JPH03228698A - オリゴ糖の配列決定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■　　の　　１ この発明は、オリゴ糖の配列決定方法、更に詳しくは、
その成分が本質的に同時に測定されるオリゴ糖の配列決
定方法に関する。

化合物の配列決定を行なう数多くの分析技術は、その出
発化合物を識別するためにそれらの生成物を分析して追
跡するよく知られた化学または酵素反応の利用によるこ
とが有用である。例えばエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解の
ような蛋白質の配列決定は蛋白質やペプチドの一次構造
の直接決定に長年広く用いられてきた［エドマン（Ｅｄ
ｍａｎ）　ｌスカンジナビア化学誌Ａｃｔａ、　Ｃｈｅ
ｍ、　５ｃａｎｄ、　１０　、７６Ｈ１９５６）　；フ
ンキャピラー（ＨｕｎＫａｐｉ　ｌ　１ｅｒ）及びフー
ド（Ｈｏｏｄ）　。

科学サイエンス５ｃｉｅｎｃｅ　　２１９　、６５０−
６５９　（１９８３）］。

さらに最近導入されたＤＮＡ配列決定の早くて簡単な方
法は、また生化学及び分子生物学に対して重要な道具と
なってきた。そのＤＮＡ配列決定にもっとも広く用いら
れている技術はマクサム（Ｍａｘａｍ）とギルバート（
Ｇｉｌｂｅｒｔ）、科学国立アカデミ−会報Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　　　（ＵＳＡ）
■５６０−５６４　（１９７７）、及びサンガー　（Ｓ
ａｎｇｅｒ）ら、科学国立アカデミ−会報Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

米■旦針）　ｌ、　５４６３−５４６７　（１９７７）
、のちのである。

方法はさらにコハクによって“糖タンパク質の炭水化物
、炭水化物の生物学″”　（ギンスハーグ及びロビンズ
編集）（Ｇｉｎｓｂｕｒｇ　ａｎｄ　Ｒｏｂｉｎｓ　、
　Ｅｄｓ、　ＬＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎ
ｓ　、２　　巻、８７−１６２頁、　１９８４に記述さ
れ、またスナイダー（Ｓｎｉｄｅｒ）　、によっても同
書の１６３−１９３頁、１９８４に記載されたようなオ
リゴ糖の配列決定に対し開発されてきた。またハラダ（
Ｈａｒａｄａ）らの　　　　　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。

川４　、３７４−３８１　（１９８７）も参照のこと。

大部分のタンパク質は〇−配糖体に結合するか、または
Ｎ配糖体に結合した糖類を含む糖タンパク質である。

これらのＩＲＮは単独の単糖がらＣｏケ以上の単糖残基
を含む高度に分枝した構造へ変化に富んでいる。そのよ
うなオリゴ糖における単糖の配列決定には単糖残基の順
位と分校パターン、それぞれの配糖体結合（αまたはβ
）の配向及び種々の単複間の結合（即ち１→３．１→４
等）を決めることを含む。

配列決定の多くの有用な分析技術は、実際には連続して
起こる。即ち単独の反応が行われ、その生成物が分析さ
れ、次いで第２の反応と第２の分析が続き、出発原料に
対してが、または最初の反応の生成物に対して行われる
。これらの技術の連続して起こる性質を次の図式で大要
を説明できる。

サンプル士試　薬　ｌ→生成物１＋結　果　１または十
試　薬　２→生成物２＋試　薬　２これらの連続的な技
術は、極めて適応性と感受性に冨んでいる。即ちそれぞ
れの続いて起こる反応は前の結果を基にして選ぶことが
でき（適応性）、１つの反応の生成物は次のに対する出
発点として用いられる（感受性）。しかしこれらの技術
にも不利な点があり、連続して起こる技術なので工程が
おそくなり、手順を予め決めない限り自動化すること困
難となりそのためにその適応性を失う結果となる。

オリゴ糖の配列と構造の決定は、種々の分野特に医学及
び薬学の分野で極めて重要である。例えば糖タンパク質
の炭水化物構造は、その生物学的活性に著しい効果を有
する。即ちオリゴ糖はタンパク質の抗原性、安定性、溶
解性及び三次構造に影響を及ぼす。炭水化物の側鎖はま
たタンパク質の半減期に影響を及ぼし、適切な細胞上の
レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に対しそれを攻撃目標
とする。炭水化物の残基は細胞間及び細胞内認識の両者
に影響を及ぼす。こうして糖の原子団（ｇｒｏｕｐ）は
患者に与えると、治療力のあるタンパク質の相対的な効
果を管理することができる。糖タンパク質の炭水化物の
一部分（ｍｏｉｅｔｙ）のこれら及びそのほかの機能は
、例えばデレンテ（Ｄｅｌｅｎｔｅ）　、生物工学にお
ける動向Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　３　
（９）、２１Ｂ（１９８５）；ヴアンプルント（ｖａｎ
　Ｂｒｕｎｔ）　、生物／工学−射旦ＺＴｅｃｈｎｏｌ
ｏ　　４．８３５−８３９　（１９８６）及びタウント
ン−リグビー（Ｔａｕｎｔｏｎ　−Ｒｉｇｂｙ）＋生物
工学（米国）８ｉｏｔｅｃｈ　ＩＪＳＡ　１９８８　、
会議録Ｐｒｏｃ、　Ｃｏｎｆ、サンフランシスコ（Ｓａ
ｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）　＋１１月１４−１６　、１
９８８゜１６８−１７６頁によって討議されている。

