TWI707695B - Ｉａｐ抑制劑和溶瘤病毒在製備抗腫瘤藥物中的應用 - Google Patents

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Abstract

本發明屬於生物醫藥領域，涉及Caspase活化劑與溶瘤病毒的聯用在製備抗腫瘤藥物中的應用。本發明首次發現Caspase活化劑可以增加溶瘤病毒的抗腫瘤效應，兩者聯用起到極強的協同性作用，對用藥敏感性不高的腫瘤治療來說提供了一個有效的治療方案。

Description

IAP抑制劑和溶瘤病毒在製備抗腫瘤藥物中的應用
本發明屬於生物醫藥領域，涉及Caspase(凋亡蛋白酶(半胱胺醯天冬胺酸特異性蛋白酶))活化劑與溶瘤病毒的聯用在製備抗腫瘤藥物中的應用。
溶瘤病毒(oncolytic virus)是一類靶向性感染並殺傷腫瘤細胞，而不破壞正常細胞的可複製病毒。溶瘤病毒療法(oncolytic virotherapy)是一種創新的腫瘤靶向治療策略，它利用天然的或經基因工程改造的病毒選擇性的感染腫瘤細胞，並在腫瘤細胞中複製，達到靶向性溶解、殺傷腫瘤細胞的作用，但是對正常細胞無害。
M1病毒(Alphavirus M1)屬於甲病毒屬(Alphavirus)，其在製備抗腫瘤藥物方面具有潛在的應用效果。例如中國發明專利申請201410425510.3公開了M1病毒能選擇性引起腫瘤細胞死亡而不影響正常細胞存活，其在抗腫瘤方面具有非常好的應用前景。然而，不同腫瘤對M1病毒的敏感性不一，對於某些腫瘤，M1病毒單獨用藥時，溶瘤作用還不夠理想。例如中國發明專利申請201410425510.3所記載的(其所討論的溶瘤病毒如M1病毒以及其對不同腫瘤的作用效果/水準/方法等均通過引用的方式合併於此)，M1作為抗腫瘤藥物使用時，對於結直腸癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌的效果不如胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤明顯；而膠質瘤、子 宮頸癌、肺癌則更其次；而胃癌則最不顯著。
發明人此前申請的專利201510990705.7中，將大黃酚及其衍生生物作為M1病毒的抗瘤增效劑，二者組合可以將腫瘤細胞的存活率降低至39.6%，但其抗癌強度存在很大的進步空間。本發明的目的在於提供一種M1抗瘤增效劑，能夠起到更好的抗癌效果。
本發明的目的之一在於提供Caspase活化劑在製備溶瘤病毒抗瘤增效劑方面的應用。
本發明的另一個目的在於提供一種抗瘤藥物組合物，其可以使得-溶瘤病毒發揮更好的抗瘤效果。
本發明的另一個目的在於提供一種針對溶瘤病毒不敏感的腫瘤，安全有效的溶瘤病毒增效藥物。
發明通過以下技術方案實現上述目的。
發明人發現Caspase活化劑與甲病毒聯用作為抗癌療法，在抗癌效果上獲得令人驚歎的效果。
活化的Caspase引起細胞凋亡的作用是已知的。Caspase家族蛋白酶具有三大亞族，Caspase-1、4、5、11屬於第一亞族；Caspase-2、9屬於第二亞族；Caspase-3、、7、8、10屬於第三亞族。起始Caspase在外來蛋白信號的作用下被切割啟動，啟動的Caspase對執行者Caspase進行切割並使之啟動，被啟動的執行者Caspase進而通過對Caspase靶蛋白的水解，導致程式性細胞死亡。
在溶瘤病毒與Caspase聯合治療的方案中，溶瘤病毒與 Caspase的相互作用機制尚未非常明確。但可以發現的是，在一些聯合方案中，溶瘤病毒和Caspase活化劑並不能起到協同性的促凋亡機制。
本發明首次提供了Caspase活化劑在製備溶瘤病毒抗腫瘤增效劑方面的應用；所述的溶瘤病毒選自至少一種甲病毒；優選地，所述的甲病毒選自M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。M1病毒屬於蓋塔相似病毒，據報導在已發現的相關病毒中，這兩者的同源性高達97.8%(Wen JS,Zhao WZ,Liu JW,Zhou H,Tao JP,Yan HJ,Liang Y,Zhou JJ,Jiang LF,Genomic analysis of a Chinese isolate of Getah-like virus and its phylogenetic relationship with other Alphaviruses.Virus Genes.2007；35(3)：597-603)。可以預期兩者將具有較為相似的性質。
