JP2005530157A - ムコ多糖症および他の関連障害のオリゴ糖バイオマーカー - Google Patents

Abstract

本発明は、ムコ多糖症（「ＭＰＳ」）および関連する疾患を診断する方法に関する。本発明は、ＭＰＳまたは関連する障害を有する患者の生体液または組織に存在する生化学マーカー（「バイオマーカー」）を同定し定量する方法に関する。本発明の一側面は、ＭＰＳおよび関連する疾患の診断、キャラクタリゼーション、監視および臨床管理を行うために、その標的動物から採取された標的生体試料から標的ＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖の標的量を測定すること、および次にその標的量と基準ＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖の基準量とを比較することを含む。本発明は、キットについても記載し、そのキットは、オリゴ糖誘導体化溶液と、酸溶液と、内部標準と、固相抽出カラムと、固相抽出カラム洗液と、オリゴ糖溶離溶液と、ＭＰＳまたは関連する疾患の診断にそのキットを使用するための使用説明書のセットとを備える。

Description

本発明は、一般にムコ多糖症（「ＭＰＳ」）および関連する疾患の診断に関する。さらに具体的には、本発明はＭＰＳの診断、キャラクタリゼーション、監視、および臨床管理のための生化学マーカー（「バイオマーカー」）として使用するための、患者の生体液または組織に存在するオリゴ糖の同定法および定量法に関する。

関連出願：
本出願は、２００２年６月１４日出願のオーストラリア仮特許出願ＳＮ ＰＳ２９３０に基づいて優先権を主張する。

リソソーム蓄積症（「ＬＳＤ」）は若齢の小児を一般に冒す、４０を超える異なる遺伝病からなる群を意味する。ＬＳＤに冒された個体は、特異的障害および関与する特定の遺伝子型に応じて広範囲の臨床症状を現す。ＬＳＤに付随する臨床症状は、その小児と冒された個体の家族との両方に甚大な打撃を及ぼし得る。例えば、中枢神経系の機能不全、行動の問題、および重症の精神遅滞が多くのＬＳＤに特徴的である。ＭＰＳと呼ばれる特異的なＬＳＤ群は、他の臨床症状として骨格異常、臓器巨大症、角膜の混濁、および異形を含む。患者はＭＰＳの目に見える臨床特徴をもたずに普通は生まれるが、進行性の臨床波及を発生する場合がある。重症例では、冒された小児は絶え間ない医学管理を必要とするが、それでも青年期になる前に死亡することが多い。

健康管理に対するＬＳＤの重大性は、ＬＳＤの群発生率を他のよく知られており集中的に研究された遺伝性障害の群発生率、例えばフェニルケトン尿症（１：１４０００）および嚢胞性線維症（１：２５００）（数字は白人の人口での発生率を表す）と比較すると明らかになる。ＭＰＳはＬＳＤの主要な群であり、オーストラリアの出生例では１：２２０００の複合発生率を有する。ＭＰＳには６つの型があり、（１）ＭＰＳ Ｉ（ハーラー症候群またはシャイエ症候群）はα−Ｌ−イズロニダーゼの欠乏が原因であり、グリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）であるデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸のリソソームへの貯留を生じ、（２）ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）はイズロン酸−２−スルファターゼの欠乏が原因であり、ＭＰＳ Ｉでみられるのと同様のＧＡＧがリソソームに貯留され、（３）ＭＰＳ ＩＩＩ（サンフィリポ症候群）には４つの亜型があり、その全てでＧＡＧの１つであるヘパラン硫酸の貯留を生じるが、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＣおよびＭＰＳ ＩＩＩＤはそれぞれスルファミダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、グルコサミンアセチル−ＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼおよびグルコサミン−６−スルファターゼの欠乏が原因であり、４）ＭＰＳ ＩＶ（モルキオ症候群）には２つの亜型であるＭＰＳ ＩＶＡおよびＩＶＢがあり、それぞれＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼの欠乏が原因であり、どちらの亜型もリソソームにＧＡＧであるケラタン硫酸の貯留を伴い、（５）ＭＰＳ ＶＩ（マロトー・ラミー症候群）はＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの欠乏によりＧＡＧであるデルマタン硫酸がリソソームに貯留することが原因であり、（６）ＭＰＳ ＶＩＩ（スライ症候群）はβ−グルクロニダーゼの欠乏と、リソソームへのデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の貯留が原因である。

過去２０年間にＬＳＤの診断はかなりの進歩を遂げた。例えば、クロマトグラフィーに基づくＭＰＳおよびオリゴ糖の尿検査の開発と導入は、これらの障害について臨床的に選択された患者をスクリーニングすることを容易にした。ＭＰＳおよび若干のオリゴ糖障害の疑いを示す臨床指標がみられた後、次の診断段階には尿の検査が必要となり、尿検査が「陽性」の場合には続いて特異的酵素分析を行う。このスクリーニング法は実施が容易であるが、比較的大きな労働力を要し、結果を正確に解釈するには経験を必要とすることが多い。結果として、クロマトグラフィーに基づくＬＳＤのクリーニング試験は、一部のセンターでは使用されていない。そのうえ、これらの検査は自動化されにくく、そのことが新生児に対するスクリーニング戦略として使用することをさらに制限している。

特異的基質と抗体捕獲アッセイの産生は特異的ＳＬＤの酵素分析をさらに正確にした。しかし、これらのアッセイの多くは依然として時間がかかり、侵襲性で、複雑で、培養細胞または組織生検を必要とすることから、不便で高価になりがちである。結果として、ＬＳＤの試験は症状の初期段階にある冒された小児にとって第一線の戦略ではないことが多い。ＬＳＤの臨床診断は一連の専門家を何度も訪問する必要があることが多く、それには数カ月、または数年さえかかることがある。この長期の経過が患者と家族に極めて大きなストレスを与える。したがって、ＬＳＤを早期診断するための迅速で正確で経済的な検査を開発する必要がある。

多くのＬＳＤの新しい治療法も、早期診断に対する要求を変えた。例えば、提案された多くの治療法の有効性は、疾患の早期検出と早期治療に大きく依存すると考えられる。理想的には、不可逆的な病理が始まる前に治療を開始すべきであるため、新生児でのＬＳＤのスクリーニングは確実に早期検出をもたらすであろう。しかし、新生児における発症前診断が理解されるならば、患者の、疾患の、および治療の管理についてのいろいろな懸念が主な問題となるであろう。例えば、多くのＬＳＤで表出する広範囲の臨床スペクトルのせいで、疾患の表現型と疾患の進行速度に関する付加的な情報なしには、治療法の適正な選択が困難となるであろう。さらに、ＬＳＤ患者における臨床重症度のレベルを詳細に記述せずに薬剤の処方または酵素置換療法（「ＥＳＴ」）を設定することは不確実で、患者にとって潜在的に有害となろう。よって、疾患の進行を監視する方法、特定の表現型を決定する方法、ならびに前臨床状態及び臨床状態と診断された個体の両者での治療の効果を監視する方法も必要となる。

個体がＬＳＤの臨床症状を現し始めた後でも、疾患を実際に臨床診断することは依然として複雑な過程である。例えば、一連のアッセイを伴う試験を尿、血液、および一部の障害では皮膚線維芽細胞について実施しなければならない。これらのアッセイには時間がかかり、高価で、侵襲性であるため、新生児の大量スクリーニングに応用するには適当でない。その理由から、当技術分野ではＬＳＤのさらに優良なバイオマーカーを同定する必要性がある。これらのバイオマーカーは新生児のスクリーニング計画の開発への応用性があり、同時に上に強調した多くの他の問題と取り組む潜在性も有する。新生児におけるＬＳＤのスクリーニングは、その疾患の早期検出をもたらすことを確実にするが、冒された新生児から疾患を検出するためには全ての新生児をスクリーニングしなければならない。ＬＳＤの家族歴を有する患者には、症状発生前にＬＳＤの検査を行う正当な理由がある。しかし、家族歴を有さない個体に発症前にＬＳＤを検出するコストは経済的に正当化できない。したがって、全ての新生児をスクリーニングできるような経済的に実行可能なＬＳＤのスクリーニング法が必須である。

ＭＰＳおよびオリゴ糖症の患者にみられる特異的オリゴ糖バイオマーカーを検出し監視する方法を記載した公表論文がいくつかある。例えば、１９８０年にＫｉｍｕｒａ Ａ、Ｈａｙａｓｈｉ Ｓ、Ｔｓｕｒｕｍｉ ＫはＴｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３１（３）：２４１〜７に「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｄｅｒｍａｔａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｅｘｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ａ Ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｈｕｎｔｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ」という標題の論文を公表した。この論文は、コンドロイチナーゼＡＢＣによる尿ＤＳの分解により得られ、Ｄｏｗｅｘ１カラムで分離された二糖ユニットの分析を介して、ハンター症候群の患者の尿中のデルマタン硫酸（「ＤＳ」）の化学構造がどのように研究されたかを記載した。そのＤＳはイズロニルＮ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸の二糖繰り返しユニットから基本的に構成され、過剰の硫酸の約９０％がそのユニットの付加的な硫酸基としてイズロン酸残基と連結していた。Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸およびＮ−アセチルガラクトサミン−４，６−二硫酸残基は少量成分であった。非硫酸化二糖ユニットは分解生成物から検出されなかった。スルホイズロン酸残基のみがＤＳ分子の非還元末端の糖として見い出され、本疾患でイズロノ硫酸スルファターゼが欠如していることと矛盾しなかった。

１９８１年にＫｏｓｅｋｉ Ｍ、Ｉｎｏ Ｓ、Ｋｉｍｕｒａ Ａ、Ｔｓｕｒｕｍｉ ＫはＴｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３５（４）：４３１〜９に「Ａｂｎｏｒｍａｌ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ」という標題の論文を公表した。シアロ複合糖質の尿中排泄の異常がＭＰＳの患者４名で観察された。尿中シアロ複合糖質はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５およびＧ−５０による連続ゲルろ過、ならびにＤｏｗｅｘ１イオン交換クロマトグラフィーにより８つの画分に分けられた。これらの画分の量の比較から、マンノースとグルコサミン含量に富む画分がＭＰＳの患者におけるシアロ複合糖質の尿中排泄の増加に貢献していることが示された。この画分の主成分は、ジシアリル−オロソ−Ｎ−オクタオースであり、これはＡｓｎ−Ｎアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）結合を有する糖タンパク質の代表的なオリゴ糖側鎖であった。理論に捕らわれることを望んだわけではないが、この異常はＭＰＳの二次病変であるが、シアロ糖タンパク質の代謝の障害がこれらの疾患の病因と密接に関係していると想像できる。

１９８３年にＰｕｒｋｉｓｓ Ｐ、Ｇｉｂｂｓ ＤＡ、Ｗａｔｔｓ ＲＷはＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１３１（１〜２）：１０９〜２１に「Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ ｗｈｏ ｗｅｒｅ Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ」という標題の論文を公表した。この手紙形式の報告は、線維芽細胞の移植による治療途中のＭＰＳ患者における尿中のＧＡＧとオリゴ糖の組成について研究している。オリゴ糖を溶液中に残しながら尿中ＧＡＧを９−アミノアクリジンで沈殿させた。両画分をゲルろ過でさらに分画した。ＧＡＧ亜画分中のイズロン酸、グルクロン酸、ガラクトサミンおよびグルコサミン含量を調べた。理論に捕らわれることを望んだわけではないが、４年半にわたって線維芽細胞の反復移植の治療を受けてきた患者においてこれらのパラメータに変化がみられなかった。オリゴ糖画分のアミノ糖組成が調べられて、変化していないことが示された。さらに、ハーラー病の患者４名およびハンター病の患者２名では、移植に特異的に関係する尿中ＧＡＧの硫酸化度は変化していないことが分かった。著者らは、線維芽細胞の移植が糖質含量に、ならびに尿中のＧＡＧおよびオリゴ糖の硫酸化度に、検出できるような変化をもたらさないと結論した。

１９８４年にＥｌｌｉｏｔｔ Ｈ、Ｈｏｐｗｏｏｄ ＪＪはＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８（１）：２０５〜９に「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ Ｄ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ ａ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｓｕｌｆａｔｅ ａｓ ｔｈｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｓｕｌｆａｔｅ ｓｕｌｆａｔａｓｅ」という標題の論文を公表した。この論文は、白血球と培養皮膚線維芽細胞とのホモジェネート、ならびに正常個体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ欠乏症（サンフィリポＤ症候群、ＭＰＳ ＩＩＩＤ）に冒された患者および他のＭＰＳに冒された患者から得られた尿の濃縮物と共に放射性標識単糖であるＮ−アセチルグルコサミン［１−１４Ｃ］６−硫酸（ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ）を温置することによって、いかにしてＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ活性をアッセイしたかを論じた。そのアッセイはＭＰＳ ＩＩＩＤのホモ接合体と、正常対照および他のＭＰＳ型とをはっきりと識別した。ＧｌｃＮＡｃ６Ｓに対する酵素の活性レベルを、ヘパリンから調製した硫酸化二糖および硫酸化三糖と比較した。その二糖は単糖と同じ速度で脱硫酸され、三糖は単糖の３０倍の速度で脱硫酸された。グルコース６−硫酸およびＮ−アセチルマンノサミン−６−硫酸に対するスルファターゼ活性は検出されなかった。ＧｌｃＮＡｃ６Ｓを加えた線維芽細胞のホモジェネートにおけるスルファターゼ活性はｐＨ６．５の至適ｐＨ、みかけのＫｍ３３０μｍｏｌ／ｌ、および硫酸イオンとリン酸イオンとの両方による阻害を示した。サンフィリポＤ症候群の酵素を日常的に検出するには、白血球および皮膚線維芽細胞におけるＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼのアッセイに放射性標識基質ＧｌｃＮＡｃ６Ｓを使用することを薦めている。

１９８４年にＫｉｍｕｒａ Ａ、Ｈａｙａｓｈｉ Ｓ、Ｋｏｓｅｋｉ Ｍ、Ｋｏｃｈｉ Ｈ、Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｋ．はＴｏｈｏｋｕ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４４（３）：２２７〜３６に「Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｅｘｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ」という標題の論文を公表した。この論文はＭＰＳ ＩＩＩ−Ｂの２名の同胞から得た尿中ヘパラン硫酸（「ＨＳ」）をＤｏｗｅｘ１およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いたクロマトグラフィーでどのように分画したかを論じた。それらのＭｒは１６００から８０００の範囲で、それらの９５％が５０００以下の領域に含まれた。低Ｍｒの画分では含まれるＯ−硫酸およびＮ−硫酸基の量が多くなった。無傷のＨＳ分子はＧｌｃＮＡｃおよびグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）に富むブロックと、グルコサミン−Ｎ−硫酸（ＧｌｃＮＳ）、イズロン酸（ＩｄＵＡ）およびＯ−硫酸に富むブロックから構成されることが化学分析とＨＳの脱アミン切断によって示唆された。ＧｌｃＮＡｃ−ＵＡ−ＧｌｃＮＳ−ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃが１８００以下のＭｒを有するＨＳの主要なオリゴ糖であることが分かった。三糖であるＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−無水マンノース（ａｎＭａｎ）およびＧｌｃＮＡｃ−ＩｄＵＡ−ａｎＭａｎは、脱アミン切断によりＨＳオリゴ糖の非還元末端から放出された。これらの三糖はエステル型硫酸を０．３ｍｏｌ保有していた。ＧｌｃＮＡｃ−ＩｄＵＡ−ａｎＭａｎの方が他方よりも硫酸化度が高かった。重大な量の非硫酸化三糖の放出が、この疾患における酵素の欠損と一致している。別のＭＰＳ ＩＩＩの患者から得た尿中ＨＳを同様に調べた。患者を酵素的に検討しなかったが、尿中ＧＡＧの構造から、その患者にα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが欠損していることが示唆された。

