KR100834732B1 - 형질전환 동물의 유즙으로부터 재조합 단백질을 정제하기위한 전처리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형질전환 동물의 유즙으로부터 재조합 단백질을 정제하기 전에,

재조합 단백질의 침전이 용이하지 않은 경우에 형질전환 동물로부터 수득한 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수한 후 1차 침전제를 첨가하여 불순물을 1차 침전시키고 전이금속염을 첨가하여 불순물을 2차 침전시킨 후 상등액을 정밀 여과하여 불순물을 제거함으로써 형질전환 동물의 유즙을 전처리하는 방법에 관한 것이다.

또한, 재조합 단백질의 침전이 용이한 경우에 형질전환 동물로부터 수득한 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수한 후 1차 침전제를 첨가하여 재조합 단백질을 1차 침전시키고 전이금속염을 첨가하여 재조합 단백질을 2차 침전시킨 후 침전물을 완충 용액에 재용해하고 정밀 여과하여 불순물을 제거함으로써 형질전환 동물의 유즙을 전처리하는 방법에 관한 것이다.

형질전환 동물의 유즙, 재조합 단백질, 황산암모늄, 전이금속염, 전처리 방법

Description

형질전환 동물의 유즙으로부터 재조합 단백질을 정제하기 위한 전처리 방법{Pre-treatment Method for Purification of Recombinant Proteins from Transgenic Animal Milk}

도 1은 본 발명에 따라 형질전환 동물의 유즙으로부터 재조합 단백질을 정제하기 위한 전처리 방법의 개요를 나타낸 것이다.

도 2는 pH 침전법을 사용하여 유즙내 불순물이 효과적으로 제거된 결과를 총 단백질 농도와 재조합 단백질의 비활성도로 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 황산암모늄 침전 및 전이금속염 침전에 의해 유즙내 불순물이 더욱 효과적으로 제거된다는 것을 분광광도계 측정법으로 확인한 결과이다.

도 4는 본 발명에 따른 황산암모늄과 전이금속염 침전에 의해 유즙내 불순물이 더욱 효과적으로 제거된다는 것을 보여주는 사진이다.

도 5는 본 발명에 따른 황산암모늄 침전 및 전이금속염 침전에 의해 유즙내 불순물이 더욱 효과적으로 제거된다는 것을 에리스로포이에틴 회수율과 비활성도로 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명에 따른 황산암모늄과 전이금속염 침전에 의해 유즙내 불순물이 더욱 효과적으로 제거된다는 것을 보여주는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과 이다.

도 7은 본 발명에 따라 유즙내 에리스로포이에틴의 농도를 국제 표준시료와 상호 비교하여 측정할 때 이용한 효소면역 측정법의 검량곡선을 나타낸 것이다.

본 발명은 형질전환 동물의 유즙으로부터 재조합 단백질을 정제하기 위한 전처리 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 유즙을 원심분리한 후 상등액에 1차 침전제를 첨가하여 불순물 또는 재조합 단백질을 침전시키고, 전이금속염을 첨가하여 불순물 또는 재조합 단백질을 침전시키고, 이로부터 회수한 산물을 정밀 여과함으로써 형질전환 동물의 유즙을 전처리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서의 형질전환 동물은 인간과 유사한 단백질을 생산할 수 있는 소와 돼지를 말하여, 유선을 통해 분비되는 인간 유래 재조합 단백질은 빈혈치료용 적혈구 형성 조혈인자인 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EPO), 혈우병 치료제인 본 빌리브란트 인자 (von Willebrand Factor, vWF) 및 제 8 인자 (Factor VIII), 혈전치료제인 조직 플라스노미겐 액티베이터 (tissue plasminogen activator, tPA) 등을 일컫는다. 본 발명은 형질전환 돼지의 유즙으로부터 인간 유래 에리스포포이에틴의 생산을 위한 전처리 방법을 예시로 들고 있다.

천연형 인간 에리트로포이에틴은 165개의 아미노산으로 구성된 단량체 당단백질로 전체 분자량이 약 34,000 달톤(~34 kDa) 정도 되며, 단백질 부분의 분자량 은 약 18,000 달톤이다. 전체 분자량의 약 40%를 이루고 있는 당쇄 부분은 에리스로포이에틴의 생체내 활성에 필수적인 역할을 담당하며, 아미노산 24번째, 38번째 및 83번째에 위치한 Asn에 N-결합 당쇄와 126번째에 위치한 Ser에 하나의 뮤신형 O-결합 당쇄를 보유하고 있는 것으로 알려져 있다.

