ES2286830T3 - Composiciones de analogos de scf y metodos. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES POLIPEPTIDICAS ANALOGAS AL FACTOR DE LAS CELULAS MADRE (SCF), A VECTORES, CELULAS HUESPED Y PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCION DE ADN RECOMBINANTE DE LOS CITADOS ANALOGOS DE SCF.
Description
Composiciones de análogos de SCF y métodos.
La presente invención se refiere a composiciones
de polipéptidos análogos al factor de células madre ("SCF") y
vectores, células hospedadoras y procedimientos para la producción
de ADN recombinante de los presentes análogos de SCF. Además, en
otros aspectos más, se proporcionan composiciones farmacéuticas y
métodos de uso.
El factor de células madre ("SCF",
véase Publicación PCT Nº WO 91/05795; también llamado
ligando-kit, Publicación PCT Nº WO 92/03459, factor
de crecimiento de mastocitos, véase Publicación PCT Nº WO
92/00376 y factor Steel (o "SF" o "SLF") White, Cell
63: 5-6 (1990)) es un factor hematopoyético
que actúa sobre las células progenitoras hematopoyéticas. El gen que
codifica SCF se ha clonado y expresado, por ejemplo, Martin et
al., Cell 63: 203-211 (1990) y
Publicación PCT Nº WO 91/05795.
Un sello de la actividad de SCF es la
multiplicación de las células progenitoras en la sangre medular y
periférica. El SCF puede mostrarse útil en varios marcos de
enfermedad en los que la mielosupresión da como resultado
morbilidad y mortalidad significativas. Estos marcos incluyen el uso
de SCF para: movilizar células progenitoras para su uso en
transplante después de quimioterapia mieloablativa, preparar la
médula antes de la recogida de médula ósea para un transplante
autólogo de médula ósea y para acelerar la reconstitución
hematopoyética después de quimioterapia de dosis convencional o
quimioterapia mieloablativa/irritación corporal total.
El SCF tiene numerosas formas activas,
incluyendo una versión unida a membrana y una versión soluble.
Véase Publicación PCT Nº WO 91/05795. Los análogos con
deleción C-terminal también tienen actividad. Por
ejemplo, SCF 1-137 (con "1" refiriéndose al
primer aminoácido de la proteína madura) muestra actividad biológica
y SCF 1-141 muestra actividad biológica más o menos
completa. Langley et al., Arch. Biochem. Biophys. 311:
55-61 (1994). También se ha estudiado SCF
1-165 que tiene ácido aspártico en la posición 10,
en lugar de una asparagina como en la secuencia nativa (denominada
"N10D") y se descubrió que no influye de forma apreciable en la
tasa de formación de dímeros. Lu et al., Biochem. J.
305: 563-568 (1995). Ciertos dímeros de SCF
unidos covalentemente se presentan en la Publicación PCT Nº WO
95/26199. Se afirma que la estabilidad aumenta por un enlace
covalente intermolecular.
Los análogos de SCF con actividad biológica y
estabilidad aumentadas, tales como los que se proporcionan en este
documento, serían deseables para los consumidores, ya que pueden
usarse dosificaciones más bajas para conseguir el mismo resultado
biológico. Dichos análogos serían deseables para los fabricantes, ya
que más producto activo da como resultado más unidades de producto
vendidas por lote de producción. La estabilidad aumentada,
particularmente la vida útil aumentada, sería particularmente útil
para consumidores y fabricantes. Por lo tanto, la presente
invención proporciona estas ventajas y satisface las necesidades de
consumidores y fabricantes.
La presente invención se refiere a análogos de
SCF que contienen asparagina sustituida con ácido aspártico en cada
una de las posiciones 10 y 11 (de acuerdo con la numeración de la
Figura 1, donde la metionina está en la posición -1). De forma
sorprendente e importante, se ha descubierto que estas sustituciones
dan como resultado análogos de SCF que tienen actividad biológica
sustancialmente mayor y estabilidad aumentada en comparación con SCF
sin modificar.