さらに類偵のタンパク質又は同一のアミノ酸配列を有す
るタンパク質のグリコジル化パターン（ｐａｔｔｅｒｎ
）　　（即ち特定の部位における特別な構造）における
相違は抗原性、新陳代謝、及びその他の生理学上の特性
に関し意味深い効果をもたらすことは明らかである。例
えば、パレータ（Ｐａｒｅｋｈ）ら。

自然Ｎａｔｕｒｅ　３１６　、４５２−４５７　（１９
８５）　　による“全血清のグリコジル化パターンにお
ける変形（ｃｈａｎｇｅ）を伴なうリューマチ性関節炎
及び骨関節炎の共働”のレポート及び米国特許４，６５
９，６５９を参照のこと。

オリゴ糖の配列決定の実際の用途は、米国特許４，７５
１，０８４に組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔｉｓｓ
ｕｅ　ｐｌａｓｓｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ）
（ｔＰＡ）として周知の医学的に重要な抗血栓症糖タン
パク質について具体的に説明されている。そのオリゴ糖
の配列決定を実行する方法を改良することはこうして医
学及び薬学の分野及びそのほかでかなりの価値があるこ
とであろう。

光所辺１皇星籠皿 この発明に従って、オリゴ糖配列決定の今までにない方
法を提供し、それにより成分は本質的に同時に決定され
る。便利なようにこの方法はここでは試薬配列所定法（
Ｒｅａｇｅｎｔ　Ａｒｒａｙ　ＡｎａｌｙｓｉｓＭｅｔ
ｈｏｄ）　（以下、ＲＡＡＭという）と呼ばれている。

先行技術のオリゴ糖配列決定の連続法においては、特定
の結合の存在は分割を引き起こす与えられた酵素の能力
によって決定づけられる。ＲＡＡＭ法においては、一定
の結合の存在は一定のその結合を分割する分割試薬、例
えば特殊な酵素を欠いている試薬混合物の無能力性によ
って決定される。一定の結合に到達するまで、すべての
そのほかの結合が分割されるならば、その結合は試薬混
合物によって分割に停止点（ｓｔｏｐ　ｐａｉｎｔ）を
形成する。オリゴ糖における停止点の位置は残存する部
分　（ｆｒａｇａ＋ｅｎｔ）の大きさによって決められ
る。もしその結合が生じなければ停止点に達することな
く、分割は完全に行なわれる。

この発明の方法は次のような一連の段階を含むものとし
て便利よく記述される。

Ａ、配列決定されるべきオリゴ糖の還元性末端の残基に
識別ラベルを配置して、 Ｂ、前記オリゴ糖の既知の整数量の複数の部分に分割し
、 Ｃ０それぞれの前記部分を、異なった試薬混合物で処理
し、一連の反応混合物を提供し、Ｄ、それぞれの分離し
た反応混合物から、既知の整数量の生成物をプール（ｐ
ｏｏｌ）　シて生成物プールを作り、 Ｅ１反応生成物のモル比を測定し前記生成物プールの分
析を行ない、及び Ｆ、前記反応生成物のモルブレヴアレンス（ＩＩｏｌａ
ｒ　ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）から出発オリゴ糖を再生ま
たは識別する。

この発明の方法の同時に起こる性質を次の図式で大要を
説明できる。

試薬配列　　分析 ニ 二の発明の方法の２つの主な利点は、すべての反応が同
時に行なわれ、簡単な分析が最後に行なわれるので、第
１に反応の意味が明らかでそのため自動化には適してい
ること、第２は連続して起こる技術よりははるかに早い
ということである。

皇宜坐註豊星説所 明細書がこの発明を組み立てているとみなされる主題を
特に指摘し、はっきりと要求している特許請求の範囲で
結論づけると同時に、この発明は添付する図面とともに
選ばれる次に記述する発明の好ましい実施態様から十分
に理解されると考えられる。

第１図はこの発明の１つの実施態様の図式で、Ａ・・・
Ｂ・・・Ｃ・・・Ｄ・・・Ｅとして表した線状のオリゴ
糖は、第１Ｂ図で示した酵素混合物によって生成した酵
素反応の停止点１，２，３，４．５及び６の所でその二
糖結合はエキソグリコシダーゼａ、ｂ。

Ｃ及びｄで分解される。酵素の存在−＊；酵素の不在＝
０ 第２図はこの発明のもう１つの実施ｍ様の図式た分枝オ
リゴ糖は第１図ではオリゴ糖と同様に処理されるが酵素
の混合物ａ＋ａ’は酵素ａ（第２Ｂ図）の代りに用いら
れまたは酵素混合物の拡大した原子団（第２Ｃ図）で処
理される。

第３図はこの発明のそのほかの実施態様に従って配列し
た３つの図解した複雑なオリゴ糖の構造を示す。構造Ｉ
−複雑な２つのアンテナを有するオリゴ糖；構造■−複
雑な３つのアンテナを有するオリゴ糖；構造■＝複雑な
フコース化した（ｆｕｃｏｓｙｌａＬｅｄ）　　２つの
アンテナを有するオリゴ糖。

