JPH10507924A

JPH10507924A - 糖物質の配列に関する分析法

Info

Publication number: JPH10507924A
Application number: JP8514399A
Authority: JP
Inventors: ガラハー、ジョン、トーマス; ターンブル、ジェリミ、エーワン; ホップウッド、ジョン、ジョセフ
Original assignee: カンサーリサーチキャンペーンテクノロジーリミテッド
Priority date: 1994-10-29
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 1998-08-04
Also published as: WO1996013606A1; CA2203932A1; US6589757B1; DK0788554T3; DE69514540T2; AU3750295A; EP0788554B1; AU696971B2; EP0788554A1; GB9421819D0; ES2141390T3; ATE188742T1; DE69514540D1; GR3032943T3; PT788554E

Abstract

(57)【要約】オリゴ糖鎖のもとでモノサッカライドの配列を決定するために、グルコサミノグルカン（ＧＡＧ’Ｓ）のような糖類を分析する方法において、糖鎖は、たとえばそれらの還元末端でラベリングやタッギングすることによってマークされた末端となり、そしてその糖物質は、たとえば低ｐＨの亜硝酸のような選択的切断試薬を用いて制御された部分解重合に供され、その方法により、採用された選択的切断試薬の特異なグルコースの結合特性に関係するあらゆる可能なスペクトルの長さの中で異なった波長を持ちうる部分糖鎖の混合物が生成するように、既知の結合特性に従ってグリコシドの内部の結合を切断するような糖の分析手法に関するものである。次いでこの部分糖鎖の混合セットのサンプルは、糖鎖の還元末端で特定のグルコシド結合のみを切断するエキソグリコシダーゼを含めた選ばれた外酵素と、糖鎖の還元末端で単糖残基から硫酸化グループを選択的に取り除くエキソスルファターゼで処理される。これらの外酵素は予め定められた手段にしたがって単一で、もしくはその外酵素の組合わせでそのサンプルに適用する。処理されたサンプルはその後、最初の糖物質の中にあったそれに相応する糖鎖の還元末端に由来する端末をもつ部分糖鎖を検出するためにポリアクリルアミドのゲルを用いる簡便的な方法としての電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析される。ＰＡＧＥ、好ましくは傾斜溶離法ＰＡＧＥを用いることにより、異なったサンプルがゲルの並列トラックの中で操作され、最初の糖化合物における単糖の配列が演繹化されることを可能にする情報を提供することのできる原子移動による帯パターンが得られる。

Description

【発明の詳細な説明】糖物質の配列に関する分析法発明の分野本発明は糖物質配列の分析法に関するもので、それはとりわけ、多数のアミノ糖残基、例えば、生物学的に重要な多糖類である硫酸ヘパリン（ＨＳ）およびヘパリンを含めたグルコサミノグルカン類（ＧＡＧ´ｓ）に見い出される数多いアミノ糖残基を含む糖鎖の配列決定に応用できるものである。発明の背景硫酸ヘパリンおよびヘパリンは、化学的に同族のグルコサミノグルカン類（ＧＡＧ´ｓ）であり、交互にα，β−結合しているグルコサミンとアセチルおよびＮ−とＯ−硫酸塩グループによる置換体、およびヘキスロ酸の片割れであるＤ− とＬ−の異性体の存在することから生起するかなりの構造的変化を伴ったヘキスロ酸残基から成り立っている。これらの多糖類は多くの種々の細胞やその生化学的活性にとって本質的に重要な物質である。これらの調整機能は結合、あるケースでは活性化の場合に、細胞の成長をコントロールする蛋白質に関係する分子、細胞の粘着力そして血止めや脂肪質の新陳代謝のような酵素を介したプロセスにたいするこれらの能力に依存する。しかしながら、ＨＳ／ヘパリンの中で単糖類の配列による蛋白質結合についての分析は一般に困難であり、また今日に至ってもなお、日常的使用に適した普遍的な方法は記述されていない。本発明の目的はＨＳ（または硫酸ヘパリンのプロテオグルカンＨＳＰＧ）やヘパリンから誘導されるオリゴ糖のような部分糖鎖の配列分析の新規な方法を提供するものであり、この方法により外観とその他の関心のある配列の素早い解明が容易となり、そしてそれにより多糖類が治療としての機能を有する薬として役立てるために化学的合成物の理屈にあった設計が可能となる。本発明の要約１つの観点として、この発明は、参照されうる糖鎖、例えばＨＳ／ヘパリンの糖鎖の還元末端における特異な内部結合の切断によってあらかじめ部分解重合を起こさせた後、非還元性末端（ＮＲＥ）をもつ糖あるいはそれれらの硫酸塩グループの外酵素除去によってある範囲でラベルされた部分糖鎖を生み出し、それがゲル電気泳動法またはその他の適当な技術により分離可能で、単糖とそれらの置換基が判読できるような配列情報を与えるという概念に基づくものであると考えることができる。この発明は主として硫酸ヘパリンやヘパリンに見出だされる糖類に関連して述べられており、この基本的原理である配列を知る手順はグルコプロテインの糖成分を含むＧＡＧ´ｓ以外の多くの異なった糖類カライドにも応用できる。特別なグルコシダーゼにおいて、糖鎖の非還元性末端での末端糖残基を除去するための外酵素の使用は、そのような糖鎖の配列を決定する方法に関連して以前から提唱されており、例えば、ＷＯ92/02816およびＷＯ92/19974とＷＯ92/19768 がある。しかしながら、これらの既往の技術による提唱では、前記外酵素で処理する前に、内部グリコシド結合の切断を含む糖物質の部分解重合のような予備的なステップについての記述はない。例えばＷＯ92/02816においては、糖類の配列決定の方法に関して提唱されており、そこでは最初には分断されない糖類の非還元性末端において最終の糖残基を除去して同定し、有効な外酵素を用いること、そして次のステップに進む前の各々の段階の後で回収した残存糖鎖で配列決定することが開示されている。しかしながら、ＷＯ92/19974とＷＯ92/19768では外酵素をとりわけ可能な配列決定剤として言及されているが、これらは、本発明に求められているような予備的な部分解重合は実施しないで、くりの繰返しプロセスにおいて分析されているオリゴ糖に直接応用できることを再度提唱している。これらすべての既往の技術による方法では、その配列に関する情報は本発明におけるそれとは異なったやり方で得られ、かつ与えられている。さらに特徴的には、本発明ではその糖鎖の中の単糖類の配列を決定するために糖物質を分析する方法を広い範囲にわたって提供するものであり、その中で糖鎖の非還元末端における特別なグルコシド結合のみを切断することで知られた特性を持つエキソグリコシターゼを構成している選ばれた外酵素類が配列の情報を得るために使用され、それが以下のステップから成ることで特徴づけられる方法； (a) 前記糖物質を対象として、ある既知の前もって定められた結合特性にしたがって内部のグリコシド結合の切断に効果的で選択可能な切断試薬を伴った処理による制御された部分解重合に供するステップで、それにより、そこに採用された特異な選択的切断試薬のグリコシド結合の特性が与えられるすベて可能な長さの範囲から特異な代表長を持つ部分糖鎖の混合物セットを生成させるために、前記物質を制御された部分解重合に供するステップ (b) 部分糖鎖の選ばれたサンプル、または前記混合物からなるサンプルを予め定められた手段にしたがって、その外酵素の単独かもしくは組み合わせで処理するステップ、そして (c) 前記サンプルまたはサンプル類を分析するステップで、その中に存在し、最初の糖物質の中にあったそれに相応する糖鎖の還元末端から誘導される還元末端を破壊しない切断処理によって発生する種々の部分糖鎖を検出するための分析を行い、前記結果を収集してその最初の糖物質における単糖の配列を少なくとも部分的に推定することを可能にする情報を得る分析ステップ本発明によってこの糖類の配列を決定する方法を実施するに当って、この糖物質は一般に、通常は制御された部分解重合のステップに先立って、単糖の配列に関係のある普通の参照標識あるいは読取り機構を提供するために還元末端に参照しうる特徴を導入する目的で糖鎖をそれらの還元末端で修正し、かつ分析の際に、最初の糖物質の中のそれに相当する糖鎖の還元末端から誘導される還元末端を持つ部分糖鎖が容易に検出できるように処理される。この末端の参照できる特徴は、習慣的には単糖類にその還元末端で選択的に、例えば放射化学性、蛍光牲、ビオチンあるいはその他の比色法で検出可能なラベリングによって提供される。もし、糖物質の部分解重合を行うために、低ｐＨの亜硝酸が以下に述べるような糖物質の部分解重合に使用された場合には、現在好まれて使用されている蛍光性のラベリング剤には後にさらに詳しく記述べるアントラニル酸が用いられる。しかしながら、もし亜硝酸以外の精選された分離剤がこの部分的解重合に持ち込まれる場合には、例えばエンドグルコシダーゼの酵素、アミノクマリン・ヒドラジン、例えば7-アミノ-4メチルクマリン-3-アセチル・ヒドラジンが、比較的高いラベル効果を持つ蛍光性のラベリング剤を提供するために好んで使用される。放射化学性のラベリング剤には、トリチル化した水素化ほう素が使用される。末端に参照付をつけた糖鎖または部分糖鎖を用意する技術において普段はあまり好まれては用いられない代わりの物質では、その糖鎖の還元末端を固相の担持体にカッブリングさせて固定化すことができる。