CN105980412A - 通过衍生化唾液酸残基的糖基化分析 - Google Patents

Abstract

本发明涉及将可以存在于聚糖部分上的唾液酸衍生化的方法。这种方法可以用于确定例如糖蛋白和糖脂的糖基化分布，以及这种方法在临床分析以及生物发育和控制中的应用。

Description

通过衍生化唾液酸残基的糖基化分析

发明领域

本发明涉及衍生化可以存在于聚糖部分之上的唾液酸的方法。这可以用于确定例如糖蛋白和糖脂的糖基化分布(glycosylation profile)，以及这种方法在临床分析以及生物发育和控制中的应用。

发明背景

糖基化是对如溶解度、折叠和受体结合活性[1-3]的蛋白特性具有显著影响的常规翻译后修饰。越来越多的疾病已经表现出与糖基化的改变相关，包括各种形式的癌症、自身免疫和先天性疾病[4-8]。正因为如此，单个蛋白质或如血浆的更复杂样品的聚糖分析可以作为重要的临床生物标志物[9]。此外，已知聚糖影响生物药物的活性、稳定性和免疫原性，需要仔细地监测和控制[10，11]。

糖基化的一个重要特征是唾液酸(例如，N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸)的存在[12]。这些单糖已显示在细胞通信中具有作用，与特定类型的凝集素相互作用，并已与癌症和亚稳态(metastaticity)相关联[13-15]。在人的糖基化的情况下，唾液酸可以通过α2,6或α2,3糖苷键连接于末端半乳糖，并因此显示不同的功能。例如，α2,3连接的N-乙酰神经氨酸是用于形成唾液酸基路易斯X结构而特别需要的，其已显示可以指示几种类型癌症的转移[16-19]，而α2,6连接的唾液酸在半乳糖凝集素抑制中显示作用，从而促进细胞存活[20-22]。随着分析需求的增加，发展高通量(HTP)糖组学方法引起了人们极大的兴趣。

一种良好适于糖组学研究的技术是基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法(MS)，因为它可以迅速地提供聚糖结构的组成、序列和支化方面的信息[23]。然而，唾液酸是通过相对较弱的键连接于聚糖的，在质谱仪中各离子化和加速阶段期间通过在源和亚稳衰变常常导致残基的损失。另外，唾液酸化聚糖物质在添加盐的情况下倾向于显示高变异性，导致单个聚糖组合物有多个信号。此外，如存在于唾液酸上的羧基相当易于通过MALDI负电离，在比较酸性和中性寡糖时产生信号强度的偏差，阻碍对混合样品的相对定量[24]。

改善唾液酸化聚糖的MALDI-TOF-MS测定的一种方法是衍生化[25，26]。具体地，唾液酸羧基的化学修饰可以很大程度上防止亚稳衰变，并且所得到的反应产物可以连同非唾液酸化物质一起在正离子模式MALDI-TOF-MS中进行分析[24，25，27]。有趣的是，已经开发出反应条件允许以连接依赖的方式进行唾液酸衍生，从而对α2,3键连接的唾液酸(易于内酯形成)和α2,6键连接的唾液酸(经历其他化学修饰，如酯化和酰胺化)进行差异化衍生化。在文献中描述的方法涉及甲酯化或(甲基)酰胺化，但这些通常需要高度纯化的聚糖样品，严酷的条件或长的反应时间，并且不显示完全的连接特异性[28-30]。虽然这些程序可以为唾液酸化寡糖的分析提供信息，但是对于复杂样品HTP分析的适用性有限。

本发明的目的之一是避免和/或减轻上述缺点中的至少一个。

发明概述

本发明基于本发明人进行的研究，以开发适于与唾液酸化聚糖的MALDI-TOF-MS测定一起使用的唾液酸衍生化方法。

本发明的第一个方面提供了一种用于衍生化聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，该方法包括：

将生物样品或聚糖制剂与包含至少一种碳二亚胺以及至少一种三唑或2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma Pure)的试剂反应，以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。

本发明人已观察到，衍生化是以唾液酸残基的连接特异的烷基酯化和内酯形成的方式进行的，几乎没有或没有观察到酰胺化。通常，可以观察到少于1％的酰胺化，如少于0.5％或0.1％的酰胺化。本发明人已观察到，唾液酸乙酰化可以在选择的衍生条件下被保留。另外，衍生化可以对于N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸发生，还可以对于连接于如N-乙酰氨基葡糖的N-乙酰氨基己糖残基的唾液酸发生。