Los presentes análogos se produjeron en parte a
partir de observaciones parciales realizadas durante estudios de
envejecimiento in vitro, donde se descubrió que el SCF de
tipo silvestre era altamente inestable en ciertos tampones de
formulación. De predecía que dicho SCF de tipo silvestre tendría la
vida útil más corta. Ahora se ha descubierto que la principal
inestabilidad del SCF de tipo silvestre la causa la reacción de
desamidación en el resto aspartilo (asparagina, ASN, "N") en
la posición 10 de la secuencia (con respecto a la proteína madura
como en la Figura 1). La desamidación también dio como resultado la
isomerización del resto aspartilo desamidado mediante
desplazamiento del enlace peptídico alfa/beta. La especie de SCF
isomerizada no es activa biológicamente. También existe un riesgo
de antigenicidad debido al cambio sutil en la estructura molecular.
Como se demuestra a continuación, los análogos proporcionados en
este documento son más estables que el SCF de tipo silvestre,
tienen actividad biológica aumentada y eliminan cualquier riesgo
asociado con la desamidación.
Otros aspectos de la presente invención incluyen
ácidos nucleicos que codifican los presentes análogos de SCF,
vectores, células hospedadoras y procesos para la producción de ADN
recombinante de los presentes análogos de SCF. Además, en otros
aspectos más, se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos
de uso.
La Figura 1 es una ilustración de la secuencia
de aminoácidos para los aminoácidos 1-248 de la
forma unida a la membrana de SCF humano recombinante.
\global\parskip0.850000\baselineskip
La Figura 2 es un gráfico que ilustra la
cantidad relativa de proteína intacta/análogo en un ensayo de
estabilidad acelerada (véase infra). Las muestras se
mantuvieron a 37ºC durante 1-5 días y después se
analizaron los productos de degradación. Las muestras ensayadas
fueron (a) "rhSCF, tipo silvestre", met-1 SCF
1-165 humano recombinante, (b) "variante N10D,
N11D", met-1 SCF 1-165 humano
recombinante que tiene un resto de ácido aspártico en las
posiciones 10 y 11; (c) "variante N10D", es decir el mismo que
(b) anteriormente, excepto con el ácido aspártico solamente en
posición 10; y (d) "variante N10E" el mismo que N10D excepto
con un ácido glutámico en posición 10.
La presente invención se refiere a análogos
particulares de SCF que demuestran mayor actividad biológica que
SCF sin modificar. Más específicamente, la presente invención se
refiere a análogos de SCF en los que cada uno de los restos ASN en
las posiciones 10 y 11 (de acuerdo con la Fig. 1) se sustituyen con
un resto Asn. Como se ha indicado anteriormente, se ha descubierto
que la sustitución de las asparaginas en las posiciones 10 y 11 (de
acuerdo con la Figura 1) da como resultado una molécula que
demuestra una actividad biológica sustancialmente mayor que SCF sin
modificar. Los presentas análogos se denominan en este documento
N10D, N11D (para el análogo que tiene sustituciones en la posición
10ª y 11ª). Los cambios en las dos posiciones dan como resultado
actividad biológica adicional (en un ensayo de proliferación de
células megacariocíticas) sobre el cambio N10D en solitario.
Por comodidad, la expresión "N10D, N11D" se
refiere genéricamente a los presentes análogos de SCF, ya sean
análogos de la proteína SCF 1-248 de longitud
completa (Figura 1) o análogos de alguna forma diferente como se
describe a continuación. Cuando se describe un análogo particular en
este documento, se menciona la secuencia de aminoácidos no
modificada particular. Por ejemplo, a continuación se muestra el
análogo de SCF N10D SCF met 1-165 (un análogo de
SCF que tiene 165 aminoácidos de la Figura 1 con un resto metionilo
N-terminal y asparagina sustituida con ácido
aspártico en la posición 10).
Los análogos de SCF pueden ser análogos en
comparación con la molécula de SCF humano de longitud completa
(como en la Figura 1) o pueden ser análogos de un SCF modificado,
tales como SCF que tienen aminoácidos 1-165 ó
1-164 de la Figura 1. (Los presentes ejemplos de
trabajo mostraron SCF 1-165 modificados que tienen
un resto metionilo en la posición -1). Otro tipo de SCF es uno que
tiene 220 aminoácidos, debido a la deleción de un exón (la versión
de SCF unido a la membrana). Véase, PCT WO 91/05795, titulado,
"Stem Cell Factor", publicado el 2 de mayo de 1991. La
publicación PCT sobre el Factor de Células Madre anterior, en la
Figura 44 ilustra SCF 1-220. Los SCF modificados
también incluyen aquellos con deleciones de uno o más aminoácidos en
el extremo C, cadena abajo de los aminoácidos 1-138
o más preferiblemente 1-141 (de la Figura 1) y
aquellos con deleciones N-terminales de la posición
1 a 4 (también de la Figura 1).
