CN107941963A - 一种增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其采用高效液相色谱检测样品中的盐酸氨基葡萄糖的含量和/或硫酸软骨素的含量;先取戊烷磺酸钠0.87g,加乙腈‑水溶液500mL溶解即得流动相;在检测波长为190‑192nm;流动相流速0.15~0.25ml/min;流动相比例为乙腈‑戊烷磺酸钠溶液5:95检测;本发明通过摸索高效液相的色谱条件能够高效、准确、重现性好的检测出制剂中含有的盐酸氨基葡萄糖和硫酸软骨素的含量,使二者的分离度均大于1.5,两者与邻近的杂质分离度均大于2.0。该方法具有通用性,操作简便,专属性强,灵敏度、准确度和精密度良好等特点。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品中主要成分的检测方法,特别涉及以盐酸氨基葡萄糖、硫酸软骨素钠、乳矿物盐、透明质酸钠、酪蛋白磷酸肽为主要成分的保健食品中,用于盐酸氨基葡萄糖和硫酸软骨素的含量检测的方法。
背景技术
据不完全统计,我国60岁以上的老年人骨质疏松症发病率约为59.89%,增加骨密度、有效治疗骨质疏松症已经成为人们广泛关注的重要课题。
骨质疏松是一种“静悄悄”的疾病,是以单位体积内骨组织量减少、骨皮质变薄、海绵骨骨小梁数目及大小均减少、髓腔增宽、骨荷载功能减弱等为特征的疾病,通常要等到骨折发生才能被觉察到。临床上主要依据反映骨量的主要指标即骨密度来诊断。骨质疏松的信号包括身高缩短、圆肩、驼背以及检验诊断出的骨质流失,还有可能有脖子痛和肩痛等症状。骨质疏松的患者骨头松脆、导致骨折风险增加,尤其是髋关节、脊柱和腕部非常容易骨折。
骨关节炎是关节的一种慢性疾病,承重的关节尤其容易产生这疾病。据流行病学统计,目前全球关节炎患者有3.55亿人,在中国的患者人数超过1亿,并且还在增加,50岁以上的人群中70-80%患着不同程度的各种关节炎症。骨关节炎的发生通常是渐进性的,最常被累及的有髋关节、膝关节、手指和脊柱,其他关节也可能受影响,疼痛是最主要的症状,在运动时加重,休息之后可得到缓解。随着关节炎的恶化,关节的运动能力逐渐丧失,并且出现压痛,还可能有刺痛的感觉。脊柱部位的骨关节炎还可能造成手臂和腿部出现刺痛。作为世界头号致残性疾病,严重的骨关节炎可导致人体全部活动能力丧失。
现氨糖类保健食品种类较多,复配维生素D、酪蛋白磷酸肽、透明质酸钠、钙剂等等,达到增加骨密度的保健功能,本发明的目的是排除透明质酸钠在保健食品中盐酸氨基葡萄糖和硫酸软骨素的含量测定。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明针对市场上的增加骨密度保健食品,发明一种用于检测产品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素含量的方法,其具体的技术方案为:采用高效液相色谱检测样品中的盐酸氨基葡萄糖的含量和/或硫酸软骨素的含量;
按照下述比例制备样品溶液:取25-30mg样品加至5-10ml乙腈中,振荡使其分散均匀,再加入水用超声波使溶解,超声10-20min;再补加水定容至100ml;
按照下述比例制备乙腈-戊烷磺酸钠溶液,作为流动相:取戊烷磺酸钠0.87g,加乙腈-水溶液500mL溶解即得;
检测波长为190-192nm;
流动相流速0.15~0.25ml/min;
流动相比例为乙腈-戊烷磺酸钠溶液(4.75~5.25):(95.25~94.75);其中,优选的体积比为5:95。
精密量取样品溶液5μl注入液相色谱仪,记录色谱图。
优选的情况下,所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,所述流动相流速为0.16ml/min、0.20ml/min或0.24ml/min。
优选的情况下,所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,所述乙腈-水溶液按照体积比为5-10:95-90的比例配制。
