CN115032377B - 一种粘多糖贮积症生物标记物及应用 - Google Patents

一种粘多糖贮积症生物标记物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种粘多糖贮积症生物标记物及应用。所述生物标志物包括：艾杜糖酸‑(1‑O‑4)‑N‑磺基胺基葡萄糖苷，艾杜糖酸‑(1‑O‑4)‑N,6‑二磺基胺基葡萄糖苷，4,5‑不饱和葡萄糖酸‑(1‑O‑3)‑6‑磺基‑N‑乙酰胺基半乳糖苷，4,5‑不饱和葡萄糖酸‑(1‑O‑4)‑N‑乙酰胺基葡萄糖苷，4,5‑不饱和葡萄糖酸‑(1‑O‑3)‑N‑磺基胺基葡萄糖苷。本发明根据粘多糖化合物的基本结构及粘多糖贮积症的发病机理分析，认识到尿液中特定的二糖单元可作为粘多糖贮积症筛查的生物标志物，并成功用于粘多糖贮积症的筛查和粘多糖贮积症I型，II型和IVA型的区分。

Description

一种粘多糖贮积症生物标记物及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种粘多糖贮积症生物标记物及应用。
背景技术
粘多糖亦称为糖胺聚糖，属于多糖类化合物，其化学结构由糖醛酸和氨基己糖组成的二糖单元交替重复排列，部分结构可含磺酸基团。根据具体组成的二糖单元不同，可分为硫酸类肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等。粘多糖广泛存在于哺乳动物体内，是骨基质和结缔组织细胞的主要成分。其在溶酶体中经由特定水解酶代谢降解，任何一种溶酶体酶的缺陷会造成其分解障碍在体内聚积，从而造成骨骼发育障碍、智力迟钝、肝脾肿大，同时尿液中粘多糖类排出增多，即，粘多糖贮积症（mucopolysaccharidosis，MPS）。根据酶缺陷类别和临床表现，将MPS分为I~VII等6型及若干亚型。其中，MPS I型，MPS II型及MPSIVA型为中国人群中发病率相对较高的亚型（分别占MPS发病率的10%~20%左右），其分别为体内艾杜糖醛酸酶、艾杜糖硫酸酯酶、半乳糖胺硫酸酯酶异常所致。
对于MPS I型，因艾杜糖醛酸酶异常，主要影响到体内硫酸类肝素、硫酸皮肤素的代谢，具体为其艾杜糖苷键断裂异常，影响多糖向后续二糖至单糖代谢，进而产生堆积。对于MPS II型，因艾杜糖硫酸酯酶异常，主要影响到体内硫酸类肝素、硫酸皮肤素的代谢，具体为其艾杜糖苷单元上磺酸基代谢异常，无法有效清除，影响后续代谢至堆积。和I型蓄积的化合相比，主要区别在于蓄积化合物上磺酸基团的保留。对于MPS IVA型，为半乳糖胺硫酸酯酶异常，主要影响到体内硫酸软骨素、硫酸角质素的代谢，进而产生对应的磺酸基半乳糖胺相关结构蓄积。和I型与II型不同，IVA型并不影响硫酸类肝素代谢。蓄积的粘多糖随尿液排出体内，通过外加裂解酶的方式，可以将尿液中分子量较大的粘多糖裂解为其对应的二糖单元，保留其特定的蓄积特异性结构。分析不同亚型的发病机理，做出推断，如果可以有效提取出生物基质中特定的二糖单元并对其进行检测，可实现对粘多糖贮积症筛查的同时，区分疾病亚型。
临床上粘多糖贮积症筛查的经典方法为比色法，对尿液中粘多糖总量进行快速检测，实现MPS患者和正常人群的区分。但因其不能区分具体粘多糖类型而无法对MPS具体亚型做出判断（参见申请号为201710883968.7的中国专利，公开了“一种粘多糖检测试剂盒”）。液相色谱串联质谱法因其灵敏度高、特异性强、监测通量高的特点，更适合于不同类型粘多糖的同时监测。
本发明通过液相色谱串联质谱检测平台，对不同亚型（I、II、IVA）的粘多糖贮积症患者样本和健康人群样本进行不同二糖单元的检测，筛选出特定的二糖单元，包括：艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷(I0S0)，艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷(I2S6)，4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷(D0a6)，4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷(D0A0)，4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷(D0S0)中联合使用作为生物标志物。可以实现粘多糖贮积症患者的筛查，并有效区分疾病亚型。目前尚无将此几种标志物联合使用用于粘多糖贮积症及相关亚型（I、II、IVA）区分的报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种粘多糖贮积症生物标记物及应用，具体涉及一种生物标志物在粘多糖贮积症筛查，尤其是亚型I型，II型和IVA型区分上的应用。
本发明的技术方案如下：
第一方面：
本发明提供一种生物标志物在制备粘多糖贮积症的筛查、不同亚型诊断或风险评估的产品中的用途，所述生物标志物为软骨素ABC酶和肝素裂解酶裂解的二糖单元；其中，所述肝素裂解酶包括肝素裂解酶I、肝素裂解酶II和肝素裂解酶III。
