JP4066388B2 - Scf類似体組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、幹細胞因子(「SCF」)類似体ポリペプチド組成物、ならびに該SCF類似体の組換えDNA製造のためのベクター、宿主細胞および方法に関する。また、さらに他の側面では、薬剤組成物および使用方法を提供する。
背景
幹細胞因子(「SCF」、PCT公開 No. WO91/05795を参照;kit−リガンド(PCT公開 No. WO92/03459)、マスト細胞増殖因子(PCT公開 No. WO92/00376)およびSteel因子(「SF」または「SLF」)(White, Cell 63: 5-6(1990)とも言う。)は、造血前駆細胞に対して作用する造血因子である。SCFをコードする遺伝子は、クローン化され、発現されている(例えば、Martinら、Cell 63: 203-211(1990)およびPCT公開 No. WO91/05795(その全体を参照することによって本明細書に組み入れる。))。
SCF活性の一つの特徴は、骨髄および末梢血液での始原前駆細胞の拡張である。臨床的には、SCFは、骨髄抑制によりかなりの罹患率および死亡率に至る多数の疾患の準備において有用であると考えられる。これらの準備としては、骨髄外科化学療法後の移植で使用するための前駆細胞の可動化、自己骨髄移植のための骨髄採取前の下準備および基準用量による化学療法または骨髄外科化学療法/全身照射後の造血再構成の促進、におけるSCFの使用が挙げられる。
SCFは、膜結合型および可溶型などの多くの活性型を有する。PCT公開 No. 91/05795を参照。C−末端欠失類似体も活性を有する。例えば、SCF1−137(「1」は成熟タンパク質の最初のアミノ酸を意味する。)は、生物学的活性を示し、SCF1−141は、完全な生物学的活性を多少示す(Langleyら、Arch. Biochem. Biophys. 311:55-61(1994))。SCF1−165は、天然の配列にあるアスパラギンの代わりに10位にアスパラギン酸を有するが(N10Dと言う。)、これも研究されており、二量体生成速度にあまり影響がないことが分かった(Luら、Biochem.J.305: 563-368(1995))。ある種の共有的に結合したSCF二量体がPCT公開WO95/26199で報告されている。安定性は、分子間共有結合によって増加することが報告されている。
本明細書で提供するような、生物学的活性および安定性の増加したSCF類似体は、より低い用量の使用で同じ生物学的結果を達成することができるので、消費者にとって望ましい。そのような類似体は、より活性の大きい物質により、製造バッチ当たりの販売される製品単位が多くなるので、製造者にとっても望ましい。安定性の増加、特に在庫有効期間の増加は、消費者にとっても製造者にとっても特に有用である。すなわち、本発明は、これらの利点を提供し、消費者および製造者の要求を満足するものである。
発明の概要
本発明は、10位および11位(図1の番号に従う。メチオニンは、−1位である。)にアスパラギンの代わりにアスパラギン酸を含むSCF類似体に関する。驚いたことに、そして重要なことに、これらの置換の結果、非修飾SCFと比較して、生物学的活性がかなり高く、安定性も増大したSCF類似体が得られることが見いだされた。
本発明の類似体は、一部には、野生型SCFがある種の組成物緩衝液中でかなり不安定であることが見いだされたinvitroエージング研究中に行われた観察から得られた。該野生型SCFは、在庫有効期間がより短いことが予想される。このたび、野生型SCFの主な不安定性は、配列の10位(図1の成熟タンパク質に関して)にあるアスパラギン(ASN、「N」)残基での脱アミド化反応によって引き起こされることが見いだされた。脱アミド化は、α/βペプチド結合のシフトによる脱アミド化したアスパラギン残基の異性化によっても生じる。異性化したSCF種は、生物学的に活性でない。また、分子構造の敏感な変化により抗原性になる危険もある。下記に示すように、本明細書に示す類似体は、野生型SCFよりも安定性が高く、生物学的活性が増大し、脱アミド化に関連する危険性もない。
本発明の他の側面は、本発明のSCF類似体をコードする核酸、本発明のSCF類似体の組換えDNA製造のためのベクター、宿主細胞および方法を含む。また、さらに他の側面では、薬剤組成物および使用法が提供される。
【図面の簡単な説明】
図1は、ヒト組換えSCFの膜結合型のアミノ酸1−248に対するアミノ酸配列を示す図である。