优选的情况下,所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,所述乙腈-水溶液按照体积比为5:95的比例配制。
优选的情况下,所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,所述色谱图的出峰顺序依次为硫酸软骨素、氨基葡萄糖,硫酸软骨素与氨基葡萄糖的分离度均大于1.5,两者与邻近的杂质分离度均大于2.0。
优选的情况下,所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,所述硫酸软骨素钠进样浓度在9.008μg/mL~90.08μg/mL范围内呈良好的线性关系,盐酸氨基葡萄糖进样浓度在11.87μg/mL~118.7μg/mL内呈良好的线性关系。
优选的情况下,所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,所述硫酸软骨素钠的最低检测限为1.61ng,即本品中含有0.13%的硫酸软骨素钠即可检出;盐酸氨基葡萄糖的最低检测限为4.84ng,即本品中含有0.39%的盐酸氨基葡萄糖即可检出。
优选的情况下,所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,求得硫酸软骨素钠的最小定量限为5.63ng,即本品中含有0.45%的硫酸软骨素钠即可定量;盐酸氨基葡萄糖的最小定量限为14.51ng,即本品中含有1.16%的盐酸氨基葡萄糖即可定量。
优选的情况下,所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,制备样品溶液前,先将样品研细成粉末,置100-105℃下干燥4-5h。
优选的情况下,所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,制备的样品溶液在使用前,用0.2μm的聚四氟乙烯膜(PTFE)滤膜滤过。
优选的情况下,所述的乙腈为色谱级;所述的戊烷磺酸钠的纯度≧99.5%:
优选的情况下,所述标准品为盐酸氨基葡萄糖SIGMA有限公司;硫酸软骨素钠BSIGMA有限公司,加体积比为5:95的乙腈-水溶液稀释制成硫酸软骨素钠浓度约0.045mg/mL和盐酸氨基葡萄糖浓度约为0.060mg/mL的混合对照品溶液,用0.2μm的聚四氟乙烯膜(PTFE)滤膜滤过备用。
本发明的创新特征是:
本发明所述方法主要针对市场上各种具有增加骨密度功能的保健食品的制剂,此类制剂由盐酸氨基葡萄糖、硫酸软骨素钠、乳矿物盐、酪蛋白磷酸肽、透明质酸钠和适宜辅料制备而成。通过摸索高效液相的色谱条件能够高效、准确、重现性好的检测出制剂中含有的盐酸氨基葡萄糖和硫酸软骨素的含量,使硫酸软骨素与氨基葡萄糖的分离度均大于1.5,两者与邻近的杂质分离度均大于2.0。该方法具有通用性,操作简便,专属性强,灵敏度、准确度和精密度良好等特点。
附图说明
图1硫酸软骨素线性范围曲线图;
图2氨基葡萄糖线性范围曲线图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1
氨糖软骨素加钙胶囊:自制,该制剂由盐酸氨基葡萄糖、硫酸软骨素钠、乳矿物盐、酪蛋白磷酸肽、透明质酸钠和适宜辅料制备而成。具体的,本发明所使用的三批次胶囊的原料成分和比例如下:
批号20141101
盐酸氨基葡萄糖(95重量份)、硫酸软骨素钠(72重量份)、乳矿物盐(200重量份)、酪蛋白磷酸肽(17重量份)、透明质酸钠(10重量份)和辅料淀粉((6重量份)
批号20141102
盐酸氨基葡萄糖(90重量份)、硫酸软骨素钠(77重量份)、乳矿物盐(200重量份)、酪蛋白磷酸肽(17重量份)、透明质酸钠(10重量份)和辅料淀粉(6重量份)
批号20141103
盐酸氨基葡萄糖(100重量份)、硫酸软骨素钠(67重量份)、乳矿物盐(200重量份)、酪蛋白磷酸肽(17重量份)、透明质酸钠(10重量份)和辅料淀粉((6重量份)
实施例2
1.仪器与试剂、试药
1.1仪器与材料
安捷伦1100高效液相色谱仪,配紫外检测器
