CN102584728A - 一类基于三嗪结构的糖标记试剂及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类基于三嗪结构的糖标记试剂、其制备方法以及在毛细管电泳质谱连用技术(CE-MS)中的检测应用。该类糖标记试剂具有基于三嗪的特征结构，通过结构上的肼基在还原或非还原条件下共价耦联糖类样品。标记后的样品经过预处理(还原标记)或者直接(非还原标记)进行CE-MS分析。该类标记试剂以及标记分析方法的应用前景广阔，可包括临床诊断，疾病的早期诊断，生物制剂活性与均一性的分析等等。
Description
技术领域
本发明涉及一类基于三嗪结构的糖标记试剂制备及其在毛细管电泳质谱连用技术(CE-MS)中的检测应用。
背景技术
糖是组成生命体最基本的四种生命分子中的一大类。广泛存在于人体内，据估计人体70％以上的蛋白均为糖基化的蛋白。蛋白的糖基化在蛋白质结构和功能的调节上起着非常关键的作用。糖基化水平的改变通常是蛋白结构与功能变化的标志。因此糖的研究得到来自临床和生物制剂领域的极大关注。
由于绝大部分的糖都没有可以用于检测的生色基团，因此难以用光学手段进行检测，同时大部分的糖很难离子化，因此质谱的检测也存在着相当大的困难。为了解决这些问题，在过去的几十年里，多种基于不同检测手段(紫外可见，荧光等)的糖标记试剂被开发出来。
CE-MS(毛细管电泳-质谱连用)在分析水溶性的极性样品上具有高效液相色谱质谱连用技术所不具备的优势，其具有样品消耗小，分离效率高，同时定性能力强的特点。因此该技术有潜力成为对于糖类样品分析的理想方法。然而由于一直没有适合于该方法的糖类标记试剂，从而在很大程度上限制了这一技术在糖类分析中的进一步发展。
发明内容
本发明的目的在于提出一类基于三嗪结构的糖标记试剂及其合成方法和应用。
本发明提供的一类新型糖标记试剂为3种不同取代的三聚氯氰T1/T2/T3，其结构式分别为：
T1的结构式：
T2的结构式：
T3的结构式：
本发明基于三嗪结构的糖标记试剂的合成方法，具体包括：
T1合成方法：
2-氯-4，6-二甲氧基-s-三嗪溶于一定体积有机溶剂(乙腈/四氢呋喃)中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时。将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂(乙醚/乙酸乙酯/二氯甲烷)萃取若干次，浓缩。
T2合成方法：
将三聚氰氯溶于一定量甲醇，加入过量碱，在冰浴条件下搅拌反应过夜，层析色谱监控至反应完全。待反应完全后，将反应溶液倒入冰水混合物中，搅拌，过滤，用水洗涤至无氯离子，真空干燥，得到白色粉末。
将上一步产物溶于一定量有机溶剂(二氯甲烷/乙腈/四氢呋喃)，加入过量三级胺(N，N-二异丙基乙胺/三乙胺/吡啶/咪唑)，室温下加入当量二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-过夜。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于一定体积有机溶剂(乙腈/四氢呋喃)中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时。将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂(乙醚/乙酸乙酯/二氯甲烷)萃取若干次，浓缩。
T3合成方法：
三聚氰氯溶于一定量有机溶剂(二氯甲烷/乙腈/四氢呋喃)，加入过量三级胺(N，N-二异丙基乙胺\三乙胺\吡啶\咪唑)，在室温下加入过量二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-过夜。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于一定体积有机溶剂(乙腈/四氢呋喃)中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时。将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂(乙醚/乙酸乙酯/二氯甲烷)萃取若干次，浓缩。
本发明提供基于该类糖标记试剂的多糖标记方法，包括：
T1标记方法
将过量的标记试剂T1加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1～1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
T2标记方法
将过量的标记试剂T2加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1～1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
T3标记方法
(1)非还原条件下的标记反应
标记反应如下所示：
(a)针对水溶性糖类样品
将多糖的水溶液与有机溶剂(甲醇/乙醇/丙醇/异丙醇/丁醇/异丁醇)按V(有机溶剂)∶V(水)＝9∶1～1∶5混合，加入催化量的冰醋酸，以及过量的标记物T3，混合均匀，50-75℃下反应1-3小时。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
(b)针对干粉糖类样品
将过量的标记试剂T3加入有机溶剂(甲醇/乙醇/丙醇/异丙醇/丁醇/异丁醇)与水的混合溶液中(V(有机溶剂)∶V(水)＝9∶1～1∶5)，加入催化量的冰醋酸，混合均匀，配制成为标记溶液。将标记溶液与粉末糖类样品混合，50-75℃下反应1-3小时。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
(2)还原条件下的标记反应(标记反应2)
标记反应如下所示：
(a)针对水溶性糖类样品
