된 개별 용량) 투약하는 투약을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투약(예를 들어, 관류)을 수반할 수 있다.
대략적으로 또는 약: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 하나 이상의 관심 값에 적용될 때 명시된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 달리 명시되지 않는 한 또는 문맥상 달리 자명하지 않는 한 명시된 참조 값의 어느 방향으로든(초과 또는 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외).
암: 용어 "암," "악성종양," "신생물," "종양," 및 "암종"은 비교적 비정상적이고/이거나, 제어되지 않고/않거나, 자율적인 성장을 나타내는 세포를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 세포 증식 제어의 상당한 손실을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 종양은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성, 및/또는 비-전이성인 세포일 수 있거나 또는 이를 포함한다. 본 개시내용은 교시하는 것이 특히 관련될 수 있는 특정 암을 구체적으로 식별한다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양을 특징으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 혈액 종양을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 당업계에 알려진 상이한 유형의 암의 예는 예를 들어, 백혈병, 림프종(호지킨 및 비-호지킨), 골수종 및 골수증식성 장애를 포함하는 혈액암; 고형 조직의 육종, 흑색종, 선종, 및 암종; 입, 목, 후두, 및 폐의 편평 세포 암종; 간암; 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 자궁암, 자궁내막암, 또는 신세포 암종과 같은 비뇨생식기암; 골암; 췌장암; 피부암; 피부 또는 안구내 흑색종; 내분비계의 암; 갑상선의 암; 부갑상선의 암; 두경부암; 유방암; 위장관암; 신경계 암; 및 유두종과 같은 양성 병변을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 방광암, 예를 들어, 고등급 비-근육-침습성 방광암(NMIBC)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 제자리 암종(CIS) 및/또는 고등급 유두 질환이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 Ta 또는 T1 방광암이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 칼메트-게랭간균(BCG)-내성 암이거나 또는 이를 포함한다.
약제학적 조성물: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 활성제가 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되는 조성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 활성제는 관련 집단에게 투여될 때 미리 결정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 레지멘으로 투여하기에 적절한 단위 투여량으로 존재한다. 약제학적 조성물은 다음에 대해 적응된 것들을 포함하여, 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별히 제형화될 수 있다: 경구 투여, 예를 들어, 물약(수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제(예를 들어, 협측, 설하, 및 전신 흡수에 대해 표적화됨), 볼루스, 분말, 과립, 혀에 도포하기 위한 페이스트; 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지속-방출 제형으로서 예를 들어, 방광내, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여; 예를 들어, 피부, 폐, 또는 구강에 도포되는 크림, 연고, 또는 제어-방출 패치 또는 스프레이로서 국소 적용;예를 들어, 페서리, 크림, 또는 폼으로서 질내 또는 직장내; 설하; 안구; 경피; 또는 비강, 폐, 및 다른 점막 표면. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 방광내 점적주입을 위한 현탁액(예를 들어, 멸균 현탁액)으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 인간 대상체에게 투여하도록 의도되고 이에 적합하다.
약제학적으로 허용되는 담체: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 대상 화합물을 하나의 기관, 또는 신체의 일부에서 또 다른 기관, 또는 신체의 일부로 전달하거나 또는 수송하는데 수반되는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각 담체는 제형의 다른 성분과 호환가능하고 환자에게 해롭지 않다는 의미로 "허용되"어야 한다. 약제학적으로 허용되는 담체로서 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스, 및 이의 유도체; 분말화 트라가칸트(tragacanth); 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 마그네슘 하이드록시드 및 알루미늄 하이드록시드와 같은 완충제; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장성 염수; 링거 용액; 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 약제학적 제형에 이용되는 다른 무독성 호환가능한 물질을 포함한다.
대상체: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간, 비-인간 포유동물, 비-인간 영장류, 영장류, 실험실 동물, 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌, 고양이, 또는 개)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 성인, 청소년, 또는 소아 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같이 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 본원에 나열된 암 또는 종양(예를 들어, 방광암 또는 종양, 예를 들어 고등급 비-근육-침습성 방광암(NMIBC))을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태에 취약하다. 일부 구현예에서, 취약한 대상체는 질환, 장애, 또는 병태가 발생할 위험이 증가되는(참조 대상체 또는 집단에서 관찰된 평균 위험과 비교하여) 성향이 있고/있거나 이를 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 하나 이상의 질환, 장애 또는 병태로 진단되었다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태의 특정 증상(예를 들어, 질환의 임상 징후) 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태의 임의의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 환자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 바 있는 개체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 병태를 진단하고/하거나 치료하기 위한 특정 요법을 받고 있거나 또는 받은 바 있다.
치료: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"(또는 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징, 및/또는 원인의 발병을 부분적으로 또는 완전히 경감시키고, 개선하고, 완화하고, 억제하고, 지연시키고, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나 발병률을 감소시키는 요법의 임의의 투여를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체의 치료 및/또는 질환, 장애, 및/또는 병태의 초기 징후만 나타내는 대상체의 치료일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체의 치료일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단된 대상체의 치료일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병태의 발생 위험 증가와 통계적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 감수성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체의 치료일 수 있다.
본 개시내용은 부분적으로, 동결하지 않고/않거나 동결된 상태로 저장하지 않고 바이러스 감염력을 보존하는 방식의 발견에 기반한다. 발견은 바이러스를 보호하기 위한 제제로서 사이클로덱스트린(사이클릭 올리고당류), 및 예를 들어, 온도 변화에 반응하여 pH를 변화시킬 수 있는 액체 저장 완충액을 사용한다. 이론에 얽매이려는 의도 없이, 보다 염기성인 pH에서, 완충액은 사이클로덱스트린의 내부 공동 내에서 전하에 영향을 미쳐, 바이러스 캡시드 폴리펩티드가 내부에 결합하는 것을 촉진하는 것으로 여겨진다. 사이클로덱스트린 내부와 연관되어 있지만, 바이러스는 저온의 손상 효과로부터 물리적으로 보호된다. 보다 산성인 pH에서, 완충액은 반대 효과를 가지고 있어서, 바이러스 캡시드 폴리펩티드가 더 이상 사이클로덱스트린의 내부 공동에 결합되지 않도록 사이클로덱스트린으로부터 바이러스의 방출을 촉진한다. 따라서 이 시스템은 pH-의존적 전환을 가능하게 하여, 바이러스가 저장 동안 보호를 위해 사이클로덱스트린 내부에 로딩될 수 있고, 이어서 바이러스가 사이클로덱스트린으로부터 후속적으로 방출될 수 있도록 한다.
일부 구현예에서, 대상체에게 바이러스-로딩된 사이클로덱스트린의 투여는 pH-의존적 전환을 초래하여, 사이클로덱스트린으로부터 바이러스 입자를 방출한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자가 대상체에게 투여 전에 사이클로덱스트린으로부터 방출되도록 pH는 대상체에게 투여 전에, 예를 들어 의사, 약사, 또는 다른 의료인에 의해 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 시스템은 온도 변화에 반응하여 pH를 변화시키는 완충액을 사용한다. 예를 들어, 더 낮은 온도에서, 완충액은 보다 염기성으로 유지되어 바이러스 캡시드 폴리펩티드가 사이클로덱스트린의 내부에 결합하는 것을 촉진한다. 더 높은 온도에서, 완충액은 보다 산성이 되어 사이클로덱스트린으로부터 바이러스의 방출을 촉진한다. 본원에 기재된 시스템은 예를 들어, 액체 바이러스 현탁액을 차갑지만 동결되지 않은 액체로(예를 들어, 약 -20℃에서) 저장하는 데 사용될 수 있고, 이어서 대상체에게 투여 전에, 현탁액을 가온시켜(예를 들어, 실온까지), 사이클로덱스트린으로부터 바이러스를 방출할 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 온도-반응성 바이러스 저장 시스템은 적어도 만 1 년 동안 액체 현탁액에 저장될 때 바이러스 감염력을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 개시내용은 적어도 부분적으로 동결되지 않은 액체로서 저장된 바이러스에 대한 장기 보존 방법을 제공한다. 본 개시내용의 저장 시스템은 예를 들어, 감염성 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스를 포함하는 다양한 의학적으로 유용한 바이러스, 이러한 바이러스로부터 제조된 바이러스 백신, 및 이러한 바이러스의 재조합 버전에 효과적일 것이며, 여기서 바이러스는 액체 형태로 저장되지만 그럼에도 불구하고 원래 감염력을 높은 백분율로 유지한다.