１９８４年にＫｏｄａｍａ Ｃ、Ｏｔｏｔａｎｉ Ｎ、Ｉｓｅｍｕｒａ Ｍ、Ｙｏｓｉｚａｗａ ＺはＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京）９６（４）：１２８３〜７に「Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｐｐｙｒｉｄｙｌａｍｉｎｏ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒｓ ｂｙ Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅｓ」という標題の論文を公表した。この論文は高速液体クロマトグラフィーによって４つの不飽和二糖（ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−６ＳおよびΔＤｉ−ｄｉＳ）を分離し定量するための高感度法をどのように開発したかを論じている。これらの不飽和二糖を蛍光化合物である２−アミノピリジンと結合させた。移動相として８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ６．０）／メタノール（体積比３０／１）を用いたｍｕＢｏｎｄａｐａｋ−Ｃ１８カラムを使って、得られたピリジルアミノ誘導体の完全な分離を達成した。蛍光の発光（ピーク高）と、結合反応に使用した各基準二糖の量との間に直線関係が存在した。商業的に入手できるコンドロイチン硫酸ＡおよびＣ、ＤＳならびにＭＰＳ患者の尿中ＧＡＧをコンドロイチナーゼで分解して分析することに、本方法を応用した。本方法がコンドロイチン硫酸異性体からコンドロイチナーゼによって生成するｎｍｏｌ〜ｐｍｏｌレベルの不飽和二糖の分離と定量に有用であり、構造のキャラクタリゼーションに使用できることを得られたデータは示した。

１９８５年にＨｏｐｗｏｏｄ ＪＪ、Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｈ．はＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２９（３）：５７９〜８６に「Ｕｒｉｎａｒｙ Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｌｐｈａｔｅｄ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｅｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ」という標題の論文を公表した。硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミンをヒトの尿から単離し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−硫酸（ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸（ＧａｌＮＡｃ６Ｓ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−４，６−二硫酸（ＧａｌＮＡｃ４，６ｄｉＳ）と仮に同定した。ＭＰＳ−ＩＩＩＤ、ＭＰＳ−ＩＶＡおよびＭＰＳ−ＶＩの患者の尿は、正常個体の尿と比べてそれぞれ３８０、１８０、４２０倍に上昇した濃度のＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧａｌＮＡｃ６ＳおよびＧａｌＮＡｃ４Ｓを含有している。ＭＰＳ−ＶＩの患者の尿もＧａｌＮＡｃ４，６ｄｉＳを正常レベルの６００倍以上含有している。ムコリピドーシスＩＩ型の患者、多発性スルファターゼ欠乏症の患者、および一般に検討されたＭＰＳの患者全ての尿は正常対照およびα−マンノシドーシス患者の尿で検出されたレベルの少なくとも５〜１０倍高い硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミンを含有している。臨床的に軽症の表現型の患者の尿は、臨床的に重症のＭＰＳ患者の尿から単離されたよりも少ない硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミンを含有している。４つの硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミンの起源は分かっていない。しかし、ケラタン硫酸とコンドロイチン６−硫酸由来で非還元末端にβ結合した６−硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミン残基を含む一連のオリゴ糖基質を、培養ヒト皮膚線維芽細胞のホモジェネートと共に温置すると、ＧｌｃＮＡｃ６ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓがそれぞれ放出されることが間接的に示された。コンドロイチン４−硫酸由来で非還元末端にβ結合したＧａｌＮＡｃ４Ｓ残基を含むオリゴ糖基質を同様に温置したとき、ＧａｌＮＡｃ４Ｓの放出を実証できなかった。ヒトの尿に存在する硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミンの全てではないにしても一部は、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸またはコンドロイチン硫酸の非還元末端でβ結合している硫酸化ＧｌｃＮＡｃ残基または硫酸化ＧａｌＮＡｃ残基に対するβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの作用から得られる、と我々は提案する。

１９９５年にＭｕｒａｔａ Ｋ、Ｍｕｒａｔａ Ａ、Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ．はＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．６７０（１）：３〜１０に「Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｉｇｈｔ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒｓ Ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅｓ」という標題の論文を公表した。特異的ヘパラン硫酸リアーゼ、ヘパリチナーゼＩおよびヘパリナーゼによるＨＳ異性体およびヘパリンに由来する構成性不飽和二糖（ΔＤｉ−ＳＨＳ）の同定が、スルホン化スチレンジビニルベンゼン共重合体を用いた高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を使って達成されたことを、この論文は示した。ＨＳ異性体由来の８つのΔＤｉ−ＳＨＳ生成物が同定された。不均一な硫酸化ＨＳ同位体とヘパリンを、ヘパリチナーゼＩおよびヘパリナーゼによる酵素分解によって種々のΔＤｉ−ＳＨＳに変換する。これらの酵素の実際的な応用を特異的酵素とＨＰＬＣを用いて検討した。ハーラー症候群の患者では、尿中ＨＳ異性体から８つの個々のΔＤｉ−ＳＨＳが同定された。

１９９６年にＴｏｍａ Ｌ、Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ＣＰ、Ｎａｄｅｒ ＨＢ．はＬａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７５（６）：７７１〜８１に「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｅｎｄｓ ｏｆ Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅｓ Ｅｘｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｈｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅｓ：ａ Ｎｅｗ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ’ｓ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ」という標題の論文を公表した。この論文は、サンフィリポ症候群およびハンター症候群の患者が尿中に排泄したＨＳの構造の酵素分析と化学分析から、それらの非還元末端が互いに異なり、それらの症候群の酵素欠乏を反映していることが示されたと論じた。種々の症候群から得たヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩＩ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍの粗酵素抽出物および亜硝酸分解で処理した。サンフィリポＡ症候群（ヘパランＮ−スルファターゼの欠乏）およびサンフィリポＢ症候群（α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの欠乏）の患者から得たＨＳをヘパリチナーゼＩＩで分解すると、不飽和二糖以外にかなりの量のグルコサミンＮ−硫酸とＮ−アセチルグルコサミンがそれぞれ生成した。ハンター症候群（イズロン酸スルファターゼの欠乏）の患者から得たＨＳをヘパリチナーゼＩＩまたは粗酵素抽出物で分解すると、非還元末端に硫酸化ウロン酸を含んだ２つの飽和二糖などの、いろいろな生成物が生じた。サンフィリポＣ症候群（アセチルＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼの欠乏）の患者から得たＨＳから、ヘパリチナーゼＩＩの作用によって非置換アミノ基を有するグルコサミンを含む２つの硫酸化三糖が他の生成物以外に生成した。ＭＰＳの鑑別診断の新しい手段を提供する以外に、これらの結果はｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリチナーゼ類の特異性に新しい洞察をもたらしている。

１９９８年にＢｙｅｒｓ、Ｓ．Ｒｏｚａｋｌｉｓ、Ｔ．Ｂｒｕｍｆｉｅｌｄ、Ｌ．Ｋ．Ｒａｎｉｅｒｉ、Ｅ．およびＨｏｐｗｏｏｄ、Ｊ．Ｊ．はＭｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．１９９８年１２月、６５（４）：２８２〜９０に「Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ＭＰＳ」という標題の論文を公表した。この研究で著者らは、多様なＭＰＳから尿中ＧＡＧを精製してキャラクタリゼーションするために陰イオン交換クロマトグラフィーと３０〜４０％の勾配ポリアクリルアミノゲル電気泳動（勾配ＰＡＧＥ）を組み合わせて使用した。種々のＭＰＳからの尿中ＧＡＧは勾配ＰＡＧＥで異なるパターンを示した。また、適当なＭＰＳ酵素による分解後の電気泳動のバンドパターンが移動することにより、ＭＰＳの型と亜型のさらなる確認が実証された。彼らは各ＭＰＳがその特定のＭＰＳ障害に欠乏している酵素に特異的な基質から成る非還元末端を有する独特なスペクトルのＧＡＧを蓄積すると報告した。非還元末端の構造と特定なＭＰＳとの絶対的な相関と、組換えリソソーム酵素を利用できることが、個々のＭＰＳを迅速に正確に診断する手段を提供している。

２００３年にオーストラリア仮特許ＳＮ ＰＳ２９３０の出願後にＲａｍｓａｙ ＳＬ、Ｍｅｉｋｌｅ ＰＪ、Ｈｏｐｗｏｏｄ ＪＪはＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７８（３）：１９３〜２０４に「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」という標題の論文を公表した。この論文はＭＰＳがＧＡＧの貯留を特徴とするＬＳＤのどのようなグループであるかを論じている。Ｘ連鎖のハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）を除き、ＭＰＳは常染色体に劣性遺伝し、ＧＡＧを異化するのに必要な１０個のリソソーム酵素のいずれか１つの欠乏を生ずる。リソソームに貯留されるＧＡＧの種類と大きさは、特定の酵素欠乏によって決定される。これらのＧＡＧの上昇は、その後に組織、循環および尿で観察される。患者の試料から得た硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミン含有単糖および二糖を誘導体化してエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析で定量する方法が開発された。大部分のＭＰＳの型の尿では、二硫酸化および一硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミン（ＧａｌＮＡｃ４，６Ｓ、ＧａｌＮＡｃ６Ｓ、ＧａｌＮＡｃ４ＳまたはＧｌｃＮＡｃ６Ｓ）、ならびに一硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミン−ウロン酸二糖（ＧａｌＮＡｃ６Ｓ−ＵＡ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−ＵＡまたはＧｌｃＮＡｃ６Ｓ−ＵＡ）が有意に増加した。ＭＰＳの患者から採取した血漿とろ紙につけた乾燥した血液のスポットを分析すると、一硫酸化Ｎ−アセチルヘキソサミンの総量の上昇を示したが、尿でみられるよりは小さいものであった。骨髄移植のレシピエントであるＭＰＳ ＩＶＡおよびＭＰＳ ＶＩの患者の尿試料は移植後にＨｅｘＮＡｃＳ、ＨｅｘＮＡｃＳ（２）／ＧａｌＮＡｃ４，６ＳおよびＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡの減少を示した。この減少は、比較的軽症の表現型の患者で同定されたものに匹敵するレベルまでの臨床改善と相関していた。

上に挙げたそれぞれの参照の全体は、参照により本明細書に組み込まれている。

したがって、ＬＳＤの早期診断のための迅速、正確かつ経済的で、自動化に耐える検査の開発の必要性がある。さらにそのスクリーニング法は、臨床的に冒された個体および臨床的に冒されていない個体における治療効果を監視する能力を有すべきである。よって、ＬＳＤのためのそのように多様な臨床バイオマーカーの同定は、新生児のスクリーニング計画の開発に、またＬＳＤの早期診断と治療に伴う他の多くの諸問題に取り組む能力に重大な影響を及ぼすであろう。本発明はＭＰＳ患者およびオリゴ糖症患者にみられる特異的オリゴ糖バイオマーカーを検出、定量および監視する方法を提供する。

本発明は、ＭＰＳおよび関連する疾患の診断法に関する。本発明は、ＭＰＳまたは関連する疾患の前臨床状態または臨床状態の診断手段として、ＭＰＳまたは関連する障害を有する患者の生体液または組織に存在する生化学マーカー（「バイオマーカー」）を同定し定量する方法に関する。

本発明の第一側面は、標的動物におけるＭＰＳ病の前臨床状態または臨床状態の診断法に関する。本発明は、その標的動物から採取された標的生体試料から標的ＭＰＳバイオマーカーの標的量を測定すること、および次にその標的量を基準ＭＰＳバイオマーカーの基準量と比較することを含む。実施形態では、標的ＭＰＳバイオマーカーは基準ＭＰＳバイオマーカーと同一または同等であり、標的ＭＰＳバイオマーカーおよび基準ＭＰＳバイオマーカーは特異的オリゴ糖に対応する。その基準量は、既知のＭＰＳ臨床状態を有する基準動物または基準動物の群から測定される。その基準ＭＰＳバイオマーカーの基準量からの標的ＭＰＳバイオマーカーの標的量の偏差は、ＭＰＳ病の前臨床もしくは臨床指標、ＭＰＳ病の進行の指標、またはＭＰＳ病の後退の指標である。好ましい実施形態では、標的ＭＰＳバイオマーカーおよび基準ＭＰＳバイオマーカーは、標的量と基準量を測定する前に誘導体化剤と反応させることにより誘導体化される。その誘導体化剤は、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（「ＰＭＰ」）を含む場合もある。好ましい実施形態では、ＭＰＳオリゴ糖バイオマーカーの標的量と基準量をタンデム質量分析法で測定する。しかし、他の実施形態の同定法をクロマトグラフィーによるアッセイ、イムノアッセイ、液体クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、質量分析またはそれらの組合せから選択できる。

好ましい実施形態では、ＭＰＳバイオマーカーは特異的オリゴ糖に対応し、そのオリゴ糖は１〜１２残基の糖鎖長を有する硫酸化分子または非硫酸化分子を含む。これらのオリゴ糖は標的生体試料から同定されたＧＡＧの切断生成物を含み、そのＧＡＧはＨＳ、ＤＳ、ケラタン硫酸またはコンドロイチン硫酸である。別の好ましい実施形態では、標的生体試料に含有されるＭＰＳバイオマーカーを、特定のＭＰＳ病亜型の特徴となる欠乏した酵素の第一機能的酵素同等物で分解する。例えば、ＭＰＳ−Ｉで欠乏している酵素の第一機能的酵素同等物はα−Ｌ−イズロニダーゼを含む。標的ＭＰＳバイオマーカーの標的量を測定する前に分解ステップを用いると、定量の感度が向上する。

一実施形態では、ＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖は、ＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖の標的量を、同オリゴ糖または類似したＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖の基準量と比較することによって標的動物または患者におけるＭＰＳを診断するために使用される。例えば、ＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖の標的量の値の範囲が、ＭＰＳ病を有さない動物から得られたオリゴ糖の基準量に対する値の範囲よりも大きいとき、標的動物はＭＰＳ病を有すると診断できる。さらに、類似しているが減弱したＭＰＳ病の表現型を有する基準動物におけるＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖の基準量に比べ、ＭＰＳ病を有する標的動物におけるＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖の標的量の方が大きい。代わりに、ＭＰＳ病を有する標的動物におけるＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖の標的量は、ＭＰＳ病を有する同一標的動物であるが、有効なＭＰＳ療法を受けた後の時点の標的動物に比べて大きい。このとき、有効なＭＰＳ療法は骨髄移植（「ＢＭＴ」）またはＭＰＳ酵素置換療法を含む。ＭＰＳ療法の適当な種類と程度を決定するために、標的量と基準量の比較を利用できる。

別の具体的な実施形態では、標的ＭＰＳバイオマーカーまたは基準ＭＰＳバイオマーカーを正確に定量するために内部標準を利用する。好ましい実施形態では、重水素化したＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸（「ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）」）を内部標準として使用した。他の内部標準は検討されるオリゴ糖と類似した非生理学的オリゴ糖を含む。例えば、コンドロイチナーゼによるコンドロイチン硫酸の分解で得られるが非還元末端に不飽和ウロン酸を有する非生理学的オリゴ糖である。

生体試料は尿、細胞抽出物、血液、血漿、ＣＳＦまたは羊水から選択できるが、好ましい実施形態では尿が使用される。その方法はＭＰＳ病の亜型に選択的なＭＰＳバイオマーカーを含み、そのＭＰＳ病はＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ、ＭＰＳ−ＶＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＣ、ＭＰＳ−ＩＩＩＤ、ＭＰＳ−ＩＶまたはそれらの組合せである。その方法をＭＰＳ病の診断のための新生児のスクリーニングに使用できる。