在一個實施例中，採用的溶瘤病毒為保藏編號CCTCC V201423(具體資訊如中國專利104814984A所記載)的M1病毒。
優選地，所述的Caspase活化劑為Caspase-3、7、8和9的活化劑中的至少一種；Casepase活化劑是一種能提高至少一種所述Caspase表達水準、或提高其蛋白活性的物件。在一些實施例中，Caspase活化劑是有效於、或者針對於、生產或適用於、或特異於：NCBI gene ID 836的Caspase3、或NCBI Gene ID：840的Caspase7、或NCBI Gene ID：841的Caspase8、或NCBI Gene ID：842的Casepase9。在一些實施例中，Caspase活化劑是有效於、或者針對於、生產或適用於、或特異於NCBI gene ID 836的Caspase 3、或NCBI Gene ID：840的Caspase 7、或NCBI Gene ID：841的Caspase8、或NCBI Gene ID：842的Casepase9的變異體。所述的變異體可以是與上述的任一種Casepase的氨基酸序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%， 至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性的蛋白。
更優選地，所述的Caspase活化劑為Caspase抑制解除劑；更優選地，所述的Caspase活化劑為IAP抑制劑；更優選地，所述的IAP抑制劑選自cIAP-1、cIAP-2和XIAP中的至少一種。
作為可選的方案，所述的IAP抑制劑選為抑制IAP蛋白活性的物質、或降解IAP蛋白的物質、或降低IAP蛋白水準的基因工具； 優選地，所述的抑制IAP蛋白活性的物質或降解IAP蛋白的物質選自蛋白或化合物； 更優選地，所述的抑制IAP蛋白活性的物質或降解IAP蛋白的物質選自Smac蛋白或Smac類似化合物； 或者更優選地，所述的抑制IAP蛋白活性的物質或降解IAP蛋白的物質選自Smac類似化合物為LCL161、Birinapant中的至少一種； 或者更優選地，所述的降低IAP蛋白水準的基因工具為RNA干擾、microRNA、基因編輯或基因敲除材料。
IAP抑制劑可包括一些小的抑制核酸分子，例如短干擾RNA(siRNA)，雙鏈RNA(dsRNA)，microRNA(miRNA)，核酶，以及小髮夾RNA(shRNA)，這些都能減弱或消除IAP蛋白的表達。
這些小的抑制核酸分子可能包括第一、第二鏈，二者雜交彼此形成一個或多個雙鏈區，每條鏈大約18~28個核苷酸的長度，大約18~23個核苷酸的長度，或者18，19，20，21，22個核苷酸的長度。另外，單鏈也可能包含能夠相互雜交形成雙鏈的區域，例如在shRNA分子中。
這些小的抑制核酸分子在保持這種減弱或消除IAP的表達的能力時，可能包括修飾性核苷酸。修飾性核苷酸可用於改善體外或體內特性，如穩定性、活性和/或生物利用度。舉個例子，這種小的抑制性核酸分子可以包括修飾的核苷酸，其含量為siRNA分子中核苷酸總數的百分比，如至少約5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%或100%。這些修飾性核苷酸可能含有去氧核苷酸、2’-甲基核苷酸、2’-去氧-2’-氟核苷酸、4’-三核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸和/或2’-O-甲氧乙基核苷酸等。小的抑制核酸分子，如短干擾RNA(siRNA)，也可能含有5’-和/或3’-帽結構，以此來防止核酸外切酶對其降解。
在一些實施例中，IAP抑制劑可以是與SEQ ID Nos1-12中核酸序列具有至少90%，至少91%，至少93%，至少94%，至少95%，至少92%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性的核酸。
在一些實施例中，小抑制核酸分子組成的雙鏈核酸含有兩端鈍、或懸垂的核苷酸。其他核苷酸可能包括會導致錯位、凸起、迴圈、或擺動堿基對的核苷酸。小抑制核酸分子可以設計配方以便施用，例如，通過脂質體包裹，或摻入其他載體(如可生物降解聚合物水凝膠，或環糊精)。
