TWI722357B - 極光激酶抑制劑和α病毒用於製備抗腫瘤藥物之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明屬於生物醫藥領域，涉及極光激酶抑制劑和α病毒用於製備抗腫瘤藥物之用途。本發明首次發現極光激酶抑制劑可以用於製備α病毒抗腫瘤增效劑。本發明同時涉及一種包含極光激酶抑制劑以及α病毒的藥物組合物，包含極光激酶抑制劑及α病毒的藥品套組，以及極光激酶抑制劑與α病毒在治療腫瘤，特別是對所述α病毒不敏感的腫瘤中的用途。

Description

極光激酶抑制劑和α病毒用於製備抗腫瘤藥物之用途
本發明屬於一種用於製備抗腫瘤藥物中之用途，具體涉及極光激酶抑制劑與α病毒的組合用於製備抗腫瘤藥物中之用途。
溶瘤病毒(oncolytic virus)是一類選擇性的感染並殺傷腫瘤細胞，而不損傷正常細胞的可複製病毒。溶瘤病毒療法(oncolytic virotherapy)是一種創新的腫瘤靶向治療策略，它利用天然的或經基因工程改造的病毒選擇性的感染腫瘤細胞，並在腫瘤細胞中複製，達到靶向性溶解、殺傷腫瘤細胞的作用，但是對正常細胞沒有損傷。
M1病毒(Alphavirus M1)屬於α病毒屬(Alphavirus)，其用於製備抗腫瘤藥物方面具有較好的應用效果。例如中國大陸發明專利申請號：201410425510.3之專利公開了M1病毒能選擇性引起腫瘤細胞死亡而不影響正常細胞存活，其在抗腫瘤方面具有非常好的應用前景。然而，不同腫瘤對M1病毒的敏感性不一，對於某些腫瘤，M1病毒單獨用藥時，溶瘤作用還不夠理想。例如中國大陸發明專利申請號：201410425510.3之專利所記載的，M1作為抗腫瘤藥物使用時，對於結直腸癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌的效果不如胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤明顯；而膠質瘤、子宮頸癌、肺癌則更其次；而胃癌則最不顯著。
篩選增加溶瘤病毒腫瘤治療效果的化合物有望增加溶瘤病毒的抗瘤譜及抗瘤強度。發明人此前申請的中國大陸發明專利申請號：201510990705.7之專利中，將大黃酚及其衍生生物作為溶瘤病毒的抗瘤增效劑，二者組合可以將腫瘤細胞的存活率降低至39.6%，但其抗癌強度存在很大的進步空間，此外，這種聯合應用的作用機制尚不明確。
研究特定溶瘤病毒的增效途徑並不簡單。儘管已有眾多已被報道的對某些溶瘤病毒具有抗腫瘤增效作用的物質。但是，不同屬的溶瘤病毒往往在增效機制上表現各異。簡單的挪用難以獲得理想的效果。例如，作為被證實能協同增效溶瘤棒狀病毒的HDAC抑制劑(Nguye,T.L.,et al.,Chemical targeting of the innate antiviral response by histone deacetylase inhibitors renders refractory cancers sensitive to viral oncolysis.Proceedings of the national academy of sciences,2008.105(39)：p.14981-14986.；Shulak,L.,et al.,Histone Deacetylase Inhibitors Potentiate Vesicular Stomatitis Virus Oncolysis in Prostate Cancer Cells by Modulating NF-kB-Dependent Autophagy.Journal of Virology,2014.88(5)：p.2927-2940.；Bridle,B.W.,et al.,HDAC Inhibition Suppresses Primary Immune Responses,Enhances Secondary Immune Responses,and Abrogates Autoimmunity During Tumor Immunotherapy.Molecular therapy,2013.21(4)：p.887-894.)，發明人卻發現，其被用於與α病毒聯用後，卻沒有獲得類似的增效效果。這也是溶瘤病毒增效劑開發難度大的其中一個原因。