Los SCF modificados pueden incluir aquellos que
tienen otras adiciones, deleciones o sustituciones, siempre que
posean al menos una de las actividades biológicas hematopoyéticas
del SCF humano de origen natural. Una actividad biológica
hematopoyética preferida es la capacidad de estimular el crecimiento
de células progenitoras hematopoyéticas tempranas. Véase la
Publicación PCT Nº WO 91/05795, passim. Se espera que la
modificación usando la presente invención de sustitución de la
asparagina a ácido aspártico en el sitio correspondiente de la
molécula de SCF "de partida" aumente la actividad de la
molécula de SCF "de partida". (la expresión "de partida"
está entre comillas porque, típicamente, el ácido nucleico que
codifica estas proteínas y no la propia proteína, es el punto de
partida para producir los presentes análogos).
Los SCF modificados específicos que pueden
usarse como material "de partida" para poner en práctica la
presente invención (puesto que los cambios correspondientes a N10D
y N10D, N11D es probable que aumenten la actividad biológica)
incluyen (en referencia a la Figura 1):
- (a)
- cualquiera de SCF 1-138 o, preferiblemente 1-141 (que tiene al menos la cisteína C-terminal de la Figura 1 en esta posición), a 1-248, puesto que estas deleciones terminales no afectan de forma apreciable a la actividad biológica en un bioensayo UT-7 (como se describe a continuación);
- (b)
- SCF 1-127, 1-130 y 1-137, que tienen actividad reducida; y
- (c)
- cualquiera de los anteriores SCF que tenga deleciones N-terminales en las posiciones 1, 2, 3 ó 4 (y que siga teniendo al cisteína en posición 4).
Además, los dímeros covalentes como los que se
presentan en el documento WO 95/26199, tales como aquellos en los
que se usan enlazadores de aminoácidos para unir covalentemente el
extremo N de un monómero al extremo C de otro monómero, pueden
incluir uno o más monómeros que sean un análogo de la presente
invención.
Los SCF preferidos como SCF "de partida"
son SCF 1-248, SCF 1-165, SCF
1-164, puesto que se piensa que estos poseen la
mayor actividad biológica y se han caracterizado.
Los presentes análogos de SCF pueden tener un
resto metionilo en posición -1 (típicamente debido a la expresión
bacteriana).
Los presentes análogos de SCF pueden incluirse
en una preparación de formas monoméricas o diméricas y se prefieren
homodímeros para mantener la mayor actividad biológica. Se puede
tener un heterodímero compuesto por una molécula N10D y una N10D,
N11D, también con actividad aumentada. También puede prepararse un
heterodímero con N10D, N11D y SCF nativo (tal como SCF
1-64 ó 1-165 sin modificar). La
preparación de SCF puede ser una mezcla de hetero- y
homo-dímeros, o puede ser una mezcla de dichos
dímeros y monómeros.
Las nuevas secuencias de ácidos nucleicos de la
invención incluyen secuencias útiles para asegurar la expresión en
células hospedadoras procariotas o eucariotas de los presentes
análogos de SCF, N10D, N11D. Los ácidos nucleicos pueden
purificarse y aislarse, de modo que la región codificante es útil
para producir los presentes polipéptidos.
Más específicamente, las secuencias de ADN de la
invención comprenden:
- (a)
- la secuencia de ADN que se muestra en las SEC ID Nº 3 y 4, y 6 y 7;
- (b)
- las secuencias de ADN de la subparte (a) modificadas para codificar otra versión de SCF que tienen al menos una de las propiedades biológicas hematopoyéticas de SCF humano de origen natural. Preferiblemente la propiedad biológica es la propiedad de unión a un receptor de SCF (el receptor c-kit), pero otra propiedad biológica es la capacidad de estimulación de la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas tempranas. Otra propiedad biológica es la capacidad de estimulación de melanocitos para producir melanina. Otras propiedades biológicas serán evidentes para los especialistas en la técnica.
