CN102239173A - 与修饰的聚糖相关的方法 - Google Patents

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Abstract

除其他事项之外，本披露提供了用于富集、鉴别、和/或定量非常规修饰的聚糖类(例如磷酸化的聚糖类、硫酸化的聚糖类、和/或多乙酰化的聚糖类)的方法。在很多实施方案中，这些方法包括：提供一种聚糖制品，从该聚糖制品中已经释放了唾液酸；使该唾液酸酶处理过的聚糖制品经受一种基于荷质比来分离聚糖的分离技术；并且使用至少一种定量标准物对这些带电荷的产物进行定量。

Description

与修饰的聚糖相关的方法
本申请要求于2008年12月19日提交的美国临时专利申请序列号61/139,224的优先权，其全部披露通过引用结合在此。
背景
对于结合糖(例如糖蛋白)上的聚糖的修饰通常显著地影响该结合糖的功能。例如，聚糖修饰可以影响糖蛋白正确折叠的能力、稳定性(例如，对蛋白质分解和/或其他降解的耐受性)、催化活性、药效学和/或药物代谢动力学特性、和/或与其他分子的相互作用。糖蛋白的聚糖修饰可以影响该糖蛋白的转运和靶向。例如，糖蛋白的聚糖修饰可以影响该糖蛋白是否保留在细胞内(包括，例如将该糖蛋白正确地靶向到正确的一个或多个亚细胞区室中)，该糖蛋白是否将是膜结合的和/或该糖蛋白是否将是从细胞中分泌的。
概述
聚糖通常通过唾液酸化(即，通过加入一种唾液酸)来修饰。当分析糖蛋白时通常忽略了对聚糖的非常规修饰，例如硫酸化、磷酸化以及多乙酰化唾液酸化(例如，二乙酰化唾液酸化)。这类修饰可能被忽略至少部分是由于它们的分析的复杂性以及这类修饰的不稳定性。本披露包括以下认识，即虽然如此，非常规修饰是生物学相关的并且用于对它们进行鉴别和定量的方法是令人希望的。
除其他事项之外，本披露提供了用于对非常规修饰的聚糖进行富集、鉴别、检测和/或定量的方法。在很多实施方案中，这些方法包括提供一种聚糖制品(例如唾液酸酶处理过的聚糖制品)，从该聚糖制品中已经释放了唾液酸类。这种制品包括聚糖(即，耐唾液酸酶的聚糖)，这些聚糖没有被释放唾液酸的处理所切割。所提供的方法典型地包括使所提供的聚糖制品经受一种分离技术，该技术将具有一个第一电荷的聚糖类与不带电的聚糖类和/或具有一个第二电荷的聚糖类分开，和/或基于聚糖的荷质比来分离它们；并且任选地对分离出的聚糖进行定量。在很多实施方案中，定量包括使用至少一种定量标准物。
附图简要描述
[0001]图1描绘了一个示例性的N-连接的聚糖的结构。
图2描绘了聚糖中修饰的残基的非限制性实例：甘露糖-6-磷酸(M6P)和6-磺酸基-N-乙酰葡糖胺(6-磺酸基-GlcNAc)。为了清楚起见，在没有另外的修饰下描绘了一种常见唾液酸的结构(N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac))。正常地乙酰化出现在位置5处(已示出)；在位置7、8、和9处可以发生另外的乙酰化。如在此所使用的，关于唾液酸“多乙酰化”是指在位置7、8、和9中两个或更多个位置处另外的乙酰化。关于唾液酸使用“二乙酰化”来指在位置7、8、和9中两个位置处另外的乙酰化。
图3描绘了在唾液酸酶处理后，从一个中国研究来源获得的，从具有生物活性的促红细胞生成素治疗性糖蛋白衍生的非常规修饰的种类的一种阴离子交换层析-高效液相色谱(AEX-HPLC)图。插图描绘了使用2-氨基苯甲酰胺-壳二糖作为外标物的一个校准曲线。在此被鉴别为非常规修饰的种类的这些峰被进一步鉴别为磷酸化的N-聚糖和硫酸化的聚糖。
图4描绘了在唾液酸酶处理后，从具有与图3中所描述的促红细胞生成素治疗性糖蛋白97％的氨基酸序列一致性，具有生物活性的感兴趣的一种第二糖蛋白衍生的非常规修饰的种类的一种阴离子交换层析-高效液相色谱(AEX-HPLC)图，。在此被鉴别为非常规修饰的种类的这些峰被进一步鉴别为磷酸化的N-聚糖和硫酸化的聚糖。
图5描绘了来自硫酸化的聚糖的色谱分析的结果，这些聚糖是从小鼠体内产生的单克隆抗EGFR抗体衍生的。通过质谱法来鉴别该峰内聚糖的构成。例如在图B中所使用的命名法中，“5，4，1，0，0+SO3”相应于HexNAc5、Hex4、Fuc1、NeuAc0、NeuGc0+一个硫酸盐。
图6描绘了来自硫酸化的和二乙酰化唾液酸化的聚糖的色谱分析的结果，这些聚糖是从来自一个单克隆(克隆1)的CTLA4-IgG衍生的。通过质谱法来鉴别该峰内聚糖的构成。
图7描绘了来自硫酸化的和二乙酰化唾液酸化的聚糖的色谱分析的结果，这些聚糖是从来自两个不同的单克隆(克隆2，上图；克隆3，下图)的CTLA4-IgG衍生的。
定义
乙酰基：如在此所使用的，术语“乙酰基”(也称作“乙酰基团”并且通常缩写为“Ac”)被用于此处是指具有化学式-COCH3的官能团。
乙酰化：如在此所使用的，术语“乙酰化”是指通过共价地加入一个乙酰基团来进行修饰。例如，一种乙酰化的聚糖是通过共价地加入一个或多个乙酰基团来进行修饰的一种聚糖。乙酰化的聚糖可以或不可以具有另外的修饰。
乙酰化：如在此所使用的，术语“乙酰化”(在IUPAC命名法中也被称作“乙酰基团化”)是指将一个或多个乙酰基团共价地加到一个分子上(例如，一种聚糖上)的过程。
大致、约、大约：如在此所使用的，当应用于感兴趣的一个或多个值时，术语“大致”、“约”或“大约”是指类似于所说明的参考值的一个数值。在某些实施方案中，术语“大致”、“约”或“大约”是指落在所说明的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少之内的数值的一个范围。
生物样品：如在此所使用的，术语“生物样品”是指从任何活细胞或生物体获得的、由其排泄的或由其分泌的任何固体或液体样品，包括但不限于组织培养物、生物反应器样品、人或动物的组织、植物、果实、蔬菜、单细胞的微生物(例如，细菌以及酵母)以及多细胞的生物体。例如，生物样品可以是从以下各项得到的一种生物液体：例如，血液、血浆、血清、尿液、胆汁、精液、脑脊髓液、房水或玻璃体液、或任何一种身体的分泌物、一种渗出液、一种溢泌物(例如，从脓肿或感染或炎症的任何其他部位获得的液体)、或者从关节获得的液体(例如，正常的关节或被疾病(如类风湿性关节炎、骨性关节炎、痛风或脓毒性关节炎)侵袭的关节)。生物样品还可以是例如，从任何器官或组织(包括活检或尸检样本)获得的样品，可以包括细胞(不论是原代细胞或培养细胞)，任何细胞的条件培养基、组织或器官、组织培养物。
细胞表面糖蛋白：如在此所使用的，术语“细胞表面糖蛋白”是指一种糖蛋白，其至少一部分存在于细胞的外表面上。在一些实施方案中，细胞表面糖蛋白是一种蛋白，该蛋白被定位在细胞表面上，这样使得这些聚糖结构中至少一个存在于该细胞的外表面上。
细胞表面聚糖：“细胞表面聚糖”是一种聚糖，该聚糖存在于细胞的外表面上。在本披露的多个实施方案中，细胞表面聚糖作为细胞表面糖蛋白的一部分被共价地连接到一个多肽上。细胞表面聚糖还可以被连接到细胞膜的类脂上。
相关联：如在此所使用的，术语“相关联”是指在两个事物之间建立一种可预测的关系。在此所描述的实施方案中，细胞的表面上的糖基化模式(或其一种特征)是与由该细胞所生成的一种目标结合糖(例如，糖蛋白)的糖基化模式(或其一种特征)相关联。这些相关联的模式(或特征)不必彼此完全相同，只要一个可以从另一个被预测出来即可。一旦建立了相关性，它能够被记录在例如一种书面记录中或能够另外地被附加到一种介质或记忆源中(例如，计算机可读的介质或计算机存储体或存储盘)。然后，相关的糖基化模式(或其特征)的检测可以包含参考书面的或附加的记录、或参考证实该相关性的比较实验、等。这种比较实验可以与糖基化模式(或其特征)的评估同时完成，或可以是一种历史的或将来的实验。
二乙酰化：如在此所使用的，术语“二乙酰化”是指在通常未发现乙酰化的分子上两个位置处的乙酰化。当用于唾液酸分子的修饰时，“二乙酰化”是指除了在位置5处的乙酰化之外(这是典型地唾液酸中的乙酰化)，在两个位置处的乙酰化。在一些实施方案中，唾液酸分子的“二乙酰化”包括位置7、8、和9中的两个位置的乙酰化。(参见图2。)
聚糖：如本领域中已知的并且在此所使用的，“聚糖”是糖类。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，但典型地包含至少三个糖，并且可以是直链的或分支的。聚糖可以包括天然的糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、等)和/或修饰的糖(例如，2’-氟代核糖、2’-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺酸基N-乙酰葡糖胺、等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还包括结合糖的聚糖组分(例如，一种糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等)。该术语还包括游离的聚糖，包括从结合糖中切割的或另外地由其释放的聚糖。
聚糖制品：如在此所使用的，术语“聚糖制品”是指根据一个特定的产生方法而获得的一组聚糖。在一些实施方案中，“聚糖制品”是指从一种糖蛋白制品(参见以下糖蛋白制品的定义)中获得的一组聚糖。在某些实施方案中，聚糖制品包括对唾液酸酶具有耐受性的聚糖。
结合糖：如在此所使用的，术语“结合糖”包括其中至少一个糖部分被共价地连接到至少一个其他部分上的所有分子。该术语具体地包括具有共价附连的糖部分的所有生物分子，包括例如N-连接的糖蛋白、O-连接的糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等。
糖形：术语“糖形”被用在此处是指结合糖的一种特定的形式。即，当相同的主链部分(例如多肽、脂类、等)，(该相同的主链部分是结合糖的一部分)具有被连接到不同的聚糖或聚糖的不同组上的可能性时，则结合糖(即，其中主链被连接到一个特定组的聚糖上)的每一种不同形式被称为一种“糖形”。
糖脂：如在此所使用的，术语“糖脂”是指包含一个或多个共价连接的糖部分(即，聚糖)的一种类脂。该一个或多个糖部分可以是处于单糖、二糖、低聚糖、和/或多糖的形式。该一个或多个糖部分可以包括糖残基的一个单一的无支链的链或者可以包括一个或多个分支的链。在某些实施方案中，这些糖部分可以包括硫酸基团和/或磷酸基团。在某些实施方案中，这些糖蛋白包含O-连接的糖部分；在某些实施方案中，这些糖蛋白包含N-连接的糖部分。
糖蛋白：如在此所使用的，术语“糖蛋白”是指一种蛋白，该蛋白包含共价连接至一个或多个糖部分(即，聚糖)上的一个肽主链。如本领域的普通技术人员所理解的，这种肽主链典型地包括氨基酸残基的一个直链。在某些实施方案中，这种肽主链跨越了细胞膜，这样使得它包括一个跨膜部分以及一个细胞外部分。在某些实施方案中，跨越了细胞膜的糖蛋白的肽主链包括一个细胞内部分，一个跨膜部分、以及一个细胞外部分。在某些实施方案中，本披露的方法包括用一种蛋白酶来切割一种细胞表面糖蛋白以释放该糖蛋白的细胞外部分，或其一部分，其中这种暴露基本上不使细胞膜破裂。该一个或多个糖部分可以是处于单糖、二糖、低聚糖、和/或多糖的形式。该一个或多个糖部分可以包括糖残基的一个单一的无支链的链或者可以包括一个或多个分支的链。在某些实施方案中，这些糖部分可以包括硫酸基团和/或磷酸基团。可替代地或另外地，糖部分可以包括乙酰基、羟乙酰基、丙基或其他烷基的修饰。可替代地或另外地，糖部分可以通过二乙酰化来修饰。在某些实施方案中，这些糖蛋白包含O-连接的糖部分；在某些实施方案中，这些糖蛋白包含N-连接的糖部分。在某些实施方案中，在此所披露的方法包括对以下各项中任何一项或全部进行分析的一个步骤：细胞表面糖蛋白、释放的细胞表面糖蛋白的片段(例如，糖肽)、附连到细胞表面糖蛋白上的细胞表面聚糖、细胞表面糖蛋白的肽主链，此类糖蛋白、聚糖和/或肽主链的片段，以及它们的组合。
糖蛋白制品：如在此所使用的术语，“糖蛋白制品”是指一组单独的糖蛋白分子，该组中的每一个包括具有一个特定氨基酸序列(这种氨基酸序列包括至少一个糖基化位点)的多肽以及被共价地附连到该至少一个糖基化位点上的至少一种聚糖。在糖蛋白制品中的一种特定的糖蛋白的单独的分子典型地具有相同的氨基酸序列，但是可以在该至少一个糖基化位点的占用率方面和/或在被连接到该至少一个糖基化位点上的聚糖的身份方面有所不同。即，一种糖蛋白制品可以仅包括一种特定的糖蛋白的一种单一的糖形，但是更典型地包括多种糖形。相同的糖蛋白的不同制品可以在存在的糖形的身份方面(例如，在一种制品中存在的糖形可能是另一种制品中不存在的)和/或在不同糖形的相对量的方面有所不同。在一些实施方案中，本发明提供了用于分析相同糖蛋白的不同制品(即，具有相同的氨基酸序列)的方法以及试剂。在一些实施方案中，本发明提供了用于分析两个(或更多个)糖蛋白的方法以及试剂，这些糖蛋白的氨基酸序列显示至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的一致性，或者更高的一致性。
糖苷酶：如在此所使用的术语“糖苷酶”是指一种试剂，该试剂切割位于聚糖中顺序的糖之间或糖与主链部分之间(例如，在糖蛋白的糖与肽主链之间)的一个共价键。在一些实施方案中，糖苷酶是一种酶。在某些实施方案中，糖苷酶是包括一个或多个多肽链的一种蛋白(例如，一种蛋白质酶)。在某些实施方案中，糖苷酶是一种化学切割试剂。