在本發明優選的實施例中，IAP抑制劑為IAP的干擾RNA片段，或是抗IAP的抗體。在一些實施例中，IAP抑制劑是有效的，旨在針對于或者靶向於，生產或使用，或者是特異於NCBI Gene ID：329的cIAP-1、或者NCBI Gene ID：330的cIAP-2、或者NCBI Gene ID：331的XIAP。在另外一些實施例中，IAP抑制劑是有效的，旨在針對于或者靶向於，生產或使用， 或是特異於NCBI Gene ID：329的cIAP-1、或者NCBI Gene ID：330的cIAP-2、或者NCBI Gene ID：331的XIAP的變異體。IAP蛋白變異體可以是與上述任一IAP的氨基酸序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性的蛋白。在一些實施例中，IAP蛋白抑制劑即為一種抗體。該抗體可能是單克隆抗體，多克隆抗體，多價抗體，多特異性抗體(例如：雙特異性抗體)，和/或連接在IAP上的抗體片段。該抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體、CDR移植抗體或人型抗體。抗體片段可以是，例如，Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，Fd，單鏈Fv(scFv)，具二硫鍵的FV(sdFv)，或VL、VH結構域。抗體可能是一個共軛的形式，例如，結合一個標籤、一個可檢測標記，或一種細胞毒性劑。抗體可能是同型IgG(例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgM、IgE或IgD。
同時，發明也提供了含有上述Caspase活化劑和溶瘤病毒的藥物組合物；或者藥品套裝，在所述的藥品套裝中IAP抑制劑和溶瘤病毒被分開包裝。
藥物組合物還可以包含藥學上可接受的載體；所述載體優選地選自凍乾粉針、注射劑、片劑、膠囊、試劑盒或貼劑。
作為抗腫瘤療法，所述的腫瘤可以為實體瘤或血液瘤；優選地，所述的實體瘤為肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌；或者優選地，所述的腫瘤為對所述溶瘤病毒不敏感的腫瘤；更優選地，所述腫瘤為對溶瘤病毒不敏感的肝癌、結直腸 癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
在實施治療性的方案中，蛋白類或基因工具類的Caspase活化劑，或化合物類的活化劑均是可選的。
Smac蛋白的全稱為second mitochondria-derived activator of caspase，其存在於粒線體，在凋亡發生時其從粒線體轉運至細胞漿並調控凋亡相關通路。同時，Smac(包括其類似物)能使腫瘤細胞對TNF-α，TRAIL等細胞因數敏感，從而增強旁細胞效應。Smac主要通過抑制IAP家族蛋白水準和功能發揮作用。目前一共有8種IAP蛋白，其中cIAP-1,cIAP-2和XIAP研究得最為透徹，IAP通過抑制Caspase的啟動發揮抑制凋亡的功能。IAP蛋白在多種腫瘤中高表達並且與腫瘤發展和預後不良相關，因此利用Smac(包括Smac類似化合物)抑制IAP能選擇性在腫瘤中發揮抗腫瘤作用。
目前，已有人嘗試將Smac類似化合物與其他的化療藥物聯合治療胰腺癌。如Dineen等利用JP1021(Smac類似物)與吉西他汀聯合使用可明顯減少細胞的增殖。在其實驗中，未加藥的細胞早期凋亡率為17%，單獨應用JP1021(10μmol/L)和單獨應用吉西他汀(10μmol/L)的凋亡率分別為31%和58%，而二者聯合作用的早期凋亡率僅比單獨使用吉西他汀稍有提升，二者聯合並未顯示出協同作用。
許多組合物的治療效果是難以預期的。例如，一些藥物之間相互作用降低治療效果或引起不期望的副作用，一些藥物組合物之間以單個藥物組合證明他們的治療效力，而一些藥物組合物在治療指數上大於單個藥物組合，具有協同作用。
本發明則首次發現，Caspase活化劑例如是IAP抑制劑和溶瘤病毒具有協同作用，可以作為溶瘤病毒的抗瘤增效劑。
發明人通過用cIAP1和cIAP2干擾片段(Si RNA)抑制這兩個基因的表達，降低相應蛋白的表達量，結果發現，單獨干擾cIAP1和cIAP2和未干擾並未引起細胞形態病變，同時單獨應用M1病毒也不引起細胞形態病變，干擾cIAP1或cIAP2聯合應用M1病毒則細胞的存活率顯著的下降。因此推測抑制cIAP1和cIAP2可以顯著增強溶瘤病毒的抗腫瘤效應。
在一些實施例中，發明人將IAP抑制劑-Smac類似物LCL161和Birinapant與溶瘤病毒聯用，結果發現，二者均可以協同增加溶瘤病毒的抗腫瘤效應。