将过量的标记试剂T3加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1～1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与水溶性糖类样品按V(标记溶液)∶V(糖类样品)＝9∶1～4∶1的比例混合均匀。将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，-20℃保存。
(b)针对干粉糖类样品
将过量的标记试剂T3加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1～1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，-20℃保存。
本发明提供一类基于T3结构的稳定同位素标记试剂。
氘标记的T3结构式：
氘标记的T3的合成方法：
三聚氯氰溶于一定量有机溶剂(二氯甲烷/乙腈/四氢呋喃)，加入过量三级胺(N，N-二异丙基乙胺\三乙胺\吡啶\咪唑)，在室温下加入过量氘代二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-过夜。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸水溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于一定体积有机溶剂(乙腈/四氢呋喃)中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时。将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂(乙醚/乙酸乙酯/二氯甲烷)萃取若干次，浓缩。
15N标记的T3结构式：
15N标记的T3的合成方法：
三聚氯氰溶于一定量有机溶剂(二氯甲烷/乙腈/四氢呋喃)，加入过量三级胺(N，N-二异丙基乙胺\三乙胺\吡啶\咪唑)，在室温下加入过量15N代二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-24h。经由薄层色谱检测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸水溶液与水分别洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于一定体积有机溶剂(乙腈/四氢呋喃)中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时。将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂(乙醚/乙酸乙酯/二氯甲烷)萃取三次，浓缩。
13C标记的T3结构式：
13C标记的T3的合成方法
13C代三聚氯氰溶于一定量有机溶剂(二氯甲烷/乙腈/四氢呋喃)，加入过量三级胺(N，N-二异丙基乙胺\三乙胺\吡啶\咪唑)，在室温下加入过量二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-24h。经由薄层色谱检测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸水溶液与水分别洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于一定体积有机溶剂(乙腈/四氢呋喃)中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时。将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂(乙醚/乙酸乙酯/二氯甲烷)萃取三次，浓缩。
本发明提供基于同位素标记的T3的多糖标记方法。
标记方法：
(1)非还原条件下的标记反应
(a)针对水溶性糖类样品
将多糖的水溶液与有机溶剂(甲醇/乙醇/丙醇/异丙醇/丁醇/异丁醇)按V(有机溶剂)∶V(水)＝9∶1～1∶5混合，加入催化量的冰醋酸，以及过量的稳定同位素标记T3，混合均匀，50-75℃下反应1-3小时。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
(b)针对干粉糖类样品
将过量的稳定同位素标记T3加入有机溶剂(甲醇/乙醇/丙醇/异丙醇/丁醇/异丁醇)与水的混合溶液中(V(有机溶剂)∶V(水)＝9∶1～1∶5)，加入催化量的冰醋酸，混合均匀，配制成为标记溶液。将标记溶液与粉末糖类样品混合，50-75℃下反应1-3小时。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
(2)还原条件下的标记反应
(a)针对水溶性糖类样品
将过量的稳定同位素标记T3加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1～1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与水溶性糖类样品按V(标记溶液)∶V(糖类样品)＝9∶1～4∶1的比例混合均匀。将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
(b)针对干粉糖类样品
将过量的稳定同位素标记T3加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1～1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
本发明提供一种糖类样品的相对定量方法
通过将经由稳定同位素标记T3标准样品与T3标记的糖类样品按比例混合，对混合物进行质谱分析。通过稳定同位素标记的标准样品峰与样品峰峰高或峰面积进行比较从而实现对糖类样品的相对定量。
本发明基于三嗪结构的糖标记试剂用于CE-MS的分析应用。
本发明的技术效果：
本发明新型糖标记试剂具有基于三嗪的特征结构，通过结构上的肼基在还原或非还原条件下共价耦联糖类样品。标记后的样品经过预处理(还原标记)或者直接(非还原标记)进行CE-MS分析。具有如下优点：
(1)提高了糖标记的效率，节约了标记反应时间；