極光激酶(Aurora kinases)是絲胺酸/蘇胺酸激酶，其功能是作用在有絲分裂和細胞分裂中的多方面的調節劑。有三種相關的哺乳動物極光激酶，分別是極光激酶-A(Aurora A)、極光激酶-B(Aurora B)和極光 激酶-C(Aurora C)。這些激酶在許多癌症中過度表現，目前這些激酶已經被人發現作為癌症治療的新靶點。
其中，極光激酶-A(Aurora A)是一個重要的有絲分裂調節因子。分別先後定位於中心體和紡錘體極，參與G2/M轉換的調節，在早期有絲分裂事件中作用於中心體的成熟與分離及紡錘體的組裝等。極光激酶-A的過度表現是極光激酶-A誘導腫瘤發生的必要特徵。
其中，極光激酶-B(Aurora B)是負責調控細胞有絲分裂的一類重要的絲胺酸/蘇胺酸激酶。近年來，隨著Aurora B相關研究的不斷深入，人們逐漸認識到Aurora B在細胞有絲分裂以及腫瘤形成中的重要作用。在細胞有絲分裂中，Aurora B參與了諸如中心體成熟分離、紡錘體組裝和維持、染色體分離以及胞質分裂等多個事件。異常表現的Aurora B往往會導致細胞在有絲分裂的過程中出現大量的異常現象。此外，Aurora B還可能參與了腫瘤形成，已經發現一些靶向作用於極光的小分子具有顯著的抑癌作用。
其中，極光激酶-C(Aurora C)是染色體過客蛋白(chromosome passenger protein)，它在有絲分裂早期與染色體集合，後期則轉移到紡錘體中間區，最後在胞質分裂期定位於中間體。
CN 106535940A中報導了極光激酶抑制劑能夠增效溶瘤病毒單純皰疹病毒HSV1716。
本發明的目的在於提供一種α病毒抗腫瘤增效劑。
本發明的另一個目的在於提供能夠選擇性的增強α病毒對腫瘤細胞的殺傷作用，而不影響正常細胞的抗癌增效劑。
本發明的另一個目的在於提供一種極光激酶抑制劑用於製備α病毒抗瘤增效劑方面之用途。
本發明的另一個目的在於提供一種抗瘤藥物組合物，其可以使得α病毒發揮更好的抗瘤效果。
本發明的進一步目的在於提供一種針對α病毒不敏感的腫瘤，安全有效的α病毒增效藥物。
發明透過以下技術方案實現上述目的：
發明人透過研究、篩選發現，極光激酶抑制劑可以增強α病毒的溶瘤效果。
所述的極光激酶抑制劑為抑制極光激酶活性的物質、或降解極光激酶的物質、或降低極光激酶水平的基因工具、或它們的組合。
發明人透過抑制極光激酶可以顯著增強α病毒的溶瘤效應。發明人採用了抑制極光激酶活性的化合物巴拉替布(Barasertib)協同α病毒作用於腫瘤細胞，實驗結果發現，巴拉替布(Barasertib）可以協同及α病毒增強抗腫瘤效應。
本發明首次發現，極光激酶抑制劑可以作為α病毒的抗瘤 增效劑/耐藥逆轉劑。
本發明提供了極光激酶抑制劑用於製備α病毒抗瘤增效劑/耐藥逆轉劑方面之用途。
耐藥逆轉劑是指，當採用一些α病毒作為抗腫瘤藥物用於治療腫瘤時，存在著一些腫瘤對α病毒並不太敏感，或者說這些腫瘤對α病毒具有抗性，此時，可以採用與極光激酶代謝途徑抑制劑(作為耐藥逆轉劑)聯用α病毒的方式，以逆轉腫瘤對所述α病毒的抗性。
所述的極光激酶抑制劑包括但不限於選自以下化合物或其具有極光激酶抑制作用的衍生物、或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、互變異構物、同分異構物：巴拉替布(Barasertib)、禾比瑞丁(Hesperadin)或CCT137690等抑制極光激酶蛋白活性的化合物。化合物的獲取方式可選但不限於：自己化學分離或合成或者從商業途徑購買。