これにより、次の部分的解重合処理によってそれらの部分糖鎖を作り出すことができ、その部分糖鎖が物理的に分離され、取り除かれるべき最初の損なわれていない糖鎖の還元末端に近づかせないようにすることができ、その上で引き続いて固定化された部分糖鎖を固相の支から解放し、次いで前に述べたような外酵素による処理のために準備される必要とする部分糖鎖の混合セットを提供する。好まれた実施態様において、以下により詳細に説明すると、ポリアクリルアミドのゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のような電気泳動、通常たとえば傾斜溶離法ＰＡＧＥは分断処理によって生ずる部分糖鎖の検出のために使用されており、それらの部分糖鎖は電気泳動の媒体の中で異なった移動性を表現する長さと成分の差異に従って分離される。充電されないあるいは軽く充電された糖鎖のために、もし必要ならばその物質は電気泳動による分離技術の使用を可能にするために知られた方法で適当に電気的に充電されたグループがその中に入り込むような予備的操作で処理される。しかしながら、この処理は既にかなりの量の充電された硫酸塩やカルボキシル・グループを保有して連鎖しているＨＳあるいはヘパリンのオリゴ糖類には常に必要ということではない。その他の選択すべき分離技術、例えばキャピラリーの電気泳動あるいは高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）もまた、その必要とする解析能力が得られる限り、部分糖鎖を検出するために使用することができる。制御された部分解重合のステップの後に、部分糖鎖を混合したセットが通常ある数の分離サンプルを提供するために使用される。これらのサンプルの１つと一般に最初の保護サンプルはその後、外酵素処理の前の対照サンプルに比べて異なった部分糖鎖が存在するかどうかを分離して検出するために、たとえば傾斜溶離法ＰＡＧＥの分離技術に掛けられる。同時に、部分糖鎖のセットのその他のサンプルもまた、これらの他のサンプルの各々が異なった外酵素または外酵素の組合わせで処理された後に、異なった部分糖鎖を分離し検出するために同一の分離技術に掛けられる。たとえばこの残基にとっては、この方法がとりわけ有用であるグルコサミノグルカン（ＧＡＧ´ｓ）に見出だされような多くのアミノ糖の残基を含む糖鎖の配列決定に関する発明に利用される場合には、特異な内部グリコシド結合の切断を含む前もって制御された部分解重合が最も便利に行われるが、その方法は化学的に選択しうる分離剤として低ｐＨの亜硝酸を用いる方法であり、以下にさらに十分に記述する。しかしながら、適当な酵素であるエンドグルコシダーゼ、たとえばバクテリアのリアーゼ・ヘパリナーゼ（ＥＣ4.2.2.7）あるいはヘパリチナーゼ（ＥＣ4.2.2.8）が内部のグリコシド結合の酵素による切断に選ばれ、それを引起こす適当な条件のもとに使用することが、化学的に選ばれうる分離剤に代わる物としてのいくつかのケースで可能である。ＧＡＧ´ｓおよび類似の糖類もまた一般には種々の硫酸化された単糖類を含んでいるので、最初の加水分解と部分解重合の後に得られる部分糖鎖の処理のために用いられる選ばれうる酵素類はその糖鎖の非還元末端での特異な末端の単糖類の残基から特殊な硫酸グループを制御された方法で除去することに影響を与えることのできる選ばれうるエキソスルフェート類であり、通常はエキソグルコシダーゼに加える形で含まれているであろう。その他の追加の特異な酵素は必要とされる配列に関する情報を取り出したり、確認したりするために選択された総括的手順の一部分として、部分的解重合の後に得られる部分糖鎖の分析にもまた使用される。本発明による配列の決定を行う場合に用いることの出来る選ばれうる分離剤の例は以下のものを含む。上記に用いられた短縮記号とラベル記号は次の意味を持つ。上述した酵素は外酵素であってそれはグルカンの部分糖鎖の非還元性末端で最終末端糖の残基またはこれらの硫酸置換体を取り除くために作用する。多くのその様な酵素の詳細は既に文献で知られており、恐らく、その１つは、D.A.Laneらによる編集、Edward arnold London，により1989に出版された書“Heparin:Chem ical and Biological Properties,Clinical Applications”,のpages 191〜227 にある“ヘパリンと硫酸ヘパリンを退化させる酵素”と題するJohn J.Hopwoodによる有益な論文、そして同じくD.A.Laneらによる編集、Plenum Press.NewYork, により1992に出版された書“ヘパリンとそれに関係する多糖類”の中のpage１21 〜134にあるCraig FreemanとJohn J.Hopwoodの書いた“ヘパリンと硫酸ヘパリンのリゾソームによる退化”と題するもう１つの論文が例として参考になる。これらの酵素の幾つかは商業的に入手可能であり、その他のものは文献に記載されている方法で天然のソースから単離、精製して得ることができる。さらに、いくつかのケースでは、再結合性が知られており、もし入手出来れば、これらは通常到達し得る高いレベルの純度を理由にしばしば好んで用いられる。上記のことに関連したいくつかの酵素の単離、調製あるいは性質が述べられている公開された研究論文には以下のものが含まれる： Alfred Linker,(1979)による“硫酸ヘパリンのオリゴ糖の構造と外酵素によるその退化”Biochem.J.，183,711-720; Craig Freemanとjohn J.Hopwood(1992)による“人間とα-Ｌ-イズロニダーゼ”Biochem.J.，282,899-908; Wolfgant Rohr bornとKurt von figura,(1978)による“人間の胎盤とα-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ：認められた多糖型の精製、特徴および退化”Hoppe-Sey1er´s Z.Phys iol.Chem.，359. 1353-1362;Craig FreemanとJohn J.Hopwood,(1986),による“ 人間の肝臓とスルファミン酸・スルフヒドロラーゼ”Biochem.J.，234, 83-92; Craig Freeman,ら(1987)，“人間の肝臓とＮ-アセチルグルコサミン-6-スルフェート・スルファターゼ”Biochem.J.，246, 347-354; Craig FreemanとJohn J.Ho pwood,(1991),による“培養された人間の皮膚のフィブロブラスト・ホモゲネートの中のグルクロネート-2-スルファターゼの活性”Biochem.J.，279, 399-405; Craig FreemanとJohn J.Hopwood,(1991),による“人間の肝臓とＮ-アセチルグルコサミン-6-スルフェート・スルファターゼ”Biochem.J.，246, 355-365; Irw in G.Leder(1980)による“メチル-2-デオキシ-2-スルファミノ-α-Ｄ-グルコピラノサイド 3-硫酸塩に作用する人間の尿からの新規な3-Oスルファターゼ”Bio chemical and Biophysical Research Communication，94,1183-1189; Julie Bie licki，ら(1980)，“人間の肝臓とイズロネート-2-スルファターゼ”Biochem.J.，271, 75-86; そしてUlf Lindahlら(1980)による“ヘパリンの抗トロンビン結合配列における3-Ｏ-硫酸のＤ-グルコサミン残基の立証”Bioc hemistry，77,6551-6555. 酵素とそれの調製の再結合形式は、例えば国際特許公報ＷＯ93/10244において合成α-Ｌ-イズロニダーゼに関して述べられている。上記に言及した特許公報の内容を参考のためにここに引用した。低いｐＨで用いられた亜硝酸（ＨＮＯ₂）の試薬はアミノ糖が糖鎖における結合の位置に関係なくＮ-硫酸化（ＧlcＮＳＯ₃）である時、ヘキソサミニターゼによる結合を切断するが、しかし、最も重要なことは、ＧlcＮＡｃ→ＧlcＡ結合はＨＮＯ₂による切断に抵抗する。亜硝酸による制御された加水分解や部分解重合は、Steven RadoffおよびIsidore Danishefsky,によるJ.Biol.Chem.(1984),259, Page 166-172に書かれた試薬を調製することによって達成することができる。この報文の内容も参考のために、ここに引用した。しかし、実施された詳細を伴った典型的な事例を以下に述べる。糖類の亜硝酸による加水分解や部分解重合のための実施例の条件（１ないし２モル）の処理されるべき糖類を遠心分離器による脱水によって乾燥し、８０マイクロリットルの蒸溜水に溶かして氷の上で冷却する。この溶液に１９０ミリモル塩酸の１０マイクロリットルおよび１０ミリモルのＮａＮＯ₂の１０マイクロリットル、両方とも予め氷の上で冷却して置いたものを加える。予め定められた時点（例えば０、２０、４０、６０、９０および１２０分）で、反応混合物のいくらかは除かれ、そして低いｐＨのＨＮＯ₂による加水分解はこれらの反応物を冷却するために過剰な硫酸アンモニウムを添加するか、またはｐＨを４．０以上に上昇させる（例えばＮa₂ＣＯ₃solutionの添加による）ことのいずれかの方法でストップされる。事実、２００ミリモルの酢酸ナトリウムのｐＨ５．０緩衝液の1/4量添加することによってその反応を停止することが最も便宜的な方法として知られている。このことはｐＨを約４．３〜４．４に上昇させ、次の酵素処理をすばやく受入れるような緩衝条件を提供し、かようにして、塩または緩衝剤の交換を排除するような、さらに一掃するステップのための必要性を避けることができる。