Más específicamente, los presentes ácidos
nucleicos son aquellos que codifican N10D, N11D en (en referencia a
la Figura 1):
- (a)
- cualquiera de SCF 1-138 o, preferiblemente 1-141 (que tiene al menos la cisteína C-terminal de la Figura 1 en esta posición) a 1-248;
- (b)
- SCF 1-127, 1-130 y 1-137; y
- (c)
- cualquiera de los anteriores SCF que tenga deleciones N-terminales en las posiciones 1, 2, 3 ó 4 (y que siga teniendo la cisteína en posición 4).
Las secuencias de ADN pueden incorporar codones
que faciliten la transcripción y traducción de ARN mensajero en
hospedadores microbianos. Dichas secuencias fabricadas pueden
construirse fácilmente de acuerdo con los métodos de Alton et
al., solicitud publicada PCT WO 83/04053. Los ADN pueden
codificar opcionalmente un resto metionina
N-terminal.
Las secuencias de ADN proporcionadas por la
invención son útiles para generar nuevos y útiles vectores de ADN
viral y de plásmidos, nuevas y útiles células hospedadoras
procariotas y eucariotas transformadas y transfectadas (incluyendo
células bacterianas y de levadura y células de mamífero en cultivo)
y nuevos y útiles métodos para el cultivo de dichas células
hospedadoras capaces de expresar los presentes análogos de SCF. Las
secuencias de ADN que codifican análogos de SCF biológicamente
activos proporcionados en este documento (o los ARN
correspondientes) pueden ser útiles para terapia génica en casos en
los que aliviaría la subproducción de SCF.
La presente invención también proporciona
procesos de producción de los presentes análogos de SCF. Se
proporciona un proceso para producir el análogo de SCF N10D, N11D a
partir de una célula hospedadora que contiene ácido nucleico que
codifica dicho análogo de SCF compuesto por:
- (a)
- cultivar dicha célula hospedadora que contiene ácido nucleico que codifica dicho análogo de SCF en condiciones que facilitan la expresión de dicha molécula de ADN; y
- (b)
- obtener dicho análogo de SCF.
Las células hospedadoras pueden ser procariotas
o eucariotas e incluyen bacterias, células de mamífero (tales como
células de Ovario de Hámster Chino), células de levadura y células
de insecto. Se prefiere la producción usando una célula bacteriana
por su mayor facilidad de producción comercial.
La invención también incluye composiciones
farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de productos de
polipéptidos de la invención junto con diluyentes, conservantes,
solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos
farmacéuticamente aceptables útiles en terapia con SCF. Dichas
composiciones incluyen diluyentes con diversos contenidos de tampón
(por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y
fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes
solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80),
anti-oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico,
metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, Thimersol,
alcohol bencílico) y sustancias formadoras de volumen (por ejemplo,
lactosa, manitol); la incorporación del material en preparaciones
particuladas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico,
ácido poliglicólico, etc., o en asociación con liposomas. Dichas
composiciones influirán en el estado físico, estabilidad, tasa de
liberación in vitro y tasa de eliminación in vivo de
los presentes análogos de SCF. Véase por ejemplo el documento
Remington's Pharmaceutical Sciences 18ª Ed. (1990, Mack Publishing
Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712.
En este documento también se incluyen derivados
de los presentes análogos de SCF. Dichos derivados incluyen
moléculas modificadas mediante una o más moléculas de polímeros
solubles en agua, tales como polietilenglicol o mediante la adición
de poliaminoácidos. Dicha derivatización puede producirse únicamente
en el extremo N- o C- o puede haber múltiples sitios de
derivatización. La sustitución de uno o más aminoácidos con lisina
puede proporcionar sitios de derivatización adicionales.
Los presentes análogos o derivados de los mismos
pueden formularse para administración por inyección, u oral, nasal,
pulmonar, tópica u otros tipos de administración como reconocerá un
especialista en la técnica. La formulación puede ser líquida o
puede ser sólida, tal como liofilizada, para reconstitución.