糖基化模式：如在此所使用的，术语“糖基化模式”是指在一个特定的样品上存在的一组聚糖结构。例如，一个特定的结合糖(例如，糖蛋白)或一组结合糖(例如，一组糖蛋白)将具有一种糖基化模式。在一些实施方案中，提及细胞表面聚糖的糖基化模式，或者一种“表面糖基化模式”。如在此所使用的，“表面糖基化模式”可以指存在于感兴趣的一个单一的细胞表面糖蛋白和/或糖脂的细胞外结构域上的聚糖的模式(或“糖基化模式”)。另外地或者可替代地，“表面糖基化模式”可以指存在于多种细胞表面糖蛋白和/或糖脂的细胞外结构域上的聚糖的模式(或“糖基化模式”)。在某些实施方案中，“表面糖基化模式”描述了存在于细胞表面糖蛋白和/或糖脂的整个补体上的聚糖的模式(或“糖基化模式”)。基于上下文，本领域的普通技术人员应当容易地理解“表面糖基化模式”是否是指多种细胞表面糖蛋白和/或糖脂的糖基化模式。糖基化模式可以被表征为，例如聚糖的身份、单独的聚糖或特定类型的聚糖的量(绝对的或相对的)、糖基化位点的占用程度、聚糖的修饰(例如唾液酸化、多乙酰化唾液酸化、磷酸化、硫酸化、等)、等，或者这些参数的组合。
多乙酰化：如在此所使用的，术语“多乙酰化”是指在通常未发现乙酰化的分子上的两个或更多个位置处的乙酰化，。当用于唾液酸分子的修饰时，“多乙酰化”是指除了在位置5处的乙酰化之外(这是典型地唾液酸中的乙酰化)，在两个或更多个位置处的乙酰化。在一些实施方案中，唾液酸分子的多乙酰化包括位置7、8、和9中两个或更多个位置的乙酰化。(参见图2。)
N-聚糖：如在此所使用的，术语“N-聚糖”是指糖的一种聚合物，该聚合物从一种结合糖中释放出来，但是之前通过一个氮连接(参见以下N-连接的聚糖的定义)被连接到该结合糖上。
N-连接的聚糖：如在此所使用的，术语“N-连接的聚糖”是指通过一个氮连接被连接到一个结合糖上的聚糖。存在着不同种类的N-连接的聚糖，但是它们典型地基于共同的核心戊糖(Man)3(GlcNAc)(GlcNAc)。
O-聚糖：如在此所使用的，术语“O-聚糖”是指糖的一种聚合物，该聚合物从一种结合糖中释放出来，但是之前通过一个氧连接(参见以下O-连接的聚糖的定义)被连接到该结合糖上。
O-连接的聚糖：如在此所使用的，术语“O-连接的聚糖”是指通过一个氧连接被连接到一个结合糖上的聚糖。O-连接的聚糖典型地通过N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)而被附连至糖蛋白上或者通过N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)而被附连至L-丝氨酸(Ser)或L-苏氨酸(Thr)的羟基基团上。一些O-连接的聚糖还具有多种修饰作用，如乙酰化作用和硫酸化作用。在一些例子中，O-连接的聚糖通过岩藻糖被附连到糖蛋白上，或通过甘露糖被附连到L-丝氨酸(Ser)或L-苏氨酸(Thr)的羟基基团上。
磷酸基：如在此所使用的，术语“磷酸基”被用于此处是指一个PO4 -基团(在自由溶液中)，或一个PO3基团(作为化合物的一部分)。作为化学名称的一部分，术语“磷酸基”是指通过加入一个磷酸基团进行的化学修饰。
磷酸化：如在此所使用的，术语“磷酸化”是指通过共价加入一个磷酸基团而进行的修饰。例如，磷酸化的聚糖是通过共价加入一个或多个磷酸化的基团而修饰的聚糖。磷酸化的聚糖可以或不可以具有另外的修饰。
磷酸化作用：如在此所使用的，术语“磷酸化作用”是指将一个或多个磷酸基团共价地加至一个分子(例如，一种聚糖)上的过程。
蛋白酶：如在此所使用的，术语“蛋白酶”是指一种试剂，该试剂切割位于多肽链中的顺序的氨基酸之间的一个肽键。在一些实施方案中，蛋白酶是一种酶(即，一种蛋白水解酶)。在某些实施方案中，蛋白酶是包括一个或多个多肽链的一种蛋白(例如，一种蛋白质酶)。在某些实施方案中，蛋白酶是一种化学切割试剂。
蛋白质：总体而言，“蛋白”是一种多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的链)。蛋白可以包括除了氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以被另外地加工或修饰。本领域的普通技术人员应当理解的是“蛋白”可以是如细胞所生产的一种完整的多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是它的一个功能性部分。普通技术人员应当进一步地理解的是有时蛋白可以包括多于一种的多肽链，例如通过一个或多个二硫键相连接或者通过其他方式相结合。
唾液酸：如在此所使用的，术语“唾液酸”是用于神经氨酸(一种九碳单糖)的N-或O-取代的衍生物的一个通称。神经氨酸的氨基基团典型地在唾液酸中带有乙酰基亦或羟乙酰基基团。存在于唾液酸上的羟基取代基可以通过乙酰化作用、甲基化作用、硫酸化作用、以及磷酸化作用进行修饰。主要的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。唾液酸将一个负电荷传递到聚糖上，因为羧基基团在生理pH下倾向于解离出一个质子。示例性的去质子的唾液酸显示如下：
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唾液酸酶：如在此所使用的，术语“唾液酸酶(sialidase)”(也拼写为“sialydase”)是指从聚糖上切割唾液酸残基的一种试剂。在一些实施方案中，唾液酸酶是一种酶。在某些实施方案中，唾液酸酶是包括一个或多个多肽链的一种蛋白(例如，一种蛋白质酶)。在某些实施方案中，唾液酸酶是一种化学切割试剂；在一些这样的实施方案中，唾液酸酶是一种弱酸。
对唾液酸酶具有耐受性：如在此所使用的，当用于指聚糖时，术语“对唾液酸酶具有耐受性”描述了基本上对于通过如在此定义的唾液酸酶处理进行的切割具有耐受性的特征。例如，对唾液酸酶具有耐受性的聚糖可以缺乏唾液酸酶修饰。另外地或可替代地，对唾液酸酶具有耐受性的聚糖可以包括基本上不能被唾液酸酶处理来切割的多种修饰。这类修饰的实例包括硫酸化、磷酸化、和/或多乙酰化唾液酸化。如在此所使用的，“对唾液酸酶具有耐受性”的聚糖包括包含唾液酸修饰和其他修饰两者的聚糖，这些其他修饰基本上不能被唾液酸酶处理来切割。例如，具有唾液酸修饰和磷酸化作用两者的聚糖分子是对唾液酸酶具有耐受性的。
唾液酸酶处理：如在此所使用的，“唾液酸酶处理”是指在适当的条件下用一种试剂进行处理从而允许切割唾液酸残基的连接的显著的比例。在一些实施方案中，唾液酸酶处理导致了从分子(例如聚糖)释放唾液酸。在一些实施方案中，该试剂是一种酶多肽，例如一种唾液酸酶多肽。在一些实施方案中，该试剂是一种化学试剂，例如一种弱酸或弱酸的一种组合。在一些实施方案中，将具有唾液酸酶活性的试剂的一种组合用于唾液酸酶处理中。因此，“唾液酸酶处理的”样品(像例如唾液酸酶处理的聚糖制品)在这些条件下经历了用一种试剂进行的处理从而允许切割唾液酸残基的连接的显著的比例。
基本上：如在此所使用的，术语“基本上”是指展示出感兴趣的特征或特性的全部或接近全部的范围或程度的定性的情况。生物学领域的普通技术人员应当理解的是生物学以及化学现象很少(如果有的话)会达到完成和/或进行到完成或实现或避免一个绝对的结果。因此，术语“基本上”被用在此处用来获得在许多生物学以及化学现象中潜在地缺少的内在的完全性。对于仅给出一个具体的实例，当也就是说一种处理“基本上”不会使细胞膜破裂时，它意思是指例如，在处理的过程中以及在处理之后所有的或大部分的细胞膜保持完整，这样使得细胞内的糖蛋白或糖肽不会因此从细胞中释放出来。在某些实施方案中，当应用于未破裂的细胞膜时，术语“基本上”是指一种情况，其中经受了一种特定处理的细胞的15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少展示出可测量的破裂的细胞膜。在某些实施方案中，当应用于未破裂的细胞膜时，术语“基本上”是指一种情况，其中经受了一种特定处理的细胞没有一个展示出可测量的破裂的细胞膜。
硫酸基：如在此所使用的，术语“硫酸基(sulfate)”被用在此处是指一个SO4 -基团(在自由溶液中)，或一个SO3基团(作为化合物的一部分)，并且可替代地拼写为“sulphate”。作为化学名称的一部分，术语“硫酸基”是指通过加入一个硫酸基团来进行的化学修饰。
硫酸化：如在此所使用的，术语“硫酸化(sulfated)”是指通过共价加入一个硫酸基团来进行的修饰，并且可替代地拼写为“sulphated”。例如，硫酸化的聚糖是通过共价加入一个或多个硫酸基团来进行修饰的聚糖。硫酸化的聚糖可以或不可以具有另外的修饰。
硫酸化作用：如在此所使用的，术语“硫酸化作用”是指将一个或多个硫酸基团共价地加至一个分子上(例如，一个聚糖上)的过程。
非常规修饰：如在此所使用的，当用于聚糖的修饰时，术语“非常规修饰”是指除了在位置5处的乙酰化之外，除了不对这些唾液酸进行修饰的唾液酸化之外的修饰。非常规修饰的非限制性实例包括磷酸化、硫酸化、以及多乙酰化唾液酸化。例如，可以将甘露糖残基在C-6位置处磷酸化，可以将N-乙酰葡糖胺残基在C-6位置处硫酸化，可以将唾液酸残基在除了在通常的位置5处进行乙酰化之外，在位置7、8、和9中两个位置处进行乙酰化，等。
某些优选的实施方案的详细描述
如在此所描述的，本披露涉及对混合物中的非常规修饰的聚糖进行富集、鉴别、检测和/或定量的方法。总体上，非常规修饰的聚糖包括除了唾液酸化之外的修饰，该唾液酸化将一个电荷传递到聚糖上。在一些实施方案中，该电荷是一个负电荷。非常规修饰的实例包括磷酸化、硫酸化、多乙酰化唾液酸化或它们的一种组合。在很多实施方案中，方法包括提供一种聚糖制品，从该聚糖制品中已经释放了唾液酸类；使该聚糖制品经受一种分离技术，该分离技术基于荷质比来分离聚糖类；并且对至少一种分离出的聚糖进行定量。在很多实施方案中，这种定量包含使用至少一种定量标准物。
I.聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类)
总体而言，通过从聚糖的一个来源获得材料并且对该材料进行处理从而提供了聚糖制品。如在此所使用的，术语“聚糖制品”典型地是指当该材料已经经历处理以释放聚糖后，包括聚糖的材料。在很多实施方案中，聚糖制品还经历了一种处理和/或过程以从该制品释放唾液酸。在一些实施方案中，用于释放唾液酸的处理包括如在此所描述的唾液酸酶的处理。还经历了唾液酸酶处理的聚糖制品在此被称为“唾液酸酶处理的聚糖制品”。如在此所使用的，术语“唾液酸酶处理的聚糖制品”包括已经经历了除了所描述的处理之外的处理加工的材料。
可以从如以下所讨论的多种来源获得聚糖。为了有助于更好地理解所提供的方法，提供了聚糖以及结合糖的描述。
A.聚糖和结合糖
总体而言，聚糖是指一个碳水化合物部分，在一些实施方案中该碳水化合物部分被共价地附连到一种糖蛋白上。碳水化合物部分(例如，低聚糖链)通过或者N-连接亦或O-连接被连接到内质网中以及高尔基体中的糖蛋白上。本披露包括以下识别，即确定聚糖(例如，结合到糖蛋白中的多肽上的聚糖)的非常规修饰(例如磷酸化)是有利的。可以使用在此所描述的方法来分析任何聚糖的非常规修饰(例如，聚糖制品内的量、修饰的化学性质、等)。可替代地或另外地可以使用多种方法来富集非常规修饰的聚糖种类。
1.N-连接的聚糖
典型地，N-连接的低聚糖链被加到内质网的腔中的糖蛋白上(参见Alberts et al.，Molecular Biology of the Cell，1994，通过引用结合在此)。碳水化合物部分被加到包含在目标一致序列Asn-X-Ser/Thr内的天冬酰胺残基的侧链上的氨基基团上，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。通常地，在内质网中通过特异性的糖苷酶来修剪初始的低聚糖链，产生由两个N-乙酰葡糖胺以及三个甘露糖残基组成的一个短的、分支的核心低聚糖。
可以将N-连接的聚糖和N-聚糖再分成三个不同的组，称为“高甘露糖型”、“杂合型”、以及“复合型”，其中在所有三个组中均存在一个共同的戊糖核心(Manp(α1，6)-(Manp(α1，3))-Manp(β1，4)-GlcpNAc(β1，4)-GlcpNAc(β1，N)-Asn)。对该核心的修饰作用包括，例如，另外的糖基化作用，提供一个二等分的GlcNAc，将一个岩藻糖基残基附接至最靠内的GlcNAc上，以及用唾液酸(Neu)残基进行加帽。图1描绘了一个示例性的N-连接的聚糖的结构。如图1所示，就(高达)4个触角而言，N-连接的聚糖的结构变化大多数发生在图1中所描绘的N-连接的聚糖的左手侧。N-连接的聚糖通常被发现作为肽(即，糖肽)以及蛋白(即，糖蛋白)的组分。
在内质网中进行初始的处理之后，然后糖蛋白被运送至高尔基体，在那里可以发生进一步的处理。修剪过的N-连接的低聚糖链可以通过加上几个甘露糖残基来修饰，导致了一个“高甘露糖的低聚糖”。可替代地或另外地，可以将N-乙酰葡糖胺的一个或多个单糖单元加到核心甘露糖的亚单位上从而形成“复合的低聚糖”。可以将半乳糖加到N-乙酰葡糖胺的亚单位上，并且可以将唾液酸的亚单位加到半乳糖的亚单位上，导致了以唾液酸、半乳糖、或N-乙酰葡糖胺残基中任何一种来终止的链。可以将岩藻糖残基加到核心低聚糖的N-乙酰葡糖胺残基上。这些加入的每一个都是由特异性的糖基转移酶来催化的。
‘杂合聚糖’包含高甘露糖以及复合聚糖二者的特征。例如，杂合聚糖的一个支链可以主要地或唯一地包括甘露糖残基，而另一个支链可以包括N-乙酰葡糖胺、唾液酸、半乳糖、和/或岩藻糖。
