JP2017526649A - ｒＨｕ−ＧＣＳＦの精製のための新規プロセス - Google Patents

Abstract

本発明は、新規のスケーラブルかつ工業的に実行可能な組換えヒトＧ−ＣＳＦの精製のための下流プロセスを提供する。

Description

本発明は、タンパク質の精製のための新規プロセスに関する。より具体的には、本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（ｒＨｕ−ＧＣＳＦ）の精製のためのプロセスに関する。

顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦ）は、顆粒球を産生してそれらを血流中に放出するよう骨髄を刺激する糖タンパク質である。生物学的治療法において、Ｇ−ＣＳＦは、新生児感染症の治療、好中球減少症に罹患する患者における顆粒球輸血、重度の感染症及び敗血症、急性骨髄性白血病に有効性を示しており、必要不可欠な生物学的製剤となっている。商業的には、糖鎖を含まない大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）由来Ｇ−ＣＳＦ（非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦ：フィルグラスチム、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、Ａｍｇｅｎ）、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞由来ＣＳＦ（グリコシル化Ｇ−ＣＳＦ：レノグラスチム、Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａ ＵＫ Ｌｔｄ）を含む、２つの形態の組換えヒトＧ−ＣＳＦが利用可能である。

フィルグラスチムは、１８，８００ダルトンの分子量を有する、水溶性の１７５個のアミノ酸からなるタンパク質である。フィルグラスチムは、ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子を含有する遺伝子操作プラスミドで形質転換した大腸菌の菌株の細菌発酵から得られる。Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性は、前駆体「幹細胞」の刺激及び種々の血液細胞株への分化、分化した血液細胞株の増殖の刺激、ならびに増殖した細胞株から成熟血液細胞への最終分化の刺激を含む。

組換えタンパク質の高レベルの発現が不溶性凝集体である封入体（ＩＢ）の形成をもたらすため、また組換えタンパク質は、タンパク質を生物学的に活性な、さらなる精製ステップに適したものにするための付加的な下流ステップを必要とする生物学的に不活性な形態で存在するため、宿主系として微生物を使用する治療用組換えタンパク質の生成は、しばしば困難である。さらに、初期回収、可溶化、及び再生ステップに関係する問題のために、ＩＢからタンパク質を回収することは困難であることが多い。封入体からの組換えタンパク質の生成は、単純かつ費用対効果の高い下流プロセスが開発され得れば、実行可能であり得る。

生物医薬品に対する需要の拡大は、生物学的タンパク質の上流プロセス及び下流プロセスの両方における進歩を促した。過去数年で細胞の培養力価が大きく向上し、このことが、生物医薬品の開発の中心を下流プロセスに関する商業上の懸念を改善することに向かわせた。タンパク質生物製剤は、典型的には一連の不純物とともに生成される。これらは、宿主細胞に関連する不純物、プロセス不純物、及び生成物に関連する不純物／変異体を含む。これらのうち、生成物に関連する不純物／変異体は、それらの物理化学的特性が生成物自体に極めて類似しているため除去することが困難であるが、これらの不純物／変異体は、標的治療剤の生物学的活性に重大な影響を及ぼし得る。

前述の変異体／不純物は、Ｇ−ＣＳＦのメチオニン（Ｍｅｔ）残基の異なる酸化形態を含む。Ｇ−ＣＳＦタンパク質は、Ｍｅｔ１位、Ｍｅｔ１２２位、Ｍｅｔ１２７位、及びＭｅｔ１３８位に４つのメチオニン残基を含有することが知られている。異なる酸化条件では、４つのメチオニン残基の各々が異なる速度で酸化するが［Ｍｅｔ１＞Ｍｅｔ１３８＞Ｍｅｔ１２７＞Ｍｅｔ１２２］、それは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のクロマトグラムによって天然型Ｇ−ＣＳＦに分離され得ることが観察されている。さらに、天然型Ｇ−ＣＳＦのミスフォールディングによって形成されるＧ−ＣＳＦの還元形態及び凝集形態等の不純物は、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて付加的なピークを示す。これら及び他の形態のそのような望ましくないＧ−ＣＳＦは、天然型Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性の低下を引き起こす。したがって、治療タンパク質の医薬開発において、精製プロセス中にそのような不純物を除去することが非常に重要である。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、天然型と同じ生物学的活性を有するが、時には患者の免疫原性反応を引き起こし得るＧ−ＣＳＦのＮ−ホルミルメチオニン変異体の余分なピークも、天然型Ｇ−ＣＳＦとともに観察される。Ｎ−ホルミルメチオニン変異体は、組換えタンパク質の高レベル発現に起因する、大腸菌のｄｅｆ遺伝子によるホルミル基の部分的保持の結果である。この変異体もまた不純物であり、除去する必要がある。したがって、その効果的な除去が、治療タンパク質の細菌に基づく生成のための精製プラットフォームの主要目的である。

前述の生成物に関連する不純物を除去するために、生成物と樹脂、例えば、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）（陽イオン交換及び金属親和性相互作用）、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（陽イオン交換及び疎水性相互作用）、カプト・アドヘア（Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ）（陰イオン交換及び疎水性相互作用）、及びＨＥＡ／ＰＰＡ等との間の相互作用の組み合わせを提供する樹脂の使用に関与する、マルチモーダルクロマトグラフィー等の種々のクロマトグラフィー技術が先行技術において使用された。これらの樹脂は全て、効果的であり、異なる選択性を提供するが、従来のイオン交換及び疎水性樹脂と比較した場合に費用が高く、したがって最終生成物のコストを増加させる。さらに、マルチモード樹脂によるプロセスパラメータの最適化は、面倒で時間のかかるプロセスであり、プロセスの開発時間、及びその後のクロマトグラフィーの実行時間を増加させる。

過去数年において、治療用Ｇ−ＣＳＦの開発及び製造は、多数の精製スキームに関与している。例えば、ＷＯ１９８７／０３６８９は、組換え型Ｇ−ＣＳＦの単離及び精製のために免疫親和性クロマトグラフィーの使用を開示しているが、これは、それ自体の規制上の懸念をもたらすため、商業生産のために広く受け入れられている手法ではない。また、免疫親和性クロマトグラフィー培地のコストは、それらの調製にモノクローナル抗体を使用するため、従来のクロマトグラフィーマトリックスと比較して非常に高い。

欧州特許第ＥＰ２３４１０６１号は、Ｇ−ＣＳＦの調製のために、２つのゲル濾過クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含む一連の４つのクロマトグラフィーステップに関与する精製プロセスを開示している。

別の欧州特許である第ＥＰ１９０４５２２号は、主として３つのクロマトグラフィーステップ、すなわち、２つの陽イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーに関与するＧ−ＣＳＦの精製に使用される精製プロセスを開示している。

ＷＯ２００１／０４１５４は、Ｇ−ＣＳＦを精製するために疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィーを含む精製プロセスを開示している。大腸菌由来のＧ−ＣＳＦ、封入体の可溶化、及びＧ−ＣＳＦのリフォールディングは、考えられるさらなるステップである。商業規模では、複数ステップのプロセスに起因して最終収率が大幅に減少する。したがって、より短時間でより高い収率を有する、より少ないステップを伴う簡素化されたプロセスが必要とされる。

従来技術において、記載される精製プロセスは、複雑で時間がかかり、精製されたＧ−ＣＳＦを得るために複数のクロマトグラフィーステップを含む。さらに、以前のプロセスのいずれからも、工業規模での安定な生成物の一貫した製造を保証できる、Ｇ−ＣＳＦの生成のための基本的で堅実な、商業的に実用的な戦略は解明されなかった。その後、Ｇ−ＣＳＦの生成に関する重大な課題を克服するために、Ｇ−ＣＳＦの高い回収率のための、単純でスケーラブルであり、商業的に実行可能な、より安定したプロセスが現在までに開発され、本発明に開示されている。本発明のプロセスは、より高い収率及び純度を有するＧ−ＣＳＦを工業規模で製造するための、合理化され、独立した、ロバストかつスケーラブルな下流プロセスステップを含む。