図2は、加速安定性アッセイ(下記を参照)における完全なタンパク質/類似体の相対量を示すグラフである。サンプルを1〜5日間37℃で維持した後、分解産物の分析を行った。試験したサンプルは次の通りである:(a)「rhSCF、野生型」、組換えヒトmet−1SCF1−165、(b)「N10D、N11D変異体」、10位および11位にアスパラギン酸残基を有する組換えヒトmet−1SCF1−165、(c)「N10D変異体」、すなわち、(b)と同じであるが、10位のみにアスパラギン酸がある、および(d)「N10E変異体」、N10Dと同じであるが、10位にグルタミン酸がある。
発明の詳細な説明
本発明は、非修飾SCFよりも高い生物学的活性を示す特定のSCF類似体に関する。上記で示したように、10位および11位(図1に従う)におけるアスパラギンの一方または両方の置換は、非修飾SCFよりもかなり高い生物学的活性を示す分子を生じることが分かった。本発明の類似体は、本明細書では、N10D(10位のアスパラギンがアスパラギン酸で置換されている)およびN10D、N11D(11位にさらに置換を有するSCF類似体)と言う。好ましくは、N10D、N11Dである。両方の位置での変異により、N10Dのみの変異よりもさらに生物学的活性(巨核球細胞増殖アッセイにおいて)が得られるからである。
便宜上、「N10D」および「N10D、N11D」は、全長1−248のSCFタンパク質(図1)の類似体または下記に述べる他のいくつかの型の類似体であろうとなかろうと、総称的に本発明のSCF類似体を意味する。特定の類似体を本明細書で検討する場合は、その特定の未変換アミノ酸配列を参照する。例えば、下記に示すのは、SCF類似体N10DSCFmet1−165である(図1の165個のアミノ酸を有するSCFの類似体であり、N−末端はメチオニン残基であり、10位のアスパラギンはアスパラギン酸で置換されている)。
SCF類似体は、ヒトSCFの全長分子(図1)と比較した類似体であり、あるいは、図1のアミノ酸1−165または1−164を有するSCFなどの修飾SCFの類似体である(本発明の実施例は、−1位にメチオニン残基を有する修飾SCF1−165を示す。)。別の型のSCFは、エキソンの欠失により220個のアミノ酸を有するものである(SCFの膜結合型)。「幹細胞因子」と題する、1991年5月2日に公開されたPCT WO 91/05795(その全体を参照することにより本明細書に組み入れる。)を参照。上記の幹細胞因子に関するPCT公開は、図44にSCF1−220を例示している。修飾SCFは、C−末端の1個以上のアミノ酸が欠失して、アミノ酸1−138、より好ましくは1−141(図1)になったもの、またはN−末端の1位〜4位(図1)が欠失したものも含む。
修飾SCFは、天然のヒトSCFの造血生物学的活性の少なくとも1つを有する限り、他の付加、欠失または置換を有するものも含む。好ましい造血生物学的活性は、初期の造血前駆細胞の増殖刺激能である。SCF PCT公開 WO91/05795、各所を参照。「出発」SCF分子上の対応する部位でのアスパラギンのアスパラギン酸への置換という本発明を使用した修飾は、「出発」SCF分子の活性の増加が期待される。(「出発」の用語は、典型的には、タンパク質自体ではなく、これらのタンパク質をコードする核酸が本発明の類似体を製造するための出発点であるため、引用する。)
本発明を行うための「出発」物質として使用できる具体的な修飾SCFとしては、(N10DおよびN10D、N11Dに対応する変化は、恐らく生物学的活性を増加することであるため)、以下のものが挙げられる(図1を参照)。
(a)SCF1−138、好ましくは1−141(少なくともその位置で図1のC−末端システインを有する)から1−248までのいずれか(これらのC−末端欠失は、UT−7バイオアッセイ(下記に記載)において生物学的活性にあまり影響しないので);
(b)活性の低下したSCF1−127、1〜130および1−137;ならびに
(c)1、2、3または4位にN−末端欠失を有する(および4位にシステインが残っている)上記SCFのいずれか。
さらに、WO 95/26199で報告された共有二量体、例えばアミノ酸リンカーを使用して一方のモノマーのN−末端が他方のモノマーのC−末端に共有的に連結された共有二量体などには、本発明の類似体である1以上のモノマーが含まれる。
「出発」SCFに対して好ましいのは、SCF1−248、SCF1−165、SCF1−164であり、これらは、もっとも大きい生物学的活性を有すると考えられ、解析されている。
本発明のSCF類似体は、−1位にメチオニン残基を有すると考えられる(典型的には、細菌発現に起こりやすい)。