En general, los presentes análogos (o derivados
de los mismos) serán útiles de la misma manera que los son los SCF
disponibles actualmente, excepto que los presentes análogos
proporcionan una mayor eficacia (aproximadamente del 200% como
demostrará a continuación). Estos usos incluyen el tratamiento de
diversas afecciones hematopoyéticas. Véase el documento WO
91/05795, Véase también el documento U.S.S.N. 07/982.255. Por
lo tanto, las presentes composiciones y métodos para la fabricación
de medicamentos pueden ser útiles para el tratamiento de dichas
afecciones. Dichas afecciones incluyen, aunque sin limitación, el
tratamiento de leucopenia, el tratamiento de trombocitopenia, el
tratamiento de anemia, favorecer el injerto de médula ósea durante
el transplante, favorecer la recuperación de médula ósea en
tratamiento de radiación, aplasia o mielosupresión de la médula
ósea inducida química o quimioterapéuticamente y síndrome de
inmunodeficiencia adquirida. Además, las presentes composiciones de
análogos de SCF pueden usarse para movilizar células progenitoras de
la sangre periférica. Además, las presentes composiciones de
análogos de SCF pueden ser útiles para el tratamiento de trastornos
de pigmentación, tales como vitíligo.
Las presentes composiciones de análogos (o
derivados) de SCF también pueden usarse in vitro. Por
ejemplo, en un marco de terapia génica, puede desearse transfectar
una célula hematopoyética con ADN exógeno y cultivar dicha célula
usando las presentes formulaciones de análogos de SCF. Por lo tanto,
en otro aspecto más, la presente invención incluye un método para
cultivar células hematopoyéticas in vitro compuesto por:
- (i)
- colocar dichas células en un medio de cultivo adecuado, conteniendo dicho medio de cultivo adecuado una composición de análogos de SCF de acuerdo con la presente invención, y
- (ii)
- proporcionar condiciones adecuadas para el cultivo de dichas células hematopoyéticas.
Más particularmente, la presente invención
proporciona un método para transfectar células hematopoyéticas con
ADN exógeno que comprende:
- (i)
- cultivar dichas células hematopoyéticas con una composición de análogos de SCF de acuerdo con la presente invención, y
- (ii)
- transfectar dicha célula cultivada con ADN exógeno. Las células hematopoyéticas pueden ser, por ejemplo, células de la médula ósea o células progenitoras de la sangre periférica.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona un kit que contiene componentes para cultivar células
de médula ósea o células progenitoras de la sangre periférica,
compuesto por:
- (i)
- una composición de análogos de SCF de la presente invención, y
- (ii)
- componentes adecuados para preparar medio para cultivar células de médula ósea o células progenitoras de la sangre periférica.
Los usos o productos en este documento pueden
implicar la administración o inclusión de al menos un factor
adicional seleccionado entre EPO, G-CSF,
M-GDF, GM-CSF,
M-CSF, CSF-1, IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11, IL-12, IGF-1,
LIF, interferón (tales como \alpha, \beta, gamma o de consenso)
factores neurotróficos (tales como BDNF, NT-3, CTNF
o noggin), otros factores de crecimiento
multi-potentes (tales como, hasta el punto en que
estos han demostrado ser dicho factor de crecimiento
multi-potencial, ligando
flt-3/flk-2, factor de proliferación
de células madre y factor de células madre totipotente), factores
del crecimiento de fibroblastos (tales como FGF) y análogos,
moléculas de fusión u otros derivados de los anteriores. Por
ejemplo, se ha descubierto que SCF en combinación con
G-CSF moviliza células progenitoras de la sangre
periférica in vivo. Ex vivo, por ejemplo, se ha
descubierto que SCF en combinación con G-CSF,
IL-3 e IL-6, es útil para la
multiplicación de células progenitoras de la sangre periférica. Los
presentes análogos posibilitan usos similares.
Generalmente, una cantidad eficaz de los
presentes análogos (o derivados) de SCF, se determinará mediante la
edad, peso y estado o gravedad de la enfermedad del receptor.
Véase el documento Remintong's Pharmaceutical Sciences,
supra, en las páginas 697-773. Típicamente,
puede usarse una dosificación entre aproximadamente 0,001 \mug/kg
de peso corporal/día y aproximadamente 1000 \mug/kg de peso
corporal/día, pero puede usarse más o menos, como reconocerá un
especialista en la técnica. La dosificación puede ser una o más
veces al día o de forma menos frecuente y puede ser junto con otras
composiciones como se describe en este documento. Debe observarse
que la presente invención no se limita a las dosificaciones
mencionadas en este documento.
El siguiente ejemplo se ofrece para ilustrar más
completamente la invención, pero no debe interpretarse que limita
el alcance de la misma. El ejemplo ilustra la preparación del SCF
met 1-165 N10D y N10D, N11D, y la determinación de
que al evitar la desamidación en la asparagina en la posición 10ª
y/o 11ª se evitan subproductos de degradación de SCF humano
recombinante. También se describe el ensayo de estos análogos de SCF
in vitro.