所述生物标志物包括艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷、艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷；
当标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷含量相对于正常人群升高，且能够检测到艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷时，即判定为MPS I型；
当标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷含量相对于正常人群升高，且能够检测到艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷(I2S6)时，即判定为MPS II型；
当标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷含量相对于正常人群未见变化，同时，标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷含量相对于正常人群升高，且未检出艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷和艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷时，即判定为MPS IVA型。
当标志物D0A0、D0S0、D0a6含量相对于正常人群升高，若同时检测到I0S0和I2S6时，则表明样本可能存在贮存不当，或者取样污染等情况，则需按照标准取样流程，取患者新鲜样本重新进行检测。
当仅有标志物D0A0、D0S0、D0a6升高时，则需按照标准取样流程，取患者新鲜样本，现取现测，若复测结果一致，需根据患者症状表现辅助判断，考虑为MPS I和MPS II型轻症或MPS VII型。
所述生物标志物的样本来自尿液、血清、血浆、全血、干血斑中的任意一种。
第二方面：
本发明提供一种检测如上所述的生物标志物的方法，包括如下步骤：
1）待测样品准备，所述待测样品为尿液样本；
2）样本酶解和蛋白沉淀：在待测的尿液样本中加入酶溶液和孵育缓冲液进行孵育，孵育后蛋白沉淀，离心取上清液；
3）上机检测：采用液相色谱串联质谱法对步骤2）得到的上清液进行检测，针对性检测二糖单元；（通过不同二糖单元的色谱峰面积比较，对粘多糖贮积症及不同亚型进行筛查。）
其中，步骤2）中，所述酶溶液包括软骨素裂解酶ABC溶液和肝素裂解酶溶液；其中，所述肝素裂解酶溶液包括肝素裂解酶I溶液、肝素裂解酶II溶液和肝素裂解酶III溶液。
步骤2）中，所述孵育温度为37±1℃，所述孵育时间为10~18 h；所述孵育缓冲液含Tris40-60mM，乙酸钠50-60 mM，pH为7.0-7.5（pH用浓盐酸或氢氧化钠溶液调节）。
进一步，步骤2）中：所述软骨素裂解酶ABC溶液的配置溶液为质量浓度0.01%牛血清白蛋白水溶液；
所述肝素裂解酶I溶液的配置溶液为含Tris 20-30 mM、氯化钠50 -60mM、氯化钙4-5 mM、质量浓度0.01-0.02%牛血清白蛋白，pH为7-7.5的溶液（pH用浓盐酸或氢氧化钠溶液调节）
所述肝素裂解酶II溶液的配置溶液为含Tris 20-30 mM、氯化钠50 -60mM、氯化钙4-5 mM、质量浓度0.01-0.02%牛血清白蛋白，pH为7-7.5的溶液（pH用浓盐酸或氢氧化钠溶液调节）；
所述肝素裂解酶III溶液的配置溶液为含Tris 20-30 mM、氯化钠50 -60mM、氯化钙4-5 mM、质量浓度0.01-0.02%牛血清白蛋白，pH为7-7.5的溶液（pH用浓盐酸或氢氧化钠溶液调节）；
所述软骨素裂解酶ABC用量 0.5-5 mu/样本，所述肝素裂解酶I的用量10-50 mu/样本、所述肝素裂解酶II的用量10-50 mu/样本、所述肝素裂解酶III的用量10-50 mu/样本。
进一步，所述肝素裂解酶I、所述肝素裂解酶II、所述肝素裂解酶III的最佳用量分别为20-50 mu/样本，含量过低则达不到有效的酶解效果。
步骤3）中，所述二糖单元为所述软骨素ABC酶和所述肝素裂解酶I、肝素裂解酶II、和肝素裂解酶III裂解的二糖单元，所述二糖单元包括艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷，艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷，4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷，4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷，4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷中的。
步骤3）中，所述液相条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide ，长度100mm，内径×2.1 mm，填料粒径1.7 um；
流动相：A：含有20mM乙酸铵的水溶液；B：乙腈；
