TWI732025B - Ｂｃｌ-ｘＬ抑制劑和溶瘤病毒在製備抗腫瘤藥物中的應用 - Google Patents

Ｂｃｌ-ｘＬ抑制劑和溶瘤病毒在製備抗腫瘤藥物中的應用 Download PDF

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Abstract

本發明屬於生物醫藥領域，涉及Bcl-xL抑制劑和溶瘤病毒在製備抗腫瘤藥物的應用。本發明首次發現Bcl-xL抑制劑可以用於製備溶瘤病毒抗腫瘤增效劑。本發明同時涉及一種包含Bcl-xL抑制劑以及溶瘤病毒的藥物組合物，包含Bcl-xL抑制劑及溶瘤病毒的藥品套組，以及Bcl-xL抑制劑與溶瘤病毒在治療腫瘤，特別是對所述溶瘤病毒不敏感的腫瘤中的用途。

Description

Bcl-xL抑制劑和溶瘤病毒在製備抗腫瘤藥物中的應用
本發明屬於生物醫藥領域，涉及Bcl-xL抑制劑與溶瘤病毒的組合在製備抗腫瘤藥物中的應用。
溶瘤病毒(oncolytic virus)是一類靶向性感染並殺傷腫瘤細胞，而不破壞正常細胞的可複製病毒。溶瘤病毒療法(oncolytic virotherapy)是一種創新的腫瘤靶向治療策略，它利用天然的、或經基因工程改造的病毒、或兩者的組合，選擇性地感染腫瘤細胞，並在腫瘤細胞中複製，達到靶向性溶解、殺傷腫瘤細胞的作用，但是對正常細胞沒有損傷，或者只有很小的損傷。
M1病毒(Alphavirus M1)就是一種溶瘤病毒，它屬於甲病毒屬(Alphavirus)，其在製備抗腫瘤藥物方面具有潛在的應用效果。例如中國發明專利申請號：201410425510.3公開了M1病毒能選擇性引起腫瘤細胞死亡而不影響正常細胞存活。然而，不同腫瘤對M1病毒的敏感性不一，對於某些腫瘤，M1病毒單獨用藥時，溶瘤作用還不夠理想。例如中國發明專利申請號：201410425510.3所記載的(其所討論的溶瘤病毒如M1病毒以及其對不同腫瘤的作用效果/水準/方法等均透過引用的方式合併於此)，M1 作為抗腫瘤藥物使用時，對於結直腸癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌的效果不如胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤明顯；而膠質瘤、子宮頸癌、肺癌則更其次；而胃癌則最不顯著。
篩選增加溶瘤病毒腫瘤治療效果的化合物有望增加溶瘤病毒的抗瘤譜及抗瘤強度。發明人此前申請的中國發明專利申請號：201510990705.7中，將大黃酚及其衍生生物作為溶瘤病毒的抗瘤增效劑，二者組合可以將腫瘤細胞的存活率降低至39.6%。儘管如此，組合式治療(包括溶瘤病毒)仍存在很大的發展空間。本發明的目的在於提供一種溶瘤病毒抗瘤增效劑，能夠起到更好的抗癌效果。
本發明的目的之一在於提供Bcl-xL抑制劑在製備溶瘤病毒抗瘤增效劑方面的應用。
本發明的另一個目的在於提供一種抗瘤藥物組合物，其可以使得溶瘤病毒發揮更好的抗瘤效果。
本發明的另一個目的在於提供一種針對溶瘤病毒不敏感的腫瘤，安全有效的溶瘤病毒增效藥物。
本發明也提供了治療實體或血液系統(例如：血液)癌症的方法，這包括實施上述組合式治療方案。
發明人研究發現，Bcl-xL抑制劑可以增強溶瘤病毒的溶瘤效果。
所述的Bcl-xL抑制劑為抑制Bcl-xL蛋白活性的物質、或降解Bcl-xL蛋白的物質、或降低Bcl-xL蛋白水準的基因工具。
Bcl-2家族基因表現的蛋白稱為Bcl-2家族蛋白。Bcl-2家族成員是進化上相關的蛋白質。這些蛋白質控制線粒體外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)，目前已知Bcl-2家族總共由25個基因組成，其中Bax、BAD、Bak和Bok等成員可以產生促細胞凋亡作用，而Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w等產生抗細胞凋亡作用。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡路徑中一種重要的蛋白，在腫瘤的發生及轉移中起著重要的作用。由於Bcl-2、Bcl-xL和Bal-w等Bcl-2家族蛋白在癌細胞中高度表現，因此，Bcl-2家族蛋白抑制劑可以選擇性地在腫瘤細胞中發揮抗腫瘤的作用。
然而，難以預見的是，並不是所有的Bcl-2家族蛋白的抑制劑均可以起到協同增強溶瘤病毒的溶瘤效果。
正如本文所述，Bcl-xL和Bcl-w干擾片段(SiRNA)被用於抑制這兩個基因的表現，從而降低相應蛋白的表現量，結果發現，單獨干擾Bcl-xL、Bcl-w以及未干擾組並未引起細胞形態病變。同時單獨應用M1病毒也不引起細胞形態病變。但是，干擾Bcl-xL聯合應用M1病毒組引起了顯著細胞形態病變，而干擾Bcl-w聯合應用M1病毒組卻不能引起顯著細胞形態病變。此外，發明人採用單獨Bcl-2的抑制劑ABT-199聯合溶瘤病毒處理腫瘤細胞，腫瘤細胞存活率並沒有顯著性差異，說明抑制Bcl-2不能引起M1病毒溶瘤效應的增加。
因此發明人推測，只有透過抑制Bcl-xL才可以顯著增強溶瘤病毒的溶瘤效應。針對該推測，發明人採用了抑制Bcl-xL活性化合物ABT-263或ABT-737協同溶瘤病毒尤其是M1病毒作用於腫瘤細胞，實驗結果發現，ABT-263或ABT737或其組合，均可以協同溶瘤病毒增強抗腫瘤效應。
ABT-263(Navitoclax)是Bcl-2家族蛋白抑制劑中的一種，它是Bcl-xL、Bcl-2和Bcl-w蛋白的抑制劑，解離常數(Ki)分別為
Figure 106128178-A0202-12-0004-66
0.5nM，
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1nM和
Figure 106128178-A0202-12-0004-68
1nM，但與Mcl-1和A1結合微弱。