本发明可以使存在于聚糖部分上的衍生的唾液酸残基，以在本领域中已知的如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)的质谱技术被分析，如本文中将进一步描述的。然而，衍生反应可以允许其他类型的分析得以进行。例如衍生反应可以允许糖缀合物和/或其它糖基化分子被修饰从而修改其物理化学性质，包括改变在毛细管凝胶电泳中的迁移位置，或者在色谱结合分析中的释放。

所述至少一种碳二亚胺可以是N,N'-二环己基碳二亚胺(DDC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，例如以其盐酸盐的形式。所述至少一种碳二亚胺可以以0.01-1M，如0.1-0.8M，通常，0.25-0.75M的浓度在溶液中提供。

合适的三唑包括羟基苯并三唑(HOBt)，通常以水合的形式，诸如一水合物，其可以以0.1-1M，如0.2-0.8M，通常，0.25-0.75M的浓度在溶液中提供。

所述试剂可以包括单个碳二亚胺和三唑/Oxyma Pure组合，或可以提供包含一个或多个碳二亚胺与一种或多种三唑/oxyma pure组合的混合物。

试剂成分的特别优选的组合是DCC与HOBt，DCC与oxyma pure，EDC与HOBt以及EDC与oxyma pure。特别优选的组合是EDC和HOBt。

通常，试剂组分作为单一试剂组合物提供。试剂组分可以以醇溶液提供，如甲醇、乙醇、(异)丙醇或丁醇。试剂的醇溶液可以是0.01至1M，如0.05至0.8M，0.2至0.7M，如0.4至0.6M，特别是0.5M。备选地，试剂最初可以以冻干形式提供，其用样品和合适的醇恢复(reconstitute)。

通常，用于唾液酸衍生反应的醇含量将为50％至99％，例如70％至96％，特别是95％v/v。

本发明人已观察到，醇的选择可以影响所发生衍生化的程度和类型。在某些实施方案中，优选的醇为甲醇或乙醇，并且在一个特别优选的实施方案中，醇是乙醇。

反应可优选在酸性或中性条件(例如，pH值1.9至pH 7.6)下进行。这可以通过加入酸来实现。如三氟乙酸(TFA)，如0.1％至0.4％的TFA。本发明人已观察到，在酸性条件可以减少或最小化不需要的副产物。

事实上，本发明人已观察到，使用酸性条件可以有助于使利用先前已知的衍生化剂4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)所观察到的副产物最小化，特别是使用不纯的样品时。

本发明的另一个方面提供了衍生化在聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，该方法包括：

将生物样品或聚糖制剂与DMT-MM在酸性条件下反应；以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。

优选的酸性条件是通过将TFA加入到反应中提供的，例如0.1％至0.4％TFA，通常为0.2％的TFA。

本发明可以在纯化或不纯的样品上进行。例如，本发明人已经能够将来自血浆和纤维蛋白原样品的唾液酸化的聚糖衍生化，所述纤维蛋白原样品已经被酶消化的以使得任何聚糖都可用于反应。在释放N-连接寡糖中使用的合适的酶是糖苷内切酶，如PNGase F。有利的是，本发明人已经能够进行本发明的衍生化反应而不用按照上述酶反应所要求的任何纯化，这是与现有技术相反的，现有技术教导在可以进行衍生化之前需要从如血浆的生物样品纯化聚糖。不希望受理论的束缚，似乎其中提供试剂的醇溶液，可以能够沉淀蛋白质等，否则其可能干扰衍生反应。

因此，本发明的另一个方面提供了衍生化聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，该方法包括：

处理生物样品或聚糖制剂，通常为酶处理，以释放样品内存在的聚糖部分；并将处理过的生物样品与包含含有至少一种碳二亚胺和至少一种三唑或2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma pure)的试剂或DMT-MM的醇溶液直接反应，以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。

如上述所用术语“直接”应理解为该样品在进行衍生化反应之前不进行纯化步骤。它不是指一段时间，因此，并不意味着衍生化步骤必须立即进行。在处理步骤和衍生步骤之间可以有一段时间的延迟。

任选地，试剂溶液可以是酸性的，如上所述。

另一方面提供了包含至少一种碳二亚胺和至少一种三唑或2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma pure)的醇溶液，用于衍生化在聚糖部分上存在的唾液酸残基。

还提供了上述醇溶液在衍生化聚糖部分上存在的唾液酸残基中的用途。

优选的醇类和浓度以及溶液的组分及其浓度，在上文中定义。

有利的是，本发明的衍生反应以单一步骤进行，因此可视为“一锅(one-pot)”反应。该(一锅)衍生化反应可以在任何合适的反应温度进行任何合适的时间长度。通常反应时间为约1分钟至约5小时，例如约5分钟至约2小时(例如约15分钟至约1小时)。

