JP2883175B2 - 糖構造解析方法及び糖構造解析用キット - Google Patents
糖構造解析方法及び糖構造解析用キットInfo
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- JP2883175B2 JP2883175B2 JP20119290A JP20119290A JP2883175B2 JP 2883175 B2 JP2883175 B2 JP 2883175B2 JP 20119290 A JP20119290 A JP 20119290A JP 20119290 A JP20119290 A JP 20119290A JP 2883175 B2 JP2883175 B2 JP 2883175B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、糖の構造解析において、糖構造解析のため
の一連の反応を、同一容器内で効率よく行う、糖の微量
構造解析のための糖構造解析方法、及びそれに使用する
キットに関する。
の一連の反応を、同一容器内で効率よく行う、糖の微量
構造解析のための糖構造解析方法、及びそれに使用する
キットに関する。
複合糖質は生体内の重要な構成成分であり、その糖鎖
は細胞表面における種々の認識現象に関与していると考
えられている。近年複合糖質の生理活性とその糖鎖構造
との関係の研究が非常に活発となり、それに伴い微量の
試料を用いても構造解析のできる種々の新しい方法が開
発されつつあり、糖鎖構造解析方法の一つである糖組成
分析においても高感度な分析方法が要求されてきてい
る。
は細胞表面における種々の認識現象に関与していると考
えられている。近年複合糖質の生理活性とその糖鎖構造
との関係の研究が非常に活発となり、それに伴い微量の
試料を用いても構造解析のできる種々の新しい方法が開
発されつつあり、糖鎖構造解析方法の一つである糖組成
分析においても高感度な分析方法が要求されてきてい
る。
現在行われている糖組成分析方法には、糖のメチル配
糖体のトリメチルシリル化物のガスクロマトグラフィー
による方法〔スウィーリー（Sweeley,C.C）ら、ジャー
ナル オブ アメリカン ケミカル ソサイエティー
（J.Amer.Chem.Soc.）第85巻、第2497〜2507頁（196
3）、及びメガ（Mega,T.）ら、アナリティカル バイオ
ケミストリー（Anal.Biochem.）第119巻、第17〜24頁
（1982）〕があるが、糖を誘導体化する操作が煩雑な
上、分析の感度はナノモルレベルであり、アミノ糖の定
量は困難であるなどの課題がある。また他に、糖を金電
極パルス電解検出する高速液体クロマトグラフィーによ
る方法〔ハーディ（Hardy,M.R.）ら、アナリティカル
バイオケミストリー、第170巻、第54−62頁（1988）〕
は、糖を標識しないで分析するので操作自体は簡便であ
るが、その分析の感度はナノモルレベルであり、アミノ
糖の定量もやはり困難である。
糖体のトリメチルシリル化物のガスクロマトグラフィー
による方法〔スウィーリー（Sweeley,C.C）ら、ジャー
ナル オブ アメリカン ケミカル ソサイエティー
（J.Amer.Chem.Soc.）第85巻、第2497〜2507頁（196
3）、及びメガ（Mega,T.）ら、アナリティカル バイオ
ケミストリー（Anal.Biochem.）第119巻、第17〜24頁
（1982）〕があるが、糖を誘導体化する操作が煩雑な
上、分析の感度はナノモルレベルであり、アミノ糖の定
量は困難であるなどの課題がある。また他に、糖を金電
極パルス電解検出する高速液体クロマトグラフィーによ
る方法〔ハーディ（Hardy,M.R.）ら、アナリティカル
バイオケミストリー、第170巻、第54−62頁（1988）〕
は、糖を標識しないで分析するので操作自体は簡便であ
るが、その分析の感度はナノモルレベルであり、アミノ
糖の定量もやはり困難である。
武本らの２−アミノピリジンを用いて糖を蛍光標識
し、高速液体クロマトグラフィーにより糖組成分析を行
う方法〔タケモト（Takemoto,H.）ら、アナリティカル
バイオケミストリー第145巻、第245〜250頁（198
4）〕は試料の酸加水分解の工程、糖のＮ−アセチ
ル化の工程、糖の２−アミノピリジンによる蛍光標識
化の工程、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によ
る蛍光標識化糖の検出の工程より成り、非常に高感度な
分析方法であるが、各工程の操作が煩雑で、長時間を要
する。本発明者らは先に、２−アミノピリジンを用いた