発明の目的
本発明の目的は、高効率でロバストな、経済的かつスケーラブルな組換えヒトＧ−ＣＳＦの精製のための下流プロセスを提供することである。

本発明は、新規のスケーラブルかつ工業的に実行可能な組換えヒトＧ−ＣＳＦの精製のための下流プロセスを提供する。

添付の図面を以下の通り記載する。

ｒＨｕ−ＧＣＳＦの可溶化ＩＢのＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。 ｒＨｕ−ＧＣＳＦの酸性化したリフォールディング溶液のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。 可溶化、リフォールディング、及び酸性化したｒＨｕ−ＧＣＳＦ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。 イオン交換クロマトグラフィー−Ｉ溶出のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。 疎水性相互作用の溶出液のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。 精製ｒＨｕ−ＧＣＳＦタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。 精製ｒＨｕ−ＧＣＳＦタンパク質のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。 精製ＰＥＧ−ＧＣＳＦタンパク質のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。 精製ＰＥＧ−ＧＣＳＦタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。

本発明は、Ｇ−ＣＳＦを産生する微生物からの組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の単離及び精製のためのプロセスを開示する。組換えプラスミドまたはウイルスＤＮＡベクターで形質転換または形質導入された宿主細胞は、生物学的に活性なヒトＧ−ＣＳＦまたはヒトＧ−ＣＳＦの遺伝子操作変異体を発現する。発現されたタンパク質は、本発明に記載される新規方法を用いて精製される。Ｇ−ＣＳＦの全てまたは一部をコードするＤＮＡ配列は、選択された非哺乳動物宿主による発現のために「好ましい」コドンの組込みを含む。ＧＣＳＦ遺伝子は、シャトルプラスミドに挿入して増幅することができる。ＧＣＳＦオープンリーディングフレームを含む設計されたベクターは、次いで、化学的にコンピテントな宿主細胞に形質転換して単離することができる。

次いで、ｐＨ５〜８で２０℃〜４０℃、より好ましくはｐＨ７．０〜７．５で２５℃〜３０℃の範囲の制御温度下にある発酵槽で細胞を増殖させてもよい。このようにして得られたバイオマスを、本出願に記載される新規単離及び精製プロセスに供して精製されたＧＣＳＦを得ることができる。

Ｇ−ＣＳＦの単離及び精製のための新規プロセスであって、
ｉ．大腸菌の高細胞密度発酵及び封入体の単離によるｒＨｕ−ＧＣＳＦの生成ステップと、
ｉｉ．Ｇ−ＣＳＦを放出するための、ステップ（ｉ）から得られた封入体の可溶化ステップと、
ｉｉｉ．ステップ（ｉｉ）から得られたＧ−ＣＳＦタンパク質のリフォールディングステップと、
ｉｖ．ステップ（ｉｉｉ）から得られたＧ−ＣＳＦタンパク質の清澄及び精製ステップと、
ｖ．任意選択的に、ステップ（ｉｖ）から得られた精製されたＧ−ＣＳＦをＰＥＧに結合させるステップと、
ｖｉ．任意選択的に、ステップ（ｖ）から得られた結合（ペグ化）Ｇ−ＣＳＦを、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するステップと、を含み、
可溶化された封入体から精製されたＧＣＳＦを得るためのプロセスの収率は５０〜７０％の範囲であり、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析されるＧ−ＣＳＦの純度は９８％以上であり、
凝集体等の不純物の合計は２％以下である。ＲＰＨＰＬＣによって分析した場合のＧ−ＣＳＦの純度は９６．５％以上であり、
酸化ＧＣＳＦ、還元ＧＣＳＦ、ｆ−ｍｅｔ ＧＣＳＦの合計は３．５％以下であり、
ＧＣＳＦからＰＥＧ−ＧＣＳＦを生成するプロセスの収率は６０〜７５％の範囲であり、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した場合のＰＥＧ−ＧＣＳＦの純度は９５％以上である。

大腸菌の高細胞密度発酵及び封入体の単離によるｒＨｕ−ＧＣＳＦの生成
本発明のＧＣＳＦの精製は、発酵ブロスの可溶性画分と微粒子画分とを分離してバイオマスを収集することによるｒＨｕ−ＧＣＳＦの生成によって実行されてもよい。分離は、好ましくは遠心分離、濾過によって、より好ましくは遠心分離によって行われてもよい。

分離された細胞は、ｐＨ７〜９の溶解緩衝液を使用することによってさらに溶解されてもよく、より好ましくは、溶解緩衝液のｐＨはｐＨ７．５〜８．５である。細胞溶解の後に、封入体の単離が続いてもよい。

単離は、好ましくは、実験室規模の超音波破砕機、高圧細胞ホモジナイザー、遠心分離、濾過、より好ましくは、実験室規模の超音波破砕機及び高圧細胞ホモジナイザーの組み合わせからなる群から選択される計器を使用して、個々にまたは組み合わせて行われてもよい。

単離された封入体は、好ましくは、トリス−ＥＤＴＡ−トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）緩衝液、トリス−ＥＤＴＡ−ＤＯＣ緩衝液、トリス−ＮａＣｌ−尿素緩衝液、トリス緩衝液、トリトンＸ−１００からなる群から選択される緩衝液でさらに洗浄されてもよく、好ましくは、緩衝液は、トリス−ＥＤＴＡ、尿素、ＮａＣｌ、及びトリトンＸ−１００の混合物である。トリスの濃度は、３０〜５０ｍＭの範囲で存在し、ＥＤＴＡは３〜７ｍＭの範囲であり、尿素は０．１〜０．５Ｍの範囲であり、ＮａＣｌは１〜２Ｍの範囲であり、トリトンＸ１００は０．８〜１．５％の範囲である。洗浄緩衝液のｐＨは、７．５〜８．５の範囲に維持されてもよい。洗浄緩衝液の温度は、２０〜２５℃の範囲に維持されてもよく、インキュベーション時間は６０〜９０分の範囲である。

本発明の細胞溶解剤及び洗浄緩衝液の選択は、封入体のより高い回収率を可能にするような選択である。

組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒＨｕ−Ｇ−ＣＳＦ）を放出するための、ステップ（ｉ）から得られた封入体の可溶化
細菌封入体の可溶化は、適切に最適化されなければ、さらなるプロセスステップの収率及び精製されるタンパク質の品質にまで影響を及ぼし得る重大なステップである。

単離された封入体は、尿素、緩衝液、及びアルカリｐＨの還元剤の可溶化混合物中で可溶化されてもよい。

上記還元剤は、好ましくは、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システインを含む群から選択されてもよく、より好ましくは、還元剤はシステインであり、２０〜１００ｍＭの範囲で存在する。還元剤は、８〜１１の範囲のｐＨで４５〜１２０分間、より好ましくは９〜１０のｐＨで６０分間加えられてもよい。本発明の還元剤の選択は、可溶化が２〜３時間で達成されるような選択である。還元剤は、好ましくは可溶化の６０分後に加えられてもよく、可溶化は、還元剤の存在下で約６０分間継続される。また、選択される還元剤の濃度は、リフォールディング緩衝液にいずれの還元剤も加える必要がないように最適化される。

緩衝液は、トリス、ＥＤＴＡ、尿素、及びそれらの混合物を含む群から選択され、好ましくは、緩衝液は混合物であり、尿素の濃度は６〜８Ｍの範囲で存在し、トリスは２０〜５０ｍＭの範囲であってもよく、ＥＤＴＡは２〜７ｍＭの範囲であってもよく、緩衝液のｐＨはｐＨ１０に維持されてもよく、可溶化混合物のｐＨは、９．５〜１０．５の範囲に維持されてもよい。

可溶化された封入体溶液は、８，０００〜１５，０００ｇで１０〜３０分間、より好ましくは１０，０００〜１２，０００ｇで３０分間の遠心分離によって清澄されてもよい。

ｒＨｕ−ＧＣＳＦの可溶化ＩＢの純度は、図１に表されるようにＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルによって推定されてもよい。放出されたＧ−ＣＳＦの純度は、２５〜５０％の範囲であることが分かる。

ステップ（ｉｉ）から得られたＧＣＳＦタンパク質のリフォールディング
タンパク質をリフォールディングするために使用されるリフォールディング緩衝液は、通常、リフォールディング溶液の伝導率を増加させるために塩酸グアニジニウム及びアルギニン等の化学物質からなる。このリフォールディング溶液の処理は、しばしば、イオン交換クロマトグラフィーステップの前に限外濾過／透析濾過ステップを有する必要性を要し、下流プロセス操作に余計な時間、複雑性、及び支出が加わる。これらの制約に留意して、本発明のリフォールディングプロセスは、いずれの余分な調整ステップも行うことなく、リフォールディング溶液をイオン交換クロマトグラフィーに直接充填することができるように開発される。