通常的反应温度为约0℃至约100℃，例如约10℃至约80℃(例如，从约30℃至约60℃)。

本发明可以在包含例如糖蛋白、糖脂、糖缀合物和其它糖基化分子的任何聚糖制剂上实施。通常，例如，聚糖可以释放自研究的生物样品内含有的含聚糖分子或可保持与其组成部分或部分，例如肽或脂质部分连接。在任一种情况下，这类制剂被称为聚糖制剂。糖蛋白的实施例包括激素，如红细胞生成素。

如本文所用的术语“聚糖制剂”是指根据特定制备方法得到的一组聚糖。在一些实施方案中，聚糖制剂是指从糖蛋白制剂获得的一组聚糖。

如本文所用的术语“生物样品”是指任何固体或流体样品，其由任何活细胞或生物体获得，由任何活细胞或生物体排泄或由任何活细胞或生物体分泌，所述活细胞或生物体包括但不限于组织培养物、生物反应器、人或动物组织、植物、果实、蔬菜、单细胞微生物(诸如细菌和酵母)和多细胞有机体。例如，生物样品可以是生物流体，其获得自例如血液、血浆、血清、尿、胆汁、精液、脑脊液、水性或玻璃体液、或者任何身体分泌物、漏出液、渗出液(例如，从脓肿或者任何其它感染或炎症位点获得的液体)，或者从关节(例如，正常关节或受疾病诸如类风湿性关节炎，骨关节炎，痛风或脓毒性关节炎影响的关节)获得的流体。生物样品还可以是例如从任何器官或组织(包括活组织检查或尸体解剖样本)获得的样品，可包含细胞(无论是原代细胞或培养的细胞)，任何细胞、组织或器官，组织培养物条件的培养基。所述生物样品可以直接使用，或者可以进行一个或多个纯化或反应的步骤以分离和/或提高特定的糖蛋白、糖脂、糖缀合物等的存在。

糖蛋白可以是细胞表面糖蛋白。如本文所用的，术语“细胞表面的糖蛋白”是指这样的糖蛋白，至少其一部分存在于细胞的外表面上。在一些实施方案中，细胞表面糖蛋白是定位在细胞表面上使得至少一个聚糖结构是存在于细胞外表面上的蛋白质。在本公开的许多实施方案中，细胞表面聚糖共价连接至多肽作为细胞表面糖蛋白的一部分。细胞表面聚糖也可以连接于细胞膜脂质，并被称为糖脂。

如本文所用的术语“糖脂”是指包含一个或多个共价连接的糖部分(即，聚糖)的脂质。

所述一个或多个糖部分可以是单糖、二糖、寡糖和/或多糖的形式。所述一个或多个糖部分可以包括糖残基的单个无支链的链，或者可以包括一个或多个支链。在本公开的某些实施方案中，糖部分可以包括硫酸和/或磷酸基团。在某些实施方案中，糖蛋白含有O-连接的糖部分；在某些实施方案中，糖蛋白含有N-连接的糖部分，这是本领域技术人员所理解的，肽骨架通常包含氨基酸残基的直链。在某些实施方案中，肽骨架跨细胞膜，使得其包括跨膜部分和细胞外部分。在某些实施方案中，跨细胞膜的糖蛋白的肽骨架包含细胞内部分、跨膜部分和细胞外部分。在某些实施方案中，本公开内容的方法包括用蛋白酶将细胞表面糖蛋白切割以释放糖蛋白的细胞外部分，或其部分，其中此释放基本上不破裂细胞膜。所述一个或多个糖部分可以是单糖、二糖、寡糖和/或多糖的形式。所述一个或多个糖部分可以包括糖残基的单个无支链的链，或者可以包括一个或多个支链。在本公开的某些实施方案中，糖部分可以包括硫酸和/或磷酸基团。备选地或另外地，糖部分可以包括乙酰基、羟乙酰基、丙基或其它烷基修饰。在某些实施方案中，糖蛋白含有O-连接的糖部分；在某些实施方案中，糖蛋白含有N-连接的糖基部分。在某些实施方案中，本文公开的方法包括分析细胞表面糖蛋白，细胞表面糖蛋白的被释放片段(例如，糖肽)，附着于细胞表面糖蛋白的细胞表面聚糖，细胞表面糖蛋白的肽骨架，这类糖蛋白的片段，聚糖和/或肽骨架及其组合的任一个或所有的步骤。

如本文所用的术语“糖缀合物”，包括其中至少一个糖部分共价连接至至少一个其它部分的所有分子。该术语具体包括所有具有共价连接糖部分的生物分子，包括例如N-连接的糖蛋白、O-连接的糖蛋白、糖脂、蛋白多糖等。