N-连接的聚糖涉及多种细胞加工。例如，N-连接的聚糖对真核细胞中正确的蛋白折叠有影响。内质网中的分子伴侣蛋白(例如，钙联接蛋白以及钙网蛋白)结合到存在于N-连接的聚糖核心上的三个葡萄糖残基上。分子伴侣蛋白典型地帮助聚糖附连到其上的蛋白的折叠。在正确的折叠之后，将这三个葡萄糖残基移去，并且该N-连接的聚糖可以移动到进一步的加工反应上。如果蛋白未正确地折叠，则这三个葡萄糖残基被再附连，允许该蛋白与分子伴侣再结合。这种循环可以重复数次，直至蛋白达到其正确的构象。如果蛋白重复地未正确地折叠，则通常地它从内质网中被排泄出来并且被细胞质蛋白酶降解。
可替代地或另外地，N-连接的聚糖通过空间位阻效应对蛋白折叠产生影响。例如，由于附近聚糖的大小，可以暂时地阻断肽中的半胱氨酸残基与其他半胱氨酸残基形成二硫键。因此，N-连接的聚糖的存在可以允许细胞控制哪些半胱氨酸残基将形成二硫键。
N-连接的聚糖可以涉及细胞间相互作用。例如，肿瘤细胞经常产生异常的N-连接的聚糖结构，这些结构可以被天然杀伤细胞上的CD337受体识别为表示所讨论的细胞是癌性的一种信号。
N-连接的聚糖可以涉及将降解的溶酶体酶类靶向至溶酶体。使用甘露糖-6-磷酸残基来修饰N-连接的聚糖可以用作表示这种聚糖被附连到其上的蛋白应当被靶向至溶酶体的一个信号。
2.O-连接的聚糖
O-连接的低聚糖链被加至多肽链中特异性的丝氨酸或苏氨酸残基上。该第一糖残基(在许多情况下它是一种N-乙酰半乳糖胺)的转运典型地在内质网中开始并且在高尔基体中完成。一次一个地加入O-连接的低聚糖的这些残基并且通过特异性的酶进行催化来加入每个残基。与N-连接的糖基化作用相反，用于O-连接的糖基化作用的共有氨基酸序列较少地被良好地定义。
3.结合糖
本披露的技术可以用于评估和/或富集感兴趣的任何结合糖(此后称为“目标结合糖”)上的非常规修饰的聚糖。关于“感兴趣的结合糖”、“感兴趣的糖蛋白”、“目标结合糖”、“目标糖蛋白”等并不旨在意指总是存在其聚糖正在被评估的一个特定的结合糖。实际上，在某些实施方案中，使用所提供的方法来评估来自存在于一种源材料中的结合糖上的聚糖，而不旨在靶向一种特定的结合糖。
在某些实施方案中，对感兴趣的特定的结合糖上的聚糖进行评估。在一些实施方案中，该感兴趣的结合糖是一种糖蛋白(此后称为“目标糖蛋白”)。
在一些实施方案中，该目标结合糖是由细胞自然地产生的。在一些实施方案中，该目标结合糖不是由细胞自然地产生的；而是，已经将细胞工程化来生产它。在一些实施方案中，这种目标结合糖是由细胞自然地产生的，但是已经将该细胞工程化从而以升高的水平和/或在预定的条件下(例如，在存在一种诱导剂的情况下、等)来生产它。
在多个实施方案中，当施用于动物(例如，哺乳动物(如，人类))时，目标结合糖具有治疗活性。例如，促红细胞生成素、干扰素、血液凝血因子、集落刺激因子、多种抗体、以及某些酶类、等都是糖蛋白，这些糖蛋白目前是作为生物药剂学的试剂在工程化的细胞系中来生产的。在一些实施方案中，生物药剂学的试剂上的聚糖(例如，像以前提到的那些)如在此所描述的那样进行测定。本领域的普通技术人员应当知道为了治疗以及其他目的可以进行工业化表达(例如，在生产型生物反应器中)的其他商业相关的结合糖。本披露提供了用于对此类商业相关的结合糖的聚糖(例如糖蛋白)进行评估的多种方法。
代表性的可商购的糖蛋白的产品包括，例如表1中所列出的那些。
表1：可商购的糖蛋白产品的非限制性的实例
Figure BPA00001374798600161
Figure BPA00001374798600181
如本领域的普通技术人员所应当理解的，此类治疗性糖蛋白的糖基化模式(包括例如像在此所讨论的那些的修饰)能够潜在地影响它们的治疗特性。在一些实施方案中，当正在生产糖蛋白时(即，在生产的不同阶段)，对该治疗性糖蛋白的聚糖进行评估。这类评估可以有助于质量控制。
本领域的普通技术人员应当理解的是本披露不限于对以上所列出的结合糖上、或者实际上对治疗性结合糖上、或者对细胞中其表达(和/或表达的程度或时间)已经被工程化的这些结合糖上的聚糖进行评估。这些代表了本披露的某些具体的实施方案；然而，本领域的普通技术人员应当理解的是本披露的原理适用于任何一种目标结合糖。
B.聚糖和/或结合糖的来源
可以被处理以获得一种聚糖制品的材料一般包括其聚糖有待分析和/或富集的结合糖(例如糖蛋白)。可以从多种来源获得材料，包括但不限于，治疗性配制品(例如，促红细胞生成素、胰岛素、人生长激素、等)、商业生物产品(例如，在表1中所提出的那些)、生物反应器、以及生物样品。材料可以从一个来源获得或者从多个来源合并。如在此所使用的，术语“生物样品”是指从任何活细胞或生物体(包括但不限于组织培养物、人或动物的组织、植物、果实、蔬菜、单细胞的微生物(如，细菌以及酵母)、多细胞的生物体、以及它们的组合)获得的、由其排泄的或由其分泌的任何一种固体或液体的样品(例如体液)。例如，生物样本可以是从下组中获得的一种生物液体，该组由以下各项组成：例如，血液、血浆、血清、尿液、胆汁、精液、脑脊髓液、房水或玻璃体液、或任何一种身体分泌物、一种渗出液、一种溢泌物(例如，从脓肿或感染或炎症的任何其他部位获得的液体)，或者从关节获得的液体(例如，正常的关节或被疾病(如，类风湿性关节炎、骨性关节炎、痛风或脓毒性关节炎)侵袭的关节)。生物样品还可以是例如从任何一种器官或组织获得的(包括活检或尸检样品)一种样品，可以包括细胞(不论是原代细胞或培养细胞)、任何细胞的条件培养基、组织或器官、组织培养物。
可以被处理以获得一种聚糖制品的来源材料可以被任何机器、人、或实体所接收。在一些实施方案中，来源材料可以被机器所接收，然后它可以进行糖蛋白制品的一个或多个测试、处理、或精制。在一些实施方案中，来源材料可以被人接收。在一些实施方案中，来源材料可以从一个外面的实体来接收。在一些实施方案中，来源材料可以被个人或企业(为一个第二个人或企业完成表征服务)所接收。例如，一个企业可以得到运行，其中该企业接收了来自其他企业或实验室的来源材料(这些来源材料包括有待表征的聚糖)。适合用于处理以得到一种聚糖制品的来源材料能够以任何方式进行预处理。例如，可以对来源材料进行预处理以分离出一种或多种糖形。
在某些实施方案中，来源材料包括由细胞生产的多种结合糖(例如，多种糖蛋白)。可以在多种细胞和/或细胞系的任何一种中生产糖蛋白。实际上，可以使用糖基化了其多种蛋白中至少一些的任何一种细胞并且在允许这种糖基化作用发生的任何条件下使其生长。适合的细胞包括但不限于：哺乳动物细胞、禽类细胞、鱼类细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞、以及杂交细胞。在一些实施方案中，已经对这些细胞进行(例如，用遗传方法和/或用化学方法)工程化以使一个或多个糖基化特征更类似于人类细胞。
根据本披露可以使用的示例性的哺乳动物细胞包括但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞、幼仓鼠肾(BHK细胞)、NS0细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、U87细胞、A172细胞、HL60细胞、A549细胞、SP10细胞、DOX细胞、DG44细胞、HEK293细胞、SHSY5Y、Jurkat细胞、BCP-1细胞、COS细胞、Vero细胞、GH3细胞、9L细胞、3T3细胞、MC3T3细胞、C3H-10T1/2细胞、NIH-3T3细胞、以及C6/36细胞。
根据本披露可以使用的示例性的鱼类细胞系包括但不限于：ZF4细胞、AB9细胞、GAKS细胞、OLF-136细胞、CAEP细胞、CAF细胞、OLHE-131细胞、OLME-104细胞、ULF-23细胞、BRF41细胞、Hepa-E1细胞、Hepa-T1细胞、GEM-81细胞、GEM-199细胞、GEM-218细胞、GAKS细胞、D-11细胞、R1细胞、RTG-2细胞、RTO细胞、以及TPS细胞。更完整的列表可以在Fryer and Lannan，2005，“Three decades of fish cell culture：a currentlisting of cell lines derived from fishes，”J.Tissue Culture Methods，16：87-94中找到。
根据本披露可以使用的示例性的昆虫细胞系包括但不限于：SFM细胞、Sf21细胞、Sf9细胞、Schneider细胞、S2细胞、T.ni细胞、SES-MaBr-1细胞、SES-MaBr-3细胞、NIAS-MB-25细胞、NIAS-MaBr-92细胞、FRI-SpIm-1229细胞、SES-MaBr-4细胞、NIAS-LeSe-11细胞、TUAT-SpLi-221细胞、NIAS-PX-64细胞、NIAS-MB-32细胞、NIAS-MaBr-93细胞、SES-MaBr-5细胞、BM-N细胞、NIAS-PX-58细胞、MBHL-2细胞、以及MBHL-3细胞。
本领域的普通技术人员应当认识到的是根据本披露这是一种示例性的，而不是全面的，可以使用的不同细胞的列表。有利地是可以使用其他细胞来生产目标糖蛋白。此类细胞可以处于培养物中或者处于组织、器官、或生物体的环境中。
本领域的普通技术人员还应当理解的是根据本披露可以使用多种表达系统和载体从而在所使用的细胞或细胞系中表达感兴趣的蛋白(例如参见Molecular cloning：A Laboratory Manual，Ed.by Sambrook，CSHL Press，2002)。
而且，根据本披露可以使用多种细胞培养基中任何一种，包括能够支持一种或多种细胞类型或细胞系的生长的复合培养基和/或无血清的培养基。典型地，细胞培养基包含一种缓冲剂、盐类、能源、多种氨基酸(例如，天然的氨基酸、非天然的氨基酸、等)、多种维生素、和/或多种痕量元素。细胞培养基可以任选地包含多种其他成分，包括但不限于：碳源(例如、天然的糖类、非天然的糖类、等)、辅因子、脂类、糖类、核苷类、动物衍生的组分类、水解产物类、激素类/生长因子类、表面活性剂类、指示剂类、矿物质类、特异性酶类的激活剂类/抑制剂类、以及有机物类(例如，丁酸酯(该丁酸酯诱导了凋亡，该凋亡释放了糖基化酶)经常使细胞的生长速率变缓(这种变缓改变了糖基转移酶的水平，该糖基转移酶的水平可以导致更成熟的糖基化作用)；并且导致细胞的能量方面的变化；氯喹，它影响细胞内的pH；甜菜碱，它是一种渗透保护剂；氨，它改变了细胞内的pH水平并且它可以改变糖基转移酶的效率；等)、和/或小分子代谢产物(例如，CMP-唾液酸、葡糖胺、非天然的糖衍生物、等)。根据本披露适合使用的细胞培养基可以从多个来源(例如ATCC(Manassas，Va))商购。
在某些实施方案中，使用以下培养基中的一种或多种来生长细胞：RPMI-1640培养基、达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基、伊格尔最低基础培养基、F-12K培养基、伊思考夫氏改良的达尔伯克氏培养基。如本领域的普通技术人员所应当理解的，当使用无血清和/或无蛋白胨的限定培养基时，这种培养基典型地高度富集了多种氨基酸以及痕量元素(参见例如授予Mather等人的美国专利号5,122,469，以及授予Keen等人的美国专利号5,633,162)。
不同的细胞培养基可以影响该培养基中所表达的糖蛋白的糖基化模式。例如，一种给定的细胞培养基可以导致产生糖蛋白，这些糖蛋白具有一种增加的糖基化模式、一种降低的糖基化模式、或一种改变的糖基化(例如，表示在某些聚糖方面增加并且在其他聚糖方面降低)。本领域的普通技术人员应当知道并且应当能够选择适合用于生长细胞的一个或多个细胞培养基，这些生长细胞的聚糖有待使用本披露的某些方法来进行分析。
在一些实施方案中，将这些细胞按照以下方式进行培养：分批培养、加料分批培养、灌注培养、静态悬浮(例如，转瓶、T型烧瓶、微载体、T150、等)、和/或在摇床上。
根据本披露生产至少一种糖蛋白(即，目标糖蛋白)的细胞可以在多种细胞培养条件中任何一种下进行生长。
在一些实施方案中，在这些条件下培养这些细胞，这样使得预期该目标糖蛋白展示出一种所希望的糖基化模式。在一些实施方案中，对一个或多个细胞培养条件进行控制和/或改变从而生产具有更加令人希望的糖基化模式的目标糖蛋白。可以被控制或改变的此类细胞培养条件包括但不限于：pH、CO2水平、氧气水平、培养物的搅拌速率、氧化还原的条件、培养温度、细胞密度、种子培养物的密度、培养的持续时间、反应器的设计、喷雾速率、和/或摩尔渗透压浓度。
如果希望的话，可以使用多种方法中任何一种来从这种细胞培养基中分离出这些细胞。在某些实施方案中，在悬浮培养下生长这些细胞。在此类实施方案中，可以通过离心和清洗(例如，使用一种生理学上适合的洗涤液，如磷酸盐缓冲盐水)的一个或多个循环将这些细胞从这种细胞培养基中纯化出来。
在某些实施方案中，在粘附培养下生长这些细胞。在此类实施方案中，通过首先从培养物表面释放这些细胞从而可以将它们从细胞培养基中纯化出来。例如，通过使这些细胞经受EDTA可以将它们从这种培养物表面释放出来。本领域的普通技术人员应当知道可以用于将粘附的细胞从这种培养物表面释放出来的其他适合的试剂。在释放之后，可以通过离心和洗涤(例如，使用一种生理学适合的洗涤液，如磷酸盐缓冲盐水)的一个或多个循环来纯化这些细胞。当在悬浮培养下生长细胞时，应该注意不要用太大的力来离心这些细胞以避免不必要的细胞破裂。
C.处理
然后使包括结合糖的来源材料经受如以下所描述的双重处理。如在此所使用的“聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类”是指在双重处理和任选的另外的加工(例如像另外的处理、储存、分级分离、冷冻、融化、等)之后所得到的制品。
