KR20220041003A - 니클로사마이드를 포함하는 항-메르스 코로나바이러스 조성물 - Google Patents

니클로사마이드를 포함하는 항-메르스 코로나바이러스 조성물 Download PDF

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KR20220041003A
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mers
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Abstract

본 발명은 니클로사마이드(niclosamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 지연방출 조성물을 포함하는, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

Description

니클로사마이드를 포함하는 항-메르스 코로나바이러스 조성물{ANTI-MERS CoV COMPOSITION COMPRISING NICLOSAMIDE}
본 발명은 니클로사마이드(niclosamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 지연방출 조성물을 포함하는, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
MERS(Middle East Respiratory Syndrome, 중동호흡기증후군)는 베타코로나바이러스 속(genus)에 속한 신종 코로나바이러스(CoV)인 메르스 코로나바이러스(MERS-CoV)에 감염되어 발생하는 급성호흡기질환으로서, 발열, 기침, 호흡곤란 등의 증상을 나타내며 확진 환자 10 명 당 3~4 명이 사망하는 것으로 보고되어 있다.
코로나바이러스는 사람과 동물에서 주로 폐렴과 장염을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 간혹 신경계 감염과 간염을 유발하는 것으로도 알려져 있다. 코로나바이러스는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는, 약100-120 nm 크기의 positive sense RNA 바이러스이다. 유전적 구조에 기초하여 알파코로나바이러스(alphacoronavirus), 베타코로나바이러스(betacoronavirus), 감마코로나바이러스(gammacoronavirus), 델타코로나바이러스(deltacoronavirus)의 4가지 속(genera)으로 세분된다. 이 중 인간에게 중증의 급성호흡기 감염을 유발하는 인간코로나바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARSCoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2; coronavirus disease 2019, COVID-19)이며, 모두 베타코로나바이러스에 속한다.
코로나바이러스는 가장 외각에 있는 spike 단백질 (S), hemagglutinin-esterase (HE) 단백질, transmembrane (M) 단백질, small membrane (E) 단백질 및 nucleocapsid (N) 단백질 등 총 5개의 구조 단백질로 이루어져 있다. 이 중 spike 단백질은 세포 수용체와 결합하는 리간드 역할을 하며, 숙주세포와 바이러스간의 융합을 유도하는 단백질로 가장 변이가 심한 단백질로 알려져 있다.
코로나 바이러스는 그 변이가 심하여 기존 항바이러스제가 다시 적용될 경우 최신 유행하고 있는 형태의 바이러스형과 맞지 않으면 효과가 낮은 단점이 있어, 감염 억제 및 치료 효과가 우수한 항바이러스제의 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
Michela Mazzon et al., Viruses 2019, 11, 176; 「Identification of Broad-Spectrum Antiviral Compounds by Targeting Viral Entry」
본 발명의 목적은 니클로사마이드(niclosamide) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 지연방출 조성물을 포함하는, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 니클로사마이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 지연방출 조성물을 포함하는 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, “니클로사마이드(niclosamide)”는 1960년 FDA 승인을 받아 50년 가까이 다양한 기생충 감염 치료에 사용되는 경구형 살리실 아닐리드 유도체이다. 이러한 기존 니클로사마이드 제제는 수용해도 및 장관투과도가 매우 낮아 생체이용율이 극도로 낮음에 따라 체내에서 항바이러스 활성을 달성하기 위한 혈중 약물농도의 달성 및 유지가 불가능하였다. 특히 경구 투여시 약물의 청소율(Clearance)이 극도로 빠른 것으로 나타나, 기존 제형으로는 니클로사마이드를 항바이러스 용도로의 체내 적용이 불가능한 문제가 있었다.
본 발명의 지연방출 조성물은 상기와 같은 니클로사마이드 기존 제형의 문제점을 해결하고 항바이러스 활성을 나타낼 수 있는 PK 프로파일 특성을 나타내는 것으로서, 유효 혈중농도가 장시간 유지될 수 있도록 하여 유효한 항바이러스 활성이 나타날 수 있도록 하였다.