洗脱梯度条件为：
Figure 495632DEST_PATH_IMAGE001
进一步，步骤3）中，所述质谱方法：
离子源：电喷雾离子源；
检测模式：负离子，多反应监测；
离子源参数为：电喷雾电压：3000 V；离子源温度：500℃；气帘气：30 psi；雾化气（GAS1）：50 psi；辅助加热气（GAS2）：50 psi；
MRM监测信息为：
Figure 841163DEST_PATH_IMAGE002
本发明的关键之处在于认识到存在于尿液中的某些二糖单元可作为粘多糖贮积症的生物标志物，尤其是用于亚型I型，II型和IVA型的区分。而不是现有技术中只能通过筛查粘多糖整体变化来判定疾病，但无法区分具体亚型。本发明通过对粘多糖类化合物结构及粘多糖贮积症不同亚型发病机理分析，并结合不同粘多糖贮积症亚型实际样本验证，筛选出生物标志物包括：艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷(I0S0)，艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷(I2S6)，4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷(D0a6)，4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷(D0A0)，4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷(D0S0)。可用作粘多糖贮积症筛查，尤其是亚型I型，II型和IVA型的区分。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明通过对粘多糖类化合物结构及粘多糖贮积症不同亚型发病机理分析，推断了尿液等生物基质中的特定二糖单元可以作为粘多糖贮积症筛选和不同亚型区分的生物标志物。通过测定了不同亚型的粘多糖贮积症人群样本，包括I型2例，II型3例，IVA型5例，健康人群4例，对推断的二糖单元作为生物标志物的有效性进行了验证。结果表明对比健康人群和疾病人群，特定的生物标志物或其组合的含量具有显著性差异，T检验P值小于0.05。可有效实现MPS疾病的筛查，并对MPS I型、MPS II型、MPS IVA区分。由此可将这些具有显著性差异化合物作为诊断标志物用于粘多糖贮积症筛查和亚型的区分；
（2）通过采用液相色谱串联质谱的监测方法，实现了尿液中多种粘多糖的同时监测；
（3）通过采用裂解酶孵育的方法，有效的保护并保留了硫酸软骨素、硫酸肝素的疾病特异性二糖单元，确保其磺酸基团不受影响；
（4）通过采用非衍生化的样本处理方式，缩短了样本前处理时间，降低了操作复杂度；
（5）通过采用本发明方法，实现了黏多糖贮积症的有效筛查和对不同粘多糖贮积症亚型（I型，II型，IVA型）的有效区分。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1. 健康人群尿液样本中I0S0（Rt 6.19），I2S6（Rt 6.24），D0a6（Rt 4.96），D0A0（Rt 5.11），D0S0（Rt 5.68）的色谱图。
图2. MPS I型患者尿液样本中I0S0（Rt 6.19），I2S6（Rt 6.24），D0a6（Rt 4.96），D0A0（Rt 5.11），D0S0（Rt 5.68）的色谱图。
图3. MPS II型患者尿液样本中I0S0（Rt 6.19），I2S6（Rt 6.24），D0a6（Rt 4.96），D0A0（Rt 5.11），D0S0（Rt 5.68）的色谱图。
图4. MPS IVA型患者尿液样本中I0S0（Rt 6.19），I2S6（Rt 6.24），D0a6（Rt4.96），D0A0（Rt 5.11），D0S0（Rt 5.68）的色谱图。
图5.各生物标志物在不同人群样本中的色谱峰面积箱型图。（*与健康人群相比，p< 0.01； #与健康人群相比，p < 0.05）。
图6. MPS I型和MPS II型尿液样本经4-8℃冰箱和室温条件下交替存放一个月，非还原端标志物I0S0和I2S6色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下述实施例中：
软骨素裂解酶ABC（货号：C2905）、肝素裂解酶I（货号：H2519）、肝素裂解酶II（货号：H6512）、肝素裂解酶III（货号：H8891）均购自sigma公司。
实施例 1
1. 样本酶解：取尿液样本20 μL，置于1.5 mL EP管中，加入软骨素裂解酶ABC（5mu/样本），肝素裂解酶I（20 mu/样本），肝素裂解酶II（20 mu/样本），肝素裂解酶III（20mu/样本），孵育缓冲液100 μL；涡旋10 s后，置于37℃恒温孵育12 h；
软骨素裂解酶ABC溶液的配置：取软骨素裂解酶ABC粉末，加入质量浓度0.01%牛血清白蛋白水溶液；配置后软骨素裂解酶ABC溶液中含酶0.5 mu/uL；
肝素裂解酶I溶液的配置：取肝素裂解酶I粉末，加入含Tris 20 mM、氯化钠50mM、氯化钙4mM、质量浓度0.01%牛血清白蛋白，pH为7.5的溶液；配置后肝素裂解酶I溶液中含酶2mu/uL；
