KR100567448B1 - 형질전환 동물의 유즙 전처리방법 및 이를 통한 인체단백질의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형질전환 동물의 유즙 전처리방법 및 이를 통한 인체 단백질의 정제방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 형질전환 동물의 유즙을 원심분리, 저온 침전(cryoprecipitation), 황산암모늄 침전(ammonium sulfate precipitation)을 통하여 전처리하고, 소수성 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피 등의 정제단계를 순차적으로 수행함으로써 신속하고, 경제적이며, 고순도, 고효율의 인체 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

형질전환 동물, 유즙, 단백질, 정제, 저온침전, 황산암모늄 침전, 소수성 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피

Description

형질전환 동물의 유즙 전처리방법 및 이를 통한 인체 단백질의 정제방법{Methods of preparation of milk from transgenic animals and their use for the purification of human proteins in milk}

도 1은 본 발명의 정제 공정 중 1단계 유즙 전처리 공정인 저온 침전이며 이 공정을 통해 hEPO 외 다수의 불순 단백질(카제인)을 제거한 것으로 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본명의 정제 공정 중 2단계 유즙 전처리 공정인 황산암모늄 침전법 (ammonium sulfate precipitaion :ASP)이며, 이 공정을 통해 hEPO 외 다수 불순 단백질을 제거한 것으로 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 1단계 정제 공정인 소수성 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것이고, 정제 공정을 통해 분리된 hEPO 정제물의 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(a)과 웨스턴 블롯 결과(b)를 나타낸 것이다[MW: 분자량 표지; 레인 1: 황산암모늄 침전 후 상등액; 레인 2: 소수성 크로마토그래피 통과 후 분획물; 레인 3: 소수성 크로마토그래피 용출액 1;레인 4: 소수성 크로마토그래피 용출액 2; 레인 5: 황산 암모늄 침전 후 상등액; 레인 6: 소수성 크로마토그래피 통과 후 분획물; 레인 7: 소수성 크로마토그래피 용출액 1; 레인 8: 소수성 크로마토그래피 용출액 2].

도 4의 a)는 hEPO의 헤파린 컬럼과 hEPO의 결합여부를 예비 실험한 것으로 웨스턴 블롯 결과이고, b)는 2단계 정제 공정인 헤파린 세파로스 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것이고, c)는 이것의 용출액을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 결과로, 실선은 hEPO 분획을 나타낸 것이다.

도 5의 a), b)는 각 정제 단계에서 에리트로포이에틴의 회수율을 효소면역측정 방법으로 확인한 것이며, c)는 헤파린 크로마토그래피 용출액의 hEPO 분획을 모은 최종 정제된 hEPO이다.

도 6은 본 발명이 제공하는 형질전환 동물의 유즙으로부터 목적 단백질의 정제 과정을 도식화한 것이다.

본 발명은 형질전환 동물의 유즙 전처리방법 및 이를 통한 인체 단백질의 정제방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 형질전환 동물의 유즙을 원심분리, 저온 침전(cryoprecipitation), 황산암모늄 침전(ammonium sulfate precipitation)을 통하여 전처리하고, 소수성 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피 등의 정제단계를 순차적으로 수행함으로써 신속하고, 경제적이며, 고순도, 고효율의 인체 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

인체 단백질이란 에리스로포이에틴(EPO), 성장 호르몬, 여포자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 혈액응고 제8인자(Factor VIII), vWF(von Wilibrand Factor), 콜라겐 등을 말하며, 이중 인간 에리스로포이에틴(hEPO)은 신장에서 생성 분비되는 조혈호르몬으로서, 적혈구계의 세포에 특이적으로 작용하며, 골수 중의 적아구계 전구세포의 분화와 증식을 조절하는 순환당단백질이다[Carnot 등, Compt. Rend., 143:384,1906]. hEPO는 주로 태아의 간이나 성인의 신장에서 생산되며 혈중 저산소 상태에서 생성이 증가하여 적혈구 세포의 생산을 조절한다.

