CN105985424B - 一种干细胞因子功能性肽段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种干细胞因子功能性肽段及其应用。首次揭示一种可有效地促进人造血干细胞的扩增的多肽，其来源于人干细胞因子，氨基酸序列短，易于人工合成；其可以作为rhSCF的替代产品，用于培养人造血干细胞，使得体外培养人造血干细胞的成本显著降低。

Description

一种干细胞因子功能性肽段及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域；更具体地，本发明涉及一种干细胞因子功能性肽段及其应用。

背景技术

造血干细胞(Hematopoietic stem cell，HSC)是指骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其他细胞。它们具有良好的分化增殖能力，干细胞可以救助很多患有血液病的人们，最常见的就是白血病。造血祖细胞：造血干细胞在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的祖细胞，称造血祖细胞(hematopoieticprogenitor cells，HPCs)，它也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，但已失去多向分化能力。CD34是目前基础或临床研究中用于造血干祖细胞富集最常用的表面分子。

1957年，美国华盛顿大学多纳尔·托玛斯发现正常人的骨髓移植到病人体内，可以治疗造血功能障碍。这一技术很快得到全世界的认可，并已成为根治白血病等病的主要手段。造血干细胞移植技术的发现和应用为人类战胜疾病带来新的希望。

干细胞因子(Stem Cell Factor，SCF)是一种重要的造血因子，对正常造血细胞、肥大细胞、黑色素细胞、生殖细胞的增殖和分化以及肿瘤细胞的增殖和恶性演进等起着重要的调节作用。SCF对于人造血干细胞的扩增是非常重要的，是人造血干细胞体外扩增所必须的因子。

在人染色体中，SCF位于12q22～24。SCF有2种存在形式：可溶型和膜结合型。在人体中，编码248个氨基酸的mRNA(SCF248)，其第6个外显子中有一蛋白切割位点。由此mRNA表达165个氨基酸的可溶性SCF。编码220个氨基酸的mRNA(SCF220)，其第6个外显子中无蛋白切割位点。由此mRNA表达膜结合型SCF。

SCF和其他细胞因子一起诱导干祖细胞增生、延长其存活期及引起干祖细胞动员。虽然SCF的受体在祖细胞无显著不同，但SCF诱导红系祖细胞增生比粒-单祖细胞强，可能是其他特异性因素影响祖细胞对SCF的反应性。

作为一种细胞因子，目前在本领域已经可以利用重组法生产hSCF(rhSCF)。rhSCF和天然SCF有着相同生物学活性。两种形式SCF对造血都能起到重要作用。然而，目前用于培养造血干细胞时，一般运用的均是全长的可溶型的hSCF，鉴于其序列较长，人工合成非常困难，需要借助于条件复杂的重组表达技术，且全长的可溶型hSCF作为商品在市场销售，价格昂贵，对于人造血干祖细胞的大规模体外培养是很大的限制。目前本领域中对于SCF的功能域的研究还未见明确报道。

发明内容

本发明的目的在于提供种干细胞因子功能性肽段及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，所述多肽具有如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示的氨基酸序列。

在一个优选例中，所述的多肽是人干细胞因子的片段(即：其不是全长的人干细胞因子)。

在另一优选例中，所述的多肽的氨基酸序列长度低于100aa，更佳地低于50aa；更佳地低于25aa。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于促进人造血干细胞或人造血祖细胞的扩增。

在一个优选例中，所述的人造血干细胞或人造血祖细胞是离体的细胞。

在另一优选例中，所述的用途为非疾病治疗用途。

在本发明的另一方面，提供一种用于培养人造血干细胞或人造血祖细胞的培养基，所述的培养基中包含所述的多肽。

在一个优选例中，所述的培养基是STEMSFM；添加10±2％(v/v)胎牛血清，1±0.2％(w/v)青链霉素，2±0.3mM L-谷氨酰胺，20±5ng/ml rhTPO和200±50ng/mlrhFLT-3，以及100±30ng/mL所述的多肽。