ABT-737是一種BH3模擬抑制劑，作用於Bcl-xL、Bcl-2和Bcl-w，EC50分別為78.7nM、30.3nM和197.8nM；但對Mcl-1、Bcl-B及Bfl-1沒有抑制作用。ABT-199(GDC-0199)是高效的Bcl-2選擇性抑制劑，Ki為0.01nM，比對Bcl-xL和Bcl-w的抑制性高4800倍以上，對Mcl-1無活性。
本發明則首次發現，Bcl-xL抑制劑可以作為溶瘤病毒的抗瘤增效劑。
本發明提供了Bcl-xL抑制劑在製備溶瘤病毒抗瘤增效劑方面的應用。
Bcl-xL抑制劑是一種物質(例如化合物、胺基酸序列或核苷酸序列)或是一種能夠剔除或影響Bcl-xL基因表現或降低Bcl-xL蛋白量或蛋白活性的工具。本領域的技術人員能夠修飾、替換和/或改變這些抑制 化合物、序列或基因工具。如果透過上述方式獲得的物質具有抑制Bcl-xL的作用，那麼該物質就屬於本發明所述的Bcl-xL抑制劑，並且屬於本發明中上述物質、化合物和工具的同質替換。
所述的Bcl-xL抑制劑包括但不限於(S)-醋酸棉酚((S)-Gossypol acetic acid)(式1)、變棉子酚(Apogossypol)(式2)、A-1155463(式3)、AT-101(R-(-)-醋酸棉酚(R-(-)-gossypol acetic acid))(式4)、WEHI-539及其鹽酸鹽(WEHI-539和WEHI-539鹽酸鹽(hydrochloride))(式5)、藤黄酸(Gambogic Acid)(式6)、A-1210477(式7)、ABT-263(式8)和ABT-737(式9)等抑制Bcl-xL蛋白活性的化合物。化合物的獲取方式可選但不限於：自己化學分離或合成或者從商業路徑購買。
其他一些抑制Bcl-xL蛋白活性的低分子量化合物，也可作為文中所說的Bcl-xL蛋白抑制劑，這包括BH3I(式10)、BH3I-1(式11)、TW-37(式12)、2-甲氧基-抗黴素A3(2-methoxy-antimycin A3)(式13)、BI-97C1(式14)、ABT-199(式15)、BM-1197(式16)和A-1331852(式17)。Hennessy曾在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters雜誌中描述了其他一些可用的Bcl-xL蛋白抑制劑(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2016,26：2105-2114；incorporated by reference herein in its entirety)。
在本發明優選的實施例中，Bcl-xL抑制劑為ABT-263、ABT-737或它們的組合。
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Bcl-xL抑制劑還包括針對Bcl-xL基因表現抑制工具，包括但不限於RNA干擾(RNAi)、微RNA(microRNA)以及基因編輯或基因剔除等材料。
Bcl-xL抑制劑可包括一些小的抑制核酸分子，例如短干擾RNA(siRNA)，雙鏈RNA(dsRNA)，微RNA(microRNA，miRNA)，核酶，以及小髮夾RNA(shRNA)，這些都能減弱或消除Bcl-xL蛋白的表現。
這些小的抑制核酸分子可能包括第一、第二鏈，兩者雜交彼此形成一個或多個雙鏈區，每條鏈大約18~28個核苷酸的長度，大約18~23個核苷酸的長度，或者18、19、20、21、22個核苷酸的長度。另外，單鏈也可能包含能夠相互雜交形成雙鏈的區域，例如在shRNA分子中。
這些小的抑制核酸分子在保持這種減弱或消除Bcl-xL的表現的能力時，可能包括修飾性核苷酸。修飾性核苷酸可用於改善體外或體內特性，如穩定性、活性和/或生物利用度。舉個例子，這種小的抑制性核 酸分子可以包括修飾的核苷酸，其含量為siRNA分子中核苷酸總數的百分比，如至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。這些修飾性核苷酸可能含有去氧核苷酸、2’-甲基核苷酸、2’-去氧-2’-氟核苷酸、4’-三核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸和/或2’-O-甲氧乙基核苷酸等。小的抑制核酸分子，如短干擾RNA(siRNA)，也可能含有5’-和/或3’-帽結構，以此來防止核酸外切酶對其降解。
在一些實施例中，Bcl-xL抑制劑可以是與SEQ ID Nos：1-4中核酸序列具有至少90%、至少91%、至少93%、至少94%、至少95%、至少92%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性的核酸。
在一些實施例中，小抑制核酸分子組成的雙鏈核酸含有兩端鈍、或懸垂的核苷酸。其他核苷酸可能包括會導致錯位、凸起、迴圈、或擺動鹼基對的核苷酸。小抑制核酸分子可以設計配方以便施用，例如，透過脂質體包裹，或摻入其他載體(如可生物降解聚合物水凝膠，或環糊精)。
在本發明優選的實施例中，Bcl-xL抑制劑為Bcl-xL的干擾RNA片段，或是抗Bcl-xL的抗體。在一些實施例中，Bcl-xL抑制劑是有效的，旨在針對於或者靶向於，生產或使用，或者是特異於Bcl-xL(基因庫登錄號Z23115，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)。在另外一些實施例中，Bcl-xL抑制劑是有效的，旨在針對於或者靶向於，生產或使用，或是特異於Bcl-xL(基因庫登錄號Z23115)變異體。Bcl-xL蛋白變異體可能至少 80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%與Bcl-xL蛋白的胺基酸序列一致。在一些實施例中，Bcl-xL蛋白抑制劑即為一種抗體。該抗體可能是單克隆抗體，多克隆抗體，多價抗體，多特異性抗體(例如：雙特異性抗體)，和/或連接在Bcl-xL上的抗體片段。該抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體、CDR移植抗體或人型抗體。抗體片段可以是，例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、單鏈Fv(scFv)、具二硫鍵的FV(sdFv)、或VL、VH結構域。抗體可能是一個共軛的形式，例如，結合一個標籤、一個可檢測標記，或一種細胞毒性劑。抗體可能是同型IgG(例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgM、IgE或IgD。