在本發明一優選的實施例中，極光激酶蛋白抑制劑為巴拉替布(Barasertib)，其結構式如式1所示：
Figure 107147878-A0101-12-0005-1
在本發明另一優選的實施例中，極光激酶蛋白抑制劑為禾比瑞丁(Hesperadin)，其結構式如式2所示：
Figure 107147878-A0101-12-0006-2
在本發明另一優選的實施例中，極光激酶蛋白抑制劑為CCT137690，其結構式如式3所示：
Figure 107147878-A0101-12-0006-3
在本發明一些優選的實施例中，極光激酶抑制劑還包括針對極光激酶基因表現抑制工具，包括但不限於基因干擾、基因沉默、以及基因編輯或基因剔除等工具手段。
作為一種可選的實施方式，所述極光激酶基因表現抑制工具選自DNA、RNA、PNA、DNA-RNA-雜合體中的一種或幾種。它們可以是單鏈的或雙鏈的。
極光激酶抑制劑可包括一些小的抑制核酸分子，例如短干擾RNA(siRNA)，雙鏈RNA(dsRNA)，微小RNA(miRNA)，核酶，以及小髮夾RNA(shRNA)，這些都能減弱或消除極光激酶蛋白的表現。
這些小的抑制核酸分子可能包括第一、第二鏈，二者雜交彼此形成一個或多個雙鏈區，每條鏈大約18~28個核苷酸的長度，大約18~23個核苷酸的長度，或者18、19、20、21、22個核苷酸的長度。另外，單鏈也可能包含能夠相互雜交形成雙鏈的區域，例如在shRNA分子中。
這些小的抑制核酸分子在保持這種減弱或消除極光激酶蛋白的表現的能力時，可能包括修飾性核苷酸。修飾性核苷酸可用於改善體外或體內特性，如穩定性、活性及/或生物利用度。這些修飾性核苷酸可能含有脫氧核苷酸、2’-甲基核苷酸、2’-脫氧-2’-氟核苷酸、4’-三核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸及/或2’-O-甲氧乙基核苷酸等。小的抑制核酸分子，如短干擾RNA(siRNA)，也可能含有5’-及/或3’-帽結構，以此來防止核酸外切酶對其降解。
在一些實施例中，小抑制核酸分子組成的雙鏈核酸含有兩端鈍、或懸垂的核苷酸。其他核苷酸可能包括會導致錯位、凸起、循環、或擺動鹼基對的核苷酸。小抑制核酸分子可以設計配方以便施用，例如，透過脂質體包裹，或摻入其他載體(如可生物降解聚合物水凝膠，或環糊精)。
在本發明另一些優選的實施例中，所述的極光激酶抑制劑還包括抗體、抗體功能性片段、肽類、和擬肽類中的一種或幾種。其中，所述的抗體可能是單克隆抗體，多克隆抗體，多價抗體，多特異性抗體(例如：雙特異性抗體)，及/或連接在極光激酶上的抗體片段。該抗體可以是嵌合抗體、人類化抗體、CDR移植抗體或人型抗體。抗體片段可以是，例如，Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，Fd，單鏈Fv(scFv)，具二硫鍵的FV(sdFv)，或VL、VH結構域。抗體可能是一個共軛的形式，例如，結合一個標簽、一個可檢測標記，或一種細胞毒性劑。抗體可能是同型IgG(例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgM、IgE或IgD。
所述的α病毒選自M1病毒及/或給塔病毒(Getah virus)中的一種或多種。
本發明所說的α病毒(M1病毒、給塔病毒)可以尤其地指目前已有的病毒，但也不排除一些可能發生的自然變異或者進行了突變(自然突變、強制性突變、或選擇性突變)、基因修飾、序列增加或刪除或部分替換的病毒。這裡所述的α病毒包括已經進行了上述改變的病毒。最好是上述改變並不影響所說的α病毒發揮本發明所述的作用。所說的極光激酶抑制劑為能起到敲低或影響極光激酶基因表現或者降低極光激酶蛋白量或蛋白活性的物質(例如化合物、或胺基酸序列、核苷酸序列等)或工具等。本領域技術人員可以對其抑制化合物或者基因工具進行修飾、替換、改變等，但只要起到上述抑制極光激酶作用的，則屬於本發明的極光激酶抑制劑，屬於上述物質、化合物或工具等的同質替換。