タンパク質リフォールディングは、一般的に、非常に低いタンパク質濃度で行われるため、大量のリフォールディング緩衝液を必要とする。最も一般的に使用されるリフォールディング緩衝液の構成成分はアルギニンであるが、これは、大量のリフォールディング緩衝液に使用される非常に高価な成分であるだけでなく、リフォールディング溶液の高い伝導率にも寄与し、緩衝液をイオン交換クロマトグラフィーに充填することを不適合にする。したがって、本発明は、下流プロセスのより高い全収率に寄与する新規かつ進歩性のあるリフォールディング手法を用いる。また、本発明において請求される新規構成成分は、プロセスを経済的にし、プロセスにおける余分な単位操作を回避する。

リフォールディングのために、清澄された可溶化封入体溶液が、任意選択的に酸化剤を含む、尿素及びソルビトールを含有するリフォールディング緩衝液によって希釈されてもよい。

上記酸化剤は、好ましくは、シスチン、システイン、酸化グルタチオン（ＧＳＳＨ）、シスタミンからなる群から選択されてもよく、より好ましくは、酸化剤はシスチンである。

酸化剤の量は、好ましくは０〜５ｍＭの範囲であってもよく、より好ましくは、シスチンの量は０〜３ｍＭの範囲である。

本発明の酸化剤の選択は、８５〜９５％のより高いリフォールディング収率及び４０〜７０％のＲＰ−ＨＰＬＣ純度が達成され得るような選択である。

リフォールディングは、室温または２〜８℃で１４〜２８時間の期間にわたって、より好ましくは室温で１２〜１８時間行われてもよい。

リフォールディングされたタンパク質溶液は、任意選択的に酸性化剤の存在下で酸性化されてもよい。上記酸性化剤は、好ましくは、酢酸ナトリウム、酢酸、塩酸、オルトリン酸からなる群から選択されてもよく、より好ましくは、酸性化剤は塩酸である。

酸性化したリフォールディング溶液のｐＨは、ｐＨ３．０〜５．５の範囲に調整され、２０〜６０分間維持されてもよく、より好ましくは、３．５〜４．５の範囲のｐＨに３０〜４５分間維持されてもよい。

リフォールディングステップの収率は、好ましくは５０〜９０％の範囲であり、より好ましくは、収率は６０〜８５％である。

酸性化したリフォールディングＧＣＳＦの純度は、図２に表すように、ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルによって推定されてもよい。

可溶化溶液、リフォールディング溶液、酸性化溶液、及びイオン交換クロマトグラフィー溶出液は、図３に表すように、ｒＨｕ−ＧＣＳＦに関連する低分子量及び高分子量の不純物を特徴付けるためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されてもよい。

ステップ（ｉｉｉ）から得られた酸性化Ｇ−ＣＳＦタンパク質の清澄及び精製
酸性化したリフォールディングＧ−ＣＳＦタンパク質溶液は、任意選択的に、精製のためにクロマトグラフィーに供する前に、形成され得るあらゆる沈殿物及び微粒子状物質を除去するために濾過及び／または遠心分離に供されてもよい。

Ｇ−ＣＳＦは、リフォールディングプロセスの間に沈殿する場合があり、リフォールディング後の清澄を困難にする濁り／曇りの原因となり得る。沈殿の程度は、可溶化とそれに続くリフォールディング戦略に依存する。そのような多くの場合、タンパク質溶液の清澄は、プロセス流に存在する広範囲の粒径及び種類に起因して濾過ステップを含む。

全体的な生成コストを最小限に抑えるために、清澄、微粒子除去、及び／またはバイオバーデン減少の単一ステップに近づくことが好ましい。また、プロセスにおける単位操作及びプロセス機器のサイズの選択に大きく依存する、より小さく、より柔軟性のある、費用対効果の高い製造設備を有することが有利である。

上記清澄は、限外濾過、透析濾過、精密濾過、深層濾過、接線流濾過、全流濾過、及び遠心分離、好ましくは精密濾過及び遠心分離を含む群から選択されてもよい。

上記遠心分離プロセスは、バッチモード及び連続モードから選択されてもよく、好ましくは、遠心分離プロセスは連続プロセスである。

種々の分離技術が、タンパク質をその物理的特性及び化学的特性に依存して精製するために使用される。

天然型組換えＧＣＳＦタンパク質生成物のメチオニン酸化、還元、及びｆ−Ｍｅｔ形態は、特定の生成物変異体であり、大腸菌等の発現系に関連する不純物であると考えられる。そのような生成物変異体は、それらの構造的及び機能的態様において天然型タンパク質とは異なり、患者において生物学的活性の喪失及び免疫原性反応を引き起こし得る。本発明は、これらの生成物変異体の選択的な除去のために、２つのクロマトグラフィーステップによる精製プロセスを開示する。密接に関連する生成物変異体の分離における特有の選択性は、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるｐＨ及び塩に基づく溶出勾配を組み合わせて用いることで得ることができる。プロセスに関連する不純物の完全な除去は、２ステップ精製プロセスにおいても達成される。

現在のところ、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）が、その高い能力及びスケーラビリティに起因して生物学的製剤の精製プロセスの骨格を形成しているが、種々の生成物の不純物／変異体の選択的な除去は、若干限定されている。

本発明において、タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーと、それに続く疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製されてもよく、プロセス及び生成物に関連する不純物は、ｐＨ勾配及び塩勾配の組み合わせを用いて、高いプロセス収率を有する許容できる限界まで除去される。

酸性化したリフォールディング溶液は、イオン交換クロマトグラフィーに供することによって精製されてもよい。上記イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーのいずれかであってもよく、より好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィー、最も好ましくは弱陽イオン交換クロマトグラフィーであってもよい。精製のための陽イオン交換クロマトグラフィーは、固定相及び移動相をさらに含む。

陽イオン交換クロマトグラフィーの固定相は、ＳＰセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦ、ＣＭセファロースＦＦ、ＳＰセファロースＨＰ、フラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＳＯ３、フラクトゲルＳＥ Ｈｉ Ｃａｐ、より好ましくはＣＭセファロースＦＦを含む群から選択されてもよい。

陽イオン交換クロマトグラフィーの移動相または結合緩衝液は、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム、オルトリン酸、または混合物を含む群から選択され、好ましくは、混合物は酢酸ナトリウム及び酢酸を含む。移動相または結合緩衝液の濃度は２０〜５０ｍＭであり、ｐＨは３．５〜４．５の範囲である。

ＧＣＳＦタンパク質は、４．０〜６．０の範囲、好ましくは４．５〜５．６の範囲のｐＨの、酢酸ナトリウム、酢酸、及びＮａＣｌの混合物を含む緩衝液を使用して、陽イオン交換カラムから溶出される。溶出モードは、段階勾配、直線勾配、及び／または両方の組み合わせを含む群から選択され、好ましくは、溶出に使用される勾配は段階勾配である。

Ｇ−ＣＳＦを含有するリフォールディング及び酸性化された溶液は、例えば、ｐＨ３．０〜ｐＨ５．０の酸性条件下で陽イオン交換培地に適用されてもよく、例えば、ｐＨ４．０〜ｐＨ８の弱酸性から弱塩基性のｐＨで培地から溶出されてもよい。Ｇ−ＣＳＦは、４０〜５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）中でＮａＣｌまたは他の塩、例えば、０〜２００ｍＭのＮａＣｌの上昇勾配を用いて、弱酸性条件の陽イオン交換培地から溶出されてもよい。代替として、ｒＨｕ−Ｇ−ＣＳＦは、いずれかの塩を使用してまたは使用せずに、ｐＨ５．６〜６．２の４０〜５０ｍＭの酢酸ナトリウムを使用して、弱塩基性条件の陽イオン交換培地から溶出されてもよい。