用于制备聚糖制品的双重处理总体上包括(1)用于从结合糖释放聚糖的一种处理以及(2)用于释放唾液酸的一种处理。可以按相对于彼此的任何顺序来完成这些处理，包括同时的和/或重叠的进行处理。例如，可以从结合糖中释放聚糖，并且然后对聚糖进行处理以释放唾液酸(例如，使用唾液酸酶)。在一些实施方案中，对结合糖进行处理以释放唾液酸(例如，使用唾液酸酶)，并且然后从结合糖中释放聚糖。在一些实施方案中，在双重处理的总持续时间的至少一部分期间，结合糖同时经受两种处理。
1.聚糖的释放
使用多种方法中任何一种(例如在此所描述的方法)来从结合糖释放聚糖。
在某些实施方案中，在已经将这些结合糖从细胞中释解出来之后(例如，通过用蛋白酶进行处理(如以下更详细地描述))，将一种或多种聚糖结构从这些结合糖上切割下来。在某些实施方案中，将一种或多种聚糖结构从还未从细胞中释解出来的结合糖(例如在细胞表面上的结合糖)上切割下来。
在某些实施方案中，通过使用识别并切割这些聚糖结构的一种酶或多种酶来释放一种或多种聚糖结构。根据本披露，可以使用从结合糖上切割这些聚糖结构的多种糖苷酶以及其他酶类中的任何一种。此类酶的几个实例在R.A.O′Neill，Enzymatic release of oligosaccharides from glycoproteins forchromatographic and electrophoretic analysis，J.Chromatogr.A 720，201-215.1996；以及S.Prime，et al.，Oligosaccharide sequencing based on exo-andendo-glycosidase digestion and liquid chromatographic analysis of the products，J.Chromatogr.A 720，263-274，1996中进行了综述，其中每一篇通过引用以其全部内容结合在此。在某些实施方案中，使用酶PNGase F(肽N-糖苷酶F)来从一种糖肽或糖蛋白上移去这些聚糖。PNGase-F是一种酰胺酶，它切割来自N-连接的糖蛋白的高甘露糖、杂合、以及复合低聚糖的最靠内的GlcNAc与天冬酰胺残基之间的酰胺键。另外地或可替代地，在某些实施方案中，使用酶PNGase A、O-聚糖酶、和/或Endo-H来移去这些聚糖。
为了改进糖蛋白中糖基化位点对于切割酶的可接近性，一些糖蛋白可以经历一个蛋白质变性的步骤。典型地，蛋白质变性是通过使用洗涤剂(例如SDS)和/或二硫化物还原剂(例如β-巯基乙醇)来完成的，尽管根据本披露用来使糖蛋白变性的方法不限于使用此类试剂。例如，暴露于高温下能够足以使糖蛋白变性，这样使得适合用于切割这些聚糖结构的酶能够接近该切割位点。在某些实施方案中，通过将糖蛋白在以下温度下孵育足以使该糖蛋白变性的一段时间来使该糖蛋白变性：约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99、约100摄氏度、或更高。
在某些实施方案中，采用洗涤剂、二硫化物还原剂、高温、和/或其他试剂或反应条件的一个组合来使糖蛋白变性。本领域的普通技术人员应当知道足以使糖蛋白变性的适合的条件、孵育时间、等。应当注意的是位于免疫球蛋白G(IgG)中保守的Fc位点上的低聚糖容易被PNGase F切割。因此，当使用这种酶时，典型地不需要将蛋白质变性的步骤用于IgG分子。PNGaseF还能够在稀氨水溶液中将这些低聚糖移去，在37℃下在2.5M脲中稳定持续24小时，并且在5M脲中仍然具有其40％的活性。因此，PNGase F具有以下优点，即在某些变性条件下它能够从糖蛋白中切割聚糖。
根据本披露可以用来从结合糖中切割这些聚糖结构的其他适合的酶类包括但不限于：PNGase A、O-聚糖酶、和/或Endo-H。本领域的普通技术人员应当知道用于从结合糖中切割聚糖的其他适合的酶类。在一些实施方案中，使用多种酶来从结合糖上切割这些聚糖结构。在一些实施方案中，同时施用此类多种切割酶。在一些实施方案中，顺序地施用此类多种切割酶。
在一些实施方案中，通过使用除了酶之外的试剂来从结合糖上切割一个或多个聚糖结构。在一些实施方案中，可以使用一种化学试剂或多种化学试剂(例如，暴露于一种试剂，如肼、硼氢化钠、内切糖苷酶、三氟甲磺酸(TFMS)、和/或β-消除剂、等)来从结合糖上切割聚糖结构。例如：已经成功地采用这种化学性肼的应用来切割这些聚糖结构。作为另一个非限制性实例，已经建议可以将氨-碳酸铵的一种混合物用于以其天然形式碱性释放N-连接以及O-连接的低聚糖两者(参见Y.Huang，et al.，Microscalenonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis throughMALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis，Anal.Chem.73，6063-60，2001，通过引用以其全部内容结合在此)。本领域的普通技术人员应当知道根据本披露可以使用的其他适合的化学试剂。在一些情况下，使用化学试剂来从糖蛋白上切割这些聚糖结构导致了蛋白质的降解以及切割。然而，在切割之后，在分析和/或表征之前经常将这种聚糖结构从这种糖蛋白的蛋白组分中纯化出来。在此类情况下，用化学试剂处理之后这种蛋白组分的降解对于本披露的实践不是有害的。在一些情况下，这种蛋白组分的降解甚至可以帮助对这种或这些切割的聚糖结构进行纯化的过程。
2.唾液酸的释放
提供一种聚糖制品(从该聚糖制品中已经释放了唾液酸类)总体上包括将包括聚糖类(释放的或在结合糖的环境中的，或者二者)的一种组合物暴露于一种或多种试剂，该一种或多种试剂在允许切割唾液酸残基的条件下切割多种唾液酸残基。根据所提供的方法，可以使用从聚糖上切割这些唾液酸残基的多种试剂中任何一种。
在一些实施方案中，从聚糖制品上释放唾液酸包括用唾液酸酶进行处理。例如，使用具有唾液酸酶活性的酶多肽、化学试剂(例如，弱酸等)，或它们的一种组合可以完成唾液酸酶的处理，。
在一些实施方案中，使用能够切割唾液酸的连接的一种或多种酶多肽(例如，能够水解唾液酸的糖苷键，能够内切水解寡-或聚(唾液)酸中的(2→8)-α-唾液酸连接，和/或能够消除N-乙酰神经氨酸糖苷中的α-唾液酸化基团)来完成唾液酸酶的处理。这些酶典型地被称为唾液酸酶和/或神经氨糖苷酶。典型地，一种特定的唾液酸酶优选地切割一个特定种类的唾液酸键。
可以适合使用的酶多肽包括，但不限于：外切-α-唾液酸酶(也被称为乙酰神经氨酸基水解酶、α-神经氨酸苷酶、或乙酰神经氨酸苷酶；包括归类在E.C.3.2.1.18下的酶多肽)，内切-α-唾液酸酶(也被称为聚唾液酸2，8-α-唾液酸基水解酶、内切-N-酰基神经氨酸苷酶、内切神经氨酸苷酶、内切-N-乙酰神经氨酸苷酶、聚(α-2，8-唾液酸基)内切-N乙酰神经氨酸苷酶、聚(α-2，8-唾液酸)α-2，8-唾液酸基水解酶、或内切唾液酸酶；包括归类在E.C.3.2.1.129下的酶多肽)，以及脱水唾液酸酶(也被称为脱水神经氨酸苷酶、唾液酸结合糖N-酰基神经氨酸基水解酶(2，7-环化)、或唾液酸酶L)。
唾液酸酶的非限制性具体的实例包括唾液酸酶1(也被称为溶酶体唾液酸酶、NEU1、或神经氨酸苷酶1)，唾液酸酶2(也被称为细胞质唾液酸酶、NEU2、或神经氨酸苷酶2)，唾液酸酶3(也被称为细胞膜唾液酸酶、NEU3、或神经氨酸苷酶3)，唾液酸酶4(也被称为NEU4或神经氨酸苷酶4)，G9唾液酸酶，神经节苷脂唾液酸酶，神经节苷脂特异性的唾液酸酶，红细胞凝集素-神经氨酸苷酶蛋白质，小鼠骨骼肌唾液酸酶，N-乙酰神经氨酸基糖基水解酶，N-酰基神经氨酸糖基水解酶，AS85-1.1蛋白，SA85-1.2蛋白，SA85-1.3蛋白，唾液酸酶A，唾液酸酶C，唾液酸酶S，以及反式唾液酸酶。
适合用于唾液酸酶处理的酶多肽可以从多个来源得到，包括但不限于：天然发生的来源、重组地工程化的种类、等。可以使用已知的和/或天然发生的唾液酸酶的多种变体。很多物种(包括，但不限于：烟草节杆菌、节杆菌、产脲节杆菌、噬菌体E、噬菌体K1E、噬菌体K1F、噬菌体PK1A、噬菌体PK1F、产气荚膜梭菌、气肿疽梭菌、索氏梭菌、白喉棒杆菌、溃疡棒杆菌、牡蛎、中国仓鼠、溶组织内阿米巴、猪丹毒丝菌、智人、甲型流感病毒、乙型流感病毒、北美巨蛭、产绿微单胞菌、腮腺炎病毒、小鼠、新城疫病毒、多杀巴斯德菌、链球菌、阴道毛滴虫、多杀巴斯德菌、链球菌、野猪、阴道毛滴虫、克氏锥虫以及霍乱弧菌)生产了根据所提供的方法可以被生产和/或使用的唾液酸酶。
如本领域中已知的，根据所提供的方法和系统，未知的和/或未在酶数据库中列出的(例如像还未被表征的酶)，但是尽管如此仍然切割唾液酸残基的连接的酶，可以是合适使用的。
用酶多肽进行处理的适当的条件可以随具体的酶多肽而变化。典型地，在存在酶多肽的浓度足以催化希望量的切割持续一个给定的时间期间下，在酶多肽的最佳温度下或在酶多肽的最佳温度附近孵育包含聚糖的样品。例如，一些孵育可以在约37℃下完成。孵育期间可以持续5分钟、10分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、1小时10分钟、1小时20分钟、1小时30分钟、1小时40分钟、1小时50分钟、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、或者更长时间。在一些实施方案中，包含聚糖的样品可以用酶多肽孵育过夜。
如在此提到的唾液酸酶和/或它们的变体的任何组合可以被用于唾液酸酶处理。使用多于一种酶的处理可以是顺序的(即，一种酶多肽孵育紧接着另一种酶多肽孵育，任选地通过失活一种酶而分开)，和/或同时的(即，同时使用多于一种的酶多肽)。
在一些实施方案中，使用一种或多种化学试剂来完成唾液酸酶处理。例如，可以使用本领域已知的多种方法中任何一种来完成唾液酸残基的弱酸水解。总体上，弱酸水解包括将样品与稀酸孵育一个短的时间期间(任选地在加热下)。用于弱酸水解的酸的非限制性实例包括硫酸(H2SO4)、盐酸(HCl)、甲酸(CH2O2)、等。用于弱酸水解的酸溶液的pH值典型地范围从约pH1.4至约pH6.9，例如约pH 6.9、pH 6.8、pH 6.7、pH 6.6、pH 6.5、pH 6.4、pH 6.3、pH 6.2、pH 6.1、pH 6.0、pH 5.9、pH 5.8、pH 5.7、pH 5.6、pH 5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH 5.2、pH 5.1、pH 5.0、pH 4.9、pH 4.8、pH 4.7、pH 4.6、pH 4.5、pH 4.4、pH 4.3、pH 4.2、pH 4.1、pH 4.0、pH 3.9、pH 3.8、pH 3.7、pH 3.6、pH 3.5、pH 3.4、pH 3.3、pH 3.2、pH 3.1、pH 3.0、pH 2.9、pH 2.8、pH 2.7、pH 2.6、pH 2.5、pH 2.4、pH 2.3、pH 2.2、pH 2.1、pH 2.0、pH 1.9、pH 1.8、pH 1.7、pH 1.6、pH 1.5、或pH 1.4。在一些实施方案中可以使用更低的pH条件。用于弱酸水解处理的酸的浓度可以是，例如，约0.70M、0.65M、0.60M、0.55M、0.50M、0.45M、0.40M、0.35M、0.30M、0.25M、0.20M、0.15M、0.10M、0.05M、0.025M、0.020M、0.015M、0.010M、0.005M、或更低。在一些实施方案中可以使用更高的酸的浓度。可以在弱酸中进行孵育持续一个时间期间，例如小于约10.0小时、9.5小时、9.0小时、8.5小时、8.0小时、7.5小时、7.0小时、6.5小时、6.0小时、5.5小时、5.0小时、4.5小时、4.0小时、3.5小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、1分钟、或更短时间。在一些实施方案中，可以将包含聚糖的样品孵育更长的时间期间。
在其中使用弱酸水解的一些实施方案中，在弱酸处理期间将包含聚糖的样品加热。可以在多个温度下加热样品，例如像约30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、或更高温度。
在一些实施方案中，用于释放唾液酸的处理导致聚糖的显著的去唾液酸化。如本领域中所理解的，不是所有的唾液酸残基都可以从已经经历用于释放唾液酸的处理的聚糖分子上被释放出来。在一些实施方案中，在用于释放唾液酸的处理之前用于释放唾液酸的处理使高达约25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更少的唾液酸残基存在于聚糖制品中。在一些实施方案中，这些残留的唾液酸残基并不干扰随后的处理和/或分析。在一些实施方案中，在随后的处理和/或分析之前使用一个或多个另外的处理来降低残留的唾液酸的百分比；在一些这样的实施方案中，一个或多个另外的处理包括用于释放唾液酸的一个或多个另外的处理。
在一些实施方案中，包括聚糖的组合物包括多个唾液酸，这些唾液酸以这样一种方式来修饰从而使它们对于用来释放唾液酸的处理具有耐受性；在一些这样的实施方案中，这些修饰使这些唾液酸对唾液酸酶的切割具有耐受性。这种修饰的一个实例是在除了位置5(该位置被典型地乙酰化)之外的两个或更多个位置处的乙酰化，如以下进一步所述，称为“多乙酰化唾液酸化”。当包括聚糖的一种组合物含有这类修饰的唾液酸时，唾液酸残基的残留百分比可以是更高的。