在另一优选例中，所述的培养基是STEMSFM；添加10±1％(v/v)胎牛血清，1±0.1％(w/v)青链霉素，2±0.2mM L-谷氨酰胺，20±5ng/ml rhTPO和200±30ng/mlrhFLT-3，以及100±20ng/mL所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种用于培养人造血干细胞或人造血祖细胞的试剂盒，所述的试剂盒中包括所述的多肽；或包括所述的培养基。

在本发明的另一方面，提供一种培养人造血干细胞或人造血祖细胞的方法，所述方法包括：利用所述的培养基培养人造血干细胞。

在一个优选例中，所述的方法为非疾病治疗方法。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、全长是rhSCF多肽的序列，下划线所示各区段(P0-P10)为设计并合成的11条多肽。

图2、11条多肽的ELISA实验结果，其中第0号多肽(P0，SEQ ID NO:2的肽)与抗rhSCF抗体呈现阳性反应，其余10条多肽均为阴性反应。

其中，Neg(Coating BSA)为包被BSA(不包被抗原)的阴性对照；Neg(w/o mAb)为包被第0号多肽，但不孵育抗rhSCF单克隆抗体(PBST代替)的阴性对照；Pos(Coating rhSCF)为包被全长rhSCF的阳性对照。

图3A、总细胞扩增倍数的统计结果。其中FT表示细胞培养基中添加Flt-3L和TPO这两种细胞因子，浓度分别为200ng/ml和20ng/ml。其中，P0指SEQ ID NO:2的肽。

图3B、CD34阳性细胞扩增倍数的统计结果。其中，P0指SEQ ID NO:2的肽。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种可有效地促进人造血干细胞的扩增的多肽，其来源于人干细胞因子，氨基酸序列短，易于人工合成；其可以作为rhSCF的替代产品，用于培养人造血干细胞，使得体外培养人造血干细胞的成本显著降低。

本发明的多肽

如本文所用，所述的“本发明的多肽”、“活性多肽”、“短肽”、“SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的多肽”可互换使用。

本发明中，“分离的多肽”是指多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质，本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该多肽，基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上产生单一的主带。

本发明的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所述的多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。优选合成多肽。

基于本发明的活性多肽进行修饰后获得的多肽也被包含在本发明中。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本领域技术人员均了解，除甘氨酸外，多数氨基酸的α-碳原子为不对称碳原子(即与α-碳原子键合的四个取代基各不相同)，因此氨基酸可以有立体异构体，即可以有D-型与L-型两种构型。本发明的活性多肽可以是由D-型氨基酸构成的，也可以是由L-型氨基酸构成的，或者同时含有D-型与L-型两种分类的氨基酸。

按本发明所提供的序列结构，可采用多种方法来制备本发明的多肽。所述的方法包括但不限于：化学合成法，重组法。考虑到多肽的长度较短，优选的是化学合成方法。一种制备方法例如包括步骤：

(1)根据所提供的氨基酸序列，通过化学合成法合成粗肽；和

(2)对步骤(1)获得的粗肽进行纯化，从而获得所述的多肽。

此外，在合成时，还可在多肽的氨基酸侧链还设置保护基团，这是本领域已知的技术。

所述的重组法通常是将所述核酸克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。鉴于本发明的多肽是氨基酸序列长度较短的，可以采取多拷贝串联表达的方式进行重组表达，这样可以获得较高的得率。

本发明的活性多肽具有促进人造血干细胞扩增的作用，并且，其还具有序列简单、合成方便等优点。

本发明的活性多肽可以作为rhSCF的替代品应用于临床和科研实践中，使得在体外扩增人造血干细胞的成本明显降低。

本发明还涉及一种多核苷酸，其编码所述的多肽，该多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

编码本发明的多肽的多核苷酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。目前，也已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的多肽的DNA序列。