溶出は、好ましくは１００〜２５０ｃｍ／時間、より好ましくは１５０〜２００ｃｍ／時間の流速で行われてもよい。動的結合能は、好ましくは１０〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５〜１８ｍｇ／ｍｌであってもよい。

イオン交換クロマトグラフィーステップの収率は、好ましくは７０〜９８％、より好ましくは９０〜９８％の範囲であってもよい。

本発明の陽イオン交換培地の選択は、少量のリフォールディング溶液を使用して培地が調整され、緩衝液交換クロマトグラフィーまたはＴＦＦを用いた透析濾過等の単位操作の使用を回避するような選択であってもよい。イオン交換溶出液の純度は、図４に表すように、ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルによって推定されてもよい。陽イオン交換クロマトグラフィーステップから得られるＧ−ＣＳＦのＲＰ−ＨＰＬＣ純度は、９０％〜９７％の範囲である。

ｒＨｕ−Ｇ−ＣＳＦを含有するイオン交換クロマトグラフィー溶出液は、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ７．０、より好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲の酸性条件下で、疎水性相互作用培地に適用されてもよい。

イオン交換クロマトグラフィー溶出液は、希釈溶液中の硫酸アンモニウムの有効濃度が０．５〜１．５Ｍの範囲、好ましくは０．７〜１．０Ｍの範囲に留まることを確実にするために、硫酸アンモニウムで希釈される。

本発明の疎水性相互作用培地または固定相は、フェニルセファロースＦＦ、ブチルセファロース、Ｎｕｖｉａｃ−Ｐｒｉｍｅ、ＨＥＡハイパーセル、ＰＰＡハイパーセル、フェニルセファロースＨＰ、ＭＥＰハイパーセル、及びカプト・アドヘア、好ましくはフェニルセファロースＦＦを含む群から選択されてもよい。

疎水性相互作用クロマトグラフィーの移動相または結合緩衝液は、４．５〜６の範囲のｐＨの、酢酸ナトリウム、酢酸、及び硫酸アンモニウムの混合物を含み、より好ましくは、ｐＨは５．２〜５．８の範囲である。

溶出は、好ましくは、９５〜３００ｃｍ／時間、より好ましくは１００〜２５０ｃｍ／時間の流速で行われてもよい。

精製されたＧＣＳＦタンパク質は、４〜６の範囲、より好ましくは４．０〜５．０の範囲のｐＨの、酢酸ナトリウム及び酢酸を含む移動相を使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーの固定相から溶出される。溶出モードは、段階勾配、直線勾配、及び両方の組み合わせを含む群から選択され、好ましくは、溶出に使用される勾配は段階勾配である。

溶出液は、９５〜３００ｃｍ／時間、好ましくは１００〜２５０ｃｍ／時間の流速で得られる。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ステップの収率は、好ましくは８０〜９０％の範囲であってもよい。疎水性相互作用クロマトグラフィーから得られるＧ−ＣＳＦタンパク質の純度は、９６．５％〜９９．５％の範囲である。

本発明の第２のクロマトグラフィーの選択は、達成されるＧＣＳＦの最終純度がｒＨｕ−ＧＣＳＦの薬学的調製物に必要とされる品質に合致するような選択である。ＨＩＣ溶出液の純度は、図５に表すように、ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルによって推定されてもよい。

ＨＩＣに充填されたＷａｓｈ−Ｉは、ｒＨｕ−ＧＣＳＦに関連する低分子量及び高分子量の不純物を特徴付けるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されてもよい。

結果は、２つのクロマトグラフィーステップによる精製後の生成物回収率が最大５０〜７０．０％であり、純度レベルが９８．０％超であることを示している。ｐＨに基づく溶出及び塩に基づく溶出の組み合わせを用いた種々の生成物変異体の選択的な除去、ならびにクロマトグラフィーステップの独立した選択を用いた宿主細胞不純物の除去は、本発明のプロセスの新規かつ進歩性のある特徴である。

疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出液は、任意選択的に製剤緩衝液中で交換される緩衝液であってもよい。生物学的に活性なＧ−ＣＳＦを含有する製剤緩衝液中でリフォールディングされたＧ−ＣＳＦは、０．５〜０．９ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．８５〜０．９０ｍｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を有する、医薬品グレードの組換えヒトＧ−ＣＳＦを生成するために滅菌濾過されてもよい。最終精製タンパク質の純度は、図６に表すように、ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルによって推定されてもよい。

本発明に記載されるプロセスによって得られる組換えヒトＧ−ＣＳＦは、血液学及び腫瘍学に関連する病状、例えば、好中球減少症、急性骨髄性白血病、ならびに本発明のＧ−ＣＳＦの投与で治療可能なヒト、動物、家禽、ブタ、ウマ、またイヌ及びネコにおける様々な感染症の治療に有用であり得る。

任意選択的に、ステップ（ｉｖ）から得られた精製されたＧ−ＣＳＦをＰＥＧに結合させる
精製されたｒＨｕ−ＧＣＳＦ（原薬）は、酸性ｐＨの好適な緩衝液中でポリエチレングリコールに結合させてもよい。

上記緩衝液は、好ましくは、酢酸ナトリウム、酢酸リン酸塩、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、フタル酸水素カリウム、四ホウ酸ナトリウム、より好ましくは酢酸ナトリウムを含む群から選択されてもよい。

上記結合反応のｐＨは、好ましくはｐＨ５．０〜５．８の範囲であってもよい。

上記結合反応は、結合反応に使用される精製されたｒＨｕ−ＧＣＳＦと比較して３〜５倍高い量（ｗ／ｗ）の２０ｋＤ ＰＥＧアルデヒドを加えることによって行われてもよい。

上記結合反応は、任意選択的に、好ましくは、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、ハイドロサルファイトナトリウム、より好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む群から選択される還元剤の存在下で行われてもよい。

還元剤は、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲の濃度、より好ましくは２０ｍＭで加えられてもよい。反応混合物は、室温で１２〜１８時間、より好ましくは１２〜１６時間撹拌されてもよい。モノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦの収率は、好ましくは６５〜８５％、より好ましくは７０〜７５％の範囲である。モノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦ反応混合物は、好ましくは、さらなる精製のために１〜１０℃で、より好ましくは２〜８℃で保存されてもよい。

ステップ（ｖ）から得られた結合（ペグ化）Ｇ−ＣＳＦを、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて任意選択的に精製する
結合させたペグ化Ｇ−ＣＳＦ混合物は、平衡化緩衝液で希釈されてもよく、ｐＨは３．５〜５．０の範囲に調整され、より好ましくは、ｐＨは４．０〜４．５に調整されてもよい。

上記希釈試料は、イオン交換クロマトグラフィー、より好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィーに供されてもよい。陽イオン交換クロマトグラフィーは、固定相または陽イオン交換培地、及び移動相または結合緩衝液を含み、固定相または陽イオン交換培地は、ＭａｃｒｏＣａｐ−ＳＰ及びＳＰセファロースＦＦ、フラクトゲルＳＯ３を含む群から選択され、好ましくは、固定相はＭａｃｒｏＣａｐ−ＳＰである。溶出緩衝液または溶出移動相は、酢酸ナトリウム、酢酸、塩化ナトリウム、及びそれらの混合物から選択され、好ましくは、移動相は混合物である。酢酸ナトリウムの濃度は１０〜５０ｍＭの範囲であり、塩化ナトリウムの濃度は０．２５〜０．７５Ｍである。溶出緩衝液または溶出移動相のｐＨは、３．５〜５の範囲で存在し、好ましくは、ｐＨは４．０〜４．５である。溶出モードは、段階勾配、直線勾配、及び両方の組み合わせを含む群から選択され、好ましくは、溶出に使用される勾配は段階勾配である。陽イオン交換クロマトグラフィーから得られるモノペグ化ＧＣＳＦの収率は８０〜９５％の範囲であり、好ましくは、範囲は８５〜９０％である。

精製されたモノペグ化ｒ−Ｈｕ−ＧＣＳＦは、１００〜１５０ｃｍ／時間、より好ましくは１００ｃｍ／時間の流速で溶出を行うことによってカラムから回収及び溶出されてもよい。

以下の分析方法を用いて、充填、フロースルー、洗浄、及び溶出を含む全てのクロマトグラフィー試料を分析してもよい。
ａ）同定のためのＲＰ−ＨＰＬＣ、及び図８に表されるような純度分析。
ｂ）図９に表されるような純度分析のためのＳＤＳ ＰＡＧＥ（還元）。
ｃ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法による総タンパク質