구체적으로, 상기 지연방출 조성물은 니클로사마이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체를 포함하는 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 음이온계 다당류는 카복시 다당류인 것일 수 있으며, 상기 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체는 카복시메틸 셀룰로오스, 카복시에틸 셀룰로스, 카복시메틸 키토산 또는 카복시메틸 덱스트란일 수 있으나, 상기에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로 상기 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체는 카복시메틸 셀룰로오스일 수 있으나, 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체로서 약학 제제의 부형제로 적용되어 본 발명의 효과를 나타낼 수 있는 고분자면 제한없이 적용될 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 조성물은 인산염 및 나트륨염을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 인산염 및 나트륨염은 인산 나트륨 일염기 일수화물로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 구체적으로, 상기 지연방출 조성물은 만니톨을 추가로 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당알코올로서 주사 제형에 적용될 수 있는 부형제이면 필요에 따라 변경하여 적용할 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체를 포함하여 니클로사마이드 지연방출 조성물을 제조하였으며, 상기 제조된 조성물에서 목적하는 혈중 약물농도의 달성 및 유지가 가능할 뿐 아니라(도 1 및 도 2), 유효한 메르스 코로나바이러스 억제 효과까지 나타냄을 확인하였다.
본 발명에서, 상기 “메르스 코로나바이러스 감염”은 메르스 코로나 바이러스에 의해 폐 및/또는 기도가 감염된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 호흡기 질환을 동반하며, 염증 반응이 심화되면 조직 손상까지 이어질 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 니클로사마이드를 비경구 투여한 경우, 높은 생체이용율과 혈중 농도 유지 효과를 나타냄에 따라(도 1 및 도 2), 경구 투여에 비해 독성이 낮아 사망 개체가 나타나지 않으면서도 메르스 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 나타나면서 체중이 유지될 수 있음을 확인하였으며(도 3), 메르스 코로나바이러스가 감염된 마우스 폐 조직에서 바이러스 역가를 현저히 낮추는 효과가 있음을 확인하였다(도 4).
이와 같이 니클로사마이드의 비경구 투여를 제시한 본 발명은 메르스 코로나 바이러스 감염에 의한 염증 반응 및 조직 손상에 대해 효과적으로 대응할 수 있다.
본 발명에서, “예방”은 본 발명의 조성물이 메르스 코로나바이러스에 의한 감염의 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, “치료”는 본 발명의 조성물이 메르스 코로나바이러스에 의한 감염의 증상이 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여 제제인 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 피하 또는 근육으로 투여되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 적용될 수 있으며, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성별, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 적용될 수 있으며, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성별, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 메르스 코로나바이러스 감염을 가진 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 메르스 코로나바이러스 감염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 니클로사마이드(niclosamide) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물은 이상 증상을 발현하지 않으면서 항메르스 코로나바이러스 효과를 가진다.
또한, 니클로사마이드 기존 제형의 문제점을 해결하고 유효혈중농도 및 표적 장기에서의 약물농도가 장시간 유지될 수 있도록 하여 유효한 항바이러스 활성이 나타날 수 있도록 함으로써 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료 효과가 유효하게 나타날 수 있도록 한 것이다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 비교예 1 및 실시예 1 제형의 투여 후 혈중 농도를 24 시간 동안 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1 제형 투여 후 혈중 농도를 336 시간 동안 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 G1 내지 G4 군에 따른 각 개체(도 3A) 및 군(도 3B)의 체중 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 G1 내지 G4 군에 따른 마우스 폐 조직에서의 메르스 바이러스 역가를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 니클로사마이드 지연방출 조성물의 제조
하기 표 1의 조성에 따른 니클로사마이드 제형을 제조하였다. 구체적으로, 주사용수에 카복시메틸셀룰로오스 나트륨, 인산 나트륨 일염기 일수화물 및 만니톨을 투입, 교반하여 완전히 용해시킨 후 니클로사마이드를 투입하여 교반시켰다. 이후 호모믹서(homomixer)를 이용하여 균질하게 혼화한 후, 121 ℃에서 15 분 동안 고압증기멸균하여 무균화 공정을 진행하였다. 이후 습식 밀링법을 통해 목표하는 입자도로 약물입자도를 조절하고, 필요에 따라 사후멸균하여 제조를 완료하였다.
Figure pat00001
비교예 1. 니클로사마이드 비교 제형 1
종래 니클로사마이드는 난용성으로 인하여 DMSO에 녹인 형태로 in vitro에서 효능이 측정되었으며, 이러한 기존 제형을 참고하여 비교 제형 1을 제조하였다.