3.从细胞释放结合糖
在某些实施方案中，例如涉及使用由细胞生产的结合糖的那些，这些方法进一步包括从细胞释放结合糖。在一些这样的实施方案中，在从细胞释放结合糖之后，从结合糖释放聚糖。
在一些实施方案中，释放存在于细胞内的结合糖。
在一些实施方案中，从存在于细胞表面上的结合糖中释放聚糖。在一些这样的实施方案中，聚糖制品是从结合糖得到的，这些结合糖主要地是从细胞的表面释放的。由此类实施方案所提供的几个优点之中是以下事实，即可以得到一种高纯度集合的细胞表面聚糖，而没有被主要地发现于细胞内部的聚糖显著地污染。例如，使用本披露的某些方法，当将细胞表面聚糖从细胞中释放出来时基本上避免了细胞的溶解。另外地或者可替代地，与目前可供使用的方法相比较，在此所披露的某些方法在操作步骤的数目和/或难度方面提供了显著的降低。
在某些实施方案中，通过使这些细胞经受一种或多种蛋白酶而从细胞释放结合糖。这些蛋白酶切割多肽链内的酰胺键。存在几类的蛋白酶，包括化学试剂以及酶试剂二者。蛋白水解酶包括例如，丝氨酸蛋白酶类、苏氨酸蛋白酶类、半胱氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类、金属蛋白酶类、以及谷氨酸蛋白酶类。根据本披露可以使用的特异性蛋白水解酶的非限制性实例包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、疟原虫胃蛋白酶、肾素、凝乳酶、木瓜蛋白酶、一种组织蛋白酶(例如组织蛋白酶K)、一种半胱天冬酶(例如CASP3、CASP6、CASP7、CASP14)、钙蛋白酶1、钙蛋白酶2、溶血素、羧肽酶A或B、基质金属蛋白酶、一种谷氨酸蛋白酶、和/或它们的组合。本领域的普通技术人员应当知道多种其他的蛋白酶，可以根据本披露使用这些蛋白酶来从细胞表面释放糖蛋白。
在一些实施方案中，从膜释放细胞表面结合糖。在一些这样的实施方案中，使用一种或多种苛性清洗剂来提取膜结合的结合糖，此后在从结合糖释放聚糖的处理之前将自由糖透析掉。在其中从膜释放结合糖的一些实施方案中，将洗涤剂处理降至最低或完全避免从而将细胞膜的破裂降至最低。例如，在一些实施方案中，这些细胞膜的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多仍然是完整的(例如，如通过台盼蓝排除法所监测的)。可以使用这些方法来减少或消除来自存在于细胞内部的未成熟的、高甘露糖糖蛋白的污染。
在一些实施方案中，在使细胞膜的破裂降至最低的条件下，使这些细胞经受一种或多种蛋白酶。在一些实施方案中，将细胞暴露于一种或多种蛋白酶持续一个限定的时间期间从而避免细胞膜的显著地溶解。
例如，可以使细胞经受一种或多种蛋白酶持续一个时间期间，该时间期间小于约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1分钟。在一些实施方案中，使细胞经受一种或多种蛋白酶持续一个时间期间，该时间期间大于15分钟，只要不发生细胞膜的显著的溶解即可。例如，可以采用一个足够低浓度的一种或多种蛋白酶、一个足够低的温度和/或多种其他因素或条件中任何一种，这样使得将总蛋白酶活性降低至一个点，在该点不发生细胞膜的显著地溶解。本领域的普通技术人员应当知道并且将能够采用确保不发生细胞膜的显著地溶解的多个因素或条件。
在一些实施方案中，例如通过用蛋白酶进行处理，从细胞中释放至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的结合糖。
在某些实施方案中，通过使细胞经受处于至少约0.1mg/mL的浓度下的一种或多种蛋白酶(例如，蛋白水解酶类)来释放结合糖。在某些实施方案中，通过使细胞经受处于小于约2.0mg/mL的浓度下的一种或多种蛋白酶(例如，蛋白水解酶类)来释放结合糖。在某些实施方案中，通过使细胞经受处于约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mg/mL或更高的浓度下的一种或多种蛋白酶(例如，蛋白水解酶类)来释放细胞表面聚糖。
在某些实施方案中，通过使细胞经受多种蛋白酶来释放结合糖。例如，可以使细胞经受2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种蛋白酶来释放结合糖。可以将这样的多种蛋白酶同时地和/或顺序地施用于该细胞。在某些实施方案中，通过使细胞同时地经受多种蛋白酶来释放结合糖，此后将释放出的结合糖从细胞中纯化出来。
在某些实施方案中，通过使一个细胞经受一种第一蛋白酶(或多种第一蛋白酶)持续一个第一时间期间，此后使该细胞经受一种第二蛋白酶(或多种第二蛋白酶)持续一个第二时间期间来释放结合糖。在用第二蛋白酶进行处理之前，可以任选地将第一蛋白酶去除和/或失活。作为举例，可以将该第一蛋白酶孵育在一个温度下持续足以使它失活的一段时间来失活该蛋白酶。另外地或可替代地，可以通过将该第一蛋白酶与对该蛋白酶具有特异性的一种抑制剂(例如，特异性地结合到该第一蛋白酶上并且抑制其催化活性的一种抗体或其他分子)进行孵育来失活该第一蛋白酶。使该第一蛋白酶失活的其他方法对于本领域的普通技术人员而言应该是已知的。在其中通过将该第一蛋白酶与一种特异性的抑制剂进行孵育来使该第一蛋白酶失活的情况下，应当理解的是该抑制剂的存在不应显著地抑制该第二蛋白酶的活性。
在一些实施方案中，在释放聚糖之前将该一种或多种蛋白酶去除和/或失活。作为举例，可以将一个蛋白酶孵育在一个温度下持续足以使其失活的一段时间来使该蛋白酶失活。可替代地或另外地，通过用特异性地结合到一种蛋白酶上并且抑制其活性的一种抑制剂或抗体或其他分子进行孵育可以使该蛋白酶失活。
4.另外的外切糖苷酶处理
在一些实施方案中，除了经历如以上提到的用于释放聚糖的处理和用于释放唾液酸的处理之外，用一种或多种外切糖苷酶来消化聚糖。在一些这样的实施方案中，根据所提供的方法对这类另外的外切糖苷酶处理的消化产物进行分析。
如以上提到的，唾液酸酶被典型地归类为外切糖苷酶。任选的另外的外切糖苷酶处理总体上包括用除了唾液酸酶之外的至少一种外切糖苷酶进行处理。在一些实施方案中，一种或多种唾液酸酶与不是唾液酸酶的一种或多种其他的外切糖苷酶相结合来使用。
在一些实施方案中，另外的外切糖苷酶处理与聚糖释放处理和/或用于释放唾液酸的处理同时地或相重叠地进行。在一些实施方案中，在唾液酸酶处理之前进行另外的外切糖苷酶处理。在一些实施方案中，在唾液酸酶处理之后进行另外的外切糖苷酶处理。
外切糖苷酶类是从聚糖的非还原端来切割末端的糖苷键的酶类。它们对于特定的单糖连接以及异头性(α/β)是典型地高度特异性的。在一些实施方案中，相邻的分枝模式可以影响外切糖苷酶的特异性。外切糖苷酶处理通常导致标准的触角连接的聚糖被切割成包含3个甘露糖以及2个glcNAc残基的戊糖核心(M3N2)。然而，某些聚糖种类(例如，触角岩藻糖化的种类、高甘露糖以及杂合聚糖、乳糖胺扩展的聚糖、磷酸化的聚糖、硫酸化的聚糖，多乙酰化唾液酸化的聚糖，等)可以是对外切糖苷酶处理具有耐受性的，并且可以通过色谱被分辨出来并且相对于M3N2戊糖进行定量(如在此所讨论的)。
在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶仅识别并且切割一种特定类型的糖苷连接。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割多于一种特定类型的糖苷连接。根据本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶包括但不限于：唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。可以从任何来源得到外切糖苷酶，包括商业来源(例如，来自QA-Bio、ProZyme、Roche、Sigma、NEB、EMD、Glyko、等)。可替代地或另外地，可以从一种细胞性来源(例如细菌、酵母、植物、等)来分离和/或纯化这些外切糖苷酶。
外切糖苷酶类(例如，唾液酸酶类、半乳糖苷酶类、己糖胺酶类、岩藻糖苷酶类、以及甘露糖苷酶类)可以被分成多个类别或“亚组”。在一些实施方案中，不同的亚组显示出对于切割不同类型的连接的不同的能力。表1提出了一些示例性的外切糖苷酶，它们的连接特异性、以及从中衍生出每一项的生物体。本领域的普通技术人员应当理解这是一个示例性的，而非全面的外切糖苷酶的列表，以及可以根据本披露使用具有任何连接特异性的任何外切糖苷酶。
表1.示例性的外切糖苷酶
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*“EC#”是指酶学委员会登记号
根据本披露，可以用任何一种外切糖苷酶来消化这些聚糖(例如像已经从糖蛋白和/或细胞表面释放出的那些)。在某些实施方案中，通过使一组聚糖经受多种外切糖苷酶来对这些聚糖进行消化。例如，可以使一组聚糖经受2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，同时施用多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，顺序地施用多种外切糖苷酶。在一些实施方案中，改变所施用的外切糖苷酶的身份揭示了有关聚糖的结构和/或构成的信息。在一些实施方案中，改变施用多种外切糖苷酶的顺序揭示了有关聚糖的结构和/或构成的信息。
在一些实施方案中，用多种外切糖苷酶顺序地消化揭示了有关聚糖的结构和/或构成的信息，该信息与用同一组外切糖苷酶同时地消化所揭示的信息不同。在一些实施方案中，用多种外切糖苷酶顺序地消化揭示了有关聚糖的结构和/或构成的信息，该信息与用同一组外切糖苷酶同时地消化所揭示的信息相同。对于在聚糖结构的分析中外切糖苷酶消化的应用的更完全的讨论参见由Parsons等人于2008年4月15日提交的名称为“使用外切糖苷酶来表征N-聚糖”的共同未决的国际申请No.PCT/US08/60343，其全部内容通过引用结合在此。
D.聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类)
在如以上所讨论的双重处理(用于释放聚糖的处理和用于释放唾液酸的处理)之后，可以将聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类)与所提供的方法一起使用。
在某些实施方案中，聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类)包括未被唾液酸化的聚糖。
在某些实施方案中，聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类)包括对唾液酸酶具有耐受性的聚糖。
在某些实施方案中，聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类)包括非常规修饰的聚糖。总体上，非常规修饰的聚糖带有除了唾液酸化之外的修饰。在很多实施方案中，非常规修饰将一个电荷传递到这些聚糖上；在一些这样的实施方案中，该电荷是一个负电荷。
在一些实施方案中，非常规修饰的聚糖包括磷酸化的聚糖。聚糖中磷酸化的残基的一个非限制性实例是甘露糖-6-磷酸(Man-6-P)。
在一些实施方案中，非常规修饰的聚糖包括硫酸化的聚糖。聚糖上的硫酸化可以发生在多个位置中任何一个上。聚糖可以被单和/或多硫酸化(即，在一个给定聚糖分子上多个位置处硫酸化)。在一些聚糖种类中已知被硫酸化的位置的非限制性实例包括末端Gal的C-3以及末端N-乙酰乳糖胺单元的一个GlcNAc残基的C-6。硫酸化的聚糖包括硫酸化的葡糖胺多糖(例如硫酸乙酰肝素、硫酸葡聚糖、硫酸角质素、以及硫酸软骨素)。
在一些实施方案中，非常规修饰的聚糖包括具有另外的修饰的唾液酸化的聚糖，这些另外的修饰使这些唾液酸残基对唾液酸酶的切割具有耐受性。例如，聚糖制品可以包括多乙酰化唾液酸化的聚糖。典型地在位置5处将唾液酸残基乙酰化(见图2)；这样5-乙酰化的唾液酸是典型地对唾液酸酶处理敏感的。诸位申请人已经发现在两个或更多个另外的位置处被乙酰化的唾液酸(多乙酰化的唾液酸)总体上是对唾液酸酶处理具有耐受性的。在一些实施方案中，在位置7、8、和9中两个或更多个位置处将多乙酰化的唾液酸乙酰化(见图2)。
在一些实施方案中，聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类)包括无修饰的聚糖(如在此所讨论的，无论唾液酸化和/或非常规修饰)。
在一些实施方案中，非常规修饰的聚糖是低丰度的聚糖。例如，在一些实施方案中，非常规修饰的聚糖构成该聚糖制品的小于约50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.08％、0.05％、或更少。在一些实施方案中，对唾液酸酶具有耐受性的聚糖包含约0.01％的聚糖。在一些实施方案中，非常规修饰的聚糖构成源制品中(和/或初始来源材料中)聚糖的总量的小于约50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.08％、0.05％、或更少。在一些实施方案中，非常规修饰的聚糖构成源制品和/或材料中聚糖的总量的约0.01％。
II.聚糖制品的分析