留去可能なピリジル−（２）−アミノ化試薬〔以下、ピ
リジル−（２）−アミノ化をPA化と略記する〕と還元剤
を用いることにより、糖の蛍光標識化反応終了後、濃縮
乾固方法により、過剰の試薬を除去でき、従来必要であ
ったゲルろ過クロマトグラフィーによる糖蛍光標識化物
の精製工程を省略する糖組成分析の簡便方法を見出して
いる〔スズキ（Suzuki,J.）ら、生化学、第60巻、第689
頁（1988）〕。しかし、この方法においても、トリフル
オロ酢酸による試料の酸加水分解後の試料のＮ−アセチ
ル化反応において、従来方法で用いられている重炭酸ナ
トリウムと無水酢酸の系を用いるため、Ｎ−アセチル化
反応終了後、過剰の試薬の除去のためのイオン交換クロ
マトグラフィー等による試料の脱塩操作が必要であり、
このため糖組成分析の一連の反応を同一の容器内で行う
ことができず、糖の微量組成分析を行うに際し、操作
性、定量性の点で問題があった。
し、高速液体クロマトグラフィーにより糖組成分析を行
う方法〔タケモト（Takemoto,H.）ら、アナリティカル
バイオケミストリー第145巻、第245〜250頁（198
4）〕は試料の酸加水分解の工程、糖のＮ−アセチ
ル化の工程、糖の２−アミノピリジンによる蛍光標識
化の工程、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によ
る蛍光標識化糖の検出の工程より成り、非常に高感度な
分析方法であるが、各工程の操作が煩雑で、長時間を要
する。本発明者らは先に、２−アミノピリジンを用いた
留去可能なピリジル−（２）−アミノ化試薬〔以下、ピ
リジル−（２）−アミノ化をPA化と略記する〕と還元剤
を用いることにより、糖の蛍光標識化反応終了後、濃縮
乾固方法により、過剰の試薬を除去でき、従来必要であ
ったゲルろ過クロマトグラフィーによる糖蛍光標識化物
の精製工程を省略する糖組成分析の簡便方法を見出して
いる〔スズキ（Suzuki,J.）ら、生化学、第60巻、第689
頁（1988）〕。しかし、この方法においても、トリフル
オロ酢酸による試料の酸加水分解後の試料のＮ−アセチ
ル化反応において、従来方法で用いられている重炭酸ナ
トリウムと無水酢酸の系を用いるため、Ｎ−アセチル化
反応終了後、過剰の試薬の除去のためのイオン交換クロ
マトグラフィー等による試料の脱塩操作が必要であり、
このため糖組成分析の一連の反応を同一の容器内で行う
ことができず、糖の微量組成分析を行うに際し、操作
性、定量性の点で問題があった。
また、複合糖質から、糖鎖を化学的な方法例えば、ヒ
ドラジン分解方法で切り出し、その後糖鎖のＮ−アセチ
ル化を行い、次に蛍光標識化を行い、この標識化物のHP
LCによる溶出位置と標準物質の溶出位置を比較し、糖鎖
の構造を解析する方法においても、Ｎ−アセチル化の段
階で同様な問題点を有していた。
ドラジン分解方法で切り出し、その後糖鎖のＮ−アセチ
ル化を行い、次に蛍光標識化を行い、この標識化物のHP
LCによる溶出位置と標準物質の溶出位置を比較し、糖鎖
の構造を解析する方法においても、Ｎ−アセチル化の段
階で同様な問題点を有していた。
本発明の目的は、糖のＮ−アセチル化の段階におい
て、留去可能な試薬を見出し、酸加水分解、Ｎ−アセチ
ル化反応、蛍光標識化反応等の一連の化学反応を同一の
容器内で、連続して行うことにより、簡便かつ高感度に
糖構造解析を行うための方法及びキットを提供すること
にある。
て、留去可能な試薬を見出し、酸加水分解、Ｎ−アセチ
ル化反応、蛍光標識化反応等の一連の化学反応を同一の
容器内で、連続して行うことにより、簡便かつ高感度に
糖構造解析を行うための方法及びキットを提供すること
にある。
［課題を解決するための手段］ 本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は糖の構造
解析方法に関し、糖の構造解析方法において、水性媒体
中における糖の選択的Ｎ−アセチル化用試薬として、ピ
リジン、水性媒体としての水又は水とメタノールとの混
合媒体、アセチル化剤としての無水酢酸を用いることを
特徴とする。
解析方法に関し、糖の構造解析方法において、水性媒体
中における糖の選択的Ｎ−アセチル化用試薬として、ピ
リジン、水性媒体としての水又は水とメタノールとの混
合媒体、アセチル化剤としての無水酢酸を用いることを
特徴とする。
本発明の第２の発明は、糖の構造解析用キットに関
し、水性媒体中における糖の選択的Ｎ−アセチル化用試
薬として、水若しくは水及びメタノールと、ピリジン
と、無水酢酸とを用いることを特徴とする。
し、水性媒体中における糖の選択的Ｎ−アセチル化用試
薬として、水若しくは水及びメタノールと、ピリジン