第４図は第３図のオリゴ糖構造Ｉの配列決定に対するＲ
ＡＡＭを示した図式である。

第５図は第４図で配列決定したオリゴ糖に対するコンピ
ューターでシミュレートしたバイオ・ゲル（Ｂｉｏ−Ｇ
ｅｌ）Ｐ−４ＲＡ　Ａ　Ｍの図表（強度対グルコース単
位）をグラフで表したものである。

第６図は第８図、第１Ｏ図及び第１２図のこの発明のそ
のほかの実施態様におけるオリゴ垢配列決定に用いた酵
素配列を示す。

第７図は画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）の強さ（計数７分）
をデキストランの内部にある標準の酸による加水分解物
の流体力学量（グルコース単位における）に対してプロ
ットしたバイオ・ゲルＰ−４クロマトダラムを示す。

第８図は第６図で示した酵素配列を用い第７図で配列決
定したオリゴ糖に対しコンピューターでシミュレートし
たバイオ・ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）　Ｐ−４ＲＡＡＭの
図表を示す。

第９図は画分の強さ（計数７分）をデキストランの内部
にある標準の酸による加水分解物の流体力学量の（グル
コース単位における）に対してプロットしたバイオ・ゲ
ルＰ−４クロマトグラムを示す。

第１Ｏ図は第６図で示した酵素配列を用い第９図におけ
る配列したオリゴ糖に対しコンピューターでシミュレー
トしたバイオ・ゲルＰ−４ＲＡＡＭの図表を示す。

第１１図はその図の中で示した酵素配列を用いて表現し
たオリゴ糖に対するコンピューターでシミュレートした
Ｐ−４ＲＡＡＭの図表を示す。

第１２図はその図の中で表現した酵素配列を用いて示し
たオリゴ糖に対するコンピューターでシミュレートした
Ｐ−４ＲＡＡＭの図表を示す。一番高い　ＲＡＡＭの図
表は、（第１１図の一番高いＲＡＡＭに比べて）モノガ
ラクトース化しフコース化した２つのアンテナを有する
オリゴ糖の１５％の汚染物質の効果を示す。また不完全
な酵素の消化の効果も示している。

第１３図は拡大したブランクの対角線配列がブランクの
対角線配列を用いた同じ試薬配列分析法（ＲＡＡＭ）の
図表をもたらす２つの類似のオリゴ糖を如何に正しく区
別するかを示す。

第１４図はその図の中で表現されたオリゴ糖に関する拡
大した酵素配列とＲＡＡＭを行なった結果の図表を示す
。

この発明の方法に従って配列決定できるオリゴ糖はいろ
いろな植物源や動物源から得られる。例えば： （１）精製した塘タンパク質及び塘ホルモン（２）全血
清及びその両分 （３）例えば尿、乳、胎便、粘液、初乳グロブリン等々
のような生物学的セクレチン； （４）例えば腎臓、肝臓、心臓、肺臓、すい臓、肺臓の
よ−５−な全器官： （５）植物の幹及び葉の抽出物； （６）種子成分； （７）　　レクチン及び （８）　　エムルシン。

そのような植物や動物の材料からヒドラジン分解のよう
な化学的な方法による還元性末端残基を含むオリゴ糖を
分離することは、米国特許４．７１９．２９４及び４，
７３６，０２２．及びタカサキ（Ｔａｋａｓａｋｉ）ら
の酵素方法論Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　８３　、
２６３−２６８（１９８２）に記載されている。

酵素の方法による還元性末端残基を含むオリゴ糟の分離
は、ヒラニらの分析生化学Ａｎａｌ、　Ｂｉ−ｃｈｅｍ
、　１６２　、４８５−４９２　（１９８７）に述べら
れているようにＮ−グリカナーゼを用いて具体的に説明
されている。

配列決定されるべきオリゴ糖の還元性末端残基に配置さ
れた識別ラベルは、例えば放射性ラベル、分光的活性レ
ポーターグループ（ｓｐｅｃｔｒｏ−ｓｃｏｐｉｃａｆ
ｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ）
または化学的活性レポーターグループ（ｃｈｅａ＋１ｃ
ａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｒｏｕｐ
）があげられる。そのラベルの実例としては、放射性三
重水素　（３Ｈ）、２−アミノピリジンラベル及びグリ
コジルアミンの添付した螢光ラベルがある。オリゴ槽上
の放射性ラベルは、例えば還元性末端のＮ−アセチルグ
ルコサミンの残基を水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢ３
Ｈａ）で還元することによって提供される。

このラベルされたオリゴ糖サンプルは既知の整数量であ
るべき、前もって決められた数の部分に分割される。具
体的にこの発明の実施態様を説明すると、オリゴ糖は複
数の等しい部分に分けられ、その部分は決められた二糖
結合の数より、数にして２つ以上多い。しかしサンプル
部分の数はオリゴ糖結合の数に関係づける必要はない。

分離したオリゴ糖の部分を処理するのに用いる試薬は、
例えば Ａ）エキソグリコシダーゼ及びエンドグリコシダーゼの
ような酵素分割試薬、 Ｂ）炭素−炭素結合切断用の酢化分解、過ヨウ素酸塩酸
化に用いられるような化学分割試薬、及びスミス分解試
薬、及び Ｃ）オリゴ糖構造分析に用いられるメチル化剤、例えば
ジメチル硫酸（Ｍｅ２ＳＯ４）のような化学修飾試薬、
等々が挙げられる。