시스템 구성요소
본 개시내용의 온도-반응성 시스템은 사이클로덱스트린, 완충액, 트리스(Tris), 및 다양한 다른 구성요소를 포함할 수 있다.
사이클로덱스트린
사이클로덱스트린은 α-1,4 글리코시드 결합에 의해 연결된 글루코스 하위단위의 매크로사이클릭 고리로 이루어진 사이클릭 올리고당류의 알려진 패밀리이다. 사이클로덱스트린은 효소적 전환에 의해 전분으로부터 생산된다. 오늘날 알려진 바와 같은 사이클로덱스트린은 1891년에 A Villiers에 의해 처음으로 설명되었을 때 "셀룰로신"이라고 불렀다. 곧이어, F. Schardinger는 3 가지 자연 발생 사이클로덱스트린 -α, -β, 및 -γ를 식별하였다. 따라서 이들 화합물은 Schardinger 당으로 지칭되었다. 1911년 내지 1935년 사이에 25 년 동안, 독일의 Pringsheim은 이 분야의 선두적인 연구자였으며, 사이클로덱스트린이 많은 다른 화학물질과 안정한 수성 복합체를 형성하였음을 입증하였다. 사이클로덱스트린은 도넛 모양 구조를 가지며, 내부 도넛 구멍 및 공동은 다른 화합물을 수용하거나 또는 캡슐화할 수 있다. 따라서, 산업 및 약리학적 적용을 위한 사이클론덱스트린 및 그의 유도체에 의한 캡슐화를 탐구하는 데 광범위한 작업이 수행되었다. 선행 기술은 복합체화에 사용되는 과정 중에서, "니딩(kneading)" 과정이 가장 좋은 과정 중 하나임을 교시한다. 그러나, 특히, 본 개시내용의 시스템은 이를 필요로 하지 않는다.
사이클로덱스트린은 아밀로스(전분의 단편)에서와 같이 1->4로 연결된 5 개 이상의 α-D-글루코피라노시드 단위로 구성된다. 전형적인 사이클로덱스트린은 고리에서 6 내지 8 개의 단위 범위의 다수의 글루코스 단량체를 함유하여, 7 개의 글루코스 하위단위를 함유하는 β(베타)-사이클로덱스트린과 함께 원추형을 생성한다. 가장 큰 현재 알려진 잘 특성화된 사이클로덱스트린은 32 개의 1,4-무수글루코피라노시드 단위를 함유하는 반면, 좋지 않게 특성화된 혼합물로서, 적어도 150-원 사이클릭 올리고당류가 또한 알려져 있다. 일부 구현예에서, 사이클로덱스트린은 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린(예를 들어, CAS 등록 번호 128446-35-5)이다.
소수성 내부 및 친수성 외부를 사용하여, 사이클로덱스트린은 소수성 화합물과 복합체를 형성한다. 알파-, 베타-, 및 감마-사이클로덱스트린은 모두 일반적으로 미국 FDA에 의해 안전한 것으로 인정된다. 그들은 하이드로코르티손, 프로스타글란딘, 니트로글리세린, 이트라코나졸, 클로람페니콜을 포함한 다양한 약물의 전달에 적용되었다. 사이클로덱스트린은 이들 약물에 용해성 및 안정성을 부여한다. 소수성 분자가 있는 사이클로덱스트린의 포함 화합물은 신체 조직을 침투할 수 있으며, 이들은 특정 조건 하에 생물학적 활성 화합물을 방출하는 데 사용될 수 있다.
사이클로덱스트린의 이러한 다양한 알려진 용도와 대조적으로, 본 시스템은 감염성 바이러스를 완충액이 가온될 때까지 보다 염기성인 pH 저장 완충액에 의한 감소로부터 보호하여 완충액 pH를 증가시키는 완전히 새로운 용도를 위한 사이클로덱스트린을 포함한다. 이는 완충 용액의 pH 변화로 인해 바이러스-사이클로덱스트린 복합체의 제어된 분해를 야기하여, 사이클로덱스트린과 바이러스 캡시드 폴리펩티드 사이의 수소 또는 이온 결합 상실을 야기한다. 이론에 얽매이려는 의도 없이, 이 시스템은 저장 동안 사이클로덱스트린의 내부 내에서 바이러스를 격리하고, 예를 들어, 환자에게 투여 전에 제형이 가온될 때 사이클론덱스트린 복합체로부터 바이러스를 방출할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나의 바이러스 입자는 이에 결합된 많은 사이클로덱스트린 분자를 가질 수 있다. 예를 들어, 바이러스 표면 상의 하나 이상의 바이러스 스파이크 페플로머는 각각 하나 이상의 사이클로덱스트린 분자에 결합할 수 있다. 바이러스 입자를 보호하기에 적절한 사이클로덱스트린 분자가 있다는 것을 보장하기 위해, 본원에 기재된 시스템의 일부 바람직한 구현예는 바이러스 입자보다 훨씬 더 많은 사이클로덱스트린 분자, 예를 들어, 바이러스 입자 당 약 1 x 109 내지 약 1 x 1012(예를 들어, 약 1 x 109, 약 1 x 1010, 약 1 x 1011, 또는 약 1 x 1012) 개의 사이클로덱스트린 분자를 포함한다.
완충액
본 개시내용의 시스템은 맥클베인(McIlvaine) 완충액과 유사한 완충 용액을 포함한다. 맥클베인 완충액은 시트레이트-포스페이트 완충액으로도 알려진 시트르산 및 인산수소이나트륨으로 구성된 완충 용액이다. 이는 1921년에 미국 농학자 (West Virginia University의 Theodore Clinton McIlvaine)에 의해 발명되었다. 2 가지 스톡 용액을 혼합하여 pH 2.2 내지 8에서 제조될 수 있다. 맥클베인 완충액은 글리세롤과 1:1로 혼합될 때 수용성 장착 배지를 제조하는 데 사용될 수 있다. 맥클베인 완충액의 제조는 인산이나트륨 및 시트르산을 필요로 하는 반면, 본 개시내용의 시스템을 위한 완충액은 인산이나트륨을 인산일나트륨(이수화물)으로 대체한다.
인산일나트륨(이수화물)은 또한 인산이수소나트륨 탈수화물(CAS 등록 번호: 13472-35-0), 인산나트륨 일염기성 탈수화물 및 인산이수소일나트륨 탈수화물로 알려져 있다. 이는 종종 유화제, 증점제, 연수용, 및 효율적인 녹 방지 용액으로 사용된다. 본 개시내용의 시스템에서, 인산일나트륨(이수화물)은 완충액의 일부로서 포함될 때 pH를 제어할 수 있다.
시트르산은 화학식 C6H8O7을 갖는 약한 유기산이다. 이는 감귤류에서 자연적으로 발생한다. 생화학에서, 모든 호기성 유기체의 대사작용에서 발생하는 시트르산 회로의 중간체이다. 산성화제, 산화방지제, 향미제 및 킬레이트제로서 광범위하게 사용된다. 용어 "시트레이트"는 시트르산의 유도체, 즉 용액에서 발견되는 염, 에스테르, 및 다원자 음이온을 나타내기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 바와 같이 본원에 사용된다. 예를 들어, 예시적인 시트레이트 염은 시트르산삼나트륨이며; 시트레이트 에스테르는 트리에틸 시트레이트이다. 염의 일부일 때, 시트레이트 이온의 화학식은 C6H5O3- 7 또는 C3H5O(COO)3- 3으로 표현된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 시트르산 일수화물을 포함한다.