根据所提供的方法，聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类)(例如唾液酸酶处理的聚糖制品)包括通过这种处理未被释放的聚糖(例如对唾液酸酶具有耐受性的聚糖)以及使这些聚糖制品经受一种或多种分离技术，该一种或多种分离技术从不带电的聚糖和/或具有一个第二电荷的聚糖中分离具有一个第一电荷的聚糖，和/或基于荷质比来分离聚糖。在一些实施方案中，使用至少一种定量标准物来对至少一种分离出的聚糖(例如具有一个第一电荷或具有一个第一荷质比的聚糖)进行定量。在某些实施方案中，在定量之前和/或之后，对分离出的聚糖(例如对具有第一电荷和/或具有第一荷质比的聚糖)进行另外的分析。在一些实施方案中，使用在一个或多个分离步骤、任选的一个或多个分析步骤、或它们的一种组合期间所得的信息来鉴别分离出的聚糖。在一些实施方案中，对样品中分离出的聚糖种类(例如像非常规修饰的聚糖种类)进行分离、分析、和/或定量的步骤被重复进行，并且来自这种重复的数据被记录到一个数据库中(例如，如下所述)。在一些实施方案中，鉴别聚糖种类(例如非常规修饰的聚糖)可以完全地或部分地取决于数据库中的信息。
A.带电荷的聚糖的分离
在本领域中已知多种方法来从样品中不带电的和/或带相反电荷的分子中，和/或从具有不同荷质比的其他分子中分离带电荷的分子。根据本披露可以使用这些方法中任何一种，以及它们的变体来分离聚糖。在一些实施方案中，从其他的聚糖制品中分离具有一个第一电荷和/或具有一个第一荷质比的聚糖。
在一些实施方案中，从具有一个更低第一荷质比的聚糖中分离具有一个特定第一荷质比的聚糖。在一些实施方案中，从具有一个更高第一荷质比的聚糖中分离具有一个特定第一荷质比的聚糖。
在一些实施方案中，该第一荷质比具有在约0至约0.0014的范围内的一个绝对值，并且从其他聚糖中分离具有这种第一荷质比的聚糖，这些其他聚糖的荷质比具有在约0至0.003的范围内的一个绝对值。
在一些实施方案中，从其他的聚糖制品中分离具有一个第一电荷的聚糖。
在某些实施方案中，该第一电荷是一个负电荷并且该第二电荷是一个正电荷。在这类实施方案中，分离出的聚糖包括带负电荷的聚糖，这些带负电荷的聚糖是从中性聚糖和/或带正电荷的聚糖中分离的。在一些这样的实施方案中，这些带负电荷的聚糖包括磷酸化的聚糖、硫酸化的聚糖、多乙酰化唾液酸化的聚糖、或它们的一种组合。
在很多实施方案中，使用层析技术来完成带电荷的聚糖的分离。例如，可以使用一个带电荷的柱(例如在离子交换层析中)来对聚糖制品(从这些聚糖制品中已经释放了唾液酸类)(例如，唾液酸酶处理的聚糖制品)进行分离。为了从其他聚糖中分离带负电荷的聚糖，可以使用例如一个阴离子交换柱(如在阴离子交换层析(AEC/AEX)中)。典型地用于阴离子交换层析的树脂包括但不限于：Q-树脂(一种季胺)以及DEAE树脂(二乙基氨基乙烷)。用于阴离子交换层析的带电荷的树脂可以从以下供应商处商购，例如BioRad(加利福尼亚州赫尔克里士市)和Amersham Biosciences(英国查尔方特圣贾尔斯市)。
用于层析实验的具体条件可以取决于正在被分离的特定的聚糖种类、聚糖制品的构成、等。
在一些实施方案中，使用适合用于分离分子的任何一种方法来完成一个或多个另外的分离步骤，包括但不限于：允许基于大小、疏水性、电荷、荷质比、或它们的一种组合、等进行分离的方法。在以前的分离步骤之后和/或另一个过程(例如像如以下所讨论的任选的分析)之后，可以立即执行另外的分离步骤。作为一个非限制性实例，在一个阴离子交换柱上的分离步骤之后，可以使用一个第二维的层析(例如正相酰胺层析)。可以使用来自分离的一个或者两个步骤的信息来鉴别聚糖种类。
B.分离出的聚糖的分析
在某些实施方案中，所提供的方法包括对分离出的和/或隔离的聚糖(例如，具有一个第一电荷和/或一个第一荷质比的聚糖)的结构特征进行分析。在一些实施方案中，分析可以能够鉴别带电荷的聚糖。可以任选地从多于一个聚糖制品和/或样品来合并分离出的和/或隔离的聚糖。
可以通过以下任何一种技术来对这些聚糖进行分析，这些技术包括例如：配体结合、质谱法、核磁共振、和/或其他方法。用于分析聚糖的多种方法在本领域内是已知的。例如参见Anumula，Anal.Biochem，350(1)：1-23，2006；Klein et al.Anal.Biochem.，179：162-66，1989；以及Townsend，R.R.，Carbohydrate Analysis：High Performance Liquid Chromatography andCapillary Electrophoresis，ed.Z.El Rassi，pp.181-209，1995，Yuan et al.，J.Chromatography A(2005)1067：145-152，它们的每一个的内容均通过引用以其全文结合在此。
在一些实施方案中，如在此所描述的聚糖的分析可以包括，例如，处理聚糖以释放某些糖(例如单糖)组分。例如，在一些实施方案中，用一种或多种内切糖苷酶处理作用来处理聚糖。
可以通过多种方法中的一种或多种来分析聚糖。作为非限定性的实例，可以通过以下方法来表征聚糖，例如核磁共振(NMR)、质谱法、液相色谱法、2维色谱法、SDS-PAGE、抗体染色法、凝集素染色法、单糖定量、毛细管电泳法、荧光团辅助糖电泳(FACE)、胶束电动色谱法(MEKC)、外切糖苷酶和/或内切糖苷酶处理、以及它们的组合。本领域的普通技术人员应当知道可以用来表征聚糖的其他方法。
在一些实施方案中，通过色谱方法(例如像液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)，超高效液相色谱法(UPLC)，薄层层析法(TLC)，以及它们的组合)来分析聚糖的结构和/或构成(例如，单糖构成)。
在一些实施方案中，通过质谱法(MS)以及相关的方法(例如像串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、傅里叶变换质谱法(FTMS)、离子迁移率分离质谱法(IMS-MS)、电子转移解离法(ETD-MS)、以及它们的组合)来分析聚糖的结构和/或构成(例如单糖构成)。
在一些实施方案中，通过电泳法(例如像毛细管电泳法(CE)、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)紧接着使用识别特异性的聚糖结构的抗体进行蛋白质印迹的方法、以及它们的组合)来分析聚糖结构和/或构成(例如单糖构成)。
在一些实施方案中，通过核磁共振(NMR)以及相关的方法(包括但不限于：一维NMR(1D-NMR)、二维NMR(2D-NMR)、相关谱魔角自旋NMR(COSY-NMR)、全相关谱NMR(TOCSY-NMR)、异核单量子相干NMR(HSQC-NMR)、异核多量子相干(HMQC-NMR)、旋转核欧沃豪斯效应谱NMR(ROESY-NMR)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY-NMR)、以及它们的组合)来分析聚糖结构和/或构成(例如单糖构成)。
在某些实施方案中，在表征之前对结合糖和/或聚糖结构进行标记。如本领域的普通技术人员已知的，在表征期间这种标记可以增大信号和/或降低背景噪音。根据本披露可以使用多种标记中任何一种，包括但不限于：荧光标记、放射性标记、和/或化学发光标记。在某些实施方案中，用荧光的2-氨基苯甲酰胺(“2-AB”)来标记这些聚糖结构。根据本披露本领域的普通技术人员应当知道可以使用的其他适合的标记。
在一些实施方案中，可以采用多于一种的分析技术和/或执行另外的分析步骤。这些另外的步骤可以紧接着一个以前的分析步骤和/或一个不同的步骤(例如分离具有一个第一电荷和/或具有一个特定荷质比，等的聚糖)。
C.定量
在一些实施方案中，方法包括使用至少一种定量标准物(即，一个已知数量的分子，该分子能够以平行于分离出的聚糖和/或与其一起的方式来移动)来对至少一种分离出的聚糖进行定量。例如，在一种方法中(例如色谱法)可以使用一个或多个定量标准物通过所产生的一个校准曲线来推断代表色谱图中分离出的聚糖的一个或多个峰下的高度和/或面积从而得到样品中分离出的聚糖的量的近似值。
在一些实施方案中，定量是相对的(即，相对于其他种类来确定特定种类的聚糖的量)。例如，可以相对于其他聚糖种类来确定非常规修饰的聚糖种类的量。可替代地或另外地，可以相对于彼此来确定多种类型的非常规修饰的聚糖种类(例如磷酸化的聚糖、硫酸化的聚糖、和/或多乙酰化唾液酸化的聚糖)的量。
在一些实施方案中，定量是绝对的。例如，确定了分离出的聚糖种类(例如像非常规修饰的聚糖种类)的绝对量。可以使用例如用定量标准物所获得的值的一条标准曲线(或“校准曲线”)来确定绝对定量。
标准物可以是“外部的“(即，与多个聚糖制品分开地移动，例如以平行方式)和/或“内部的”(即，与多个聚糖制品一起移动，也被称为“示踪”)。无论是内部的或外部的，该标准被都可以被标记。在一些实施方案中，聚糖制品和标准物中的聚糖都被标记。在一些这样的实施方案中，用相同类型的标记物来标记聚糖和标准物两者。可以用与聚糖相同类型的标记物来标记内标和外标两者。在使用具有相同标记物的内标的实施方案中，基于例如大小的差异典型地可以将内标与标记的聚糖分开和/或区别开。例如，标准物可以在分子量方面远小于给定制品中的大多数聚糖，这样可以预期在与制品中的聚糖不同的时间点处将标准物洗脱出来。
可以用作合适的定量标准物的分子包括但不限于：较小的聚糖分子、植物的碳水化合物、等。在一些实施方案中，2-氨基苯甲酰胺-壳二糖被用作定量标准物。在一些实施方案中，通过切割结合糖和/或聚糖来得到定量标准物，这样来产生聚糖的片段，标记得到的片段，并且表征这些片段，这样使得它们的大小是已知的(如在相关的分离和/或分析技术下所确定的)。
III.应用
应当理解的是在此所披露的这些方法可以被用于多种应用中任何一种。总体而言，在涉及聚糖的结构特征的任何应用中(例如在希望表征与目标结合糖(例如一种糖蛋白)相关联的聚糖和/或分离某些聚糖种类(例如非常规修饰的聚糖)的应用中)，所提供的方法是有用的。
例如，如在此所描述的方法可以被用来确定特定的非常规修饰的聚糖(和/或包含它们的结合糖)的特征行为。一旦已经确定这种特征行为，可以使用这些技术的应用以在聚糖或结合糖制品中鉴别特定的这类聚糖。可替代地或另外地，在此所述的技术可以独自地或与其他技术(例如像在此所描述的)相结合来使用用来分离和/或表征一种或多种结合糖(例如包含非常规修饰的聚糖)或聚糖(例如非常规修饰的聚糖)。类似地，无论存在于检测峰或带的非常规修饰的聚糖的结构是否是已知的，可以将峰/带形互相比较以估计不同的结合糖或聚糖制品中非常规修饰的聚糖的不同水平/量。
如以前提到的，可以将所提供的方法应用到从广泛多样的来源得到的聚糖制品上，这些来源包括但不限于治疗性配制品以及生物样品(例如，包含细胞的样品)。根据本披露在被分析之前或之后这种聚糖制品可以经历一个或多个分析和/或纯化步骤。例如，在一些实施方案中，用一种或多种可检出的标志物或可以通过多种技术(例如像质谱法或NMR)来协助分析的其他试剂来标记聚糖制品中的聚糖。根据本披露可以将多个分离和/或隔离步骤中任何一个应用到聚糖制备中。
在一些实施方案中，使用所提供的方法来表征和/或控制或比较治疗性产物的质量。糖基化作用通常可能影响治疗性蛋白产物的活性、生物利用率、或其他特征。例如，可以使用所提供的方法来对生产治疗性蛋白产物的细胞中糖基化模式(例如非常规修饰的构成和/或类型)进行评估。在一些实施方案中，将分析完成而不分离这些产物。除其他事项之外，所提供的方法可以有助于在用于治疗性蛋白的生产体系中对糖基化模式进行实时分析。
可以将所提供的方法用于针对生产感兴趣的治疗性或其他商业相关的糖蛋白的过程开发的一个或多个阶段。可以采用本披露的方法的此类过程开发阶段的非限制性的实例包括细胞选择、克隆选择、培养基优化、培养条件、处理条件、和/或纯化步骤。本领域的普通技术人员应当知道其他的过程开发阶段。
可以使用所提供的方法来监测在一个特定的细胞培养中和/或在特定的生长条件下发生的糖基化作用的程度和/或类型(包括非常规修饰的一种或多种类型(如果存在的话))，由此允许调节或可能终止培养，从而(例如)实现一种特别希望的糖基化模式或从而避免发展一种特别不希望的糖基化模式。
可以使用所提供的方法来评估细胞或细胞系的糖基化特征，这些细胞或细胞系被考虑用于产生一种特别希望的糖蛋白(例如，甚至在将这些细胞或细胞系进行工程化从而生产糖蛋白、或从而以商业相关的水平来生产糖蛋白之前)。
在一些实施方案中，使用所提供的方法来监测生产糖蛋白的细胞的培养期间糖基化的模式。例如，糖蛋白的生产(例如，商业生产)可以涉及以下步骤：(1)培养产生这种糖蛋白的细胞，(2)贯穿培养细胞的过程中以定期的或不定期的间隔获得样品，(3)从这些样品获得聚糖制品，以及(4)对这些制品中聚糖上的糖基化模式进行分析(特别是，非常规修饰的构成以及类型)。在一些实施方案中，对细胞表面结合糖上的糖基化模式进行分析；在一些这样的实施方案中，方法进一步包括将不同样品的细胞表面糖基化模式彼此进行比较和/或与由相关的一种或多种细胞所产生的一种或多种非细胞表面糖蛋白的糖基化模式进行比较的一个步骤。在一些实施方案中，方法进一步包括将用于一种或多种所获得的样品的糖基化模式与一种参比样品的糖基化模式进行比较的一个步骤。