所述的溶瘤病毒選自甲病毒中的至少一種；優選地，甲病毒選自M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。本發明所述的甲病毒(例如M1病毒、蓋塔病毒)包括目前已有的溶瘤病毒，也包括一些可能發生了自然變異或者突變(自然突變、強制性突變，或選擇性地突變)、基因修飾、序列增加或刪除或部分替換的病毒。這裡所述的溶瘤病毒包括已經進行了上述改變的病毒。最好是上述改變並不影響所說的溶瘤病毒發揮本發明所述的作用。
例如，溶瘤病毒可以是基因資料庫登錄碼EF011023(Genbank Accession No.EF011023)的M1病毒，或者是基因序列與基因資料庫登錄碼EF011023(Genbank Accession No.EF011023)的M1病毒具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%序列同一性的病毒。
在一些實施例中，溶瘤病毒是中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的保藏編號CCTCC V201423(保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期2014年7月17日)的M1病毒。溶瘤病毒也可以是與保藏編號CCTCC V201423的M1病毒具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%序列同一性的病毒。
例如，溶瘤病毒可以是基因資料庫登錄碼EU015062(Genbank Accession No.EU015062)的蓋塔病毒，也可以是與基因資料庫登錄碼EU015062(Genbank Accession No.EU015062)的蓋塔病毒具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%，在至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%序列同一性的病毒。
本發明還提供一種用於治療腫瘤的藥物組合物，其包含一種或多種Bcl-xL抑制劑以及一種或多種溶瘤病毒。本發明還提供用於治療腫瘤的藥品套組，其包含一種或多種Bcl-xL抑制劑，以及一種或多種溶瘤病毒。藥品套組區別於組合物的地方在於，Bcl-xL抑制劑不同於溶瘤病毒的劑型，而是獨立包裝(例如：一粒藥丸、或一個膠囊、或一個藥片或一個安瓿瓶中，含有Bcl-xL抑制劑；另一粒藥丸、或一個膠囊、或一個藥片或一個安瓿瓶中，含有溶瘤病毒)。在一些實施例中，溶瘤病毒、Bcl-xL抑制 劑，以及溶瘤病毒和Bcl-xL抑制劑的組合，也可含一種或多種佐劑。所述的佐劑是指在藥物組成中，可輔助藥物療效的成分。藥品套組也可以包含獨立包裝的Bcl-xL抑制劑，以及獨立包裝的溶瘤病毒。藥物套組中Bcl-xL抑制劑，以及溶瘤病毒的施用，可以是同時施用或者是以任意的前後順序施用，例如在溶瘤病毒之前施用Bcl-xL抑制劑，或者在溶瘤病毒之後施用Bcl-xL抑制劑，或者兩者同時施用。在各種實施例中，患者可以是哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物可以是人。
所述的Bcl-xL蛋白抑制劑包括但不限於(S)-醋酸棉酚((S)-Gossypol acetic acid)(式1)、變棉子酚(Apogossypol)(式2)、A-1155463(式3)、AT-101(R-(-)-醋酸棉酚(R-(-)-gossypol acetic acid))(式4)、WEHI-539及其鹽酸鹽(WEHI-539和WEHI-539鹽酸鹽(hydrochloride))(式5)、藤黄酸(Gambogic Acid)(式6)、A-1210477(式7)、ABT-263(式8)和ABT-737(式9)等抑制Bcl-xL蛋白活性的化合物。或者針對Bcl-xL基因表現抑制工具，包括但不限於RNA干擾(RNAi)、微RNA(microRNA)以及基因編輯或剔除等工具手段。優選ABT-263、ABT-737或它們的組合。
所述的溶瘤病毒選自甲病毒中的至少一種；優選地，甲病毒選自M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。在組合物或藥品套組中，ABT-263或ABT-737與溶瘤病毒的配比可選地為：0.01~15mg：103~109PFU；優選0.01~10mg：104~109PFU；進一步優選0.01~10mg：105~109PFU。
Bcl-xL抑制劑的使用劑量最好是從0.01毫克/千克到15 mg/kg，而溶瘤病毒在施用時其滴度最好從103到109(PFU/kg)。在一些實施例中，滴度從103到104，或者104到105，或者105到106，或者106到107，或者107到108，或者108到109(PFU/kg)均可使用。在一些實施方案中，Bcl-xL抑制劑的使用劑量從0.01mg/kg至10mg/kg，而溶瘤病毒的滴度從104至109(PFU/kg)；更優選地，Bcl-xL抑制劑的使用劑量從0.1mg/kg至10mg/kg，而溶瘤病毒的滴度範圍從105至109(PFU/kg)。