最終的に一旦すべての時点で完了すれば、直ちにその整数量が再び混合され、溜められる。このことは決定的である。それは一部加水分解された糖類生成物の混合されたセットが造り出され、無作為にすべての可能性のある結合位置に相当する部分糖鎖を含有しているからである。しかし、シングル・タイム・ポイントではそのような代表されるセットを造り出せないものである。かようにして、その部分糖鎖は亜硝酸試薬のその特別なグルコシドの結合特性について可能性のある長さの全スペクトルを完全に網羅した異なった長さを持ち、そして理想的に言えば、まさに異なった長さの部分糖鎖の一様な分布であるべきである。この発明において、事実上、ＨＮＯ₂の処理によるＮ-硫酸化ジサッカライドの抑制された、不完全な加水分解、すなわち、その部分的ＨＮＯ₂による切断あるいは解重合（ここではｐＨＮＯ₂の記号で表す）は特異なエキソグルコシダーゼとエキソスルフェートによる攻撃にある範囲のＮＲＥ糖と硫酸グループを曝すような分析のもとで、糖物質のグルカンの構造を“切断する”ために用意されている。まさに、生成する部分糖鎖の非還元末端で作用する外酵素の前向きの作用による内部結合の切断を含む予め制御された加水分解と部分解重合を組合わせたこの二重の攻撃は、この発明によってもたらされる配列決定の方法を特徴づける重要な意味があり、且つ鍵を握る要点であると見なすことが出来る。さらに詳細な説明この発明とそれが実施可能な態様を、以下に限定しない実例を参考にしながら、さらに詳細に述べる。図面の簡単な説明上記に言及した説明的な示例については、添付した図面を参照しながら行なう。Ｆｉｇｕｒｅ１Ａは仮想のものではあるが、硫酸ヘパリンまたはヘパリンから誘導されるオクタ糖（重合度ｄｐ＝８）の部分糖鎖の考えられる構造を表わしている。Ｆｉｇｕｒｅ１Ｂは、部分解重合の後に糖類の部分糖鎖の混合セットを与えるＦｉｇｕｒｅ１Ａのオクタ糖を示す。Ｆｉｇｕｒｅ２はこの発明に従って６行った外酵素による処理後のＦｉｇｕｒｅ１Ｂに示された糖類の部分糖鎖のセットについてのＰＡＧＥを用いた電気泳動による分離と分析を図解したチャートまたはダイアグラムであり；そして、Ｆｉｇｕｒｅ３は本発明の開発期間中に行われたいくらかの予備的な研究で得られた電気泳動にゲルによる帯パターンの写真的表示のホトコピーである。実施例１添附の図面Ｆｉｇ．１Ａに図解したオクタ糖の部分糖鎖の配列を決定するために、最初に還元末端（(8)番目の基団）でのＧlcＮＳＯ₃-基団は、よく知られている多くの技術のどれか１つ、例えばタッグを含む糖類の特異な検出を可能にする放射性化学の、蛍光性の、あるいはビオチンのラベルを導入する技術を用いてラベルされるかまたはタッグが付けられ、そして最も重要なこととして、その配列が糖の連鎖に沿って読み取ることのできる還元末端（ＲＥ）の場所での参照可能な点または読み取れる特徴を提供するものである。ラベルやタッグを与えるための蛍光性物質の使用はしばしば好まれる選択であるが、しかし糖類連鎖の部分的解重合が低ｐＨの亜硝酸によって逐次的に行われた場合は、本実施例のように、その蛍光性が亜硝酸によって好んで消滅することのない蛍光性物質を選ぶ事が重要である。このように、高いカップリング効果は蛍光性ラベルまたはタッグとしてのアミノコウマリン・ヒドラジド試薬（例えば、7-アミノ-4-メチルコウマリン-3-アセチル・ヒドラジドで、Pierce Ltd.,U.K. から入手できる）を用いて達成されるが、残念ながら、その蛍光性は亜硝酸によって消滅するという理由で、この示例では満足すべきものでなかった事が判った。しかしながら、このラベル用試薬はもうひとつの選択されるべき切断のための試薬を部分的解重合を行うために採用した時は、使用にとって全く満足であるべきである。本実施例の場合はしたがって、使用に選ばれた蛍光性物質によるタッグはアントラニリル酸（2-アミノ安息香酸；ＡＢＡ；励起波長は２９０ナノメーター、放射波長３９０ナノメーターを持つ）で、手軽にそしてそれ相応に効果的であるる。この試薬は先にK.R.AnumulaによってAnalytical Biochemistry,220,275-283 (1994)に記述されたものだが、下記に記述したようにいくらか修正した方法によって、還元性のアミノ化反応による糖の還元末端に特異的にカップリングされる。すくなくともＧＡＧｓからの硫酸化した糖については、下記の反応条件が満たされるべきであることが知られている。共役されるべき（２０〜１００ナノモル）糖を遠心蒸発によりマイクロ遠心分離管の中で乾燥させ、２００ミリモルのＡＢＡと１００ミリモルの還元体（シアノ水素化ほう素ナトリウム）を含有する２５０マイクロリットルのホルムアミドの中に直接溶解させ、そして５０℃にて１６〜２４時間加熱する。カップリングされた後、遊離したＡＢＡ還元体とホルムアミドはたとえば透析、弱アニオンによる交換クロマトグラフィあるいはゲル濾過のクロマトグラフィなどによる方法で、タッグされた糖類から取り除かれる。後者はそれが通常、注ぎ込まれたサンプルの定量的回収を可能とするので、一般に好んで使用される。次の工程は簡便なものとして見出だされている。サンプル（蒸溜水で全量１ミリリットルに希釈された２５０マイクロリットルの反応体混合物）は２つの５ミリリットルの商品名ハイトラップ（ＨｉＴｒａｐ^TM 脱塩カラム、Pharmacia社の製品）の上に注ぎ込まれる。これらのカラムは直列に繋がれ、１分間１ミリリットルの流速を持つ蒸溜水で溶離される。０．５ミリリットルの部分糖鎖が集められる。４またはそれ以上の単位糖から成る典型的な糖類では、空間速度（約７〜１２の部分糖鎖）で溶離する。これらの部分糖鎖は溜められ、冷凍乾燥または遠心蒸発により濃縮される。このやり方は、タッグ試薬からタッグされた糖物質の迅速な精製を可能とし、定量的な回収を与え、続いて行われる酵素が作用する条件を妨害するであろう塩類の含まれていない生成物が得られる。糖類−ＡＢＡの共役化合物の蛍光スペクトルはＡＢＡのないそれと比較して変化していることが観察された。標本的には、その共役物は３００〜３２０ナノメーターの範囲で最大励起を示し、それは通常に得られる３１２ナノメーターの紫外線（たとえば、ランプまたは透照用ランプ）による検出のために理想的である。最大発光スペクトルは標本的には４００〜４２０ナノメーター（明紫色の蛍光）の範囲にある。蛍光性のタッグによるカップリングに続いて糖類は、もし必要ならば、陰イオン交換型の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）あるいは傾斜溶離法（ＰＡＧＥ）のような技術を用いた配列決定のための分析に先立って、さらに精製される。後者の傾斜溶離法は精製の目的で特に有効に使用されているが、その理由はそれがたとえば、Turnbull,GallagherらによるBiochemical Journal(1988)251,5 97-608および追加の改良でBiochemical Journal(1991)265,715-724の記載に見られるように、タッグされた糖類には＋に負荷されたナイロン膜への電子移動によって容易に元に戻ることのできるすぐれた解除性があるためである。ここではこれらの出版物の内容を参照文献として再度挿入した。この技術においては、電気泳動用のゲルにおける固有の帯パターンはカットされ、これらの位置は紫外線ランプ（２５４または３１２ナノメーターの波長）を用いて達成される。糖類は３７℃で５時間、回転ミキサーの上にあるマイクロ遠心分離管の中、５モル塩化ナトリウム溶液の中で孵卵させることによりその膜から解離させることができ、次いで上記に述べたような「ハイトラップ」脱塩カラムの上で、その溶液のクロマト展開によって脱塩できる。このやり方はサンプルが蛍光性物質によるタッギングの工程の前に行われる均質化に精製を必要としないようなサンプルからの配列のために糖類を調製する事にとって有用である。まさに、傾斜溶離法ＰＡＧＥはその他の方法（例えば陰イオン交換型ＨＰＬＣ）に較べてより効果的に多くの糖類を分割するので、配列決定のためにそれが均質な糖類の見本を調製するのに好まれる方法なのである。図１Ａに図解したこのdp8の部分糖鎖を前述のｐＨＮＯ₂で処理すると、同じ図面の図１Ｂに図解したように、末端でラベルされ、またはタッグされた部分糖鎖（以後ｐＨＮＯ₂部分糖鎖と言う）と各々新たに短くなったＮＲＥとの混合物が生成するであろう。次の段階では、ｐＨＮＯ₂を含む混合物のサンプル、好ましくは整数比のサンプルは、入り易い硫酸グループと糖の残基を取り除くために、異なった特異性を持つ酵素類（単独で、あるいは組合わせで）によってそれぞれ処理され、そしてその結果生じた糖類は各々の部分について行われる傾斜溶離法のポリアクリルアミドのゲル電気泳動法（傾斜溶離法ＰＡＧＥ）によって分離される。その結果、添附の図面で図２のダイアグラムにおいて表示したような目で確認できる帯スペクトル・パターンが得られる。簡単にするために、この特異な実施例は末端での硫酸化および非硫酸化のヘキスロン酸を除くための酵素の使用についてのみ記述しているが、しかしながら実際には完璧な配列の同定を達成するために、若干の追加の処理が必要となるかもしれない。そのｐＨＮＯ₂部分糖鎖のサンプルはイズロネート-2-スルファターゼ、グルクロニダーゼおよびイズロニダーゼ、そしてイズロネート-2-スルファターゼとイズロニダーゼの組合わせを用いてそれぞれ分離して処理される。これらの酵素により処理されたサンプルは傾斜溶離法ＰＡＧＥによる分離の異なった飛跡の中で各々が分離されて分析される。