(2)极大地简化了标记产物的纯化步骤；
(3)有效地提高了糖检测的分离效率；
(4)提高了糖检测的灵敏度；
(5)极大地提高了大分子量糖的检测的灵敏度。
(6)同时为糖类定量分析提供了稳定同位素标记物，促进了糖类的定量研究。
本发明的标记试剂以及标记分析方法的应用前景广阔，包括：临床诊断，疾病的早期诊断，生物制剂活性与均一性的分析等等。
附图说明
图1T-3还原标记的多聚葡萄糖的CE-MS分析；在图1中x轴表示迁移时间，单位为秒(s)，y轴为质谱响应强度。
图2T-3非还原标记的多聚葡萄糖的CE-MS分析；在图1中x轴表示迁移时间，单位为秒(s)，y轴为质谱响应强度。
具体实施方式
下面详细的描述出本发明的最佳实施例。
T1合成的实施例1
2-氯-4，6-二甲氧基-s-三嗪溶于四氢呋喃中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶5，加热回流反应8h。将反应液倒入足量碎冰中，二氯甲烷萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)。
T1合成的实施例2
2-氯-4，6-二甲氧基-s-三嗪溶于乙腈中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶3，加热回流反应12h。将反应液倒入足量碎冰中，乙酸乙酯萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)。
T2合成的实施例1
将三聚氰氯溶于甲醇中，加入碳酸氢钠，n(三聚氰氯)∶n(碳酸氢钠)＝1∶1.5，在冰浴条件下搅拌反应12h，层析色谱监控至反应完全。待反应完全后，将反应溶液倒入冰水混合物中，搅拌，过滤，用水洗涤至无氯离子，真空干燥，得到白色粉末。
将上一步产物溶于二氯甲烷中，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，n(反应物)∶n(DIPEA)＝1∶2，室温下加入二乙胺，n(反应物)∶n(二乙胺)＝1∶1.1，室温下搅拌继续反应24h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于四氢呋喃中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶5，加热回流反应8h。将反应液倒入足量碎冰中，二氯甲烷萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)
T2合成的实施例2
将三聚氰氯溶于甲醇中，加入碳酸氢钠，n(三聚氰氯)∶n(碳酸氢钠)＝1∶2，在冰浴条件下搅拌反应8h，层析色谱监控至反应完全。待反应完全后，将反应溶液倒入冰水混合物中，搅拌，过滤，用水洗涤至无氯离子，真空干燥，得到白色粉末。
将上一步产物溶于四氢呋喃中，加入三乙胺，n(反应物)∶n(三乙胺)＝1∶2.5，室温下加入二乙胺，n(反应物)∶n(二乙胺)＝1∶1.3，室温下搅拌继续反应12h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于乙腈中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶3，加热回流反应12h。将反应液倒入足量碎冰中，乙酸乙酯萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)
T3合成的实施例1
三聚氰氯溶于二氯甲烷中，加入DIPEA，n(反应物)∶n(DIPEA)＝1∶2.2，在室温下加入二乙胺，n(反应物)∶n(二乙胺)＝1∶2.2，室温下搅拌继续反应24h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于四氢呋喃中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶5，加热回流反应8h。将反应液倒入足量碎冰中，二氯甲烷萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)
T3合成的实施例2
三聚氰氯溶于四氢呋喃中，加入三乙胺，n(反应物)∶n(三乙胺)＝1∶2.5，室温下加入二乙胺，n(反应物)∶n(二乙胺)＝1∶2.5，室温下搅拌继续反应12h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于乙腈中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶3，加热回流反应3h。将反应液倒入足量碎冰中，乙酸乙酯萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)
T3合成的实施例3
三聚氰氯溶于乙腈中，加入咪唑，n(反应物)∶n(咪唑)＝1∶3，在室温下加入二乙胺，n(反应物)∶n(二乙胺)＝1∶3，室温下搅拌继续反应18h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于氯仿中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶7，加热回流反应6h。将反应液倒入足量碎冰中，乙醚萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)
氘标记的T3合成的实施例1
三聚氰氯溶于二氯甲烷中，加入DIPEA，n(反应物)∶n(DIPEA)＝1∶2.2，在室温下加入氘代二乙胺，n(反应物)∶n(氘代二乙胺)＝1∶2.1，室温下搅拌继续反应24h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于四氢呋喃中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶5，加热回流反应8h。将反应液倒入足量碎冰中，二氯甲烷萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)