本発明の第二の側面は、標的動物におけるＭＰＳ病の前臨床状態または臨床状態の診断法にも関する。その方法は、ＭＰＳバイオマーカーを中に含む生体試料を標的動物から得ること、誘導体化剤または誘導体化溶液でＭＰＳバイオマーカーを誘導体化して誘導体化したＭＰＳバイオマーカーを形成させること、その誘導体化したＭＰＳバイオマーカーに固相抽出カラムを接触させること、洗液でその固相抽出カラムを洗浄すること、溶離溶液でその固相抽出カラムからその誘導体化したＭＰＳバイオマーカーを溶離させること、溶離したＭＰＳバイオマーカーの量を測定すること、および溶離したＭＰＳバイオマーカーの量を基準ＭＰＳバイオマーカーの量と比較することを含む。基準ＭＰＳバイオマーカーの量を既知のＭＰＳの臨床状態を有する動物の基準群または基準動物の群から測定する。この方法では、そのＭＰＳバイオマーカーは基準ＭＰＳバイオマーカーと同一か同等であり、そのＭＰＳバイオマーカーと基準ＭＰＳバイオマーカーのそれぞれはオリゴ糖である。加えて、ＭＰＳバイオマーカーの量と基準ＭＰＳバイオマーカーの量は標準化され、ある実施形態ではそれぞれの量はクレアチニンまたは別のオリゴ糖に対して標準化される。基準ＭＰＳバイオマーカーの量と比較したときの溶離したＭＰＳバイオマーカーの量の偏差は、ＭＰＳ病、ＭＰＳ病の進行またはＭＰＳ病の後退の前臨床または臨床の指標とみなされる。

生体試料中のＭＰＳバイオマーカーを、誘導体化ステップの前に凍結乾燥する場合もある。このとき好ましい誘導体化溶液はＰＭＰを含む。ＭＰＳバイオマーカーは特異的オリゴ糖に対応し、そのオリゴ糖は１〜１２残基にわたる糖鎖長を有する硫酸化分子を含む。これらのオリゴ糖は、標的生体試料から同定されたＧＡＧの切断生成物を含む。そのＧＡＧはＨＳ、ＤＳ、ケラタン硫酸またはコンドロイチン硫酸である。別の具体的実施形態では、標的生体試料が含有するＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖を、特定のＭＰＳ病の亜型に特徴的な欠乏している酵素の第一機能的酵素同等物で分解する。例えば、ＭＰＳ−Ｉにおいて欠乏している酵素の第一機能的酵素同等物はα−Ｌ−イズロニダーゼを含む。その標的ＭＰＳバイオマーカーの標的量を測定する前に分解ステップを用いると、定量の感度が上がる。

本発明の第三の側面は、標的動物におけるＭＰＳ病の前臨床状態または臨床状態を診断するために使用されるキットである。好ましい実施形態では、そのキットは、標的ＭＰＳバイオマーカーの化学組成を改変するために使用されるオリゴ糖誘導体化剤と、誘導体化反応後に誘導体化剤を中和するために使用される酸性溶液と、その標的ＭＰＳバイオマーカーの量を正確に測定するために使用される内部標準と、誘導体化された標的ＭＰＳバイオマーカーを精製するために使用される固相抽出カラムと、標的ＭＰＳバイオマーカーが結合したその固相抽出カラムから不純物を除去するために使用される固相抽出カラム洗液と、その固相抽出カラムからその標的ＭＰＳバイオマーカーを溶離するために使用されるオリゴ糖溶離溶液と、そのキットの使用説明書のセットとを備える。

具体的な一実施形態では、オリゴ糖誘導体化溶液はＰＭＰを含む。好ましい酸性溶液はギ酸を含む。誘導体化されたオリゴ糖ＭＰＳバイオマーカーを固相抽出カラムに吸収させる。好ましいカラムはＣ１８逆相カラムを含み、好ましいカラム洗液はＣＨＣｌ_３を含む。結合したカラムから結合したオリゴ糖を取り出すために、ＣＨ_３ＣＮとギ酸とを含む好ましい溶離溶液が使用される。

そのキットは内部標準も包含し、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）が好ましい内部標準である。しかし、検討されるオリゴ糖に類似した非生理学的オリゴ糖も内部標準として使用できる。例えば、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するコンドロイチン硫酸をコンドロイチナーゼで分解してその非生理学的オリゴ糖を得ることができる。

用語：
本明細書において使用するような「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語は、１つまたは複数を意味する。本特許請求の範囲に使用するように、「含む」という単語と共に使用されるとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語は１つまたは複数を意味する。本明細書で使用するように「別の」は少なくとも二番目以上を意味する。

本明細書において使用するような「動物」、「被験者」、「個体」または「患者」という用語は、取り替えて使用でき、ヒトを含めた動物界の種を指す。

本明細書において使用するような「臨床状態」という用語は、医師によってＭＰＳ障害を調査または治療されている患者を指す。

本明細書において使用するような「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、述べられた要素もしくは完全体の、または要素もしくは完全体の群の、包含を意味するために使用されるが、他のいかなる要素もしくは完全体の、または要素もしくは完全体の群の、除外を意味するためには使用されない。

本明細書において使用するような「ムコ多糖症（ＭＰＳ）」という用語は、リソソーム内へのＧＡＧの蓄積と貯留を特徴とする、リソソーム蓄積症（「ＬＳＤ」）の亜群を指す。

本明細書において使用するような「ＭＰＳバイオマーカー」という用語は、個体由来の生体液から検出できるオリゴ糖を指す。このＭＰＳバイオマーカーの量は個体におけるＭＰＳ障害の臨床状態または前臨床状態の指標である。

本明細書において使用するような「ＭＰＳ酵素置換療法」という用語は、ＭＰＳ患者に欠乏している酵素または欠陥のある酵素を置換する薬剤または治療法を指す。

本明細書において使用するような「標準化する」という用語は、標的試料、基準試料または他の試料を基準、パターン、モデルなどと調和させることを指す。例えば、一実施形態では、ＭＰＳ患者および非ＭＰＳ患者の尿試料を各試料のクレアチニンの１μｍｏｌ等量を用いることによって標準化した。

本明細書において使用するような「表現型」という用語は、遺伝および環境の両方に起因する、解剖学的形質および心理学的形質を含めた生物に顕在する特徴をひとまとめにしたものを指す。

本明細書において使用するような「前臨床状態」という用語は、症状が発現する前の疾患期間を指す。

本明細書において使用するような「基準量」という用語は、生体液中のＭＰＳバイオマーカーの標準化された既知の量を指す。その基準量は、ＭＰＳ病の規定された臨床状態、前臨床状態または表現型を有する動物または動物群から測定される。基準量は、生体液中のＭＰＳバイオマーカーの相対量と、既知の臨床状態、前臨床状態または表現型との間に相関を有している多様な動物または動物群から編集された表を指す場合もある。

ＬＳＤの共通の１つの特徴は、リソソームへの物質の蓄積と貯留である。ＬＳＤに冒された個体での物質の蓄積と貯留は、細胞内のリソソームの数と大きさが総細胞体積の約１〜５０％に増加することを招く。冒されていない個体では、そのような物質は概してリソソーム内で分解生成物に分解してからリソソーム膜を通過して輸送される。本発明者らは、ある種のリソソームタンパク質が冒された個体のリソソーム中で高レベル存在することを以前に発見した（Ｍｅｉｋｌｅら１９９７、Ｈｕａら１９９８）。これらの同定されたタンパク質は、全てのＬＳＤの早期診断に有用なバイオマーカーとなり得る。例えば、リソソーム関連膜タンパク質（「ＬＡＭＰ」）、サポニンおよびα−グルコシダーゼが有用なバイオマーカーとして同定され、これらのタンパク質レベルを監視するために高感度の免疫定量アッセイが開発された。「高リスク」群におけるＬＡＭＰ−１レベルまたはＬＡＭＰ−２レベルだけの測定では、ＬＳＤに冒された個体の６５％までを同定し、ＬＡＭＰとサポニンの１つとの組合せではＬＳＤに冒された個体の同定は約８５％に増加した。

ＬＳＤの二番目の特徴は、貯留された基質がエキソサイトーシスまたは細胞死後の膜の破裂のどちらかによって細胞から結局放出されることである。結果として、種々の生体液（例えば血液や尿）中の特異的基質の同定と定量から、個体におけるＬＳＤを確認できる。さらに、特異的基質の定量は、関与する特定のタイプの障害も解明する。貯留された基質のレベルは疾患の重症度と相関し、その疾患の重症度は、臨床または前臨床での進行を監視するために、そして来たる治験（動物およびヒト）の効果を監視するために重要であろう。

ＭＰＳ障害群では、リソソームにおける主要貯留物質はＧＡＧ、具体的にはＨＳ、ＤＳ、ケラタン硫酸およびコンドロイチン硫酸を含む。エンドグリコシダーゼはＧＡＧを切断できるため、本発明者らは低分子量のオリゴ糖断片がＭＰＳ障害群に有用なバイオマーカーであると確定した。よって、本発明者らは、「リスクのある」個体から採取された生体試料中の特異的オリゴ糖（具体的には硫酸化オリゴ糖）のレベルが上昇していることがＭＰＳまたは多発性スルファターゼ欠乏症の指標であることを確認した。目的のオリゴ糖は一般に１〜１２個の糖残基を含む（すなわち単糖から十二糖の範囲）であろう。理論に捕らわれることを望んだわけではないが、これらのオリゴ糖はこれらの障害を有する患者に蓄積したＧＡＧ貯留基質に由来する。

したがって、動物から採取された生体試料中のあるオリゴ糖（例えば硫酸化単糖から硫酸化十二糖）の量を測定することは、ＭＰＳまたは多発性スルファターゼ欠乏症のスクリーニング法または監視法を提供する。理論に捕らわれることを望んだわけではないが、オリゴ糖の量の上昇はその障害が存在することの指標であり、そのオリゴ糖の形成は１つまたは複数のＧＡＧの切断により起こる。それらのオリゴ糖は、１つまたは複数の以下のＧＡＧ：ＨＳ、ＤＳ、ケラタン硫酸またはコンドロイチン硫酸、から得られる。特異的オリゴ糖を同定できるいかなる方法（例えばタンデム質量分析、質量分析、液体クロマトグラフィーおよび／またはイムノアッセイ）も、「リスクのある」個体におけるＭＰＳまたは多発性スルファターゼ欠乏症を同定および監視することを可能にするであろう。

生体試料中のオリゴ糖レベルの上昇を新生児のスクリーニング用マーカーとして、またはＭＰＳの治療を受けている患者の進行を監視するために利用できることが、本発明の目的である。被験者はすでにＭＰＳ障害と診断されている場合もあるし、診断されていない場合もある（すなわち前臨床状態または臨床状態）。被験者の臨床状態をこれらの方法で監視し、治療方式（例えば酵素置換療法、遺伝子療法および／または食餌療法）の有効性を測定できる。さらに、本発明の実施形態のいくつかを代表し、本発明を制限することを意図しない１つまたは複数の以下の実施例を参照することで、本発明をよりよく理解できよう。

試料の調製：生体試料からのオリゴ糖の単離
本発明の一実施形態は、標的動物または基準動物から採取された生体試料からオリゴ糖を測定することを含む。その生体試料は、尿、血液、細胞または目的オリゴ糖を含有する他の生体試料を含み得る。尿試料の採取は簡単で非侵襲的な操作であるため、以下の実施例のいくつかでは尿を生体試料として使用した。しかし、生体試料としての尿の利用は、他の生体試料を特異的オリゴ糖の測定に使用することから除外することを意図しない。さらに、当業者は、以下の実施例で使用される試薬の一部を、本発明の範囲と精神を逸脱することなしに様々な種類の生体試料を処理するために変えることができると認識しているであろう。

下記に示すいくつかの実施例では、同意のもとに患者の尿を得、以下のように処理した。破片を除去するために尿５００ｍｌを採取し２０００×ｇで１０分間遠心分離して透明にした。次に、透明となった尿に、０．１ＭのＮａＣＯＯＣＨ_３（ｐＨ５．０）で予め平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌの５０ｍｌカラムを自然重力で通過させた。次に、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムを１０カラム容の平衡化緩衝液で洗った。１．２ＭのＮａＣｌを含有する０．１ＭのＮａＣＯＯＣＨ_３（ｐＨ５．０）で尿中ＧＡＧを溶離させた。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムからの溶離画分についてウロン酸をアッセイした。かなりの量のウロン酸を含有する画分をプールし、凍結乾燥し、水４．０ｍｌで再構成した。次に、プールしたＧＡＧを、０．５ＭのＮＨ_４ＣＯＯＨで予め平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２カラム（内径１．５ｃｍ×長さ１７０ｃｍ）で分画した。Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２からの体積４．０ｍｌの５５画分を回収し、二番目のウロン酸アッセイを行った。図１はＭＰＳ Ｉの患者の尿（黒ひし形）および対照尿（灰色棒線）のオリゴ糖の溶離像を示す。

続いて、画分３１〜５４を質量分析用に下記のように誘導体化した。しかし、当業者は、本発明の範囲と精神から逸脱することなしに生体試料からＧＡＧを精製するために使用される多くの試薬を利用できることを認識しているであろう。

ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）の調製：
重水素化内部標準ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）をグルコサミン−６−硫酸（ＧｌｃＮ６Ｓ）の選択的Ｎ−アセチル化によって調製した。超音波処理によってピリジン（７００μｌ）、ジメチルホルムアミド（７００μｌ）およびメタノール（５０μｌ）の無水溶液に単糖ＧｌｃＮ６Ｓ（２５ｍｇ）を溶解した。得られた溶液を氷冷しながら撹拌し、無水酢酸（ｄ_６）（２×２０μｌ）を３０分間隔で加えた。１時間後に、４％アンモニア水溶液（５００μｌ）で反応を停止させ、次に窒素気流下に置き溶媒を除去した。このステップを繰り返した。残渣を水（５００μｌ）に溶かし、陰イオン交換カラム（ＡＧ１−Ｘ８、Ｈ^＋型、１００〜２００メッシュ、ベッド体積５ｍｌ）に載せ、脱イオン水（４カラム容）で洗った。単糖をＬｉＣｌ（２．５Ｍ）で溶離させ、得られた画分をビシンコニン酸マイクロウェル・アッセイ（ＢＣＡ（商標）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、イリノイ州）で監視した。ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）を含有する画分をプールし、Ｐ２ｆｉｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のサイズ排除カラム（５０×１ｃｍ）で脱塩した。脱塩された画分をプールし、凍結乾燥して、白色固体５．５ｍｇを生成させた（回収率１８．７％）。質量分析計で未重水素化ＧｌｃＮＡｃ６Ｓと比較することでＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）の純度を測定した。ニュートラル・ロス（ＮＬ３７４）ＥＳＩ／ＭＳＭＳ実験はＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）化合物が純度８３．９５％（ｗ／ｗ）であることを示した。しかし、当業者は、本発明の範囲と精神から逸脱することなしに重水素化内部標準ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）を製造するために使用される多くの試薬を利用できることを認識しているであろう。