かようにして、図２のチャートもしくはダイアグラムにおいては、トラックｃからｆまでは酵素処理されたサンプルを表わし、トラックｂは酵素処理を施さないｐＨＮＯ₂の部分糖鎖I,II，およびIII（図１Ｂ）が完全なセットに分離されていることを表わし、そして原型の部分糖鎖のみ（部分糖鎖Ｉ）はトラックａに示されている。かようにして、この読み取りにより、部分糖鎖Ｉの配列の大半を読むことが可能となる。この部分糖鎖の検出の様式はそのタッグの性質に左右されることは勿論ではあるが、最も慣例的には蛍光または蛍光グラフィックによる方法、あるいは例えば、この技術でよく知られているビオチン／アビジンによる検出技術を用いた比色法による方法がよく用いられる。要約すれば、図２において、異なったトラックでの試料の同定は下記の通りにまとめられる。ａ）部分糖鎖Ｉｂ）部分糖鎖Ｉ（ｐＨＮＯ₂）、ＨＮＯ₂による部分水解物ｃ）ｐＨＮＯ₂＋イズロネート-2-スルフェイト（１２Sase)帯移動マーク＊ｄ）ｐＨＮＯ₂＋グルコシターゼ(Gase)−帯移動マーク＄ｅ）ｐＨＮＯ₂＋イズロニダーゼ(IDase)−帯移動マーク∞ ｆ）ｐＨＮＯ₂＋イズロネート-2-スルフェイト＋イズロニダーゼ −帯移動マークσおよびγ このようなゲルによる電気泳動の操作条件は以前からある参照文献、例えばTu rnbullおよびGallagher(1988)Biochem J.251,597〜608に記載の通りである。図２に描かれた移動帯パターンから2,4,6および8の糖単位（dp2〜dp8）を伴った糖類の異なった移動性を反映していることが判る。光性物質によりタッグされた糖類の酵素処理と、処理された糖類のＰＡＧＥによる分離に関する実施例１に適応しうるさらなる詳細な説明上記に述べたように、部分的なＨＮＯ₂の加水分解（ｐＨＮＯ₂）によって生成したタッグのついた糖類の酵素処理において、糖類の混合セットは整数比で（酵素の消化に供した糖のセット１に対し、残りの未処理の糖の比が１である）分割される。このように、最終の容積が１２５マイクロリットルのｐＨＮＯ₂により処理されたサンプルは２５マイクロリットルに５分割され、そのうち４つは異種の酵素による処理に当てる。分割された各々は約２００〜４００ピコモルの糖類を含有しているであろう。酵素による処理には１０マイクロリットルの外酵素の緩衝溶液（ｐＨ４．０で２００ミリモルの酢酸ナトリウムの緩衝液）、ミリリットル当り２ミリグラムの牛の血清アルブミンを含む液の２マイクロリットル、２マイクロリットルの適当な酵素（ミリリットル当たり３〜６Ｕの濃度、ここで１Ｕは１分間に加水分解される１マイクロモルの基質を意味する）および最終容積を４０マイクロリットルにするための蒸溜水の添加を必要とする。次にこのサンプルは３７℃で完全な消化を得るために通常に十分な３０〜１２０分間孵卵させる。後者は配列を決める過程にとって重要である。その理由は酵素消化が不完全であると、より複雑な帯パターンが造られ、同時に配列の不均質により偽りの表示を与えることになるからである。組合わせた酵素が要求される場所では、これらはサンプルとともに段階的にあるいは同時に孵卵させる。これ以外のｐＨの最適条件で酵素を使用する場合は、別の緩衝剤がこのｐＨＮＯ₂による反応を停止させるためと同時に、一方では実際の酵素による消化を促進させるために使用される。もし必要ならば、１００℃で１〜５分間加熱することによってある酵素の活性を異なった酵素による二次的消化に先立って破壊することが可能である。サンプルの容量は電気泳動の分析に先立って、遠心分離による蒸発によって簡単に縮小することができる。ポリアクリルアミドのゲルを用いた電気泳動（ＰＡＧＥ）により配列の決定の目的でその処理された糖類を分離する方法は非常に効果的であり、精製に関しては既に述べたように、傾斜溶離法ＰＡＧＥは、単一のゲル上でそれが幅広いサイズ範囲で糖類について良好な分析が出来るという理由で、特に役立つ。このベイシックな方法、消化されたオリゴ糖に関する精密図の作り方は以前にTurnbullおよびGallagherらにより（再度参照のこと；Biochem Journal(1988)251,597〜608 およびBiochem Journal(1991) 265,715〜724）示されたように詳細に述べられている。簡単に言えば、傾斜溶離法ＰＡＧＥのゲルは代表的なもので長さ16〜32cm 、厚さ0.5〜3mmで長い形をした分析用ゲル（全アクリルアミドの濃度は20%〜50% 、架橋剤は0.5%〜5%）および短い堆積チップのゲル（代表的なものでは5%の全アクリルアミド）から構成され、上記の緩衝系を用いて調製される。サンプル（代表的には１０％グリセロールの場合１０〜２０マイクロリットル）は堆積チップ状ゲルの中にある間隙に装填され、１５０ボルトで３０分間ゲルの中を走らせ、続いてその操作が完了するまで（すなわち、マーカーの染料が予め定められた位置まで移動するまで）２００〜１０００ボルトの負荷をかけ電気泳動させる。分析された蛍光性のあるＡＢＡ−糖類の共役化合物（ピコモルの量）の目視による確認は紫外線透照器を用いて容易に達成できる。それらは裸眼で容易に見ることのできるシャープな明紫色の蛍光帯として現れる。感度の改良は接写の工夫のあるＣＣＤ（Carge Coupled Device）カメラの使用で達成される。配列決定の目的のためには、そのゲルには、ｐＨＮＯ₂によるサンプルが実際には適当な外酵素類で処理される場合と同様に、酵素により処理されていない最初の糖構造のままタッグされた糖類およびｐＨＮＯ₂により生じた糖類のサンブルも装填されるべきである。このことにより、手の付けられていない糖類とｐＨＮＯ₂処理により生じた糖類のランニングの位置について、酵素処理された糖類と直接比較する事とが出来るようになる。図２における移動帯パターンの説明つぎに、図２における移動帯パターンをさらに詳細に述べる。トラック（ａ）は最初の部分糖鎖の大きさを表現し、トラック（ｂ）は最初のｐＨＮＯ₂による処理後の帯パターンを示している。dp6およびdp4で２つの追加の帯パターンが存在しているのは、部分糖鎖Ｉ（図１）において(2)と(4)の位置でのＧlcＮＳＯ₃ 残基の確認を意味する。ジ糖鎖(dp2)は見られないので、(6)の位置でのアミノ糖はＧlcＮＡｃであることが推論できる。ＧlcＮＡｃは、ＧlcＡとはα1,4結合でなければならないので、この後者の残基は(7)の位置に存在すると推論できる。イズロネート-2-スルファターゼ（トラックｃ）で処理した後は、最初の部分糖鎖のみが位置（帯＊）を移動させているようであり、このことは(1)の単位が2 -Ｏ-硫酸グループであることを示している。β−グルコロニダーゼ（トラックｄ）のみが部分糖鎖II（dp6）に表わしている帯（＄）の位置を移動させているので、これにより(3)の位置での残基はＧlcＡであることが同定できる。イズロニダーゼ（トラックｅ）は部分糖鎖IIIに表している帯（∞）の移動のみを引き起しており、したがって硫酸化されないイズロネートは(5)の位置にあることになる。最後に、イズロネート-2-スルファターゼとイズロニダーゼの組合わせ酵素処理（トラックｆ）は部分糖鎖III（τ）および部分糖鎖Ｉ（σ）の両方とも移動を起こしている。後者のケースでは、その移動性はスルファターゼの酵素単独（トラックｃ；帯＊）で処理した場合より大きい。このことにより、(1)での糖残基は2-Ｏ-硫酸グループの酵素による除去後にイズロニダーゼ化しやすくなるイズロネート-2-硫酸であるということが確認される。かようにして、図２における帯パターンによって、部分糖鎖Ｉが下記に示される特徴をもつ配列であることを可能にしている。ＧlcＮＳＯ₃またはＧlcＮＡc では６−硫酸塩部分糖鎖Ｉ（図１）における単位糖(4)および(6)でアミノ糖に連結している6- Ｏ-硫酸の存在は図２に描かれた固有の帯パターンからは同定することはできない。しかしながら、アミノ糖の6-Ｏ-硫酸化物は、その中でｐＨＮＯ₂処理の高い比率の部分糖鎖の混合物を、末端連鎖であるヘキスロネートの除去を確実にするためにイズロネート-2-スルファターゼ、イズロニダーゼおよびグルクロニダーゼなどの外酵素の組み合わせによって処理し、それと同時になお部分糖鎖の末端に曝されているアミノ糖から6-Ｏ-硫酸グループを取り除くであろうグルサコミン6-Ｏ-スルファターゼで処理するような特別なトラック（ここでは示されていない）に導くことによって容易に検出可能である。6-Ｏ-硫酸のロスは傾斜溶離ＰＡＧＥの上での移動性のシフトによって拾い上げることが出来る。例えば、単位糖(4)（図１）について考えてみれば判る。これはｐＨＮＯ₂（図２のトラックｂ）処理の後の部分糖鎖II(dp6)の中に存在するであろう。この部分糖鎖IIの中の端末ＧlcＡを酵素により除去すれば、dp5の部分糖鎖（トラックｄ；記号＄）を造り出す。この構造は非還元末端（ＮＲＥ）で曝される位置にあるＧlcＮＳＯ₃ (6S)（単位糖４）を持っており、この6-Ｏ-スルファターゼ酵素により移動性の増加を引き起している6-Ｏ-硫酸が取り除かれる。隣接するＮ−アセチル化基の配列についての追加的方法ＨＳ／ヘパリンの糖類を配列する場合、時々１つまたはそれ以上のＮ−アセチル化のジサッカライドが別の種類であるＮ−硫酸塩化のジ糖類の配列の中のどこにはいり込むかというケースに遭遇する。このことはｐＨＮＯ₂による処理では外酵素の攻撃のための新しい還元末端を造り出すことができないことを意味しており、そして同時にまた、ある位置において得ることの出来る配列情報が制限されることを意味する。例えば、本実施例の中の部分糖鎖Ｉは単位体(6)の位置でＧlcＮＡｃの残基を含有しており、したがってｐＨＮＯ₂による処理では(7)および(8)の位置から成る部分糖鎖を造り出せない。このことはこれらの残基が直接には配列しないであろうことを意味する。しかしながら、この問題は外酵素であるＮ−アセチルグルコサミニダーゼを用いることによって克服できる。