氘标记的T3合成的实施例2
三聚氰氯溶于四氢呋喃中，加入三乙胺，n(反应物)∶n(三乙胺)＝1∶2.5，室温下加入氘代二乙胺，n(反应物)∶n(氘代二乙胺)＝1∶2.2，室温下搅拌继续反应12h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于乙腈中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶3，加热回流反应3h。将反应液倒入足量碎冰中，乙酸乙酯萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)
氘标记的T3合成的实施例3
三聚氰氯溶于乙腈中，加入咪唑，n(反应物)∶n(咪唑)＝1∶3，在室温下加入氘代二乙胺，n(反应物)∶n(氘代二乙胺)＝1∶2.3，室温下搅拌继续反应18h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于氯仿中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶7，加热回流反应6h。将反应液倒入足量碎冰中，乙醚萃取三次，浓缩。(结果见表一报道)
15N标记的T3合成的实施例1
三聚氰氯溶于二氯甲烷中，加入DIPEA，n(反应物)∶n(DIPEA)＝1∶2.2，在室温下加入15N代二乙胺，n(反应物)∶n(氘代二乙胺)＝1∶2.1，室温下搅拌继续反应24h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于四氢呋喃中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶5，加热回流反应8h。将反应液倒入足量碎冰中，二氯甲烷萃取三次，浓缩。
15N标记的T3合成的实施例2
三聚氰氯溶于四氢呋喃中，加入三乙胺，n(反应物)∶n(三乙胺)＝1∶2.5，室温下加入15N代二乙胺，n(反应物)∶n(氘代二乙胺)＝1∶2.2，室温下搅拌继续反应12h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于乙腈中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶3，加热回流反应3h。将反应液倒入足量碎冰中，乙酸乙酯萃取三次，浓缩。
15N标记的T3合成的实施例3
三聚氰氯溶于乙腈中，加入咪唑，n(反应物)∶n(咪唑)＝1∶3，在室温下加入15N代二乙胺，n(反应物)∶n(氘代二乙胺)＝1∶2.3，室温下搅拌继续反应18h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于氯仿中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶7，加热回流反应6h。将反应液倒入足量碎冰中，乙醚萃取三次，浓缩。
13C标记的T3合成的实施例1
13C代三聚氰氯溶于二氯甲烷中，加入DIPEA，n(反应物)∶n(DIPEA)＝1∶2.2，在室温下加入二乙胺，n(反应物)∶n(氘代二乙胺)＝1∶2.1，室温下搅拌继续反应24h。经由薄层色谱监测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于四氢呋喃中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶5，加热回流反应8h。将反应液倒入足量碎冰中，二氯甲烷萃取三次，浓缩。
13C标记的T3合成的实施例2
13C代三聚氰氯溶于四氢呋喃中，加入三乙胺，n(反应物)∶n(三乙胺)＝1∶2.5，室温下加入二乙胺，n(反应物)∶n(氘代二乙胺)＝1∶2.2，室温下搅拌继续反应12h。经由薄层色谱检测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于乙腈中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶3，加热回流反应3小时。将反应液倒入足量碎冰中，乙酸乙酯萃取三次，浓缩。
13C标记的T3合成的实施例3
13C代三聚氰氯溶于乙腈中，加入咪唑，n(反应物)∶n(咪唑)＝1∶3，在室温下加入二乙胺，n(反应物)∶n(氘代二乙胺)＝1∶2.3，室温下搅拌继续反应18h。经由薄层色谱检测反应完成情况。反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别各洗三次，收集有机相，浓缩。
上步产物溶于氯仿中，加入水合肼，n(反应物)∶n(水合肼)＝1∶7，加热回流反应6h。将反应液倒入足量碎冰中，乙醚萃取三次，浓缩。
表一标记物T1/T2/T3及氘标记的T3质谱与核磁表征结果
T1标记糖类样品的实施例1
将过量的标记试剂T1加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在65℃的烘箱中反应3h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
T1标记多糖样品的实施例2
将过量的标记试剂T1加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在75℃的烘箱中反应1.5h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
T2标记多糖样品的实施例1
将过量的标记试剂T2加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在65℃的烘箱中反应3h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
T2标记多糖样品的实施例2