優選使用劑量為：ABT-263或ABT-737使用範圍為0.01mg/kg至15mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為感染複數(MOI)從103至109(PFU/kg)；優選ABT-263或ABT-737使用範圍為0.01mg/kg至10mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從104至109(PFU/kg)；更優選ABT-263使用範圍為0.1mg/kg至10mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從105至109(PFU/kg)。
在一個實施方式中，所述溶瘤病毒選自甲病毒中的至少一種。
優選地，所述溶瘤病毒為M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。M1病毒屬於蓋塔相似病毒，據報導在已發現的相關病毒中，這兩者的同源性高達97.8%。在一個實施例中，採用的溶瘤病毒為中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的保藏編號CCTCC V201423(具體資訊如中國專利公開號：104814984A所記載)的M1病毒。
單個溶瘤病毒株也可以施用。在其他實施方案中，也可使用多種菌株和/或類型的溶瘤病毒。
在各種實施例中，Bcl-xL抑制劑和溶瘤病毒的組合可用於治療各種腫瘤。合適的腫瘤可以為實體瘤或血液瘤。在一些實施例中，上述實體瘤為肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、或胃癌；或者優選地，所述的腫瘤為對溶瘤病毒不敏感的腫瘤；更優選地，所述腫瘤為對溶瘤病毒不敏感的肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。更優選的實施方式中，所述腫瘤為對M1溶瘤病毒不敏感的腫瘤。
可以使用單個Bcl-xL抑制劑，也可以幾種抑制劑同時或者先後使用。Bcl-xL抑制劑和/或溶瘤病毒，可能是一個或多個抑制劑的組合物的形式，並且一個或多個載體、賦形劑、稀釋劑、藥學上可接受的載體、穩定劑、緩衝劑、防腐劑、表面活性劑、抗氧化劑和其他添加劑。該藥物組合物可以給予患者透過各種路徑用藥，如口服、經皮膚的、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、滴鼻、鞘內注射、全身地或局部性地。通常，Bcl-xL抑制劑採用口服、注射、靜脈注射或皮下注射方式用藥。Bcl-xL抑制劑可以與溶瘤病毒一起存在於組合物中，或者兩者可以以單獨的組合物而存在。
本公開還涉及治療腫瘤的方法。在一些實施例中，對患有腫瘤的對象給藥一種或多種Bcl-xL抑制劑以及一種或多種溶瘤病毒。腫瘤可能是實體瘤，也可能是血液腫瘤。優選的是，實體腫瘤為肝癌、結腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、腦膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌；最好，腫瘤對溶瘤病毒不敏感；更優選的是，腫瘤 為肝癌、結腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、腦膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌，這些腫瘤對溶瘤病毒不敏感。Bcl-xL抑制劑可以和溶瘤病毒同時給藥，也可以在溶瘤病毒之前或之後。此外，Bcl-xL抑制劑和/或溶瘤病毒可能是每週給藥一次或幾次(例如，每週2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。Bcl-xL的抑制劑和/或溶瘤病毒可以給藥一個或幾個星期(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，一個月，甚至幾個月(2、3、4、5、6、7、8，9、10、11、12或更多)。
在一些實施方案中，Bcl-xL的抑制劑(如ABT-263、ABT-737或它們的組合)可以是注射劑、片劑、膠囊、貼劑、或者試劑盒等的形式。在一些實施例中，Bcl-xL的抑制劑可能是試劑盒的一部分。在一些實施例中，Bcl-xL的抑制劑和溶瘤病毒的組合可以注射用藥，最好是靜脈注射。
本發明顯示：Bcl-xL抑制劑(例如ABT-263和ABT-737)可以增加溶瘤病毒的抗腫瘤效應，以提高溶瘤病毒作為抗腫瘤藥物時的治療有效性。細胞學實驗證明M1病毒和Bcl-xL抑制劑(例如ABT-263、ABT-737)聯合應用，可顯著引起腫瘤細胞的形態學病變，從而顯著增強對腫瘤細胞的抑制作用。
一些實施例將Bcl-xL抑制劑(ABT-263或ABT-737)與M1病毒一起作用於人肝細胞癌Hep3B株。出人意料地，其結果發現抗病毒化合物ABT-263或ABT-737和M1病毒聯合應用時，顯著增加腫瘤細胞形態病變，顯著降低腫瘤細胞存活率。例如在本發明的一個實施例中，當M1病毒(MOI=0.001)單獨處理肝癌細胞時(無Bcl-xL抑制劑參與)，腫瘤細 胞存活率為81.5%，而當以100nM的ABT-263或ABT-737與同樣MOI的M1病毒聯用時，腫瘤細胞存活率大幅下降至25.2%。與單用M1病毒的抗腫瘤效果相比，Bcl-xL抑制劑(如ABT-263)與M1聯用時，其溶瘤效果顯著提升。