酵素分割試薬を用いるこの発明の実施態様を具体的に説
明すると処理の段階には次のことが含まれる：それぞれ
のオリゴ糖サンプル部分を、種々の複数の酵素を含む特
定の酵素試薬ユニットの配列と反応させ、前記オリゴ糖
サンプル中に存在している選ばれた二糖結合を分割し、
前記オリゴ糖サンプル中においてそれぞれの前記結合は
ただ１つの前記酵素によって分解され、且前記試薬ユニ
ットは全部でオリゴ糖サンプル部分の数に等しく、次の
ように構成される： （１）１つの前記試薬ユニットはすべての前記酵素の混
合物を含み、 （２）　　もう１つの前記試薬ユニットはブランクで全
然前記酵素を含まない、及び （３）残っている前記試薬ユニットはそれぞれ残ってい
る前記試薬ユニットの他のそれぞれに含まれている１つ
の酵素を除くすべての前記酵素の混合物を含む。

この発明の実施態様をもう１つ具体的に説明すると、酵
素試薬ユニットの拡大した配列は、１つ以上の前記の酵
素によって分割された結合によって生じた縮重を相殺す
るために用いられる。次に示す細胞外酵素とそれらの特
異性は、これらの酵素混合物中で用いられる酵素を具体
的に説明している。

第 表 第 １ 表 （続） 酵素反応は前もって決められた時間の間または望ましい
終点（ｅｎｄ　ｐａｉｎｔ）まで続けられ、または最後
まで達成され反応混合物または最終の分割反応生成物を
それぞれの前記オリゴ糖部分について提供される。

それぞれの分離した反応混合物からの生成物は結合して
生成物プールとなる。前記生成物のプレヴァレンスは定
量的に同時に測定して反応生成物のモル比を決定し得−
る。単一の分析はすべての生成物のプールで行なわれ、
又は、そうではなく１つの分析はたとえば生成物の半分
に、もう１つの分析が生成物のほかの半分に行なわれる
。

生成物プールの分析は次のような技法を用いて行なわれ
る。

Ａ）例えばバイオ・ゲル（登録商標） （Ｂｌｏ−Ｇｅ１■）Ｐ−４のゲルが過クロマトグラフ
ィー〔ヤマシタら、酵素方法論Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ…１
別、　１０５−１２６　（１９８２）　）のようなサイ
ズ排除クロマトグラフ４−（ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉ
ｏｎ　ｃｈｒｏｎ＋ａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用い、それ
に対して生成物溶離（ｅｌｕｔｉｏｎ）容積は予知でき
る。流体力学量は下の第２表に示したものが用いられる
。

第 表 流体力学量決定 下記の規則は酵素分割のあとフラグメントの流体力学量
を決定するのに用いられる： ｅｕＮＡｃ （Ｎ アセチルノイラミン酸） ＝６．０ 還元性末端 ０．５ Ｂ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の技法〔
バーデイ［Ｈａｒｄｙｌ及びタウンゼント（Ｔｏｗｎｓ
ｅｎｄ）　＋科学国立アカデミーＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ８５　、３２８９
−３２９３　（１”ｒ８８）；タウンゼント（Ｔｏｗｎ
ｓｅｎｄ）ら自然、　Ｎａｔｕｒｅ　　３３５　　、３
７９−３８０　（１９８Ｂ）　）　、は実験データの基
礎を得、既知の標準と比較して生成物を確認している。

Ｃ）例えばキャピラリー電気泳動〔ゴートン（Ｇｏｒｄ
ｏｎ）ら、科学　５ｃｉｅｎｃｅ　　」４２．２２４−
２２８（１９８Ｂ）　）及びゲル電気泳動のような電気
泳動は実験データの基礎を得、既知の標準と比較して生
成物を確認している。

反応生成物のモルプレヴァレンスからの出発オリゴ糖の
再生または識別は、コンピューターがもたらしたデータ
ベース（理論的または実験的データを基にした）または
数多くのオリゴ糖に対する結果の純粋な実験データベー
スで、分析結果を直接解読しまたは分析結果の比較を行
なっている。

監視技法には次のようなそれぞれの生成物のモルプレヴ
ァレンスを決定するオリゴ糖配列決定方法が用いられる
。

Ａ）電流滴定法、例えばパルス電流滴定検出Ｂ）化学反
応性方式、例えば抗体認識及び質量分光測定 Ｃ）分光法、例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）（Ｖｌｉｅｇ
ｅｎｔｈａｒｔら、上級炭素化学及び生化学Ａｄｖ、　
Ｃａｒｂ、　Ｃｈｅ＋ｍ、　＆　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　
４１．２０９−３７４（１９８３））　、質量分光測定
、赤外、紫外及び螢光、 及び好ましい実施態様において： Ｄ）還元性末端を還元することによる反射能ラベルの添
付。

さらに詳しくこの発明を具体的に説明するために、オリ
ゴ糖配列決定のＲＡＡＭを下記の実施例においてオリゴ
糖のエキソグリコシダーゼ配列決定の具体的な応用に関
して記述しよう。この発明はこれらの具体的な実施例に
限定されないことは理解されよう。