在一些實施例中，α病毒是保藏編號CCTCC V201423(保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期2014年7月17日)的M1病毒。作為很可能來源於同一毒株的病毒，Genbank Accession No.EF011023記錄了一株M1的序列。給塔病毒作為與M1病毒具有高達97.8%(Wen et al.Virus Genes.2007；35(3)：597-603)同源性的病毒，兩者具有很高的同一性，M1病毒也被一些文獻歸類為類給塔病毒(Getah-like virus)。可以預期二者具有相似的功效。
單個α病毒株也可以施用。在其他實施方案中，也可使用多種菌株及/或類型的α病毒。
本發明還提供一種用於治療腫瘤的藥物組合物，其包含極光激酶抑制劑以及α病毒。本發明還提供用於治療腫瘤的藥品套組，其包含極光激酶抑制劑或其衍生物或它們的組合，以及α病毒。藥品套組區別於組合物的地方在於，極光激酶抑制劑不同於α病毒的劑型，而是獨立包裝(例如：藥丸、或膠囊、或藥片或安瓿瓶中，含有極光激酶抑制劑；另外的藥丸、或膠囊、或藥片或安瓿瓶中，含有α病毒)。在一些實施例中，α病毒、極光激酶抑制劑，以及α病毒和極光激酶抑制劑的組合，也可含一種或多種佐劑。所述的佐劑是指在藥物組成中，可輔助藥物療效的成分。藥品套組也可以包含獨立包裝的極光激酶抑制劑，以及獨立包裝的α病毒。藥物套組中極光激酶抑制劑，以及α病毒的施用，可以是同時施用或者是以任意的前後順序施用，例如在α病毒之前施用極光激酶抑制劑，或者在α病毒之後施用極光激酶抑制劑，或者兩者同時施用。在各種實施例中，患者可 以是哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物可以是人。
所述的極光激酶蛋白抑制劑包括但不限於巴拉替布(Barasertib)(式1)、禾比瑞丁(Hesperadin)(式2)或CCT137690(式3)這一類的抑制極光激酶蛋白活性的化合物。或者針對極光激酶基因表現抑制工具，包括但不限於基因干擾、基因沉默以及基因編輯或剔除等工具手段。
所述的α病毒選自M1病毒和給塔病毒的至少一種。
需要說明的是，本發明中，所述的激光激酶抑制劑包括極光激酶-A(Aurora A)抑制劑、極光激酶-B(Aurora B)抑制劑和極光激酶-C(Aurora C)抑制劑中的一種或幾種。
在組合物或藥品套組中，巴拉替布(Barasertib)、禾比瑞丁(Hesperadin)或CCT137690與α病毒的配比可選地為：0.01~200mg：103~109PFU；優選0.1~200mg：104~109PFU；進一步優選0.1~100mg：105~109PFU。
優選使用劑量為：巴拉替布(Barasertib)、禾比瑞丁(Hesperadin)或CCT137690使用範圍為0.01mg/kg至200mg/kg，同時α病毒使用力價為感染複數(MOI)從103至109(PFU/kg)；優選巴拉替布(Barasertib)、禾比瑞丁(Hesperadin)或CCT137690使用範圍為0.1mg/kg至200mg/kg，同時α病毒使用力價為MOI從104至109(PFU/kg)；更優選巴拉替布(Barasertib)、禾比瑞丁(Hesperadin)或CCT137690使用範圍 為0.1mg/kg至100mg/kg，同時α病毒使用力價為MOI從105至109(PFU/kg)。
在一個實施方式中，所述腫瘤為實體瘤或血液瘤。在一個實施方式中，所述實體瘤為肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、或胃癌。在優選的實施方式中，所述腫瘤為對α病毒不敏感的腫瘤。在更優選的實施方式中，所述腫瘤為對M1病毒不敏感的腫瘤。