ｐＨＮＯ₂によって生成する部分糖鎖IIIはイズロニダーゼ（５の位置のイズロニック酸の残基取り除くために）、グルコサミン6-Ｏ-スルファターゼ（6位置でのＧlcＮＡｃにある6-Ｏ-硫酸塩を取り除くために）、そしてＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（６位置のＧlｃＮＡｃ残基を取り除くために）を用いて処理することが出来る。この結果、7および8（すなわちＧlcＡ−ＧlcＮＳＯ₃ ^*）の位置から成る部分糖鎖だけとなり、仮にも7位置の末端のウロン酸塩の残基がｐＨＮＯ₂の処理によって造り出されたとした記述が既に存在していたとしても、これらの位置でのこのような残基の配列が確認出来るであろう。もし、１個以上のＧlcＮＡｃの残基を入り込ませようとすれば、このプロセスはそれが入り込むまで何回も繰返せばよい。硫酸ヘプリンの構造に関して現在までに知られている知識に基づけば、この場合はその配列はＯ-硫酸塩による置換体のないＧlcＡ−ＧlcＮＡｃの残基の繰返しが支配する配列になり易いと言える。このように、それぞれ各々のシフトがそれぞれに同定されることを可能にする各々個別の酵素消化を行った後、グルクロニダーゼあるいはＮ−アセチルグルコサミニダーゼを不活性化しておく必要がある。（すなわち、両方の酵素の組合わせを用いたときに起り得る１回のステップで崩壊するような残基の隣接配列を避けるために）配列のミクロ的差異２つの極めて類似した構造は傾斜溶離法ＰＡＧＥの上では単一の帯として走査される可能性がある。しかしながら、述べられたこの配列決定の手順によって、配列におけるこのタイプの差異は検出できるであろう。例えば、(3)の位置でいくらかの連鎖はＧlcＡ−よりむしろIdoＡを含んでいると仮定すると、(3)の位置での存在頻度に比例したグルクロニダーゼ（トラックｄ）およびイズロニダーゼ（トラックｅ）による処理の後に、ヘキサおよびペンタの両方の帯が存在するであろう。ＧaseとＩdaseの両方の酵素を使用した１つのトラックでは、ヘキサからペンタまでの帯においてその完全なシフトに影響を与える。このことは見た目で明らかである。Ｎ-硫酸（ＧlcＮＳＯ₃）とＮ−アセチル化（ＧlcＮＡｃ）のグルコサミンの残基の配列にも変化があるべきである。しかしこれは、還元末端（ＮＲＥ）を持つ非置換性のＧlcＮＡｃ単位糖にのみ作用するＮ−アセチルグルコサミニダーゼを使用すれば検出可能となる。もし、例えば(2)の位置でのＧlcＮＳＯ₃の単位糖がしばしばＧlcＮＡｃであるならば、このことはイズロニダーゼ、１２SaseとＧ aseとの混合物でその酵素を熱によって不活性化したカクテルを用いて孵卵されたｐＨＮＯ₂処理の糖類を追加のトラックに走査せることによって検出できる。もし、単位糖(2)が常にＧlcＮＳＯ₃であるならば、dp7を越えた分子サイズの減少はあり得ないであろう。しかし、糖類に比例してＧlcＮＡｃの存在がる場合は、その存在はdp6（ヘキサ）での追加の帯によって示されるであろう。配列に関するさらなる見解ＨＳとヘパリンはともにＧlcＮＳＯ₃-がＣ-3の位置で、ＧlcＡ単位体がＣ-2の位置でＯ-硫酸グループを含んでいる。しかしながら、エキソスルファターゼの酵素は特にこれらの置換体を取り除く能力のあることが知られている。（例えば以下の文献を参照のこと；Irwin G Leder(1980)“メチル-2-デオキシ-2-スルファミノ−α-Ｄ-グルコピラノシド・3-スルフェートに作用する人間の尿からの新奇な3-0スルファターゼ”Biochemical and Biophysical Research Communicatio ns,94,1183〜1189；Ulf Lindahlら(1980)“ヘパリンの坑トロンビン結合配列における3-Ｏ-硫酸Ｄ-グルコサミン残基の存在”；Crag FreemanおよびJohn J Hop wood(1989)“人間の肝臓、グルクロネート・2-スルファターゼ”Biochem.J.,259 ,209〜216およびCrag FreemanとJohn J Hopwood(1992)“人間とα-Ｌ-イズロニダーゼ”Biochem.J.,282,899〜908）．したがって、これらの酵素はこの配列決定の手順の中に組入れられている。同様にして、（エキソ）Ｎ−スルファミダーゼ（例えば、Crag FreemanとJohn J Hopwood(1986)“人間の肝臓、スルフォヒドロラーゼ・スルファミン酸”Biochem.J.,234,83〜92を参照のこと）はＮ-硫酸グループの存在を確認するために使用可能である。以前に示したように、ｐＨＮＯ₂に代わるべき多くの化合物もまた、最初の部分解重合と内部結合の固有の切断のために有効である。知られている代替の試薬または処理薬を用いた例には、ｐＨ４．０でＨＮＯ₂の処理によってフォローされるヒドラジンによる分解（ＧlcＮＡｃ−→ＨｅｘＡ結合を切断）が、そしてまた外酵素であるヘパリチナーゼ（ＧlcＮ．Ｒ−→ＧlcＡ結合を切断）およびヘパリナナーゼ（ＧlcＮＳＯ₃±(6S)−→ＩdoＡ(2S)結合を切断）の使用が含まれている。これらの後者のリアーゼ型の酵素もまた、ヘキスロン酸の残基の性質に関して価値のある配列の情報を提供することが出来る。さらにヘパリナーゼ／ヘパリチナーゼの処理による部分糖鎖のさらなる配列には、排除が目的の切断メカニズムを含んだこれらの酵素の内部的態様によって発生する非還元性末端の不飽和のＨｅｘＡ（±2S）の残基の除去を必要とするかも知れない。しかしながら、このことは特別なバクテリア型酵素（グルコロネート・スルファターゼやグルコニダーゼ）または水銀塩（文献、U.Ludwigsら(1987)“不飽和のウロン酸の残基と水銀塩との反応”Biochem.J.,245,795〜804）による処理によって達成される。原理的には、この発明の方法はいかなる大きさの糖類の部分糖鎖にも応用可能であり、実施において、その有効な範囲は今日得られる分離技術の分解能にかかっている。さらにまた、既に述べたように、この配列決定の方法は、その他のグルコサミノグルカン（ＧＡＧ´ｓ）、糖蛋白質あるいはその他の糖鎖を含む物質から切り取られた糖の配列に関する分析にも適用できる。Ｎ−アセチル化のアミノ糖がＧＡＧ´ｓの中のすべてのジサッカラィドが単位糖の構成分子として存在しているので、興味のある糖類がＧlcＮＡc／ＧalＮＡｃのヘキソサミニダーゼ結合位置でヒドラジン／ｐＨ４．０ＨＮＯ₂を用いた部分的なヒドラジン分解によって切断でき、ここに述べられた手順に続いたエキソグリコシダーゼおよびエキソスルファターゼの適当な使用により配列されるうる部分糖鎖を造り出す。二者択一的にに部分的切断がＧＡＧ種の酵素（例えばコンドロイチンおよびデルマタン硫酸の代わりにコンドロイチナーゼＡＣおよびＡＢＣを、ケラタン硫酸の代わりにケラタナーゼ）により達成される。末端連鎖のタッギングと分離技術はＨＳ／ヘパリンに関して述べた技術と類似のものであろう。実施例２ところで、以下の図示的実施例により、図３にポリアクリルアミドのゲルを用いた電気泳動の帯パターンが示されているが、この図はいくらかの予備的な研究から誘導され、下記に示す単純な繰返しの構造を持っている³⁵Ｓにより新陳代謝的にラベルされたヘキサ糖の部分糖鎖の配列関し、本発明のような手段を応用したいくつかの態様を描き出している；この部分糖鎖の試験用サンプルは、影響を受けやすい結合で加水分解や部分解重合のみを生じるために作られた条件のもとに、まず最初にＨＮＯ₂で処理された。その結果生じたｐＨＮＯ₂による部分糖鎖（dp 6,4および2）の混合物は次いでゲルを通じての濾過によって脱塩され、３２．５〜４０％傾斜溶離法ＰＡＧＥゲル上で、最初のままの糖物質（すなわち、その後処理が行われていない）かまたは異なった外酵素類の組合わせによって処理された後のいずれかが分析される。組合わせた処理は示された順序にしたがって順次実施された。図３に図示したトラックは下記の通りである。（ＢＢおよびＰＲはそれぞれ、ブロモフェノール・ブルーとフェノール・レッドのマーカーのための染料を意味する）- (1) 処理されていないｐＨＮＯ₂の部分糖鎖 (2) Ｇaseのみ (3) Ｉ2 Ｓaseのみ (4) Ｉ2 Ｓase＋Ｉdase (5) Ｉ2 Ｓase＋Ｉ dase＋Ｇ6Ｓase ｐＨＮＯ₂の処理（トラック１）によって、dp6およびdp4の位置（矢印で示された）で期待された主バンドが現れ、それは配列決定のために観察されなければならないこれらの帯の移動を意味する。dp6の矢印のついた帯は損なわれていない最初の部分糖鎖に相当する。dp4の矢印のついた帯は構造がであることを示している。（この特異な実施例において、dp2の生成物はゲルから離れて移動し、したがって見えなくなった事に注目のこと）外酵素による処理について言えば、その結果は明瞭なＮＲＥ残基の段階的な除去を示している。Ｇaseは影響を受けない（トラック２）。Ｉ2 Saseはdp6および dp4の両方から2-Ｏ-硫酸グループを取り除くように作用し、その結果帯がずれる（トラック３における帯、それぞれａおよびａ´）。次に、I daseはイズロニック酸の残基を取り除くように作用し、その結果ペンタ-およびトリ-の糖となる。（トラック４における帯、それぞれｂおよびｂ´）。Ｇ6 Saseはさらに6-Ｏ-硫酸グループを取り除くように作用し、さらなる移動を与える（トラック５における、帯ｃ）。（トリサッカライドｂ´からの6-Ｏ-硫酸がとり除かれたことは結果として、ゲルの移動が由来し、あるいは恐らく分離された部分糖鎖が放射性ラベル物質の蛍光グラフィクによる検出のために移されたナイロンの膜上の滞留時間の不足のいずれかによって、そのパターンから消失したことに注目のこと）。