예를 들어, 0.2 몰의 인산일나트륨(이수화물)을 물에 용해시키고, 1 리터를 만들기에 충분한 양의 물을 첨가하여 인산이나트륨의 0.2M 스톡 용액 1 리터를 제조할 수 있다. 예를 들어, 0.1 몰(19.21 gms)의 시트르산을 물에 용해시키고, 1 리터를 만들기에 충분한 양의 물을 첨가하여 시트르산의 0.1M 스톡 용액 1 리터를 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 인산일나트륨(이수화물) 및 시트르산은 약 1.7 : 약 0.01의 비율로 사용된다. 일부 구현예에서, 인산일나트륨(이수화물) 및 시트르산은 약 1.5 : 약 0.01, 내지 약 2.0 : 약 0.01의 비율로 사용된다.
본원에 기재된 완충액은 또한 시트르산나트륨 이수화물을 포함할 수 있다. 시트르산나트륨 탈수화물은 식품에서 유화제로 사용되고, 또한 기증된 혈액이 저장 시 응고되는 것을 방지하기 위한 항응고제로서 사용된다. 일부 구현예에서, 시트르산나트륨 탈수화물이 포함되고 시트르산과 함께 pH 조절제로서 기능한다.
본원에 기재된 완충액은 또한 염화마그네슘을 포함할 수 있다. 염화마그네슘은 화학식 MgCl2의 화학적 화합물 및 이의 다양한 수화물 MgCl2(H2O) x 를 지칭할 수 있다. 수화된 염화마그네슘은 염수 또는 해수로부터 추출될 수 있다. 일부 염화마그네슘은 해수의 태양 증발로부터 제조된다. 일부 구현예에서, 염화마그네슘은 MgCl 육수화물이다. 염화마그네슘은 알려져 있고 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, USP, CAS 등록 번호 7791-18-6).
트리스
본 개시내용의 시스템은 온도-의존적 pH 이동 특성을 부여하기 위해 트리스를 포함한다. 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민 또는 THAM으로도 알려진 트리스는 화학식 (HOCH2)3CNH2의 유기 화합물이다. 이는 1차 아민을 함유하고 따라서 전형적인 아민과 연관된 반응, 예를 들어, 알데하이드와의 축합을 겪는다. 의학에서, 트로메타민은 때때로 특정 상황에서 중증 대사성 산증의 치료를 위한 집중 관리에 제공된 약물로서 사용된다. 일부 약제는 트로메타민 염으로 제형화된다. 이들은 헤마베이트(트로메타몰 염으로서 카보프로스트), 및 케토로락 트로메타몰을 포함한다. 본 개시내용의 시스템에서, 트리스 완충액은 예를 들어, 대상체에게 투여 전에 제형이 더 낮은 온도에서 더 높은 온도로 온도를 변화시킬 때(예를 들어, 저온 저장에서 제거되고 가온됨(예를 들어, 실온 또는 체온까지)) pH를 감소시킨다. 일부 구현예에서, pH 변화는 예를 들어, 온도가 5 섭씨 온도에서 25 섭씨 온도로 증가함에 따라 섭씨 온도 당 평균 약 0.03 단위 pH이다.
일부 구현예에서, 온도-의존적 pH 이동 특성은 트리스 대 인산나트륨의 비율에 기반한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 인산나트륨의 몰 당 약 0.5 내지 약 2 몰의 트리스의 트리스 대 인산나트륨의 몰 비(예를 들어, 인산나트륨의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트리스, 예를 들어, 인산나트륨의 몰 당 약 1 몰의 트리스, 인산나트륨의 몰 당 약 1.25 몰의 트리스, 또는 인산나트륨의 몰 당 약 1.5 몰의 트리스)를 포함한다.
추가 구성요소
일부 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 폴리소르베이트 80(Tween 80)을 포함한다. 폴리소르베이트 80은 식품, 화장품 및 완충액에서 바이러스의 규칙적 분포를 보장하는 백신 현탁액에서 종종 사용되는 비이온성 계면활성제 및 유화제이다. 이 합성 화합물은 점성의 수용성 황색 액체이다. 폴리소르베이트 80은 비경구 투여를 위한 약제의 수성 제형을 안정화하는 데 사용되는 부형제이고, 인기있는 항부정맥 약물인 아미오다론의 제조에서 유화제로서 사용된다. 또한 일부 유럽 및 캐나다 인플루엔자 백신에서 부형제로서 사용된다. 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 인플루엔자 백신은 용량 당 2.5 μg의 폴리소르베이트 80을 함유한다. 또한 Middlebrook 7H9 브로쓰에서 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 배양에 사용된다. 또한 에스트로겐-조절 약물인 에스트라소르브(Estrasorb)에서 유화제로서 사용되고, IPA(이소프로필 알코올) 결합을 하면서 약물 및 부형제의 안정화를 위한 과립화에 사용된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 하나 이상의 당업계에 알려진 동결보호제를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결보호제의 포함은 원하는 경우 및/또는 필요한 경우 바이러스 현탁액이 동결되도록 한다. 동결보호제의 일 예는 글리세롤이다. 또한 글리세린이라고 하며 단순한 폴리올 화합물이다. 이는 단맛이 나고 무독성인 무색, 무취, 점성 액체이다. 글리세롤 백본은 글리세리드로 알려진 지질에서 발견된다. 항균성 및 항바이러스성 특성을 갖기 때문에 FDA 승인된 상처 및 화상 치료에 광범위하게 사용된다. 또한 간 질환을 측정하는 효과적인 마커로서 사용될 수 있다. 또한 식품 산업에서 감미료로서 광범위하게 사용되고 제약 제형에서 습윤제로서 광범위하게 사용된다. 3 개의 하이드록실 기의 존재로 인해, 글리세롤은 물과 혼화성이고 사실상 흡습성이 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 동결보호제로서 수크로스(공통 당)를 포함한다. 이는 2 가지 단당류인 글루코스 및 프룩토스로 구성된 분자인 이당류이다. 수크로스는 식물에서 자연적으로 생산되며, 이로부터 설탕이 정제된다. 분자식은 C12H22O11이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 통상적으로 NODA로도 알려진 스테로이드-유사 페난트렌 유도체인 (3α,5β, 7α,12α)-N-[3-[(4-O-D-갈락토피라노실-D-글루코노일)아미노]프로필]-3,7,12-트리하이드록시-N-[3-[[(3α,5β, 7α,12α)-3,7,12-트리하이드록시-24-옥소콜란-24-일]아미노] 프로필]-콜란-24-아미드, CAS 등록 번호 2127497-44-5를 포함한다(예를 들어, WO 2017/180344; WO 2005/058368; US 6,392,069 참조). NODA는 점막-다당류 코팅의 바이러스 침투를 돕는 것으로 알려져 있다. 따라서, 바이러스가 점막-다당류-코팅된 신체 부위에 투여되어야 하는 일부 구현예에서, NODA가 포함된다.