또한, hEPO는 165개의 아미노산으로 구성되어 있으며 3개의 N-결합 당쇄와 1개의 O-결합 당쇄를 포함하고 있으며 전체 당쇄는 hEPO 분자량의 40%에 해당한다. 천연형 hEPO는 산성(acid), 단일형의 당단백질로서 전체 분자량이 약 34,000달톤 정도이며, 당을 제외한 단백질 부분만의 분자량은 약 18,000달톤이다[Wang 등, Endocrinology, 116, 2286, 1985]. 또한, hEPO는 아미노산 Asn24, Asn38 및 Asn83의 위치에 3개의 N-결합 당쇄와 Ser126 위치에 하나의 뮤신형(mucin-type) O-결합 당쇄를 가지고 있다.

천연형 hEPO의 활성은 hEPO 분자내의 당함량에 따라 그 활성도가 결정되며, 현재 만들어지고 있는 hEPO의 형태는 재조합 hEPO와 형질전환 동물에서 유래된 hEPO로 크게 나누며, 상업용 생산은 재조합 hEPO가 전세계시장을 차지하고 있다.

이런 형질전환 동물모델 생산은 여러 가지 측면에서 재조합 세포생산에 비해 여러가지 장점이 있다. 첫째로 천연적인 것과 거의 동일한 고품질의 생리활성물질을 얻을 수 있다는 점이며, 둘째로 동물세포 배양시스템은 일반적으로 1리터당 200 mg 수준의 재조합 단백질을 생산하지만 형질전환동물에서는 1리터당 수 그램의 수준이므로 대량생산이 가능하여 획기적인 원가절감이 가능하고, 셋째로 우리가 필요로 하는 생리활성물질을 생산하는 형질전환 동물이 만들어지면 이들이 지니고 있는 외래의 유전자가 자손에게 그대로 유전되어 영속적인 생산시스템을 유지할 수 있다.

따라서, 본 발명은 형질전환된 동물의 유즙에서 목표단백질의 상업적 생산에 필요한 정제방법을 제공한다

현재까지 알려진 재조합 hEPO 정제방법으로는 대부분 크로마토그래피에 의해 이루어지고 있는데, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 결합 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 친화성 흡착 크로마토그래피 등이 있다. 공업적 생산규모의 EPO의 정제방법으로는 미국특허 제 4,667,016 호를 들 수 있고, 이 또한 재조합 hEPO의 정제에 관한 것으로, 형질전환 동물 유즙에서 hEPO의 정제 방법 및 이것의 상업적 생산은 전혀 없는 상태이다.

한편, 미국 특허 제6,268,487호와 미국 특허 제6,183,803호 등에서 유즙 전처리에 대한 방법들이 있는데, 이들 방법은 복잡한 공정과 pH에 따른 단백질의 변성을 주는 문제점이 있었다. 또한, 형질전환 동물의 유즙으로부터 단백질 정제하는 연구로는 락토페린(lactoferrin), 알파 1 프로테인에이즈 인히비터(-1 proteinase inhibitor), 피브리노겐(fibrinogen) 등을 정제한 방법[미국특허 제5,919,913호, 미국 특허 제6,194,553호]이 있으나, 복잡한 정제 과정, 정제 효율 등에 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 보다 단순화된 형질전환 동물의 유즙으로부터 단백질을 정제하기 위한 방법을 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 형질전환 동물의 유즙이라는 특수한 환경에 가장 적합하고 간단한 방법으로 인체 단백질 분리를 위한 유즙 전처리 공정과 크로마토그래피법을 확립하였으며, 이를 통하여 고순도의 단백질을 분리함으로써 전체적인 정제 공정을 단순화하였을 뿐만 아니라, 저비용, 고효율의 인체 단백질 정제방법을 구축함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 형질전환 동물의 유즙 전처리방법 및 이를 통하여 간편하고 경제적이며, 고효율, 고순도의 인체 단백질을 정제하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 형질전환 동물의 유즙 전처리방법 및 이를 통한 인체 단백질의 정제방법을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 형질전환 동물의 유즙을 원심분리, 저온침전(cryoprecipitation), 황산암모늄 침전(ammonium sulfate precipitation)을 통하여 유즙을 전처리하고, 소수성 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피 등의 정제단계를 순차적으로 수행 하여 신속하고 경제적이며 고순도, 고효율의 인체 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 인체 단백질 정제방법의 특징은 유즙 전처리 단계로 지방제거를 위한 원심분리와 목적한 인체 단백질 외 다량의 불순단백질을 제거하기 위한 저온 침전법 및 황산암모늄 침전법(ammonium sulfate)이 사용되며, 목적 단백질 정제단계로 소수성 크로마토그래피(hydrophobic interaction), 헤파린 크로마토그래피(heparin chromatography) 단계를 포함한다.