本発明のSCF類似体は、モノマーまたは二量体の製剤に含めることができ、最も高い生物学的活性を維持するためには、ホモ二量体が好ましい。1つのN10Dおよび1つのN10D、N11D分子から成るヘテロ二量体であってもよく、これも活性が強められる。また、N10D、N11Dおよび天然のSCF(非修飾SCF1〜164または1〜165)を有するヘテロ二量体を調製してもよい。SCF製剤は、ヘテロおよびホモ二量体の混合物であってもよく、該二量体とモノマーの混合物であってもよい。
本発明の新規核酸配列は、本発明のSCF類似体、N10DおよびN10D、N11Dの原核または真核宿主細胞での発現を安全に行うために有用な配列を含む。その核酸配列は、精製して単離することができるので、所望のコード領域は、本発明のポリペプチドの製造に有用である。
特に、本発明のDNA配列は、以下を含む。
(a)配列番号3および4および6および7に記載のDNA配列;
(b)天然のヒトSCFの造血生物学的特性の少なくとも一つを有するSCFの別の型をコードするように修飾されたサブパート(a)のDNA配列。好ましくは、生物学的特性がSCF受容体(c−kit受容体)に結合する特性であるが、別の生物学的特性は、初期造血前駆細胞の増殖刺激能である。別の生物学的特性は、メラニンを製造するためのメラノサイトの刺激能である。他の生物学的特性は、当業者に明らかである。
特に、本発明の核酸は、下記(図1を参照):
(a)SCF1−138、好ましくは1−141(少なくともその位置に図1のC−末端システインを有する)から1−248までのいずれか;
(b)SCF1−127、1−130および1−137;ならびに
(c)1、2、3または4位にN−末端欠失を有する(そして、4位にシステインが残っている)上記SCFのいずれかにおけるN10DまたはN10D、N11Dをコードするものである。
DNA配列は、微生物宿主におけるメッセンジャーRNAの転写または翻訳を促進するコドンを挿入することができる。製造される該配列は、Altonら、PCT公開出願 WO 83/04053の方法に従って容易に構築できる。DNAは、所望により、N−末端メチオニン残基をコードすることができる。
本発明によって提供されるDNA配列は、新規かつ有用なウイルスおよびプラスミドDNAベクター、形質転換され、トランスフェクションされた新規かつ有用な原核および真核宿主細胞(培地で増殖させた細菌および酵母細胞ならびに哺乳類細胞を含む)、ならびに本発明のSCF類似体を発現し得る該宿主細胞の新規かつ有用な培養増殖方法を生むのに有用である。本明細書で提供する生物学的に活性なSCF類似体をコードするDNA配列(または対応するRNA)は、例えばSCFの生産不足を緩和する遺伝子治療に対して有用であると考えられる。
本発明はまた、本発明のSCF類似体の製造法も提供する。提供される、該SCF類似体をコードする核酸を含む宿主細胞からSCF類似体N10Dおよび/またはN10D、N11Dを製造する方法は、
(a)該SCF類似体をコードする核酸を含む該宿主細胞を、該DNA分子の発現を促進する条件下で培養し;
(b)該SCF類似体を得る
ことから成る。所望により、その方法で得られた他の成分から該SCF類似体を精製・単離してもよい。
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり、細菌、哺乳類細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルの細胞、ベビーハムスター腎臓細胞など)、酵母細胞および昆虫細胞を含む。工業的に製造するのに最も容易であることから、細菌宿主細胞を使用する製造が好ましい。
また、本発明の有効な量のポリペプチド産物を、SCF治療に有用な薬学的に許容される希釈剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、アジュバントおよび/または担体とともに含む薬剤組成物も本発明に包含される。該組成物は、種々の緩衝剤(例えば、トリス−HCl、酢酸塩、リン酸塩)を含み、種々のpHおよびイオン強度を有する希釈剤;界面活性剤および溶解剤(例えば、Tween 80、Polysorbate 80)、酸化防止剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、Thimersol、ベンジルアルコール)および増量物質(例えば、ラクトース、マンニトール)などの添加剤;ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒状製剤への、またはリポソームと結合した、物質の混入を含む。該組成物は、本発明のSCF類似体の物性、安定性、in vivo放出速度およびin vivoクリアランス速度に影響を及ぼす。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA18042),p ages 1435-1712(参照することにより本明細書に組み入れる。)を参照。