スー」Ｌ−桝 ＲＡＡＭのオ曹ゴ　　　への 生物学的なオリゴ糖の共有結合構造を決定する主な先行
技術の１つは、逐次エキソグリコシダーゼ消化を基にし
ている。放射能を持った三重水素（３Ｈ）でラベルした
還元性末端を有するオリゴ糖は、特定のエキソグリコシ
ダーゼで処理し、還元性末端生成物は放射能計数管によ
ってモニターされるバイオ・ゲルＰ−４クロマトグラフ
ィーを用いるその流体力学量を基にして分析される。次
いで最初の反応の生成物を別のエキソグリコシダーゼで
処理し分析を続ける。

この実施例においてオリゴ糖のエキソグリコシダーゼ配
列決定に適用されたようなＲＡＡＭで最初のオリゴ糖サ
ンプルは多くの等しい部分に分けられる。それぞれの部
分は別々のエキソグリコシダーゼの混合物で処理し単一
の還元性末端フラグメントをもたらす。その結果生成し
た、すべての還元性末端のフラグメントを含む生成物プ
ールはバイオ・ゲルＰ−４クロマトグラフィーで分析す
る。

最後のスペクトルで、それぞれの反応混合物からの積分
強度を含む強さ（計数７分）対流体力学量（グルコース
単位）をプロットする。エキソグリコシダーゼの混合物
はそれぞれの反応に用いられるので、得られた情報は単
一の酵素が用いられる逐次技法の情報とは異なる。ＲＡ
ＡＭの固有特性ではなくて用いられた酵素配列の特性で
ある）。

オリゴ糖配列決定の先行技術の逐次法においては、特定
の結合の存在は与えられた酵素の分割を起こす能力によ
って決定される。ＲＡＡＭにおいては、一定の結合の存
在は、その結合の分割を起こす一定の酵素を欠く酵素混
合物の無能力性によって測定される。一定の結合に達す
るまで、すべてのそのほかの結合が分割されることから
、その結合は酵素混合物によって分割に停止点を形成す
る。オリゴ糖における停止点の位置は残存するフラグメ
ントの大きさによって決められる。もしその結合が生じ
なければ停止点に到達することなく、分割は完全に行な
われる０例えばエキソグリコシダーゼａ、ｂ、ｃ及びｄ
によって分割された結合を有する第１Ａ図で示した線状
のオリゴ＠ＡＢＣＤＥを考えよう。エキソグリコシダー
ゼの混合物ａ十ｃ＋ｄは最後のフラグメントＢＣＤＥを
形成するであろう（ＢＣ結合はエキソグリコシダーゼｂ
がないときには停止点を形成する。）。しかし結合ＢＣ
を欠く糖は完全に分割し、それによって生成物Ｅを生じ
る。そのような混合物のセット（酵素配列）を用いるこ
とによって完全なオリゴ糖が停止点のパターンによって
マツピングされる。

西　１−ｉ 酵素配列の最初の目的はオリゴ糖がマツピングできるよ
うな停止点のパターンを作り出すことである。はっきり
明示された停止点のパターンを作り出すには、次の必要
条件を満たすような基本的な酵素のセットを選ぶべきで
ある： １、　オリゴ糖で起こりうる各全ての二糖結合を分割す
るために望ましい全ての酵素を含む混合物。

２、余分があってはならない（即ち、一定の結合はただ
１つの酵素によって分割されなければならない）。

酵素は単糖及び／または特定な結合であり、しかし特定
な武装因子を有しないことが好ましい。

さもなければ停止点のパターンは関連する化合物の間を
変動してしまうおそれがある。線状のオリゴ糖に対して
は、基本的な酵素配列は次のものを用いてもたらされる
： １、酵素を有しないブランクの混合物−これは出発生成
物の流体力学量をもたらす。

２、　それぞれが１つの酵素を欠いている混合物これら
は構造のマツピングに用いられる停止点のパターンをも
たらす。

３、　すべての酵素を含む混合物−これは単糖をラベル
した生成物（例えばＮ位に結合したオリゴ糖にはＮ−ア
セチルグルコサミン（Ｇｌｃ　ＮＡｃ）ラベルした生成
物）を生じ、オリゴ糖が、用いられている配列によって
完全に配列決定されることを保証する試験を提供する。

前述の混合物のセットは、ブランク対角線配列と呼ばれ
る。第１Ａ図に説明した線状構造に対するような配列は
第１Ｂ図に示し、それがもたらす停止点パターンは第１
Ａ図に示す。

第２Ａ図に示すような分枝オリゴ糖については、停止点
の同じパターンは同じ手順で作られるが、酵素の混合物
ａ＋ａ’が酵素ａの代りに使用されることは除外される
（第２Ｂ図）。

いったん正確な゛体止点パターンが作られると、さらに
選択的な酵素を用いる基本的な配列を拡大することによ
って余分な特異性が包含される。すでに存在する混合物
を基にして余分の混合物が加えられ、普通の酵素がさら
に特異的な酵素によって置きかえられる（例えば第２Ｂ
図の配列は、さらに特異的な酵素ａによって置きかえら
れた複合酵素ａ＋ａ’を有する混合物を加えることによ
って拡大される。第２Ｃ図）。構造的な制限のために、
これらの余分な混合物のあるものはよけいなものかも知
れない。拡大した配列は、同じ方法でそのほかのさらに
選択された試薬と代って更に拡大し得る。