標的溶出画分は、好ましくはｐＨ３．０〜４．０の範囲のｐＨ、より好ましくはｐＨ４．０〜４．５の、酢酸ナトリウム及びソルビトールを含有するペグフィルグラスチムの所定の製剤緩衝液中で緩衝液交換されてもよい。

精製されたモノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦは、１０ｋＤａの限外濾過膜によって最大９〜１２ｍｇ／ｍｌまでさらに濃縮されてもよく、より好ましくは、精製されたモノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦは、１１．０〜１１．５ｍｇ／ｍｌの範囲に濃縮されてもよい。

したがって、得られた最終ＴＦＦ残余分は、目的とする品質の濾液を得るために０．２ミクロンで滅菌濾過されてもよく、生成物のホールドアップを回収するために滅菌濾過の間に製剤緩衝液によって希釈されてもよく、濾過は、＞１０ｍｇ／ｍｌのペグフィルグラスチム濃度で生成物を回収するように最適化されてもよい。

生成された最終精製モノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦは、次に使用されるまで、好ましくは１〜１０℃の範囲の温度、より好ましくは２〜８℃で保存されてもよい。

ＰＥＧ−ＧＣＳＦ濃縮溶液またはＰＥＧ−ＧＣＳＦ原薬またはＰＥＧ−ＧＣＳＦバルク原薬またはＰＥＧ−ＧＣＳＦ ＡＰＩを規格と照合して確認するために、以下の分析方法によって最終ＰＥＧ−ＧＣＳＦ濃縮溶液を分析してもよい。
ａ）外観及びｐＨ
ｂ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、Ｎ末端配列分析、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、及びペプチドマップによる同一性及び純度の確認
ｃ）ＥＬＩＳＡを使用したＨＣＰの決定
ｄ）規格通りの生物活性
ｅ）ｑ ＰＣＲを用いた宿主細胞ＤＮＡの定量
ｆ）ＬＡＬ試験を用いたエンドトキシンの定量
ｇ）分子ふるいＨＰＬＣによる凝集体
ｈ）ＲＰ−ＨＰＬＣによる関連不純物
ｉ）規格通りの無菌性

徹底した分析、及びイノベーター製品との物理的比較の後に、本発明に記載されるプロセスによって精製された生成物は、６５％超の全プロセス収率を有するイノベーター製品と非常に類似したＮ−末端モノペグ化ＧＣＳＦであると結論付けることができる。

本発明に記載されるプロセスを使用して得られるｒＨｕ−ＧＣＳＦ及びｒＨｕ ＰＥＧ−ＧＣＳＦ原薬は、研究論文及び最先端の組織内分析法を用いて徹底的に特徴付けられる。本明細書のプロセスを使用して得られるｒＨｕ−ＧＣＳＦ生成物は、以下の重要な品質特性を満たすが、表１及び表２に詳細に記される重要品質特性の結果に限定されるものではない。

表１及び表２から、本発明のプロセスによって得られたｒＨｕ−ＧＣＳＦ及びｒＨｕ ＰＥＧ−ＧＣＳＦは、はるかに低い不純度プロファイルとともに、より高い力価を有することが見て取れる。

本発明において、ｒＨｕ−ＧＣＳＦ（フィルグラスチム）及びＰＥＧ−ＧＣＳＦ（ペグフィルグラスチム）を得る精製プロセスにおける前述の改善は、予想されるより高い全生成物収率に加えて、ヒトによる介入、資本支出、及び運営コストの減少の観点から有益である。

一実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体中のＧ−ＣＳＦの薬学的組成物も開示する。これらの組成物は、血管内、腹腔内、皮下、筋肉内に、または医薬品分野で既知の形態を用いることによって投与されてもよい。血管内、腹腔内、皮下、筋肉内の場合、活性薬剤成分は、水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の好適な担体と組み合わされてもよい。

一実施形態において、本発明は、顆粒球の増殖及び分化のために、薬学的に許容される賦形剤を含む液体の非経口静脈内製剤中に本発明のプロセスから得られるＧ−ＣＳＦを含む薬学的組成物を提供する。

一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、
５％ソルビトール及び０．００４％ポリソルベート８０を含有する、ｐＨ４．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中に配合された本発明のプロセスから得られるＧ−ＣＳＦまたはフィルグラスチムを含む。

一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、

５％ソルビトール及び０．００４％ポリソルベート２０を含有する、ｐＨ４．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中に配合された本発明のプロセスから得られるＰＥＧ−ＧＣＳＦ／ペグフィルグラスチムを含む。

別の実施形態において、本発明は、顆粒球の増殖及び分化のために、請求項１に記載されるように液体の非経口静脈内製剤中に単離及び調製されたＧＣＳＦの使用を提供する。

本発明による発明は、本発明の範囲を限定すると見なされるべきではない以下の実施例によって例示され得る。

実施例−１：本発明のＧ−ＣＳＦの単離及び精製プロセス
ステップ１：大腸菌の高細胞密度発酵によるｒＨｕ−ＧＣＳＦの生成
好適な抗生物質を含有する前接種培地に、冷凍ストックから再生したペトリ皿の大腸菌細胞を接種する。培養物を３０℃で１２時間、２５０ｒｐｍでインキュベートする。好適な抗生物質を含有する基本培地に大腸菌を接種することによって前接種材料及びそれに続いて接種材料を調製し、３０℃で１２時間、２５０ｒｐｍでインキュベートする。６００ｎｍでの出発光学密度が約０．１になるように、調整済みの基本塩培地を含有する発酵槽に接種培養物を接種する。所望の光学密度_{６００ｎｍ}に達したら、１ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより培養を誘導する。誘導した流加培養中、誘導後に、誘導した大腸菌細胞を含有するブロスを、４℃及び６０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離によって回収する。回収した細胞ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。洗浄したペレット細胞をさらなる処理まで−８０℃で保存する。

ステップ２：細胞溶解、単離、及び封入体の洗浄
発酵から得られ、溶解緩衝液中で１５倍に希釈された冷凍細胞ペレット１９．０ｇは、１００ｍＭのトリス、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、及びｐＨ８．０を含む。溶液を室温（ＲＴ）で３０分間室撹拌し続ける。

３０分間撹拌した後、高圧ホモジナイザー（ＰＡＮＤＡ、Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ）を１０００バールで使用して、細胞懸濁液を高圧で均質化する。３回通過させる間に完全な細胞懸濁液を均質化する。６００ｎｍの光学密度で液滴を確認し、光学顕微鏡下で観察することにより、細胞溶解をモニタリングする。

溶解物を３回通過させた後、細胞可溶化液を１０，０００ｇの高速遠心分離に２０分間供する。上清をデカントすることにより、溶解した細胞ペレットを注意深く回収する。溶解ペレット及び上清の両方を還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。

遠心分離後に得られた溶解細胞ペレットを、２０ｍＭのトリス、１％トリトンＸ１００、５ｍＭのＥＤＴＡ、及びｐＨ８．０を含む洗浄緩衝液に再懸濁する。懸濁液を室温で３０分間室撹拌し続ける。３０分間インキュベーションし、洗浄緩衝液中で撹拌した後、懸濁液を１０，０００ｇの遠心分離に２０分間供する。上清を注意深くデカントすることにより、洗浄されたＩＢをペレット画分中に回収する。純度推定のために、洗浄されたＩＢ及び上清の両方を還元ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。洗浄された封入体（ＩＢ）は、次に使用するまで−８０℃で保存した。

ステップ３：ＧＣＳＦを放出するための封入体の可溶化
１ｇの封入体を計量し、５０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、及び８Ｍの尿素をｐＨ１０で含む２０ｍｌの可溶化緩衝液に可溶化した。１時間の可溶化後、４０ｍＭのシステインを加えてジスルフィド結合を還元し、ｐＨを１０．０に再調整し、連続的に撹拌しながら室温で６０分間可溶化を維持した。可溶化後、１１０００ｇの遠心分離を３０分間使用して、可溶化された封入体溶液を清澄した。