구체적으로, 적량의 니클로사마이드를 칭량한 다음 총 부피(total volume)의 10 %에 해당하는 DMSO를 첨가한 다음, 총 부피의 30 %에 해당하는 PEG400를 넣었다. 이후, 총 부피의 20 %에 해당하는 0.05 N의 NaOH를 추가하여 pH를 6~7로 맞춘 다음, 음파처리(sonication)하여 완전히 용해시켰다.
최종적으로 나머지 Total volume의 40 %에 해당하는 식염수를 추가하여 니클로사마이드 2~5 mg/mL의 농도로 제조하였다.
비교예 2. 니클로사마이드 비교 제형 2
전체 부피 기준0.2 %(v/v) Tween 80 및 0.5 %(w/v) 카복시메틸셀룰로오스 나트륨(Sodium carboxymethylcellulose)가 포함되도록 정제수에 혼합하여 비히클(vehicle) 용액을 제조하였다.
이후 니클로사마이드를 칭량하여 최종 니클로사마이드 함량이 30 mg/mL이 되도록 비히클 용액에 투입한 후 볼텍싱(vortexing)하여 분산시켜 비교 제형 2를 제조하였다.
실험예 1. 기존 니클로사마이드 제형 및 본 발명 조성물의 PK 프로파일 비교 1
무게 187.5~224.0 g 범위의 웅성 SD 흰 쥐(7 주령, Orient Bio Inc., Seongnam, Korea)를 사용하였다. 흰 쥐는 실험 전 14 시간 동안 절식하였고, 투여 후 4 시간까지 절식을 유지하였다. 사육장은 12시간씩 명암을 주며 적정 온도(20~25℃)및 습도(40 ~60%)를 유지하였다
상기 동물 모델을 대상으로 하기 표 2에 따라 실시예 1 및 비교예 1의 제형을 투여하였다.
Figure pat00002
상기와 같이 약물을 투여한 후, 비교예 1 제형과 본 발명의 실시예 1 제형의 약물동태시험을 수행하였다.
구체적으로, 절식시킨 흰 쥐에 니클로사마이드 2 mg/kg의 용량으로 미정맥을 통해 정맥투여 하거나 경구용 니들을 이용하여 5 mg/kg의 용량으로 경구투여 하였다. 근육 주사의 경우 26 G 주사바늘을 사용하여 니클로사마이드로써 100 mg/kg의 용량으로 오른쪽 허벅지 근육에 주사하였다. 정맥 및 경구 투여 후 5 분(정맥 투여 군만 해당), 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간 및 24 시간, 근육 주사 후 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간, 96 시간, 168 시간, 240 시간 및 336 시간에 흰 쥐를 고정틀로 고정한 후 헤파린으로 코팅된 1 mL 주사기를 이용하여 경정맥에서 혈액 150 μL를 채혈하였다. 취해진 혈액은 5 분 간 원심분리 한 후 혈장을 분리하여 분석 전까지 -20 °C에서 냉동보관 하였다.
혈장 시료 중 니클로사마이드의 농도는 HPLC/MS/MS 시스템을 이용하여 정량 하였다. 시료의 전처리 과정은 다음과 같다. 검량선을 위한 표준시료는 니클로사마이드를 아세토니트릴(acetonitrile)로 계열희석 하여 표준물질(1, 2, 3, 10, 30, 100, 300, 1,000, 2,000, 3,000 및 5,000 ng/mL)을 조제 후, 표준물질 20 μL에 공혈장 20 μL과 내부표준액(ibuprofen 1 μg/mL in acetonitrile) 20 μL 및 acetonitrile 140 μL을 가하여 전처리 하였다. 품질관리시료는 품질관리 시료용 표준물질(5, 500, 4,500 ng/mL)을 조제 후, 검량선용 표준시료와 동일한 방법으로 전처리하였다. 혈장시료의 경우, 시료 20 μL에 내부표준액 20 μL 및 아세토니트릴 160 μL을 가하여 단백질의 침전을 유도하였다. 이후 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 이용하여 10분 간 혼합시료를 현탁하고 13,500 rpm에서 10분 간 원심분리하여 상층액 150 μL을 취해 분석용기에 옮겨 이 중 5 μL를 HPLC/MS/MS 시스템에 주입하여 분석을 진행하였다.
HPLC/MS/MS 분석 조건은 아래와 같다.