第４図には、２つのアンテナを有するオリゴ糖に４つの
酵素（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を含む酵素配列を用いた効果
を図解説明する。それぞれの消化混合物Ｕ、からＵ６の
結果は表にし、最後のフラグメント図表が計算される。

それぞれのフラグメントの流体力学量はさらにそれぞれ
のオリゴ糖残基のグルコース単位から計算される（丸で
囲んだ数字）。それぞれの酵素の分割点（ｃｌｅａｖａ
ｇｅ　ｐｏｉｎｔ）はさらに破線の矢印で示す。第５図
には、第４図において配列決定されたオリゴ糖のコンピ
ューターで計算されたＲＡＡＭバイオ・ゲルＰ−４図表
を示す。

Ａ　　八　第１ゴ　の゛ 酵素ＲＡＡＭは、ここでは２つのオリゴ糖、２つのアン
テナを有する複合体（構造Ｉ、第３図）及び３つのアン
テナを有する複合体（構造■、第３図）で示す。これら
の２つの試験に用いられる酵素配列は第６図に示すが、
消化はクチナタマメα−マンノシダーゼに対し武装した
特定の条件下に行なわれた。

扛粁反グ方抜 構造の■と■はそれぞれ糖タンパク質ヒト血清トランス
フェリン及びウシ・フェチュインから作られた。両方の
化合物は水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢ３Ｈｎ）で還
元した還元性末端を放射能でラベルした。

それぞれのサンプルは７つの等しいアリコートに分け、
第６図に示したエキソグリコシダーゼ混合物で消化した
。これらの酵素混合物は０．ＩＭのクエン酸、０．２Ｍ
の第２リン酸ナトリウム及び０、（１０１％のアジ化ナ
トリウムから成る緩衝液中、ｐＨ５，０で下の第３表に
示す酵素活性で調整した。

第　　　　３　　　　表 酵素活性の１単位は、３７°Ｃで、その適当な３ｍＭの
ｐ−ニトロフェニル配糖体を加水分解するに要する量で
定義する。それぞれの場合、基材の濃度は３０μＭで酵
素反応は３７°Ｃで１８時間、トルエンを用いて行なっ
た。

その結果得られた生成物の溶液は、それぞれのサンプル
としてプールされた。バイオ・ゲルＰ−４のピークの強
さは、それぞれのピークに対応する画分をプールし、シ
ンチレーション計数器で計数７分を計って測定される。

格−来 その結果、オリゴ糖構造Ｉ及び■の酵素ＲＡＡＭ　　Ｐ
−４のクロマトグラムは第７図及び第９図にそれぞれ示
し、位置と強さのデータは下の第４表に要約する。

第 表 その結果から、これらの条件の下では用いられたすべて
のエキソグリコシダーゼは普通通り完全に反応し、それ
ぞれの酵素混合物から単独の還元性末端を有する生成物
を生産するまで作用したことが明らかである。希望によ
り、強さのデータを７（酵素混合物の数）標準化すると
、それぞれのピークは整数の強さを示す。オリゴ糖構造
Ｉ及び■に対するコンピューターでシミュレータしたバ
イオ・ゲルＰ−４ＲＡＡＭの図表はそれぞれ第８図及び
第１０図に示し、実験的に測定したバイオ・ゲルＰ−４
ＲＡＡＭの図表に一致している。

フォートラン（ＦＯＲＴＲＡＮ）　７７プログラムセツ
トをマイクロ・ヴアックス　（Ｍｉｃｒｏ−Ｖａｘ）　
　ＩＩに書き込み、実行させて、オリゴ糖に用いた前述
の酵素ＲＡＡＭの試験結果をシミュレートさせた。コン
ピューターシミュレーションは、さまざまの試験方法を
チエツクするのに用いられ（例えばさまざまの酵素配列
による結果を比較すること）、また広範囲にわたる実験
の必要性なしに、方法の理論的許容誤差を試験するのに
用いられる（例えば不完全な酵素消化または汚染物質の
存在に対し）。

正確なコンピユー−ターモデルはさらに通常の自動化さ
れた分析法に必要な理論的構造のライブラリーのために
作られる計算結果のデータベースを与えている（下記参
照）。

１−法 分枝したオリゴ糖は線状のひも（ｓｔｒｉｎｇ）の記号
で表す。それぞれのエキソグリコシダーゼの活性は、そ
こに作用するオリゴ糖サブユニットを表すひもの記号で
特徴づけている。オリゴ糖のひもは探索され、一定の酵
素活性に対し対応　するどんな区域でも抹消される。こ
の方法は必要とするいくらでも多（の酵素に対し生じた
ひもの上でくり返される。最後のフラグメントのバイオ
・ゲルｅ４分析からの流体力学量データは、上述の第２
表に記載された規則により別々の単糖ユニットの寄与を
合計して計算される。この方法は配列においてそれぞれ
の別々の酵素混合物に対しくり返され、結果を合計して
オリゴ糖に対する最終的なＰ−４図表をもたらす。すべ
ての手順は自動化され、どんな一定の酵素配列に対する
酵素　ＲＡＡＭＰ−４図表のデータベースでも、必要と
する多くのオリゴ糖に対して作られるようになる。酵素
ＲＡＡＭＰ−４図表はさらにオリゴ糖の混合物及び不完
全な酵素消化の場合に対してもシミュレートされる。