천연형 인간 에리스로포이에틴은 1906년 조혈 조절인자의 존재 가능성에 대한 연구를 통해 처음 보고되었고, 1957년 에리스로포이에틴으로 명명되었다(Jacobson et al. Nature, 1957, vol.179, p.633). 이후 지속된 연구의 결과 인간 에리스로포이에틴은 1977년에 Miyake 등이 재생 불량성 환자의 뇨로부터 대량 분리 정제하는데 최초로 성공한 이후 (Miyake et al. J. Biol. Chem. 1977, vol.252, p.5558) 그 연구가 본격화되기 시작하여 Yanagawa 등에 의해 에리스로포이에틴의 N-말단 서열이 보고되었고 (Yanagawa et al. J. Biol. Chem. 1984, vol.295, p.2707), Lai 등이 인간 뇨 유래 에리트로포이에틴 시료에서 에리스로포이에틴 전체 아미노산 서열을 결정하여 보고하였다 (Lai et al. J. Biol. Chem. 1986, vol.261, p.3116).

현재 인간 유래 재조합 에리스로포이에틴은 동물세포 배양과 형질전환 동물을 이용한 생산기술에 의해 제조되고 있다. 이런 형질전환 동물을 이용한 제조는 동물세포를 이용한 제조에 비해 여러 가지 측면에서 장점이 있다. 첫째로 천연형과 거의 동일하여 보다 안전한 고품질의 재조합 단백질을 얻을 수 있다는 점이며, 둘째로 형질전환동물 이용한 재조합 단백질의 제조는 1 리터당 수 그램의 수준으로 대량 생산이 가능하고, 셋째로 우리가 필요로 하는 재조합 단백질을 제조하는 형질 전환 동물이 만들어지면 이들이 지니고 있는 외래 유전자가 자손에게 그대로 유전되어 영속적인 생산 시스템을 유지할 수 있다는 것이다.

형질전환 동물의 유즙을 전처리하는 방법으로는 저온 침전과 황산암모늄 침전을 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 대한민국 특허 제 10-0567448호, 인간면역결핍바이러스(HIV)의 gp120 단백질, HIV gp160 단백질, 뮤신(mucin), 알파-1-당단백질(α-1-glycoprotein)과 같은 당단백질의 분리에 2가 양이온 금속을 사용한 미국 특허 제 5,276,141호와 대한민국 특허 제10-1999-0059466호가 있다.

상기 대한민국 특허 제 10-0567448호는 저온 침전법을 통하여 전처리하게 되는데, 이 방법은 시간 (약 48시간)이 오래 걸릴 뿐 아니라 대량의 유즙을 처리하는 데 한계가 있으며, 2가의 양이온 금속을 처리하는 미국 특허 제 5,276,141호와 대한민국 특허 제10-1999-0059466호는 당단백질 외의 유즙내 불순물을 효과적으로 제거하지 못한다.

본 발명자들은 황산암모늄 및 전이금속염을 이용하여 침전시킨 결과, 충분한 침전이 이루어져 침전이 용이하지 않은 재조합 단백질의 경우에는 상등액으로부터, 침전이 용이한 재조합 단백질의 경우에는 침전물로부터 목적한 재조합 단백질을 효과적으로 수득할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 한 관점으로, 형질전환 동물의 유즙으로부터 재조합 단백질을 정제하기 전에,

상기 재조합 단백질의 침전이 용이하지 않은 경우를 전제로

(1) 형질전환 동물로부터 수득한 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계;

(2) 1차 침전제를 첨가하여 불순물을 1차 침전시키는 단계;

(3) 전이금속염을 첨가하여 불순물을 2차 침전시키는 단계;

(4) 상기 단계로부터 상등액을 회수하고 정밀 여과하여 불순물을 제거하는 단계를 포함하되, 상기 단계 (2)와 (3)은 서로 순서를 바꾸거나 동시에 수행할 수 있는 형질전환 동물의 유즙 전처리 방법을 제공한다.