其他有抑制IAP活性的因為能作為IAP抑制劑的物質還有，例如，AT406(SM-406)，BV-6,SM-12d,GDC-0152,GDC-0197,SM-164,HGS 1029,LBW-242,WO2014060767,WO2014060768,WO2014060770,WO2014026882,JP1400,JP1201,JP1584,LBW242等。這些可用的IAP抑制劑可以參見Rama Rathore(Apoptosis,2017,22：898-919)，通過引用的方式合併於此)。
作為示例性的方案，化合物類的活化劑LCL161或Birinapant與溶瘤病毒的應用示例為：化合物與溶瘤病毒的配比為：0.01~15mg：103~109PFU；優選0.01~10mg：104~109PFU；進一步優選0.01~10mg：105~109PFU；進一步優選地，使用劑量為：LCL161或Birinapant使用範圍為0.01mg/kg至15mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從103至109 (PFU/kg)；優選LCL161或Birinapant使用範圍為0.01mg/kg至10mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從104至109(PFU/kg)；更優選LCL161使用範圍為0.1mg/kg至10mg/kg，同時溶瘤病毒使用滴度為MOI從105至109(PFU/kg)。
化合物的獲取方式可選但不限於：自己化學分離或合成或者從商業途徑購買。
作為示例性的方案，Caspase活化劑也可以為cIAP1和cIAP2的干擾RNA片段。
本發明所說的溶瘤病毒(例如M1病毒、蓋塔病毒等甲病毒)可以尤其地指目前已有的溶瘤病毒，但也不排除一些可能發生的自然變異或者進行了突變(自然突變、強制性突變、或選擇性突變)、基因修飾、序列增加或刪除或部分替換的病毒。這裡所述的溶瘤病毒包括已經進行了上述改變的病毒。最好是上述改變並不影響所說的溶瘤病毒發揮本發明所述的作用。所說的IAP抑制劑為能起到敲低或影響IAP基因表達或者降低IAP蛋白量或蛋白活性的物質或工具(例如化合物、或氨基酸序列、核苷酸序列等)，本領域技術人員可以對這些化合物、氨基酸序列或者基因工具進行修飾、替換、改變等，但只要起到上述抑制IAP的作用的，則屬於本發明的IAP抑制劑，屬於上述化合物、氨基酸序列、工具等的同質替換。
例如，溶瘤病毒可以是Genbank Accession No.EF011023的M1病毒，或者是基因序列與Genbank Accession No.EF011023的M1病毒具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性的病毒。
在一些實施例中，溶瘤病毒是保藏編號CCTCC V201423(保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期2014年7月17日)的M1病毒。溶瘤病毒也可以是與保藏編號CCTCC V201423的M1病毒具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性的病毒。
例如，溶瘤病毒可以是Genbank Accession No.EU015062的蓋塔病毒，也可以是與Genbank Accession No.EU015062的蓋塔病毒具有至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，在至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性的病毒。
單個溶瘤病毒株也可以施用。在其他實施方案中，也可使用多種菌株和/或類型的溶瘤病毒。
本發明還提供藥物組合物或藥品套裝。藥品套裝區別於組合物的地方在於，IAP抑制劑不同於溶瘤病毒的劑型，而是獨立包裝(例如：藥丸、或膠囊、或藥片或安剖瓶中，含有IAP抑制劑；另外的藥丸、或膠囊、或藥片或安剖瓶中，含有溶瘤病毒)。在一些實施例中，溶瘤病毒、IAP抑制劑，以及溶瘤病毒和IAP抑制劑的組合，也可含一種或多種佐劑。所述的佐劑是指在藥物組成中，可輔助藥物療效的成分。藥品套裝也可以包含獨立包裝的IAP抑制劑，以及獨立包裝的溶瘤病毒。藥物套裝中IAP抑制劑，以及溶瘤病毒的施用，可以是同時施用或者是以任意的前後順序施用，例如在溶瘤病毒之前施用IAP抑制劑，或者在溶瘤病毒之後施用IAP抑制劑，或者兩者同時施用。在各種實施例中，患者可以是哺乳動物。在一些實施 例中，哺乳動物可以是人。