本发明涉及聚糖的连接特异性唾液酸稳定化及其分析。如本文所用的术语“唾液酸”是神经氨酸的N-或O-取代的衍生物的通用术语，九碳单糖。神经氨酸的氨基通常在唾液酸中带有乙酰基或羟乙酰基。在唾液酸上存在的羟基取代基可以通过乙酰化、甲基化、硫酸化和磷酸化修饰。主要的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。唾液酸赋予聚糖负电荷，因为羧基在生理pH下倾向于解离质子。示例性去质子唾液酸如下：

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac；左)和神经氨酸(NEU；右)

本公开的方法可以用于分析在多种状态的任一种下的聚糖，包括例如游离聚糖，糖缀合物(例如，糖肽、糖脂、蛋白聚糖等)，或者细胞或细胞组分等。

还可以希望使用技术人员已知技术标记存在于生物样品或聚糖制剂中的聚糖部分。例如，糖部分的还原末端可以容易地进行标记，如用放射性或非放射性标记同位素、或者荧光或发光标签标记。例如，这类标记试剂可以用来通过将标记试剂的胺官能团与N-聚糖的还原(-CHO)端通过还原氨基化反应标记聚糖。本领域的普通技术人员将理解，多种反应条件可用于促进此还原氨基化反应，因此，设想各种反应条件，一般参见March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,M.B.Smith和J.March,第5版,John Wiley&Sons,2001,和ComprehensiveOrganic Transformations,R.C.Larock,第2版,John Wiley&Sons,1999。合适的还原氨基化条件包括提供还原剂，如NaCNBH₃、2-甲基吡啶硼烷或NaBH(OAC)₃，并保持反应混合物的pH值为酸性至弱酸性。预期如果需要可以在唾液酸衍生化之前采取这类标记，但也可以在衍生化反应之后采取。

衍生化和任选地标记过的唾液酸化的聚糖可以理想地在衍生化和/或标记后进行纯化。可以使用任何合适的纯化技术。在本发明的一个实施方案中，衍生化和任选地标记过的唾液酸化的聚糖可以通过亲水性相互作用色谱(HILIC)，多孔石墨化碳固相萃取(PGC-SPE)，阳离子交换树脂，液-液萃取或前述方法的混合进行纯化。

在一个优选的实施方案中，所述至少一种衍生化和任选地标记过的聚糖可通过HILIC纯化。这可以使用棉绒或其他形式的棉进行。总之，所述至少一种衍生化和任选地标记过的唾液酸化的聚糖被施加到包括棉的固定相上；用第一溶剂清洗固定相；并且用第二溶剂将所述至少一种衍生化和任选地标记过的唾液酸化的聚糖从固定相洗脱。通常，包含所述至少一种衍生化和任选地标记过的唾液酸化的聚糖的所述样品与有机溶剂混合的；其中有机溶剂包括乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或四氢呋喃。

优选地，有机溶剂是乙醇中的25％至80％v/v的乙腈；更优选其中有机溶剂是乙醇中40％至60％v/v的乙腈；更优选其中有机溶剂是乙醇中的50％v/v乙腈。优选地，该样品包含与有机溶剂1:1混合物。

用于洗涤的第一溶剂是包含水、有机溶剂和酸的溶剂混合物。更优选地，有机溶剂是乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或四氢呋喃，并且酸是三氟乙酸(TFA)、甲酸、乙酸、五氟丙酸或七氟丁酸。方便地，上述第一溶剂混合物在水中包括70％至95％v/v的有机溶剂和0.1％至3％v/v酸。优选地，溶剂混合物在水中包含80％和90％v/v的有机溶剂和0.5％至2％v/v酸。优选，溶剂混合物在水中包含85％v/v有机溶剂(通常为乙腈)和1％v/v酸(通常为TFA)。

优选地，第二溶剂包括极性溶剂。更优选地，极性溶剂是水、二甲亚砜或二甲基甲酰胺。任选地，第二溶剂包括比所述第一溶剂极性更大的溶剂。

不希望受理论的束缚，预期清洗从固定除相去除盐、非糖基化肽、脂质、去污剂、过量还原端标签、还原剂、唾液酸活化剂、变性剂、变性蛋白等。

优选地，固定相保持在端部开口的容器中。该容器可以是一端开口，或两端开口的。优选地，所述容器是两端开口的。

任选地，开放末端容器是移液管，多通道移液器或移液管尖端。备选地，开放末端容器可以是多孔板，如96或384孔板的孔。

便利地，纯化步骤可用于提取所述一个或多个衍生化和任选地标记过的聚糖以使其足够纯以供进一步分析，如MALDI-TOF-MS分析。

所述衍生化的唾液酸残基被发现是稳定的并且在进一步纯化之前或之后，反应溶液可以在4℃至10℃存储一段时间(例如1天至数周)，之后进行任何进一步分析。反应的，任选地纯化的样品也可被干燥，随后对恢复的样品进行分析。