作為可選的實施方案，本發明所提供的巴拉替布(Barasertib)、禾比瑞丁(Hesperadin)或CCT137690可以是注射劑、片劑、膠囊、貼劑、試劑盒等。作為優選的實施方案，本發明的增效藥物是注射劑；優選地，可採用靜脈注射。
作為本發明進一步優選的實施方案：
本發明發現了極光激酶抑制劑，例如、尤其是巴拉替布(Barasertib)可以增加α病毒的抗腫瘤效應，以提高α病毒作為抗腫瘤藥物時的治療有效性。細胞學實驗證明M1病毒和巴拉替布(Barasertib)聯合應用，可顯著引起腫瘤細胞的形態學病變，從而顯著增強對腫瘤細胞的抑制作用。
本發明聯合巴拉替布(Barasertib)和M1病毒作用於人肝細胞癌Hep3B株，出人意料的發現巴拉替布(Barasertib)和M1病毒聯合應用時，顯著增加腫瘤細胞形態病變，顯著降低腫瘤細胞存活率。例如在本發 明的一個實施例中，當M1病毒(MOI=0.001)單獨處理肝癌細胞時，腫瘤細胞存活率為79.9%，而當以0.4μM的巴拉替布(Barasertib)與同樣MOI的M1病毒聯用時，腫瘤細胞存活率大幅下降至33.2%。與單用M1病毒的抗腫瘤效果相比，巴拉替布(Barasertib)與M1聯用時，溶瘤效果顯著提升。
發明人此前將大黃酚及其衍生物作為M1病毒的抗癌增效劑，經試驗發現，50μM的大黃酚與(MOI=0.001)M1病毒聯用後，腫瘤細胞的存活率下降至39.6%，而本發明發現，將0.4μM的巴拉替布(Barasertib)與M1病毒聯用後，腫瘤細胞的存活率顯著下降至33.2%。與大黃酚及其衍生物相比，本發明的M1抗腫瘤增效劑顯著提高了腫瘤的殺傷率。並且，在巴拉替布(Barasertib)聯合M1病毒實現了上述的殺傷率時，其所需要的藥物有效劑量上僅為大黃酚的不足百分之一，具備顯著優越性。
本發明發現，巴拉替布(Barasertib)與α病毒聯合應用處理腫瘤細胞，對腫瘤細胞殺傷作用顯著優於單用相同濃度的巴拉替布(Barasertib)，例如當同樣例如以0.4μM的巴拉替布(Barasertib)處理腫瘤細胞時，腫瘤細胞存活率仍高達84.3%；M1病毒(MOI=0.001)單獨處理肝癌細胞時，腫瘤細胞存活率為79.9%。而當以0.4μM的巴拉替布(Barasertib)與M1(MOI=0.001)病毒聯用時，腫瘤細胞存活率大幅下降至33.2%。可見，巴拉替布(Barasertib)與M1聯用時大幅提升的溶瘤效果，是得益於巴拉替布(Barasertib)與M1病毒之間的協同性機制，並非簡單地 透過巴拉替布(Barasertib)的抗腫瘤機制發揮作用。
第1圖為巴拉替布(Barasertib)與M1病毒聯合處理顯著降低人肝細胞癌株Hep3B存活率。
以下實施方式是對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式不局限於以下的實施例介紹，凡依照本發明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應視為本發明保護的範疇。
在沒有特別指明的情況下，本發明採用的材料及實驗方法為常規材料及方法。
說明書中的「選自」連接著所選對象，可以理解為，例如：「X選自：A、B、C、......、E」或「X選自：A、B、C、......和E中的一種或多種」，等等，均可理解為，X包括了A、B、C、......E中的一種、或者兩者的任意組合、或者多者的任意組合。此時不排除X還包括了一些其他類別的物質。
除了上述提及的極光激酶抑制劑，本發明的抑制劑還可以選自現有技術中已經公知的極光激酶抑制劑、或者經後續研究發現具備極光激酶抑制作用的物質。
實施例1 巴拉替布(Barasertib)與M1病毒聯合處理顯著降低人肝細胞癌株Hep3B存活率
材料：
人肝細胞癌Hep3B(購於ATCC)，M1病毒(保藏編號CCTCC V201423)，高糖DMEM培養基(購於Corning)，酵素免疫分析測讀儀。
方法：