Durante el envejecimiento in vitro, la
desamidación del factor de células madre humano recombinante
(rhSCF1-165) se detectó mediante análisis por HPLC
y mediante la liberación de amoniaco soluble. La tasa de
desamidación es lenta en tampones a un pH bajo o a bajas
temperaturas, pero la tasa se acelera de forma significativa en
tampones alcalinos tales como bicarbonato sódico en combinación con
temperaturas elevadas. El aislamiento por HPLC de diversas formas
desamidadas seguido del análisis del mapa peptídico, mostró que la
desamidación implicaba asparagina en la 10ª posición en la
proteína. Después del análisis del mapa peptítico se identificaron
cantidades significativas de aspartilo e isoaspartilo, lo que
indicaba la conversión de la asparagina en la posición 10 en restos
aspartato e isoaspartato. Como resultado de la
asociación-disociación espontánea del dímero rhSCF
(véase el documento Lu et al., Biochem J. 305:
563-568 (1995)), se detectaron y aislaron un total
de cinco formas desamidadas, incluyendo dos homodímeros y tres
heterodímeros. Los ensayos de proliferación celular mostraron dos
especies heterodiméricas, obtenidas a partir de dimerización entre
isoaspartilo rhSCF y otros monómeros de rhSCF, solamente conservan
aproximadamente la mitad de la actividad biológica. El homodímero
con ácido isoaspártico en lugar de asparagina es 50 veces menos
potente, mientras que el homodímero de aspartilo, aislado durante
experimentos de desamidación o preparado recombinantemente mediante
mutagénesis sitio-dirigida como se ha descrito
anteriormente, tenía mayor actividad que la molécula convencional.
En comparación, N10A (que tiene una alanina en la 10ª posición) o
N10E (que tiene un ácido glutámico en la 10ª posición), aunque
carecían de sitio de desamidación, eran significativamente menos
activos. Todos estos análogos eran relativamente menos estables que
los que contenían el resto de asparagina. Estos resultados indicaban
que la función biológica y la estabilidad química del SCF humano
recombinante están influidas por la naturaleza humana del resto en
la posición 10.
En vista de los estudios anteriores que
demostraban que la desamidación en la posición 10 daba como
resultado una pérdida de actividad e inestabilidad de las
preparaciones rhSCF, se prepararon los presentes análogos N10D y
N10D, N11D y se ensayó su actividad biológica y su estabilidad.
Los presentes análogos de SCF se prepararon
mediante mutagénesis sitio-dirigida de SCF met
1-165. Previamente se presentó la expresión en
E. coli de SCF met 1-165. Langley et
al., Arch. Biocehm. Biophys. 295: 21-28
(1992). El ADN que codifica SCF humano recombinante tenía un codón
de metionina inicial seguido de SCF 1-165 humano.
El SCF humano recombinante purificado conserva la Met de iniciación
(posición Met -1). Los presentes análogos N10D y N10D, N11D se
prepararon mediante mutagénesis sitio-dirigida como
se describe en el documento Langley et al., Arch. Biocehm.
Biophys. 311: 55-61 (1994). También se
prepararon de esta manera otros análogos "de ensayo", N10A y
N10E.
La secuencia de aminoácidos y la secuencia de
ácido nucleico para SCF met 1-165 N10D era (SEC ID
Nº 1 (ADN) y 2 (aminoácido)):
La secuencia de aminoácidos y la secuencia de
ácido nucleico para SCF met 1-165 N10D era (SEC ID
Nº 3 (ADN) y 5 (aminoácido)):
\global\parskip1.000000\baselineskip
\newpage
La secuencia de aminoácidos y la secuencia de
ácido nucleico para SCF met 1-165 N10D, N11D era
(SEC ID Nº 6 y 7 (ADN) y 8 (aminoácido)):
\vskip1.000000\baselineskip
La confirmación de la identidad de SCF met
1-165 N10D y N10D, N11D se realizó mediante la
secuencia de aminoácidos N-terminal de proteínas
intactas. Se determinó que la secuencia de aminoácidos de SCF N10D
era
Met-Glu-Gly-Ile-[Cys]-Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys- - -,
mientras que se aclaró que la secuencia de SCF N10D, N11D era
Met-Glu-Gly-Ile-[Cys]-Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asp-Val-Lys- - -.