肝素裂解酶II溶液的配置：取肝素裂解酶II粉末，加入含Tris 20 mM、氯化钠50mM、氯化钙4 mM、质量浓度0.01%牛血清白蛋白，pH为7.5的溶液；配置后肝素裂解酶II溶液中含酶2mu/uL；
肝素裂解酶III溶液的配置：取肝素裂解酶III粉末，加入含Tris 20 mM、氯化钠50mM、氯化钙4 mM、质量浓度0.01%牛血清白蛋白，pH为7.5的溶液；配置后肝素裂解酶III溶液中含酶2mu/uL。
2. 蛋白沉降：向步骤（1）EP管内加入乙腈100 μL，涡旋10 s，于4℃下，10000g离心10 min，收集上清液150 μL等待分析。
3. 对步骤（2）得到上清液，按下述液相色谱条件和质谱条件进行样本采集。记录色谱图和各指标色谱峰面积。
3.1液相色谱条件：
1)色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide ，长度100mm，内径2.1 mm，填料粒径1.7 um，柱温40℃；
2)流动相：A：含有20mM乙酸铵的水溶液；B：乙腈；
3)进样体积：2 μL；
4)洗脱梯度条件见表1；
表1 液相色谱洗脱梯度表
Figure DEST_PATH_IMAGE003
3.2. 质谱条件：
1)离子源：电喷雾离子源；
2)检测模式：负离子，多反应监测；
3)离子源参数为：电喷雾电压：3000 V；离子源温度：500℃；气帘气：30 psi，雾化气（GAS1）：50 psi；辅助加热气（GAS2）：50 psi；
4)MRM监测信息见表2；
表2.MRM监测信息
Figure 725942DEST_PATH_IMAGE004
实施例2
按实施例1提供的方法，测定正常人群、MPS I型、MPS II型、MPS IVA型患者尿液样本，取各人群典型样本，每样本平行处理3份，记录不同指标色谱峰面积考察方法重复性，各指标色谱峰面积RSD%小于15%，表明方法对于实际样本检测重复性良好。具体结果见表3。
表3 方法重复性结果（RSD，%）
Figure 524134DEST_PATH_IMAGE005
实施例3
按实施例1描述方法，测定正常人群、MPS I型、MPS II型、MPS IVA型患者尿液样本，对不同监测指标色谱峰面积进行积分比较。
结果见图1-图4，其中：
图1. 健康人群尿液样本中I0S0（Rt 6.19），I2S6（Rt 6.24），D0a6（Rt 4.96），D0A0（Rt 5.11），D0S0（Rt 5.68）的色谱图。
图2. MPS I型患者尿液样本中I0S0（Rt 6.19），I2S6（Rt 6.24），D0a6（Rt 4.96），D0A0（Rt 5.11），D0S0（Rt 5.68）的色谱图。
图3. MPS II型患者尿液样本中I0S0（Rt 6.19），I2S6（Rt 6.24），D0a6（Rt 4.96），D0A0（Rt 5.11），D0S0（Rt 5.68）的色谱图。
图4. MPS IVA型患者尿液样本中I0S0（Rt 6.19），I2S6（Rt 6.24），D0a6（Rt4.96），D0A0（Rt 5.11），D0S0（Rt 5.68）的色谱图。
和正常人群相比，MPS I型人群样本中D0A0、D0S0、D0a6、I0S0色谱峰面积显著提高，其中，I0S0在正常人群样本中未检出；MPS II型人群样本中D0A0、D0S0、D0a6、I2S6色谱峰面积显著提高，其中，I2S6为在正常人群样本中未检出；MPS IVA型人群样本中，D0a6色谱峰面积显著提高，D0A0、D0S0与正常人群无差异，I0S0、I2S6未检出。此5种指标联合使用，可有效筛查MPS疾病样本，并对MPS I型、MPS II型、MPS IVA区分。
当任意一种标志物含量相对于正常人群出现显著性升高时，均怀疑为MPS阳性；
当标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷(D0A0)、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷(D0S0)、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷升高(D0a6)，且能够检测到艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷(I0S0)时，即判定为MPS I型；
当标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷(D0A0)、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷(D0S0)、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷升高(D0a6)升高，且能够检测到艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷(I2S6)时，即判定为MPS II型；
