JP2016015942A - グリコサミノグリカン糖鎖の配列構造を決定する方法 - Google Patents
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(ステップ1)グリコサミノグリカン糖鎖の還元末端に第1の標識化合物aを結合させて標識グリコサミノグリカン糖鎖を生成するステップ。
(ステップ2)加水分解酵素を用いて、標識グリコサミノグリカン糖鎖を限定分解するステップ。
(ステップ3)限定分解された標識グリコサミノグリカン糖鎖を、二糖ずつ糖鎖長が異なるグリコサミノグリカン糖鎖のそれぞれに分離するステップ。
(ステップ4)脱離酵素(リアーゼ)を用いて、分離された標識グリコサミノグリカン糖鎖のそれぞれを二糖に分解し、非標識二糖と第1の標識化合物aにより標識された第1の標識二糖を生成するステップ。
(ステップ5)非標識二糖の還元末端を、第2の標識化合物bを結合させて第2の標識二糖を形成するステップ。
(ステップ6)第2の標識二糖と、第1の標識二糖の組成を、二糖ずつ糖鎖長が異なるグリコサミノグリカン糖鎖のそれぞれについて決定するステップ。
(ステップ7)決定されたそれぞれのグリコサミノグリカン糖鎖の組成に基づいて、グリコサミノグリカン糖鎖の配列を決定するステップ。
まず、試料であるCSA12(図2(A))の還元末端に第1の標識化合物aを結合させて標識CSA12を形成させる(図2(B))。第1の標識化合物aとしては、蛍光標識体2−アミノピリジン(PA)を好適に使用することができる。第1の標識化合物aとして使用可能な他の物質については、第2の標識化合物bと合わせて後述する。
次に、加水分解酵素を用いて、標識CSA12を限定分解する。加水分解酵素は、グリコサミノグリカン糖鎖をエンド型に切断するヒアルロニダーゼ(睾丸由来)を好適に使用することができる。その反応混合物から、たとえば還元糖吸着クロマトグラフィーを用いて還元末端標識分解物と還元末端遊離分解物を分離することが好ましい。
次に、標識CSA12の限定分解物を、二糖ずつ糖鎖長が異なる標識グリコサミノグリカン糖鎖のそれぞれに分離する。すなわち、還元末端が第1の標識化合物aにより標識された糖鎖の分解物(還元末端a標識分解物)をその糖鎖長に応じて分離精製する。これにより、糖鎖試料の非還元末端から糖鎖が二糖ずつ切除された還元末端a標識分解物のそれぞれが取得できる。これらの分画物において、それぞれの非還元末端は飽和ウロン酸である。一方、還元末端は第1の標識化合物aで修飾され二糖ずつ糖鎖長が異なる糖鎖(a標識限定分解糖鎖)である。
次に、非標識二糖の還元末端を、第2の標識化合物bを結合させて第2の標識二糖を形成させる。つまり、分解産物である二糖の還元末端に第2の標識化合物bを結合させる反応を行う。これにより、既に第1の標識化合物aで標識されている還元末端二糖以外のすべての二糖分解物が第2の標識化合物bによって標識される。第2の標識化合物bとして、2−アミノベンズアミド(AB)を好適に使用することができる。
次に、第2の標識化合物bが結合した第2の標識二糖と、第1の標識化合物aにより標識された第1の標識二糖の組成を、二糖ずつ糖鎖長が異なるグリコサミノグリカン糖鎖のそれぞれについて決定する。つまり、第2の標識化合物bにより標識された飽和二糖(飽和二糖b標識体)と第2の標識化合物bにより標識された不飽和二糖(不飽和二糖b標識体)を分離できる分析方法を用いて、標識化合物bを検出する。これにより、二糖ずつ糖鎖長が異なる限定分解物それぞれの非還元末端由来の飽和二糖b標識体と中間の不飽和二糖b標識体を同定および定量することができる。また、二糖分解物に対して、不飽和二糖a標識体を分離できる分離方法および第1の標識化合物aを検出する方法を用いることで、第1の標識化合物aにより標識された不飽和二糖の構造を同定できる。それは当初のグリコサミノグリカン糖鎖の還元末端二糖構造である。以上の方法により、グリコサミノグリカン糖鎖試料の全二糖配列が決定できる。
最後に、決定されたそれぞれのグリコサミノグリカン糖鎖の組成に基づいて、グリコサミノグリカン糖鎖の配列を決定する。それぞれの分解物から飽和二糖として検出および同定されるものが各々の非還元末端二糖単位であり、PA標識二糖として検出および同定されるものは還元末端二糖である。これらの結果を合わせることで、元の硫酸化コンドロイチン硫酸十二糖の全糖鎖配列構造が決定できる。