예시적인 온도-반응성 바이러스 저장 시스템
일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 다음 구성요소를 포함하는 초기 제형을 포함하며, 각 구성요소의 양은 트리스(트로메타민) 중량(w/w)의 퍼센트로 표현된다: 약 5,000% 내지 약 7,000% 글리세롤; 약 900% 내지 약 1,300% 수크로스; 약 100% 트로메타민; 약 75% 내지 약 125% Na 이수소 포스페이트 탈수화물; 약 500% 내지 약 700% 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린; 약 10% 내지 약 30% MgCl 육수화물; 0% 내지 약 100% NODA; 약 20% 내지 약 50% 폴리소르베이트 80; 약 1% 내지 약 4% 시트르산나트륨 탈수화물; 및 약 0.5% 내지 약 2% 시트르산 일수화물. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 1 부의 초기 제형 및 약 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 부의 물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 다음 구성요소를 포함하는 초기 제형을 포함하며, 각 구성요소의 양은 트리스(트로메타민) 중량(w/w)의 퍼센트로 표현된다: 약 4,500%, 약 5,000%, 약 5,500%, 약 6,000%, 약 6,500%, 약 7,000%, 또는 약 7,500% 글리세롤; 약 800%, 약 900%, 약 1,000%, 약 1,100%, 약 1,200%, 약 1,300%, 또는 약 1,400% 수크로스; 약 100% 트로메타민; 약 65%, 약 75%, 약 85%, 약 95%, 약 100%, 약 105%, 약 115%, 또는 약 125% Na 이수소 포스페이트 탈수화물; 약 400%, 약 500%, 약 550%, 약 575%, 약 580%, 약 590%, 약 600%, 약 700%, 또는 약 800% 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린; 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 또는 약 40% MgCl 육수화물; 0%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100% NODA; 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 50%, 또는 약 60% 폴리소르베이트 80; 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 또는 약 5% 시트르산나트륨 탈수화물; 및 약 0.25%, 약 0.5%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 또는 약 2.5% 시트르산 일수화물. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 1 부의 초기 제형 및 약 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 부의 물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 다음 구성요소를 포함하는 초기 제형을 포함하며, 각 구성요소의 양은 트리스(트로메타민) 중량(w/w)의 퍼센트로 표현된다: 약 6,000% 글리세롤; 약 1,200% 수크로스; 약 100% 트로메타민; 약 100% Na 이수소 포스페이트 탈수화물; 약 600% 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린; 약 20% MgCl 육수화물; 0% NODA; 약 35% 폴리소르베이트 80; 약 3% 시트르산나트륨 탈수화물; 및 약 0.75% 시트르산 일수화물. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 1 부의 초기 제형 및 약 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 부의 물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 다음 구성요소를 포함하는 초기 제형을 포함하며, 각 구성요소의 양은 트리스(트로메타민) 중량(w/w)의 퍼센트로 표현된다: 약 4,000% 글리세롤; 약 700% 수크로스; 약 100% 트로메타민; 약 150% Na 이수소 포스페이트 탈수화물; 약 400% 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린; 약 60% MgCl 육수화물; 약 75% NODA; 약 90% 폴리소르베이트 80; 약 6% 시트르산나트륨 탈수화물; 및 약 3% 시트르산 일수화물. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 1 부의 초기 제형 및 약 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 부의 물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 다음 구성요소를 포함하는 초기 제형을 포함하며, 각 구성요소의 양은 트리스(트로메타민) 중량(w/w)의 퍼센트로 표현된다: 약 6,000% 글리세롤; 약 1,200% 수크로스; 약 100% 트로메타민; 약 100% Na 이수소 포스페이트 탈수화물; 약 590% 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린; 약 21% MgCl 육수화물; 약 71% NODA; 약 36% 폴리소르베이트 80; 약 3% 시트르산나트륨 탈수화물; 및 약 1% 시트르산 일수화물. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 1 부의 초기 제형 및 약 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 부의 물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 다음 구성요소를 포함하는 초기 제형을 포함하며, 각 구성요소의 양은 트리스(트로메타민) 중량(w/w)의 퍼센트로 표현된다: 약 92% 인산나트륨, 약 100% 트리스, 약 11% 염화마그네슘, 약 1,180% 수크로스, 약 5,900% 글리세롤. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 저장 시스템은 1 부의 초기 제형 및 약 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 부의 물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 예를 들어, 온도가 5 섭씨 온도에서 25 섭씨 온도로 증가함에 따라 섭씨 온도 당 약 0.03 단위 pH의 pH 이동을 나타낸다.
바이러스
본 개시내용의 시스템은 임의의 유형의 바이러스, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예를 들어, 유전자 요법을 위한 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 포유류 세포 내로의 유전자 전달을 위한 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 1 바이러스, 헤르페스 바이러스, 종양바이러스(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다, (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
레트로바이러스는 바이러스 패밀리 레트로바이러스과에 속하는 외피 바이러스이다. 일단 숙주의 세포에서, 바이러스는 바이러스 역전사 효소를 사용하여 RNA를 DNA로 전사함으로써 복제한다. 레트로바이러스 DNA를 숙주 게놈의 일부로 복제하고, 프로바이러스로 지칭된다. 이식유전자는 벡터 내에 삽입되고 당업계에 알려진 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 그런 다음 재조합 바이러스는 단리되어 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호. 5,994,136, 6,165, 782, 및 6,428,953을 참조한다.
레트로바이러스는 알파레트로바이러스의 속(예를 들어, 조류 백혈증 바이러스), 베타레트로바이러스의 속; (예를 들어, 마우스 유방 종양 바이러스) 델타레트로바이러스의 속(예를 들어, 소 백혈병 바이러스 및 인간 T-림프친화성 바이러스), 엡실론레트로바이러스의 속(예를 들어, 각막백반 진피 육종 바이러스), 및 렌티바이러스의 속을 포함한다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스는 긴 인큐베이션 기간을 특징으로 하는 레트로바이러스과 패밀리의 바이러스 속인 렌티바이러스이다. 렌티바이러스는 비분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하며; 그들은 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. 렌티바이러스 벡터는 비증식 세포를 형질도입하고 낮은 면역원성을 나타낼 수 있다는 점에서 다른 바이러스 벡터에 대한 이점을 갖는다. 일부 예에서, 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2), 유인원 면역결핍 바이러스(S1V), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 감염성 빈혈(EIA), 및 비스나 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체내에서 상당한 수준의 유전자 전달을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 이중 가닥 DNA를 함유하는 큰 바이러스 패밀리이다. 그들은 숙주 세포의 DNA를 복제하면서, 숙주의 세포 기구를 사용하여 바이러스 RNA, DNA 및 단백질을 합성한다. 아데노바이러스는 복제 및 비복제 세포 둘 다에 영향을 미치고, 큰 이식유전자를 수용하고, 숙주 세포 게놈 내에 통합하지 않고 단백질을 코딩하는 것으로 당업계에 알려져 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. AAV 시스템은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Kelleher 및 Vos, Biotechniques, 17(6):1110-17 (1994); Cotten 등, P.N.A.S. U.S.A., 89(13):6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994); Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); 및 Asokan A, 등, Mol. Ther., 20(4):699-708 (2012) 참조). 재조합 AAV(rAAV) 벡터를 생성하고 사용하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 5,139,941 및 4,797,368에 기재되어 있다. AAV1, AAV2, AAV3(예를 들어, AAV3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 및 AAV11, 뿐만 아니라 이의 변이체를 포함하는 여러 AAV 혈청형이 특성화되었다.