オリゴ糖の誘導体化：
試料である精製オリゴ糖、細胞溶解液および尿（０．５〜１．０μｍｏｌクレアチニン等量）を誘導体化前に凍結乾燥し、全血試料をろ紙（Ｓ＆Ｓ９０３、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、ダッセル、ドイツ）に染みこませて乾燥し、打ち抜いた３ｍｍの穴部分を採り、直接誘導体化した。誘導体化溶液（１ｎｍｏｌの硫酸化二糖と１ｎｍｏｌのＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）を含有する２５０ｍｍｏｌ／Ｌの１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（「ＰＭＰ」）、４００ｍｍｏｌ／ＬのＮＨ_３、ｐＨ９．１）５０〜１００μＬを各試料に添加し、液をボルテックス・ミキサーで激しく撹拌してから恒温器に入れて約７０℃で９０分間加熱した。２倍モル過剰のギ酸（５０μＬ、８００ｍｍｏｌ／Ｌ）で試料を酸性にし、水で５００μＬにした。各試料をＣＨＣｌ_３５００μＬで抽出して過剰のＰＭＰを除き、遠心分離（１３０００×ｇ、５分間）した。固相抽出カラム（２５ｍｇ、Ｃ１８）を１００％ＣＨ_３ＣＮ、５０％ＣＨ_３ＣＮ／０．０２５％ＦＡおよび水による１ｍｌの連続洗浄でプライミングした。それぞれＣＨＣｌ_３抽出（４００μＬ）したときの水層を、プライミング済みのＣ１８カラムに載せ、固相に完全に入れた。カラムを水（１×５００μＬ、２×１０００μＬの順）で洗い、Ｓｕｐｅｌｃｏ社製Ｖｉｓｉｐｒｅｐ２４真空マニホールド(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＵＳＡ)で吸引（１５分間）して、または９６穴形式の場合は凍結乾燥器（４５分間）で乾燥した。次に、乾燥した各Ｃ１８カラムをＣＨＣｌ_３（２×１０００μＬ）で洗い、取り込まれなかったＰＭＰを全て除き、再び完全に乾燥させた。５０％ＣＨ_３ＣＮ／０．０２５％ギ酸を含む水（３×２００μＬ）で誘導体化したオリゴ糖を各Ｃ１８カラムから溶離させ、Ｎ_２の気流下で乾燥した。それから、質量分析計に注入するために５０％ＣＨ_３ＣＮ／０．０２５％ギ酸を含む水５００μＬで各試料を再構成した。

質量分析
イオンスプレー源とＡｎａｌｙｓｔ１．１データシステム（ＰＥ Ｓｃｉｅｘ）を備えたＰＥ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３０００三連四重極質量分析計を用いたＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳでオリゴ糖の分析を行った。Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製ポンプを１０μｌ／ｍｉｎで使用して試料を直接注入するか、または５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．０２５％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む水をキャリヤー溶媒として用いてＧｉｌｓｏｎ２３３オートサンプラーを使って５０μｌ／ｍｉｎでインジェクトした。オリゴ糖をＱ１スキャンにおける質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて同定し、陰イオンモードでのプロダクトイオンスキャンでさらにキャラクタリゼーションした。これらのオリゴ糖の定量を陰イオンモードでのマルチプルリアクション・モニタリング（ＭＲＭ）を使って行った。各ＭＲＭ対を単位分解能で１００ミリ秒間モニタリングした。各測定について１００回の連続スキャンを平均し、内部標準のピーク高に対してＰＭＰオリゴ糖のピーク高を関連づけることで相対濃度比を計算した。

ＨＰＬＣによる定量
質量分析は本発明のオリゴ糖を測定する好ましい方法であるが、本発明の別の側面はＧＡＧ由来オリゴ糖のＨＰＬＣによる定量を必要とする。例えば、上記のように尿試料のオリゴ糖をＰＭＰで誘導体化したものは、イオン対逆相ＨＰＬＣによっても分離できる。誘導体化されたオリゴ糖を適当なイオン対試薬（１ｍＭのトリエチルアミン）を含有する水に溶解し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムにインジェクトできる。硫酸化オリゴ糖をイオン対試薬（１ｍＭのトリエチルアミン）を含有するアセトニトリル／水の勾配を使ってカラムから溶離させ、２６０ｎｍの吸光度により定量できる。しかし、当業者は、本発明の範囲と精神から逸脱することなしに本発明のオリゴ糖を測定するために多くのＨＰＬＣ試薬と方法を修正できることを認識しているであろう。

免疫定量アッセイ
特異的オリゴ糖を検出し定量する別の好ましい方法では、免疫定量アッセイにモノクローナル抗体を利用する。例えば、オリゴ糖をタンパク質担体と結合させマイクロタイター・プレートの穴の内側をコーティングするために使用できる。そのオリゴ糖に対するモノクローナル抗体を、適当なレポーター分子で標識でき、マイクロタイター・プレートの穴に入れることができる。さらに、目的のオリゴ糖を含有する試料をその穴に入れることができ、それによって穴の表面に固定化されたオリゴ糖に対するモノクローナル抗体の結合が部分的に阻害される。次に、未知の試料中のオリゴ糖レベルを定量するために、既知の量のオリゴ糖を使った検量線を使用できる。当業者は、本発明の範囲と精神から逸脱することなしに本発明のオリゴ糖を測定するために多くの免疫試薬および免疫学の方法を修正できることを認識しているであろう。

オリゴ糖のキャラクタリゼーション：
ＭＰＳ ＩおよびＭＰＳ ＩＩを有する患者の尿から単離されたオリゴ糖を、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）で評価される断片化パターンからキャラクタリゼーションした。本実施例では質量分析を使用するが、クロマトグラフィー法、イムノアッセイ、液体クロマトグラフィー−質量分析、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを含めた他の定量法も、生体試料中のオリゴ糖の量を測定するための定量法として使用できることを理解すべきである。

プロダクトイオンスキャンは親イオンから生成したプロダクトイオンを示し、それらの構造についての情報をもたらし、ＭＲＭに適したイオン対を提供する。図２はＭＰＳ Ｉの尿にみられた二糖のマススペクトルを示す。親イオンの質量電荷比（「ｍ／ｚ」）は８０６．２であり、ＭＰＳ Ｉの尿から単離された［Ｍ−Ｈ］^−１硫酸化二糖を表し、ＭＲＭ対として使用したｍ／ｚ２５６および２９５を含めた一連の娘イオンを示している。

酵素による切断
さらに、特定のオリゴ糖に存在する糖残基の性質を、特定のＭＰＳに欠乏している組換え酵素による酵素的切断によってさらにキャラクタリゼーションできる。誘導体化オリゴ糖（１００μｌ）を５０ｍＭのＮＨ_４酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中で３７℃で２４時間５ｎｇのｒｈＩＤＵＡを使って分解した。この分解物の１０分の１を質量分析で分析し、残りを５ｎｇの組換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ（５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５．６）または５ｎｇのＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（５０ｍＭのギ酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５．０）を使って３７℃で２４時間分解した。これらの分解物もＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで分析した。

Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２カラムから得た画分＃３１〜＃４１におけるオリゴ糖の構造をＥＳＩ−ＭＳＭＳでキャラクタリゼーションし、部分構造を解明し、ＭＲＭモニタリングに適したプロダクトイオンを同定した図３。図３はＭＰＳ Ｉの尿中のオリゴ糖を示す。分子量に応じたＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２の画分を基にＭＰＳ Ｉの尿から五糖、四糖、三糖および二糖を精製し、同定した。各オリゴ糖をＭＳ／ＭＳでさらにキャラクタリゼーションし、マルチプルリアクション・モニタリング（「ＭＲＭ」）用のプロダクトイオンを同定した。構造の組成を詳細に描写するために断片化パターンを使用した。分画されたＭＰＳ Ｉの尿から同定されたこれらのオリゴ糖のいずれも対照尿の質量分析ではみられなかった。対照尿はＭＰＳ Ｉの患者の尿に存在する総ＵＡの１０％未満を含有していた。画分＃３２、＃３５、＃３７、＃３９および＃４０をｒｈＩＤＵＡで処理して非還元末端にＩｄｏＡが存在するかどうかを測定した。それぞれの場合に１９３ａｍｕ（原子質量単位）の減少を認め、この末端残基がＩｄｏＡであることを確認した。ｒｈＩＤＵＡで分解後、画分＃３５および＃３９を次に組換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼおよびＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼで処理した。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼではなく、組換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼでは８０ａｍｕの減少（ＳＯ_３の脱落と提案）から、ＩｄｏＡに隣接する残基をＮ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸と同定した。四糖の酵素分解物のマススペクトルを図４に示す。図４は、組換え酵素による分解後の四糖のマススペクトル（ｍ／ｚ６３２）を示す。図４Ａはｍ／ｚ６３２．６の四糖を示す。図４Ｂは組換えα−Ｌ−イズロニダーゼによる分解後の同オリゴ糖を示す。ｍ／ｚ５４４．５はウロン酸の脱落（１７６ａｍｕ）に対応する。図４Ｃは組換えα−Ｌ−イズロニダーゼで処理してから組換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼで処理したオリゴ糖を示す。ｍ／ｚ５０４．４は硫酸の脱落に対応する（８０ａｍｕ）と提案されている。

図５に示すように、ＭＰＳ Ｉの尿から単離された三糖と四糖の非還元末端のキャラクタリゼーションを示すマススペクトルに別の例を示す。Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２カラムから得た、豊富な量の三糖および四糖を含有する画分を組換えα−Ｌ−イズロニダーゼで酵素分解した。図５Ａのスペクトルは、α−Ｌ−イズロニダーゼの非存在下におけるｍ／ｚ６３２．６の四糖［Ｍ−Ｈ］^２−、ｍ／ｚ９８２．４の三糖［Ｍ−Ｈ］⁻およびｍ／ｚ４９０．９の［Ｍ−２Ｈ］^２−を示す。図５Ｂのスペクトルは、α−Ｌ−イズロニダーゼにより酵素分解し、イズロン酸を除いた後のｍ／ｚ６３２．６、９８２．４および４９０．９の各イオンからそれぞれｍ／ｚ５４４．４、８０６．４および４０２．８のシグナルが生成したことを示す。

図６はＭＰＳ ＩＩの患者の尿から精製したオリゴ糖のＱ１マススペクトルを示す。上記のようにオリゴ糖をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌ陰イオン交換およびＢｉｏＧｅｌ Ｐ４サイズ排除で精製した。図６Ａは、糖組成（ＵＡ_２、ヘキソサミン（「ＨＮ」））の三糖画分のＱ１スペクトルを示し、ｍ／ｚ５０９のシグナルは［Ｍ−２Ｈ］^２２Ｓ含有化学種に対応し、ｍ／ｚ１０２０のシグナルは対応する［Ｍ−Ｈ］⁻化学種である。図６Ｂは、（ＵＡ_２、ＨＮＡｃ、ＨＮ）の組成の四糖画分のＱ１スペクトルを示す。ｍ／ｚ４３４および４６０のシグナルはそれぞれ［Ｍ−３Ｈ］^３−３Ｓおよび［Ｍ−３Ｈ］^３−４Ｓ含有化学種に対応する。ｍ／ｚ６５１および６９１のシグナルは対応する［Ｍ−２Ｈ］^２−化学種から生じる。

図７はＭＰＳ ＩＩの患者の尿から精製されたオリゴ糖のＱ１マススペクトルを示す。上記のようにＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌ陰イオン交換およびＢｉｏＧｅｌ Ｐ２サイズ排除でオリゴ糖を精製した。図７Ａは、（ＵＡ_３、ＨＮＡｃ、ＨＮ）の組成の五糖画分のＱ１スペクトルを示し、ｍ／ｚ４９２および５１４のシグナルはそれぞれ［Ｍ−３Ｈ］^３−３Ｓおよび［Ｍ−３Ｈ］^３−４Ｓ含有化学種に対応し、ｍ／ｚ７３９および７７９のシグナルは対応する［Ｍ−２Ｈ］^２−化学種である。図７Ｂは、（ＵＡ_３、ＨＮＡｃ_３）の組成の六糖画分のＱ１スペクトルを示し、ｍ／ｚ４５０、４７０および４９０のシグナルはそれぞれ［Ｍ−４Ｈ］^４−４Ｓ、［Ｍ−４Ｈ］^４−５Ｓおよび［Ｍ−４Ｈ］^４−６Ｓ含有化学種に対応する。図７Ｃは、（ＵＡ_４、ＨＮＡｃ、ＨＮ_２）の組成の七糖画分のＱ１スペクトルを示し、ｍ／ｚ４７３、４９３および５１３のシグナルはそれぞれ［Ｍ−４Ｈ］^４−４Ｓ、［Ｍ−４Ｈ］^４−５Ｓおよび［Ｍ−４Ｈ］^４−６Ｓ含有化学種に対応する。図７Ｄは組成（ＵＡ_４、ＨＮＡｃ_４）の組成の六糖画分のＱ１スペクトルを示し、ｍ／ｚ４５１、４６８および４８４のシグナルはそれぞれ［Ｍ−５Ｈ］^５−５Ｓ、［Ｍ−５Ｈ］^５−６Ｓおよび［Ｍ−５Ｈ］^５−７Ｓ含有化学種に対応する。ｍ／ｚ５６５および５８５のシグナルは［Ｍ−４Ｈ］^４−５Ｓおよび［Ｍ−４Ｈ］^４−５Ｓ含有化学種に対応する。

質量分析によるオリゴ糖の同定：
一実施形態では、オリゴ糖マーカーをエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（「ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ」）で同定し、酵素分解とＥＳＩ／ＭＳＭＳの組合せを使ってキャラクタリゼーションする。例えば、ＥＳＩ／ＭＳＭＳによるオリゴ糖マーカーの測定は、尿、血漿、血液または皮膚線維芽細胞のような体液または組織試料の分析によりＭＰＳに冒された被験者の同定を可能にする。図８は、ＭＰＳ患者で同定されたオリゴ糖分析対象物質の表を示す。オリゴ糖をＭＰＳ患者の尿から精製し、タンデム質量分析で分析した。電圧を最適化し、ＭＲＭイオン類を同定して生体試料中のこれらのオリゴ糖化学種を迅速に分析できるようにした。

対照、ＭＰＳおよび多発性スルファターゼ患者の尿の分析を行った。対照（ｎ＝２６）ならびにＭＰＳおよびＭＳに冒された個体（７０名）の尿試料（０．５〜１．０μｍｏｌクレアチニン等量）を上記のように誘導体化してから、図８に示すように以前にＭＰＳの患者の尿試料で同定されキャラクタリゼーションされた単糖およびオリゴ糖２７種について質量分析計で分析した。ＭＲＭモードを使ってＰＭＰ誘導体化オリゴ糖の定量を行った。モニタリングしたイオン対を図８に示す。半ピーク高において１．０ａｍｕの解像度に設定して１００ミリ秒間各イオン対をモニタリングした。各定量測定にはインジェクション時間にわたって連続スキャンを行って平均した。ＰＭＰ−オリゴ糖のピーク高を、単糖ではＰＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ−ｄ_３内部標準の、または（他の全てのオリゴ糖では）ＰＭＰ−硫酸化二糖のどちらかのピーク高と対比することで定量を行った。選ばれたオリゴ糖のＭＲＭ分析に使用したｍ／ｚ値についてのＱ１／Ｑ３の平均値と標準偏差（「ＳＤ」）の表を図８に示す。図９は対照２６名と比べたときの各ＭＰＳ亜群における選ばれたオリゴ糖分析対象物質のＭａｎｎ ＷｈｉｔｎｅｙのＵ値を示す。ＭＰＳ患者の数をＭＰＳの型の下に表示する。各ＭＰＳ亜群について対照集団との分別をもたらす分析対象物質像があることが分かる。

Ｍａｎｎ ＷｈｉｔｎｅｙのＵ値に基づき、ＭＰＳおよび多発性スルファターゼ群と対照群とを最もよく分別する９つの分析対象物質を選択した。図１０は、対照個体におけるＧＡＧ由来オリゴ糖の相対レベルの箱型図を示す。対照固体（２６名）の尿試料について、すでに述べたようにＧＡＧ由来オリゴ糖を分析し、結果を標準化し、各分析対象物質に対する平均値に任意の値である１をあてた。その箱型図は、対照群での各分析対象物質の中央値（中央の横棒）、２５および７５百分位数（四角形）、ならびに上限および下限（上下の横棒）を示している。丸印と星印は、それぞれ線外値と極端な線外値を表す。ＭＰＳ病が進行したこと、または特異的治療法に応答しなかったことを動物における標的量が示すならば、さらに攻撃的な治療法が必要となり得る。例えば、治療の用量と期間を増加させることができる。他方で、ＭＰＳ病が後退したか、特異的治療法に応答したことを動物における標的量が示すならば、同様に攻撃性の低い治療法が必要となり得る。例えば、攻撃性の低い治療法では治療法の用量と期間を減少させることができる。

図１１は、ＭＰＳ各群に対応する分析対象物質の値の箱型図を示す。各ＭＰＳ群で、その群と対照群との、および他のＭＰＳ群との分別を可能にするような特徴的なパターンが明らかである。ＭＰＳに冒された個体の尿試料について、すでに述べたようにＧＡＧ由来オリゴ糖を分析し、各分析対象物質に対する平均値に１という値をあてた対照集団に対して結果を標準化した。箱型図はＭＰＳＩ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ、ＩＶＡ、ＶＩおよび多発性スルファターゼ欠乏症について選ばれた分析対象物質の結果を示す（それぞれ図１１パネルＡ〜Ｈ）。プロットは中央値（中央の横棒）、２５および７５百分位数（四角形）、ならびに上限および下限（上下の横棒）を示す。丸印と星印はそれぞれ線外値と極端な線外値を表す。

理論に捕らわれることを望んだわけではないが、各ＭＰＳ型における酵素の欠乏に特異的に関係するオリゴ糖があり、これらのオリゴ糖がその疾患で貯留される主な化学種である。本発明者らは、高レベルで存在するとき特異的な型のＭＰＳ障害（例えばＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩなど）の指標となるオリゴ糖を同定した。これらの研究に基づいて、各障害で推定される貯留物質のリストを下に表示する。このリストでは次の略語を利用する：ＩｄｏＡ＝イズロン酸、ＧｌｃＡ＝グルクロン酸、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ＝グルコサミン、ＵＡ＝ウロン酸、Ｓ＝硫酸、およびＧａｌ＝ガラクトース。

MPS I
デルマタン硫酸断片:
IdoA-(GalNAc-(UA-GalNAc)n)(S)m, n=0-5, m=0-11 ;
IdoA-(GalNAc-UA)n(S)m, n=1-6, m=0-12 ;
ヘパラン硫酸断片:
IdoA-(GlcNAc/GlcN-(UA-GlcNAc/GlcN)n)(S)m, n=0-5, m=0-17 ;
IdoA-(GlcNAc/GlcN-UA)n(S)m, n=1-6, m=0-18.