通过质谱技术，尤其MALDI-TOF分析进一步分析，是本发明的特别的特征方面。因此，按照本发明，在优选的实施方案中，本发明的上述方法进一步包括将所述衍生的和任选标记过的唾液酸化聚糖通过质谱分析，特别是MALDI-TOF分析，液相色谱仪，气相色谱，毛细管电泳，阴离子交换层析或上述方法的混合进行检测。

本发明人已观察到，分析可通过加入Na⁺，如以NaOH的形式来促进，之后使所述衍生化的样品经过MALDI-TOF分析。通常，0.1至10mM，如0.5至5mM，尤其是1mM Na⁺载体，例如NaOH，可加入到衍生样品所加入的基质材料(0.1至20mg/ml基质浓度，如1至10mg/ml，通常为5mg/ml)中。

本发明人还观察到，杂质，盐加成物的变化形式，和基质结晶的变化形式(可以干扰MALDI-TOF分析)，可以通过对衍生化的样品进行重结晶步骤来去除，之后通过MALDI-TOF分析样品。例如，待分析的纯化衍生化的样品是可以允许干燥以及将重结晶试剂加至干燥的样品以重结晶并进一步纯化待分析样品，其中重结晶试剂为含有最多5％水的乙醇。例如，初始晶体可以通过将样品与基质溶液混合，并允许该混合物干燥来形成。基质溶液例如是在50％乙腈(ACN)中的2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)，基质物质的混合物，如2,5-DHB和2-甲氧基-5-羟基苯甲酸的1:9混合物，或其他(微晶)基质，如6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)，3-氨基喹啉(3AQ)，2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)，2-(4-羟基苯基偶氮)苯甲酸(HABA)或α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。

从前述将能理解本发明可以以手动、半自动化或全自动化的方式实施。

本发明的方法可以用于显著加速工艺开发一个或多个阶段，用于生产治疗或其他商业相关的研究的糖蛋白。可以使用本公开的方法改进的这类工艺开发阶段的非限制性实例包括细胞筛选、克隆筛选，培养基优化，培养条件，工艺条件和/或纯化步骤。本领域技术人员将知道可以改善的其它工艺开发阶段。

代表性的治疗性糖蛋白产品(其生产和/或质量可按照本发明来监测)包括例如各种血液试剂(包括例如免疫球蛋白、红细胞生成素、凝血因子等)，干扰素，集落刺激因子，抗体，酶和激素的任一种。

该方法还可以用于监测在具体细胞培养中发生的糖基化的程度和/或类型，由此允许培养的调整或可能的终止，以便例如获得特定所希望的糖基化模式，或避免特定不需要的糖基化模式的发展。该方法也可以用于例如评估细胞的糖基化特性，甚至在细胞或细胞系已被改造以产生糖蛋白或以产生商业上相关水平的糖蛋白之前使用。

在本公开的一些实施方案中，对于特定的目标糖蛋白所需的糖基化模式是已知的，并且在此描述的技术允许培养物样品的监测以评估用已知产生所期望的糖基化模式的路线进行生产的过程。例如，在靶糖蛋白是治疗性糖蛋白(例如，在一个或多个国家已经经历监管审查)时，将往往希望监视培养以评估它们将产生具有与药品的已建立的糖基化模式尽可能接近相同的糖基化模式的产物的可能性，不论它是否是由完全相同的途径制造。如本文中所使用的“接近相同”是指与药品的已建立的糖基化模式具有至少90％、95％、98％或99％的相关性的糖基化模式。在这样的实施方案中，通常在多个时间点抽取生产培养的样品，并与已建立的标准或控制培养进行比较以评估相对糖基化。

为了提高糖基化位点对酶的可及性，大多数糖蛋白需要的蛋白质变性步骤。通常，这是通过使用去污剂和二硫键还原剂来实现的，而根据本公开内容用于糖蛋白变性的方法并不限于所使用的这些试剂。例如，暴露于高温可以足以使糖蛋白变性，使得用于切割聚糖结构的合适的酶能够进入切割位点。在某些实施方案中，使用去污剂、二硫键还原剂、高温和/或其它试剂或反应条件的组合来变性糖蛋白。应注意的是也能在稀氢氧化铵溶液中去除聚糖。因此，使用PNGase F来将聚糖从糖蛋白裂解的优点是稀氢氧化铵可以另外促进蛋白质底物的溶解性和一些去折叠。此外，N-连接聚糖可以使用化学方法从糖蛋白裂解。例如，N-连接聚糖可以通过用肼处理以提供N-聚糖的酰肼(即，肼解作用)。