본 발명은 다른 관점으로, 형질전환 동물의 유즙으로부터 재조합 단백질을 정제하기 전에,

상기 재조합 단백질의 침전이 용이한 경우를 전제로

(a) 형질전환 동물로부터 수득한 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계;

(b) 1차 침전제를 첨가하여 재조합 단백질을 1차 침전시키는 단계;

(c) 전이금속염을 첨가하여 재조합 단백질을 2차 침전시키는 단계;

(d) 상기 단계로부터 침전물을 회수하고 완충 용액에 재용해한 후 정밀 여과하여 불순물을 제거하는 단계를 포함하되, 상기 단계 (b)와 (c)는 서로 순서를 바꾸거나 동시에 수행할 수 있는 형질전환 동물의 유즙 전처리 방법을 제공한다.

일반적으로 유즙은 단백질, 당류, 지방 등 다양한 성분으로 구성되어 있기 때문에 원하는 재조합 단백질을 크로마토그래피 등으로 정제하기에 전에 불필요한 성분들 (불순물)을 제거하기 위한 전처리가 요구된다.

본 발명의 첫 번째 관점은 재조합 단백질의 침전이 용이하지 않은 경우, 형질전환 동물의 유즙으로부터 상기 재조합 단백질을 정제하기 앞서 전처리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 "재조합 단백질이 침전이 용이하지 않다"는 것은 재조합 단백질이 (후술되는) 당해 농도의 황산암모늄과 접촉하였을 때 침전되지 않는 경우를 의미한다. 인간 유래 단백질은 상당수가 당단백질인데, 당쇄가 단백질의 침전을 억제하는 경향이 있어 많은 인간 유래 단백질은 침전이 용이하지 않은 단백질에 속한다. 예를 들면, 에리스포포이에틴, 혈액 인자, 항체 등이 있다.

이와 같이 재조합 단백질의 침전이 용이하지 않은 경우에는

(1) 형질전환 동물로부터 수득한 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계;

(2) 1차 침전제를 첨가하여 불순물을 1차 침전시키는 단계;

(3) 전이금속염을 첨가하여 불순물을 2차 침전시키는 단계;

(4) 상기 단계로부터 상등액을 회수하고 정밀 여과하여 불순물을 제거하는 단계를 거쳐서 전처리한다. 단계 (2)와 (3)은 어떤 것을 먼저 실시하여도 무방하며, 동시에 실시할 수도 있다. 이하, 본 발명에 따른 전처리 방법을 단계별로 구체적으로 설명한다.

단계 (1)에서는 형질전환 동물로부터 수득한 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수한다. 본 발명에서 형질전환 동물의 유즙은 4,000 내지 12,000 rpm으로, 4 내 지 37℃에서, 10 내지 40분 동안 원심분리한다. 일반적으로 동물의 유즙을 원심분리하면 3개의 상으로 분리되어 최상층에는 지방이, 중간층에는 콜로이드상이, 최하층에는 불용성 복합체가 각각 형성된다. 이렇게 형성된 지방과 불용성 복합체를 제거하고, 콜로이드상을 회수하여 다음 단계에서 처리한다. 따라서, 본 발명의 단계 (1)에서 "상등액"이란 지방층을 제거한 후 중간층에 형성된 콜로이드상을 의미하는 것이다.

재조합 단백질의 pI가 5 이하이거나, 7이상인 경우에 한하여 단계 (1) 이후에 pH 변화를 유도하여 불순물을 침전시키는 단계를 추가로 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 pH 변화는 단계 (1)을 통하여 얻은 상등액의 pH를 3 내지 6의 산성 범위 또는 pH 8 내지 10의 알칼리성 범위로 변화시키는 것을 의미한다. 이러한 pH 변화는 완충용액 (예, 시트르산, 아세트산, 인산 완충용액)과 강산/강알칼리성 용액을 함께 사용하여 유도할 수 있다.

이어서, 단계 (2)에서는 단계 (1)에 따라 수득한 상등액, 전술된 pH 침전을 수행한 경우에는 pH 침전 산물 또는 단계 (3)을 먼저 수행한 경우에는 단계 (3)의 산물에 황산암모늄을 첨가하여 불순물을 1차 침전시킨다. 여기서, 1차 침전제로는 황산암모늄, 황산나트륨 또는 인산칼륨을 이용할 수 있으며, 이들의 농도는 10 내지 60%, 바람직하게는 20 내지 50%이다. 당해 농도의 1차 침전제를 첨가한 후에 4 내지 37℃에서, 1 내지 6 시간 반응시켜 불순물을 침전시킨다.