と、無水酢酸とを用いることを特徴とする。
本発明における糖とは、単糖、オリゴ糖、多糖、又は
糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質を指す。
糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質を指す。
糖組成分析を行う場合、まず試料の酸加水分解を行う
が、この方法としては公知方法であるトリフルオロ酢酸
や塩酸、あるいはそれらの両方を使う方法があり、例え
ば試料を4Mトリフルオロ酢酸中で100℃、３時間加熱
し、酸加水分解を行うことができる。酸加水分解後、過
剰の試薬を留去し、次に試料中にＮ−アセチルアミノ糖
が含有される場合、酸加水分解によりＮ−アセチルアミ
ノ糖のＮ−アセチル基が水解されているため、Ｎ−アセ
チル基を再結合させるＮ−アセチル化を行う。Ｎ−アセ
チル化用の試薬としては、従来用いられている重炭酸ナ
トリウムと無水酢酸の系では反応終了後、過剰の試薬が
留去不能なため、留去可能なＮ−アセチル化用試薬を用
いる。留去可能な試薬としては、例えばピリジン、メタ
ノールの混合液と無水酢酸の系があり、この系を用い、
常温で30分間時々かくはんすることにより、試料のＮ−
アセチル化を行うことができる。反応終了物は濃縮乾
固、凍結減圧乾燥等により、容易に過剰のＮ−アセチル
化用試薬を除去することができる。このピリジン、メタ
ノールの混合液と無水酢酸の系は留去可能な良い系であ
るが、この系を用いる場合、糖の種類によっては、その
蛍光標識化物のHPLCでの溶出位置が、他の不純物の溶出
位置と重なるときがあり、このような場合は、更に他の
系を用いるのが好ましい。好ましい例としては、水、ピ
リジン、メタノールと無水酢酸の系がある。Ｎ−アセチ
ル化試薬に水を加えることにより、不純物と蛍光標識化
糖の溶出位置の重なりがなくなり、糖の組成分析の精度
は更に上昇する。この水、ピリジン、メタノール及び無
水酢酸の使用比は、例えば容積比で水：ピリジン：メタ
ノール：無水酢酸＝10:15:30:2の割合で用いれば良い。
Ｎ−アセチル化の反応条件も、水を加えない場合と同様
に行える。反応終了後、減圧下濃縮し、過剰の試薬を留
去し、その後凍結減圧乾燥を行う場合、Ｎ−アセチル化
物を少量の水に溶解し、凍結減圧乾燥することにより、
更に、HPLCでの分析能が向上する。また、水、ピリジン
と無水酢酸の系でも良い。
が、この方法としては公知方法であるトリフルオロ酢酸
や塩酸、あるいはそれらの両方を使う方法があり、例え
ば試料を4Mトリフルオロ酢酸中で100℃、３時間加熱
し、酸加水分解を行うことができる。酸加水分解後、過
剰の試薬を留去し、次に試料中にＮ−アセチルアミノ糖
が含有される場合、酸加水分解によりＮ−アセチルアミ
ノ糖のＮ−アセチル基が水解されているため、Ｎ−アセ
チル基を再結合させるＮ−アセチル化を行う。Ｎ−アセ
チル化用の試薬としては、従来用いられている重炭酸ナ
トリウムと無水酢酸の系では反応終了後、過剰の試薬が
留去不能なため、留去可能なＮ−アセチル化用試薬を用
いる。留去可能な試薬としては、例えばピリジン、メタ
ノールの混合液と無水酢酸の系があり、この系を用い、
常温で30分間時々かくはんすることにより、試料のＮ−
アセチル化を行うことができる。反応終了物は濃縮乾
固、凍結減圧乾燥等により、容易に過剰のＮ−アセチル
化用試薬を除去することができる。このピリジン、メタ
ノールの混合液と無水酢酸の系は留去可能な良い系であ
るが、この系を用いる場合、糖の種類によっては、その
蛍光標識化物のHPLCでの溶出位置が、他の不純物の溶出
位置と重なるときがあり、このような場合は、更に他の
系を用いるのが好ましい。好ましい例としては、水、ピ
リジン、メタノールと無水酢酸の系がある。Ｎ−アセチ
ル化試薬に水を加えることにより、不純物と蛍光標識化
糖の溶出位置の重なりがなくなり、糖の組成分析の精度
は更に上昇する。この水、ピリジン、メタノール及び無
水酢酸の使用比は、例えば容積比で水：ピリジン：メタ
ノール：無水酢酸＝10:15:30:2の割合で用いれば良い。
Ｎ−アセチル化の反応条件も、水を加えない場合と同様
に行える。反応終了後、減圧下濃縮し、過剰の試薬を留
去し、その後凍結減圧乾燥を行う場合、Ｎ−アセチル化
物を少量の水に溶解し、凍結減圧乾燥することにより、
更に、HPLCでの分析能が向上する。また、水、ピリジン
と無水酢酸の系でも良い。
試料のＮ−アセチル化後、該試料の蛍光標識化は、例
えば特開平１−10177号公報記載の方法により行えば良
く、このとき、留去可能なPA化試薬、及び還元剤、例え