本發明發現Caspase活化劑，例如LCL161和Birinapant可以增加溶瘤病毒的抗腫瘤效應，以提高溶瘤病毒作為抗腫瘤藥物時的治療有效性。細胞學實驗證明M1病毒分別和LCL161、Birinapant聯合應用，可顯著引起腫瘤細胞的形態學病變，從而顯著增強對腫瘤細胞的抑制作用。
發明人聯合LCL161或Birinapant與M1病毒作用於人結直腸癌HCT116細胞株，出人意料的發現抗病毒化合物LCL161和M1病毒聯合應用，顯著增加腫瘤細胞形態病變，顯著降低腫瘤細胞生存率。例如在本發明的一個實施例中，當M1病毒(MOI=10)單獨處理結直腸癌HCT116細胞時，腫瘤細胞存活率為84%，而當以5μM的LCL161與同樣MOI的M1病毒聯用時，腫瘤細胞存活率大幅下降至33.6%。與單用M1病毒的抗腫瘤效果相比，LCL161與M1聯用時，溶瘤效果顯著提升。
發明人此前的專利(中國專利CN 201510990705.7)中，以大黃酚及其衍生物作為M1病毒的抗癌增效劑，經試驗發現，50uM的大黃酚與(MOI=0.001)M1病毒聯用後，能明顯殺傷肝癌細胞株Hep3B。而本研究將5μM LCL161與M1聯用後，能明顯殺傷結直腸癌細胞株HCT116，相比於Hep3B(0.001MOI處理後細胞存活率為85.1%)細胞，HCT116對M1細胞更為不敏感(10MOI處理後細胞存活率為84.0%)，與大黃酚相比，本發明的M1抗腫瘤增效劑能顯著提高不敏感腫瘤的殺傷力，同時，LCL161的藥物劑量僅為大黃酚的十分之一，具備顯著地優越性。
儘管LCL161本身已被報導可通過抑制腫瘤細胞內凋亡抑制蛋白cIAP1,cIAP2發揮抗腫瘤效應，然而，本發明發現，LCL161與溶瘤病 毒聯合應用處理腫瘤細胞，對腫瘤細胞殺傷作用顯著優於單用相同濃度的LCL161，例如當同樣例如以5μM的LCL161處理腫瘤細胞時，腫瘤細胞存活率仍高達92.6%，當以5μM的LCL161與M1病毒聯用時，腫瘤細胞存活率大幅下降至33.6%。可見，LCL161與M1聯用時大幅提升的溶瘤效果，是得益於LCL161與M1病毒之間的協同性機制，並非簡單地通過LCL161的抗腫瘤機制發揮作用。
本發明的重要意義還在於，對於一些對用藥敏感性較弱的腫瘤，本發明所提供的特定的聯用方案為該類腫瘤的治療提供了可靠而有效的方案。
LCL161‧‧‧LCL161處理組
Birinapant‧‧‧Birinapant處理組
M1+LCL161‧‧‧M1病毒與LCL161聯用處理組
M1+Birinapant‧‧‧M1病毒與Birinapant聯用處理組
M‧‧‧單用M1病毒組
M+L‧‧‧M1病毒與LCL161聯用處理組
圖1 LCL161與M1病毒顯著增加人結直腸癌細胞株形態學病變；圖2 LCL161/Birinapant與M1病毒聯合處理顯著降低人結直腸癌細胞株和人肝細胞癌株生存率；圖3 LCL161在協同溶瘤病毒抗腫瘤的機理研究；圖4 LCL161與M1病毒聯合處理顯著抑制人肝細胞癌株和人結直腸癌株移植瘤生長。
圖5 LCL161與M1病毒聯合應用顯著上調人結直腸細胞癌株和肝細胞癌株Caspase-3/7、8和9活性
以下實施方式是對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式不局限於以下的實施例介紹，凡依照本發明的原理或理念所作的等同的 變化或變通都應視為本發明保護的範疇。
在沒有特別指明的情況下，本發明採用的材料及實驗方法為常規材料及方法。
除非另外定義，本文所使用的所有技術術語和科學術語具有與本專利技術所屬普通技術人員通常理解的含義相同的含義。除非本文另行明確規定，文中指示物前冠詞包括多個指示物的情況。同樣，“或”一詞意在包括“和”，除非文中另有明確說明。還應理解，本文提供的核酸或多肽的資訊，例如堿基對大小、氨基酸大小、分子量或分子品質，均為近似值，且僅供於描述。“大概”“約”“大約”“左右”等詞，本領域常規技術人員可以根據記載的內容及參數等，理解為對所述物件/數值的修改，如有需要進一步的解釋以助於理解，可以理解為例如5%範圍的變化。儘管與本文描述相似或相同的方法或材料也可用於實踐或檢驗本發明公開的內容，但在下文中描述了適當的方法和材料。文中“包括”意即“包含、含有”；“例如”在本文中表示一個非限制性的例子。文中記載的序列同一性百分比，可理解為，某DNA、RNA或蛋白中，其核酸或氨基酸殘基與所述的參考序列中所一致的百分比。
如有衝突，本說明書(包括對術語的解釋)將予以控制。此外，本文所有的材料、方法和實例均為說明性的而非限制性的。