猜−来 第６図で示した酵素配列を用いる構造Ｉ及び■の酵素Ｒ
ＡＡＭＰ−４図表をコンピューター計算した場合と試験
した場合の比較を上記の第４表に示す。それから分るよ
うにコンピュータープログラムは試験データを大変よく
再現している。酵素分割の結果が正確に再現された（酵
素の特異性が既知の場合）。

これらのプログラムは、いろいろな酵素配列を用いた数
多くのオリゴ糖に対する結果をモデル化することに使用
してきた。４つのオリゴ糖に対する代表的な結果を第１
１図に示す。この場合用いた酵素配列にはα−フコシダ
ーゼを含む。たとえそれらが同じ計算された流体力学量
を有し、最初の３つの化合物がすべて密接に関連してい
ても、すべて４つの化合物はこの配列を用いて異なるＲ
ＡＡＭの図表を示す。最初の（上部）オリゴ糖は構造Ｉ
である。

酵素のＲＡＡＭＰ−４図表についてのサンプルの不純物
及び不完全な酵素消化の両方の効果は、これらのプログ
ラムを用いてモデル化された。第１２図には単独のオリ
ゴ糖（構造Ｉ）に対する計算したＲＡＡＭＰ−４の図表
を示すが、関連するオリゴ糖の１５％不純物を含むもの
（上のパネル）、または第１１図で示した同じ配列に対
する純粋なＰ−４図表と比較してβ−ガラクトシダーゼ
に対し８５％の消化効率を有するもの（中のパネル）、
またはすべての酵素に対し８５％の消化効率を有するも
の（下のパネル）を示す。これらの結果からこの方法は
サンプルの不純物に対するよりは、不完全な酵素消化に
対する方がはるかに敏感であることが明らかである。一
般に８０−８５％のサンプル純度と９０−９５％の酵素
効率であれば存在している主な成分の図表をひき出すの
に十分である。

第１３図には、いかに酵素混合物の拡大したブランクの
対角線配列が偶然おきるかも知れない縮重を減少させる
ことができるかを示す。この図解説明した例では、植物
のオリゴ糖の配列決定に要求されるエキソグリコシダー
ゼ（１から６までの酵素混合物）の基本的なブランクの
対角線配列は、ここに示した２つの近接して関連したオ
リゴ糖の構造を正しく区別できない。即ち上部の左と下
部の左のパネルに示したこれらの２つのオリゴ糖に対す
るそれぞれのＲＡＡＭＰ−４図表は全く同一である。し
かし拡大したブランクの対角線配列（その中では酵素混
合物６の代りに酵素混合物６及び６′が用いられる）は
、この２つのオリゴ糖構造に対し、独特なＲＡＡＭＰ−
４図表をもたらす。上部の右と下部の右のパネルの比較
例はこのそれぞれのオリゴ糖のＲＡＡＭＰ−４図表にお
いて明らかに本質的な違いを示している。

第１４図には、基本的にブランクの対角線配列は、２つ
の異なるオリゴ垢構造が同じＲＡＡＭＰ−４図表を有す
る可能性を減らすため極度に複雑にしていることを示す
。この図解の例においては、全部で７つの異なるエキソ
グリコシダーゼは、全部で１６の異なる酵素混合物を調
製し、オリゴ糖構造Ｉに示したＲＡＡＭＰ−４図表を作
っている。

種々のそのほかの実施例は、この発明の精神と範囲に反
することなくこの開示を解釈した後、当業者にとっては
すぐ分る所であろう。すべてのそのほかの実施例は、後
に添付する請求項の範囲内に含まれるよう志向される。