ステップ４：ＧＣＳＦタンパク質のリフォールディング
清澄及び可溶化された封入体溶液を、５０ｍＭのトリス、０．５Ｍの尿素、５％ソルビトール、及び２ｍＭのシスチンからなる１０体積のリフォールディング緩衝液中に徐々に加えることによりリフォールディングした。希釈はポンプを一定流速で使用して行われる。可溶化試料をリフォールディング緩衝液に加えた後、リフォールディングのために試料を一晩（約１６時間）室温（２５℃）に維持した。
ａ）純度分析のためのＳＤＳ ＰＡＧＥ（還元）
ｂ）同定及び純度分析のためのＲＰ−ＨＰＬＣ
ｃ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法による総タンパク質

ステップ５：酸性化したＧ−ＣＳＦタンパク質リフォールディング溶液の清澄
リフォールディングした清澄タンパク質溶液を、２０ｍＭの酢酸ナトリウムと等価の１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）の原液の添加により酸性化し、最終的に２Ｍの塩酸によってｐＨを最大ｐＨ４．０までに調整して３０分間維持した。

酸性化したリフォールディングＧ−ＣＳＦタンパク質溶液は、任意選択的に、クロマトグラフィーに供する前に、形成され得るあらゆる沈殿物及び微粒子状物質を除去するために濾過に供されてもよい。上記濾過は、好ましくは、限外濾過、透析濾過、精密濾過、深層濾過、接線流濾過、全流濾過、及び遠心分離、好ましくは精密濾過を含む群から選択されてもよい。

濾過による清澄が選択された場合、その選択は、直接充填できる程度までコロイド、凝集体、沈殿物、及び粒子を効果的に除去し、下流クロマトグラフィーカラムを保護する性能に基づいている。最終的な選択は、全体として最適な濾液の品質及び濾過のコストに基づいて行われる。フィルタの一般的な選択基準は以下の通りであるが、これらに限定されない。
ａ）流束
ｂ）スループット
ｃ）再利用可能性
ｄ）滅菌臭気
ｅ）非繊維放出
ｆ）濾液の品質
ｇ）濾過／Ｌ／ＲＵＮのコスト
ｈ）機器の設置面積

ステップ６：クロマトグラフィーによる精製
酸性化後、０．２μフィルタを用いた精密濾過により溶液を濾過して沈殿物を除去し、予め平衡化した２ｍｌの陽イオン交換カラムに充填した。４０ｍＭの酢酸ナトリウムからなる平衡化緩衝液（ｐＨ４．０）の５ＣＶでカラムを洗浄し、ＵＶ２８０からベースラインまでの吸光度を引き出した。４０ｍＭの酢酸ナトリウムを含有する洗浄緩衝液（ｐＨ５．５）でカラムをさらに洗浄し、生成物に関連する不純物を除去した。洗浄後、精製ｒＨｕ−ＧＣＳＦを回収し、４０ｍＭの酢酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウムからなる溶出緩衝液（ｐＨ５．４）を通過させることによってカラムから溶出させた。以下の分析方法を用いて、充填、フロースルー、洗浄、及び溶出を含む全てのクロマトグラフィー試料を分析する。

精製ｒＨｕ ＧＣＳＦを含有する陽イオン交換クロマトグラフィー溶出画分をプールし、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１．５Ｍの硫酸アンモニウムからなる緩衝液（ｐＨ５．４）で１：１に希釈した。希釈した溶液を０．２μフィルタで濾過して沈殿物を除去し、予め平衡化した１ｍｌのＨＩＣカラムに充填した。２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液及び０．８Ｍの硫酸アンモニウムからなる平衡化緩衝液（ｐＨ５．４）の５ＣＶでカラムを洗浄し、ＵＶ２８０からベースラインまでの吸光度を引き出した。標的タンパク質を回収し、２０ＣＶの２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を含む平衡化及び溶出緩衝液（ｐＨ４．０）の直線勾配を実行してカラムから溶出させた。

以下の分析方法を用いて、充填、フロースルー、洗浄、及び溶出を含む全てのクロマトグラフィー試料を分析する。
ａ）純度分析のためのＳＤＳ ＰＡＧＥ（還元）
ｂ）同定及び純度分析のためのＲＰ−ＨＰＬＣ
ｃ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法による総タンパク質
ｄ）ＥＬＩＳＡを使用したＨＣＰの決定
ｅ）ＬＡＬ試験を用いたエンドトキシンの定量

ステップ７：製剤緩衝液中における精製されたＧ−ＣＳＦの回収
精製された標的タンパク質を含有するＨＩＣ画分を、１０ｍＭのナトリウム（ｐＨ４．０）、５％ソルビトール、０．００４％ポリソルベート８０からなる所定の製剤緩衝液中で緩衝液交換し、１０ｋＤａの限外濾過膜を使用して最大１ｍｇ／ｍｌまでさらに濃縮した。最終ｒＨｕ−ＧＣＳＦ濃縮溶液を０．２ミクロンで滅菌濾過し、次に使用するまで２〜８℃で保存した。

Ｇ−ＣＳＦ濃縮溶液またはＧ−ＣＳＦ原薬またはＧ−ＣＳＦバルク原薬またはＧ−ＣＳＦ ＡＰＩを規格と照合して確認するために、以下の分析方法によって最終Ｇ−ＣＳＦ濃縮溶液を分析した。
ａ）外観及びｐＨ
ｂ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、Ｎ末端配列分析、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、及びペプチドマップによる同一性及び純度の確認
ｃ）ＥＬＩＳＡを使用したＨＣＰの決定
ｄ）規格通りの生物活性
ｅ）ｑ ＰＣＲを用いた宿主細胞ＤＮＡの定量
ｆ）ＬＡＬ試験を用いたエンドトキシンの定量
ｇ）分子ふるいＨＰＬＣによる凝集体
ｈ）ＲＰ−ＨＰＬＣによる不純物
ｉ）規格通りの無菌性

ステップ８：陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたペグ化Ｇ−ＣＳＦの結合及び精製
５％ソルビトール及び０．００４％Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中に１〜１．２ｍｇ／ｍｌ濃度で存在する精製ｒＨｕ−ＧＣＳＦを、ｐＨ５．０の１Ｍの酢酸ナトリウムの添加により約５．０のｐＨに調整する。最終緩衝液強度は、約５０ｍＭである。３倍量（重量ベース）のｍＰＥＧ−２０ｋＤａ−ＣＨＯを、ペグ化前の反応混合物中に存在するｒＨｕ−ＧＣＳＦの量まで反応混合物ｍＰＥＧ−２０ｋＤａ−ＰＥＧ−アルデヒドに加える。直ちに、２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム［Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ_３］を反応混合物に加える。反応混合物を室温［約２５℃］で一晩撹拌する。プロセス中、モノペグ化フィルグラスチムの割合を確認するために品質分析が行われ、１４時間後に概して７５〜８０％のモノペグ化フィルグラスチムが得られ、ｐＨ８．０の１Ｍのトリスで反応を停止させて、さらなる処理まで２〜８℃で保存する。

結合反応混合物を平衡化緩衝液で２０倍に希釈し、ｐＨを４．０に調整する。希釈した試料を、予め平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＭａｃｒｏＣａｐ ＳＰ）に１００ｃｍ／時間の線流速で充填する。２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）からなる平衡化緩衝液の５ＣＶでカラムを洗浄し、１００ｃｍ／時間の線流速でＵＶ２８０からベースラインまでの吸光度を引き出す。精製したＮ−末端モノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦを回収し、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌからなる溶出緩衝液（ｐＨ４．０）を１００ｃｍ／時間の線流速で１０ＣＶ、０〜１００％の直線勾配で通過させることによってカラムから溶出させる。

以下の分析方法を用いて、充填、フロースルー、洗浄、及び溶出を含む全てのクロマトグラフィー試料を分析する。
ｄ）純度分析のためのＳＤＳ ＰＡＧＥ（還元）
ｅ）同定及び純度分析のためのＲＰ−ＨＰＬＣ
ｆ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法による総タンパク質

クロマトグラフィー溶出液の標的画分を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、５％ソルビトール、０．００４％ポリソルベート２０を含有する緩衝液（ｐＨ４．０）中で緩衝液交換する。