在一些实施方案中，用于特定的目标糖蛋白的所希望的糖基化模式是已知的，并且在此所述的技术允许对这些培养样品进行监测以沿着已知产生所希望的糖基化模式的路径来对生产的进展进行评估。例如，当目标糖蛋白是治疗性糖蛋白(例如在一个或多个国家中已经历了监管评审)时，经常所希望的是对这些培养物进行监测以对它们将产生具有与药品的已确立的糖基化模式尽可能接近的糖基化模式的产物的可能性进行评估，无论它是否正在通过确实相同的路径进行产生。如在此所使用的，关于与产物的糖基化模式相比较的糖基化模式“接近”是指一种糖基化模式，该模式与药品的已确立的糖基化模式具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％的相关性。在此类实施方案中，典型地在多个时间点获取这些生产培养物的样品并将它们与一个已确立的标准物或与一个对照培养物进行比较以便评估相对的糖基化作用。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更少)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多)的非常规修饰的聚糖。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更少)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多)的磷酸化的聚糖。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更少)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多)的硫酸化的聚糖。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更少)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多)的乙酰化的聚糖。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更少)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多)的多乙酰化唾液酸化的聚糖(例如二乙酰化的聚糖)或一种特定的多乙酰化的聚糖。
在一些实施方案中，除了与非常规修饰相关的特征之外，所希望的糖基化模式将具有其他特定的特征。例如，在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更少)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多)的核心岩藻糖基化作用。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将包括低水平(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更少)或高水平(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多)的连接到N-乙酰葡糖胺上的唾液酸。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式(例如，通过已产生的非细胞表面糖蛋白所观察到的一种细胞表面糖基化模式和/或一类糖基化模式)将是更广泛的。例如，在一些实施方案中，所希望的糖基化模式显示出糖基化位点高的占用率(例如，高于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高)；在一些实施方案中，所希望的糖基化模式显示出高分支程度(例如，高于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或更高具有三或四触角的结构)。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将是较不广泛的。例如，在一些实施方案中，所希望的细胞表面糖基化模式显示出糖基化位点低占用率(例如，低于约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约15％、约5％、约1％、或更低)；和/或低分支程度(例如，低于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％或更低具有三或四触角的结构)。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式在一些方面将是更广泛的，并且在其他方面将是较不广泛的。例如，采用倾向于产生具有长的，无支链的低聚糖链的糖蛋白的细胞系可以是令人希望的。可替代地，采用倾向于产生具有短的，高度分支的低聚糖链的糖蛋白的细胞系可以是令人希望的。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将对于特定类型的聚糖结构进行富集。例如，在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将具有低水平的(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更低)高甘露糖或杂合结构，高水平的(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高)高甘露糖结构，高水平的(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高；例如，每个糖蛋白至少一个)磷酸化的高甘露糖，或低水平的(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更低)磷酸化的高甘露糖。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将包括至少约一个唾液酸。在一些实施方案中，所希望的糖基化模式将包括一个高水平的(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高)被唾液酸化的末端。在一些实施方案中，包括唾液酸化作用的所希望的糖基化模式将显示至少约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更高的N-乙酰神经氨酸和/或小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、或更低的N-羟乙酰神经氨酸。
在一些实施方案中，所希望的糖基化模式显示分支伸长的特异性(例如，大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多的延伸是在α1，6甘露糖分枝上；或大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、或更多的延伸是在α1，3甘露糖分枝上)。
根据本披露可以监测其生产和/或质量的代表性的治疗性糖蛋白产物包括，例如，多种血液学试剂中任何一种(包括例如，促红细胞生成素、血液凝固因子，等)、干扰素类、集落刺激因子类、抗体类、酶类、激素类、等。
在一些实施方案中，提供了多种方法，在这些方法中将来自不同来源或样品的聚糖彼此进行比较。在一些这样的实例中，随着时间的过去得到了来自相同来源的多个样品，这样使得糖基化模式中的变化(并且特别是在非常规修饰的构成和/或一个或多个类型中)得以监测。在一些实施方案中，以定期的间隔取出包含聚糖的样品。在一些实施方案中，按照以下间隔取出包含聚糖的样品：约30秒、约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约10小时、约12小时、或约18小时的间隔，或以甚至更长的间隔。在一些实施方案中，以不定期的间隔取出包含聚糖的样品。在一些实施方案中，以5小时的间隔取出包含聚糖的样品。
在一些实施方案中，样品之一是历史的样品，和/或历史样品的一个记录被用于比较(例如，如在药品的批量释放测试中)。在一些实施方案中，样品之一是一个参比样品。
在某些实施方案中，对在一个或多个不同的生长参数下生长的感兴趣的糖蛋白的糖基化模式方面的变化进行测试以确定用于糖蛋白生产的一个或多个所希望的生长参数、或多个参数的组合。在一些实施方案中，糖基化模式方面的差异是通过观察和/或测量糖基化模式的特征来确定的，这些特征例如但不限于：非常规修饰的聚糖的构成和/或一种或多种类型、糖基化位点的占用率、所连接的聚糖的身份、所连接的聚糖的相对量、所连接的聚糖的完全的或部分的构成、和/或所连接的聚糖的相对量。可替代地或另外地，可以测量对于本领域的普通技术人员已知的其他糖基化模式的特征。
在一些实施方案中，使用在此所提供的这些方法来监测不同样品中发生(例如在不同的细胞培养物中)的聚糖修饰的程度和/或类型。
在一些实施方案中，对来自不同的细胞培养物的样品的聚糖进行比较，这些样品是在以下条件下制备的，即在一个或多个选定的参数方面有所不同(例如，细胞类型，培养类型[例如，连续进料对比分批进料，等]、培养条件[例如，培养基的类型、一种或多种特定的培养基中特定组分的存在或浓度、渗透性、pH、温度、一种或多种组分(如渗透性、pH、温度，等)偏移的时间或程度]、培养时间，分离步骤，等)，但在其他方面完全相同；从而确定选定的一个或多个参数对聚糖修饰和/或糖基化模式的其他特征的影响。在某些实施方案中，对来自不同细胞培养物样品的聚糖进行比较，这些样品是在以下条件下制备的，即仅一个选定的参数有所不同；从而确定该单一选定的参数对聚糖修饰和/或糖基化模式的其他特征的影响。因此，除其他应用之外，本发明的这些技术可以有助于确定多个特定的参数对细胞中糖基化模式的影响。
在一些实施方案中，对来自不同批次的细胞的聚糖进行了比较，无论通过相同的方法还是通过不同的方法来制备，以及无论同时地还是分开地来制备，这些细胞产生一种感兴趣的糖蛋白(例如，一种治疗性糖蛋白)。在此类实施方案中，本披露有助于对糖蛋白制品进行质量控制(即，一种目标糖蛋白制品的制备)。在一些实施方案中，多种方法有助于对生产感兴趣的糖蛋白的特定的培养的进展进行监测(例如，当样品在不同的时间点从培养物中被取出，和被分析以及被彼此进行比较时)。在这些实施方案的任何一个中，例如可以将这些聚糖分析的特征记录在一个质量控制记录中。如以上所指出的，在一些实施方案中，与糖蛋白的一个先前的或标准批次的历史记录、和/或与一个参比样品进行了比较。
在某些实施方案中，可以将本披露用于多项研究中用来改变细胞的糖基化特征，例如用来建立具有一个或多个所希望的非常规修饰的细胞系和/或培养条件。然后可以使用这种细胞系和/或这些培养条件(如果希望的话)来生产一种特定的目标结合糖(例如，糖蛋白)，预期这种或这些糖基化特征对于该目标结合糖是有益的。
根据本披露，可以使用在此所描述的技术来检测希望的或不希望的聚糖，例如用来对产品中存在的一种或多种污染物进行检测或定量，或用来对存在的一种或多种活性的或所希望的种类进行检测或定量。
在不同的实施方案中，通过检测一种或多种特定的聚糖(其存在或水平(不论绝对的或相对的)可能与一种特定的疾病状态(包括对一种特定疾病的易感性)和/或随着时间的过去此类聚糖的浓度方面的变化相关联)，可以使用这些方法来评估一种或多种生物标记的糖基化作用，该一种或多种生物标记在症状出现之前和/或疾病状态发展到不可治疗或较小可能性治疗的情况之前指示(例如)一种疾病状态。例如，在本披露的一些实施方案中，这种目标结合糖是一种生物标记。
在某些实施方案中，使用所提供的方法来分离特定的聚糖，例如一种特定的聚糖种类或一组聚糖种类。例如，可以使用所提供的方法来分离非常规修饰的聚糖，例如像磷酸化的聚糖、硫酸化的聚糖、多乙酰化唾液酸化的聚糖、或它们的一种组合。
在某些实施方案中，在此所描述的方法有助于检测和/或分离以非常低的水平存在于一种来源中(例如，一种生物样品)的特定的聚糖(例如，非常规修饰的聚糖)。在此类实施方案中，有可能对聚糖的水平进行检测和/或任选地定量，这些聚糖按照以下水平存在于一个来源中的一组聚糖中：小于约10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、或0.01％。在一些实施方案中，有可能对聚糖的水平进行检测和/或任选地定量，这些聚糖的水平构成一种聚糖制品的0.1％至5％之间，例如，0.1％至2％之间，例如，0.1％至1％之间。在某些实施方案中，有可能对聚糖的水平进行检测和/或任选地定量，该这些聚糖的水平在约0.1fmol至约1mmol之间。
在一些实施方案中，可以将在此所描述的技术与一种或多种其他技术相结合，用于检测、分析、和/或分离聚糖或结合糖。
IV.数据库
在一些实施方案中，将分离出的聚糖与以前鉴别的分离出的聚糖进行比较。这类比较可以能够分析分离出的聚糖。在一些实施方案中，将以前鉴别的聚糖的特征储存在一个数据库中。例如，分离出的聚糖的分析包括使用数据库中的信息。
所提供的方法还可以包括产生聚糖特性(例如像，当暴露于一种或多种不同的分析技术时，特定的非常规修饰的聚糖的性能)的列表。还提供了产生特定的聚糖和/或结合糖制品的特性的列表的方法。这些代表性的特性包括，例如制品中一种特定的非常规修饰的聚糖的存在或数量，一个或多个特定的糖基化位点的占用程度，(例如，被非常规修饰的聚糖占用)，聚糖(例如存在的非常规修饰的聚糖)的类型，不同聚糖(例如，非常规修饰的聚糖)的相对量，等。在一些实施方案中，一个列表包括聚糖或结合糖制品中存在的一种或多种类型的单糖的数量。该列表可以还或可替代地包括该聚糖或结合糖的总质量，一种结合糖的非糖部分的质量，一种和/或多种非常规修饰的聚糖的质量，等。