ば２−アミノピリジン1gを酢酸0.468ml及びメタノール
0.6mlに溶解したPA化試薬や、ジメチルアミンボラン59m
gを酢酸1mlに溶解した還元剤を用いれば良い。
えば特開平１−10177号公報記載の方法により行えば良
く、このとき、留去可能なPA化試薬、及び還元剤、例え
ば２−アミノピリジン1gを酢酸0.468ml及びメタノール
0.6mlに溶解したPA化試薬や、ジメチルアミンボラン59m
gを酢酸1mlに溶解した還元剤を用いれば良い。
蛍光標識化後、過剰の試薬を、例えばメタノールを添
加し共沸操作を行うことにより除去できる。このよう
に、Ｎ−アセチル化の段階で、留去可能なＮ−アセチル
化用試薬を用いることにより、糖の酸加水分解から、蛍
光標識化までの一連の反応を同一容器内で行うことが可
能となる。この蛍光標識化物は、例えば水に溶解後、例
えばイオン交換樹脂クロマトグラフィー、逆相ODSカラ
ムクロマトグラフィー、順相カラムクロマトグラフィー
等により効率よく分離することができる。
加し共沸操作を行うことにより除去できる。このよう
に、Ｎ−アセチル化の段階で、留去可能なＮ−アセチル
化用試薬を用いることにより、糖の酸加水分解から、蛍
光標識化までの一連の反応を同一容器内で行うことが可
能となる。この蛍光標識化物は、例えば水に溶解後、例
えばイオン交換樹脂クロマトグラフィー、逆相ODSカラ
ムクロマトグラフィー、順相カラムクロマトグラフィー
等により効率よく分離することができる。
また、生体内の複合糖質より、試料を、例えばヒドラ
ジン分解方法で切り出す方法においては、無水ヒドラジ
ンで試料を100℃、10時間処理し、過剰の試薬をトルエ
ンと共沸留去し、次いで上記方法に準じ、糖鎖のＮ−ア
セチル化、蛍光標識化を行うことにより、同一容器内で
効率よくこれらの反応を進行させることができる。
ジン分解方法で切り出す方法においては、無水ヒドラジ
ンで試料を100℃、10時間処理し、過剰の試薬をトルエ
ンと共沸留去し、次いで上記方法に準じ、糖鎖のＮ−ア
セチル化、蛍光標識化を行うことにより、同一容器内で
効率よくこれらの反応を進行させることができる。
本発明のＮ−アセチル化用試薬をそろえてキットとし
ておくことで目的試料の糖構造解析を簡便に行うことが
できる。
ておくことで目的試料の糖構造解析を簡便に行うことが
できる。
キット中に含有される試薬としては、留去可能なＮ−
アセチル化試薬であれば良いが、例えば、水、ピリジ
ン、メタノールをそれぞれ単独、又は混合したものと、
無水酢酸を含有させれば良い。このほか、糖切り出し用
の無水ヒドラジン、酸加水分解用のトリフルオロ酢酸、
蛍光標識化用の留去可能なPA化試薬及び還元剤を含有さ
せても良い。また、HPLCを行う場合の標準物質、例えば
PA化されたGlcNAc、GalNAc、Man、Gal、Fuc等を含有さ
せても良く、また本発明者らが先に出願した特開平３−
277298号公報中に記載のPA化オリゴ糖（表１）を含有さ
せても良く、更にはHPLC用カラムをそろえておいても良
い。
アセチル化試薬であれば良いが、例えば、水、ピリジ
ン、メタノールをそれぞれ単独、又は混合したものと、
無水酢酸を含有させれば良い。このほか、糖切り出し用
の無水ヒドラジン、酸加水分解用のトリフルオロ酢酸、
蛍光標識化用の留去可能なPA化試薬及び還元剤を含有さ
せても良い。また、HPLCを行う場合の標準物質、例えば
PA化されたGlcNAc、GalNAc、Man、Gal、Fuc等を含有さ
せても良く、また本発明者らが先に出願した特開平３−
277298号公報中に記載のPA化オリゴ糖（表１）を含有さ
せても良く、更にはHPLC用カラムをそろえておいても良
い。
（表１中Ｇはガラクトース、GNはＮ−アセチルグルコサ
ミン、Ｍはマンノース、Ｆはフコース、Ｘはキシロー
ス、NANAはＮ−アセチルノイラミン酸、ChSはコンドロ
イチン硫酸、ChS・Ａはコンドロイチン硫酸Ａ、ChS・Ｂ
はコンドロイチン硫酸Ｂ、ChS・Ｃはコンドロイチン硫
酸Ｃ、ChS・Ｄはコンドロイチン硫酸Ｄ、HSはヘパラン
硫酸、DSはデルマタン硫酸、 PAは、ピリジル−（２）−アミノ基を示す） この本発明の糖構造解析キットを用いることにより、
糖鎖の微量構造解析を簡便に、高感度に、また定量的に
行うことが可能となる。
ミン、Ｍはマンノース、Ｆはフコース、Ｘはキシロー
ス、NANAはＮ−アセチルノイラミン酸、ChSはコンドロ
イチン硫酸、ChS・Ａはコンドロイチン硫酸Ａ、ChS・Ｂ
はコンドロイチン硫酸Ｂ、ChS・Ｃはコンドロイチン硫
酸Ｃ、ChS・Ｄはコンドロイチン硫酸Ｄ、HSはヘパラン
硫酸、DSはデルマタン硫酸、 PAは、ピリジル−（２）−アミノ基を示す） この本発明の糖構造解析キットを用いることにより、