このテスト例において、その糖物質には選択的にラベルされたりマークが付けられたりした訳ではないが、先行した実際の結果からは、ｐＨＮＯ₂は部分解重合のために使用可能であること、また同時に、エキソグリコシターゼおよびエキソスルファターゼは、オリゴ糖の部分糖鎖の移動性において明確に予測できるシフトを生み出すめにＮＲＥ（非還元末端）の糖残基を攻撃することが確認された。このように、わずか１つの小さなテスト・サンプルに関する実施ではあるが、これらの結果は明らかに、このエキソ配列の手順が迅速でかつ正確に、単糖類の残基とＨＳ／ヘパリンの部分糖鎖のＮＲＥ端末での硫酸グループの配列を決定するために使用することが出来ることを証明しているのみでなく、さらに加えてこの普通に行われる手順は、ＧlcＮＳＯ₃残基でＨＮＯ₂のような選択的切断試薬を用いた部分糖鎖の部分的内部切断によって発生する新たに造られた終端ＮＲＥにも適用できることも証明している。糖類を固相の担持体に選択的にカップリングさせることを含む、代わるべき配列に関する手法糖物質の連鎖、とくに配列決定のために、還元末端で検出可能なラベリング化合物によりタッギングするもう１つの方法は、それらの還元末端を通じてそれを固相の担持物に選択的にカップリングさせるか付着させる方法である。グルコシド結合の中の部分的内部切断（例えばｐＨＮＯ₂による）は、糖鎖がこのようにして固定化され、これ以上還元末端に接近しない部分糖鎖が徹底した洗浄によって簡単に除去され得るにも拘らず実施された。もし、それらの還元末端に付けられた糖物質を固相の担持物質から脱離するための有効な手段があれば、タッグされた蛍光性糖類のｐＨＮＯ₂処理よって造られるそれらに相当する部分糖鎖の混合物のセットを得ることが出来る。実際に、このことによって参照されうるマーキングのある還元末端が再び提供される。そのような手法はRadoffおよびDanish esky(1984)によりJ.Biol.Chem.,259,166-172の中で“参照マーク付き末端基”を持つ多糖類の糖鎖を得るためにとして既に記述されており、その中で彼等は不溶性で活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）のマトリックスのカップリング用としてのカップリング剤（チラミン）をヘパリン糖鎖の還元性最終末端に付加している。この方法において、糖物質の糖鎖について、通常はまず最初に、それらの還元末端のタッグとして固相の担持体にカップリングするためのカップリング剤を取付けることによる改良が選択的になされであろう。しかしながら、例えばブロテオグルカンのような物質の糖類の組成の配列を決定する場合に、糖鎖の還元末端が既にポリペプタイドの連鎖と結合しているか、あるいは共役結合しているところでは、この最初の改良は必要とされない。その理由は、これらの現に存在しているポリペプタイドの鎖が適当な固相のマトリックスの担持体、例えばＣＮＢｒで活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（商標）の上にカップリングするために直接使用できるからである。Lyonら(1987)Biochem.J.242,493-498 およびTurn bull,Gallagherら(1991)によるBiochem.J.277,297-303。前記固相の担持体にカップリングして糖物質の固定化することを含む手段については特別な研究がなされ、放射性が生化学合成的（例えば３Ｈ−グルコサミンで）にラベルされた極めて少量のサンプル（例えば培養された細胞程度の量）を用いて、その配列を分析する本発明による分析法が実施されるに至った。実際に、この手順もまた僅かながら改善されたが、その中では部分解重合の工程がカップリングおよび糖鎖またはその部分糖鎖を固相の担持体の上に固定化する前に行われる改善がある。例えば、糖物質はその還元末端で２−イミノ−ビオチン・ヒドラジンの形でカップリング剤により最初にかつ特定的にタッグすることが出来、その後、それらは既に述べたようなｐＨＮＯ₂による処理に供される。ｐＨＮＯ₂による処理の後に、部分糖鎖を還元末端であるビオチン残基の力でアビジン−アガロースの上に捕獲することが出来る。完全な洗浄に続いて、付着している糖類の残りはｐＨ４の緩衝液でゲルを溶離することによるマイルドな条件のもとで、ゲルから脱離させることが出来る。この回収された糖類はその後、既に述べられたように直接配列のための分析に掛けられる。これらは、電気泳動による分離の後に、再度引用した文献（Turnbull,Gallagherら,Biochemcal Jour nal(1988)251,597-608 およびBiochemcal Journal(1991)265,715-724）に述べられているような方法、ナイロン膜物質と蛍光グラフィーへの電子移動によって簡単に検出される。上記に見られるように、この発明はいくつかの異なった態様を提供するものであり、一般的に言えば、それは十分明確にあるいは不明確に、そして単純にあるいはある一方のものとの組合せで、ここに開示されたすべて新規で発明力のある特徴と態様を含んでいる。さらにまた、この発明の範囲は実施例によってあるいは単に記述的なあるいは説明的なセンスにおいて用いられた言葉や表現によって制約されると解釈されるべきでないし、また多くの変更態様は添附された特許請求の範囲に定義されたこの発明の範囲内で可能であろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１２月２日【補正内容】それがゲル電気泳動法またはその他の適当な技術により分離可能で、単糖とそれらの置換基が判読できるような配列情報を与えるという概念に基づくものであると考えることができる。この発明は主として硫酸ヘパリンやヘパリンに見出だされる糖類に関連して述べられており、この基本的原理である配列を知る手順はグルコプロテインの糖成分を含むＧＡＧ´ｓ以外の多くの異なった糖類カライドにも応用できる。特別なグルコシダーゼにおいて、糖鎖の非還元性末端での末端糖残基を除去するための外酵素の使用は、そのような糖鎖の配列を決定する方法に関連して以前から提唱されており、例えば、ＷＯ92/02816およびＷＯ92/19974とＷＯ92/19768 がある。しかしながら、これらの既往の技術による提唱では、前記外酵素で処理する前に、内部グリコシド結合の切断を含む糖物質の部分解重合のような予備的なステップについての記述はない。例えばＷＯ92/02816においては、糖類の配列決定の方法に関して提唱されており、そこでは最初には分断されない糖類の非還元性末端において最終の糖残基を除去して同定し、有効な外酵素を用いること、そして次のステップに進む前の各々の段階の後で回収した残存糖鎖で配列決定することが開示されている。しかしながら、ＷＯ92/19974とＷＯ92/19768では外酵素をとりわけ可能な配列決定剤として言及されているが、これらは、本発明に求められているような予備的な部分解重合は実施しないで、くりの繰返しプロセスにおいて分析されているオリゴ糖に直接応用できることを再度提唱している。これらすべての既往の技術による方法では、その配列に関する情報は本発明におけるそれとは異なったやり方で得られ、かつ与えられている。１つの承認がKyung-Bok Leeらによって研究報文Carbohydrate Resaearch,214( 1991),155-168,に与えられている。これはオリゴ糖の配列に関係したエキソグリコシダーゼとエンドグリコシダーゼの使用に言及している。しかしながら、この公表物には配列決定において本発明に関係する特許請求の範囲でその中に定義されているのと同じ手法で、エキソグリコシダーゼとエンドグリコシダーゼの両方を組み合わせて使う事について開示されていない。さらに特徴的には、本発明は糖鎖を構成している糖物質の分析し配列を決定する方法を幅広く提供するもので、それは、それぞれのすべてが同一のものでなく、しかも還元末端で参照可能な特徴を含むグリコシドの結合を通して内部結合している３個以上の単糖の単位体を含む糖の連鎖から構成される糖物質を分析して配列を決定する手法であり、その中に糖鎖の非還元末端で特定のグリコシド結合のみを切断する特性をもつことで知られる選択性のあるエキソグリコシターゼを含む選ばれた外酵素を、配列に関する情報を得るために使用し、前記方法は以下のステップから成ることを特徴とする； (a) 前記糖物質を対象として、内部のグリコシドの結合をその敏感性に比例して切断するエキソグリコシターゼとして知られる結合特性に応じて作用する選択的切断試薬を伴った制御された処理による部分解重合に供するステップ、即ち、それにより、糖鎖の非還元末端から離れた敏感なグリコシド結合について、グリコシド結合に対しそこに採用された選択的切断試薬の特性が与えられるすべて可能な長さの中から特異な代表長を持つ糖鎖、最初から存在していて反応していない糖鎖、および反応していない部分糖鎖から成る混合セットを生成させるために、前記糖物質を制御された処理による部分解重合に供すること。 (b) 選択されたサンプル、または前記の糖鎖と前記部分糖鎖から成る前記の混合物セットを外酵素を用いて処理するステツプで、その酵素は予め決められた手順に従って単独でもしくは組合わせて使用し、すべての糖鎖の非還元末端で完全な消化が行われ、かつ敏感な結合を切断するために幾分余裕のある酵素で処理すること。そして， (c) 前記サンプルまたはサンプル類を分析するステップで、その中に存在し、最初の糖物質の中にあったそれに相応する糖鎖の還元末端から誘導される還元末端を破壊しない切断処理によって発生する種々の部分糖鎖を検出するための分析を行い、前記結果を収集してその最初の糖物質における単糖の配列を少なくとも部分的に推定することを可能にする情報を得るために分析すること。