MPS II
デルマタン硫酸断片:
IdoA2S-(GalNAc-(UA-GalNAc)n)(S)m, n=0-5, m=0-11 ;
IdoA2S-(GalNAc-UA)n(S)m, n=1-6, m=0-12.
ヘパラン硫酸断片:
IdoA2S-(GlcNAc/GlcN-(UA-GlcNAc/GlcN)n)(S)m, n=0-5, m=0-17;
IdoA2S-(GlcNAc/GlcN-UA)n(S)m, n=1-6, m=0-18.

MPS IIIA
ヘパラン硫酸断片:
GlcNS-(UA-(GlcNAc/GlcN-UA)n)(S)m, n=0-5, m=0-16;
GlcNS-(UA-GlcNAc/GlcN)n(S)m, n=1-6, m=0-18.

MPS IIIB
ヘパラン硫酸断片:
GlcNAc-(UA-(GlcNAc/GlcN-UA)n)(S)m, n=0-5, m=0-16;
GlcNAc-(UA-GlcNAc/GlcN)n(S)m, n=1-6, m=0-18.

MPS IIIC
ヘパラン硫酸断片:
GlcN-(UA-(GlcNAc/GlcN-UA)n)(S)m, n=0-5, m=0-16;
GlcN-(UA-GlcNAc/GlcN)n(S)m, n=1-6, m=0-18.

MPS IIID
ヘパラン硫酸断片
GlcNAc6S/GlcN6S-(UA-(GlcNAc/GlcN-UA)n)(S)m, n=0-5, m=0-16
GlcNAc6S/GlcN6S-(UA-GlcNAc/GlcN)n(S)m, n=0-6, m=0-18

MPS IVA
ケラタン硫酸断片:
Gal6S-(GlcNAc-(Gal-GlcNAc)n)(S)m, n=0-5, m=0-11;
Gal6S-(GlcNAc-Gal)n)(S)m, n=0-6, m=0-12;
コンドロイチン硫酸断片:
GalNAc6S-(UA-(GalNAc-UA)n)(S)m, n=0-5, m=0-11.
GalNAc6S-(UA-GalNAc)n(S)m,n=0-6, m=0-12.

MPS IVB
ケラタン硫酸断片:
Gal(GlcNac-(Gal-GlcNAc)n)(S)m, n=0-5, m=0-11.
Gal-(GlcNAc-Gal)n(S)m, n=1-6, m=0-12.

MPS VI
デルマタン硫酸断片:
GalNAc4S-(UA-(GalNAc-UA)n)(S)m, n=0-5, m=0-12,
GalNAc4S-(UA-GalNAc)n(S)m, n=0-6, m=0-13.

MPS VII
デルマタン硫酸断片:
GlcA-GalNAc-(UA-GalNAc)n)(S)m, n=0-5, m=0-11;
GlcA-(GalNAc-UA)n(S)m, n=0-6, m=0-12.
ヘパラン硫酸断片:
GlcA-(GlcNAcS/GlcNS-(UA-GlcNAc/GlcN)n)(S)m, n=0-5, m=0-17;
GlcA-(GlcNAc/GlcN-UA)n(S)m,n=0-6, m=0-18.

本リストは糖残基の重合度１２または１３以下のオリゴ糖を包含している。当業者は、単糖から５０００Ｄａを超える分子量の比較的高分子量の化学種までのオリゴ糖連続体があることを認識するであろう。さらに、当業者は、一次貯留基質によりリソソームの機能が阻害された結果として、他の非特異的オリゴ糖が増加する場合がある（二次貯留）と認識しているであろう。本リストは一例として示され、本発明の範囲と精神を制限することを意図していない。

ＭＰＳの診断：
生体試料から単離されたオリゴ糖の識別力の一例として、対照８名およびＭＰＳ Ｉの患者１４名の尿中の６種のオリゴ糖（ＨＮＡｃ（Ｓ）、ＵＡ−ＨＮ−ＵＡ（Ｓ）、ＵＡ−ＨＮ−ＵＡ（２Ｓ）、ＵＡ−ＨＮＡｃＳ、ＵＡＨＮＡｃ−ＵＡ（Ｓ）、およびＵＡ−ＨＮＡｃ−ＵＡ−ＨＮＡｃ（２Ｓ））の相対レベルを測定した。測定した６つのオリゴ糖のうち５つでは対照集団とＭＰＳ集団の間にオーバーラップはなかった。対照およびＭＰＳ Ｉの患者における尿中のオリゴ糖の相対濃度を図１２に示し、上記のように内部標準（ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３））に対する相対定量を行った。対照およびＭＰＳ Ｉの患者の、１μｍｏｌクレアチン等量を有する尿試料を誘導体化してタンデム質量分析計で分析した。図１２の各プロットは異なるオリゴ糖を表し、Ｎ＝は各群（すなわち対照またはＭＰＳ−Ｉ）における標本数を表す。中央の横線は各群の中央値を示し、白四角形は２５および７５百分位数を示す。上下の誤差線は範囲の限界を示し、記号（「○」）は統計的な線外値を表す。

表現型Ｉの測定：
ＦＣＳを１０％補充したイーグルの修正基礎培地（ＢＭＥ）で、対照２名およびＭＰＳ Ｉの患者３名から得たヒト皮膚線維芽細胞を６週間集密後培養した。細胞を回収し、細胞抽出物を調製してから、ＭＰＳ Ｉの尿で同定されたオリゴ糖を質量分析で分析した（図１３）。対照および中等症のＭＰＳ Ｉを有する患者の細胞系から単離されたオリゴ糖の相対レベルに顕著な差を認めた。例えば、細胞タンパク質１ｍｇあたりのＵＡ−ＨＮ−ＵＡ（２Ｓ）の相対レベルは、対照患者由来のＳＦ５３４４細胞系では０．０３４であった。このとき中等症ＭＰＳ−Ｉを有する患者由来のＳＦ２６６２細胞系は、細胞タンパク質１ｍｇあたりＵＡ−ＨＮ−ＵＡ（２Ｓ）の相対レベルが３倍を超える高さであった（０．０９０）。重症の患者２名と中等症の患者との間でオリゴ糖レベルに４倍以上の差があることも明らかとなり、このことはオリゴ糖レベルと患者の重症度の間の相関関係を実証している。

表現型ＩＩの測定
一部のＭＰＳ Ｉの患者の尿試料中の相対オリゴ糖レベルは遺伝子型とも相関した。各尿試料について０．５μｍｏｌクレアチニン等量をＰＭＰで誘導体化し、図８の選ばれたオリゴ糖について質量分析で分析した。尿試料をＭＰＳ Ｉの個体（ｎ＝７）および年齢を合わせた対照（ｎ＝２６）から採取した。選ばれたオリゴ糖について尿試料を質量分析で分析した。これらの尿試料を、遺伝子型と臨床情報が記録されている一連の臨床表現型を有するＭＰＳ Ｉの患者から採取した。図１４に示すように、ＭＰＳ Ｉの患者では対照の平均と比べて選ばれたオリゴ糖の各ＭＲＭ対のレベルが上昇していた。

分子遺伝学的分析は疾患の重症度に有益な予測をもたらさないことが多いが、疾患の重症度を知ることはＭＰＳ Ｉを適正に管理するための最高のことである。図１４に示すように大部分のオリゴ糖のレベルは突然変異の重篤度とよく相関した。例えばＲ８９Ｑ対立遺伝子はＷ４０２Ｘ対立遺伝子よりも軽症とみなされ、Ｗ４０２Ｘ対立遺伝子は重症とみなされている（Ｓｃｏｔｔら、１９９３）。したがって、図１４に示すようにＷ４０２Ｘ対立遺伝子を有する患者におけるオリゴ糖レベルは、軽症のＲ８９Ｑ対立遺伝子を有する患者でのオリゴ糖レベルと比べて高値であった。適当な内部標準の合成はリソソームの貯留による特異的オリゴ糖生成物の正確な定量を可能にするであろう。そのことは次に、ＬＳＤ病表現型の効果的な予測に使用できる。理論に捕らわれることを望んだわけではないが、血液、組織生検または培養細胞のような他の起源の生体試料を使用した同様の取り組みでも似通った相関となるであろう。

治療法Ｉの監視：
オリゴ糖のレベルがどのように治療の効果の監視に使用できるかの一例として、対照と治療を受けているＭＰＳ Ｉの患者で比較を行った。図１５は骨髄移植（「ＢＭＴ」）前後のＭＰＳ Ｉ患者における相対オリゴ糖レベルを示す。ＢＭＴを受ける前のＭＰＳ−Ｉの患者から尿試料を得、ＢＭＴの３カ月後および８カ月後の患者から再び試料を採取した。各尿試料についてＭＰＳ Ｉの尿に存在した６つのオリゴ糖（ＵＡ−ＨＮ−ＵＡ（２Ｓ）、ＨＮＡｃ（Ｓ）、ＵＡ−ＨＮ−ＵＡ（Ｓ）、ＵＡ−ＨＮＡｃ（Ｓ）、ＨＡ−ＨＮＡｃ−ＵＡ（Ｓ）およびＵＡ−ＨＮＡｃ−ＵＡ−ＨＮＡｃ（２Ｓ））を分析した。全てのオリゴ糖で相対レベルが正常範囲に向けて継続的に減少していることを認めた。例えばＢＭＴ前では尿中ＵＡ−ＨＮＡｃ（Ｓ）の相対濃度は１３．９３であったが、ＢＭＴの３カ月後および８カ月後の相対レベルはそれぞれ８．３９および２．１２であった。さらに、ＵＡ−ＨＮＡｃ（Ｓ）の尿中相対レベルの対照８名の平均は０．０４であった。

治療法ＩＩの監視
骨髄移植の前、および骨髄移植後のいくつかの時点でＭＰＳ ＩＶＡおよびＭＰＳ ＶＩの患者から尿試料を採取した。各試料を誘導体化して選ばれたオリゴ糖を分析した。結果（図１６および図１７）は、移植後の時間の長さに対応してこれらの患者で貯留オリゴ糖が減少したことを示している。図１６は骨髄移植前後でのＭＰＳ ＩＶＡに冒された個体の尿中のＧＡＧ由来オリゴ糖の相対レベルを示す。ＭＰＳ ＩＶＡに冒された個体の尿試料を移植前（黒棒線）および移植の０．５、１．６および１１．６年後（それぞれ斜線棒線、あみがけ棒線および白棒線）に採取した。すでに述べたように各試料についてＧＡＧ由来オリゴ糖を分析し、各分析対象物質についての平均値に１という値をあてた対照集団に対して結果を標準化した。

図１７は骨髄移植前後のＭＰＳ ＶＩに冒された個体の尿におけるＧＡＧ由来オリゴ糖の相対レベルを示す。ＭＰＳ ＶＩに冒された個体の尿試料を移植前（黒棒線）および移植の１．１、４．０および４．９年後（それぞれ斜線棒線、あみがけ棒線および白棒線）に採取した。すでに述べたように各試料についてＧＡＧ由来オリゴ糖を分析し、各分析対象物質についての平均値に１という値をあてた対照集団に対して結果を標準化した。

治療法ＩＩＩの監視：
多くのＬＳＤの動物モデル、例えばイヌのＭＰＳ Ｉ、ネコのＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＶＩのネコ、およびマウスのＭＰＳ ＶＩＩが存在する。ネコにおけるＭＰＳ ＶＩ障害はＭＰＳの測定のモデルとして使われてきて、疾患の病因と治療の転帰の両方に関して非常に貴重な情報をもたらした。本実施例では、ＭＰＳ ＶＩ型のネコモデルを使用して、ＭＰＳ ＶＩ型ネコにおいて治療様式中に非侵襲性生化学的監視を行うためにＭＳ／ＭＳがどのように硫酸化単糖および硫酸化二糖を測定できるかを実証した。ＭＰＳ ＶＩ型のネコに、生後１カ月間、高用量（２０ｍｇ／ｋｇ）の組換えネコ４−スルファターゼ（「ｒｆ４Ｓ」）酵素置換療法を行い、続いて低用量（１ｍｇ／ｋｇ）のｒｆ４Ｓをさらに２カ月行い、３カ月間１ｍｇ／ｋｇの酵素置換療法を維持した動物と比較した。

ＭＰＳ ＶＩのネコの尿および血液中において硫酸化単糖Ｎ−アセチルヘキソサミン（「ＨｅｘＮＡｃ」）および硫酸化二糖Ｎ−アセチルヘキソサミン−ウロン酸（「ＨｅｘＮＡｃ−ＵＡ」）は上昇した。これらのマーカーから、最初の４週間の治療時での治療群間に明らかな分別が示され、低用量群での値は未治療のＭＰＳ ＶＩのネコよりもわずかに低いだけであったが、高用量群は正常なネコでの値に近似していた。しかし、高用量の治療を中止した２カ月のうちに両群のオリゴ糖レベルの差は最小となり、未治療のネコと病気に冒されていないネコの間に位置した。治験の終了時には、最初に高用量の酵素置換療法を施行した動物では身体の全般的な疾患の特徴に、そして組織中のリソソームの空胞化にも主観的な改善は最小であることに気付いた。最初の高用量療法は動物における貯留量を減少させたが、連続する低用量療法を経て持続する臨床利益を有さなかった。理論に捕らわれることを望んだわけではないが、ＭＰＳ病が進行したか、または特定の治療法に応答しなかったことを、動物における標的量が示すならば、さらに攻撃的な治療法が必要となり得る。例えば、治療の用量または期間を増加させることができる。他方で、ＭＰＳ病が後退したか、特定の治療法に応答したことを、動物における標的量が示すならば、同様に攻撃性の低い治療法が必要となり得る。例えば、攻撃性の低い治療法では治療法の用量または期間を減少させることができる。