단계 (3)에서는 단계 (1)에 따라 수득한 상등액, 전술된 pH 침전을 수행한 경우에는 pH 침전 산물 또는 단계 (2)를 먼저 수행한 경우에는 단계 (2)의 산물에 전이금속염을 첨가하여 불순물을 2차 침전시킨다. 여기서, 전이금속염은 Mn, Fe, Co, Ni, Cu 및 Zn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 전이금속을 포함하는 염류를 의미하며, 이들의 농도는 5 내지 500mM, 바람직하게는 40 내지 200mM이다. 당해 농도의 전이금속염을 첨가한 후에 4 내지 37℃에서, 1 내지 24 시간 반응시켜 불순물을 침전시킨다.

한편, 본 발명에서는 단계 (2)와 (3)을 동시에 실시할 수 있는데, 이러한 양태에서는 전술된 농도의 제1첨가제 중 일부를 첨가한 후에 4 내지 37℃에서, 1 내지 6 시간 반응시켜 불순물을 침전시키고, 남은 제1첨가제를 첨가하고, 당해 농도의 전이금속염을 첨가한 후 4 내지 37℃에서, 1 내지 24 시간 반응시켜 불순물을 침전시킨다.

단계 (4)에서는 전술된 단계로부터 얻은 산물을 원심분리하여 상등액을 회수한 후 정밀 여과하여 불순물, 특히 미세한 불순물을 제거한다.

본 발명에서는 단계 (4)를 실시하기에 앞서 전술된 단계로부터 얻은 산물을 한외 여과하여 재조합 단백질을 농축하는 것이 바람직하다. 한외 여과에 의해 단계 (2)와 (3)에서 사용된 각종 염류들을 제거할 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명의 두 번째 관점은 재조합 단백질의 침전이 용이한 경우, 형질전환 동물의 유즙으로부터 상기 재조합 단백질을 정제하기 앞서 전처리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 "재조합 단백질이 침전이 용이하다"는 것은 재조합 단백질이 (후술되는) 당해 농도의 황산암모늄과 접촉하였을 때 침전되는 경우를 의미 한다.

이와 같이 재조합 단백질이 침전이 용이한 경우에는

(a) 형질전환 동물로부터 수득한 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계;

(b) 1차 침전제를 첨가하여 재조합 단백질을 1차 침전시키는 단계;

(c) 전이금속염을 첨가하여 재조합 단백질을 2차 침전시키는 단계;

(d) 상기 단계로부터 침전물을 회수하고 완충 용액에 재용해한 후 정밀 여과하여 불순물을 제거하는 단계를 포함한 형질전환 동물의 유즙을 전처리하는 방법에 관한 것이다. 단계 (b)와 (c)는 어떤 것을 먼저 실시하여도 무방하며, 동시에 실시할 수도 있다.

단계 (a)는 전술된 단계 (1)과 동일한 절차에 따라 실시할 수 있다.

단계 (b)에서는 전술된 단계 (2)와 동일한 절차 및 조건에 따라 진행하되, 불순물이 아니라 목적한 재조합 단백질을 침전시키며, 단계 (c)에서도 전술된 단계 (3)과 동일한 절차 및 조건에 따라 진행하되, 불순물이 아니라 목적한 재조합 단백질을 침전시킨다.

단계 (d)에서는 전술된 단계로부터 얻은 산물을 원심분리하여 침전물을 회수한 후 완충용액에 재용해하고 정밀 여과하여 불순물, 특히 미세한 불순물을 제거한다. 여기서, 이용 가능한 완충용액은 특별히 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 임의의 완충용액을 필요에 따라 선택하여 이용할 수 있다.

상기 단계 (d)에서는 침전물을 회수하여 완충용액에 재용해한 후 한외여과한 다음에 정밀여과하는 것이 바람직하다. 한외여과는 특히, 단계 (2)와 (3)에서 사용된 각종 염류들이 단백질의 안정성에 영향을 줄 경우에 염과 금속이온을 제거하기 위하여 수행하는 것이 바람직하다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 원심분리

인간 에리스로포이에틴으로 형질전환된 돼지로부터 수득한 유즙 40㎖을 15,950xg, 4℃에서 30분간 원심분리를 실시하였다. 3개의 상으로 층이 분리되는데, 최상층의 지방과 최하층의 불용성 복합체를 제거하고 중간층의 콜로이드상을 회수하였다. 이 때 손실된 에리스로포이에틴의 양은 약 1~2%이었다.