当标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷(D0A0)、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷(D0S0)未见显著变化，同时，标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷升高(D0a6)出现显著升高，且未检出艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷(I0S0)和艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷(I2S6)时，即判定为MPS IVA型。
当标志物D0A0、D0S0、D0a6含量相对于正常人群升高，若同时检测到I0S0和I2S6时，则表明样本可能存在贮存不当，或者取样污染等情况，则需按照标准取样流程，取患者新鲜样本重新进行检测；
当仅有标志物D0A0、D0S0、D0a6升高时，则需按照标准取样流程，取患者新鲜样本，现取现测，若复测结果一致，需根据患者症状表现辅助判断，考虑为MPS I和MPS II型轻症或MPS VII型；
典型样本的色谱峰面积见表4。各生物标志物在不同人群样本中的色谱峰面积箱型图见图5，（*与健康人群相比，p < 0.01； #与健康人群相比，p < 0.05）。
表4. 各检测指标在不同人群样本中代表性色谱峰面积
Figure 988614DEST_PATH_IMAGE006
*与健康人群相比，p< 0.01; #与健康人群相比，p< 0.05。
对比例1
按实施例1的方法，选择MPS I型、MPS II型患者尿液样本，于4-8℃冰箱和室温条件下交替存放一个月，检测存放前后I0S0、I2S6指标变化。结果如图6（MPS I型和MPS II型尿液样本经4-8℃冰箱和室温条件下交替存放一个月，非还原端标志物I0S0和I2S6色谱图）。其中，（A）为MPS II型尿液样本存放前检测，I0S0（7.79）和I2S6（8.54）叠加色谱图；（B）为MPS II型尿液样本存放后检测，I0S0（7.79）和I2S6（8.54）叠加色谱图；（C）为MPS I型尿液样本存放前检测，I0S0（7.79）色谱图；（D）为MPS I型尿液样本存放后检测，I0S0（7.79）色谱图。由图6可知，在此种存放条件下，MPS II型尿液样本中的I2S6信号会逐步降低。且因其结构上脱去一分子磺酸基团后即产生I0S0相同结构，久放后，在MPS II型尿液样本内亦可检出I0S0干扰信号。MPS I型尿液样本中I0S0信号久放后减弱至消失，可能与存放过程中，环境因素促使磺酸基团逐步脱落、或不同结构GAG自身稳定性有关。因此，为更好的对疾病亚型进行区分，需在此两种标志物的基础上，加入D0A0、D0S0、D0a6三种指标共同判定。
对比例2
按实施例1的方法，选择一例 MPS II型轻症患者尿液样本进行检测，尿液样本送检后经过一次冻融过程（-20℃-室温），检测结果与实施例3中健康人群检测结果比对。具体结果如表5。其中，MPS II型轻症患者中D0A0、D0S0、D0a6三种指标与健康样本平均值相比，均有3倍以上明显升高，I2S6和I0S0标志物未检出。原因在于，该患者属于轻症患者，而轻症患者GAG升高水平不明显，且经体外裂解酶处理时，主要产生为内部二糖标志物（D0A0、D0S0、D0a6），每当量GAG只能产生一当量的非还原端基标志物（I2S6）。非还原端基标志物含量相对较低，检测信号相对弱。
表5. MPS II型轻症患者尿液样本经冻存后初次检测结果
Figure 188651DEST_PATH_IMAGE007
。
由对比例1和2可知，当对轻症样本进行早期筛查，或在送检样本因运输、存储等条件保存不当时，仅依靠非还原端标志物（I2S6、I0S0）对疾病阳性或亚型的判定，存在一定漏判风险，因此本发明，考虑到临床样本实际存放、运输、标志物稳定性等多方面原因。最终采用两种非还原端二糖标志物（I2S6、I0S0），三种内部二糖单元标志物（D0A0、D0S0、D0a6），共同实现对于MPS阳性筛查，MPS I型，MPS II型和MPS IVA型的判定。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种生物标志物在制备粘多糖贮积症的筛查、不同亚型诊断或风险评估的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物为软骨素ABC酶和肝素裂解酶裂解的二糖单元；其中，所述肝素裂解酶包括肝素裂解酶I、肝素裂解酶II和肝素裂解酶III；
所述生物标志物包括艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷、艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷；
用于区分MPS I型的生物标志物为4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷和艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷；当标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷含量相对于正常人群升高，且能够检测到艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷时，即判定为MPS I型；