緩衝液交換した試料を、１０ｋＤａの限外濾過膜を使用して最大約１１ｍｇ／ｍｌまでさらに濃縮する。最終ＴＦＦ残余分を、目的とする品質の濾液を得るために０．２ミクロンで滅菌濾過し、緩衝液を用いて希釈する。生成物のホールドアップを回収するための滅菌濾過の間に、＞１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＧＣＳＦ濃度で生成物を回収するように濾過を最適化する。最終生成物は、次に使用するまで２〜８℃で保存する。

ペグフィルグラスチム濃縮溶液またはペグフィルグラスチム原薬またはペグフィルグラスチムバルク原薬またはペグフィルグラスチムＡＰＩを規格と照合して確認するために、以下の分析方法によって最終ペグフィルグラスチム濃縮溶液を分析する。
ｊ）外観及びｐＨ
ｋ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、Ｎ末端配列分析、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、及びペプチドマップによる同一性及び純度の確認
ｌ）ＥＬＩＳＡを使用したＨＣＰの決定
ｍ）規格通りの生物活性
ｎ）ｑ ＰＣＲを用いた宿主細胞ＤＮＡの定量
ｏ）ＬＡＬ試験を用いたエンドトキシンの定量
ｐ）分子ふるいＨＰＬＣによる凝集体
ｑ）ＲＰ−ＨＰＬＣによる関連不純物
ｒ）規格通りの無菌性

本発明において、ＰＥＧ−ＧＣＳＦの精製プロセスにおける上述の改善は、最終生成物において予想されるより高い全生成物収率に加えて、ヒトによる介入、資本支出、及び運営コストの減少の観点から有益である。

Claims (13)