本发明第一次提供如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽，因此，其作为一个全新的抗原，针对其的特异性抗体也是新颖的。这里，“特异性”是指抗体能识别和结合于本发明的多肽。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明中，所用的术语“多克隆抗体”(多抗)指一组与抗原有特异性结合能力的球蛋白，其是由抗原刺激机体，产生免疫学反应后，由机体的浆细胞合成并分泌的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。多克隆抗体的好处在于它们的效价高，特异性高，亲和力强，灵敏度好，便于人为处理和质量控制，此外，多克隆抗体制备相对容易，更为经济。多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。本发明的多肽，可被施用于动物(如兔，小鼠，大鼠等；较佳地是兔)以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本发明的多肽的细胞也可用来免疫动物来生产抗体。多克隆抗体可以用淋巴结注射法，皮下多点注射法，多途径联合注射法等免疫方法制得。

利用本发明的多肽，也可以生产单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

培养基及培养方法

本发明还提供了一种可用于培养人造血干细胞的培养基，所述的培养基含有有效量的本发明所述的多肽。

本发明的多肽，适用于作为全长rhSCF的替代品。因此，任何本领域公知应用于培养人造血干细胞的培养基、且其中全长rhSCF替换为本发明的多肽后获得的培养基均包含在本发明中。

作为本发明的优选方式，所述的培养基是STEMSFM；且其中添加10±2％(v/v)胎牛血清，1±0.2％(w/v)青链霉素，2±0.3mM L-谷氨酰胺，20±5ng/ml rhTPO和200±50ng/ml rhFLT-3，以及100±30ng/mL本发明所述的多肽。

本发明还提供了培养人造血干细胞的方法，所述方法包括：利用本发明所述的培养基培养人造血干细胞。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、多肽的设计

165aa的rhSCF多肽的全长氨基酸序列如下：

MEGICRNRVTNNVKDVTKLVANLPKDYMITLKYVPGMDVLPSHCWISEMVVQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNYSIIDKLVNIVDDLVECVKENSSKDLKKSFKSPEPRLFTPEEFFRIFNRSIDAFKDFVVASETSDCVVSSTLSPEKDSRVSVTKPFMLPPVA(SEQ ID NO:13)

如图1，基于含有165个氨基酸的rhSCF多肽(SEQ ID NO:13)，将该多肽序列进行分段，设计11条多肽。在设计时，每条多肽之间有3-5个氨基酸的重叠，分别标记为P0-P10。

P0：LPSHCWISEMVVQLSDSL(SEQ ID NO:1)；

P0(两端添加K)：KK LPSHCWISEMVVQLSDSL K(SEQ ID NO:2)；

P1：EGICRNRVTNNVKDVTKL(SEQ ID NO:3)；

P2：NNVKDVTKLVANLPK(SEQ ID NO:4)；

P3：LPKDYMITLKYVPGMDVLPSHCW(SEQ ID NO:5)；

P4：VQLSDSLTDLLDKFSNISEGLSNY(SEQ ID NO:6)；

P5：SNYSIIDKLVNIVDDLVECVKEN(SEQ ID NO:7)；

P6：VKENSSKDLKKSFKSPEPR(SEQ ID NO:8)；

P7：SPEPRLFTPEEFFRIFNRSIDA(SEQ ID NO:9)；

P8：RSIDAFKDFVVASETSDCVVSSTLSP(SEQ ID NO:10)；

P9：STLSPEKDSRVSVTKPFML(SEQ ID NO:11)；

P10：VSVTKPFMLPPVA(SEQ ID NO:12)。

这11条多肽覆盖rhSCF的全长。

这11条多肽分别通过人工合成的方法制备。针对图1中P0段，在合成时在两端多加了3个K(N端多两个K，C端多一个K)，构成SEQ ID NO:2序列，以使其在人工合成过程中，更容易合成和纯化。