将过量的标记试剂T2加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝1∶1)，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液。将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀。将混合溶液在75℃的烘箱中反应1.5h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
T3非还原条件下标记多糖样品：
实施例1
过量标记试剂T3分散于异丙醇的水溶液中，V(异丙醇)∶V(水)＝1∶1，随后加入催化量的冰醋酸。将混合后的标记溶液与糖样品混合。将混合溶液在70℃的烘箱中反应1h。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
实施例2
过量标记试剂T3分散于甲醇的水溶液中，V(甲醇)∶V(水)＝1∶3，随后加入催化量的冰醋酸。将混合后的标记溶液与糖样品混合。将混合溶液在55℃的烘箱中反应3h。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
实施例3
过量标记试剂T3分散于异丙醇的水溶液中，V(异丙醇)∶V(水)＝1∶1，随后加入催化量的冰醋酸。该混合后的标记溶液加入装有干粉样品的管中，混合均匀。将混合溶液在70℃的烘箱中反应1h。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
实施例4
过量标记试剂T3分散于甲醇的水溶液中，V(甲醇)∶V(水)＝1∶3，随后加入催化量的冰醋酸。该混合后的标记溶液加入装有干粉样品的管中，混合均匀。将混合溶液在55℃的烘箱中反应3h。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
T3还原条件下标记多糖样品：
实施例1
过量的标记试剂T3与过量氰基硼氢化钠溶于一定量醋酸的DMSO溶液(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1)。将混合后的标记溶液与糖类水溶样品按V(标记溶液)∶V(糖类样品)＝9∶1的比例混合均匀。将混合溶液75℃反应1.5h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
实施例2
过量的标记试剂T3与过量氰基硼氢化钠溶于一定量醋酸的DMSO溶液(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝1∶1)。将混合后的标记溶液与糖类水溶样品按V(标记溶液)∶V(糖类样品)＝4∶1的比例混合均匀。将混合溶液65℃反应3h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
实施例3
过量的标记试剂T3与过量氰基硼氢化钠溶于一定量醋酸的DMSO溶液(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1)。将混合后的标记溶液加入装有干粉样品的管中，混合均匀。将混合溶液75℃反应1.5h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
实施例4
过量的标记试剂T3与过量氰基硼氢化钠溶于一定量醋酸的DMSO溶液(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝1∶1)。将混合后的标记溶液加入装有干粉样品的管中，混合均匀。将混合溶液65℃反应3h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
稳定同位素标记T3非还原条件下标记多糖样品：
实施例1
过量的稳定同位素标记T3分散于异丙醇中的水溶液中，V(异丙醇)∶V(水)＝1∶1，随后加入催化量的冰醋酸。将混合后的标记溶液与糖样品混合。将混合溶液在70℃的烘箱中反应1h。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
实施例2
过量的稳定同位素标记T3分散于甲醇中的水溶液中，V(甲醇)∶V(水)＝1∶3，随后加入催化量的冰醋酸。将混合后的标记溶液与糖样品混合。将混合溶液在55℃的烘箱中反应3h。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
实施例3
过量稳定同位素标记T3分散于异丙醇水溶液中，V(异丙醇)∶V(水)＝1∶1，随后加入催化量的冰醋酸。该混合后的标记溶液加入装有干粉样品的管中，混合均匀。将混合溶液在70℃的烘箱中反应1h。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
实施例4
过量稳定同位素标记T3分散于甲醇水溶液中，V(甲醇)∶V(水)＝1∶3，随后加入催化量的冰醋酸。该混合后的标记溶液加入装有干粉样品的管中，混合均匀。将混合溶液在55℃的烘箱中反应3h。将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
稳定同位素标记T3还原条件下标记多糖样品：
实施例1
过量的稳定同位素标记T3与过量氰基硼氢化钠溶于一定量醋酸的DMSO溶液(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1)。将混合后的标记溶液与糖类水溶样品按V(标记溶液)∶V(糖类样品)＝9∶1的比例混合均匀。将混合溶液75℃反应1.5h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
实施例2
过量的稳定同位素标记T3与过量氰基硼氢化钠溶于一定量醋酸的DMSO溶液(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝1∶1)。将混合后的标记溶液与糖类水溶样品按V(标记溶液)∶V(糖类样品)＝4∶1的比例混合均匀。将混合溶液65℃反应3h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
实施例3