HPLC System: Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)
컬럼(Column): ZORBAX® Phenyl 5 μm, 2.1*50 mm (Agilent)
이동상(Mobile phase):
A: 10 mM 암모늄 포르메이트(Ammonium formate)
B: 아세토니트릴(Acetonitrile)
[등용매용리 (Isocratic elution)]
Figure pat00003
유량(Flow rate): 300 μL/분
온도: 컬럼 40 ℃ 및 오토샘플러 트레이(autosampler tray) 10℃
실행시간(Run time): 3 분
검출: Tandem quadrupole mass spectrometer(API 4000, QTRAP®, Applied Biosystems/MDS SCIEX, Foster City, CA, USA)
커튼가스(curtain gas): 20 psi
이온소스가스 1(ion source gas 1): 50 psi
이온소스가스 2(ion source gas 2): 50 psi
이온 분사 전압(ionspray voltage): -4200 V
온도: 600 ℃
multiple-reaction-monitoring (MRM) mode: negative
니클로사마이드 및 이부프로펜의 분자 이온은 각각 -38 V 및 -10 V의 collision energy에 의해 조각화 되었으며, collision gas는 장비에서 'medium (8 psi)'으로 설정하였다. 이온의 검출은 ESI negative MRM 모드로 진행하였고, 니클로사마이드는 m/z 324.92 → 170.90에서, 이부프로펜은 m/z 205.06 → 161.10에서 두 채널을 동시에 정량 하였다. 검출피크의 적분은 Analyst software version 1.6.2(Applied Biosystems/MDS SCIEX)을 이용하여 진행하였다.
혈장 중 니클로사마이드의 정량범위는 0.001 ~ 5.0 μg/mL이었고, 해당 분석에서 니클로사마이드는 0.80 분, 이부프로펜은 0.76 분의 피크 머무름 시간을 나타내었다.
시간에 따른 혈장 중 니클로사마이드의 농도를 상기에 기재된 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 구하고, WinNonlin® 4.2(Pharsight Corp., Cary, NC, USA) 소프트웨어의 non-compartmental analysis로 약동학적 매개변수(PK parameters)를 계산하였다. 최고농도(Cmax)와 최고농도 도달시간(Tmax)은 혈중 약물 농도 대비 시간에 따른 곡선에서 경시적으로 구하였고, 소실속도상수(Ke)는 log scale의 terminal phase에서 선형회귀분석을 통해 계산하였다. 반감기(T1/2)는 LN2를 Ke로 나누어 구하였고, 혈중 약물 농도 대 시간 곡선하면적(AUC0-∞) 및 혈중약물 모멘트 대 시간 곡선하면적(AUMC0-∞)은 선형사다리꼴법(linear trapezoidal rule)과 표준면적 외삽법(standard area extrapolation method)으로 계산하였다. 클리어런스(clearance, CL)와 분포용적(steady state volume of distribution, Vss)는 다음의 식(1~3)으로 계산하였다.
Figure pat00004
상기와 같은 방법을 이용하여 기존 니클로사마이드 제형(비교예 1)과 본 발명의 실시예 1 제형의 PK 프로파일을 비교하였다.
그 결과, 실시예 1을 투여한 경우 비교예 1을 투여한 경우에 비해 혈중 농도가 현저히 높게 유지됨을 확인하였다(도 1). 반면, 비교예 1을 정맥투여한 경우 8시간 이내 혈중 농도가 1 ng/mL 이하로 감소되었으며, 비교예 1을 경구로 투여하더라도 24시간 이후 혈중 농도가 1 ng/mL 이하로 감소되었다.
또한, 실시예 1 투여 후 장시간 혈중 농도 유지 여부를 추가로 확인하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 실시예 1 투여시 336 시간까지도 혈중 농도가 지속적으로 유지될 수 있음을 확인하였다.
또한, 하기 표 3에 나타난 바와 같이 비교예 1 정맥투여의 경우, 용해도 한계로 인해 투여용량이 제한적이고, 반감기가 1시간으로 매우 빠른 소실(Clearance)이 나타났으며, 비교예 1 경구투여의 경우 Cmax = 21ng/ml 수준으로 활성에 필요한 체내노출 달성 불가능한 것으로 나타났다.
반면, 본 발명 실시예 1의 제형의 경우 Cmax = 223 ng/ml, 9일 이상의 반감기를 나타내어 항바이러스 활성에 필요한 체내노출이 충분히 달성될 수 있음을 확인하였다.