１，９−ジメチルメチレンブルー（「ＤＭＢ」）アッセイを用いた尿中ＧＡＧの監視
低用量および高用量ＥＲＴで治療されたＭＰＳ ＶＩのネコにおいてＤＭＢアッセイで測定される尿中総ＧＡＧは、未治療ＭＰＳ ＶＩの動物と対照動物の間の中間値を示した（図１８）。約２５日齢で高用量の治療を受けたネコにおけるＧＡＧレベルは、低用量で治療を受けたネコに比べてほぼ正常化していた。これは生後２８日間投与された高ｒＦ４Ｓ用量率と一致していた。生後約５５および９０日では尿中ＧＡＧレベルは高用量動物と低用量動物の両方で類似していた。図１８は表示された時点での正常（×）、ＭＰＳ ＶＩ未治療（□）、ＭＰＳ ＶＩ低用量治療（○）およびＭＰＳ ＶＩ高用量治療（△）動物から採取された尿を示す。ＤＭＢ色素結合アッセイを用いてクレアチニンに対して標準化することで尿中の総ＧＡＧを測定した。

ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いた尿中ＧＡＧ由来オリゴ糖の監視
ヒトＭＰＳ ＶＩにおける疾患の状態と相関することが以前に示された２つのオリゴ糖（Ｒａｍｓａｙら２００３ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２００３；７８（３）：１９３〜２０４）を正常ネコ、ＭＰＳ ＶＩに冒されたネコおよび酵素で治療されたＭＰＳ ＶＩのネコにおいて分析した。未治療ＭＰＳ ＶＩのネコの尿から有意なレベルの単糖ＨｅｘＮＡｃＳを検出した。そのレベルは１５〜２５日齢では正常動物の４〜５倍高く、９０日齢では正常ネコの７倍となった（図１９）。低用量治療群における２５日齢での初期の硫酸化単糖レベルは未治療のＭＰＳ ＶＩのネコと類似していた。対照的に、高用量治療群は正常レベルにずっと近似していた。しかし、約５５日齢までに（両群共に用量１ｍｇ／ｋｇ）、両ＥＲＴ用量群における硫酸化単糖レベルは互いに類似し、正常ネコと未治療のＭＰＳ ＶＩのネコの間の中間のレベルに近づいた。図１９は、示した時点での正常（×）、ＭＰＳ ＶＩ未治療（□）、ＭＰＳ ＶＩ低用量治療（○）およびＭＰＳ ＶＩ高用量治療（△）動物から採取した尿を示す。単糖ＨｅｘＮＡｃＳの濃度をタンデム質量分析を使って測定し、クレアチニンに対して標準化した。

硫酸化二糖ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡについても同様の排泄パターンが観察されており、それは１５〜２５日齢では正常ネコでみられたレベルの約１５倍、９０日齢ではみられたレベルの約３７倍であった。硫酸化単糖の結果と釣り合うことに、高用量治療群の動物における尿中の硫酸化二糖の初発量は正常値に近似していたが、低用量動物の尿中の硫酸化二糖の量は未治療のＭＰＳ ＶＩ動物に近似していた。約５５日齢までに両ＥＲＴ用量群の尿中硫酸化二糖の量は互いに類似した。図２０は、示した時点での正常（×）、ＭＰＳ ＶＩ未治療（□）、ＭＰＳ ＶＩ低用量治療（○）およびＭＰＳ ＶＩ高用量治療（△）動物から採取した尿を示す。二糖ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡの濃度をタンデム質量分析を使って測定し、クレアチニンに対して標準化した。

７２６／１７３ＭＲＭ対で表される非硫酸化二糖ＨｅｘＮＡｃ−ＵＡは、ＭＰＳ ＶＩの疾患状態と無関係な非貯留性ＧＡＧ由来分析対象物質であり、クレアチニンに代わる標準尺度を提供する。硫酸化二糖ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡの量をＨｅｘＮＡｃ−ＵＡに対す比としてプロットすると、経時的に異なるパターンが観察される（図２１）。図２１は示した時点での正常（×）、ＭＰＳ ＶＩ未治療（□）、ＭＰＳ ＶＩ低用量治療（○）およびＭＰＳ ＶＩ高用量治療（△）動物から採取した尿を示す。二糖ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡおよびＨｅｘＮＡｃ−ＵＡの相対濃度をタンデム質量分析を使って測定し、比で表す。

ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡ：ＨｅｘＮＡｃ−ＵＡの比は、齢と共に減少しない代わりにわずかな増加を示した。ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡ：ＨｅｘＮＡｃ−ＵＡの比は、２１日齢では正常ネコの値の約３３倍で、それに比べて９０日齢では正常ネコの値の４７倍であった。初期の時点では、異なるＥＲＴ群の動物の間で差が認められた。高用量の動物は尿中ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡ：ＨｅｘＮＡｃ−ＵＡの値が正常に近い一方で、低用量動物は未治療ＭＰＳ ＶＩの動物に匹敵した。以前の結果と同様に、約５５日間治療するまでには尿中ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡ：ＨｅｘＮＡｃ−ＵＡの値は両治療群の間で類似した。クレアチニンに対して標準化した以前の結果とは対照的に、全ての動物の尿でＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡ：ＨｅｘＮＡｃ−ＵＡの比は齢と共に増加した。

血中のＧＡＧ由来オリゴ糖の監視
未治療ＭＰＳ ＶＩ群におけるＨｅｘＮＡｃＳの濃度は、齢と共に全般的な増加を示したが、対照のネコは一貫して低レベルを維持した（図２２）。低用量および高用量のＥＲＴのネコは、用量に関連したＨｅｘＮＡｃＳの血中レベルを示す。高用量群に比べて低用量群では初発レベルが高いことが分かる。次に、両群は９０日齢までに未治療ＭＰＳ ＶＩのネコと正常ネコの間のほぼ中間でプラトーとなった。正常動物、ＭＰＳ ＶＩの動物およびＭＰＳ ＶＩの治療動物の間で循環中に同様のパターンの分析対象物質レベルが観察される（図１９と図２２を比較）。しかし、治療群間の分別は尿で観察されたようには明確でなかった。理論に捕らわれることを望んだわけではないが、これと同一の取り組みを血液、組織生検または培養細胞のような他の起源の生体試料に使用でき、同様の相関をもたらすであろう。図２２は正常（□）、ＭＰＳ ＶＩ未治療（■）、ＭＰＳ ＶＩ低用量治療（●）およびＭＰＳ ＶＩ高用量治療（▲）動物から採取した血液中の単糖ＨｅｘＮＡｃＳの濃度を示す。単糖ＨｅｘＮＡｃＳの濃度をタンデム質量分析で測定した。値は示した齢範囲について平均±２×標準誤差で表示する。それぞれの齢範囲についてのデータ点の数をｘ軸の下に示す。

貯留されたオリゴ糖の酵素分解／化学分解
ＭＰＳにおいて貯留されたオリゴ糖を精製後にキャラクタリゼーションするために酵素分解が用いられている。代替的な戦略は、患者の試料中の貯留オリゴ糖を分解するために酵素分解または化学分解を利用することで、それによって貯留物質の定量の感度が上がるうえに、ＭＰＳの型についての付加的な情報がもたらされる。

対照およびＭＰＳ Ｉに冒された個体から得た培養ヒト皮膚線維芽細胞を１〜８週間培養して増殖させ、次に超音波処理し、得られた溶解液を遠心分離で透明にした。次に、その溶解液を加熱（１００℃、５分間）し、α−Ｌ−イズロニダーゼによる分解前に全てのリソソーム酵素を不活性化した。続いてそのオリゴ糖を、ＭＰＳ Ｉで欠乏している酵素であるα−Ｌ−イズロニダーゼで分解し、選ばれたオリゴ糖を酵素処理の前後にＭＳＭＳで測定した。図２３は、α−Ｌ−イズロニダーゼで処理する前後の対照およびＭＰＳ Ｉの細胞溶解液中の単糖およびオリゴ糖のレベルを示す。対照およびＭＰＳ Ｉに冒された個体から得た細胞溶解液をα−Ｌ−イズロニダーゼで分解し、分解前（白棒線）および分解後（黒棒線）の相対オリゴ糖レベルを測定した。相対オリゴ糖レベルを細胞タンパク質で補正した。図２３Ａは、酵素分解の結果、対照細胞系ではなくＭＰＳ Ｉ細胞系においてウロン酸のレベルが大きく増加したことを示す。Ｎ−アセチルグルコサミン（図２３Ｂ）はＭＰＳ Ｉ細胞系でわずかに増加しただけで、対照細胞系では増加しなかった。ＨＮＡｃＳ、ＨＮＡｃ−ＵＡオリゴ糖およびヘキソサミン−Ｎ−硫酸−ウロン酸（ＨＮＳ−ＵＡ）オリゴ糖でも有意な増加を観察した（それぞれ図２３Ｃ、ＤおよびＥ）。非還元末端にＨＮＡｃを有するオリゴ糖のこれらの増加に対応して、対照細胞系ではなくＭＰＳ Ｉ細胞系でＵＡ−ＨＮＡｃＳの濃度の減少を観察した（図２３Ｆ）。図２３Ａ＝ＵＡ、図２３Ｂ＝ＨＮＡｃ、図２３Ｃ＝ＨＮＡｃＳ、図２３Ｄ＝ＨＮＡｃ−ＵＡ、図２３Ｅ＝ＨＮＳ−ＵＡ、図２３Ｆ＝ＵＡ−ＨＮＡｃＳである。欠乏している酵素だけが一次貯留オリゴ糖を分解すると期待されるため、これらの結果は、貯留基質の酵素分解がこれらの基質からのシグナルを増幅し、特定のＭＰＳ亜型をキャラクタリゼーションする価値を実証している。

理論に捕らわれることを望んだわけではないが、他のＭＰＳで欠乏している酵素も、患者の試料中のオリゴ糖の貯留から生ずるシグナルを増幅し、ＭＰＳの型をキャラクタリゼーションするために同様に使用することができる。同様に、コンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼまたはヒアルロニダーゼのような他のＧＡＧ分解性細胞内酵素も、ＧＡＧ由来の比較的高分子量のオリゴ糖を二糖、三糖または四糖に分解し、それによってシグナルを増幅するために使用できよう。この取り組みは、比較的高分子量のオリゴ糖のそれぞれから、そして特定のＭＰＳ障害の特徴となる一次貯留基質からも非還元二糖、三糖または四糖を放出できるであろう。

細胞内酵素以外に、化学切断も比較的高分子量のオリゴ糖化学種を分解して、シグナルを増幅し、ＭＰＳ型に特徴的な二糖、三糖または四糖化学種を生成させるために使用できよう。例えば、ＨＳの亜硝酸分解は還元末端に無水マンノースを有する二糖および他のオリゴ糖を生成するであろう。

ＬＣ−ＭＳＭＳによるＭＰＳの患者におけるオリゴ糖の同定
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｒｅｌカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（０．１〜２ＭのＮａＣｌによる溶離）後にＢｉｏＧｅｌ Ｐ１０を用いたゲルろ過（２００ｍＭのギ酸アンモニウム、ｐＨ６．０）によりＭＰＳ ＶＩの患者の尿からＧＡＧを精製した。六糖を主に含有する画分を単離し、ＬＣ−ＭＳＭＳによる配列測定に使用した。ＬＣ−ＭＳＭＳでは六糖の０．５μｇウロン酸等量を、２００ｍＭのギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．２）に溶かした５ｍＭの０−（４−ニトロベンジル）−ヒドロキシルアミンＨＣｌ（ｐＮＯ_２ＨＡ）で３７℃で一晩温置して誘導体化した。ＬＣ−ＭＳＭＳの前にその物質を凍結乾燥し、０．５ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を含有する水で再構成した。緩衝液Ａ（０．５ｍＭのＴＥＡ）および緩衝液Ｂ（６０％アセトニトリル、０．５ｍＭのＴＥＡ）を用いてＡｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８カラム（２ｍｍ×１５０ｍｍ）でＬＣを実施した。溶離液をＡＰＩ３０００ＡＰＩ−ＳＣＩＥＸタンデム質量分析計に０．２ｍＬ／ｍｉｎの速度で注入した。酵素分解については、誘導体化前にギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．２）中で組換え４−スルファターゼ０．０５μｇを用いて０．５μｇＵＡ等量を分解した。

この六糖は正常な対照尿では観察／検出されなかった。図２４Ａは、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−ＵＡ−ｐＮｏ２ＨＡと同定された主要ピークとしてのｍ／ｚ５１４の六糖［Ｍ−３Ｈ］^３−のピークを表すスペクトルを示し、７３１のピークはＧａｌＮＡｃ４Ｓ−ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−ＵＡ−ｐＮｏ２ＨＡを表す。図２４Ｂは、図２４Ａに示す六糖の組換え４−スルファターゼで処理後を示す。ｍ／ｚ５１４のピークは低くなり、［Ｍ−３Ｈ］^３−および［Ｍ−２Ｈ］^２−二硫酸化六糖（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−ＵＡ−ｐＮｏ２ＨＡ）に対応するｍ／ｚ４８７およびｍ／ｚ７３１の主要なピークがみられる。

培養皮膚線維芽細胞におけるＭＰＳ Ｉの表現型の補正
ＧＡＧの異化は、まず細胞内酵素が多糖をオリゴ糖に切断し、次に一連の細胞外酵素がこれらのオリゴ糖の非還元末端のみに作用して単糖および硫酸イオンを生成するという２部構成で起こる。エキソヒドロラーゼであるα−Ｌ−イズロニダーゼの欠乏が引き起こすＭＰＳ Ｉとして知られているリソソーム蓄積障害では、２つの異なるＧＡＧであるデルマタン硫酸とヘパラン硫酸の断片が蓄積することが示されている。両ＧＡＧから得られるオリゴ糖である五糖、四糖、三糖および二糖を、陰イオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過を組み合わせて用いてＭＰＳ Ｉの患者の尿から単離した。これらのオリゴ糖をエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析で同定し、α−Ｌ−イズロニダーゼによる分解に対する感受性から非還元末端にα−Ｌ−イズロニダーゼを有することを示した。ＭＰＳ Ｉの患者由来の培養皮膚線維芽細胞は、デルマタン硫酸由来四糖を除き尿中に同定されたのと同じヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸由来二糖および三糖を蓄積することを示した。ＭＰＳ Ｉの線維芽細胞の培地に組換えα−Ｌ−イズロニダーゼを補充することによるＭＰＳ Ｉの表現型の補正は、冒されていない対照線維芽細胞のレベルまで二糖および三糖のレベルを低下させた。さらに、デルマタン由来四糖のレベルは初めは増加し、次に経時的に減少したことは、そのオリゴ糖が異化の中間生成物であり、他のオリゴ糖と同じくらい効率的にはα−Ｌ−イズロニダーゼの基質として回転しないことを示唆している。これらのＧＡＧオリゴ糖は、ムコ多糖症Ｉ型の臨床重症度と管理に有用な生化学マーカーであることを証明できよう。これらのオリゴ糖はＭＰＳ Ｉの患者の尿試料では臨床重症度に比例して上昇し、ＢＭＴ後の患者では減少することが示された。

実験方法
細胞培養の材料全てをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから入手した。組換えヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ｒｈＩＤＵＡ）、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼおよびヤギＮ−アセチルグルコサイン−６−スルファターゼをそれぞれＣＨＯ−Ｋ１発現系から調製した。ＤＥＡＥ ＳｅｐｈａｃｅｌをＰｈａｒｍａｃｉａから、サイズ排除ゲルＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２（微粒）をＢｉｏ−Ｒａｄから入手した。Ｃ１８エンドキャップｉｓｏｌｕｔｅ固相抽出カートリッジをＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手し、ＰＭＰを東京化成工業株式会社から購入した。質量分析のための溶媒は全てＨＰＬＣ等級で他の全ての試薬は分析等級であった。尿試料を診断用に本部門に提出し、−２０℃で保存した。