이식유전자
본 개시내용의 시스템은 임의의 관심 이식유전자를 포함하거나 또는 암호화하는 본원에 기재된 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 이의 결실, 삽입, 또는 치환 변이체, 생물학적 활성 단편, 및 대립유전자 형태를 포함한 유형 1 및/또는 유형 2 인터페론을 포함하거나 또는 암호화한다. 유형 1 인터페론은 인터페론-α, -β, -ε, -κ, -ω, -δ, -ζ 및 -τ 및 그들의 하위유형을 포함하는 반면, 유형 2 인터페론은 인터페론-γ로 지칭된다(예를 들어, Lee 등, Front. Immunol. 9:2061 (2018) 참조). 특정 인터페론-α는 α-1(GenBank 수탁 번호 NP 076918), α-1b(GenBank 수탁 번호 AAL35223), α-2, α-2a(GenBank 수탁 번호 NP000596), α-2b(GenBank 수탁 번호 AAP20099), α-4(GenBank 수탁 번호 NP066546), α-4b(GenBank 수탁 번호 CAA26701), α-5(GenBank 수탁 번호 NP 002160 및 CAA26702), α-6(GenBank 수탁 번호 CAA26704), α-7(GenBank 수탁 번호 NP 066401 및 CAA 26706), α-8(GenBank 수탁 번호 NP002161 및 CAA 26903), α-10(GenBank 수탁 번호 NP 002162), α-13(GenBank 수탁 번호 NP 008831 및 CAA 53538), α-14(GenBank 수탁 번호 NP 002163 및 CAA 26705), α-16(GenBank 수탁 번호 NP 002164 및 CAA 26703), α-17(GenBank 수탁 번호 NP 067091), α-21(GenBank 수탁 번호 P01568 및 NP002166), 및 미국 특허 번호 5,541,293; 미국 특허 번호 4,897,471; 및 미국 특허 번호 4,695,629에 기재된 바와 같은 공통 인터페론을 포함하나 이에 제한되지 않는 인간 인터페론 α 하위유형; 및 미국 특허 번호 4,414,150에 기재된 바와 같은 하이브리드 인터페론을 포함한다. 인터페론-γ는 예를 들어, EP 77,670A 및 EP 146,354A, 및 GenBank 수탁 번호 NP 002168에 기재되어 있다. 본 개시내용의 특정 조성물은 예를 들어, 신호 서열이 있거나 없는 미국 특허 번호 6,835,557에 기재된 인터페론-α를 암호화하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비복제 재조합 아데노바이러스 벡터는 유형 5 비복제 아데노바이러스 벡터이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비복제 재조합 아데노바이러스 벡터는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,210,939에 기재된 재조합 아데노바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 적어도 하나의 IFN α-2(예를 들어, IFN α-2a 또는 IFN α-2b 중 하나 또는 둘 다)를 암호화한다. 특정 구현예에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 인간 IFN α-2b를 암호화한다.
바이러스 입자의 저장
본 개시내용의 시스템은 바이러스 입자(예를 들어, 바이러스 벡터 입자)를 포함하는 제형을 저장하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, 인터페론 α-2b를 암호화하는 아데노바이러스 벡터)는 본 개시내용의 시스템을 사용하여 제형화되고 저장 조건에 적용되며, 예를 들어, 약 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 14 개월, 16 개월, 18 개월, 20 개월, 22 개월, 24 개월, 28 개월, 32 개월, 36 개월, 48 개월, 또는 그 이상 동안 동결 또는 비동결 저장된다(예를 들어, 약 -60℃에서, 약 -20℃에서, 약 -15℃에서, 약 -10℃에서, 약 -5℃에서, 약 0℃에서, 약 4℃에서, 또는 약 8℃에서). 일부 구현예에서, 이러한 저장 조건에서 저장 후, 바이러스 벡터는 대조군에 비해, 높은 수준의 감염력을 유지한다. 예를 들어, 이러한 저장 조건에서 저장 후, 바이러스 벡터는 감염력 대조군 수준(예를 들어, 이러한 저장 조건에서 저장하기 전 이러한 바이러스 벡터의 감염력 수준, 또는 이러한 저장 조건 동안 이전 시점에서 이러한 바이러스 벡터의 감염력 수준)에 비해, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상인 감염력 수준을 입증한다. 일부 구현예에서, 이러한 저장 조건에서 저장 후, 바이러스 벡터는 감염력 대조군 수준(예를 들어, 이러한 저장 조건에서 저장하기 전 이러한 바이러스 벡터의 감염력 수준, 또는 이러한 저장 조건 동안 이전 시점에서 이러한 바이러스 벡터의 감염력 수준)에 비해, 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 이하 또는 그 이하로 감소되는 감염력 수준을 입증한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, 인터페론 α-2b를 암호화하는 아데노바이러스 벡터)는 본 개시내용의 시스템을 사용하여 제형화되고 저장 조건에 적용되며, 예를 들어, 약 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 14 개월, 16 개월, 18 개월, 20 개월, 22 개월, 24 개월, 28 개월, 32 개월, 36 개월, 48 개월, 또는 그 이상 동안 동결 또는 비동결 저장된다(예를 들어, 약 -60℃에서, 약 -20℃에서, 약 -15℃에서, 약 -10℃에서, 약 -5℃에서, 약 0℃에서, 약 4℃에서, 또는 약 8℃에서). 일부 구현예에서, 이러한 저장 조건에서 저장 후, 제형은 대조군에 비해, 높은 수준의 총 바이러스 입자 농도를 유지한다. 예를 들어, 이러한 저장 조건에서 저장 후, 총 바이러스 입자 농도의 수준은 총 바이러스 입자 농도의 대조군 수준(예를 들어, 이러한 저장 조건에서 저장하기 전 총 바이러스 입자 농도의 수준, 또는 이러한 저장 조건 동안 이전 시점에서 총 바이러스 입자 농도의 수준)에 비해, 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 이러한 저장 조건에서 저장 후, 총 바이러스 입자 농도의 수준은 총 바이러스 입자 농도의 대조군 수준(예를 들어, 이러한 저장 조건에서 저장하기 전 총 바이러스 입자 농도의 수준, 또는 이러한 저장 조건 동안 이전 시점에서 총 바이러스 입자 농도의 수준)에 비해, 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 이하 또는 그 이하로 감소된다.
바이러스 입자 농도 및 감염력을 측정하기 위한 방법 및 검정은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Nyberg-Hoffman 등, Nat. Med. 3:808-11 (1997); Barde 등, Curr. Protoc. Neurosci. 53:4.21.1-4.21.23 (2010); Pankaj, Mater. Methods 3:207 (2013); WO2017/048599를 참조한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 저장 조건 하에 저장된 바이러스 벡터의 샘플은 바이러스 입자 농도 또는 감염력을 측정하기 전에, 실온으로 가져온다(예를 들어, 약 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 또는 그 이상 동안 실온에서 유지). 당업계에 알려진 바와 같이, 감염력 수준은 예를 들어, mL 당 NAS IU(정규화되고 조정된 표준 - 감염 단위)로 표현될 수 있다.
조성물 및 투여
본원에 기재된 시스템(예를 들어, 본원에 기재된 시스템 구성요소 및 바이러스 벡터를 포함하는 조성물)은 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 예를 들어, 질환, 예를 들어, 암(예를 들어, 방광암)의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하도록 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 통상적인 약제학적 관행에 따라 주사용 멸균 제형으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 방광내 점적주입을 위한 멸균 현탁 제형이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 오염물(예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, HEK293 세포) 및/또는 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청)의 구성요소(예를 들어, DNA 및 단백질))이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 미량의 오염물(예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, HEK293 세포) 및/또는 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청)의 구성요소(예를 들어, DNA 및 단백질))을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 보존제가 실질적으로 없다.
임의의 특정 형태의 선택 또는 사용은 부분적으로 의도된 투여 방식 및 치료 적용에 의존할 수 있다. 예를 들어, 전신 또는 국소 전달을 위해 의도된 조성물은 주사용 또는 주입용 용액의 형태일 수 있다. 따라서, 조성물은 비경구 방식(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 주사)에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비경구 투여는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 제한 없이, 방광내, 정맥내, 비강내, 안구내, 폐, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 폐내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 대뇌내, 두개내, 경동맥내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 투여 경로는 비경구적, 예를 들어, 방광내 점적주입 또는 주사에 의한 투여일 수 있다. 일부 구현예에서, 방광내 투여는 카테터와 같은 장치에 의해 달성될 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 시스템은 본원에 기재된 저장 조건 하에 저장하기 위한 바이러스 벡터와 함께 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 동결 저장되고 대상체에게 투여하기 전에 액체가 될 때까지 실온(예를 들어, 약 20℃ 내지 약 25℃)에서 해동된다. 일부 구현예에서, 조성물은 동결되지 않은 상태로 저장되고 대상체에게 투여 전에 실온(예를 들어, 약 20℃ 내지 약 25℃)으로 가온된다. 일부 구현예에서, 조성물은 대상체에게 투여 전에 실온으로 가온되고, 실온에서 약 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 또는 그 이상 동안 유지된다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 예를 들어, 암(예를 들어, 암, 예를 들어, 암종 또는 다른 고형 또는 혈액 암, 암 전이)을 치료하거나 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 조직병리학적 유형 또는 침습성 단계와 관계없이, 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직, 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 암과 연관된 전이성 병변을 치료하거나, 또는 이의 크기, 수, 또는 성장 속도를 감소시키는 데 특히 유용하다.