실시예 2: pH 침전

에리스로포이에틴의 등전점이 3.8 내지 4.5이므로 상기 실시예 1을 통하여 얻은 상등액에 완충용액 (~4.5 : 구연산, ~ 5.5 : 초산, ~ 7.5 : 인산, ~ 8.5 : 트리스 완충용액)과 0.1 N 황산을 처리하여 상등액의 pH를 4.0 내지 5.5로 낮추어 불 순물의 침전을 유도하였다.

전술된 pH 침전의 산물을 대상으로 총 단백질의 농도와 에리스로포이에틴의 비활성도를 측정한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 pH 침전에 의해 유즙내 불순물이 효과적으로 제거되었다.

실시예 3: 황산암모늄 및 전이금속염 침전

실시예 2를 통하여 얻은 산물에 황산암모늄을 20% 첨가하고 1시간 동안 반응시켜 불순물을 침전시켰다. 이어서, 황산암모늄을 35% 까지 첨가한 후 염화아연을 10 내지 200mM의 농도로 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 불순물을 침전시켰다. 이렇게 얻은 산물을 6,000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하였다.

상기 상등액에 남아있는 불용성 단백질의 양을 분광광도계로 측정한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 상등액에 존재하는 불순물의 양이 급격히 감소하였다. 즉, 황산암모늄과 전이금속염 침전에 의해 불순물이 더욱 효과적으로 제거된다는 것을 확인할 수 있었다. 도 3에서 좌측부터 차례대로 시료 1은 35% 황산암모늄 침전, 시료 2는 35% 황산암모늄 침전 + 10mM 염화아연, 시료 3은 35% 황산암모늄 침전 + 20mM 염화아연, 시료 4는 35% 황산암모늄 침전 + 40mM 염화아연, 시료 5는 35% 황산암모늄 침전 + 60mM 염화아연, 시료 6은 35% 황산암모늄 침전 + 80mM 염화아연, 시료 7은 35% 황산암모늄 침전 + 100mM 염화아연, 시료 8은 35% 황산암모늄 침전 + 150mM 염화아연, 시료 9는 35% 황산암모늄 침전 + 200mM 염화아연으로 각각 처리된 것이다.

상술된 결과는 도 4에서와 같이 불순물이 제거된 정도를 육안으로도 관찰할 수 있다.

또한, 황산암모늄 및 전이금속염을 이용한 침전이 불순물만을 선택적으로 침전시키는지 여부를 확인하기 위하여 상기 상등액을 대상으로 에리스로포이에틴 활성 및 비활성도 (총 에리스로포이에틴 활성/총 단백질 양, U/mg)를 측정한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 에리스로포이에틴은 침전시키지 않고 불순물만을 선택적으로 침전시킬 수 있었다. 특히, 에리스로포이에틴의 수율이 80%에 이르는 것을 확인할 수 있다.

실시예 4: 한외여과 및 정밀여과

여과막을 펌프와 함께 장착하고 5ℓ의 3차 멸균수로 펌프를 이용하여 순화시켜 주면서 여과장치의 내부를 세척하였다. 이어서, 상기 실시예 3에서 얻은 상등액을 펌프를 통하여 여과 장치에 주입하여 여액을 회수하여 재주입하는 방식으로 한외여과를 수행하였다. 한외여과가 완료된 후 여액의 부피는 200㎖였다. 여기서 나온 여액을 0.45㎛의 필터를 이용하여 정밀여과를 실시하였다.

실시예 5: 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동을 이용한 순도 분석

유즙의 전처리 후 잔류 단백질 및 제거된 불순 단백질을 확인하기 위하여 폴 리아크릴 아미드 겔 전기영동법을 사용하였다. 전기영동용 젤(12%)을 전기영동장치에 설치하고 이동 완충액을 채웠다. 각 시료 5㎕를 샘플 완충용액 25㎕와 혼합한 후 95℃에서 5분간 가열한 후 12,000rpm에서 3~4 분간 원심분리하고 분자량 표준품 (BIO-RAD 사)과 함께 각 웰에 30㎕ 씩 주입하였다. 시료 주입 후 150V의 정전압으로 전기영동하였고 전개가 완료되면 젤을 꺼내어 쿠마시 염색을 실시하였다.