用于区分MPS II型的生物标志物为4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷和艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷；当标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷含量相对于正常人群升高，且能够检测到艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷时，即判定为MPSII型；
用于区分MPS IVA型的生物标志物为4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷含量、艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷和艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷；当标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-4)-N-乙酰胺基葡萄糖苷、4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-N-磺基胺基葡萄糖苷含量相对于正常人群未见变化，同时，标志物4,5-不饱和葡萄糖酸-(1-O-3)-6-磺基-N-乙酰胺基半乳糖苷含量相对于正常人群升高，且未检出艾杜糖酸-(1-O-4)-N-磺基胺基葡萄糖苷和艾杜糖酸-(1-O-4)-N,6-二磺基胺基葡萄糖苷时，即判定为MPS IVA型。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物的样本来自尿液、血清、血浆、全血、干血斑中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物的检测方法包括如下步骤：
1）待测样品准备，所述待测样品为尿液样本；
2）样本酶解和蛋白沉淀：在待测的尿液样本中加入酶溶液和孵育缓冲液进行孵育，孵育后蛋白沉淀，离心取上清液；
3）上机检测：采用液相色谱串联质谱法对步骤2）得到的上清液进行检测，针对性检测二糖单元；
其中，步骤2）中，所述酶溶液包括软骨素裂解酶ABC溶液和肝素裂解酶溶液；其中，所述肝素裂解酶溶液包括肝素裂解酶I溶液、肝素裂解酶II溶液和肝素裂解酶III溶液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2）中，孵育温度为37±1℃，孵育时间为10~18 h；所述孵育缓冲液含Tris40-60mM，乙酸钠50-60 mM，pH为7.0-7.5。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2）中：
所述软骨素裂解酶ABC溶液的配置溶液为质量浓度0.01%牛血清白蛋白水溶液；
所述肝素裂解酶I溶液的配置溶液为含Tris 20-30 mM、氯化钠50 -60mM、氯化钙4-5mM、质量浓度0.01-0.02%牛血清白蛋白，pH为7-7.5的溶液；
所述肝素裂解酶II溶液的配置溶液为含Tris 20-30 mM、氯化钠50 -60mM、氯化钙4-5mM、质量浓度0.01-0.02%牛血清白蛋白，pH为7-7.5的溶液；
所述肝素裂解酶III溶液的配置溶液为含Tris 20-30 mM、氯化钠50 -60mM、氯化钙4-5mM、质量浓度0.01-0.02%牛血清白蛋白，pH为7-7.5的溶液；
所述软骨素裂解酶ABC用量 0.5-5 mu/样本，所述肝素裂解酶I的用量10-50 mu/样本，所述肝素裂解酶II的用量10-50 mu/样本，所述肝素裂解酶III的用量10-50 mu/样本。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3）中，
液相条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide，长度100mm，内径2.1 mm，填料粒径1.7 um；
流动相：A：含有20mM乙酸铵的水溶液；B：乙腈；
洗脱梯度条件为：
Figure 49611DEST_PATH_IMAGE001
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3）中，质谱方法：
离子源：电喷雾离子源；
检测模式：负离子，多反应监测；
离子源参数为：电喷雾电压：3000 V；离子源温度：500℃；气帘气：30 psi；雾化气GAS1：50 psi；辅助加热气GAS2：50 psi；
MRM监测信息为：
Figure 179241DEST_PATH_IMAGE002
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