这样的一个方法的一个实例包括测量一个特定的聚糖、聚糖制品、或结合糖制品的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个特性，并且记录针对一个或多个特性的一个值来产生这些聚糖特性的一个列表。这类方法可以还或可替代地包括产生结合糖特性的一个列表。
在一些实施方案中，该列表是明确地体现在计算机可读介质(例如计算机硬盘、软盘、CD-ROM、等)中的一个数据结构。例如，一个数据结构可以具有多个输入，其中每个输入编码一个特性的一个值。这些输入可以被任何种类的值编码，例如像单比特值、单数字型十六进制值、十进制值、等。
还提供了明确地体现在一种或多种计算机可读介质中的多个数据库，其中这些数据库储存了描述一种或多种聚糖、聚糖制品和/或结合糖制品的信息(例如关于非常规修饰的构成和/或类型的信息)。所提供的数据库包括相应于聚糖和/或结合糖的多个数据单元。数据单元包括一个标识符，该标识符包括一个或多个域，每个域储存相应于这些聚糖和/或结合糖的一个或更多特性的一个值。在一些实施方案中，该标识符包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个域。例如，一个数据库可以是所有可能的结合糖和/或聚糖的一个数据库，或可以是表示一个或多个样品的糖组图谱或模式的值的数据库。
提供了用于分析包含聚糖的样品(例如，非常规修饰的聚糖)的改进的方法，其中使用一个分析-计算组合平台来实现聚糖的彻底表征。可以将在此所描述的这些方法中任何一种与多种计算方法相结合。可以使用从不同的实验技术中收集的不同的信息来产生约束条件。可以与一组基于蛋白质组学和糖组学的生物信息学工具以及用于有效表征(非常规修饰、糖基化位点占用率、定量、聚糖结构、等)感兴趣的聚糖/结合糖混合物的数据库相结合来实现约束条件的产生。数据库可以是本领域中已知的那些或可以用所提供的方法来产生。作为一个实例，用分析和计算相结合的技术来分析聚糖的方法包括对包含聚糖的样品进行实验，分析该实验结果，产生约束条件，并且解决它们。可以用从实验结果得到的数据连同其他已知的信息(例如来自包含关于聚糖或结合糖的信息的数据库的信息)以及用分析聚糖、结合糖或它们的非糖部分的特性的其他工具(例如质量和酶作用)来产生和/或解决这些约束条件。
例如，可以使用聚糖合成的生物合成途径中已知的知识来产生约束条件。
V.试剂盒
可以将对于一种或多种所提供的方法的实践有用的试剂令人希望地一起来提供、装在一个试剂盒中。在某些实施方案中，本披露的试剂盒包括对于从细胞释放糖蛋白有用的一种或多种试剂(例如，一种或多种蛋白酶、糖苷酶、和/或其他试剂)、一种或多种唾液酸酶、和/或多种补充的组分(例如缓冲剂、辅因子、等)。在某些实施方案中，本披露的试剂盒包括对于纯化和/或分析这些聚糖制品有用的一种或多种试剂。
在一些实施方案中，所提供的试剂盒包括对于从一种糖蛋白或糖肽上切割聚糖结构有用的一种或多种试剂(例如，酶类(如PNGase F、PNGase A、O-聚糖酶、和/或Endo-H))。在一些实施方案中，本披露的试剂盒包括对于从这些糖蛋白或糖肽(例如，一种或多种糖苷酶)的蛋白组分中纯化切割的聚糖结构有用的一种或多种试剂。
在一些实施方案中，试剂盒包括用于标记这些聚糖结构的一种或多种试剂。例如，本披露的试剂盒可以包括荧光标记、放射性标记、和/或化学发光标记。在某些实施方案中，本披露的试剂盒包括荧光的2-氨基苯甲酰胺(“2-AB”)。
在某些实施方案中，所提供的试剂盒包括用于培养细胞(例如，细胞培养基、缓冲剂、培养基组分、等)和/或在已经培养细胞之后对这些细胞进行纯化的一种或多种试剂。
例证
实例1：非常规修饰的聚糖种类的鉴别和定量
这个实例中所提出的是使用用于对非常规修饰的聚糖种类进行鉴别以及定量的所提供的方法的实验结果。
通过酶的或化学的方法(例如，使用PNGase F、肼解，等)首先从感兴趣的糖蛋白中释放聚糖。然后使用2-氨基苯甲酰胺荧光标记物来标记释放出的聚糖。然后用一种唾液酸酶来处理荧光标记的N-聚糖混合物的样品，并且在37℃下孵育过夜。孵育后，将样品注射到阴离子交换柱上并且收集保留的种类(它包括带负电荷的种类)并且通过质谱法进行分析。
分别地，使用包含与混合物中聚糖的标记物相同的荧光标记物的外标来产生一个校准曲线。然后通过相对于校准曲线来推断它们的峰高/面积从而对非常规修饰的聚糖进行定量。可替代地，可以在色谱的一个第二维上(例如正相酰胺)对非常规修饰的聚糖(例如磷酸化的聚糖、硫酸化的聚糖、和/或多乙酰化唾液酸化的聚糖)进行分析，并且与预定的聚糖种类相比较可以从两个色谱分离的保留时间来确定这些种类的身份。
如图3和图4中所示，非常规修饰的聚糖比中性(去唾液酸化的)聚糖更晚地洗脱。因此可以将这一方案应用于聚糖混合物以从混合物中其他聚糖中分离非常规修饰的种类。可以使用图3的插图中所示的校准曲线来确定非常规修饰的聚糖的量。从图4中鉴别的非常规修饰的聚糖的定量分析中得到了类似的结果(数据未示出)。
如在此所描述的，图3描述了从一个中国研究来源得到的具有生物活性的促红细胞生成素治疗性糖蛋白所衍生的非常规修饰的聚糖种类的AEX-HPLC谱图。图4描述了从与图3中所描述的促红细胞生成素糖蛋白具有97％的氨基酸一致性的感兴趣的一个第二治疗性糖蛋白所衍生的非常规修饰的聚糖种类的AEX-HPLC谱图。来自各治疗性糖蛋白样品的非常规修饰的聚糖的谱图是彼此不同的。这些数据证实了所提供的方法能够区别高度类似的糖蛋白制品(例如，就聚糖组分而言)。对于抗体糖蛋白制品也已经得到类似的数据(参见图5-7)。
如图5、6和7中所示，高分辨率色谱法允许分离具有相同电荷状态的种类(例如单硫酸化的聚糖)，并且在所说明的分离条件下是可定量的。图5描绘了对小鼠体内产生的单克隆抗EGFR抗体所衍生的硫酸化的聚糖进行的色谱分析。图6和7描绘了对抗CTLA4-IgG单克隆抗体的单独的克隆所衍生的非常规修饰的聚糖进行的色谱分析。这些数据证实了所提供的方法能够区别由不同细胞系(例如，不同的克隆)所产生的糖蛋白。
等效物
本领域的普通技术人员应当认识，或者能够使用不超出常规的实验来确定，在此所描述的本披露的具体的实施方案的多个等效物。从在此所披露的本发明的说明书或实践的考虑中，其他实施方案对于本领域的普通技术人员来说将是清楚的。所意图的是该说明书和多个实例仅被认为是示例性的，其中本发明的真实范围将由以下权利要求来指出。
在权利要求中，冠词如“一个”、“一种”以及“该”可以表示一个或多个，除非指明与此相反或另外地从上下文中是显然的。在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为是满足以下条件：该组成员中一个、多个、或全体是否存在于，被用于一个给定的产品或方法、或者另外地与其相关联，除非指明与此相反或另外地从上下文中是显然的。本披露包括多个实施方案，其中该组中正好一个成员存在于，被用于一种给定的产品或方法，或者另外地与其相关联。本披露包括多个实施方案，其中该组成员中多个、或全体存在于，被用于一种给定的产品或方法，或者另外地与其相关联。
此外，应该理解的是本披露包括了所有变体、组合、以及排列，其中来自所列出的权利要求中一个或多个的一个或多个限制、要素、条款、描述性用语、等被引入到另一个权利要求中。例如，可以对从属于另一个权利要求的任何一个权利要求进行修改以便包括从属于同一基础权利要求的任何一个其他的权利要求中所发现的一个或多个限制。此外，当权利要求列举一种组合物时，应当理解的是包括为了在此所披露的目的中任何一项使用该组合物的方法，并且包括根据制造在此所披露的项目的多种方法中任何一种或本领域中已知的其他方法来制造该组合物的方法，除非另有说明或者除非对于本领域的普通技术人员而言显然会产生一种矛盾或不一致性。
当要素以列表(例如以马库什组的形式)的形式提出时，应理解的是这些要素中每个分组也被披露并且任何一个或多个要素可以从该组中被移出。总体而言，当本披露或本披露的多个方面是指包括特定的要素、特征、等时，应当理解的是本披露或本披露的多个方面的某些实施方案包括，或主要地包括此类要素、特征，等。为了简明性的目的，那些实施方案没有在此处的这些词语中被具体地提出。注意到的是术语“包括”旨在是开放性的并且允许包含另外的要素或步骤。
当给出范围时，包括了端点。此外，应该理解的是，除非另有指明或另外地从上下文中以及本领域的普通技术人员的理解中是显然的，被表达为范围的数值可以假定在本披露的不同实施方案中所说明的范围内的任何一个特定值或子区域为该范围的下限单位的十分之一(除非另外地在上下文中清楚地指出)。
此外，应当理解的是可以明确地将落在现有技术内的本披露的任何一个具体实施方案从这些权利要求中任何一项或多项中排除。因为此类实施方案被认为对于本领域的普通技术人员是已知的，即使没有在此明确地提出这种排除，它们也可以被排除。出于任何原因(不论是否与现有技术的存在相关联)，本披露的这些组合物的任何一个具体实施方案(例如，任何外切糖苷酶、任何糖苷键、任何反应条件、任何纯化的方法、产物分析的任何方法、等)可以从任何一个或多个权利要求中被排除。
以上以及贯穿本文所讨论的这些公开文件仅仅是因为它们的披露早于本申请的提交日而提供。在此的任何事项都不得被解释为承认诸位发明人由于现有披露而没有权利提前这个披露的日期。

Claims (31)

1.一种方法，包括以下步骤：
a)提供一种聚糖制品，从该聚糖制品中已经释放了唾液酸类；
b)使该聚糖制品经受一种分离技术，该分离技术基于荷质比来分离聚糖类；并且
c)使用至少一种定量标准物来对至少一种分离出的聚糖进行定量。
2.如权利要求1所述的方法，其中该提供步骤包括将一种包括聚糖类的组合物暴露于至少一种试剂，该试剂在允许切割唾液酸残基的条件下切割多种唾液酸残基。
3.如权利要求1所述的方法，其中该聚糖制品包括选自下组的非常规修饰的聚糖类，该组由以下各项组成：硫酸化的聚糖类、磷酸化的聚糖类、多乙酰化唾液酸化的聚糖类、以及它们的组合。
4.如权利要求3所述的方法，其中这些非常规修饰的聚糖构成该聚糖制品中存在的聚糖类的少于约50％。
5.如权利要求4所述的方法，其中这些非常规修饰的聚糖构成该聚糖制品中存在的聚糖类的少于约10％。
6.如权利要求4所述的方法，其中这些非常规修饰的聚糖构成该聚糖制品中存在的聚糖类的少于约5％。
7.如权利要求4所述的方法，其中这些非常规修饰的聚糖构成该聚糖制品中存在的聚糖类的少于约1％。
8.如权利要求4所述的方法，其中这些非常规修饰的聚糖构成该聚糖制品中存在的聚糖类的少于约0.1％。
9.如权利要求4所述的方法，其中这些非常规修饰的聚糖构成该聚糖制品中存在的聚糖类的少于约0.05％。
10.如权利要求1所述的方法，进一步包括分析分离出的聚糖类的结构特征。
11.如权利要求1所述的方法，进一步包括分析分离出的聚糖类的单糖构成。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中该分析结构特征的步骤包括执行选自下组的一种技术，该组由以下各项组成：核磁共振(NMR)、质谱法、液相色谱法、二维色谱法、毛细管电泳法(CE)、以及它们的组合。
13.如权利要求1、10或11所述的方法，进一步包括将分离出的聚糖类与以前鉴别的分离的聚糖类进行比较。
14.如权利要求13所述的方法，其中这些以前鉴别的分离的聚糖的特征被储存在一个数据库中。
15.如权利要求12所述的方法，进一步包括将分离出的聚糖类与以前鉴别的分离的聚糖类进行比较。
16.如权利要求15所述的方法，其中这些以前鉴别的分离的聚糖的特征被储存在一个数据库中。
17.如权利要求12所述的方法，进一步包括对分离出的聚糖类的结构特征进行一个或多个另外轮次的分析。
18.如权利要求1所述的方法，其中该经受步骤包括在一个带电荷的柱上对该聚糖制品进行分离。
19.如权利要求18所述的方法，其中该带电荷的柱是一个阴离子交换柱。
20.如权利要求1所述的方法，进一步包括一个在该聚糖制品中标记聚糖类的步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其中用与这些聚糖相同的标记物来标记该定量标准物。
22.如权利要求1所述的方法，其中该提供步骤包括提供从结合糖类中释放出的一种聚糖类制品。
23.如权利要求22所述的方法，其中这些结合糖包括糖蛋白类。
24.如权利要求22所述的方法，其中这些聚糖是使用一种糖苷酶多肽来从结合糖类中释放的。
25.如权利要求22所述的方法，其中这些聚糖是通过肼解来从结合糖类中释放的。
26.如权利要求22所述的方法，其中这些结合糖是从治疗性配制品类、商品化的生物制品类、生物反应器类、以及生物样品类中得到的。
27.如权利要求22所述的方法，其中这些结合糖是从选自下组的来源得到的，该组由以下各项组成：组织培养物类、人或动物的组织类、植物类、果实类、蔬菜类、以及它们的组合。
28.如权利要求26所述的方法，其中这些结合糖是从体液类中获得的。
29.如权利要求28所述的方法，其中这些结合糖是从选自下组的体液中获得的，该组由以下各项组成：血清、血浆、血液、唾液、精液、尿液、脑脊髓液、以及它们的组合。
30.如权利要求1所述的方法，进一步包括鉴别这些分离出的聚糖。
31.如权利要求1所述的方法，进一步包括进行一种或多种技术，该一种或多种技术允许基于大小、疏水性、电荷、或它们的一种组合来分离多种分子。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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