發明人此前的專利(中國專利申請號：CN 201510990705.7)中，大黃酚及其衍生物可作為M1病毒的抗癌增效劑，50μM的大黃酚與M1病毒(MOI=0.001)聯合使用能使腫瘤細胞的存活率下降至39.6%，而本發明顯示Bcl-xL抑制劑與溶瘤病毒聯合使用能顯著降低腫瘤細胞的存活率。例如，100nM的ABT-263與M1病毒聯用後，腫瘤細胞的存活率顯著下降至25.2%。與大黃酚及其衍生物相比，本發明的M1抗腫瘤增效劑顯著提高了腫瘤的殺傷率。另外，Bcl-xL抑制劑(如ABT-263)在藥物有效劑量上僅為大黃酚的千分之二，並且作為抗腫瘤增效劑作用快速，其用時為大黃酚的三分之二(大黃酚處理72小時，ABT-263處理48小時)。
據報導，Bcl-2家族抑制劑如ABT-263、ABT-737、ABT-199可透過抑制腫瘤細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w發揮抗腫瘤效應。然而，正如本文所述，並非所有的Bcl-2家族抑制劑均能協同增強溶瘤病毒的溶瘤效果。意想不到地是Bcl-xL抑制劑可以協同增強溶瘤病毒的抗腫瘤效應，而Bcl-2或Bcl-w的抑制劑則不能協同增強溶瘤病毒的抗腫瘤效應。
如本文所述，Bcl-xL抑制劑(例如：ABT-263或ABT-737)與溶瘤病毒聯合應用可處理腫瘤細胞，對腫瘤細胞殺傷作用顯著優於單用相同濃度的Bcl-xL抑制劑(例如：ABT-263或ABT-737)。例如當以100nM 的ABT-263處理腫瘤細胞時，腫瘤細胞存活率仍高達88.8%，當以100nM的ABT-263與M1病毒聯用時，腫瘤細胞存活率大幅下降至25.2%。可見，ABT-263與M1聯用作用時能大幅提升溶瘤效果，這得益於ABT-263與M1病毒之間的協同性機制，並非簡單地透過ABT-263的抗腫瘤機制發揮作用。
圖1 為ABT-263與M1病毒顯著增加人肝細胞癌株形態學病變。
圖2 為ABT-263/ABT-737與M1病毒聯合處理顯著降低人肝細胞癌株存活率。
圖3 為Bcl-xL蛋白抑制劑在協同溶瘤病毒抗腫瘤的機制研究。
圖4 為ABT-263與M1病毒聯合處理顯著抑制人肝細胞癌株移植瘤生長。
圖示說明：
ABT-263：ABT-263處理組；ABT-737：ABT-737處理組；M1+ABT-263：M1病毒與ABT-263聯用處理組；M1+ABT-737：M1病毒與ABT-737聯用處理組。
以下實施方式是對本發明作進一步說明，但本發明的實施方 式不局限於以下的實施例介紹，凡依照本發明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應視為本發明保護的範疇。
在沒有特別指明的情況下，本發明採用的材料及實驗方法為常規材料及方法。
除非另外定義，本文所使用的所有技術術語和科學術語具有與本專利技術所屬普通技術人員通常理解的含義相同的含義。除非本文另行明確規定，文中指示物前冠詞包括多個指示物的情況。同樣，“或”一詞意在包括“和”，除非文中另有明確說明。還應理解，本文提供的核酸或多肽的資訊，例如鹼基對大小、胺基酸大小、分子量或分子品質，均為近似值，且僅供於描述。“大概”、“約”、“大約”、“左右”等詞，本領域常規技術人員可以根據記載的內容及參數等，理解為對所述物件/數值的修改，如有需要進一步的解釋以助於理解，可以理解為例如5%範圍的變化。儘管與本文描述相似或相同的方法或材料也可用於實踐或檢驗本發明公開的內容，但在下文中描述了適當的方法和材料。文中“包括”意即“包含、含有”；“例如”在本文中表示一個非限制性的例子。文中記載的序列同一性百分比，可理解為，某DNA、RNA或蛋白中，其核酸或胺基酸殘基與所述的參考序列中所一致的百分比。
如有衝突，本說明書(包括對術語的解釋)將予以控制。此外，本文所有的材料、方法和實例均為說明性的而非限制性的。
實施例1 ABT-263與M1病毒顯著增加人肝細胞癌株形態學病變
材料：
人肝細胞癌Hep3B，M1病毒，高糖DMEM培養基，倒置相差顯微鏡。
方法：
(a)細胞的培養：人肝細胞癌Hep3B生長在含10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青黴素及0.1mg/ml鏈黴素的DMEM完全培養基中；所有細胞株均置於5% CO2，37℃的恒溫密閉式孵箱(相對濕度95%)內培養傳代，倒置顯微鏡觀察生長情況。大約2~3天傳代一次，取處於對數生長期的細胞用於正式實驗。
(b)細胞處理和形態學觀察：選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液(含10%胎牛血清、1%雙抗)製成細胞懸液，細胞以2.5×104/孔的密度接種在24孔培養盤內。用ABT-263(100nM)單獨處理、M1病毒(MOI=0.001)感染細胞、M1病毒(MOI=0.001)聯合ABT-263(100nM)處理細胞，以不加M1病毒和ABT-263為對照，48小時後在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態學的變化。
結果：
如圖1所示，相差顯微鏡下觀察細胞形態，Hep3B細胞是單層貼壁生長，並且細胞緊密排列，表型一致。而ABT-263(100nM)與M1病毒(MOI=0.001)處理48小時後，細胞的形態發生了明顯改變。與對照組、M1單獨處理組、ABT-263單獨處理組相比，聯合處理組活體細胞 數目明顯減少，活體細胞的形態隨細胞體的變化而顯著變化，胞體收縮成球狀，折光率明顯增強，呈死亡病變樣。
實施例2 ABT-263或ABT-737與M1病毒聯合處理顯著降低人癌細胞株存活率
材料：
人肝細胞癌Hep3B，人膀胱細胞癌T24，人結直腸細胞癌LoVo，M1病毒(如實施例1中所描述)，高糖DMEM培養基，自動酵素免疫分析儀。
方法：
(a)接種細胞、給藥處理：選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液(含10%胎牛血清、1%雙抗)製成細胞懸液，以每孔4×103/孔的密度接種在96孔培養盤內。12小時後見細胞完全貼壁，實驗分對照組、單獨ABT-263組、M1感染組和ABT-263/M1聯用組或者ABT-737/M1聯用組。所用劑量為：M1病毒感染細胞；M1病毒設不同的劑量梯度。