糖鎖の微量構造解析を簡便に、高感度に、また定量的に
行うことが可能となる。
例えば、本発明の方法を用いて、試料中の糖の組成分
析を行い、次に同じ試料の糖のPA化を行い、ハセ（Has
e,S.）らの方法〔アナリティカル バイオケミストリ
ー、第184巻、第135〜138頁（1990）〕及びトミヤ（Tom
iya,N.）らの方法〔アナリティカル バイオケミストリ
ー、第171巻、第73〜90頁（1988）〕に準じ逆相ODSカラ
ムや順相カラムを用いたHPLCを行い、その溶出位置、及
び糖組成を比較することによって、容易に目的とする糖
の構造を推定することができる。このときは前記キット
の中に、標準物質として、PA化グルコースオリゴマー
（宝酒造社製）や表１中の化合物〔III〕を入れておい
ても良い。
析を行い、次に同じ試料の糖のPA化を行い、ハセ（Has
e,S.）らの方法〔アナリティカル バイオケミストリ
ー、第184巻、第135〜138頁（1990）〕及びトミヤ（Tom
iya,N.）らの方法〔アナリティカル バイオケミストリ
ー、第171巻、第73〜90頁（1988）〕に準じ逆相ODSカラ
ムや順相カラムを用いたHPLCを行い、その溶出位置、及
び糖組成を比較することによって、容易に目的とする糖
の構造を推定することができる。このときは前記キット
の中に、標準物質として、PA化グルコースオリゴマー
（宝酒造社製）や表１中の化合物〔III〕を入れておい
ても良い。
以下に本発明の実施例を示し本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
実施例１ オリゴ糖の糖組成分析 表１の式〔IV〕のPA化オリゴ糖（宝酒造社製）の水溶
液100μｌ（1nmolに相当）を反応チューブに入れ、減圧
下濃縮乾固した。4Mトリフルオロ酢酸40μｌを入れ、減
圧封管した後、100℃にて３時間酸加水分解を行った。
次に開管し、内部標準のリボース1nmolを加えて減圧下
濃縮乾固した後、少量の水を入れ、凍結減圧乾燥して、
余剰の試薬を留去した。残渣を水10μｌに溶解し、ピリ
ジン15μｌ、メタノール30μ１を加えた後、無水酢酸２
μｌを加え、常温にて30分間、時々かくはんしながら放
置した。減圧下濃縮乾固した後、少量の水を入れ、凍結
減圧乾燥して、余剰の試薬を留去した。残渣にPA化試薬
（２−アミノピリジン1gを酢酸0.468ml、メタノール0.6
mlに溶解して作成する）７μｌを加え、封管した後、90
℃にて15分間反応させた。反応後開管しN2気流下減圧に
て濃縮乾固した。残渣に還元剤（ジメチルアミンボラン
59mgを酢酸1mlに溶解して作成する）10μｌを加え、封
管した後、90℃、30分間反応させた。反応後、メタノー
ルを用いた共沸操作により余剰の試薬を留去した。残渣
を500μｌの水に溶解し、そのうち５μｌ（10pmol相
当）をHPLCにて分析した。第１図にそのクロマトグラム
を、溶出時間（分、横軸）と蛍光強度（縦軸）との関係
の図として示す。カラムは、パルパックＡ型（PALPAK T
ype A:宝酒造社製、4.6×150mm）を用い、溶媒は10％ア
セトニトリル含有0.7Mホウ酸緩衝液（pH9.0）で、流量
は0.3ml/分、カラム温度は65℃とした。蛍光検出は励起
波長310nm、蛍光波長380nmで行った。同様の操作を行っ
た単糖混合物（Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセ
チルグルコサミン、グルコース、マンノース、フコー
ス、ガラクトース、各1nmol）とのピーク高さの比較に
より糖組成を求め、内部標準のリボースにて補正した値
（mol/mol糖鎖）を表２に示す。
液100μｌ（1nmolに相当）を反応チューブに入れ、減圧
下濃縮乾固した。4Mトリフルオロ酢酸40μｌを入れ、減
圧封管した後、100℃にて３時間酸加水分解を行った。
次に開管し、内部標準のリボース1nmolを加えて減圧下
濃縮乾固した後、少量の水を入れ、凍結減圧乾燥して、
余剰の試薬を留去した。残渣を水10μｌに溶解し、ピリ
ジン15μｌ、メタノール30μ１を加えた後、無水酢酸２
μｌを加え、常温にて30分間、時々かくはんしながら放
置した。減圧下濃縮乾固した後、少量の水を入れ、凍結
減圧乾燥して、余剰の試薬を留去した。残渣にPA化試薬
（２−アミノピリジン1gを酢酸0.468ml、メタノール0.6
mlに溶解して作成する）７μｌを加え、封管した後、90
℃にて15分間反応させた。反応後開管しN2気流下減圧に
て濃縮乾固した。残渣に還元剤（ジメチルアミンボラン