本発明のSCF類似体の誘導体も本発明に包含される。該誘導体としては、1以上の水溶性ポリマー分子、例えばポリエチレングリコールによって、またはポリアミノ酸の添加によって修飾した分子が挙げられる。該誘導はN−またはC−末端で単独に生じ、または多重部位で誘導が生じる可能性もある。1以上のアミノ酸のリシンによる置換は、誘導のための別の部位を提供する。
本発明の類似体またはその誘導体は、注入、または経口、鼻腔、肺、局所もしくは当業者に知られている他の型の投与用に製剤化することができる。製剤は、液体であっても、また再構成するための凍結乾燥体などの固体であってもよい。
一般に、本発明の類似体(またはその誘導体)は、現在使用されているSCFが有用であるのと同様に有用である。ただし、本発明の類似体は、より大きい効力(下記に示すように、約200%)を付与する。これらの用途としては、各種の造血、神経および生殖関連疾患の治療が挙げられる。WO 91/05795(参照することにより、本明細書に組み入れる。)を参照。また、U.S.S.N 07/982,255(これも、参照することにより、本明細書に組み入れる。)も参照。すなわち、本発明組成物および薬物製造のための方法は、そのような症状の治療に有用であると考えられる。そのような症状としては、それらに限定されないが、白血病の治療、血小板減少症の治療、貧血の治療、移植中の骨髄移植の強化、放射線、化学薬品または化学療法的に誘導される骨髄形成不全または骨髄抑制の治療における骨髄回復の強化、後天性免疫不全症候群、および細胞の化学療法に対する感作が挙げられる。さらに、本発明のSCF類似体組成物は、末梢血前駆細胞の可動化に使用できる。そのような使用および組成物には、神経障害、不妊症または腸障害に苦しむ哺乳類に治療を提供することも含まれる。さらに、本発明のSCF類似体組成物は、白斑などの色素沈着障害の治療に有用であると考えられる。
本発明のSCF類似体(または誘導体)組成物はまた、invitroで使用できる。例えば、遺伝子治療の準備において、造血細胞に外因性DNAをトランスフェクションし、該細胞を本発明のSCF類似体組成物を使用して培養する必要もあろう。すなわち、さらに別の側面では、本発明は、in vitroで造血細胞を培養する方法を含み、該方法は、
(i)該細胞を適切な培地に置き、かかる適切な培地は本発明に係るSCF類似体組成物を含み、
(ii)該造血細胞の増殖に適する条件を提供する
ことを含む。
特に、本発明は、造血細胞に外因性DNAをトランスフェクションする方法を提供し、該方法は、
(i)該造血細胞を本発明に係るSCF類似体組成物とともに培養し、
(ii)培養した該細胞に外因性DNAをトランスフェクションする
ことを含む。造血細胞は、例えば、骨髄細胞、末梢血前駆細胞である。
さらに別の側面では、本発明は、骨髄細胞または末梢血前駆細胞を培養するための成分を含むキットを提供し、該キットは、
(i)本発明のSCF類似体組成物、および
(ii)骨髄細胞または末梢血前駆細胞を培養するための培地を調製するのに適した成分
を含む。
本明細書における使用または産物は、EPO、G−CSF、M−GDF、GM−CSF、M−CSF、CSF−1、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IGF−1、LIF、インターフェロン(α、β、ガンマまたはコンセンサスなど)、神経栄養因子(BDNF、NT−3、CTNFまたはノギンなど)、他の多能性増殖因子(例えば、これらがそのような多能性増殖因子、flt−3/flk−2リガンド、幹細胞増殖因子、および全能性幹細胞因子であることが示される程度まで)、繊維芽細胞増殖因子(FGFなど)、および上記の類似体、融合分子または他の誘導体から選択されるさらに少なくとも1種の因子の投与または封入を含み得る。例えば、G−CSFと組み合わせたSCFは、末梢血前駆細胞をin vivoで可動化することが見いだされた。ex vivoの、例えばG−CSF、IL−3およびIL−6と組み合わせたSCFは、末梢血細胞の拡張に有用であることが見いだされた。本発明の類似体は、同様の使用に対して提供される。
一般に、本発明のSCF類似体(または誘導体)の効果的な量は、患者の年齢、体重および疾患の症状または重度によって決定される。Remingtons Pharmaceutical Sciences(前出)、第697〜773頁(参照することにより本明細書に組み入れる。)を参照。典型的には、一日に約0.001μg/kg体重〜約1000μg/kg体重の用量が使用できるが、それより多いまたは少ない量も、熟練した開業医の認識に従って使用できる。投与は、一日に1回またはそれより多くてもよく、あるいは、しばしばそれより少なく、また、本明細書に記載の他の組成物と組み合わせてもよい。なお、本発明は、本明細書に記載した用量に限られない。