详述

现在将参照示出的图示进一步描述本发明。

图1示出了甲酯化PNGase F释放的血浆N-糖组后的反射型正离子模式(RP)MALDI-TOF-MS谱。使用各种活化剂/试剂组合和酸性条件将样品在甲醇中反应。这里展示了在该谱中存在最丰富的二唾液酸化的N-聚糖。2273.804Da的质量对应于完全甲酯化反应产物的[M+Na]⁺，而2281.770Da和2289.736Da的质量对应于缺少一个或两个甲基的种类，具有所得钠盐形成([M-H+2Na]⁺和[M-2H+3NA]⁺)。在2258.804Da处的反应产物表明羰基酰胺化，而2241.777Da指示内酯化的(lactonised)反应产物。基于修饰完整和缺少副反应以及不需要酸，选择EDC+HOBt作为最有希望的。在整个文件用于表示单糖残基的符号为岩藻糖(三角形)、半乳糖(亮圆)、甘露糖(暗圆)、N-乙酰葡糖胺(正方形)和N-乙酰神经氨酸(菱形)，而亚稳态峰由星号指示。在已知唾液酸连接的情况下，α2,3由左角表示，并且α2,6由右角表示。并没有对其他残留物的连接进行评估，并所示出的成分及结构方案基于文献[35，37，38]。

图2示出了用EDC+HOBt使用甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇作溶剂和烷基供体，将血浆N-糖组乙酯化后的RP MALDI-TOF-MS谱。这里示出了具有各种唾液酸连接类型的三唾液酸化组合物。聚糖物质显示出内酯化以及与甲醇(32.026Da)，乙醇(46.042Da)，丙醇(60.058Da)和丁醇(74.073Da)的酯化。所有醇表明为连接特异的唾液酸衍生化的烷基供体，同时甲醇和乙醇显示最高的未优化反应效率。然而，内酯化和烷基酯化的信号的相对比率每个醇都不同。

图3示出了具有指定唾液酸连接(具有α2,3-或α2,6-连接的唾液酸的唾液酸乳糖)的寡糖标准在用EDC+HOBt烷基化之后在不同温度下在甲醇或乙醇中的三次重复分析。图中所示为内酯化和酯化反应产物的平均相对强度，误差线表示标准偏差。2,6-连接的唾液酸显示在所有温度下优选与甲醇和乙醇二者形成酯。而在甲醇中将2,3-连接的唾液酸反应，显示温度依赖性效果，在4℃形成至多93.6％所需内酯化产物(SD±0.9％)。另一方面使用乙醇作为烷基供体在所有温度下显示了平均97.7％(SD±0.9％)的内酯化，并且因此最适于分离α2,3-和α2,6连接的唾液酸。

图4显示了3'-和6'-唾液酸乳糖在37℃用EDC+HOBt在甲醇或乙醇中烷基酯化1小时后的RP MALDI-TOF-MS谱。内脂化反应产物在638.190Da[M+Na]+可见，其中在甲醇和乙醇的情况下酯化质量分别为670.217和684.232Da。在任何情况下，都没有见到678.183Da的质量，这将指示烷基化不足(underalkylation)。在乙醇中反应中显示了唾液酸连接的最高特异性，其中不希望的反应产物仅有最小量的出现。

图5示出了经由A)在37℃下EDC+HOBt乙酯化1h后RPMALDI-TOF-MS，以及B)2-AA标记和利用用荧光检测的HILIC UHPLC研究，所释放的纤维蛋白原N-聚糖。C)单唾液酸化和二唾液酸化结构的三次重复分析以及相对定量表明MALDI-TOF-MS和UHPLC分析的高度相当的相对信号强度。所用缩写为：己糖(H)、N-乙酰己糖胺(N)、岩藻糖(F)，和具有非未指定连接的N-乙酰神经氨酸(S)，通过内酯化所示的α2,3-连接(L)，通过酯化所示的α2,6连接(E)。所附数字表示残基的数目。误差线显示标准偏差。

图6示出了对血浆N-糖组在37℃下实施1小时EDC+HOBt乙酯化方案后的RP MALDI-TOF-MS谱。a)完整的谱图，显示1000Da到5000Da的相对强度。B)3200Da至3800Da的中间范围的谱图。C)3800Da至5000Da的高范围谱图，显示聚糖可衍生化质量达4727.640Da。虽然质量精度使大部分成分可以指认，所示的结构基于文献并且可能不反映实际样品。