암의 예는 고형 종양, 연조직 종양, 조혈 종양 및 전이성 병변을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 고형 종양의 예는 두경부(인두 포함), 갑상선, 폐(소세포 또는 비소세포 폐 암종), 유방, 림프, 위장관(예를 들어, 구강, 식도, 위, 간, 췌장, 소장, 결장 및 직장, 및 관), 생식기 및 비뇨생식기 관(예를 들어, 신장, 요로상피, 방광, 난소, 자궁, 자궁경부, 자궁내막, 전립선, 고환), CNS(예를 들어, 신경 또는 신경교 세포, 예를 들어, 신생아세포종 또는 신경교종), 피부( 예를 들어, 흑색종)에 영향을 미치는 것들과 같은 다양한 기관계의 악성종양, 예를 들어, 육종, 선 암종, 및 암종을 포함한다. 치료될 수 있는 조혈 암의 예는 혈관종, 다발성 골수종, 림프종 및 백혈병 및 골수이형성증을 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 전술된 암과 연관된 전이성 병변을 치료, 예를 들어 감소 또는 지연시키는 데 특히 유용하다. 일부 구현예에서, 대상체는 조직의 외과적 제거, 화학요법, 또는 다른 항-암 요법 중 하나 이상을 겪었을 것이고 1차 또는 유일한 표적은 전이성 병변, 예를 들어, 뼈 또는 림프절 또는 폐 또는 간 또는 복강 또는 CNS 또는 다른 기관에서의 전이일 것이다.
당업자는 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 기재된 조성물의 적절한 투여량은 일반적으로 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 조성물의 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 이용된 투여 형태 및 활용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본원에 기재된 조성물의 경우, 치료적으로 유효 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정된 바와 같은 IC50을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, (예를 들어, 방광 조직에) 국소 투여가 바람직한 경우, 국소 부위 내에서 치료적으로 유효 농도를 달성하는 데 필요한 용량을 결정하기 위해 세포 배양 또는 동물 모델링이 사용될 수 있다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 단지 예시적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 본원에 기재된다.　
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 예시적 목적으로만 제공된다. 이는 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 범위 또는 내용을 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1은 각 성분에 대한 예시적 중량 범위를 제공하며, 각 구성요소의 양은 조성물을 만드는 데 사용된 트리스(트로메타민) 중량의 퍼센트로 표현된다.
Figure pct00001
이의 1 부(w/w)를 약 10 부(w/w)의 정제수와 조합하여 최종 완충액을 제조한다. 그런 다음 이 완충액을 사용하여 감염성 바이러스를 현탁시킨다. 완충액 중 바이러스의 밀도는 바이러스의 궁극적인 의학적 용도에 의존한다. 백신 및 다른 주사용 제품은 보다 농축된 제제(바이러스에 대한 적은 부피의 완충액)를 필요로 할 것이다. 예를 들어, 방광 점적주입 또는 흉부 관개를 위한 관개 제품은 더 많은 희석 제제, 예를 들어, 완충액의 mL 당 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1013 개의 바이러스 입자를 사용할 수 있다. 이 실시예에서, mL 당 4 x 1016 개의 렌티바이러스 입자를 사용한다.
실시예 2: 예시적인 완충액이 실시예 2로서 여기에 제시되어 있으며, 각 구성요소의 양은 조성물을 만드는 데 사용된 트리스(트로메타민) 중량의 퍼센트로 표현된다.
Figure pct00002
이의 1 부(w/w)를 9 부(w/w)의 정제수와 조합하여 최종 완충액을 제조한다. 그런 다음 이 완충액을 사용하여 완충액의 mL 당 약 1 x 1011 개의 아데노-연관 바이러스 입자의 농도로 감염성 바이러스를 현탁시킨다.
실시예 3: 또 다른 예시적인 완충액이 실시예 3으로 여기에 제시되어 있으며, 각 구성요소의 양은 조성물을 만드는 데 사용된 트리스(트로메타민) 중량의 퍼센트로 표현된다.
Figure pct00003
이의 1 부(w/w)를 9 부(w/w)의 정제수와 조합하여 최종 완충액을 제조한다. 그런 다음 이 완충액을 사용하여 완충액의 mL 당 약 3 x 1011 개의 아데노바이러스 입자의 농도로 감염성 바이러스를 현탁시킨다.
실시예 4: 또 다른 예시적인 완충액이 실시예 4로 여기에 제시되어 있으며, 각 구성요소의 양은 조성물을 만드는 데 사용된 트리스(트로메타민) 중량의 퍼센트로 표현된다.
Figure pct00004
이의 1 부(w/w)를 9 부(w/w)의 정제수와 조합하여 최종 완충액을 제조한다. 그런 다음 이 완충액을 사용하여 완충액의 mL 당 약 3 x 1011 개의 아데노바이러스 입자의 농도로 감염성 바이러스를 현탁시킨다.
본 발명자들은 본 발명의 완충액에 대해 테스트하여 현탁된 바이러스가 동결되지 않은 액체로서 저장되는 경우에도 바이러스의 감염력을 보존하며, 따라서 적어도 만 1 년 동안 감염력이 보존됨을 발견하였다.
실시예 5: 감염력 검정 프로토콜
본 발명자들은 형광 활성화 세포 분류기(FACS)를 사용하여 바이러스 샘플의 감염력을 검정하였다.
바이러스의 경우, 본 발명자들은 복제 결핍 재조합 아데노바이러스 유형 5(rAd)를 사용하였다. 검정 원리는 HEK293 세포를 15 분 동안 rAd의 세포(ppc) 당 30, 60 및 90 개의 바이러스 입자(vp)로 감염시키고 바이러스를 생산하도록 48 시간 동안 방치하는 것이다. HEK293 세포는 보완 기능을 함유하며 따라서 복제 결핍 바이러스를 복제할 수 있게 한다. 인큐베이션 후, 감염된 세포를 고정시키고 아데노바이러스 헥손 구조적 단백질에 대한 FITC 접합된 항체로 염색한다. 그런 다음 감염된 세포 내에 축적된 헥손을 유세포 분석기로 정량화할 수 있다. 감염력을 검정하는 두번째 방법으로, 본 발명자들은 인터페론에 대한 유전자를 보유하는 rAd(rAd-IFN)를 사용하였다. 이 유전자의 발현은 바이러스 감염에 대한 대용물인 인터페론 활성을 측정할 수 있게 한다.
모든 세포 작업 및 세포를 고정하는 것까지의 절차를 무균 기술을 사용하여 층류 후드에서 수행하여 작동자에 대한 생물학적 유해 물질의 위험을 최소화하였다. 고정 후, 세포측정기 분석 전에 나머지 절차를 흄 후드에서 수행하였다.
대조군 샘플 rAd를 10.9 mM 인산나트륨, 14 mM 트리스 염기, 2 mM 염화마그네슘, 2 %(w/v) 수크로스, 10 %(w/v) 글리세롤의 최종 제형 완충액에서 제형화하였으며, 이는 실온에서, 8.1의 약간 염기성 pH를 제공한다. 본 발명자들은 5.4 x 1011 vp/ml의 바이러스 입자 농도를 사용하였다.