Por lo tanto, las secuencias determinadas de los dos SCF N10D y SCF
N10D, N11D purificados coincidían con las secuencias predichas a
partir de las respectivas secuencias de ADN que se muestran en las
SEC ID Nº 3 y 4 y SEC ID Nº 6 y 7.
3. Actividad biológica aumentada. A
continuación se presentan datos que demuestran que los presentes
análogos de SCF humano recombinante N10D y N10D, N11D son
aproximadamente el 50% más activos biológicamente que el SCF
1-165 humano recombinante no modificado.
Se realizó un bioensayo UT-7
in vitro midiendo el efecto estimulador de SCF sobre la
proliferación de un cultivo celular de megacariocitos. La captación
de ^{3}H-timidina de las células cultivadas
estimuladas con las muestras es indicativa de la potencia biológica
de SCF. Se usaron los métodos de acuerdo con Smith et al.,
en Current Protocols in Immunology (Coligan et al.,
eds.) págs. 2.17.1 a 6.17.11, John Wiley & Sons, New York.
Los resultados que comparan los presenten
análogos con SCF met 1-165 sin modificar se
presentan a continuación:
Estos resultados demuestran que in vitro,
la actividad biológica de los presentes análogos de SCF
1-165 humano recombinante N10D y N10D, N11D es
aproximadamente el 50% mayor que la de SCF 1-165
humano recombinante nativo.
4. Estabilidad aumentada. A continuación
se presentan datos que demuestran que los presentes análogos de SCF
1-165 humano recombinante son más estables en
ensayos de estabilidad acelerada que el SCF 1-165
humano recombinante no modificado.
Ensayos de estabilidad. Se evaluó la
estabilidad acelerada comparativa entre SCF, SCF N10D y SCF N10D,
N11D incubando muestras en bicarbonato sódico 100 nM, pH 8,4 a 37ºC
durante 1-5 días. Se realizó HPLC de intercambio de
sulfopropilo catiónico para cuantificar la cantidad de forma no
degradada restante y de productos de desamidación formados después
del almacenamiento en el tampón mencionado anteriormente. Como se
indica en la Figura 2, SCF N10D y SCF N10D, N11D son igualmente
estables durante la incubación y muestran mejor estabilidad que el
SCF convencional.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Amgen Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES DE ANÁLOGOS DE SCF Y MÉTODOS.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Amgen Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1840 DeHavilland Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Thousand Oaks
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 91320-1789
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/628.428
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-ABRIL-1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Knight, Matthew W
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.846
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- REFERENCIA/NÚMERO DE REGISTRO: A-400
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 501 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 166 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ELEMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..166
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "la secuencia Met comienza en -1 en la Secuencia Nº 2".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 512 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 512 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 166 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ELEMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..166
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "la secuencia Met comienza en -1 en la Secuencia Nº 5".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 512 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 512 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 166 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ELEMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..166
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "la secuencia Met comienza en -1 en la Secuencia Nº 8".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ELEMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..273
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "NOTA: la proteína de SCF 1-248 madura de longitud completa comienza en el aminoácido 26; los aminoácidos 1-25 incluyen secuencias Met y líder para la forma unida a la membrana de SCF humano recombinante".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Un análogo de SCF donde dicho análogo de SCF
se diferencia de SCF por la adición, deleción y/o sustitución de al
menos un aminoácido y es capaz de estimular el crecimiento de
células progenitoras hematopoyéticas tempranas, o formas diméricas
del mismo, donde dicho análogo es un análogo de un SCF humano
recombinante y dicho análogo se selecciona entre el grupo compuesto
por:
- (a)
- cualquier análogo de SCF que tenga los restos de aminoácidos 26-163 a 26-273 de la SEC ID Nº 9, donde cada uno de los restos Asn en las posiciones 35 y 36 de la SEC ID Nº 9 se sustituye con un resto Asp;
- (b)
- análogo de SCF que tenga los restos de aminoácidos 26-152, 26-155 ó 26-162 de la SEC ID Nº 9, donde cada uno de los restos Asn en las posiciones 35 y 36 de la SEC ID Nº 9 se sustituye con un resto Asp;
- (c)
- cualquiera de los análogos de las subpartes (a) o (b) que tenga deleciones N-terminales en las posiciones 26, 27 ó 28 y que siga teniendo la cisteína en la posición 29 de la SEC ID Nº 9; y
- (d)
- cualquiera de los análogos de las subpartes (a), (b) o (c) que tenga un resto metionilo N-terminal.