實施例1 LCL161與M1病毒顯著增加人結直腸細胞癌株形態學病變
材料：
人結直腸細胞癌HCT116(購於ATCC)，M1病毒(CCTCC V201423)，高糖DMEM培養基(購於Corning)，倒置相差顯微鏡。
方法：
a)細胞的培養：人結直腸細胞癌HCT116生長在含10%FBS、100U/ml青黴素及0.1mg/ml鏈黴素的DMEM完全培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium)中；所有細胞株均置於5% CO2,37℃恒溫密閉式孵箱(相對濕度95%)內培養傳代，倒置顯微鏡觀察生長情況。大約2~3天傳代一次，取處於對數生長期的細胞用於正式實驗。
b)細胞處理和形態學觀察：選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液(含10%胎牛血清、1%青鏈黴素雙抗溶液(Life Technologies))製成細胞懸液，細胞以2.5×104/孔的密度接種在24孔培養板內。用LCL161(5μM)單獨處理、M1病毒(MOI=0.01)感染細胞、M1病毒(MOI=0.01)聯合LCL161(5μM)處理細胞，以不加M1病毒和LCL161為對照，72小時後在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態學的變化。
結果：
如圖1所示，相差顯微鏡下觀察細胞形態，HCT116細胞是單層貼壁生長，並且細胞緊密排列，表型一致。而LCL161(5μM)與M1病毒(MOI=1)處理72h後，細胞的形態發生了明顯改變，較對照組細胞，與M1單獨處理組與LCL161單獨處理組比較，聯合處理組細胞數目明顯減少，胞體收縮成球狀，折光率明顯增強，呈死亡病變樣。
實施例2 LCL161/Birinapant與M1病毒聯合處理顯著降低人結直腸細胞癌株和人肝細胞癌株生存率；
材料：
人結直腸細胞癌HCT116，SW480，人肝細胞癌Huh7,PLC，M1病毒，高糖DMEM培養基，自動酶聯檢測酶標儀。
細胞、病毒來源如同實施例1。
方法：
接種細胞、給藥處理：選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液(含10%胎牛血清、1%青鏈黴素雙抗溶液(Life Technologies))製成細胞懸液，以每孔4×103/孔的密度接種在96孔培養板內。12小時後見細胞完全貼壁，實驗分對照組，單獨藥物組(單獨使用5μM LCL161或Birinapant)，M1感染組和LCL161/M1或Birinapant/M1聯用組。所用劑量為：M1病毒感染細胞，設置不同的MOI劑量梯度；LCL161和Birinapant濃度為5μM。
MTT與細胞內的琥珀酸脫氫酶反應：培養至72h時，每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，繼續孵育4小時，此時鏡檢可觀察到、活細胞內形成的顆粒狀藍紫色甲臢結晶。
溶解甲臢顆粒：小心吸去上清，加DMSO 100μl/孔溶解形成的結晶，在微型振盪器上震盪5min，然後在酶聯檢測儀上用波長570nm檢測各孔的光密度(OD值)。每組實驗重複3次。細胞存活率=藥物處理組OD值/對照組OD值×100%。
結果：
如圖2a所示，M1病毒單獨處理對腫瘤細胞HCT116具有較小的生存率抑制作用(腫瘤細胞存活率達到84.0%),5μM的LCL161處理腫瘤細胞存活率仍高達92.6%。然而，當M1與LCL161聯用時(M1+LCL161)， 腫瘤細胞存活率顯著下降，低至33.6%。同樣，與M1病毒單獨處理組或單獨的LCL161處理組相比，各劑量組LCL161/M1聯合處理後的腫瘤細胞存活率均顯著下降。類似的結果Birinapant/M1聯合應用在HCT116中同樣觀察到(圖2b)。另外，LCL161或Birinapant與M1聯用也顯著降低腫瘤細胞SW620(圖2c和d)、Huh7細胞(圖2e和f)以及PLC細胞(圖2g和h)的存活率。
實施例3 抑制cIAP1和cIAP2協同M1溶瘤病毒抗腫瘤效應
材料：
M1病毒，人結直腸癌細胞HCT116，肝癌細胞Huh7，cIAP1和cIAP2的RNA干擾片段，MTT(甲基偶氮唑藍)購於MPbio，相差顯微鏡。
細胞、病毒來源如同實施例1。
cIAP1干擾片段(Si RNA)：
干擾片段1：
正義鏈(SEQ ID NO.1)5’-GUGAGUUCUUGAUACGAAUdTdT-3’