상기 특징적 정제 단계 이외에도 미세 지방 제거를 위한 필터여과, 완충액의 교환을 위한 투석 및 항체 제거를 위한 단백질 A 크로마토그래피의 단계를 포함한다.

또한, 상기 형질전환 동물은 돼지, 소, 양, 염소, 토끼, 마우스, 랫트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 인체 단백질의 정제방법에서는 유즙이라는 특수한 환경을 고려하지 않을 수 없다. 따라서, 1단계로 유즙 전처리 공정을 거쳐야 하며, 유즙의 원심분리를 통하여 천연 목적 단백질의 소실은 거의 없으며 유즙 내 존재한 과량의 지방을 쉽고, 신속하게 제거할 수 있다.

이때, 원심분리는 8,000 ∼ 10,000 rpm으로 4 ∼ 8 ℃에서 20 ∼ 30분 동안 수행하는 것이 바람직하다. 이렇게 원심분리하여 얻은 상등액만을 취하고, 다음으로 저온 침전법(cryoprecipitation)을 실시한다. 저온침전법을 상세히 설명하면, 상기에서 얻은 상등액에 EDTA 5 ∼ 50 mM를 넣어 -80 ∼ -50 ℃에서 12 ∼ 16 시간동안 냉동보관하고 4 ∼ 8 ℃에서 24 ∼ 36 시간 녹인 후, 원심분리하여 불순단백질을 제거한다. 그런 다음, 황산암모늄 침전법(ammonium sulfate)을 실시하는데, 이는 저온 침전 후 얻은 상등액에 5 ∼ 50% 황산암모늄을 천천히 가하고 0 ∼ 8 ℃에서 0.5 ∼ 1 시간동안 섞으면서 보관한 후, 원심분리하여 상등액을 여과시킴으로써 유즙내 과량 존재하는 카제인(casein)과 불순단백질을 일차적으로 제거한다. 이때, 상기 황산암모늄의 양은 정제 목적 단백질의 특성에 맞게 적당량을 넣고이러한 유즙 전처리 공정에서 지방과 다량의 불순단백질을 제거는 필수적이며, 정제시간 및 비용을 절감하고, 전체 정제방법의 단계 수를 감소시켜 불필요한 손실을 최소화하며, 정제 중 목적 단백질이 농축되어 이후 단계의 수행에 편리성을 부여할 수 있게 된다. 상기한 바와 같이, 공업적 생산규모에서 유즙의 전처리 공정은 컬럼의 재사용, 효율, 비용 측면에서 반드시 필요하다.

2단계로 크로마토그래피 단계에서 처음에는 소수성 크로마토그래피를 사용하며, 이는 설페이트의 영향이 없고, 완충액 교환을 할 필요가 없는 장점이 있다. 앞서 수행한 수득물에 소수성 크로마토그래피을 수행하되, 에틸렌글리콜(step gradient) 용액으로 용출한다. 그러나, 상기 수지의 종류, 칼럼의 규격, 평형화 완충액의 종류 등은 통상의 소수성 크로마토그래피 기술에 따라 수정될 수 있다.

이후 용출되어 나온 분획을 투석시킨 후 단백질 A 크로마토그래피를 수행하여 완충액의 교환과 다량의 항체 단백질을 제거한다. 이후 헤파린 크로마토그래피를 수행하는데, 한 예로 hEPO의 경우에는 크로마토그램 상에 염화나트륨의 농 도가 25 ∼ 45%(0.25 ∼ 0.45M)인 단백질 분획을 모아 최종 정제한다.

이러한 정제방법은 기존의 정제방법에 비해 정제 소요시간 및 비용을 감소시킬 수 있으며, 고순도, 고효율의 인체 단백질을 정제할 수 있어 대량생산이 가능하여 형질전환 동물을 인체 치료용 단백질 및 그 이외의 산업용 단백질 생산, 분리, 정제 등의 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 인간 에리스로포리에틴(hEPO)의 정제

1) 원심분리

형질전환 돼지[축산기술연구소 제공]에서 수거된 유즙 1L을 8000 rpm으로, 4 ℃에서 20분간 원심분리(supra 22K ,hanil)를 실시하였다. 그런 다음 최상층의 유지 고형물과 최하층의 침전물을 제외한 수용층을 수거하였다.