59mgを酢酸1mlに溶解して作成する）10μｌを加え、封
管した後、90℃、30分間反応させた。反応後、メタノー
ルを用いた共沸操作により余剰の試薬を留去した。残渣
を500μｌの水に溶解し、そのうち５μｌ（10pmol相
当）をHPLCにて分析した。第１図にそのクロマトグラム
を、溶出時間（分、横軸）と蛍光強度（縦軸）との関係
の図として示す。カラムは、パルパックＡ型（PALPAK T
ype A:宝酒造社製、4.6×150mm）を用い、溶媒は10％ア
セトニトリル含有0.7Mホウ酸緩衝液（pH9.0）で、流量
は0.3ml/分、カラム温度は65℃とした。蛍光検出は励起
波長310nm、蛍光波長380nmで行った。同様の操作を行っ
た単糖混合物（Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセ
チルグルコサミン、グルコース、マンノース、フコー
ス、ガラクトース、各1nmol）とのピーク高さの比較に
より糖組成を求め、内部標準のリボースにて補正した値
（mol/mol糖鎖）を表２に示す。
上記結果はこのPA化オリゴ糖の構造と一致する。
実施例２ タカアミラーゼＡの糖鎖の糖組成分析 糖タンパク質であるタカアミラーゼＡを、ジャーナル
オブ バイオケミストリー（J.Biochem）第92巻、第2
65〜270頁（1982）に記載の方法により精製し、それを
1.96mg秤量し、水2mlに溶解した。そのうち60μｌ（タ
カアミラーゼA 1nmolに相当）を反応チューブに入れ、
以下の操作は前述した実施例１のPA化オリゴ糖の場合と
同様の条件にて行い、同様の分析を行った。そのクロマ
トグラムを第２図に、第１図と同様な関係の図として示
す。実施例１の場合と同様の糖組成を求めた値を表３に
示す。
オブ バイオケミストリー（J.Biochem）第92巻、第2
65〜270頁（1982）に記載の方法により精製し、それを
1.96mg秤量し、水2mlに溶解した。そのうち60μｌ（タ
カアミラーゼA 1nmolに相当）を反応チューブに入れ、
以下の操作は前述した実施例１のPA化オリゴ糖の場合と
同様の条件にて行い、同様の分析を行った。そのクロマ
トグラムを第２図に、第１図と同様な関係の図として示
す。実施例１の場合と同様の糖組成を求めた値を表３に
示す。
上記結果は公知であるタカアミラーゼＡの糖鎖構造と
一致する。
一致する。
実施例３ タカアミラーゼＡの糖鎖のPA化及びHPLC分析 実施例２のタカアミラーゼＡの溶液60μｌ（タカアミ
ラーゼＡの1nmolに相当）を反応チューブに入れ、凍結
減圧乾燥した。無水ヒドラジン（ピアス社製）50μｌを
入れ、反応チューブ中の気相をN2に置換後減圧封管し、
100℃で10時間ヒドラジン分解を行った。ヒドラジン分
解後トルエン20μｌを添加し、減圧下で余剰の試薬を共
沸留去させた。この操作を３回繰返し行った。次に、残
渣を水10μｌに溶解し、ピリジン15μｌ、メタノール30
μｌを加えた後、無水酢酸２μｌを加えて常温にて30分
間時々かくはんしながら放置した。減圧下濃縮乾固した
後、少量の水を入れ、凍結減圧乾燥して、余剰の試薬を
留去した。この残渣にPA化試薬（２−アミノピリジン30
0mgを酢酸100μｌに溶かす）を20μｌ加え封管した後、
90℃にて60分間反応させた。放冷後、開管し還元剤（ジ
メチルアミンボラン40mgを200μｌの酢酸に溶かす）を2
0μｌ加え、再び封管した後、80℃、60分間反応させ
た。反応後、メタノール、トルエンを用いた共沸操作に
より余剰の試薬を留去した。残渣を100μｌの水に溶解
し、全量をTSKgelG−2000PW（7.5φ×600mm）（東ソー
社製）カラムを用いてHPLCにて分取した。溶出液は酢酸
アンモニウム緩衝液（pH7.3）を用いた。分取したPA化
糖鎖を下記の条件でHPLC分析を行った。
ラーゼＡの1nmolに相当）を反応チューブに入れ、凍結
減圧乾燥した。無水ヒドラジン（ピアス社製）50μｌを
入れ、反応チューブ中の気相をN2に置換後減圧封管し、
100℃で10時間ヒドラジン分解を行った。ヒドラジン分
解後トルエン20μｌを添加し、減圧下で余剰の試薬を共
沸留去させた。この操作を３回繰返し行った。次に、残
渣を水10μｌに溶解し、ピリジン15μｌ、メタノール30
μｌを加えた後、無水酢酸２μｌを加えて常温にて30分
間時々かくはんしながら放置した。減圧下濃縮乾固した
後、少量の水を入れ、凍結減圧乾燥して、余剰の試薬を
留去した。この残渣にPA化試薬（２−アミノピリジン30
0mgを酢酸100μｌに溶かす）を20μｌ加え封管した後、
90℃にて60分間反応させた。放冷後、開管し還元剤（ジ