(b)MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽或甲基噻唑基四唑)與細胞內的琥珀酸脫氫酶反應：培養至48小時，每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，繼續孵育4小時，此時鏡檢可觀察到、活細胞內形成的顆粒狀藍紫色甲臢結晶。
(c)溶解細胞中形成的甲臢顆粒：小心吸去上清液，加DMSO 100μl/孔溶解形成的結晶，在微型振盪器上震盪5分鐘，然後在酵 素免疫分析儀上用波長570nm檢測各孔的光密度(OD值)。每組實驗重複3次。細胞存活率=(藥物處理組的OD值/對照組的OD值)×100%。
結果：
如圖2a所示，M1病毒單獨處理對腫瘤細胞Hep3B具有相對較小的存活率抑制作用(腫瘤細胞存活率達到81.5%)，100nM的ABT-263處理組腫瘤細胞存活率仍高達88.8%，然而，當低至100nM的ABT-263與同樣MOI的M1病毒聯用(ABT-263+M1)時，腫瘤細胞存活率大幅下降至25.2%。同樣。與M1病毒單獨處理組或單獨的ABT-263處理組相比，各劑量組ABT-263/M1聯合處理後的腫瘤細胞存活率均顯著下降。類似的結果同樣能在ABT-737/M1聯合應用於Hep3B中觀察到(圖2b)，另外Bcl-xL抑制劑ABT-737與M1聯用也顯著降低腫瘤細胞T24(圖2c和2d)以及LoVo(圖2e和2f)的存活率。
然而，與M1病毒單獨處理組或單獨的Bcl-2選擇性抑制劑ABT-199處理組相比，各劑量組ABT-199/M1聯合處理後的腫瘤細胞存活率並沒有顯著性差異，說明抑制Bcl-2不能引起M1病毒溶瘤效應的增加(圖2g和2h)。
實施例3 抑制Bcl-xL協同M1溶瘤病毒抗腫瘤效應
材料：
M1病毒，人肝癌細胞Hep3B，膀胱癌細胞T24，Bcl-xL和Bcl-w RNA干擾片段，MTT(甲基偶氮唑藍)，相差顯微鏡。
Bcl-xL干擾片段(SiRNA)：
正義股(SEQ ID NO：1)
5’-GGAUACAGCUGGAGUCAGUdTdT-3’
反義股(SEQ ID NO：2)
5’-ACUGACUCCAGCUGUAUCCdTdT-3’；
Bcl-w干擾片段(SiRNA)：
正義股(SEQ ID NO：3)
5’-CAGCUGUAUUCCAUUACAUdTdT-3’
反義股(SEQ ID NO：4)
5’-AUCUAAUGGAAUACAGCUGdTdT-3’
方法：
選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液調製成細胞懸液，細胞以1×105的密度接種在6孔盤內。24小時後，加入脂質體包裹的SiRNA目標基因片段24小時後，感染M1病毒。感染48小時後，處理樣本。
(1)相差顯微鏡觀察細胞形態學病變。
(2)收集蛋白質樣本，進行西方墨點法(Western blot)檢測干擾效率以及M1病毒蛋白E1、NS3。
(3)MTT法計算細胞存活率。
結果：
在分別干擾Bcl-xL和Bcl-w之後，西方墨點法(Western blot)檢測發現Bcl-xL和Bcl-w(圖3b)基因表現顯著下降。單獨干擾Bcl-xL或Bcl-w和未干擾(CTL)或亂碼干擾組(NC)相比，並未引起細胞形態病變，同時單獨應用M1病毒也不引起細胞形態病變。然而，干擾Bcl-xL與M1病毒聯合應用(siBcl-xL+M1)可引起顯著細胞形態病變。另一方面，干擾Bcl-w與M1病毒聯合應用(siBcl-w+M1)卻不能引起顯著細胞形態病變(圖3a)；MTT檢測(ANOVA統計，***表示p<0.001)表明(圖3c)：在這些被檢測的Bcl-2家族成員中，只有干擾Bcl-xL聯合應用M1病毒組引起了人肝癌細胞Hep3B以及膀胱癌細胞T24存活率的顯著下降。
以上表明透過抑制Bcl-xL可以顯著增強M1的溶瘤效應，然而抑制Bcl-w並不能協同增強M1的溶瘤效應。
實施例4 ABT-263與M1病毒聯合應用顯著抑制人肝細胞癌株移植瘤生長。
材料：
M1病毒(如實施例1中所描述)、肝癌細胞株Hep3B、結直腸癌細胞株LoVo、4周齡雌性BALB/c裸鼠。
方法：
本實驗採用隨機的、單盲的設計。將5×106 Hep 3B或者LoVo 細胞注入到4周齡BALB/c裸鼠背側皮下。
當腫瘤大小達到50mm3時分組，包括不處理的對照組、單獨應用ABT-263組(腹腔注射10mg/kg/d)、單獨應用M1感染組(尾靜脈注射M1病毒2×106PFU/次)和ABT-263/M1聯用組(相同方式給予相同劑量的ABT-263和M1病毒)，連續注射3次(3次注射分別在第6、7、8天進行)。每兩天測量腫瘤的長寬和體重，腫瘤的體積依據公式(長×寬2)/2。測量腫瘤體積後進行單因子變異數分析(One way ANOVA)統計，***表示p<0.001，**表示p<0.01。
結果：
在兩種腫瘤細胞移植瘤動物體內，病理解剖測定腫瘤體積表明，和對照組比較，單獨應用ABT-263組和單獨M1感染組只能引起腫瘤體積輕微的縮小，而ABT-263/M1聯用組能引起腫瘤體積顯著地縮小(圖4b和4d)，並且單因子變異數分析(One way ANOVA)統計表明具有統計學差異(圖4a和4c)。這種協同性的作用在對單獨用藥敏感性低的腫瘤中被放大得尤其明顯，腫瘤體積的減小幅度驚人(圖4a)。
本發明所記載的實施方式僅為闡釋性例子，本發明的實施方式並不受上述的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等同的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
<110> 廣州威溶特醫藥科技有限公司
<120> Bcl-xL抑制劑和溶瘤病毒在製備抗腫瘤藥物中的應用
<130> 2920-WHD-TW