图7示出了在37℃下EDC+HOBt乙酯化1小时的重复性测定。将来自常规血浆储存的24份样品独立地通过PNGase F释放、乙酯化、通过HILIC SPE纯化、利用基质结晶、用乙醇重结晶，并且通过RPMALDI-TOF-MS分析。在不同天三次进行该实验，表示为实验1-3。该图显示了所观察到的平均相对强度(标准化到强度之和)，用误差线表示标准偏差。A)乙酯化后所观察的人血浆中20种最丰富N-聚糖的相对分布。B)乙酯化后可观察到的N-聚糖的范围的相对分布。

图8示出了对A)2-AB标记的A2F聚糖标准(二天线岩藻糖化的N-聚糖)和B)2-AB标记的A3聚糖标准(具有α2,3-和α2,6-连接的唾液酸的三天线N-聚糖)实施在37℃下1小时EDC+HOBt乙酯化方案后的RPMALDI-TOF-MS谱。

图9示出了IgG胰蛋白酶糖肽A)在未经衍生的情况下，B)在37℃下用EDC+HOBt在乙醇中孵育1小时后，和C)在4℃下用EDC+HOBt在甲醇中孵育1小时后的RP MALDI-TOF-MS谱。IgG2/3信号(肽序列＝EEQFNSTFR)在括号中显示，IgG1信号(肽序列＝EEQYNSTYR)没有括号，而IgG4信号(肽序列＝EEQFNSTYR)由于其低的相对强度没有被表示。天然分析时，唾液酸化的糖蛋白只显示一个小信号，用亚稳态峰(由加号表示)表示唾液酸的不稳定和损失。对于乙醇和甲醇条件，不再观察到这些亚稳态峰，并且可以观察到唾液酸化物质连同非唾液酸化的变体。用于酯化条件B和C的信号由肽上的一个内酯化和二个酯化(对于乙酯化为+38.05Da，并且对于甲酯化为+10.02Da)产生，对于α2,6-连接的唾液酸还可以观察到一个附加的酯化(分别为28.03Da和14.02Da)。对于乙酯化和甲酯化两个条件，都可以观察到副产物，其中，一种酯化已被替换为内酯化(分别为-46.04Da和-32.03Da；由星号指示)，这对于甲酯化条件来讲这是次要的。

图10示出了A)乙酯化后的牛胎球蛋白N-糖基化以及B)在m/z3213.147[M+的Na]+聚糖物质片段化的RP MALDI-TOF-MS谱，这揭示了在天线N-乙酰葡糖胺之一上存在乙酯化的N-乙酰神经氨酸。

图11示出了乙酯化后的小鼠品系C57BL6血浆N-糖基化的RPMALDI-TOF-MS谱。与乙酯化和内酯化的N-乙酰神经氨酸残基相邻，所观测的信号指示α2,3-和α2,6-连接的N-羟乙酰基神经氨酸的存在和衍生化。而未经修饰的N-羟乙酰神经氨酸有307.09Da(未检出)的质量增量，内酯化和乙酯化变体分别有289.08Da和335.12Da的质量增量。此外，可以观察到O-乙酰化聚糖的存在(m/z 2375.85和m/z 2521.90)。星号表示非聚糖信号。

图12示出了乙酯化后来自小鼠品系CD57BL6血浆的两种聚糖信号的RF MALDI-TOF/TOF-MS/MS谱。A)示出含有乙酯化的(α2,6连接)和内酯化的(α2,3连接)N-羟乙酰神经氨酸的双触角结构的片段化。B)示出的具有两个乙酯化的N-羟乙酰神经氨酸的双触角结构的片段化，其中之一为O-乙酰化的。

实验部分

样品

汇集自20个人供体(Visucon-F冰冻正常对照血浆，柠檬酸和0.02MHEPES缓冲的)的血浆是获得自Affinity Biologicals(安卡斯特，加拿大)。3'-唾液酸乳糖(Neu5Ac(α2,3)Gal(β1,4)Glc)钠盐和6'-唾液酸乳糖(Neu5Ac(α2,6)Gal(β1,4)Glc)钠盐(都具有高于98％的纯度)是从Carbosynth(康普顿，UK)购买的。将3'-和6'-唾液酸乳糖在Milli-Q水中溶解到100mg/mL浓度。来自人血浆中的纤维蛋白原购自Sigma-Aldrich公司(斯德海姆，德国)，并且在1×PBS中，在37℃下孵育4.5小时，得到24.12mg/mL纤维蛋白原溶液。