はこの発明の別の実施態様の図式図、第３図はこ応する
ＲＡＡＭを示した図式図、第５図はバイオ・ゲルＰ−４
ＲＡＡＭの強変対グルコース単位を表すグラフ図、第６
図は第８．１０．１２図のこの発明の実施態様を用いた
酵素配列を示す図、第７図は、画分の強さ（計数７分）
をデキストランの内部にある標準の酸による加水分解物
の流体力学量（グルコース単位における）に対してプロ
ットしたバイオ・ゲルＰ−４クロマトグラムを示す図、
第８図は第６図で示した酵素配列を用い第７図で配列決
定したオリゴ糖に対しコンピューターでシミュレートし
たバイオ・ゲルＰ−４ＲＡＡＭの図表図、第９図は両分
の強さ（計数７分）をデキストランの内部にある標準の
酸による加水分解物の流体力学量（グルコース単位にお
ける）に対してプロットしたバイオ・ゲルＰ−４クロマ
トダラム図、第１０図は第６で示した酵素配列を用い第
９図における配列したオリゴ糖に対しコンピューターで
シミュレートしたバイオ・ゲルＰ−４ＲＡＡＭの図トし たフ を坑 そＣ 素翫 図はその図の中で表現した酵素配列を用いて示したオリ
ゴ糖に対するコンピューターでシミュレー！ ）中で表現されたオリゴ糖に関する拡大した酵ｉ列とＲ
ＡＡＭを行なった結果の図表図である。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）オリゴ糖の配列決定方法において、 Ａ、配列決定されるべきオリゴ糖の還元性末端の残基に
   識別ラベルを配置して、 Ｂ、前記オリゴ糖を既知の整数量の複数の部分に分割し
   、 Ｃ、それぞれの前記部分を異なった試薬混合物で処理し
   、一連の反応混合物を提供し、 Ｄ、それぞれの分離した反応混合物から、既知の整数量
   の生成物をプールして生成物プールを作り、 Ｅ、反応生成物のモル比を測定し前記生成物プールの分
   析を行い、及び Ｆ、前記反応生成物のモルプレヴァレンスから出発オリ
   ゴ糖を再生または識別することを特徴とするオリゴ糖の
   配列決定方法。 （２）識別ラベルは放射性ラベル、分光活性レポーター
   グループ及び化学活性レポーターグループから成るグル
   ープから選ばれることを特徴とする請求項１、に記載の
   方法。 （３）識別ラベルはオリゴ糖の還元性末端のＮ−アセチ
   ルグルコサミン残基を水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢ
   ＾３Ｈ＿４）で還元することを特徴とする請求項２、に
   記載の方法。 （４）試薬混合物は酵素分割試薬、化学分割試薬及び化
   学修飾試薬から成るグループから選ばれることを特徴と
   する請求項１、に記載の方法。 （５）試薬混合物はエキソグリコシダーゼを含むことを
   特徴とする請求項４、に記載の方法。 （６）生成物プールの分析はサイズ排除クロマトグラフ
   ィー、高速液体クロマトグラフィー及び電気泳動から成
   るグループから選ばれた方法により行なわれることを特
   徴とする請求項１、に記載の方法。 （７）生成物プールの分析はバイオ・ゲルＰ−４ゲルク
   ロマトグラフィーにより生成物プール成分の相対的な流
   体力学量を測定して行なわれることを特徴とする請求項
   ６、に記載の方法。 （８）生成物プールの分析は電流測定検出、化学反応性
   、分光検出及び放射性計数から成るグループから選ばれ
   た方法により監視されることを特徴とする請求項１、に
   記載の方法。 （９）オリゴ糖の配列決定方法において、 Ａ、配列決定されるべきオリゴ糖サンプルの還元性末端
   に識別サンプルを配置して、 Ｂ、前記オリゴ糖サンプルを、測定されるべき二糖結合
   の数以上の、全部で２ケの複数の等して部分に分けて測
   定し、 Ｃ、それぞれの前記オリゴ糖サンプル部分を、得られた
   種々の複数の酵素を含む特定の酵素試薬ユニットの配列
   と反応させ、前記オリゴ糖サンプル中に存在している選
   ばれた二糖結合に分割し、前記オリゴ糖サンプル中にお
   いてそれぞれの前記結合はただ１つの前記酵素によって
   分割され、且前記試薬ユニットは全部でオリゴ糖サンプ
   ル部分の数に等しく、次の （１）１つの前記試薬ユニットはすべての前記酵素の混
   合物を含み、 （２）もう１つの前記試薬ユニットはブランクで全然前
   記酵素を含まない、及び （３）残っている前記試薬ユニットはそれぞれ、残って
   いる前記試薬ユニットの他のそれぞ れに含まれている１つの酵素を除くすべて の前記酵素の混合物を含む ことから構成され、 Ｄ、酵素反応が完成し、それぞれの前記オリゴ糖サンプ
   ル部分に、最終的な分割生成物を与え、及び Ｅ、前記分割生成物をプールし、オリゴ糖サンプルの正
   体を前記生成物のプレヴァレンスを測定することによっ
   て定量的かつ同時に決定することを含むことを特徴とす
   るオリゴ糖の配列決定方法。 （１０）オリゴ糖の配列決定方法において、Ａ、配列決
   定されるべきオリゴ糖サンプルの還元性末端に識別サン
   プルを配置して、 Ｂ、前記オリゴ糖サンプルを測定されるべき二糖結合の
   数より全部で多い複数の等しい部分に分け、 Ｃ、それぞれの前記オリゴ糖サンプル部分を、配列した
   種々の複数の酵素を含む特定の酵素試薬ユニットの配列
   と反応させ、前記オリゴ糖サンプル中に存在している選
   ばれた二糖結合に分割し、前記反応においてそれぞれの
   前記結合は少なくとも前記酵素の１つによって分割され
   、前記結合の１つまたはそれ以上は前記酵素の１つ以上
   により分割され、且前記試薬ユニットの数は前記酵素の
   １つ以上によって分割された結合により生じた縮重と十
   分に相殺でき、次の （１）１つの前記試薬ユニットはブランクで、前記酵素
   を全然含まない、及び （２）残っている前記試薬ユニットはそれぞれ前記酵素
   の異った混合物を含む ことから構成され、 Ｄ、酵素反応が完成し、それぞれの前記オリゴ糖サンプ
   ル部分に、最終的な分割生成物を与え、及び Ｅ、前記分割生成物をプールし、オリゴ糖サンプルの正
   体を前記生成物のプレヴァレンスを測定することによっ
   て定量的かつ同時に決定することを含むことを特徴とす
   るオリゴ糖の配列決定方法。