참조 표준으로서, 본 발명자들은 스위스 소재 Merck Sharpe & Dohme에서 제조된 정제된 rAd 바이러스를 사용하였다. 참조 표준은 1.4 x 1012 vp/ml의 바이러스 입자 농도, 1.37 x 1011 NAS IU/ml의 테스트 시작 시 감염력("NAS IU"는 정규화되고 조정된 표준 - 감염 단위임) 및 251 IU/ml의 효능을 가졌다.
rAd 과정 개발 샘플에 대한 감염력 검정은 분석될 샘플의 수에 따라 6-웰 또는 96-웰 플레이트를 사용하여 실행할 수 있다. 결과는 참조 표준에 대한 상대 역가로 보고하였고, 검정 성능은 대조군 샘플을 사용하여 모니터링하였다. 6-웰 플레이트 검정에서, 3 개의 테스트 샘플(TS), 참조 표준(RS) 및 대조군 샘플(CS)을 분석할 수 있다. 96-웰 플레이트에서 15 개의 테스트 샘플을 분석할 수 있다. 상이한 샘플의 감염력을 비교해야 하는 경우, 샘플을 동일한 검정에서 분석되어야 한다.
본 발명의 표준 검정은 20 개의 웰, 3 개의 전체 플레이트 및 4 번째에 2 개의 웰로 이루어졌다. 검정을 수행하기 위해, 본 발명자들은 먼저 7.4 x 105 개의 세포 / ml를 갖는 세포 현탁액을 제조하였다. 이렇게 하기 위해, 본 발명자들은 계산된 양의 사전 가온된 성장 배지를 멸균 용기에 피펫팅한다. 그런 다음 본 발명자들은 계산된 양의 현탁액을 성장 배지가 있는 용기로 옮기기 전에 적어도 10 회 뒤집어서 세포 현탁액을 부드럽지만 완전히 혼합하였다. 그런 다음 본 발명자들은 PIPETBOY®로 적어도 10 회 위아래로 피펫팅하여 시딩 판매 현탁액을 완전히 혼합하였다. 그런 다음 본 발명자들은 6-웰 플레이트 상의 웰 당 1 ml를 시딩하고, 플레이트 사이에 피펫 팁을 교체하고, 플레이트를 흔들어 세포 현탁액을 웰을 가로질러 고르게 분산시켰다. 그런 다음 본 발명자들은 시딩된 플레이트를 37℃, 5 % CO2 인큐베이터에 22 ±4 시간 동안 옮겼다.
세포가 고정될 때까지 작업은 LFH에서 수행하였고 이후에 흄 후드에서 수행하였다. 본 발명자들은 원심분리 후 항상 소량의 상청액을 남겨두며; 이 작은 단계는 고정 전에 특히 중요한데 세포가 너무 건조하게 흡입된 경우 쉽게 응집될 것이기 때문이다. 그런 다음 본 발명자들은 플레이트를 인큐베이터에서 제거하였으며, 제거 날짜와 시간을 표시하였다. 그런 다음 본 발명자들은 현미경으로 세포를 조사하고 부착 및 합류 정도를 기록하였다. 그런 다음 멸균 유리 파스퇴르 피펫 및 진공 펌프를 사용하여, 본 발명자들은 샘플의 모든 웰로부터 배지를 흡입하였다. 그런 다음 본 발명자들은 TrypLE™ 0.5 ml를 신속히 첨가하고 다음 샘플로 넘어갈 때 세포를 그대로 방치하였다. 본 발명자들은 샘플 사이에 파스퇴르 유리를 교체하였다.
그런 다음 본 발명자들은 세포를 세포가 분리될 때까지(이는 때때로 3 분 넘게 걸림) 세포를 실온("RT")에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 본 발명자들은 현미경으로 세포가 분리되었는지 확인하였는데, 모든 세포가 이 시점에서 분리되는 것이 중요하기 때문이다. 그런 다음 본 발명자들은 TrypLE™이 첨가된 것과 동일한 순서로 사전 가온된 성장 배지 2 ml를 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음 본 발명자들은 모든 세포가 현탁액에 있도록 하기 위해 조심스럽게 위아래로 피펫팅하였다. 그런 다음 본 발명자들은 각 튜브의 세포를 팔콘 튜브로 옮기고 튜브를 원심분리하였다. 그런 다음 본 발명자들은 각 튜브에서 배지를 흡입하였으며, 약 50 - 100 μl의 상청액을 남겨두었다.
그런 다음 본 발명자들은 나머지 상청액에 세포를 재현탁하였다. 그런 다음 본 발명자들은 빙냉 아세톤: 메탄올 1 ml를 첨가하여 세포를 고정시키고 투과성으로 만들어 부드럽게 위아래로 피펫팅하였다. 세포가 이 시점에서 단일 세포 현탁액에 있는 것이 매우 중요하다. 그런 다음 본 발명자들은 샘플을 4℃에서 15 내지 60 분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 본 발명자들은 PBS 중 1% BSA 1 mL를 각 튜브에 첨가하였다. 그런 다음 본 발명자들은 원심분리하고, 이어서 각 튜브에서 약 50 - 100 μl의 상청액을 남겨 두고 상청액을 흡입하였다.
그런 다음 본 발명자들은 나머지 상청액에 세포를 재현탁하였다. 그런 다음 본 발명자들을 모노클로날 항체 70 μl를 각 튜브에 첨가하고, 세포를 항체로 4℃에서 15 분 동안 염색하였다. 아데노바이러스를 사용한 본 발명의 실험을 위해, 본 발명자들은 아데노바이러스 헥손 캡시드 폴리펩티드에 특이적인 항체를 사용하였다. 또 다른 종류의 바이러스에 대해, 물론 해당 종류의 바이러스에 특이적인 항체를 사용할 수 있으며; 바이러스 및 항체의 특정 선택은 청구된 발명에 중요하지 않다.
본 발명자들은 CANTO II™ 상표명 형광-활성화 세포 분류기를 사용하여 형광 항체-태그된 폴리펩티드를 함유하는 세포를 카운트하였다. 분석 전에 형광-활성화 세포 분류기의 전원을 켜고 CST 비드를 먼저 성능 확인용으로 실행하였다. 첫번째 샘플을 실행하는 동안, 본 발명자들은 P1 게이트로 이동하여 주요 세포 집단을 덮었다. 본 발명자들은 데이터-수집 설정이 각 96-웰 플레이트가 각 P1 게이트에서 약 10,000 개의 이벤트를 생산하고, 각 튜브가 각 P1 게이트에서 약 50,000 개의 이벤트를 생산하도록 해야 하는 것을 선호한다.
실시예 6: 동결되지 않은 액체 완충액은 적어도 1 년 동안 감염력을 보존한다. 본 발명자들은 실시예 4의 완충액에서 바이러스의 현탁액을 제조하고, 현탁액을 -20 C에서 1 년 이상 동안 저장하고, 바이러스 입자 농도를 주기적으로 측정하였다. -20 C에서, 완충액에는 다양한 염 및 부형제가 포함되었기 때문에 액체(동결되지 않음)로 유지되었다. 본 발명의 실험 데이터는 만 1 년의 과정 동안 총 바이러스 입자 농도가 감소되었지만, 무의미하였음을 나타낸다. 또한, 보다 중요하게는, 저장된 바이러스의 감염 역가가 3 개월 후 약간 감소하였지만, 그 다음에 안정화되었고 이후에 적어도 만 1 년 동안 (초기 감염 역가의 백분율로서) 상당히 높게 유지되었다.
Figure pct00005
본 발명의 온도-반응성 완충 시스템으로 1 년에 걸쳐 달성된 주목할만한 안정성은 본 발명의 완충 시스템이 18 개월, 24 개월, 및 그 이상 저장 동안 액체 상태에서 감염력을 보존할 것임을 나타낸다.
실시예 7: 본 발명자들은 실시예 6에 대한 프로토콜을 반복하였다. 그러한 데이터는 다시 12 개월 저장 후 바이러스 입자 농도 및 감염 역가 둘 다의 안정성을 나타낸다.