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 1
Figure 106128178-A0202-12-0029-2
<210> 2
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<223> 合成的寡核苷酸
<400> 4
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Claims (52)

  1. 一種Bcl-xL抑制劑用於製備溶瘤病毒抗腫瘤增效劑的用途，其中該溶瘤病毒為M1病毒。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該M1病毒是與中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的保藏號為CCTCC V201423的M1病毒的序列具有至少97.8%序列同一性的M1病毒。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該M1病毒是中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCC V201423的M1病毒。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該Bcl-xL抑制劑為抑制Bcl-xL蛋白活性的物質、降解Bcl-xL蛋白的物質、或降低Bcl-xL蛋白水準的基因工具。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中該抑制Bcl-xL蛋白活性的物質為化合物。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的用途，其中該化合物係選自(S)-醋酸棉酚((S)-Gossypol acetic acid)、變棉子酚(Apogossypol)、A-1155463、AT-101、WEHI-539、WEHI-539鹽酸鹽(hydrochloride)、藤黄酸(Gambogic Acid)、A-1210477、ABT-263和ABT-737中的一種或幾種。
  7. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中該降低Bcl-xL蛋白水準的基因工具為RNA干擾、微RNA(microRNA)、基因編輯或基因剔除材料。
  8. 如申請專利範圍第1、2、3、4、5、6或7項所述的用途，其中該Bcl-xL抑制劑為ABT-263或ABT-737或它們的組合。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該腫瘤為實體瘤或血液瘤。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的用途，其中該實體瘤為肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的用途，其中該腫瘤對溶瘤病毒不敏感。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的用途，其中該腫瘤為對溶瘤病毒不敏感的肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  13. 一種藥物組合物，其包含：(a)至少一種Bcl-xL抑制劑；以及(b)至少一種溶瘤病毒，其中該溶瘤病毒為M1病毒。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該至少一種Bcl-xL抑制劑為抑制Bcl-xL蛋白活性的物質、降解Bcl-xL蛋白的物質、或降低Bcl-xL蛋白水準的基因工具。
  15. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該至少一種Bcl-xL抑制劑為低分子量化合物。
  16. 如申請專利範圍第14項所述的藥物組合物，其中該抑制Bcl-xL蛋白活性的物質為化合物。
  17. 如申請專利範圍第16項所述的藥物組合物，其中該化合物係選自(S)-醋酸棉酚((S)-Gossypol acetic acid)、變棉子酚(Apogossypol)、A-1155463、AT-101、WEHI-539、WEHI-539鹽酸鹽(hydrochloride)、藤黄酸(Gambogic Acid)、A-1210477、ABT-263和ABT-737中的一種或幾種。
  18. 如申請專利範圍第14項所述的藥物組合物，其中該降低Bcl-xL蛋白水準 的基因工具為RNA干擾、微RNA(microRNA)、基因編輯或基因剃除材料。
  19. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該Bcl-xL抑制劑為ABT-263或ABT-737或它們的組合。
  20. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該M1病毒是與中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的保藏號為CCTCC V201423的M1病毒的序列具有至少97.8%序列同一性的M1病毒。
  21. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該M1病毒是中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCC V201423的M1病毒。
  22. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其是用於治療腫瘤的藥物組合物。