下記実施例により、本発明をさらに十分説明するが、以下実施例は本発明の範囲を限定するものではない。実施例では、本発明のSCF met1−165N10DおよびN10D、N11Dの調製ならびに10位および/または11位のアスパラギンでの脱アミド化の回避が組換えヒトSCFの分解副生物を回避するという決定を説明する。これらのSCF類似体のinvitroでの試験も記載する。
実施例
1.10位および/または11位のアスパラギン残基が組換えヒトSCFの生物学的機能および化学安定性に影響を及ぼすことの決定
in vitroエージング中、組換えヒト幹細胞因子(rhSCF1−165)の脱アミド化を、HPLC分析および可溶性アンモニアの放出によって検出した。脱アミド化速度は、低pHまたは低温の緩衝剤中では遅いが、重炭酸ナトリウムなどのアルカリ性緩衝剤中、高められた温度と組み合わせると、かなり加速される。各種脱アミド化形態のHPLC単離の後、ペプチドマップ分析を行うと、脱アミド化がタンパク質の10位のアスパラギンに関与することが示された。ペプチドマップ分析の後、かなりの量のアスパラギン酸およびイソアスパラギン酸ペプチドが同定され、これは、10位のアスパラギンがアスパラギン酸およびイソアスパラギン酸の両残基に転化されたことを示す。rhSCF二量体の自然の会合−分解の結果として(Luら、Biochem J. 305: 563-568(1995)を参照)、2個のホモ二量体および3個のヘテロ二量体を含む全部で5種類の脱アミド化形態が検出され、単離された。細胞増殖アッセイは、イソアスパラギン酸rhSCFと他のrhSCFモノマーとの二量化二よって誘導される2種類のrhSCFヘテロ二量体が、約半分の生物学的活性を保持していることを示した。アスパラギンの代わりにイソアスパラギン酸を有するホモ二量体は、効力が50倍小さいが、アスパラギン酸ホモ二量体は、脱アミド化実験中に単離したものも、上記した部位特異的突然変異誘発によって組換え法により調製したものも、いずれも標準の分子より活性が高かった。比較すると、合成のN10A(10位にアラニンを有する)またはN10E(10位にグルタミン酸を有する)は、脱アミド化部位がないけれども、活性はかなり小さかった。これらの類似体は全て、アスパラギン残基を含むものよりも比較的安定であった。これらの結果は、組換えヒトSCFの化学的安定性が10位の残基の性質の影響を受けることを示した。
2.SCFmet1−165N10DおよびN10D、N11Dの調製
10位の脱アミド化がrhSCF製剤の活性および安定性の低下をもたらすことを示す上記研究を鑑みて、本発明のN10DおよびN10D、N11D類似体を調製し、生物学的活性および安定性を試験した。
本発明のSCF類似体は、SCFmet1−165の部位特異的突然変異誘発によって調製した。SCFmet1−165の大腸菌での発現は以前に報告された(Langleyら、Arch. Biochem. Biophys. 295: 21-28(1992))。組換えヒトSCFをコードするDNAは、開始のメチオニンコドンの後ろにヒトSCF1−165のコドンを有する。精製した組換えヒトSCFは、開始Met(Met−1位)を保持している。本発明のN10DおよびN10D、N11D類似体は、Langleyら、Arch. Biochem. Biophys. 311: 55-61(1994)に記載の部位特異的突然変異誘発によって調製した。他の「試験」類似体であるN10AおよびN10Eも同様にして調製した。
SCFmet1−165N10Dのアミノ酸配列および核酸配列は以下の通りであった(配列番号1(DNA)および2(アミノ酸))。
SCFmet1−165N10Dのアミノ酸配列および核酸配列は以下の通りであった(配列番号3および4(DNA)ならびに5(アミノ酸))。
SCFmet1−165N10D、N11Dのアミノ酸配列および核酸配列は以下の通りであった(配列番号6および7(DNA)ならびに8(アミノ酸))。
解析