1. Ｇ−ＣＳＦの単離及び精製のためのプロセスであって、
   ｉ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の高細胞密度発酵及び封入体の単離によるｒＨｕ−ＧＣＳＦの生成ステップと、
   ｉｉ．Ｇ−ＣＳＦを放出するための、ステップ（ｉ）から得られた封入体の可溶化ステップと、
   ｉｉｉ．ステップ（ｉｉ）から得られた前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質のリフォールディングステップと、
   ｉｖ．ステップ（ｉｉｉ）から得られたＧ−ＣＳＦタンパク質の清澄及び精製ステップと、
   ｖ．任意選択的に、ステップ（ｉｖ）から得られた精製されたＧ−ＣＳＦをＰＥＧに結合させるステップと、
   ｖｉ．任意選択的に、ステップ（ｖ）から得られた前記結合（ペグ化）Ｇ−ＣＳＦを、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いることによって精製するステップと、を含み、
   前記プロセスの収率は５０〜７０％の範囲であり、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析されるＧ−ＣＳＦの純度は９８％以上であり、
   凝集体等の不純物の合計は２％以下であり、ＲＰＨＰＬＣによって分析されるＧ−ＣＳＦの純度は９６．５％以上であり、
   酸化ＧＣＳＦ、還元ＧＣＳＦ、ｆ−ｍｅｔ ＧＣＳＦの合計は３．５％以下であり、
   ＧＣＳＦからＰＥＧ−ＧＣＳＦを生成するプロセスの収率は６０〜７５％の範囲であり、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した場合のＰＥＧ−ＧＣＳＦの純度は９５％以上である、プロセス。
2. 存在する酸化ＧＣＳＦの量は１．５％未満であり、還元ＧＣＳＦは１％未満であり、ｆ−ｍｅｔ ＧＣＳＦは１．５％未満である、請求項１のステップ（ｖｉ）に記載のプロセス。
3. 存在する凝集体の量は２％未満である、請求項１のステップ（ｖｉ）に記載のプロセス。
4. ＧＣＳＦのプロセス収率は５０％以上であり、ＰＥＧ−ＧＣＳＦのプロセス収率は６０％以上である、請求項１のステップ（ｖｉ）に記載のプロセス。
5. 大腸菌の高細胞密度発酵によって生成される細胞は、溶解緩衝液によって溶解され、
   前記溶解緩衝液のｐＨは、７．５〜８．５の範囲であり、
   前記単離は、実験室規模の超音波破砕機、高圧細胞ホモジナイザー、遠心分離、及び濾過、または組み合わせ、好ましくは前記実験室規模の超音波破砕機と高圧細胞ホモジナイザーとの組み合わせを含む群から選択される計器によって行われ、
   前記単離された封入体は、トリス−ＥＤＴＡ−トリトン緩衝液、トリス−ＥＤＴＡ−ＤＯＣ緩衝液、トリス−ＮａＣｌ−尿素緩衝液、トリス緩衝液、及びトリトンＸ−１００、または混合物、好ましくはトリス−ＥＤＴＡ、尿素、ＮａＣｌ、及びトリトンＸ−１００の混合物を含む群から選択される緩衝液で洗浄され、
   前記トリスは３０〜５０ｍＭの範囲で存在し、ＥＤＴＡは３〜７ｍＭの範囲であり、尿素は０．１〜０．５Ｍの範囲であり、ＮａＣｌは１〜２Ｍの範囲であり、トリトンＸ１００は０．８〜１．５％の範囲であり、
   前記洗浄緩衝液のｐＨは７．５〜８．５の範囲であり、
   温度は２０〜２５℃の範囲であり、インキュベーション時間は６０〜９０分の範囲である、請求項１のステップ（ｉ）に記載のプロセス。
6. 前記単離された封入体は、尿素、緩衝液、及び還元剤の可溶化混合物中で可溶化され、
   前記還元剤は、２０〜１００ｍＭの範囲で存在するシステインであり、
   前記緩衝液は、トリス、ＥＤＴＡ、及び尿素の混合物であり、
   尿素の濃度は６〜８Ｍの範囲であり、トリスは２０〜５０ｍＭの範囲であり、ＥＤＴＡは２〜７ｍＭの範囲であり
   前記可溶化混合物のｐＨは９．５〜１０．５の範囲であり
   前記可溶化された封入体は、８０００〜１５０００ｇの範囲の遠心分離によってＧ−ＣＳＦタンパク質を放出するように清澄され、
   前記可溶化された封入体によって放出された前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度について推定され、
   放出されたＧ−ＣＳＦの前記純度は２５〜５０％の範囲であることが分かる、請求項１のステップ（ｉｉ）に記載のプロセス。
7. 前記リフォールディング緩衝液は、アルギニンを含有し、
   前記Ｇ−ＣＳＦ可溶化タンパク質は、尿素、ソルビトール、リフォールディング緩衝液、及び酸化剤を含むリフォールディング溶液中での希釈によってリフォールディングされ、
   前記酸化剤は、シスチン、システイン、酸化グルタチオン（ＧＳＳＨ）、シスタミンを含む群から選択され、好ましくは、前記酸化剤はシスチンであり、
   シスチンは０〜３ｍＭの範囲で存在し、
   尿素は０．４Ｍ〜１Ｍの範囲で存在し、
   前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度について推定され、
   Ｇ−ＣＳＦの前記純度は、４０〜７０％の範囲であり、
   リフォールディングされたＧ−ＣＳＦの収率は、８５％〜９５％の範囲であることが分かり、
   前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質溶液は、酸性化剤の存在下で酸性化され、
   前記酸性化剤は、酢酸ナトリウム、酢酸、塩酸、及びオルトリン酸を含む群から選択され、好ましくは、前記酸性化剤は塩酸であり、
   酸性化したリフォールディングタンパク質溶液のｐＨは、３．５〜４．５の範囲であり、
   前記リフォールディングステップの収率は、５０〜９０％の範囲であり、好ましくは、前記収率は６０〜８５％である、請求項１のステップ（ｉｉｉ）に記載のプロセス。
8. 前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質は、Ｇ−ＣＳＦタンパク質の溶出液を得るために清澄及び精製され、
   前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質溶液は、精製のためにクロマトグラフィーに供する前に、沈殿物及び微粒子状物質を除去する清澄のために濾過及び遠心分離に供され、
   前記清澄は、限外濾過、透析濾過、精密濾過、深層濾過、接線流濾過、全流濾過、及び遠心分離を含む群から選択され、好ましくは、前記清澄は精密濾過または遠心分離によって行われ、
   前記遠心分離プロセスは、バッチモード及び連続モードから選択され、好ましくは、前記遠心分離プロセスは連続モードであり、
   前記精製の方法は、２つのクロマトグラフィー法を含み、
   前記クロマトグラフィー法は、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用であり、
   前記イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーから選択され、好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィーであり、より好ましくは弱陽イオン交換クロマトグラフィーであり、
   前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、固定相及び移動相を含み、
   前記固定相は、ＳＰセファロースセファロースＦＦ、ＣＭセファロースＦＦ、ＳＰセファロースＨＰ、フラクトゲルＳＯ３、及びフラクトゲルＳＥ ＨｉＣａｐ、より好ましくはＣＭセファロースを含む群から選択され、好ましくは、前記固定相はＣＭセファロースＦＦであり、
   前記移動相は、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム、オルトリン酸、または混合物を含む群から選択され、好ましくは、混合物は酢酸ナトリウム及び酢酸を含み、
   移動相の濃度は２０〜５０ｍＭであり、ｐＨは３．５〜４．５の範囲であり、
   前記ＧＣＳＦタンパク質は、４．０〜６．０の範囲、好ましくは４．５〜５．６の範囲のｐＨの、酢酸ナトリウム、酢酸、及びＮａＣｌを含む緩衝液を使用して陽イオン交換カラムから溶出され、
   溶出モードは、段階勾配、直線勾配、及び両方の組み合わせを含む群から選択され、好ましくは、溶出に使用される勾配は段階勾配であり、
   前記溶出は、１００〜２５０ｃｍ／時間、より好ましくは１５０〜２００ｃｍ／時間の流速で行われ、
   溶出液の動的結合能は、１０〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜１８ｍｇ／ｍｌの範囲であり、
   陽イオン交換クロマトグラフィーステップからのＧ−ＣＳＦのＲＰ−ＨＰＬＣ純度は、９０％〜９７％の範囲であり、
   陽イオン交換クロマトグラフィーステップからの前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質の収率は、９０％〜９８％の範囲であり、
   ｒＨｕ−Ｇ−ＣＳＦを含有するイオン交換クロマトグラフィー溶出液は、ｐＨ２．０〜７．０、好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲の酸性条件下で、疎水性相互作用クロマトグラフィーの固定相に適用され、
   希釈溶液中の硫酸アンモニウムの有効濃度が０．５〜１．５Ｍの範囲、好ましくは０．７〜１．０Ｍの範囲に留まることを確実にするために、前記イオン交換クロマトグラフィー溶出液が硫酸アンモニウムで希釈され、
   イオン交換クロマトグラフィーは、固定相及び移動相を含み、
   前記硫酸アンモニウムで処理されたＧ−ＣＳＦを含有するイオン交換クロマトグラフィー溶出液は、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ７．０、より好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の範囲の酸性条件で疎水性相互作用クロマトグラフィーの固定相に適用され、
   前記固定相は、フェニルセファロースＦＦ、ブチルセファロース、Ｎｕｖｉａｃ−Ｐｒｉｍｅ、ＨＥＡハイパーセルハイパーセル、ＰＰＡハイパーセルハイパーセル、フェニルセファロースＨＰ、ＭＥＰハイパーセル、及びカプト・アドヘア、好ましくはフェニルセファロースＦＦを含む群から選択され、
   疎水性相互作用クロマトグラフィーの移動相は、４．５〜６、より好ましくは５．２〜５．８の範囲のｐＨの、酢酸ナトリウム、酢酸、及び硫酸アンモニウムの混合物を含み、
   前記溶出は、９５〜３００ｃｍ／時間、好ましくは１００〜２５０ｃｍ／時間の流速で行われ、
   前記精製されたＧＣＳＦタンパク質は、４〜６、より好ましくは４．０〜５．０の範囲のｐＨの、酢酸ナトリウム及び酢酸を含む移動相を使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーの前記固定相から溶出され、
   溶出モードは、段階勾配、直線勾配、及び両方の組み合わせを含む群から選択され、好ましくは、溶出に使用される勾配は段階勾配であり、
   前記溶出液は、９５〜３００ｃｍ／時間、好ましくは１００〜２５０ｃｍ／時間の流速で得られ、
   疎水性相互作用クロマトグラフィーから得られるＧ−ＣＳＦタンパク質の純度は、９６．５％〜９９．５％の範囲であり、
   疎水性相互作用クロマトグラフィーから得られる前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質の収率は、８０％〜９０％の範囲である、請求項１のステップ（ｉｖ）に記載のプロセス。
9. 前記精製されたＧ−ＣＳＦタンパク質を、任意選択的に緩衝液中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合させ、
   前記緩衝液は、酢酸ナトリウム、酢酸リン酸塩、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、フタル酸水素カリウム、四ホウ酸ナトリウムを含む群から選択され、好ましくは、前記緩衝液は酢酸ナトリウムであり、
   前記結合反応のｐＨは、ｐＨ５．０〜５．８の範囲であり、
   前記結合反応は、３〜５倍高い量（ｗ／ｗ）の２０ｋＤ ＰＥＧアルデヒドを加えることによって行われ、
   前記結合反応は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、ハイドロサルファイトナトリウムを含む群から選択される還元剤の存在下で行われ、好ましくは、前記還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムであり、
   前記還元剤は、１０〜３０ｍＭの範囲で存在し、好ましくは、前記還元剤は２０ｍＭであり、
   反応混合物は、室温で１２〜１８時間、好ましくは１２〜１６時間撹拌され、
   結合反応からのモノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦの収率は、６５〜８５％の範囲であり、好ましくは、前記収率は７０〜７５％であり、
   前記モノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦ反応混合物を保存するための温度は、１〜１０℃の範囲であり、好ましくは、前記温度は２〜８℃である、請求項１のステップ（ｖ）に記載のプロセス。
10. 前記結合させたペグ化Ｇ−ＣＳＦタンパク質は、任意選択的に、陽イオン交換クロマトグラフィーによってモノペグ化Ｇ−ＣＳＦを得るために精製され、
    前記結合させたペグ化Ｇ−ＣＳＦは、ｐＨを３．５〜５．０の範囲に調整するように平衡化緩衝液で希釈され、好ましくは、前記ｐＨは４．０〜４．５の範囲に調整され、
    前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、固定相及び移動相を含み、
    前記固定相は、ＭａｃｒｏＣａｐ−ＳＰ及びＳＰセファロースＦＦ、フラクトゲルＳＯ３を含む群から選択され、好ましくは、前記固定相はＭａｃｒｏＣａｐ−ＳＰであり、
    前記移動相は、酢酸ナトリウム、酢酸、ＮａＣｌ、及びそれらの混合物から選択され、好ましくは、前記移動相は混合物であり、
    前記酢酸ナトリウムは１０〜５０ｍＭの範囲で存在し、ＮａＣｌは０．２５〜０．７５Ｍの範囲で存在し、前記移動相のｐＨは３．５〜５の範囲で存在し、好ましくは、前記ｐＨは４．０〜４．５であり、
    溶出モードは、段階勾配、直線勾配、及び両方の組み合わせを含む群から選択され、好ましくは、溶出に使用される勾配は段階勾配であり、
    前記精製されたモノペグ化ｒ−Ｈｕ−ＧＣＳＦは、１００〜１５０ｃｍ／時間、好ましくは１００ｃｍ／時間の流速で回収され、
    陽イオン交換クロマトグラフィーからのモノペグ化ＧＣＳＦの収率は、８０〜９５％の範囲であり、好ましくは、前記範囲は８５〜９０％であり、
    前記精製されたモノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦは、１０ｋＤａの限外濾過膜によって９〜１２ｍｇ／ｍｌの範囲に濃縮され、好ましくは前記精製されたモノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦは、１１．０〜１１．５ｍｇ／ｍｌの範囲に濃縮され、
    得られた前記精製されたモノペグ化ｒＨｕ−ＧＣＳＦは、１〜１０℃の範囲の温度で、好ましくは２〜８℃で保存される、請求項１のステップ（ｖｉ）に記載のプロセス。
11. 顆粒球の増殖及び分化のための、液体の非経口静脈内製剤中における、請求項１に記載の単離及び調製されたＧＣＳＦの使用。
12. 薬学的に許容される賦形剤とともに、請求項１に記載のように得られるＧＣＳＦを含む薬学的組成物。
13. 以下を含む、請求項１２に記載の薬学的組成物：
    

    

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