2) 저온 침전(cryoprecipitation)

상기 1)로부터 얻은 수득물에 최종 농도 5 mM EDTA가 되도록 넣고, -70 ℃에서 12시간 이상 냉동 보관한 후, 다시 4 ℃에서 완전히 녹였다(24시간 이상).

이후 8000 rpm으로 4 ℃에서 20분간 원심분리하였고 상등액만을 취하였다. 이를 통하여 다량의 불순 단백질과 카제인 등을 제거할 수 있다[도 1].

3) 황산암모늄 침전(ammonium sulfate precipitation)과 여과

상기 2)로부터 얻은 수득물에 최종 농도 포화된 황산암모늄(ammonium sulfate) 용액을 40%가 되도록 천천히 넣고, 4 ℃에서 2시간 동안 섞으면서 보관하였다. 이후 4000 rpm으로 4 ℃에서 20분간 원심분리하였고 상등액만을 취해 0.45 마이크론 Nalgene 필터 장치로 여과시켰다[도 2].

4) 소수성 크로마토그래피

본 실험에서는 페닐 세파로오스 6 패스트 플로우(high sub) 레진 20 ㎖을 공 컬럼(XK 16/20 column)에 충전시켰다. 페닐 수지가 충진된 칼럼에 황산암모늄 상등액을 주입하고 50% 에틸렌글리콜(step gradient) 용액으로 용출하였다. 시료의 주입에 선행하여 칼럼을 1M 황산암모늄, 50 mM 황산나트륨, pH 7.2 용액으로 평형화시키고 상기 3)에서 얻은 상등액을 주입하였다.

이상의 정제 과정을 통하여, hEPO의 용출 분획과 불순물의 용출 분획은 완전 분리되는 양상을 나타내었다[도 3].

5) 투석과 단백질 A 크로마토그래피

활성화된 투석막(dialysis tubing, SIGMA사, MWCO 12K)에 소수성 크로마토그래피의 용출액(50% 에틸렌글리콜)을 넣고 봉합한 후 100배 용량의 3차 멸균수에 대하여 6시간 간격으로 3회 투석하여 용출액 내의 에틸렌글리콜이 0.1% 이하가 되게 하였다. 이와 같이 투석을 통하여 완충액을 교환하였다. 투석이 끝난 소수성 크로마토그래피의 용출액은 다음 컬럼인 헤파린 컬럼의 사용전에 단백질 A(protein A) 5 ㎖ 컬럼을 통과하였다. 20 mM 트리스 완충액, pH 7.2 용액으로 25 ㎖ 부피로 충분히 평형화한 후 샘플을 단백질 A 컬럼을 통과하였다. 이후 소수성 크로마토그래피의 용출액을 통과시켰다. 단백질 A 컬럼을 통과한 시료를 다음 단계의 헤파린 컬럼에 사용하였다.

6) 헤파린 크로마토그래피

헤파린 크로마토그래피를 상온에서 FPLC(fast protein liquid chromatograpy) 시스템[Pharmacia사]을 이용하여 수행하였다. 헤파린 세파로오스 6 패스트 플로우[Pharmacia사] 레진 20 ㎖을 공컬럼(XK 16/20 column)에 충전시켰다. 이후 0.1% 트윈 20을 포함하는 pH 6.2의 20 mM MES로 2 ㎖/분의 유속으로 평형화시켰다. 샘플을 P 50 펌프[Pharmacia사]를 사용하여 2 ㎖/분으로 컬럼에 가하였다. 이어서, 280 mm에서의 흡광도가 안정화될 때까지 컬럼을 평형 완충제로 세척하였다. 0.1% 트윈 20 및 0.05 M NaCl을 포함하는 pH 6.2의 20 mM MES의 5배 컬럼 부피(280 ㎖)로 세척하여 느슨하게 결합된 단백질을 용리시켜 1 ㎖ 분획을 수집하였다. 0.1% 트윈 20을 포함하는 pH 6.2의 20 mM MES 중 0.05 M NaCl의 3배 컬럼 부피(60 ㎖)로 세척한 후, 용리 완충제를 5배 컬럼 부피(100 ㎖) 이상의 트윈 20을 포함하는 pH 6.2의 20 mM MES 중 1.0 M NaCl까지 증가시켰다

총 단백질을 280 nm에서의 흡광도로 모니터한 후, 염 농도는 0.25 ∼ 0.45M 에서 hEPO의 용리를 확인하였고, 이는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 용리제 분획을 분석하였다[도 4].