メチルアミンボラン40mgを200μｌの酢酸に溶かす）を2
0μｌ加え、再び封管した後、80℃、60分間反応させ
た。反応後、メタノール、トルエンを用いた共沸操作に
より余剰の試薬を留去した。残渣を100μｌの水に溶解
し、全量をTSKgelG−2000PW（7.5φ×600mm）（東ソー
社製）カラムを用いてHPLCにて分取した。溶出液は酢酸
アンモニウム緩衝液（pH7.3）を用いた。分取したPA化
糖鎖を下記の条件でHPLC分析を行った。
HPLCによる測定条件：装置：島津LC6A、カラム：コス
モシール（Cosmosil）５C18P（4.6×150mm）ナカライテ
スク製、溶離液:A液:100nM酢酸、Ｂ液:0.5％１−ブタノ
ール含有100mM酢酸、溶出法：グラジエント:B液の割合
を20分で５％から100％に増加、検出：島津蛍光検出器R
F−535にて検出（励起波長:320nm、蛍光波長:400nm）、
流速:1.5ml/分 その結果を第３図に、第１図と同様な関係の図として
示す。
モシール（Cosmosil）５C18P（4.6×150mm）ナカライテ
スク製、溶離液:A液:100nM酢酸、Ｂ液:0.5％１−ブタノ
ール含有100mM酢酸、溶出法：グラジエント:B液の割合
を20分で５％から100％に増加、検出：島津蛍光検出器R
F−535にて検出（励起波長:320nm、蛍光波長:400nm）、
流速:1.5ml/分 その結果を第３図に、第１図と同様な関係の図として
示す。
本発明のＮ−アセチル化試薬を用いた場合も、効率よ
くPA化糖鎖が調製されている。
くPA化糖鎖が調製されている。
実施例４ ガングリオシドの糖鎖の糖組成分析 糖脂質であるガングリオシド（バッケム社製）を0.5m
g秤量し、水2mlに溶解した。そのうち５μｌ（ガングリ
オシド1nmolに相当）を反応チューブに入れ、以下の操
作は前述した実施例１のPA化オリゴ糖の場合と同様の条
件にて行い、同様の分析を行った。そのクロマトグラム
を第４図に、第１図と同様な関係の図として示す。実施
例１の場合と同様に糖組成を求めた値を表４に示す。
g秤量し、水2mlに溶解した。そのうち５μｌ（ガングリ
オシド1nmolに相当）を反応チューブに入れ、以下の操
作は前述した実施例１のPA化オリゴ糖の場合と同様の条
件にて行い、同様の分析を行った。そのクロマトグラム
を第４図に、第１図と同様な関係の図として示す。実施
例１の場合と同様に糖組成を求めた値を表４に示す。
上記結果は公知であるガングリオシドの糖鎖構造と一
致する。
致する。
実施例５ ヒト・トランスフェリンの糖鎖の糖組成分析 ヒト・トランスフェリン（シグマ社製）7.5mgを1mlの
水に溶解した。そのうち10μｌ（ヒト・トランスフェリ
ンの1nmolに相当）を反応チューブに入れ、以下の操作
を前述した実施例１のPA化オリゴ糖の場合と同様の条件
にて行い、同様の分析を行った。そのクロマトグラムを
第５図に、第１図と同様な関係の図として示す。実施例
１の場合と同様に糖組成を求めた値を表５に示す。
水に溶解した。そのうち10μｌ（ヒト・トランスフェリ
ンの1nmolに相当）を反応チューブに入れ、以下の操作
を前述した実施例１のPA化オリゴ糖の場合と同様の条件
にて行い、同様の分析を行った。そのクロマトグラムを
第５図に、第１図と同様な関係の図として示す。実施例
１の場合と同様に糖組成を求めた値を表５に示す。
上記結果は公知であるヒト・トランスフェリンの糖鎖
構造と一致する。
構造と一致する。
実施例６ ヒト・トランスフェリンの糖鎖のPA化及びHPLC分析 実施例５のヒト・トランスフェリン溶液10μｌを反応
チューブに入れ、凍結減圧乾燥した。以下実施例３と同
様にヒドラジン分解、Ｎ−アセチル化、PA化を行い、次
いで同様の共沸操作にて余剰の試薬を留去した。更に実
施例３と同様の方法でPA化糖をHPLCにて分取し、分析し
た。その結果を第６図に、第１図と同様な関係の図とし
て示す。本発明のＮ−アセチル化試薬を用いた場合も、
効率よくPA化糖鎖が調製されている。
チューブに入れ、凍結減圧乾燥した。以下実施例３と同
様にヒドラジン分解、Ｎ−アセチル化、PA化を行い、次
いで同様の共沸操作にて余剰の試薬を留去した。更に実
施例３と同様の方法でPA化糖をHPLCにて分取し、分析し
た。その結果を第６図に、第１図と同様な関係の図とし
て示す。本発明のＮ−アセチル化試薬を用いた場合も、
効率よくPA化糖鎖が調製されている。
実施例７ 糖構造解析用キット 糖の構造解析用キットを作成した。
留去可能な糖のＮ−アセチル化用試薬として、水、ピ
リジン、メタノールの単独液、及び混液、無水酢酸より
成るキットを作成した（表６）。
リジン、メタノールの単独液、及び混液、無水酢酸より