SCFmet1−165N10DおよびN10D、N11Dの同一性の確認を、元のタンパク質のN−末端アミノ酸配列によって行った。SCF N10Dのアミノ酸配列は、Met-Glu-Gly-Ile-[Cys]-Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys---であることが決定され、一方、SCF N10D、N11Dの配列は、Met-Glu-Gly-Ile-[Cys]-Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asp-Val-Lys---であることが明らかにされた。従って、精製したSCF N10DおよびSCF N10D、N11Dの決定された配列は、配列番号3および4ならびに配列番号6および7に示す各々のDNA配列から予想される配列と一致する。
3.生物学的活性の増加
本発明の組換えヒトSCF類似体N10DおよびN10D、N11Dが非修飾組換えヒトSCF1−165よりも生物学的活性が約50%大きいことを示すデータを下記に示す。
生物学的活性アッセイ
in vitroUT−7バイオアッセイを、巨核球細胞培養の増殖に対するSCFの刺激効果を測定することによって行った。サンプルによって刺激された培養細胞の3H−チミジン吸収は、SCFの生物学的効力を示す。使用した方法は、Smithら、in Current Protocols in Immunology(Coliganら、編)pp. 6.17.1〜6.17.11, John Wiley & Sons, New Yorkに従った。
本発明の類似体を非修飾SCFmet1−165と比較した結果を下記に示す。
これらの結果は、in vitroでの本発明の組換えヒトSCF1−165 N10DおよびN10D、N11D類似体の生物活性が天然の組換えヒトSCF1−165より約50%高いことを示す。
4.安定性の増加
本発明の組換えヒトSCF1−165類似体が非修飾組換えヒトSCF1−165よりも加速安定性アッセイにおいてより安定していることを示すデータを下記に示す。
安定性のアッセイ
SCF、SCF N10DおよびSCF N10D、N11D間の比較による加速安定性を、100mMの重炭酸ナトリウム、pH8.4において、37℃で1〜5日間、サンプルをインキュベートすることにより評価した。SP−5PW TSKゲルカラムを使用したスルホプロピル陽イオン交換HPLCを行って、上記した緩衝液での保存において残っている未分解形および生成した脱アミド化物質の量を定量した。図2に示すように、SCF N10DおよびSCF N10D、N11Dは、インキュベート中も等しく安定であり、標準SCFよりも良好な安定性を示す。
本発明を好ましい態様によって記載したが、理解されるように、当業者には変形および改変が考えつくであろう。従って、添付のクレームは、そのような等価な変形を全てカバーするものであり、それらは、クレームした本発明の範囲内である。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:501
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列の長さ:166
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列の特徴
特徴を表す記号:Protein
存在位置:1..166
他の情報:Met配列は配列番号2の−1で開始する
配列番号:3
配列の長さ:512
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列番号:4
配列の長さ:512
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列番号:5
配列の長さ:166
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列の特徴
特徴を表す記号:Protein
存在位置:1..166
他の情報:Met配列は配列番号5の−1で開始する
配列番号:6
配列の長さ:512
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列番号:7
配列の長さ:512
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列番号:8
配列の長さ:166
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列の特徴
特徴を表す記号:Protein
存在位置:1..166
他の情報:Met配列は配列番号8の−1で開始する
配列番号:9
配列の長さ:273
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列の特徴
特徴を表す記号:Protein
存在位置:1..273
他の情報:成熟全長1-248 SCFタンパク質は、アミノ酸26で始まる;アミノ酸1-25は、Metおよびヒト組換えSCFの膜結合型に対するリーダー配列を含む