細胞培養
線維芽細胞を診断用に本病院に提出された皮膚生検から培養した。正常対照およびＭＰＳ Ｉ（中等症／重症表現型）の患者の皮膚線維芽細胞を、７５ｃｍ^２の培養フラスコに入れたウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を１０％（ｖ／ｖ）含有するＢＭＥ中で、３７℃で５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中で培養した。集密後の細胞培養物をトリプシン処理し細胞を遠心分離（２０００ｇ）で回収した。リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄後に細胞のペレットを２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）で再懸濁し、１５秒間超音波処理した。総細胞タンパク質をＬｏｗｒｙ法で測定した。各フラスコに７μｇの組換え酵素を含む培地を補充することで、ＭＰＳ Ｉの線維芽細胞および対照の線維芽細胞（集密後６週間）にＲｈＩＤＵＡを投与した。培地（＋ｒｈＩＤＵＡ）を５日間毎日補充した。ＭＰＳ Ｉの線維芽細胞を毎日回収し、対照線維芽細胞を第１日及び第５日に回収した。

オリゴ糖の貯留
ＭＰＳ Ｉおよび対照の線維芽細胞の若干の集密培養を種々の培養時間で回収した。内部標準（ＩＳＴＤ）を加えて細胞抽出物を調製し、質量分析用に誘導体化してから選ばれたＭＲＭ対について分析した。低分子量オリゴ糖の蓄積に培養時間（集密状態後のエイジング）が及ぼす効果を図２５に示す。図２５は集密後の皮膚線維芽細胞におけるオリゴ糖のＭＲＭ比を示す。若干のＭＰＳ Ｉおよび対照の皮膚線維芽細胞を集密後２〜１５週間培養した。細胞抽出物を調製し、質量分析用に誘導体化し、各ＭＲＭ対について分析した。丸と十字はそれぞれＭＰＳ Ｉの患者と対照の細胞系の皮膚線維芽細胞を表す。二硫酸化四糖（ｍ／ｚ６３２）を除き、他の全てのオリゴ糖は対照細胞系に比べＭＰＳ Ｉの線維芽細胞の培養物中に経時的に蓄積した。ＩＳＴＤに対する比に基づくと、皮膚線維芽細胞に同定された最も豊富に存在するオリゴ糖はＤＳ由来三糖（ｍ／ｚ４９０／９８２）である。この一硫酸化三糖は、培養４週間後に対照線維芽細胞に比べてＭＰＳ Ｉの線維芽細胞で上昇する。この増加は培養時間に伴って持続し、対照皮膚線維芽細胞でのレベルは少なくとも培養１０週間までは無視できる値を維持する。培養線維芽細胞では二糖（ｍ／ｚ８０６）が二番目に豊富な化学種であり、集密後６週間でＭＰＳ Ｉの細胞において明らかに上昇する。五糖（ｍ／ｚ７２０）およびＨＳ由来三糖（ｍ／ｚ１０２０／５０９およびｍ／ｚ９４０）は、集密状態を過ぎて培養したＭＰＳ Ｉの線維芽細胞に蓄積する。

貯留の補正
ＭＰＳ Ｉの線維芽細胞の培養液に５日間毎日ｒｈＩＤＵＡを投与し、対照皮膚線維芽細胞では第１日および第５日に投与した。両線維芽細胞共に集密後６週間エイジングさせた。次に、細胞を回収し、抽出物を質量分析用に調製し、各ＭＲＭ対について分析した。図２６は組換えα−Ｌ−イズロニダーゼ（ｒｈＩＤＵＡ）を添加した後のオリゴ糖レベルのＭＲＭ比を示す。ＭＰＳ Ｉの皮膚線維芽細胞および対照皮膚線維芽細胞を集密後６週間培養し続けた。ｒｈＩＤＵＡをＭＰＳ Ｉの線維芽細胞の培地に添加し、５日間毎日補充した。細胞を２４時間後に回収し、質量分析用に誘導体化し、各ＭＲＭ対について分析した。対照線維芽細胞を灰色の四角で示す。対照細胞ではｒｈＩＤＵＡを毎日添加したが、細胞の回収は第１日および第５日にのみ行った。時間０の点は４つの値の平均を表す。図２６は、培地にｒｈＩＤＵＡを補充直後に、蓄積した二糖（ｍ／ｚ８０６）および三糖（ｍ／ｚ４９０／９８２およびｍ／ｚ９４０）の量が劇的に減少したことを示している。五糖（ｍ／ｚ７２０）およびＨＳ三糖（ｍ／ｚ５０９）のレベルは変化しなかった。図２５に示すように、これらのオリゴ糖のどちらも培養６週間後のＭＰＳ Ｉの線維芽細胞に蓄積していなかった。興味深いことには、四糖（ｍ／ｚ６３２）の量はｒｈＩＤＵＡの存在下ではっきりと増加した。同様に、一部のＭＰＳ障害で上昇することが以前に示された（ＨｏｐｗｏｏｄとＥｌｌｉｏｔｔ、１９８５）硫酸化単糖（ｍ／ｚ６３０）も増加した。この単糖は、尿および線維芽細胞に存在するが、ＭＰＳ Ｉおよび対照に類似したレベルで存在する硫酸化ＨＮＡｃである。

発案したキットの材料
本発明の一側面は、標的動物におけるＭＰＳ病の前臨床状態または臨床状態を診断するために必要な試薬と材料の全てを有するキットを含む。有用なキットは、一般に標的ＭＰＳバイオマーカーの化学組成を改変するために使用されるオリゴ糖誘導体化剤と、その誘導体化反応後にその誘導体化剤を中和するために使用される酸溶液と、標的ＭＰＳバイオマーカーの量を正確に測定するために使用される内部標準と、誘導体化された標的ＭＰＳバイオマーカーを精製するために使用される固相抽出カラムと、標的ＭＰＳバイオマーカーが結合した固相抽出カラムから不純物を除去するために使用される固相抽出カラム洗液と、その固相抽出カラムから標的ＭＰＳバイオマーカーを溶離させるために使用されるオリゴ糖溶離溶液と、そのキットの使用説明書のセットとを備えるべきである。

ＮＨ_３と共に１−フェニル−３メチル−５−ピラゾロン（「ＰＭＰ」）を含むオリゴ糖誘導体化溶液は好ましい試薬であろうが、当技術分野で公知である他の誘導体化試薬も有用である。同様に、好ましい酸溶液はギ酸を含むが、他のいくつかの酸も等しく良好に作用するであろう。誘導体化されたオリゴ糖ＭＰＳバイオマーカーを固相抽出カラムに吸着させる。誘導体化されたオリゴ糖の精製に好ましいカラムはＣ１８逆相カラムを含むが、陰イオン交換カラムまたは相Ｃ１８／陰イオン交換の連結カラムなどの他の適切な固相抽出カラムも良好に働くであろう。キットでは各カラムをプライミング済みの、またはプライミングを終えていないユニットとして包装できる。好ましいカラム洗液はＣＨＣｌ_３を含むが、当技術分野で公知の他の溶液も役立つであろう。結合したカラムから、結合したオリゴ糖を取り出すためには溶離溶液が必要である。したがって、ＣＨ_３ＣＮおよびギ酸を含む好ましいキット用溶離溶液が使用されるが、他の類似した溶液も役立つであろう。

そのキットには内部標準も包含され、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）がＧｌｃＮＡｃ６Ｓの測定に好ましい内部標準であるが、他のオリゴ糖には同一の構造を有する他の重水素化標準が好ましいであろう。調査されるオリゴ糖と類似した非生理学的オリゴ糖も内部標準として使用できる。例えば、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するコンドロイチン硫酸を、コンドロイチナーゼによって分解することで非生理学的オリゴ糖が得られる。

使用説明書には、質量分析で分析するための試料調製の過程を説明している方法が包含されるであろう。付加的な情報も有用であろう。例えば、各ＭＰＳ障害型に存在し、それらの障害型の特徴となるオリゴ糖の構造を、特異的ＭＰＳバイオマーカーオリゴ糖のそれぞれを分析するための質量分析計の適当な設定条件の詳細と共に説明する印刷物を包含させることもできる。

上の実施例では質量分析を使用したが、クロマトグラフィー法、イムノアッセイおよび液体クロマトグラフィー−質量分析を含めた当技術分野で公知である他の定量法も、生体試料中のオリゴ糖レベルを測定するための定量法として使用できることを理解できる。本明細書に含まれる情報は、ＭＰＳ病の重症度を測定し、患者におけるＭＰＳ病の進行を監視し、治療の進歩を監視して、ＭＰＳ病の予測に有用である。ここに開示した本発明においては本発明の範囲と精神を逸脱することなしに色々な置き換えおよび変更ができることは当業者には容易に明らかとなろう。

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Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２カラムにより分画されたＭＰＳ Ｉの尿および対照尿のウロン酸（ＵＡ）等量の溶離像を示す図である。 親イオンから生成した娘イオンを有し、それらのイオンの構造についての情報をもたらし、マルチプルリアクション・モニタリング（「ＭＲＭ」）に適したイオン対ももたらすプロダクトイオンスキャンのマススペクトルを示す図である。 ＭＰＳ Ｉの尿中のオリゴ糖を示す図であり、ここで断片化パターンを構造の組成および非還元末端に存在する残基を詳細に描写するために使用した。 組換え酵素による分解後の四糖（ｍ／ｚ６３２）のマススペクトルを示す図である。 α−Ｌ−イズロニダーゼの非存在下（図５Ａ）および存在下（図５Ｂ）におけるＭＰＳ Ｉの尿から単離された三糖および四糖の非還元末端のＱ１マススペクトル特性を示す図である。 ＭＰＳ ＩＩの患者の尿に認められたオリゴ糖のＱ１マススペクトルを示す図である。 ＭＰＳ ＩＩの患者の尿に認められたオリゴ糖のＱ１マススペクトルを示す図である。 選ばれたオリゴ糖のＭＲＭ分析に使用された内部標準の値に対するオリゴ糖のシグナルの比の平均値と標準偏差（「ＳＤ」）のリストを示す図である。 対照２６名と比べたときのＭＰＳ亜群における選ばれたオリゴ糖分析対象物質のＭａｎｎ ＷｈｉｔｎｅｙのＵ値を示す図である。 対照個体における９つのＧＡＧ由来オリゴ糖分析対象物質の相対レベルの箱ひげ図を示す図である。 種々のＭＰＳ亜型障害を有する患者から得た９つのＧＡＧ由来オリゴ糖分析対象物質の相対レベルのいくつかの箱ひげ図を示す図である。 対照およびＭＰＳ Ｉの患者の尿中のオリゴ糖の相対濃度を示す図である。 ＭＰＳ Ｉ表現型を有する患者の皮膚線維芽細胞における相対オリゴ糖レベル（細胞タンパク質１ｍｇあたりのオリゴ糖）が対照で認められた相対レベルよりも高いことを示す図である。 選ばれたオリゴ糖の各ＭＲＭ対のレベルを示す図であり、そのレベルは対照レベルまたは基準レベルと比べたとき様々な表現型を有するＭＰＳ Ｉの患者において上昇していた。 対照値または基準値と比べたときの、骨髄移植（「ＢＭＴ」）を受ける前後のＭＰＳ Ｉの患者における相対オリゴ糖レベルを示す図である。 骨髄移植前後の、ＭＰＳ ＩＶＡに冒された個体における尿中のＧＡＧ由来オリゴ糖の相対レベルを示す図である。 骨髄移植前後のＭＰＳ ＶＩに冒された個体における尿中のＧＡＧ由来オリゴ糖の相対レベルを示す図である。 正常動物、ＭＰＳ ＶＩの未治療動物、ＭＰＳ ＶＩの低用量治療動物およびＭＰＳ ＶＩの高用量治療動物の尿中総ＧＡＧの経時変化を示す図であり、ここでＤＭＢ色素結合アッセイでＧＡＧを測定しクレアチニンに対して標準化した。 正常動物、ＭＰＳ ＶＩの未治療動物、ＭＰＳ ＶＩの低用量治療動物、およびＭＰＳ ＶＩの高用量治療動物から採取した尿中の単糖ＨｅｘＮＡｃＳの濃度の経時変化を示す図であり、ここで単糖ＨｅｘＮＡｃＳの濃度をタンデムマススペクトロメトリで測定しクレアチニンに対して標準化した。 正常動物、ＭＰＳ ＶＩの未治療動物、ＭＰＳ ＶＩの低用量治療動物およびＭＰＳ ＶＩの高用量治療動物から採取した尿中の二糖ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡの濃度の経時変化を示す図であり、ここでタンデム質量分析でＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡを測定しクレアチニンに対して標準化した。 正常動物、ＭＰＳ ＶＩの未治療動物、ＭＰＳ ＶＩの低用量治療動物およびＭＰＳ ＶＩの高用量治療動物から採取した尿中の二糖ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡおよびＨｅｘＮＡｃ−ＵＡの相対濃度の経時変化を示す図であり、ここで二糖ＨｅｘＮＡｃＳ−ＵＡおよびＨｅｘＮＡｃ−ＵＡの相対濃度をタンデム質量分析で測定し、比として表現する。 正常動物、ＭＰＳ ＶＩの未治療動物、ＭＰＳ ＶＩの低用量治療動物およびＭＰＳ ＶＩの高用量治療動物から採取した血液中の単糖ＨｅｘＮＡｃＳの濃度を示す図であり、ここで単糖ＨｅｘＮＡｃＳの濃度をタンデム質量分析で測定した。 α−Ｌ−イズロニダーゼによる処理前後の対照およびＭＰＳ Ｉの細胞溶解物中の単糖およびオリゴ糖レベルを示す図である。 組換えＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼでオリゴ糖を処理する前後の、ＭＰＳの患者におけるそのオリゴ糖のＬＣ−ＭＳＭＳによる同定を示す図である。 集密後の皮膚線維芽細胞におけるオリゴ糖のＭＲＭ比を示す図である。 組換えα−Ｌ−イズロニダーゼ（ｒｈＩＤＵＡ）の添加後のオリゴ糖のレベルのＭＲＭ比を示す図である。

Claims (61)