本発明によってこの糖類の配列を決定する方法を実施するに当って、この糖物質は一般に、通常は制御された部分解重合のステップに先立って、単糖の配列に関係のある普通の参照標識あるいは読取り機構を提供するために還元末端に参照しうる特徴を導入する目的で糖鎖をそれらの還元末端で修正し、かつ分析の際に、最初の糖物質の中のそれに相当する糖鎖の還元末端から誘導される還元末端を持つ部分糖鎖が容易に検出できるように処理される。この末端の参照できる特徴は、習慣的には単糖類にその還元末端で選択的に、例えば放射化学性、蛍光牲、ビオチンあるいはその他の比色法で検出可能なラベリングによって提供される。もし、糖物質の部分解重合を行うために、低ｐＨの亜硝酸が以下に述べるような糖物質の部分解重合に使用された場合には、現在好まれて使用されている蛍光性のラベリング剤には後にさらに詳しく記述べるアントラニル酸が用いられる。しかしながら、もし亜硝酸以外の精選された分離剤がこの部分的解重合に持ち込まれる場合には、例えばエンドグルコシダーゼの酵素、アミノクマリン・ヒドラジン、例えば7-アミノ-4メチルクマリン-3-アセチル・ヒドラジンが、比較的高いラベル効果を持つ蛍光性のラベリング剤を提供するために好んで使用される。放射化学性のラベリング剤には、トリチル化した水素化ほう素が使用される。末端に参照付をつけた糖鎖または部分糖鎖を用意する技術において普段はあまり好まれては用いられない代わりの物質では、その糖鎖の還元末端を固相の担持体にカッブリングさせて固定化すことができる。これにより、次の部分的解重合処理によってそれらの部分糖鎖を作り出すことができ、その部分糖鎖が物理的に分離され、取り除かれるべき最初の損なわれていない糖鎖の還元末端に近づかせないようにすることができ、その上で引き続いて固定化された部分糖鎖を固相の支から解放し、次いで前に述べたような外酵素による処理のために準備される必請求の範囲１．それぞれのすべてが同一のものでなく、しかも還元末端で参照可能な特徴を含むグリコシドの結合を通して内部結合している３個以上の単糖の単位体を含む糖の連鎖から構成される糖物質を分析して配列を決定する手法で、その中に糖鎖の非還元末端で特定のグリコシド結合のみを切断する特性をもつことで知られる選択性のあるエキソグリコシターゼを含む選ばれた外酵素を配列に関する情報を得るために使用され； (a) 前記糖物質を対象として、内部のグリコシドの結合をその敏感性に比例して切断するエキソグリコシターゼとして知られる結合特性に応じて作用する選択的切断試薬を伴った制御された処理による部分解重合に供するステップ、即ち、それにより、糖鎖の非還元末端から離れた敏感なグリコシド結合について、グリコシド結合に対しそこに採用された選択的切断試薬の特性が与えられるすべて可能な長さの中から特異な代表長を持つ糖鎖、最初から存在していて反応していない糖鎖、および反応していない部分糖鎖から成る混合セットを生成させるために、前記糖物質を制御された処理による部分解重合に供すステップ、 (b) 選択されたサンプル、または前記の糖鎖と前記部分糖鎖から成る前記の混合物セットを外酵素を用いて処理するステツプで、その酵素は予め決められた手順に従って単独でもしくは組合わせて使用し、すべての糖鎖の非還元末端で完全な消化が行われ、かつ敏感な結合を切断するために幾分余裕のある酵素で処理するステップ、そして、 (c) 前記サンプルまたはサンプル類を分析するステップで、その中に存在し、最初の糖物質の中にあったそれに相応する糖鎖の還元末端から誘導される還元末端を破壊しない切断処理によって発生する種々の部分糖鎖を検出するための分析を行い、前記結果を収集してその最初の糖物質における単糖の配列を少なくとも部分的に推定することを可能にする情報を得る分析ステップ、から構成される糖物質の分析方法。２．請求項１に記載の方法で、その中で前記糖鎖において、参照可能な特徴をもつ前記還元末端を提供する検出可能なラベルまたはタッグがそれらの還元末端に取り付けられ、そして、それらが放射化学のラベリング剤、蛍光性物質によるラベリングおよび比色分析によって検出できるラベリング剤から選ばれたものである方法。３．請求項２に記載の方法で、その中で還元末端を参照可能なものにし、それが検出できるラベルまたはタッグを提供するために使用される試薬がアントラニル酸、アミノコウマリン・ヒドラジドおよびトリチエート・ボロハイドライドから選ばれる化合物である方法。４．請求項１に記載の方法で、その中で部分解重合の処理が、崩壊していない最初の連鎖の還元末端には近づかない処理によって生成する前記連鎖を持つ部分糖鎖を分離したり移したりすることができる一方で、前記の連鎖または還元末端をもつ部分糖鎖を固相の担持体にカップリングさせることによって固定化されることを可能にするカップリング試薬を使用し、これらの還元末端にタッグを取り付けることにより修正した前記糖鎖を用いる方法。５．請求項４に記載の方法で、その中で前記糖鎖が前記固相の担持体にカップリングされ、それによって、その処理が崩壊していない最初の連鎖の還元末端には近づかない部分解重合の処理によって生成する前記連鎖を持つ部分糖鎖が分離されたり移されたりするステップに先立って固定化され、またその中で、外酵素によるステップ(b)における処理に先立つ連続ステップにおいて、残存している固定化された部分糖鎖が前記固相の担持体から脱離することを含む方法。６．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で選ばれた外酵素には、前記糖鎖または部分糖鎖の非還元末端における硫酸グループを単糖類残基から選択可能な制御された方法による除去を引起こさせるための特定のエキソスルファターゼも含まれている方法。７．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、糖物質の制御された部分解重合をもたらすためのステップ(a)において使用される選択可能な切断試薬が亜硝酸およびエンドグルコシダーゼ酵素から選ばれる方法。８．請求項７に記載の方法で、その中で前記選択可能な切断試薬においてそれがＮ−硫酸アミノ糖とヘキスロン酸残基とを繋いでいるヘキソサミダーゼの結合の切断には選択的に作用するが、Ｎ−アセチル化アミノ糖とヘキスロン酸残基とを繋いでいるヘキソサミダーゼの結合の切断には作用しないようにした低ｐＨの条件のもとに使用される化合物が亜硝酸である方法。９．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で、さまざまな時間区分で、前記切断試薬を用いて分離された糖のサンプルを処理することにより、制御された解重合のステップが行われ、そしてステップ(b)で用いる部分糖鎖の混合セットを提供するためにその生成物を溜め、そのことが、ステップ(b)で用いられた前記の部分糖鎖の混合セットの中にある部分糖鎖の長さが、全く短縮されない完全な長さから前記選択的な切断試薬で切断しうるこれ以上の内部グリコシドの結合を持たない最小の長さまで広がった、あらゆる範囲に分布していることを証明する手助けとなる方法。１０．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で、分析ステップ (C)を実施する際に、切断処理によって生成する部分糖鎖がそれらの長さと組成に別けて分離される方法。１１．請求項１から請求項９までのいずれかの項に記載の方法で、その中で、ステップ(a)において糖物質の部分解重合により生成する部分糖鎖の混合物セットのサンプルを外酵素による処理を行わないで前記部分糖鎖を分子の長さにしがって分離するための分離処理に供し、そしてその他のサンプルは別にされて、これらその他の各々のサンプルがステップ(b)で異種の外酵素またはそれらを組み合わせた外酵素で処理された後に、その中で長さと組成にしたがって部分糖鎖を分離するために前記と同一の分離処理にかけられる方法。１２．請求項１０または１１に記載の方法で、その中で糖物質にあった最初の糖鎖の還元性末端基を含む分離された部分糖鎖がそこにもたらされたラベルまたはタッグを検出することによって検出される方法。１３．請求項１０、１１または１２に記載の方法で、その中で部分糖鎖の前記分離が電気泳動による分離で、それによって糖物質の部分糖鎖が電気泳動の媒体の中で異なった移動性を示す長さと組成の差異にしたがって分離される電気泳動の分離技術によって達成される方法。１４．請求項１３に記載の方法で、その中でステップ(a)からの部分糖鎖の混合物セットの分離サンプルがステップ(b)の実施で異なった前記外酵素（単独または組み合わせにおいて）で処理され、同時にステップ(c)にて電気泳動のゲルを持つ異なったトラックの中での電気泳動的による分離に掛けられ、それによって長さ、および／または組成に相違のある分離された部分糖鎖の異なったゲルの移動性についての移動帯パターンの標本を与える方法。１５．請求項１４に記載の方法で、その中で電気泳動的による分離が傾斜溶離のポリアクリルアミドのゲルを用いる電気泳動法（グラジエントＰＡＧＥ）によって行われる方法。１６．請求項１４または１５に記載の方法で、その中で電気泳動法の終了後に、分離された糖の部分糖鎖を電子移動の技術によって、ナイロン膜へ移す方法。１７．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で、糖物質の元の糖連鎖の還元末端残基を含むラベルされ、あるいは“タッグ”された部分糖鎖がステップ(C)の分析で、ステップ(b)で用いられた知られた特定の外酵素と結合して、直接的な推論による配列に関する情報を与えることのできる、目視にて検出可能なパターンを提供する方法。１８．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で、糖物質がアミノ糖残基および硫酸化された単糖類、例えばグリコサミノグルカン・サッカライドなどを含有している糖の連鎖から構成されており、そしてステップ(b)に用いられる外酵素には、少なくとも下記に示す数種の外酵素；グルクロニダーゼ、イズロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、グルクロネート-2-スルファターゼ、グルコサミン-6-スルファターゼ（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン-6-硫酸・スルファターゼ）、グルコサミン-3- スルファターゼおよびスルファメート・スルフォヒドロラーゼ（スルファミダーゼ）が含まれる方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ターンブル、ジェリミ、エーワンイギリス国マンチェスターエム21 １ワイジー、チョールトン−カム−ハーディ、キルデアーロード、７ (72)発明者ホップウッド、ジョン、ジョセフオーストラリア国エスエイ 5066、ストーニィフェル、モナートコート、２