接種細胞、給藥處理：選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液(含10%胎牛血清、1%雙抗)製成細胞懸液，以每孔4×103/孔的密度接種在96孔培養盤內。12小時後見細胞完全貼壁，實驗分對照組，單獨巴拉替布(Barasertib)組，M1感染組和巴拉替布(Barasertib)/M1聯用組。所用劑量為：所用劑量為：M1病毒(MOI=0.001)感染細胞；巴拉替布(Barasertib)為0.4μM。
MTT與細胞內的琥珀酸脫氫酶反應：培養至48小時，每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，繼續孵育4小時，此時鏡檢可觀察到、活細胞內形成的顆粒狀藍紫色甲臢結晶。
溶解甲臢顆粒：小心吸去上清液，加DMSO 100μl/孔溶解形成的結晶，在微型振盪器上震盪5min，然後在酶聯檢測儀上用波長570nm檢測各孔的光密度(OD值)。細胞存活率=(藥物處理組OD值/對照組OD值)×100%。
結果：
如第1圖所示，M1病毒(MOI=0.001)單獨處理對腫瘤細 胞Hep3B具有較小的存活率抑制作用，腫瘤細胞存活率達到79.9%，0.4μM的巴拉替布(Barasertib)處理組腫瘤細胞存活率仍高達84.3%，然而，當同樣的0.4μM的巴拉替布(Barasertib)與M1病毒(MOI=0.001)聯用(巴拉替布(Barasertib)+M1)時，腫瘤細胞存活率大幅下降至33.2%。

Claims (10)

  1. 一種極光激酶抑制劑用於製備抗腫瘤的藥物之用途，其中該藥物為α病毒抗腫瘤增效劑或耐藥逆轉劑；其中該極光激酶抑制劑為巴拉替布(Barasertib)，且其中該α病毒選自M1病毒和給塔病毒(Getah virus)中的至少一種。
  2. 一種治療腫瘤的藥物組合物，包含：(a)極光激酶抑制劑；以及(b)α病毒；其中該極光激酶抑制劑為巴拉替布(Barasertib)，且其中該α病毒選自M1病毒和給塔病毒(Getah virus)中的至少一種。
  3. 如請求項2所述之組合物，其中該巴拉替布(Barasertib)與該α病毒的配比為：0.01~200mg：103~109 PFU。
  4. 如請求項2所述之組合物，其中該藥物組合物進一步包含其藥學上可接受的載體。
  5. 一種藥品套組，包含：(a)極光激酶抑制劑；以及(b)α病毒。 其中該極光激酶抑制劑為巴拉替布(Barasertib)，且其中該α病毒選自M1病毒和給塔病毒(Getah virus)中的至少一種。
  6. 如請求項5所述之藥品套組，其中該極光激酶抑制劑和該α病毒被分開包裝。
  7. 如請求項5所述之藥品套組，其中巴拉替布(Barasertib)與該α病毒的配比為：0.01~200mg：103~109 PFU。
  8. 如請求項1所述之用途，其中該腫瘤為實體瘤或血液瘤。
  9. 如請求項8所述之用途，其中該實體瘤為肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  10. 如請求項8所述之用途，其中該腫瘤為對α病毒不敏感的腫瘤。
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S. LIBERTINI ET AL, "AZD1152 negatively affects the growth of anaplastic thyroid carcinoma cells and enhances the effects of oncolytic virus dl922-947", ENDOCRINE RELATED CANCER, (20101111), vol. 18, no. 1

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