  23. 如申請專利範圍第22項所述的藥物組合物，其中該腫瘤為實體瘤或血液瘤。
  24. 如申請專利範圍第23項所述的藥物組合物，其中該實體瘤為肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  25. 如申請專利範圍第24項所述的藥物組合物，其中該腫瘤對溶瘤病毒不敏感。
  26. 如申請專利範圍第25項所述的藥物組合物，其中該腫瘤為對溶瘤病毒不敏感的肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質 瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  27. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該Bcl-xL抑制劑與該溶瘤病毒的配比為0.01~15mg：103~109PFU。
  28. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該Bcl-xL抑制劑與該溶瘤病毒的配比為0.01~10mg：104~109PFU。
  29. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該Bcl-xL抑制劑與該溶瘤病毒的配比為0.01~10mg：105~109PFU。
  30. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該Bcl-xL抑制劑的使用劑量範圍為0.01mg/kg至15mg/kg，且該溶瘤病毒給藥的滴度範圍從103至109(PFU/kg)。
  31. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該Bcl-xL抑制劑的使用劑量範圍為0.01mg/kg至10mg/kg，且該溶瘤病毒給藥的滴度範圍從104至109(PFU/kg)。
  32. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該Bcl-xL抑制劑的使用劑量範圍為0.1mg/kg至10mg/kg，且該溶瘤病毒給藥的滴度範圍從105至109(PFU/kg)。
  33. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該藥物組合物另包含一藥學上可接受的載體。
  34. 如申請專利範圍第13項所述的藥物組合物，其中該藥物組合物的劑型為凍乾粉、注射劑、片劑、膠囊或貼劑。
  35. 一種藥品套組，其包含一藥物有效成分，其中該藥物有效成分包含申請專利範圍第13至32項中任一項所述之藥物組合物。
  36. 如申請專利範圍第35項中所述的藥品套組，其特徵在於所述的Bcl-xL抑制劑與溶瘤病毒獨立存在。
  37. 一種Bcl-xL抑制劑及溶瘤病毒的組合用於製備治療腫瘤藥物的用途，其中該溶瘤病毒為M1病毒。
  38. 如申請專利範圍第37項所述的用途，其中該M1病毒是與中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的保藏號為CCTCC V201423的M1病毒的序列具有至少97.8%序列同一性的M1病毒。
  39. 如申請專利範圍第37項所述的用途，其中該M1病毒是中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCC V201423的M1病毒。
  40. 如申請專利範圍第37項中所述的用途，其中該Bcl-xL抑制劑為抑制Bcl-xL蛋白活性的物質、降解Bcl-xL蛋白的物質、或降低Bcl-xL蛋白水準的基因工具。
  41. 如申請專利範圍第40項中所述的用途，其中該抑制Bcl-xL蛋白活性的物質為化合物。
  42. 如申請專利範圍第41項中所述的用途，其中該化合物係選自(S)-醋酸棉酚((S)-Gossypol acetic acid)、變棉子酚(Apogossypol)、A-1155463、AT-101、WEHI-539、WEHI-539鹽酸鹽(hydrochloride)、藤黄酸(Gambogic Acid)、A-1210477、ABT-263和ABT-737中的一種或幾種。
  43. 如申請專利範圍第40項中所述的用途，其中該Bcl-xL蛋白水準的基因工具為RNA干擾、微RNA(microRNA)、基因編輯或基因剔除材料。
  44. 如申請專利範圍第37項中所述的用途，其中該Bcl-xL抑制劑是一種短干擾RNA(siRNA)、小髮夾RNA(shRNA)或抗體。
  45. 如申請專利範圍第37項所述的用途，其中該Bcl-xL抑制劑為ABT-263或ABT-737或它們的組合。
  46. 如申請專利範圍第37項所述的用途，其中該腫瘤為實體瘤或血液瘤。
  47. 如申請專利範圍第46項所述的用途，其中該實體瘤為肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  48. 如申請專利範圍第47項所述的用途，其中該腫瘤對溶瘤病毒不敏感。
  49. 如申請專利範圍第48項所述的用途，其中該腫瘤為對溶瘤病毒不敏感的肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  50. 一種抗腫瘤治療系統，其包括至少一種Bcl-xL的檢測試劑或檢測系統，和至少一種溶瘤病毒，其中該溶瘤病毒為M1病毒。
  51. 如申請專利範圍第50項中所述的抗腫瘤治療系統，其中該腫瘤為實體瘤或者血液瘤。
  52. 如申請專利範圍第51項中所述的抗腫瘤治療系統，其中該實體瘤為肝 癌，結直腸癌，膀胱癌，乳腺癌，子宮頸癌，前列腺癌，神經膠質瘤，黑色素瘤，胰腺癌，鼻咽癌，肺癌或胃癌。
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