反義鏈(SEQ ID NO.2)5’-AUUCGUAUCAAGAACUCACdTdT-3’
干擾片段2：
正義鏈(SEQ ID NO.3)5’-GAAUACGUCUCCAAUGAGAdTdT-3’
反義鏈(SEQ ID NO.4)5’-UCUCAUUGGAGACGUAUUCdTdT-3’
干擾片段3：
正義鏈(SEQ ID NO.5)5’-GCAAGUGCUGGAUUCUAUUdTdT-3’
反義鏈(SEQ ID NO.6)5’-AAUAGAAUCCAGCACUUGCdTdT-3’
cIAP2干擾片段(Si RNA)：
干擾片段1：
正義鏈(SEQ ID NO.7)5’-GAUUGUGCUCCUUCUUUAAdTdT-3’
反義鏈(SEQ ID NO.8)5’-UUAAAGAAGGAGCACAAUCdTdT-3’
干擾片段2：
正義鏈(SEQ ID NO.9)5’-GAUAUUUCCGUGGCUCUUAdTdT-3’
反義鏈(SEQ ID NO.10)5’-UAAGAGCCACGGAAAUAUCdTdT-3’
干擾片段3：
正義鏈(SEQ ID NO.11)5’-GAUUGUGCUCCUUCUUUAAdTdT-3’
反義鏈(SEQ ID NO.12)5’-UUAAAGAAGGAGCACAAUCdTdT-3’
方法：
選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液調製成細胞懸液，細胞以1×105的密度接種在6孔板內。24小時後，加入脂質體包裹的Si RNA目標基因片段48時後，感染M1病毒。感染48小時後，處理樣本。
收集蛋白質樣本，進行Western blot檢測干擾效率。
MTT法計算細胞存活率；
結果：
在用不同的干擾片段分別干擾cIAP1和cIAP2之後，Western blot檢測發現針對每一種IAP蛋白，至少兩條siRNA片段能引起cIAP1和cIAP2(圖3a和3b)蛋白表達顯著下降，證明干擾片段能從蛋白水準干擾cIAP1和cIAP2蛋白的表達。
圖3 c-d中，control表示對照組，即不含任何處理組，mock表示單用轉染試劑組(RNAiMAX)，NC表示亂序siRNA干擾組，後三列則表示採用siRNA片段進行干擾表達的細胞。
MTT實驗資料表明，單獨干擾cIAP1和cIAP2和未干擾(control組)或亂碼干擾組(NC)相比並未引起細胞存活率的改變，同時單獨應用M1病毒也不引起細胞存活率改變，干擾cIAP1或cIAP2和M1聯用能顯著降低腫瘤細胞的存活率(圖3c和3d)。將資料進行ANOVA統計，*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001，顯示細胞存活率的降低具有統計學意義。
以上結果說明cIAP1和cIAP2的抑制與M1聯合作用，發揮抗腫瘤效應。
實施例4 LCL161與M1病毒聯合應用顯著抑制人結直腸細 胞癌株和肝細胞癌株移植瘤生長。
材料：
M1病毒、結直腸癌細胞株HCT116、肝細胞癌株Huh7、4周齡雌性BALB/c裸鼠(Model animal research center of Nanjing University).。
細胞、病毒來源如同實施例1。
方法：
本實驗採用隨機的、單盲的設計。將5×106HCT116或者1×107Huh7細胞注入到4周齡BALB/c裸鼠背側皮下。
當腫瘤大小達到50mm3時分組，包括不處理的對照組(Control)、單獨應用LCL161組(腹腔注射20mg/kg/d)、單獨應用M1感染組(HCT116癌株移植瘤尾靜脈注射M1病毒2×106PFU/次、Huh7癌株移植瘤尾靜脈注射M1病毒5×105PFU/次)和LCL161/M1聯用組(相同方式給予相同劑量的LCL161和M1病毒)，連續注射4次(對HCT116癌株移植組，於第5、6、7、8天注射；對Huh7癌株移植組，於第10、11、12、13天注射)。每兩天測量腫瘤的長寬和體重，腫瘤的體積依據公式(長×寬2)/2。測量腫瘤體積後進行One way ANOVA統計，***表示p<0.001,**表示p<0.01、*表示p<0.05。
結果：
在兩種腫瘤細胞移植瘤動物體內，病理解剖測定腫瘤體積表明，和對照組比較，單獨應用LCL161組和單獨M1感染組只能引起腫瘤體積輕微的縮小。
對於HCT116腫瘤，LCL161組與對照組相比腫瘤體積僅減少 了29.15%，M1組與對照組相比腫瘤體積僅減少了27.93%，而LCL161/M1聯用組能引起腫瘤體積顯著地縮小(圖4)，與對照組相比腫瘤體積減少了80.42%。