成るキットを作成した（表６）。
〔発明の効果〕 以上詳細に説明したとおり、本発明の方法及びキット
を用いることにより、糖の構造解析を行うに際し、一連
の反応を同一の容器内で行うことが可能となり、一連の
反応操作が簡便化され、その微量分析が可能となった。
を用いることにより、糖の構造解析を行うに際し、一連
の反応を同一の容器内で行うことが可能となり、一連の
反応操作が簡便化され、その微量分析が可能となった。
第１図は表１中化合物〔IV〕の構成糖のPA化物の溶出パ
ターンを示すグラフ、第２図はタカアミラーゼＡの糖鎖
の構成糖のPA化物の溶出パターンを示すグラフ、第３図
はタカアミラーゼＡの糖鎖のPA化物の溶出パターンを示
すグラフ、第４図はガングリオシドの糖鎖の構成糖のPA
化物の溶出パターンを示すグラフ、第５図はヒト・トラ
ンスフェリンの糖鎖の構成糖のPA化物の溶出パターンを
示すグラフ、第６図はヒト・トランスフェリンの糖鎖の
PA化物の溶出パターンを示すグラフである。
ターンを示すグラフ、第２図はタカアミラーゼＡの糖鎖
の構成糖のPA化物の溶出パターンを示すグラフ、第３図
はタカアミラーゼＡの糖鎖のPA化物の溶出パターンを示
すグラフ、第４図はガングリオシドの糖鎖の構成糖のPA
化物の溶出パターンを示すグラフ、第５図はヒト・トラ
ンスフェリンの糖鎖の構成糖のPA化物の溶出パターンを
示すグラフ、第６図はヒト・トランスフェリンの糖鎖の
PA化物の溶出パターンを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長谷 純宏 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 31/00,31/22,33/66 C21Q 1/40
Claims (2)
- 【請求項１】糖の構造解析方法において、水性媒体中に
おける糖の選択的Ｎ−アセチル化用試薬として、ピリジ
ン、水性媒体としての水又は水とメタノールとの混合媒
体、アセチル化剤としての無水酢酸を用いることを特徴
とする糖の構造解析方法。 - 【請求項２】糖の構造解析用キットであって、水性媒体
中における糖の選択的Ｎ−アセチル化用試薬として、水
若しくは水及びメタノールと、ピリジンと、無水酢酸と
を用いることを特徴とする糖の構造解析用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20119290A JP2883175B2 (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | 糖構造解析方法及び糖構造解析用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20119290A JP2883175B2 (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | 糖構造解析方法及び糖構造解析用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0486555A JPH0486555A (ja) | 1992-03-19 |
| JP2883175B2 true JP2883175B2 (ja) | 1999-04-19 |
Family
ID=16436874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20119290A Expired - Fee Related JP2883175B2 (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | 糖構造解析方法及び糖構造解析用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2883175B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114487227A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-05-13 | 唐传生物科技（厦门）有限公司 | 一种用于单糖分析的高效液相法 |
-
1990
- 1990-07-31 JP JP20119290A patent/JP2883175B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0486555A (ja) | 1992-03-19 |
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