Figure pct00006
실시예 8: 본 발명자들은 실시예 6에 대한 프로토콜을 반복하였다. 그러한 데이터는 다시 12 개월 저장 시 바이러스 입자 농도 및 감염 역가의 주목할만한 안정성을 나타낸다.
Figure pct00007
실시예 9: 본 발명자들은 실시예 6에 대한 프로토콜을 반복하였다. 그러한 데이터는 다시 12 개월 저장 후 바이러스 입자 농도 및 감염 역가 둘 다의 안정성을 나타낸다.
Figure pct00008
실시예 10: 실시예 1의 제조물을 사용하여 실시예 6에 대한 프로토콜을 반복한다. 그러한 데이터는 다시 12 개월 저장 후 바이러스 입자 농도 및 감염 역가 둘 다의 안정성을 나타낸다.
Figure pct00009
등가물
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 전술된 설명은 예시하는 것으로 의도되며 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의된 본 발명의 범위를 제한하지 않음이 이해되어야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있다.

Claims (32)

  1. 감염성 바이러스 입자, 트로메타민 및 사이클로덱스트린을 포함하는 조성물로서, 바이러스 입자 당 약 1 x 109 내지 약 1 x 1012 개의 사이클로덱스트린 분자를 포함하는, 조성물.
  2. 감염성 바이러스 입자, 사이클로덱스트린, 트로메타민, 및 인산나트륨을 포함하는 조성물로서, 인산나트륨의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트로메타민을 포함하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물이 바이러스 입자 당 약 1 x 109 내지 약 1 x 1012 개의 사이클로덱스트린 분자를 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호적 유효량의 글리세롤, 수크로스, 또는 둘 다를 추가로 포함하는, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 트로메타민 양(w/w)의 약 600 배의 상대량으로 글리세롤을 포함하고, 상기 조성물이 트로메타민 양(w/w)의 약 120 배의 상대량으로 수크로스를 포함하는 것인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린이 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 트로메타민 양(w/w)의 약 6 배의 상대량으로 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린을 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 트로메타민 양(w/w)의 약 0.7 배의 상대량으로 (3α,5β, 7α,12α)-N-[3-[(4-O-D-갈락토피라노실-D-글루코노일)아미노]프로필]-3,7,12-트리하이드록시-N-[3-[[(3α,5β, 7α,12α)-3,7,12-트리하이드록시-24-옥소콜란-24-일]아미노] 프로필]-콜란-24-아미드(NODA)를 추가로 포함하는, 조성물.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산나트륨이 인산이수소나트륨 이수화물인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 염화마그네슘, 폴리소르베이트 80, 시트르산나트륨, 및 시트르산을 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 조성물의 밀리리터 당 약 1 x 1011 개의 바이러스 입자의 양으로 존재하는 것인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 제1 온도에서 제1 pH, 및 제2 온도에서 제2 pH를 갖되, 상기 제1 온도는 제2 온도보다 더 낮고, 제1 pH는 제2 pH보다 더 높은 것인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 온도가 약 -20℃이고, 제1 pH가 염기성 pH인, 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 제2 온도가 약 20℃ 내지 약 25℃이고, 제2 pH가 산성 pH인, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 동결되지 않은 액체로서, 또는 동결된 상태로, -20℃에서 약 1 년 동안 저장 후, 바이러스 입자가 초기 총 바이러스 입자 농도의 적어도 약 95% 및 정규화되고 조정된 표준 - 감염 단위(NAS IU)로 측정된 그의 초기 감염 역가의 적어도 약 80%를 유지하는 것인, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염성 바이러스가 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스인, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염성 바이러스가 복제 결핍 아데노바이러스인, 조성물.
  18. 인산이수소나트륨 탈수화물, 트로메타민, 글리세롤, 수크로스, 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린, NODA, 및 감염성 복제 결핍 아데노바이러스를 포함하는 조성물로서,
    인산이수소나트륨 탈수화물의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트로메타민의 상대량으로 트로메타민;
    트로메타민 양(w/w)의 약 600 배의 상대량으로 글리세롤;
    트로메타민 양(w/w)의 약 120 배의 상대량으로 수크로스;
    트로메타민 양(w/w)의 약 6 배의 상대량으로 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린;
    트로메타민 양(w/w)의 약 0.7 배의 상대량으로 NODA; 및
    조성물의 밀리리터 당 약 1 x 1011 개의 복제 결핍 아데노바이러스 입자를 포함하는 것인, 조성물.
  19. 감염성 바이러스 입자, 트로메타민 및 사이클로덱스트린을 포함하는 조성물로서, 사이클로덱스트린은 바이러스 입자 당 약 1 x 109 내지 약 1 x 1012 개의 사이클로덱스트린 분자의 상대량으로 존재하고, 트로메타민은 온도 변화에 반응하여 pH를 변화시킬 수 있고, 트로메타민은 조성물이 액체, 동결되지 않은 상태, 또는 동결된 상태에서, -20℃에서 1 년 동안 저장되는 경우, 바이러스 입자가 초기 총 바이러스 입자 농도의 적어도 약 95% 및 NAS IU로 측정된 그의 초기 감염 역가의 적어도 약 80%를 유지하는 양으로 존재하는 것인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 인산나트륨의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트로메타민의 상대량으로 존재하는 인산나트륨을 추가로 포함하는, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 인산나트륨이 인산이수소나트륨 탈수화물인, 조성물.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호적 유효량의 글리세롤, 수크로스, 또는 둘 다를 추가로 포함하는, 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 조성물이 트로메타민 양(w/w)의 약 600 배의 상대량으로 글리세롤을 포함하고, 조성물이 트로메타민 양(w/w)의 약 120 배의 상대량으로 수크로스를 포함하는 것인, 조성물.
  24. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린이 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린인, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조성물이 트로메타민 양(w/w)의 약 6 배의 상대량으로 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린을 포함하는 것인, 조성물.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염성 바이러스가 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스인, 조성물.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염성 바이러스가 복제 결핍 아데노바이러스인, 조성물.
  28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 트로메타민 양(w/w)의 약 0.7 배의 상대량으로 NODA를 추가로 포함하되, 상기 바이러스는 조성물의 밀리리터 당 약 1 x 1011 개의 바이러스 입자의 양으로 존재하는 것인, 조성물.
  29. 제19항에 있어서, 인산이수소나트륨 탈수화물의 몰 당 약 1 내지 약 1.5 몰의 트로메타민의 상대량으로 존재하는 인산이수소나트륨 탈수화물을 추가로 포함하고, 글리세롤 및 수크로스를 추가로 포함하되, 글리세롤은 트로메타민 양(w/w)의 약 600 배의 상대량으로 존재하고 수크로스는 트로메타민 양(w/w)의 약 120 배의 상대량으로 존재하며, 상기 사이클로덱스트린은 트로메타민 양(w/w)의 약 6 배의 상대량으로 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린을 포함하고, 상기 감염성 바이러스는 복제 결핍 아데노바이러스를 포함하고, 트로메타민 양(w/w)의 약 1 배의 상대량으로 NODA를 추가로 포함하되, 상기 바이러스는 조성물의 밀리리터 당 약 1 x 1011 개의 바이러스 입자의 양으로 존재하는 것인, 조성물.
  30. 감염성 바이러스의 감염력 수준을 보존하는 방법으로서, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 액체, 동결되지 않은 상태, 또는 동결된 상태로, -20℃에서 적어도 1 년 동안 저장하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 바이러스 입자가 초기 총 바이러스 입자 농도의 적어도 약 95% 및 NAS IU로 측정된 그의 초기 감염 역가의 적어도 약 80%를 유지하는 것인, 방법.
  32. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 바이러스 입자는 인간 인터페론 α-2b를 암호화하는 재조합 아데노바이러스 입자인, 방법.
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