Claims (17)
- 初期の造血前駆細胞の増殖を刺激し得るSCF類似体またはその二量体であって、当該類似体が
(a)配列番号9のアミノ酸残基26−163〜26−273を含み、但し配列番号9の35位および36位のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換されているSCF類似体、
(b)配列番号9のアミノ酸残基26−152、26−155または26−162を含み、但し配列番号9の35位および36位のアスパラギン残基がアスパラギン酸残基に置換されているSCF類似体、
(c)26、27または28位にN−末端欠失を含み、配列番号9の29位においてシステインが保持されている前記(a)または(b)のSCF類似体、および
(d)N−末端メチオニン残基を含む前記(a)、(b)または(c)のSCF類似体
から成る群より選択される組換えヒトSCFの類似体である前記SCF類似体またはその二量体。 - 請求項1に記載のSCF類似体またはその二量体であって、当該SCF類似体が配列番号8のアミノ酸配列を含むSCF類似体またはその二量体。
- 請求項1または2に記載のSCF類似体をコードするDNA分子。
- (a)配列番号6に記載のDNA配列もしくはその相補鎖、または
(b)配列番号9の35および36位にアスパラギン酸をコードする(a)のDNA配列の変異体
を含む請求項3に記載のDNA分子。 - 請求項1または2に記載のSCF類似体をコードする核酸を含む宿主細胞から当該SCF類似体を製造する方法であって、
(a)請求項3または4に記載のDNA分子を含む宿主細胞を当該DNA分子の発現を促進する条件下で培養する工程、および
(b)当該SCF類似体を得る工程
を含む前記方法。 - 請求項3または4に記載のDNA分子を含むDNAウイルスまたはプラスミドベクター。
- 請求項3または4に記載のDNAを含む宿主細胞。
- 細菌、哺乳類細胞、酵母細胞および昆虫細胞から成る群より選択される請求項7に記載の宿主細胞。
- 請求項1または2に記載のSCF類似体および医薬上許容される希釈剤、アジュバントまたは担体を含む医薬組成物。
- 造血障害の治療用医薬の製造における請求項1または2に記載のSCF類似体の使用。
- 前記造血障害が、白血球減少症、血小板減少症、貧血、移植処置中における骨髄移植の亢進、放射線、化学薬品または化学療法的に誘導される骨髄形成不全または骨髄抑制の治療における骨髄回復の亢進および後天性免疫不全症候群から選択される、請求項10に記載の使用。
- 前記医薬がEPO、G-CSF、M-GDF、GM-CSF、M-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IGF-1、LIF、インターフェロン、神経栄養因子、flt-3/flk-2 リガンドおよび繊維芽細胞増殖因子から選択される少なくとも1つの因子を更に含む請求項10または11に記載の使用。
- (i)請求項1または2に記載のSCF類似体を含む適当な培養培地中に造血細胞を置く工程、および
(ii)当該造血細胞の増殖に適した条件を提供する工程
を含む、in vitroで造血細胞を培養する方法。 - (i)請求項1または2に記載のSCF類似体を含む培地中で造血細胞を培養する工程、および
(ii)外来DNAで当該培養細胞をトランスフェクションする工程
を含む、造血細胞を外来DNAでトランスフェクションする方法。 - 前記造血細胞が骨髄細胞または末梢血前駆細胞である請求項14に記載の方法。
- 前記培養が、EPO、G-CSF、M-GDF、GM-CSF、M-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IGF-1、LIF、インターフェロン、神経栄養因子、flt-3/flk-2 リガンドおよび繊維芽細胞増殖因子から選択される少なくとも1つの追加因子を使用することを含む、請求項13乃至15のいずれかに記載の方法。
- (i)請求項1または2に記載のSCF類似体、および
(ii)骨髄細胞または末梢血前駆細胞の培養用培地の調製に適した成分
を含み、さらに
(iii)EPO、G-CSF、M-GDF、GM-CSF、M-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IGF-1、LIF、インターフェロン、神経栄養因子、flt-3/flk-2 リガンドおよび繊維芽細胞増殖因子から選択される少なくとも1つの追加因子
を含んでいてもよい造血細胞を培養するためのキット。
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