이 공정을 통하여 95% 이상의 순도를 나타내는 고순도의 hEPO를 분리할 수 있고, 각 단계별 단백질 손실량을 브래드포드(Bradford protein assay) 방법에 흡광도 562 nm에서 단백질량을 측정하여 각 단계별 단백질 소실량을 측정하였고, 각 단계별 hEPO의 정제 효율을 효소면역측정 키트(EPO-ELISA, medac)로 흡광도 405 nm 에서 측정한 결과는 다음 표 1과 같다.

구분		OD	회수율	단백질 분획
저온침전	총 유즙	2.5300	100%
	침전물	0.0300	1.20%	50-80%
	상등액	2.0100	79%	30-50%
황산암모늄 침전	총 유즙	3.4840	100%
	40% ASP 침전물	0.08	2.30%	40-50%
	40% ASP 상등액	3.36	96%	50-60%
소수성 크로마토 그래피	개시	0.9080	100%
	FT	0.1160	3.20%
	용출1 (0% 황산암모늄)	0.1080	2.20%
	용출2 (50% 에틸렌글리콜)	0.7410	80%
헤파린 크로마토 그래피	웨스턴 블롯 결과		90% 이상
최종 정제 효율			54%

실험예 1: 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 이용한 순도 분석

최종 헤파린 용출액에 대한 순도를 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법을 이용하여 측정하였다.

SDS-PAGE 젤(12%)을 전기영동장치(Xcell Ⅱ Mini-Cell)에 장치하고 이동완충 액(SDS running buffer)을 채웠다. 각 시료 30 ㎕을 샘플 완충용액 3 ㎕와 혼합한 후 95 ℃에서 5분간 가열한 후 10,000 rpm 에서 3 ∼ 4분간 원심분리하고 분자량 표준품[MBI fementas 사]과 함께 각 웰에 25 ㎕씩 주입하였다. 시료 주입 후 130 V의 전압으로 전기영동하고 전개가 완료되면 젤을 꺼내어 은염색을 실시하였다. SDS-PAGE 결과를 도 5의 c)에 나타내었으며 hEPO 최종 정제물은 95% 이상의 순도를 보였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 형질전환 동물의 유즙으로부터 인체 단백질을 정제하는 방법은 유즙 전처리 공정으로 원심분리, 저온 침전, 황산암모늄 침전 및 크로마토그래피 단계 등으로 구성되어 복잡한 기존의 정제 방법에 비해 정제 소요 시간 및 비용을 감소시킬 수 있으며, 고순도, 고효율의 인체 단백질을 정제할 수 있다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 1) 형질전환 동물의 유즙을 8,000 ~ 10,000 rpm, 4 ~ 8 ℃에서 20 ~ 30 분 동안 원심분리하여 상등액만 취하는 단계;

   2) 상기 상등액에 EDTA를 넣어 -80 ～ -50 ℃에서 12 ～ 16 시간 동안 냉동보관하고 4 ～ 8 ℃에서 24 ～ 36 시간 녹인 후, 원심분리를 통한 저온 침전하는 단계;

   3) 상기 저온 침전 후 얻은 상등액에 5 ~ 50%의 황산암모늄을 천천히 가하고 0 ～ 8 ℃에서 0.5 ～ 1 시간 동안 섞으면서 보관한 후, 원심분리하여 상등액을 여과하는 유즙 전처리를 거쳐 불순단백질을 제거하는 단계;

   4) 상기 3) 단계의 수득물에 소수성 크로마토그래피를 수행하되 에틸렌클리콜로 용출하는 단계; 및

   5) 상기 용출액을 투석하고 단백질 A 크로마토그래피와 헤파린 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 단계

   로 이루어진 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 유즙 전처리방법을 통한 인체 단백질의 정제방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 2 항에 있어서, 상기 동물은 돼지, 소, 양, 염소, 토끼, 마우스 및 랫트 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 정제방법.

Images