Claims

【特許請求の範囲】１．糖物質における単糖の連鎖の配列を決定するために、糖物質を分析する方法において、その中で糖の連鎖の非還元性末端で特定のグリコシド結合のみを切断する特性をもつことで知られるエキソグリコシターゼから成る選ばれた外酵素を配列に関する情報を得るために使用され、それが以下のステップ； (a) 前記糖物質を対象として、ある既知の前もって定められた結合特性にしたがって内部のグリコシド結合の切断に効果的で選択可能な切断試薬を伴った処理による制御された部分解重合に供するステップで、それにより、そこに採用された特異な選択的切断試薬のグリコシド結合の特性が与えられるすべて可能な長さの範囲から特異な代表長を持つ部分糖鎖の混合物セットを生成させるために、前記物質を制御された部分解重合に供するステップ、 (b) 部分糖鎖の選ばれたサンプル、または前記混合物からなるサンプルを予め定められた手段にしたがって、その外酵素の単独かもしくは組み合わせで処理するステップ、そして、 (c) 前記サンプルまたはサンプル類を分析するステップで、その中に存在し、最初の糖物質の中にあったそれに相応する糖鎖の還元末端から誘導される還元末端を破壊しない切断処理によって発生する種々の部分糖鎖を検出するための分析を行い、前記結果を収集してその最初の糖物質における単糖の配列を少なくとも部分的に推定することを可能にする情報を得る分析ステップ、から構成される糖物質の分析方法。２．請求項１に記載の方法で、還元性末端に参照マークを導入したそれらの還元性末端で上記糖物質の糖鎖を選択的に修正する予備的ステップもまた含む方法。３．請求項２に記載の方法で、その中で糖の還元末端が参照できる特徴を与える検出可能なラベルまたはタッグを前記糖鎖に取り付けることにより修正され、そしてそれらが放射化学のラベリング剤、蛍光性物質によるラベリングおよび比色分析によって検出できるラベリング剤から選ばれたラベルまたはタッグを付けた方法。４．請求項３に記載の方法で、その中で還元末端を参照可能なものにし、それが検出できるラベルまたはタッグを提供するために使用される試薬がアントラニル酸、アミノコウマリン・ヒドラジドおよびトリチエート・ボロハイドライドから選ばれる化合物である方法。５．請求項２に記載の方法で、その中で部分解重合の処理が、崩壊していない最初の連鎖の還元末端には近づかない処理によって生成する前記連鎖を持つ部分糖鎖を分離したり移したりすることができる一方で、前記の連鎖または還元末端をもつ部分糖鎖を固相の担持体にカップリングさせることによって固定化されることを可能にするカップリング試薬を使用し、これらの還元末端にタッグを取り付けることにより修正した前記糖鎖を用いる方法。６．請求項５に記載の方法で、その中で前記糖鎖が前記固相の担持体にカップリングされ、それによって、その処理が崩壊していない最初の連鎖の還元末端には近づかない部分解重合の処理によって生成する前記連鎖を持つ部分糖鎖が分離されたり移されたりするステップに先立って固定化され、またその中で、外酵素によるステップ(b)における処理に先立つ連続ステップにおいて、残存している固定化された部分糖鎖が前記固相の担持体から脱離することを含む方法。７．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で選ばれた外酵素には、前記糖鎖または部分糖鎖の非還元末端における硫酸グループを単糖類残基から選択可能な制御された方法による除去を引起こさせるための特定のエキソスルファターゼも含まれている方法。８．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、糖物質の制御された部分解重合をもたらすためのステップ(a)において使用される選択可能な切断試薬が亜硝酸およびエンドグルコシダーゼ酵素から選ばれる方法。９．請求項８に記載の方法で、その中で前記選択可能な切断試薬においてそれがＮ−硫酸アミノ糖とヘキスロン酸残基とを繋いでいるヘキソサミダーゼの結合の切断には選択的に作用するが、Ｎ−アセチル化アミノ糖とヘキスロン酸残基とを繋いでいるヘキソサミダーゼの結合の切断には作用しないようにした低ｐＨの条件のもとに使用される化合物が亜硝酸である方法。１０．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で、さまざまな時間区分で、前記切断試薬を用いて分離された糖のサンプルを処理することにより、制御された解重合のステップが行われ、そしてステップ(b)で用いる部分糖鎖の混合セットを提供するためにその生成物を溜め、そのことが、ステップ(b)で用いられた前記の部分糖鎖の混合セットの中にある部分糖鎖の長さが、全く短縮されない完全な長さから前記選択的な切断試薬で切断しうるこれ以上の内部グリコシドの結合を持たない最小の長さまで広がった、あらゆる範囲に分布していることを証明する手助けとなる方法。１１．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で、分析ステップ (C)を実施する際に、切断処理によって生成する部分糖鎖がそれらの長さと組成に別けて分離される方法。１２．請求項１から請求項１０までのいずれかの項に記載の方法で、その中で、ステップ(a)において糖物質の部分解重合により生成する部分糖鎖の混合物セットのサンプルを外酵素による処理を行わないで前記部分糖鎖を分子の長さにしがって分離するための分離処理に供し、そしてその他のサンプルは別にされて、これらその他の各々のサンプルがステップ(b)で異種の外酵素またはそれらを組み合わせた外酵素で処理された後に、その中で長さと組成にしたがって部分糖鎖を分離するために前記と同一の分離処理にかけられる方法。１３．請求項１１または１２に記載の方法で、その中で糖物質にあった最初の糖鎖の還元性末端基を含む分離された部分糖鎖がそこにもたらされたラベルまたはタッグを検出することによって検出される方法。１４．請求項１１、１２または１３に記載の方法で、その中で部分糖鎖の前記分離が電気泳動による分離で、それによって糖物質の部分糖鎖が電気泳動の媒体の中で異なった移動性を示す長さと組成の差異にしたがって分離される電気泳動の分離技術によって達成される方法。１５．請求項１４に記載の方法で、その中でステップ(a)からの部分糖鎖の混合物セットの分離サンプルがステップ(b)の実施で異なった前記外酵素（単独または組み合わせにおいて）で処理され、同時にステップ(c)にて電気泳動のゲルを持つ異なったトラックの中での電気泳動的による分離に掛けられ、それによって長さ、および／または組成に相違のある分離された部分糖鎖の異なったゲルの移動性についての移動帯パターンの標本を与える方法。１６．請求項１５に記載の方法で、その中で電気泳動的による分離が傾斜溶離のポリアクリルアミドのゲルを用いる電気泳動法（グラジエントＰＡＧＥ）によって行われる方法。１７．請求項１５または１６に記載の方法で、その中で電気泳動法の終了後に、分離された糖の部分糖鎖を電子移動の技術によって、ナイロン膜へ移す方法。１８．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で、糖物質の元の糖連鎖の還元末端残基を含むラベルされ、あるいは“タッグ”された部分糖鎖がステップ(C)の分析で、ステップ(b)で用いられた知られた特定の外酵素と結合して、直接的な推論による配列に関する情報を与えることのできる、目視にて検出可能なパターンを提供する方法。１９．前項までのいずれかの請求項に記載の方法で、その中で、糖物質がアミノ糖残基および硫酸化された単糖類、例えばグリコサミノグルカン・サッカライドなどを含有している糖の連鎖から構成されており、そしてステップ(b)に用いられる外酵素には、少なくとも下記に示す数種の外酵素；グルクロニダーゼ、イズロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、イズロネート-2-スルファターゼ、グルクロネート-2-スルファターゼ、グルコサミン-6-スルファターゼ（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン-6-硫酸・スルファターゼ）、グルコサミン-3-スルファターゼおよびスルファメート・スルフォヒドロラーゼ（スルファミダーゼ）が含まれる方法。