Figure pat00005
상기와 같이 니클로사마이드를 완전히 용해시켜 경구 투여한 경우에도 극도로 낮은 생체이용율을 나타내어, 목적하는 혈중 약물농도의 달성 및 유지가 불가능함을 확인하였다. 니클로사마이드를 경구 투여시 장관 내의 미생물에 의해 강한 환원현상과 장에서 약물 자체에 대한 글루크론산화(glucuronidation)가 나타나 경구 투여시에는 약물을 과량투여하거나 완전히 용해된 형태로 투여하여도 장에서의 강력한 초회통과 효과의 발생으로 인해 목적하는 약물의 전신작용을 달성할 수 없다.
실험예 2. 기존 니클로사마이드 제형 및 본 발명 조성물의 PK 프로파일 비교 2
상기 실험예 1과 동일한 방식을 이용하여, 비교예 2의 경구투여 제형의 용량을 증가시킨 후 PK 프로파일을 비교하였다.
구체적으로, 약물의 매우 짧은 반감기를 극복하기 위해 비교예 2를 150 mg/kg 용량으로 1 일 2 회(오전, 오후, 8시간 간격) 투여하였으며, 최초 투여후 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24 시간(1 일), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30 일 및 30 일 마지막 투여 후 0.5, 1, 4, 8, 24 시간에 채혈하여 혈중농도를 측정하였다. 측정된 데이터는 실험예 1에서의 실시예 1 데이터와 비교하였다.
Figure pat00006
그 결과, 비교예 2를 150 mg/kg 용량으로 1일 2회 반복 경구투여 하였을 때, 0.5 ~ 8시간에 최고혈중농도(Cmax)에 도달하였으며 최초 투여시는 324 ± 102 ng/mL이고 마지막 투여시는 328 ± 88.0 ng/mL이었다. AUC0-8h는 1,738 ± 415 ng·h/mL 및 1,694 ± 544 ng·h/mL이었으며, 반복투여에 의한 체내노출의 축적은 나타나지 않았다(표 5).
Figure pat00007
본 발명 실시예 1의 조성물을 100 mg/kg 용량으로 단회투여한 경우의 결과는 상기 실험예 1의 표 3, 도 1 및 도 2의 결과와 같다. 특히, 단회투여만으로도 20일 이상 혈중 농도가 유지됨을 확인하였다.
상기와 같은 결과로부터 비교예 2의 경우 고용량으로 1일 2회 분할 투여하더라도 빠른 소실로 인하여 혈중농도가 유효하게 유지되지 않아 생체이용율이 낮음을 확인하였다. 또한 비교예 2는 300 mg/kg/day 용량으로 투여하였는데, 이는 사람에서 2,800 mg/day에 해당하는 고용량으로 매우 높은 빈도의 위장관 부작용이 발생되는 양이다. 이는 기존 시판되는 니클로사마이드 경구투여 제형은 상기와 같이 혈중농도를 유지하여 유효한 생체이용율을 나타냄에 어려움이 있음을 시사하는 것이다.
반면, 본 발명의 조성물은 유효한 혈중농도를 장시간 유지할 수 있도록 함으로써 니클로사마이드의 유효한 생체이용율이 나타날 수 있음을 확인하였다.
실험예 3. 메르스 코로나바이러스에 대한 효력 시험
3-1. 시험 디자인
3-1-1. 실험 동물
ad5-hDpp4 형질전환 마우스를 이용하였다. 14~16 주령의 수컷 6 마리, 암컷 4 마리를 입수하였다. 마우스 입고 후 순화기간 동안 각군의 평균 체중이 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하였다. 시험 기간 동안 온도 21~23 ℃, 상대습도 50~60 %를 유지하여 사육하였으며, 마우스 전용 사료를 자유로이 급이하였다.
3-1-2. 바이러스 감염
Mouse-adapted MERS-CoV Huh7 p2를 5 x 107 PFU/mL 농도로 준비하여, 이소플루란(isoflurane)으로 진정시킨 마우스에 비강내(intranasal) 경로로 접종하여 감염시켰다.
3-1-3. 시험군의 구성 및 투여량 설정
시험군의 구성 및 투여물질의 투여량 설정 내용은 하기 표 6에 나타난 바와 같다. G1은 대조군(비히클 투여군)이며, G2는 비교예 2의 G3는 실시예 1의 225 mg/kg용량 투여, G4는 실시예 1의 320 mg/kg 용량 투여군으로서, G3 및 G4는 비경구 투여군이다.