對於Huh7腫瘤，LCL161組與對照組相比腫瘤體積僅減少了18.1%，M1組與對照組相比腫瘤體積僅減少了4.7%，而LCL161/M1聯用組能引起腫瘤體積顯著地縮小(圖4)，與對照組相比腫瘤體積減少了70.3%。One way ANOVA統計表明具有統計學差異。
實施例5 LCL161與M1病毒聯合應用顯著上調人結直腸細胞癌株和肝細胞癌株Caspase-3/7、8和9活性。
材料：
M1病毒、LCL161、Caspase3/7/8/9活性檢測試劑盒、DMEM完全培養液(含10%胎牛血清、1%青鏈黴素雙抗溶液(Life Technologies))、結直腸癌細胞株HCT116、肝細胞癌株Huh7、自動酶聯檢測酶標儀
方法：
選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液(含10%胎牛血清、1%青鏈黴素雙抗溶液(Life Technologies))調製成細胞懸液，細胞以4×103的密度接種在96孔板內。12小時後見細胞完全貼壁，實驗分對照組，單獨藥物組(單獨使用LCL161)，M1感染組和LCL161/M1聯用組。所用劑量為：M1劑量為1MOI(HCT116細胞)或0.1MOI(Huh7細胞)，LCL161濃度為5μM。同時設置4組重複上述處理組，用於檢測MTT以及Caspase3/7、8和9的活性。處理72小時候，每孔按體積分別加入Caspase3/7、8和9檢測液，置於孵箱繼續培養半小時，將液體吸入不透光96孔板，用酶標儀檢測化學發 光強度。同時檢測MTT，計算細胞存活率。將化學發光值比上MTT值對Caspase活性進行標化。
結果：
Caspase3/7、8和9活性檢測結果表明，在HCT116細胞和Huh7細胞中，相比於對照組(Ctrl)，單用LCL161或M1(M)組只能輕微引起Caspase3/7、8和9活性的上調，但在LCL161與M1聯用組(LM)觀察到顯著的Caspase3/7、8和9活性上調(圖5a-e)，表明Caspase活性劑LCL161和M1聯用能顯著啟動Caspase3/7、8和9活性。
本發明所記載的實施方式僅為闡釋性例子，本發明的實施方式並不受上述的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等同的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
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Figure 106128177-A0101-12-0024-9
LCL161‧‧‧LCL161處理組
M1‧‧‧單用M1病毒組
LCL161+M1‧‧‧M1病毒與LCL161聯用處理組

Claims (10)

  1. 一種IAP抑制劑用於製備抗腫瘤藥物的用途，其中，該藥物為溶瘤病毒抗腫瘤增效劑，所述的溶瘤病毒選自M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。
  2. 如請求項1所述的用途，其特徵在於，所述的IAP選自cIAP-1、cIAP-2和XIAP中的至少一種。
  3. 如請求項1所述的用途，其特徵在於，所述的IAP抑制劑選自Smac蛋白或Smac類似化合物。
  4. 如請求項1所述的用途，其特徵在於，所述的IAP抑制劑選自Smac類似化合物LCL161、Birinapant中的至少一種。
  5. 如請求項1所述的用途，其特徵在於，所述的IAP抑制劑為RNA干擾、microRNA、基因編輯或基因敲除材料。
  6. 一種治療腫瘤的藥物組合物，包含：(a)IAP抑制劑；以及(b)溶瘤病毒，所述溶瘤病毒選自甲病毒M1病毒和蓋塔病毒中的至少一種。
  7. 如請求項1-5任一項中所述的用途，其特徵在於，所述的腫瘤為實體瘤或血液瘤。
  8. 如請求項7所述的用途，其特徵在於，所述的實體瘤為肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  9. 如請求項1-5任一項中所述的用途，其特徵在於，所述的腫瘤為對所述溶瘤病毒不敏感的腫瘤。
  10. 如請求項1-5任一項中所述的用途，其特徵在於，所述的溶瘤病毒是保 藏號為CCTCC V201423的M1病毒。
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