2. Un análogo de SCF acuerdo con la
reivindicación 1, donde dicho análogo de SCF se diferencia de SCF
humano por la adición, deleción y/o sustitución de al menos un
aminoácido y es capaz de estimular el crecimiento de células
progenitoras hematopoyéticas tempranas, o formas diméricas del
mismo, donde dicho análogo tiene la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID Nº 8.
3. Una molécula de ADN que codifica un análogo
de SCF de la reivindicación 1 ó 2.
4. Una molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 3 que tiene
- (a)
- la secuencia de ADN que se muestra en la SEC ID Nº 6 o la cadena complementaria de la misma;
- (b)
- una variante de la secuencia de ADN de la subparte (a) que codifica ácido aspártico en la posición 35 y 36 de la SEC ID Nº 9.
5. Un proceso para producir un análogo de SCF de
acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 a partir de una célula
hospedadora que contiene ácido nucleico que codifica dicho análogo
de SCF que comprende las etapas de:
- (a)
- cultivar dicha célula hospedadora que contiene una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en condiciones que facilitan la expresión de dicha molécula de ADN; y
- (b)
- obtener dicho análogo de SCF.
6. Un vector de ADN viral o de plásmido que
contiene una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 3 o la
reivindicación 4.
7. Una célula hospedadora que contiene un ADN de
la reivindicación 3 o la reivindicación 4.
8. Una célula hospedadora de la reivindicación
7, donde dicha célula hospedadora se selecciona entre el grupo
compuesto por una bacteria, una célula de mamífero, una célula de
levadura y una célula de insecto.
9. Una composición farmacéutica que comprende un
análogo de SCF de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 y un
diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Uso de un análogo de SCF de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 para la preparación de un medicamento para
tratar un trastorno hematopoyético.
11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10,
donde dicho trastorno hematopoyético se selecciona entre el grupo
compuesto por leucopenia, trombocitopenia, anemia, favorecer el
injerto de médula ósea durante el transplante, favorecer la
recuperación de médula ósea en tratamiento de radiación, aplasia o
mielosupresión de la médula ósea inducida química o
quimioterapéuticamente y síndrome de inmunodeficiencia
adquirida.
12. uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 u
11, donde el medicamento incluye al menos un factor adicional
seleccionado entre EPO, G-CSF,
M-GDF, GM-CSF,
M-CSF, CSF-1, IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11, IL-12, IGF-1,
LIF, interferón, un factor neurotrófico, ligando
flt-3/flk-2 y un factor de
crecimiento de fibroblastos.
\newpage
13. Un método para cultivar células
hematopoyéticas in vitro que comprende:
- (i)
- colocar dichas células en un medio de cultivo adecuado, conteniendo dicho medio de cultivo adecuado un análogo de SCF, donde dicho análogo es un análogo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2; y
- (ii)
- proporcionar condiciones adecuadas para el cultivo de dichas células hematopoyéticas.
14. Un método para transfectar células
hematopoyéticas con ADN exógeno que comprende:
- (i)
- cultivar dichas células hematopoyéticas en un medio que contiene un análogo de SCF, donde dicho análogo es un análogo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2; y
- (ii)
- transfectar dichas células cultivadas con ADN exógeno.
15. El método de la reivindicación 14, donde
dichas células hematopoyéticas son células de médula ósea o células
progenitoras de la sangre periférica.
16. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, donde dicho cultivo incluye el uso de al
menos un factor adicional seleccionado entre EPO,
G-CSF, M-GDF,
GM-CSF, M-CSF,
CSF-1, IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IGF-1, LIF, interferón, un
factor neurotrófico, ligando
flt-3/flk-2 y un factor de
crecimiento de fibroblastos.
17. Un kit que contiene para cultivar células
hematopoyéticas que comprende:
- (i)
- un análogo de SCF donde dicho análogo es un análogo de la reivindicación 1 ó 2.
- (ii)
- componentes adecuados para preparar medio para cultivar uno de células de médula ósea o células progenitoras de la sangre periférica; y
- (iii)
- opcionalmente, al menos un factor adicional seleccionado entre EPO, G-CSF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IGF-1, LIF, interferón, un factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2 y un factor de crecimiento de fibroblastos.
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