KQ5200DB数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司
CP225D型10万分之一分析天平:德国SARTORIUS AG公司
JD60-4万分之一分析天平:沈阳龙腾电子有限公司
滤膜:聚四氟乙烯膜(PTFE):0.2μm
1.2试剂与试药
水:GB/T 6682规定的一级水
乙腈:色谱级
戊烷磺酸钠:纯度≧99.5%
1.3样品
实施例1制备的氨糖软骨素加钙胶囊:批号20141101、20141102、20141103;
1.4标准品
盐酸氨基葡萄糖:批号BCBH0834V,SIGMA有限公司提供。
硫酸软骨素钠B:批号SLBG6731V,SIGMA有限公司提供。
2.专属性实验
2.1溶液的制备
分别取批号20141101、20141102、20141103的产品各20粒,内容物研细成粉末,置100-105℃下干燥4-5h。取25-30mg样品,精密称定,置100ml容量瓶中,加入5-10ml乙腈,振荡使其分散均匀,再加入水适量,用超声波使溶解,超声10-20min,并用水定容至刻度,摇匀。液相色谱仪测定前,样品溶液用0.2μm的聚四氟乙烯膜(PTFE)滤膜滤过。
对照品溶液的制备:取硫酸软骨素钠B(批号SLBG6731V,SIGMA有限公司提供)与盐酸氨基葡萄糖(批号BCBH0834V,SIGMA有限公司提供)对照品适量,加乙腈-水(5:95)溶液稀释制成硫酸软骨素钠浓度约0.045mg/mL和盐酸氨基葡萄糖浓度约为0.060mg/mL的混合对照品溶液,用0.2μm的聚四氟乙烯膜(PTFE)滤膜滤过。
2.2流动相选择
以乙腈-戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠0.87g,加水500mL溶解,即得)(5-10:95-90)为流动相。
2.3检测波长的确定
精密称取硫酸软骨素钠和盐酸氨基葡萄糖对照品适量,加乙腈-水(5:95)溶液制成1ml中约含硫酸软骨素钠30μg、盐酸氨基葡萄糖的150μg溶液,在190~400nm范围扫描。结果显示,二者在190-192nm处有最大吸收,因此选择检测波长为:190-192nm。
2.5系统适应性
按“上文2.1溶液的制备”方法制备样品溶液和对照品溶液,精密量取两种溶液各5μl注入液相色谱仪,记录色谱图。出峰顺序依次为硫酸软骨素、氨基葡萄糖,硫酸软骨素与氨基葡萄糖的分离度均大于1.5,两者与邻近的杂质分离度均大于2.0。硫酸软骨素线性范围曲线图如图1;氨基葡萄糖线性范围曲线图如图2。
2.6专属性试验
空白辅料阴性对照溶液:取除去主药盐酸氨基葡萄糖和硫酸软骨素钠的空白辅料(即乳矿物盐、酪蛋白磷酸肽、淀粉、透明质酸钠),照本品实施例1的制备工艺方法制成空白辅料对照品,按样品溶液制备方法制成空白辅料阴性对照溶液,滤过,取续滤液5μl注入色谱仪。结果显示:空白辅料对测定无干扰。空白溶剂阴性对照溶液:取乙腈-水(5:95)空白溶剂,滤过,取续滤液5μl,注入色谱仪。结果显示:在测定峰位置无峰,空白溶剂测定无干扰。
硫酸软骨素阴性对照溶液:取除去硫酸软骨素的其他配方成分,照本品实施例1的制备工艺方法制成缺失硫酸软骨素的空白对照品,按样品溶液制备方法制成硫酸软骨素阴性对照溶液,滤过,取续滤液5μl,注入色谱仪。结果显示:在硫酸软骨素处无峰,对测定无干扰。盐酸氨基葡萄糖阴性对照溶液:取除去盐酸氨基葡萄糖的其他配方成分,照本品实施例1的制备工艺方法制成缺失盐酸氨基葡萄糖的空白对照品,按样品溶液制备方法盐酸氨基葡萄糖阴性对照溶液,滤过,取续滤液5μl,注入色谱仪。结果显示:在氨基葡萄糖无峰,对测定无干扰。
2.7耐用性试验
(1)流动相流速变化
分别采用0.16ml/min(减少20%)、0.20ml/min、0.24ml/min(增加20%)三个不同流速照含量测定试验操作。
结果显示,3个不同流速试验的出峰顺序依次为硫酸软骨素、氨基葡萄糖,硫酸软骨素和氨基葡萄糖的分离度应均大于1.5,满足系统适应性的要求,含量RSD符合规定。结果见表2。
表2耐用性试验------不同流速试验结果
(2)不同流动相比例
分别采用乙腈-戊烷磺酸钠溶液(5:95)、乙腈比例增加5%、乙腈比例减少5%的3种流动相比例照含量测定试验操作。