Figure pat00008
실시예 1투여의 경우, 바이러스 접종 24시간 전, 29 G 주사기를 이용하여, 앞, 뒤, 좌측, 우측 대퇴근(4부위)에 각각 정해진 부피를 단회 근육주사하였다.
3-2. 사망률 관찰 및 체중 측정
바이러스 감염 후 1일 마다 행동 및 사망률을 관찰하고, 감염 전 및 후 1일 마다 각 군의 개체 체중을 측정하였다. 감염 후 6일까지 진행하였다. G1의 암컷은 체중 증가 및 바이러스 미검출로 감염이 유도되지 않은 것으로 판정되면서 제외하였다.
감염 후 1일 마다 행동 및 사망률을 관찰하였으며, G2의 암컷은 감염 후 3일 째에 사망하였다. 사망한 개체는 체중 측정 결과에서 제외하였다. 니클로사마이드가 비경구 투여된 G3 및 G4의 경우에는 사망개체가 발생하지 않았다.
또한, 바이러스 감염 전 및 후 1일 마다 각 군의 각 개체 체중을 측정하였다. 체중 측정 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 G1 및 G2의 경우 바이러스 감염 전에 비해 체중이 20 % 이상 감소한 반면, G3 및 G4의 경우 체중이 감소하지 않고 유지되는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 니클로사마이드를 비경구 투여한 경우, 경구 투여에 비해 독성이 낮아 사망 개체가 나타나지 않으면서도 메르스 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 나타나면서 체중이 유지될 수 있음을 나타내는 것이다.
3-3. 폐 조직에서 바이러스 역가 측정
감염 후 6일째 이산화탄소 질식(CO2 asphyxiation)을 통해 안락사후 폐를 적출하고, 무혈청 배지(serum-free media)에 조직 균질기(tissue homogenizer)를 이용하여 조직 균질액(tissue homogenate)을 준비한 다음 8,000 g에서 10분간 원심분리하여 세포 파편(cellular debris)을 제거하였다. 준비된 조직 균질액(tissue homogenate)은 바이러스 역가 분석 전까지 -80 ℃에서 냉동 보관하였다.
바이러스 감염 후 획득한 viral stock(tissue homogenate)에 대한 바이러스 역가는 Vero 세포를 이용하여 측정하였다. 바이러스 저장물(Viral stock)의 TCID50은 stock virus를 10배씩 단계별로 희석한 샘플을 Vero 세포에 접종하고 37 ℃에서 5일간 배양한 후 세포 변성 효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. CPE 관찰을 위해, Vero 세포는 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하고 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하였다. 바이러스 역가(virus titer, TCID50/mL)는 Reed-Muench Method로 계산하였다.
MERS-CoV 감염 후 6일째에 적출한 마우스 폐 조직에서의 바이러스 역가를 Vero 세포에서 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 G1의 TCID50/mL은 7.03 x 105으로 바이러스 감염이 크게 나타났고, G2의 경우 바이러스 역가가 G1에 비해 감소된 것으로 나타났으나, 여전히 바이러스 감염이 다소 유지되고 있는 것으로 나타났다.
반면, G3 및 G4에서는 서로 다른 두 용량 모두에서 폐 조직에서의 바이러스 감염이 나타나지 않았다.
상기와 같은 결과는 니클로사마이드를 비경구 투여한 경우, 경구 투여에 비해 메르스 코로나바이러스의 억제, 감염에 대한 예방 및 치료 효과가 우수함을 나타내는 것이다. 이는 본 발명 니클로사마이드 비경구 투여 조성물의 높은 생체이용율 및 혈중 농도 유지 효과에 기인한 것으로 볼 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 니클로사마이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 지연방출 조성물을 포함하는 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 니클로사마이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체를 포함하는 것인, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 음이온계 다당류는 카복시 다당류인 것인, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체는 카복시메틸 셀룰로오스, 카복시에틸 셀룰로오스, 카복시메틸 키토산 및 카복시메틸 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 음이온계 다당류 셀룰로오스 유도체는 카복시메틸 셀룰로오스인 것인, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 인산염 및 나트륨염을 추가로 포함하는 것인, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 만니톨을 추가로 포함하는 것인, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 비경구 투여 제제인 것인, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 비경구 투여는 피하 또는 근육으로 투여되는 것인, 메르스 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 메르스 코로나바이러스 감염의 치료방법.
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Michela Mazzon et al., Viruses 2019, 11, 176; 「Identification of Broad-Spectrum Antiviral Compounds by Targeting Viral Entry」

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