二糖ずつ長さが異なる限定分解物の分離が可能でさえあれば、解析対象とするグリコサミノグリカン糖鎖試料の糖鎖長に制限はない。現在のゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、長さが二糖分異なる2つの糖鎖を分離する性能から考えると、糖鎖長は約6〜約30糖であることが好ましく、約12糖〜約20糖であることがより好ましい。糖鎖は、完全長の配列が決定される必要はなく、たとえば還元末端側から一部の配列のみが決定されてもよい。あるいは非還元末端側から一部の配列のみが決定されてもよい。
コンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカン糖鎖は、成長因子や細胞受容体など多くの生理活性分子との強い結合性を見せ、多様で重要な生理機能を発揮している。これらの生理機能として、例えば、癌抑制作用、中枢神経再生制御作用や、免疫細胞活性化作用、ウイルス感染防御作用などが知られている。グリコサミノグリカン糖鎖は、医薬品あるいは診断薬としての臨床応用が期待されている。しかし、従来は活性構造の糖鎖配列構造を解析する手法がなかったために、臨床応用に結びつく活性糖鎖開発が進展しなかった。本実施の形態に係る方法を用いて上記生理機能を示すグリコサミノグリカン糖鎖の配列構造を決定することによって、医薬品や診断薬開発などの臨床応用に結びつけることが可能となる。
Sugiuraらの方法(Glycoconj.J.(2008)vol.25、pp521−530)を用いて合成したコンドロイチン十二糖(CH−12)を、J.Biol.Chem.(2012)vol.287、pp43390−43400に記載の方法に準じて、組換えコンドロイチン4−硫酸基転移酵素−1(C4ST−1)を用いて酵素合成コンドロイチン硫酸A十二糖(CSA12)を合成した。この標品は6個あるGalNAc残基の4位水酸基に硫酸基が修飾された構造であり、その修飾硫酸基数と糖鎖配列における修飾位置が異なる糖鎖の混合物である。この標品をイオン交換樹脂カラム(mono Q HR 5/10、GEヘルスケア社製)にアプライし、50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)から0.5Mの食塩を含有する同緩衝液への直線濃度勾配クロマトグラフィーにより溶出した。すると当該標品CSA12は複数の画分に分離され、その主要な画分を低塩濃度の溶出から順にCSA12−a、CSA12−bとした。二糖組成分析結果からそれぞれの画分の硫酸基修飾数は12糖あたり1個、2個と推定された。
(コンドロイチン硫酸A十二糖の還元末端蛍光標識(PA化))
上記イオン交換クロマトグラフィーで分離した分子内に1個の硫酸基が結合した酵素合成コンドロイチン硫酸A十二糖画分(CSA12−a、9.4nmol)を0.025 mg/μLの2−アミノピリジン(PA)および0.024mg/μLのナトリウムシアノボロヒドリド(NaBH3CN)の30%酢酸−ジメチルスルホキシド(DMSO)溶液(5μL)を加え溶解し、60℃で2時間加熱した。反応液を室温まで冷却後、0.2M酢酸アンモニウム水溶液で平衡化したSuperdex Peptide HR 10/300カラム(GEヘルスケア社製)にアプライし、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。溶出液を励起波長(Ex)310nm、放出波長(Em)370nmの蛍光波長で検出し、当該画分を集め、還元末端蛍光標識コンドロイチン硫酸十二糖画分a(PA−CSA12−a)を得た。
上記PA化コンドロイチン硫酸A十二糖画分a(PA−CSA12−a)を150mM食塩を含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)20μLで溶解し、ヒツジ睾丸由来ヒアルロニダーゼ(シグマ社製)を加えて、37℃で30分間インキュベートした。100℃で1分間加熱処理後、室温にまで冷却し、BlotGlycoカラム(住友ベークライト社製)に反応液を通し、水200μLを2回カラムに通し、PA化糖を回収した。このとき酵素分解によって生成する還元端遊離糖鎖はカラムに吸着される。通過液および洗浄液を集め、Superdex 30HR 16/600カラム(GEヘルスケア社製)にアプライし、0.2M酢酸アンモニウム水溶液で溶出した。溶出液をEx310nm、Em370nMの蛍光波長で検出し、部分分解されたPA化オリゴ糖(十糖、八糖、六糖)画分を分取した。