过量的稳定同位素标记T3与过量氰基硼氢化钠溶于一定量醋酸的DMSO溶液(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝9∶1)。将混合后的标记溶液加入装有干粉样品的管中，混合均匀。将混合溶液75℃反应1.5h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
实施例4
过量的稳定同位素标记T3与过量氰基硼氢化钠溶于一定量醋酸的DMSO溶液(V(冰醋酸)∶V(DMSO)＝1∶1)。将混合后的标记溶液加入装有干粉样品的管中，混合均匀。将混合溶液65℃反应3h。反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
本发明还涉及标记后糖类样品的CE-MS分析，该方法包含以下内容：
本发明所采用的CE-MS分析基于Beckman Coulter公司的HSPS CE-MS接口技术。所采用的毛细管电泳仪为PA800 Plus(Beckman Coulter，CA，USA)，质谱仪为6320 iontrap(Agilent，CA，USA)
毛细管电泳分离条件：
电泳缓冲溶液：含30-50％甲醇的pH 2-420-100mM醋酸-醋酸铵溶液；
导电液：含30-50％甲醇的pH 2-420-100mM醋酸-醋酸铵溶液；
电泳分离电压：30kV；
进样：5Psi×5s；
分离毛细管：N-CHO coating HSPS interface(Beckman Coulter，CA，USA)；
电导通毛细管：200μm i.d.，365μm o.d.毛细管(Polymicro Technologies，AZ，USA)
质谱检测条件：
干燥气流速：5L/min
干燥气温度：100℃
喷雾电压：1400V
质谱检测分子量范围：700-2000m/z
按照说明中的CE-MS分析方法对T3还原标记的多聚葡萄糖标准品进行检测(见图1)；
在图1中x轴为迁移时间，y轴为质谱响应强度。随着迁移时间，多聚葡萄糖从小到大依次被质谱检测到。说明标记试剂T3还原形式可以对糖类进行标记，同时满足CE-MS分离检测的需要。
按照说明中的CE-MS分析方法对T3非还原标记的多聚葡萄糖标准品进行检测(见图2)；
在图2中x轴为迁移时间，y轴为质谱响应强度。随着迁移时间，多聚葡萄糖从小到大依次被质谱检测到。说明标记试剂T3通过非还原形式可以对糖类进行标记，同时满足CE-MS分离检测的需要。
上面描述的实施例并非用于限定本发明，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做各种的变换和修改，因此本发明的保护范围视权利要求范围所界定。
Claims (11)
1.一种糖标记试剂，其特征在于：具有以下T1、T2或T3所代表的分子结构
2.一种稳定同位素糖标记试剂，其特征在于，具有以下T3-1、T3-2或T3-3所代表的分子结构
3.一种权利要求1中所述的糖标记试剂的合成方法，其特征在于：
2-氯-4，6-二甲氧基-s-三嗪溶于一定体积有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时后，将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取若干次，浓缩，得到T1所示的糖标记试剂；或
(1)将三聚氰氯溶于一定量甲醇，加入过量碱，在冰浴条件下搅拌反应过夜，层析色谱监控至反应完全，待反应完全后，将反应溶液倒入冰水混合物中，搅拌，过滤，用水洗涤至无氯离子，真空干燥，得到白色粉末，(2)将上一步产物溶于一定量有机溶剂二氯甲烷、乙腈或四氢呋喃中，加入过量的三级胺N，N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶或咪唑，室温下加入当量二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-过夜，经由薄层色谱监测反应完成情况，反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩，(3)上步产物溶于一定体积的有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取若干次，浓缩，得到T2所示的糖标记试剂；或
(1)三聚氰氯溶于一定量有机溶剂二氯甲烷、乙腈、或四氢呋喃中，加入过量三级胺N，N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶或咪唑，在室温下加入过量二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-过夜，经由薄层色谱监测反应完成情况，反应完成后，用大量盐酸溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩，(2)上步产物溶于一定体积有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时，将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取若干次，浓缩，得到T3所示的糖标记试剂。
4.一种权利要求2中所述的稳定同位素糖标记试剂的合成方法，其特征在于：
(1)三聚氯氰溶于一定量有机溶剂二氯甲烷、乙腈或四氢呋喃中，加入过量三级胺N，N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶或咪唑，在室温下加入过量氘代二乙胺或15N代二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-24h，经由薄层色谱监测反应完成情况，反应完成后，用大量盐酸水溶液与水分别洗若干次，收集有机相，浓缩，(2)上步产物溶于一定体积有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时，将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取若干次，浓缩，得到T3-1或T3-2所示的稳定同位素糖标记试剂；或