结果显示,3种流动相比例试验的出峰顺序依次为硫酸软骨素、氨基葡萄糖,硫酸软骨素和氨基葡萄糖的分离度应均大于1.5,满足系统适应性的要求,含量RSD符合规定结果见表3。
表3耐用性试验------不同流动相比例试验结果
2.8线性范围
精密量取硫酸软骨素0.4504mg/mL和氨基葡萄糖0.5935mg/mL的对照品混合溶液0.2ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml分别置10ml量瓶中,分别加乙腈-水(5:95)溶液定量稀释至刻度,摇匀。取上述不同浓度对照品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图,以峰面积为纵坐标,对照品浓度为横坐标绘制标准曲线,进行线性回归。
硫酸软骨素钠线性回归方程为:y=19.457x–37.656,R=0.9999;
盐酸氨基葡萄糖线性回归方程为:y=4.522x+36.446,R=0.9995;
结果显示:硫酸软骨素钠进样浓度在9.008μg/mL~90.08μg/mL范围内呈良好的线性关系,盐酸氨基葡萄糖进样浓度在11.87μg/mL~118.7μg/mL内呈良好的线性关系。结果见表4~5,标准曲线见下图。
表4硫酸软骨素线性范围的测定结果
表5氨基葡萄糖线性范围的测定结果
硫酸软骨素线性范围曲线图如图1;氨基葡萄糖线性范围曲线图如图2。
2.9最小检测限
分别逐级稀释硫酸软骨素钠和盐酸氨基葡萄糖对照品溶液,并加入配方量辅料,测定两个检测主峰的峰高,同时测定相同条件下的色谱基线噪声,取基线噪声的3倍值作为最低检测限,求得硫酸软骨素钠的最低检测限为1.61ng,即本品中含有0.13%的硫酸软骨素钠即可检出;盐酸氨基葡萄糖的最低检测限为4.84ng,即本品中含有0.39%的盐酸氨基葡萄糖即可检出。
2.10最低定量限
分别逐级稀释硫酸软骨素钠和盐酸氨基葡萄糖对照品溶液,并加入配方量辅料,测定两个检测主峰的峰高,同时测定相同条件下的色谱基线噪声,取基线噪声的10倍值作为最小检出量,重复测定6次,求得硫酸软骨素钠的最小定量限为5.63ng,即本品中含有0.45%的硫酸软骨素钠即可定量;盐酸氨基葡萄糖的最小定量限为14.51ng,即本品中含有1.16%的盐酸氨基葡萄糖即可定量,两种成分6次的定量限RSD均小于5.0%,符合规定,结果见表6。
表6最小定量限试验结果
2.11稳定性试验
取同一样品溶液,照上述色谱条件,分别在不同时间点精密量取样品5μl,注入液相色谱仪,测定峰面积,记录色谱图。结果本品在不同时间内稳定。结果见表7。
表7稳定性试验结果
2.12仪器精密度
取同一样品溶液,重复进样6次,测定峰面积,计算RSD。结果显示,仪器精密度符合规定。结果见表8。
表8仪器精密度测定结果
2.13中间精密度试验
由三个不同实验人员,分别在三天,每人按样品测定方法重复测定2次,记录色谱图,计算样品的含量。结果显示,不同时间、不同人员样品的测定结果的RSD符合规定。结果见表9。
表9中间精密度测定结果
2.14重复性试验
分别按样品溶液制备称样量的80%、100%、120%取本品(批号:20141101),精密称定,按样品测定项下方法操作,每个浓度制备6份,分别精密量取5μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,计算含量。结果显示,3个不同浓度的重复性符合规定,结果见表10。
表10重复性测定结果
2.15准确度试验
精密称取硫酸软骨素9.0mg、盐酸氨基葡萄糖12mg(相当于处方量80%),分别将置同一250ml量瓶中,加入处方量辅料,按样品制备方法制备,重复3次;再精密称取硫酸软骨素11.25mg、盐酸氨基葡萄糖15mg(相当于处方量100%);硫酸软骨素13.50mg、盐酸氨基葡萄糖18mg(相当于处方量120%),同上法操作,重复3次。按样品含量测定项下方法操作,精密量取每个浓度的3份样品各5μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,计算含量,测定回收率。结果显示,回收率符合规定,回收率在95%~105%之间,结果见表11~12。