各PA化オリゴ糖(十糖、八糖、六糖)および分解前のPA化十二糖画分a(PA−CSA12−a)(各50〜200pmol)をそれぞれ、脱離酵素であるコンドロイチンリアーゼ(コンドロイチナーゼ)ACII(生化学工業社製)10mUを含む50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)50μLに溶解し、37℃で1時間反応させた。反応液を減圧濃縮し、2−アミノベンズアミド(AB)およびNaBH3CNの30%酢酸−DMSO溶液(5μL)を加え溶解後、60℃で2時間反応させた。反応液に水200μLを加え、酢酸エチル(200μL)で4回抽出を行い、過剰の反応試薬を除去した。その水層を減圧濃縮・凍結乾燥し、50μLの水で再溶解した。再溶解液には、それぞれの限定分解オリゴ糖画分由来の非還元末端AB化飽和二糖、中間のAB化不飽和二糖、および還元末端PA化不飽和二糖が含まれる。
I II III IV V VI
糖鎖配列1:O − O − A − O − O − O
糖鎖配列2:O − O − O − A − O − O
(コンドロイチン硫酸A十二糖の還元末端蛍光標識(PA化))
実施例1のイオン交換クロマトグラフィーで分離した分子内に2個硫酸基が存在する酵素合成コンドロイチン硫酸A十二糖の画分b(CSA12−b)について、実施例1と同様の方法で還元末端PA化標識を行った。続いてSuperdex Peptide HR 10/300カラムでゲルろ過クロマトグラフィーを行い、還元末端蛍光標識(PA化)コンドロイチン硫酸十二糖画分b(PA−CSA12−b)を得た。
得られたPA化コンドロイチン硫酸A十二糖画分b(PA−CSA12−b)を実施例1と同様に、ヒツジ睾丸由来ヒアルロニダーゼで限定分解し、BlotGlycoカラムでPA化糖を回収した。さらに、Superdex 30 HR 16/600カラムにより、PA化コンドロイチン硫酸A十二糖画分bの部分分解オリゴ糖(十糖、八糖、六糖)を分取した。
各PA化オリゴ糖および分解前のPA化十二糖(PA−CSA12−b)を実施例1と同様にして、コンドロイチンリアーゼACIIで分解し、その後AB標識反応を行った。得られた標品をSenshu PAK DC−1151カラムを用いて飽和及び不飽和二糖のAB蛍光標識体を分離定量した。その結果を表4に示す。
I II III IV V VI
糖鎖配列α:O − A − A − O − O − O
糖鎖配列β:O − A − O − A − O − O
糖鎖配列γ:O − O − A − A − O − O
(α+β)÷2=0.45・・・・・(1)
(α+γ)÷2=0.60・・・・・(2)
(β+γ)÷2=0.57・・・・・(3)
これらの式より、α、β、γの値を求める。まず式(1)、(2)を変形することにより、以下の式(4)および(5)が得られる。
β=0.90−α ・・・・・(4)
γ=1.20−α ・・・・・(5)
式(4)および(5)を式(3)に導入すると、αが以下のように算出される。
α=(0.90+1.20−1.14)÷2=0.48
また、式(4)および(5)から、βとγが以下のように算出される。
β=0.90−0.48=0.42
γ=1.20−0.48=0.72
Claims (4)
- グリコサミノグリカン糖鎖の還元末端に第1の標識化合物を結合させて標識グリコサミノグリカン糖鎖を生成するステップと、
加水分解酵素を用いて、前記標識グリコサミノグリカン糖鎖を限定分解するステップと、
限定分解された前記標識グリコサミノグリカン糖鎖を、二糖ずつ糖鎖長が異なるグリコサミノグリカン糖鎖のそれぞれに分離するステップと、
脱離酵素を用いて、分離された前記標識グリコサミノグリカン糖鎖のそれぞれを二糖に分解し、非標識二糖と前記第1の標識化合物により標識された第1の標識二糖を生成するステップと、
前記非標識二糖の還元末端を、第2の標識化合物を結合させて第2の標識二糖を形成するステップと、
前記第2の標識二糖と、前記第1の標識二糖との組成を、前記二糖ずつ糖鎖長が異なるグリコサミノグリカン糖鎖のそれぞれについて決定するステップと、
決定されたそれぞれのグリコサミノグリカン糖鎖の組成に基づいて、グリコサミノグリカン糖鎖の配列を決定するステップと、を含むグリコサミノグリカン糖鎖の配列構造を決定する方法。 - 前記第1の標識化合物と、前記第2の標識化合物として、互いに異なる化合物を用いる請求項1に記載のグリコサミノグリカン糖鎖の配列構造を決定する方法。
- 前記グリコサミノグリカン糖鎖は、コンドロイチン硫酸である請求項1または2に記載のグリコサミノグリカン糖鎖の配列構造を決定する方法。
- 前記グリコサミノグリカン糖鎖は、配列の異なる複数の糖鎖を含む請求項1〜3のいずれか1項に記載のグリコサミノグリカン糖鎖の配列構造を決定する方法。
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