实施例2、ELISA鉴定有结合活性的肽段

进行ELISA反应鉴定有活性的肽段，实验步骤如下：

(1)碳酸缓冲液稀释实施例1设计的各肽段，后按100μL/孔加入96孔板中，可在4℃下过夜也可37℃温育2小时，用封口胶包好96孔板防止水分蒸发。

(2)将96孔板中溶液倒出，拍干，按200μL/孔加入PBT洗板，每次5分钟，时间到后倒出溶液，拍干板，每次洗板过程重复3次。

(3)按200μL/孔加入BST封闭液，37℃下孵育60min，用封口胶包好96孔板防止水分蒸发。

(4)用准备好的96孔板按100μL/孔加入待测液(一抗，即抗rhSCF抗体)，37℃下孵育60min。用封口胶包好96孔板防止水分蒸发。

(5)洗板过程同上，按100μL/孔加入生物素化羊抗鼠IgG，37℃下孵育45min。

(6)洗板过程同上，按100μL/孔加入过氧化物酶偶联链霉素亲和素，37℃下孵育15min。

(7)洗板过程同上，按100μL/孔加入新配OPD显色液，避光反应，此过程时间不定，要对颜色进行观察，当颜色很明显时按100μL/孔加入1M HCl终止反应，静置5min后于酶标仪处读数测定490nm处OD值。

通过ELISA的方法，本发明人找到了这11条多肽中的0号多肽(P0，SEQID NO:2的肽)与抗rhSCF抗体呈现阳性反应，如图2。

实施例3、多肽的功能研究

采用免疫磁珠分选法从人脐带血中分离得到人脐带血造血干祖细胞。分离得到的细胞分成13组，每组3个孔，用低吸附24孔板培养，初始细胞数目为5万-8万/孔，初始细胞的CD34阳性率为90％-99％，每孔的培养基体积为1mL。培养基为STEMSFM，添加10％胎牛血清，1％青链霉素，2mM L-谷氨酰胺，20ng/ml rhTPO和200ng/ml rhFLT-3。第一组为阴性对照组，加入与后面各组相同体积的PBS，第二组为阳性对照组，即在上述培养基的基础上加入100ng/mL的165aa的rhSCF多肽，第三组加入100ng/mL的P0多肽，第4至第13组依次加入第1号多肽到第10号多肽，浓度均为100ng/mL。所有的组在二氧化碳培养箱中培养3天，然后进行细胞换液，以保持细胞生长足够的营养，在第6天，所有的组的细胞进行细胞计数，并进行流式检测所有细胞中CD34阳性细胞的比例，依此确定总细胞数量和CD34阳性细胞的数量。

实验结果显示，第1号多肽到第10号多肽均和阴性对照组没有差异，第0号多肽组在总细胞和CD34阳性细胞的扩增倍数上均相对于阴性对照组具有显著性差异(P<0.05)(图3)。说明P0对于人脐带血造血干细胞体外扩增具有显著的促进的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ IDNO: 2所示。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的多肽。

3.权利要求1任一所述的多肽的用途，其特征在于，用于促进人造血干细胞或人造血祖细胞的扩增，其中，所述的人造血干细胞或人造血祖细胞是离体的细胞。

4.一种用于培养人造血干细胞或人造血祖细胞的培养基，其特征在于，所述的培养基中包含权利要求1所述的多肽。

5. 如权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述的培养基是STEM PRO®-34 SFM；添加10±2%(v/v)胎牛血清，1±0.2%(w/v)青链霉素，2±0.3mM L-谷氨酰胺，20±5 ng/mlrhTPO和200±50 ng/ml rhFLT-3，以及100±30ng/mL 权利要求1所述的多肽。

6. 如权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述的培养基是STEM PRO®-34 SFM；添加10±1%(v/v)胎牛血清，1±0.1%(w/v)青链霉素，2±0.2mM L-谷氨酰胺，20±5 ng/mlrhTPO和200±30 ng/ml rhFLT-3，以及100±20ng/mL权利要求1所述的多肽。

7.一种用于培养人造血干细胞或人造血祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求1所述的多肽；或包括权利要求4-6任一所述的培养基。

8.一种培养人造血干细胞或人造血祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求4-6任一所述的培养基培养人造血干细胞。