表11硫酸软骨素准确度试验结果
表12氨基葡萄糖准确度试验结果
2.17样品含量测定
样品溶液的制备:取本品20粒内容物研细成粉末,置105℃下干燥4h。取25mg样品,精密称定,置100ml容量瓶中,加入5ml乙腈,振荡使其分散均匀,再加入水适量,用超声波使溶解,并用水定容至刻度,摇匀。液相色谱仪测定前,样品溶液用0.2μm滤膜滤过。
对照品溶液的制备:取硫酸软骨素钠与盐酸氨基葡萄糖对照品适量,加乙腈-水(5:95)溶液稀释制成硫酸软骨素钠浓度约0.045mg/mL和盐酸氨基葡萄糖浓度约为0.060mg/mL的混合对照品溶液,用0.2μm滤膜滤过。
测定法:精密量取对照品溶液和供试品溶液各5μl,注入液相色谱仪,按外标法以峰面积计算,即得。
结果见表13。
表13含量测定结果
Claims (10)
1.一种增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:采用高效液相色谱检测样品中的盐酸氨基葡萄糖的含量和/或硫酸软骨素的含量;
按照下述比例制备样品溶液:取25-30mg样品加至5-10ml乙腈中,振荡使其分散均匀,再加入水用超声波使溶解,超声10-20min;再补加水定容至100ml;
按照下述比例制备乙腈-戊烷磺酸钠溶液,作为流动相:取戊烷磺酸钠0.87g,加乙腈-水溶液500mL溶解即得;
检测波长为190-192nm;
流动相流速0.15~0.25ml/min;
流动相比例为乙腈-戊烷磺酸钠溶液(4.75~5.25):(95.25~94.75)。
精密量取样品溶液5μl注入液相色谱仪,记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:所述流动相流速为0.16ml/min、0.20ml/min或0.24ml/min。
3.根据权利要求1所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:所述乙腈-水溶液按照体积比为5-10:95-90的比例配制。
4.根据权利要求3所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:所述乙腈-水溶液按照体积比为5:95的比例配制。
5.根据权利要求1所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:所述色谱图的出峰顺序依次为硫酸软骨素、氨基葡萄糖,硫酸软骨素与氨基葡萄糖的分离度均大于1.5,两者与邻近的杂质分离度均大于2.0。
6.根据权利要求1所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:所述硫酸软骨素钠进样浓度在9.008~90.08μg/mL范围内呈良好的线性关系,盐酸氨基葡萄糖进样浓度在11.87~118.7μg/mL内呈良好的线性关系。
7.根据权利要求1所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:所述硫酸软骨素钠的最低检测限为1.61ng,盐酸氨基葡萄糖的最低检测限为4.84ng。
8.根据权利要求1所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:得硫酸软骨素钠的最小定量限为5.63ng,盐酸氨基葡萄糖的最小定量限为14.51ng。
9.根据权利要求1所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:制备样品溶液前,先将样品研细成粉末,再置100-105℃下干燥4-5h。
10.根据权利要求1所述的增加骨密度保健食品中盐酸氨基葡萄糖与硫酸软骨素的含量测定方法,其特征在于:制备的样品溶液在使用前,用0.2μm的聚四氟乙烯膜(PTFE)滤膜滤过,所述的乙腈为色谱级;所述的戊烷磺酸钠的纯度≧99.5%。
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