1. 標的動物におけるムコ多糖症（「ＭＰＳ」）病の前臨床状態または臨床状態の診断法であって、
   （ａ）前記標的動物から採取された標的生体試料から標的ＭＰＳバイオマーカーの標的量を測定すること、および
   （ｂ）前記標的量を基準ＭＰＳバイオマーカーの基準量と比較すること
   を含み、
   前記標的ＭＰＳバイオマーカーが前記基準ＭＰＳバイオマーカーと同一または同等であり、前記標的ＭＰＳバイオマーカーおよび前記基準ＭＰＳバイオマーカーのそれぞれがオリゴ糖であり、
   前記基準量が既知のＭＰＳ臨床状態を有する基準動物、または基準動物の群から測定され、
   前記基準ＭＰＳバイオマーカーの前記基準量からの前記標的ＭＰＳバイオマーカーの前記標的量の偏差は、前記ＭＰＳ病の前臨床もしくは臨床指標、前記ＭＰＳ病の進行の指標、または前記ＭＰＳ病の後退の指標である方法。
2. 前記標的生体試料または基準生体試料が細胞抽出物、血液、血漿または尿から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記標的ＭＰＳバイオマーカーの量または前記基準ＭＰＳバイオマーカーの量を測定する前に、前記標的ＭＰＳバイオマーカーおよび前記基準ＭＰＳバイオマーカーを誘導体化剤で誘導体化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記誘導体化剤が１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（「ＰＭＰ」）を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記オリゴ糖が１から１２個の残基にわたる糖鎖長を有する硫酸化分子を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記標的生体試料から同定された前記オリゴ糖がグリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）の切断生成物を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記ＧＡＧがヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸またはコンドロイチン硫酸である、請求項６に記載の方法。
8. 前記オリゴ糖が、ＩｄｏＡ−（ＧａｌＮＡｃ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、ＩｄｏＡ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１２）、ＩｄｏＡ２Ｓ−（ＧａｌＮＡｃ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、ＩｄｏＡ２Ｓ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１２）、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−（ＵＡ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１２）、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１３）、ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、またはＧｌｃＡ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１２）を含むデルマタン硫酸断片であり、ＩｄｏＡ＝イズロン酸、ＧｌｃＡ＝グルクロン酸、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ＝グルコサミン、ＵＡ＝ウロン酸、Ｓ＝硫酸、およびＧａｌ＝ガラクトースである、請求項１に記載の方法。
9. 前記オリゴ糖が、ＩｄｏＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１７）、ＩｄｏＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＩｄｏＡ２Ｓ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１７）、ＩｄｏＡ２Ｓ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＮＳ−（ＵＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１６）、ＧｌｃＮＳ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＮＡｃ−（ＵＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１６）、ＧｌｃＮＡｃ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＮ−（ＵＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１６）、ＧｌｃＮ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ／ＧｌｃＮ６Ｓ−（ＵＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１６）、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ／ＧｌｃＮ６Ｓ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＡ−（ＧｌｃＮＡｃＳ／ＧｌｃＮＳ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１７）、またはＧｌｃＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１８）を含むヘパラン硫酸断片であり、ＩｄｏＡ＝イズロン酸、ＧｌｃＡ＝グルクロン酸、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ＝グルコサミン、ＵＡ＝ウロン酸、Ｓ＝硫酸、およびＧａｌ＝ガラクトースである、請求項１に記載の方法。
10. 前記オリゴ糖が、Ｇａｌ６Ｓ−（ＧｌｃＮＡｃ−（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、Ｇａｌ６Ｓ−（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１２）、Ｇａｌ−（ＧｌｃＮＡｃ−（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、またはＧａｌ−（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１２）を含むケラタン硫酸断片であり、ＩｄｏＡ＝イズロン酸、ＧｌｃＡ＝グルクロン酸、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ＝グルコサミン、ＵＡ＝ウロン酸、Ｓ＝硫酸、およびＧａｌ＝ガラクトースである、請求項１に記載の方法。
11. 前記オリゴ糖が、ＧａｌＮＡｃ６Ｓ−（ＵＡ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）またはＧａｌＮＡｃ６Ｓ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１２）から選択されるコンドロイチン硫酸断片であり、ＩｄｏＡ＝イズロン酸、ＧｌｃＡ＝グルクロン酸、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ＝グルコサミン、ＵＡ＝ウロン酸、Ｓ＝硫酸、およびＧａｌ＝ガラクトースである、請求項１に記載の方法。
12. 前記標的量および前記基準量が質量分析により測定される、請求項１に記載の方法。
13. 前記標的量および前記基準量がクロマトグラフィーによるアッセイ、イムノアッセイ、液体クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはそれらの組合せにより測定される、請求項１に記載の方法。
14. 前記標的量および前記基準量がクレアチニンまたは別のオリゴ糖に対して標準化されている、請求項１に記載の方法。
15. 前記標的動物がＭＰＳ療法を受けたものである、請求項１に記載の方法。
16. 前記ＭＰＳ療法が骨髄移植（「ＢＭＴ」）またはＭＰＳ酵素置換療法を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記標的動物をＭＰＳ療法で治療することをさらに含み、前記ＭＰＳ療法が前記基準量と比べた前記標的量の前記偏差に基づく、請求項１に記載の方法。
18. 前記ＭＰＳ療法が骨髄移植（「ＢＭＴ」）またはＭＰＳ酵素置換療法を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記標的生体試料および前記基準生体試料が内部標準を含有する、請求項１に記載の方法。
20. 前記内部標準が重水素化Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸（「ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）」）を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記内部標準が、調査される前記オリゴ糖と類似した非生理学的オリゴ糖を含む、請求項１９に記載の方法。
22. 前記非生理学的オリゴ糖が、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するコンドロイチン硫酸の、コンドロイチナーゼによる分解から得られる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ＭＰＳ病がＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ、ＭＰＳ−ＶＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＣ、ＭＰＳ−ＩＩＩＤ、ＭＰＳ−ＩＶ、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
24. 前記標的動物が新生児である、請求項１に記載の方法。
25. 前記標的ＭＰＳバイオマーカーが特定のＭＰＳ病亜型の特徴となる酵素と接触され、接触が前記標的量の測定前に起こる、請求項１に記載の方法。
26. 前記酵素がα−Ｌ−イズロニダーゼを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 標的動物におけるムコ多糖症（「ＭＰＳ」）病の前臨床状態または臨床状態の診断法であって、
    （ａ）誘導体化剤で標的ＭＰＳバイオマーカーを誘導体化して、誘導体化された標的ＭＰＳバイオマーカーを形成させること、
    （ｂ）前記の誘導体化された標的ＭＰＳバイオマーカーを抽出化合物と結合させて、結合した誘導体化された標的ＭＰＳバイオマーカーを生成させること、
    （ｃ）前記の結合した誘導体化された標的ＭＰＳバイオマーカーを溶離溶液で前記抽出化合物から溶離させて、溶離した標的ＭＰＳバイオマーカーを形成させること、
    （ｄ）前記の溶離した標的ＭＰＳバイオマーカーの標的量を測定すること、および
    （ｅ）前記標的量を基準ＭＰＳバイオマーカーの基準量と比較すること
    を含み、
    前記標的ＭＰＳバイオマーカーが前記ＭＰＳバイオマーカーを含有する標的動物の生体試料から得られ、
    前記標的ＭＰＳバイオマーカーが前記基準ＭＰＳバイオマーカーと同一または同等であって、前記標的ＭＰＳバイオマーカーおよび前記基準ＭＰＳバイオマーカーのそれぞれがオリゴ糖であり、
    前記基準量が既知のＭＰＳ臨床状態を有する基準動物、または基準動物の群から測定され、
    前記基準量と比べたとき前記の溶離した標的ＭＰＳバイオマーカーの前記量の偏差が前記ＭＰＳ病の、前記ＭＰＳ病の進行の、または前記ＭＰＳ病の後退の、前臨床もしくは臨床指標である方法。
28. 前記標的生体試料または基準生体試料が細胞抽出物、血液、血漿または尿から選択される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記標的ＭＰＳバイオマーカーを誘導体化する前に前記標的試料を凍結乾燥することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
30. 前記誘導体化剤が１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（「ＰＭＰ」）を含む、請求項２７に記載の方法。
31. 前記オリゴ糖が１から１２個の残基にわたる糖鎖長を有する硫酸化分子を含む、請求項２７に記載の方法。
32. 前記標的生体試料から同定された前記オリゴ糖がグリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）の切断生成物を含む、請求項２７に記載の方法。
33. 前記ＧＡＧがヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸またはコンドロイチン硫酸である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記オリゴ糖が、ＩｄｏＡ−（ＧａｌＮＡｃ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、ＩｄｏＡ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１２）、ＩｄｏＡ２Ｓ−（ＧａｌＮＡｃ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、ＩｄｏＡ２Ｓ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１２）、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−（ＵＡ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１２）、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１３）、ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、またはＧｌｃＡ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１２）を含むデルマタン硫酸断片であり、ＩｄｏＡ＝イズロン酸、ＧｌｃＡ＝グルクロン酸、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ＝グルコサミン、ＵＡ＝ウロン酸、Ｓ＝硫酸、およびＧａｌ＝ガラクトースである、請求項２７に記載の方法。
35. 前記オリゴ糖が、ＩｄｏＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１７）、ＩｄｏＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＩｄｏＡ２Ｓ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１７）、ＩｄｏＡ２Ｓ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＮＳ−（ＵＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１６）、ＧｌｃＮＳ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＮＡｃ−（ＵＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１６）、ＧｌｃＮＡｃ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＮ−（ＵＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１６）、ＧｌｃＮ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ／ＧｌｃＮ６Ｓ−（ＵＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１６）、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ／ＧｌｃＮ６Ｓ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１８）、ＧｌｃＡ−（ＧｌｃＮＡｃＳ／ＧｌｃＮＳ−（ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１７）、またはＧｌｃＡ−（ＧｌｃＮＡｃ／ＧｌｃＮ−ＵＡ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１８）を含むヘパラン硫酸断片であり、ＩｄｏＡ＝イズロン酸、ＧｌｃＡ＝グルクロン酸、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ＝グルコサミン、ＵＡ＝ウロン酸、Ｓ＝硫酸、およびＧａｌ＝ガラクトースである、請求項２７に記載の方法。
36. 前記オリゴ糖が、Ｇａｌ６Ｓ−（ＧｌｃＮＡｃ−（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、Ｇａｌ６Ｓ−（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１２）、Ｇａｌ−（ＧｌｃＮＡｃ−（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）、またはＧａｌ−（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）_ｎ（Ｓ）_ｍ（ｎ＝１〜６、ｍ＝０〜１２）を含むケラタン硫酸断片であり、ＩｄｏＡ＝イズロン酸、ＧｌｃＡ＝グルクロン酸、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ＝グルコサミン、ＵＡ＝ウロン酸、Ｓ＝硫酸、およびＧａｌ＝ガラクトースである、請求項２７に記載の方法。
37. 前記オリゴ糖が、ＧａｌＮＡｃ６Ｓ−（ＵＡ−（ＧａｌＮＡｃ−ＵＡ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜５、ｍ＝０〜１１）またはＧａｌＮＡｃ６Ｓ−（ＵＡ−ＧａｌＮＡｃ）_ｎ）（Ｓ）_ｍ（ｎ＝０〜６、ｍ＝０〜１２）から選択されるコンドロイチン硫酸断片であり、ＩｄｏＡ＝イズロン酸、ＧｌｃＡ＝グルクロン酸、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ＝グルコサミン、ＵＡ＝ウロン酸、Ｓ＝硫酸、およびＧａｌ＝ガラクトースである、請求項２７に記載の方法。
38. 前記標的量の測定が質量分析を含む、請求項２７に記載の方法。
39. 前記標的量の測定が、クロマトグラフィーによるアッセイ、イムノアッセイ、液体クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはそれらの組合せを含む、請求項２７に記載の方法。
40. 前記標的動物がＭＰＳ療法を受けたものである、請求項２７に記載の方法。
41. 前記ＭＰＳ療法が骨髄移植（「ＢＭＴ」）またはＭＰＳ酵素置換療法を含む、請求項４０に記載の方法。
42. 前記標的生体試料および前記基準生体試料が内部標準を含有する、請求項２７に記載の方法。
43. 前記標的動物をＭＰＳ療法で治療することをさらに含み、前記ＭＰＳ療法が前記基準量と比べたときの前記標的量の前記偏差に基づく、請求項２７に記載の方法。
44. 前記ＭＰＳ療法が骨髄移植（「ＢＭＴ」）またはＭＰＳ酵素置換療法を含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記内部標準が重水素化Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸（「ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）」）を含む、請求項４０に記載の方法。
46. 前記内部標準が、調査される前記オリゴ糖と類似した非生理学的オリゴ糖を含む、請求項４０に記載の方法。
47. 前記非生理学的オリゴ糖が、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するコンドロイチン硫酸の、コンドロイチナーゼによる分解から得られる、請求項４６に記載の方法。
48. 前記ＭＰＳ病がＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ、ＭＰＳ−ＶＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＣ、ＭＰＳ−ＩＩＩＤ、ＭＰＳ−ＩＶ、またはそれらの組合せである、請求項２７に記載の方法。
49. 前記標的動物が新生児である、請求項２７に記載の方法。
50. 前記標的ＭＰＳバイオマーカーが特定のＭＰＳ病亜型の特徴となる酵素と接触され、接触が前記標的ＭＰＳバイオマーカーの前記量の測定前に起こる、請求項２７に記載の方法。
51. 前記酵素がα−Ｌ−イズロニダーゼを含む、請求項５０に記載の方法。
52. 標的動物におけるムコ多糖症（「ＭＰＳ」）病の前臨床状態または臨床状態を診断するためのキットであって、
    （ａ）オリゴ糖誘導体化剤と、
    （ｂ）酸溶液と、
    （ｃ）内部標準と、
    （ｄ）固相抽出カラムと、
    （ｅ）固相抽出カラム洗液と、
    （ｆ）オリゴ糖溶離溶液と、
    を備えたキット。
53. 前記オリゴ糖誘導体化剤が１−フェニル−３メチル−５−ピラゾロン（「ＰＭＰ」）を含む溶液である、請求項４８に記載のキット。
54. 前記酸溶液がギ酸を含むバイアルである、請求項４８に記載のキット。
55. 前記内部標準が、重水素化Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸（「ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）」）を含む、請求項４８に記載のキット。
56. 前記内部標準が、調査される前記オリゴ糖と類似した非生理学的オリゴ糖を含む、請求項４８に記載の方法。
57. 前記非生理学的オリゴ糖が、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するコンドロイチン硫酸の、コンドロイチナーゼによる分解から得られる、請求項５２に記載の方法。
58. 前記固相抽出カラムがＣ１８逆相カラムを含む、請求項４８に記載の方法。
59. 前記固相抽出カラム洗液がＣＨＣｌ_３を含む、請求項４８に記載の方法。
60. 前記オリゴ糖溶離溶液がＣＨ_３ＣＮおよびギ酸を含む、請求項４８に記載の方法。
61. 標的動物におけるムコ多糖症（「ＭＰＳ」）病の前臨床状態または臨床状態の診断法であって、
    （ａ）前記標的動物から採取された標的生体試料から標的ＭＰＳバイオマーカーの標的量を測定すること、および
    （ｂ）前記標的量を基準ＭＰＳバイオマーカーの基準量と比較すること
    を含む方法であって、
    前記標的ＭＰＳバイオマーカーが前記基準ＭＰＳバイオマーカーと同一または同等であり、前記標的ＭＰＳバイオマーカーおよび前記基準ＭＰＳバイオマーカーのそれぞれがオリゴ糖であり、前記オリゴ糖が、ＨＮＡｃＳ、ＨＮＡｃＳ２、ＨＮＳ−ＵＡ、ＵＡ−ＨＮＡｃＳ、ＨＮＡｃＳ−ＵＡ、ＵＡ−ＨＮＡｃ−ＵＡ−Ｓ、（ＨＮＡｃ−ＵＡ）２−Ｓ、（ＨＮＡｃ−ＵＡ）２（Ｓ）２、または六糖を含むものであり、ＵＡ＝ウロン酸、ＨＮＡｃ＝Ｎ−アセチルヘキソサミン、ＨＮ＝ヘキソサミン、Ｈｅｘ＝ヘキソース、（Ｓ）＝定まった糖残基を有さない硫酸であり、
    前記標的ＭＰＳバイオマーカーの前記量と前記基準ＭＰＳバイオマーカーの前記量を測定する前に、前記標的ＭＰＳバイオマーカーおよび前記基準ＭＰＳバイオマーカーが誘導体化剤で誘導体化され、前記誘導体化剤が１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（「ＰＭＰ」）を含み、
    前記標的量および前記基準量がクレアチニンに対して標準化され、
    前記基準量が既知のＭＰＳ臨床状態を有する基準動物、または基準動物の群から測定され、
    前記基準量からの前記標的量の偏差は前記ＭＰＳ病の前臨床もしくは臨床指標、前記ＭＰＳ病の進行の指標、または前記ＭＰＳ病の後退の指標であり、前記ＭＰＳ病がＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＣ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＡ、ＭＰＳ ＶＩまたは多発性スルファターゼ欠乏症を含む群から選択され、
    前記標的量および前記基準量が質量分析法で測定され、
    前記標的量および前記基準量を正確に測定するために内部標準が利用され、前記内部基準が重水素化Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸（「ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（ｄ３）」）を含む方法。

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