상기 전기영동 결과는 도 6에 나타내었으며, 대부분의 분순 단백질이 제거됨을 확인할 수 있었다. 도 6에서 레인 0은 단백질 크기 마커 (Bio-Rad, Precision), 레인 1 : 유즙 원액, 레인 2는 황산암모늄 35% 침전 후 상등액, 레인 3은 황산암모늄 40% 침전 후 상등액, 레인 4는 황산암모늄 35% + 염화아연 40mM 동시 침전 상등액, 레인 5는 황산암모늄 35% + 염화아연 60mM 동시 침전 상등액, 레인 6은 황산암모늄 35% + 염화아연 80mM 동시 침전 상등액, 레인 7은 황산암모늄 35% + 염화아연 100mM 동시 침전 상등액을 각각 나타낸다.

실시예 6: 효소면역측정법에 의한 전처리 단계에 따른 수율환산을 위한 활성도 측정

형질전환 돼지의 유즙, 원심분리, pH 침전, 황산암모늄 및 전이금속염 침전, 정밀여과, 한외여과의 전 단계에 걸쳐 회수된 시료의 활성을 효소면역측정법에 의하여 측정하고 이를 통하여 각 정제 단계별 수율을 산출하였다.

효소면역측정키트의 항체흡착 플레이트의 각 웰에 분석을 위한 시료의 희석액을 100㎕씩 가하여 잘 섞은 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 각 웰의 잔여 반응 액을 제거하고 세척용액 400㎕로 4회 세척한 후 효소항체 접합체액 200㎕를 가한 후 다시 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 여액을 위의 방법으로 제거, 세척한 후 키트에 포함되어 있는 기질-발색 용액 200㎕를 웰에 첨가하고 상온에서 25분간 발색시켰다. 발색이 완료된 후 반응정지액 100㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이 로그 좌표계를 이용하여 표준액의 활성도를 횡축, 흡광도를 종축으로 하여 표준곡선을 작성하고 작성된 표준곡선으로부터 국제표준액과 시료내 에리스로포이에틴 활성도를 구하고 희석배수를 곱하여 시료의 최종 활성도를 측정하였다.

본 발명의 전처리 방법에 따르면 정제 시간이 약 4시간으로 단축되고, 회수율이 약 80% 이상에 이르러 형질전환 동물의 유즙으로부터 재조합 단백질의 정제 효율을 향상시킬 수 있다. 이로써, 본 발명의 전처리 방법을 이용하여 재조합 단백질을 대량 생산할 수 있다.

Claims (11)

1. 형질전환 동물의 유즙으로부터 재조합 단백질을 정제하기 전에,

   상기 재조합 단백질의 침전이 용이하지 않고 이의 pI가 5 이하이거나 7 이상인 경우를 전제로

   (1) 형질전환 동물로부터 수득한 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계;

   (2) 상기 상등액의 pH를 3 내지 6의 산성 범위 또는 pH 8 내지 10의 알칼리성 범위로 이동시켜 불순물을 침전시키는 단계;

   (3) 1차 침전제를 첨가하여 불순물을 1차 침전시키는 단계;

   (4) 전이금속염을 첨가하여 불순물을 2차 침전시키는 단계;

   (5) 상기 단계로부터 상등액을 회수하고 정밀 여과하여 불순물을 제거하는 단계를 포함하되, 상기 단계 (3)과 (4)는 동시에 수행할 수도 있는 형질전환 동물의 유즙 전처리 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   단계 (1)에서 4,000 내지 12,000 rpm으로, 4 내지 37℃에서, 10 내지 40분 동안 원심분리하는 것을 특징으로 하는 유즙 전처리 방법.
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,

   pH 변화는 완충 용액과 강산 또는 강알칼리성 용액을 함께 사용하여 유도하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 유즙을 전처리하는 방법.
5. 제 1항에 있어서,

   단계 (3)에서 1차 침전제는 황산암모늄, 황산나트륨 및 인산칼륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 유즙 전처리 방법.
6. 제 1항에 있어서,

   단계 (4)의 전이금속염은 Mn, Fe, Co, Ni, Cu 및 Zn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 전이금속을 포함하는 염류인 것을 특징을 하는 형질전환 동물의 유즙 전처리 방법.
7. 제 1항에 있어서,

   단계 (5) 이전에 상기 단계 (3)과 (4)로부터 수득한 상등액을 한외 여과하여 재조합 단백질을 농축하고 금속이온 및 염을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 유즙을 전처리하는 방법.
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