(1)13C代三聚氯氰溶于一定量有机溶剂二氯甲烷、乙腈或四氢呋喃，加入过量三级胺N，N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶或咪唑，在室温下加入过量二乙胺，室温下搅拌继续反应1h-24h，经由薄层色谱监测反应完成情况，反应完成后，用大量盐酸水溶液与水分别洗三次，收集有机相，浓缩，(2)上步产物溶于一定体积有机溶剂乙腈或四氢呋喃中，加入过量的水合肼，加热回流反应若干小时，将反应液倒入足量碎冰中，有机溶剂乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷萃取三次，浓缩得到T3-3所示的稳定同位素糖标记试剂。
5.权利要求1或2所述的糖标记试剂在毛细管电泳-质谱连用分析、即CE-MS分析中的应用。
6.一种基于权利要求1中的糖标记试剂T1、T2的多糖标记方法，其特征在于，
将过量的标记试剂T1或T2加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中，体积比V冰醋 酸∶VDMSO＝9∶1～1∶1，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液，将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀，将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时，反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
7.一种基于权利要求1中的糖标记试剂T3的非还原条件下的多糖标记方法，其特征在于，
(1)针对水溶性糖类样品的标记方式为：将多糖的水溶液与有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇按照体积比V有机溶剂∶V水＝9∶1～1∶5混合，加入催化量的冰醋酸，以及过量的标记物T3，混合均匀，50-75℃下反应1-3小时，将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存，或
(2)针对干粉糖类样品的标记方式为：将过量的标记试剂T3加入有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇与水的混合溶液中，体积比V有机溶剂∶V水＝9∶1～1∶5，加入催化量的冰醋酸，混合均匀，配制成为标记溶液，将标记溶液与粉末糖类样品混合，50-75℃下反应1-3小时，将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
8.一种基于权利要求1中的糖标记试剂T3的还原条件下的多糖标记方法，其特征在于，
将过量的标记试剂T3加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中，体积比V冰醋酸∶VDMSO＝9∶1～1∶1，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液；将标记溶液与水溶性糖类样品按体积比V标记溶液∶V糖类样品＝9∶1～4∶1的比例混合均匀，或者将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀；将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时，反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，-20℃保存。
9.一种基于权利要求2中的稳定同位素的糖标记试剂T3-1、T3-2或T3-3的非还原条件下的多糖标记方法，其特征在于，
(1)针对水溶性糖类样品的标记方式为：将多糖的水溶液与有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇按体积比V有机溶剂∶V水＝9∶1～1∶5混合，加入催化量的冰醋酸，以及过量的稳定同位素标记试剂T3-1、T3-2或T3-3，混合均匀，50-75℃下反应1-3小时，将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存；或
(2)针对干粉糖类样品的标记方式为：将过量的稳定同位素标记试剂T3-1、T3-2或T3-3加入有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇与水的混合溶液中，体积比V有机溶剂∶V水＝9∶1～1∶5，加入催化量的冰醋酸，混合均匀，配制成为标记溶液，将标记溶液与粉末糖类样品混合，50-75℃下反应1-3小时，将完成后的反应溶液用水稀释，低温保存。
10.一种基于权利要求2中的稳定同位素的糖标记试剂T3-1、T3-2或T3-3的还原条件下的多糖标记方法，其特征在于，
将过量的稳定同位素糖标记试剂T3-1、T3-2或T3-3加入冰醋酸与DMSO的混合溶液中，体积比V冰醋酸∶VDMSO＝9∶1～1∶1，加入当量的氰基硼氢化钠，混匀，配成标记溶液；将标记溶液与水溶性糖类样品按V标记溶液∶V糖类样品＝9∶1～4∶1的比例混合均匀，或将标记溶液与糖类干粉样品混合均匀；将混合溶液在65-75℃的烘箱中反应1.5-3小时，反应完成后经由固相微萃取柱纯化，吹干，用水重新定容，低温保存。
11.一种糖类样品的相对定量方法，其特征在于：
将经由权利要求2所限定的稳定同位素糖标记试剂T3-1、T3-2或T3-3标记的标准样品与权利要求1所限定的糖标记试剂T3标记的糖类样品按比例混合，对混合物进行质谱分析；通过稳定同位素糖标记试剂T3-1、T3-2或T3-3标记的标准样品峰与糖标记试剂T3标记的糖类样品峰峰高或峰面积进行比较，从而实现对糖类样品的相对定量。
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