化学药品、试剂和酶

在该研究中使用的Milli-Q水(MQ)是由Millipore Q-Gard2系统生成的，保持在≥18兆欧。甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丁醇、三氟乙酸(TFA)、冰醋酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、磷酸氢二钠二水合物(Na2HPO4·2H2O)，磷酸二氢钾(KH2PO4)和氯化钠(NaCl)购自默克公司(达姆施塔特，德国)。N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、羟基苯并三唑(HOBt)水合物、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-甲基吡啶硼烷(2-PB)、二甲亚砜(DMSO)、50％氢氧化钠(NaOH)，98％甲酸(FA)，25％氢氧化铵的水溶液(NH4OH)和Nonidet P-40(NP-40)获自Sigma-AldrichChemie(斯德海姆，德国)，而1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)盐酸盐和2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(商品名OxymaPure)源自Fluorochem(哈德菲尔德，英国)。该研究所用其他组分包括购自Roche Diagnostics(曼海姆，德国)的重组肽-N-糖苷酶F(PNGase F)，购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，美国)的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)，购自Bruker Daltonik(不来梅，德国)的2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)和购自Biosolve(法尔肯斯瓦德，荷兰)的HPLC SupraGradient乙腈(ACN)。

N-聚糖的释放

如之前所述，N-聚糖是从人血浆和纤维蛋白原样品中释放的[31]。将10μL样品通过加入20μL2％SDS并在60℃下孵育10分钟变性。释放步骤随后通过加入20μL在2.5×PBS(1×PBS制备为含有5.7g/LNa2HPO4·2H2O，0.5g/LKH2PO4和8.5g/L NaCl的MQ)中含有2％NP-40和0.5mU PNGase F的释放混合物，并在37℃下孵育过夜进行。

活化剂/试剂比较

对各种试剂及其组合测试利用唾液酸甲酯化未纯化的PNGase F释放的血浆N-糖组样品的适用性。将DMT-MM、HOBt、Oxyma Pure、DCC和EDC以0.5M溶解在甲醇中，具有和没有0.2％TFA。将1μL释放的血浆N-糖组(近似14μg血浆蛋白及其糖基化)加入到20μL每种试剂中。此外，将1μL释放的血浆N-糖组加入到20μL甲醇中，其中含有DCC与HOBt，DCC与Oxyma Pure，EDC与HOBt或EDC与Oxyma Pure的试剂组合，每个组分的浓度为0.25M，并且每个条件使用和不使用0.2％TFA。所有样品在60℃下孵育1小时。

反应混合物被发现不直接与MALDI-TOF-MS相容，因为在BrukerAnchorchip靶板上的1μL斑点不充分干燥(均不使用和使用基质)，并且对以这种方式制备的样品的测量未得到可辨的分析物信号。样品对与挥发性有机物(ACN、乙醇、丙酮)的共蒸发或真空压力的应用也没有反应。由于此种原因，样品清理被认为有必要从而从反应混合物中将聚糖富集和纯化，并且我们选择使用棉花作为固定相的HILIC SPE，如前述[32]。

当直接从反应混合物中提取时，聚糖表现出在棉花固定相上保留不足，在分析时得到非常低的质谱信号。因此，在进行聚糖富集和MALDI-TOF-MS分析之前，将20μLACN加入，并将样品在-20℃下孵育15分钟。

醇比较

选择0.25M EDC与0.25M HOBt作为唾液酸酯化最有希望的试剂组合，并且对除了甲醇之外的其它醇进行了测试，以用作组合溶剂和烷基供体。将0.25M EDC与0.25M HOBt分别溶于甲醇、乙醇、2-丙醇和1-丁醇。将1μL PNGase F释放的血浆N-糖组加入每个条件下的20μL溶液，并将样品在60℃下孵育1小时。在此之后，将20μL ACN加入并将样品在-20℃孵育，之后聚糖富集并通过MALDI-TOF-MS分析。

关于α2,3-和α2,6-唾液酸乳糖上的连接特异性

使用具有已知唾液酸连接位点的寡糖标准对0.25M EDC与0.25MHOBt在甲醇和乙醇条件下的连接特异性进行测试。将1μL 100mg/mL(100μg)α2,3-或α2,6-唾液酸乳糖加入到含有0.25M EDC 0.25MHOBt的20μL甲醇或乙醇中。将样品在60℃、50℃、37℃、21℃或4℃下孵育1小时。此后，加入20μLACN，并将所有样品在-20℃下，孵育15分钟，之后进行聚糖富集和通过MALDI-TOF-MS分析。

纤维蛋白原聚糖标记

将纤维蛋白原的PNGase F-释放的N-聚糖的等份通过乙酯化或用2-AA荧光标记还原端，以允许对MALDI-TOF-MS和配有荧光检测的亲水相互作用液相色谱(HILIC)超高液相色谱法(UHPLC)进行比较。对于乙酯化，之前的实验中建立了最佳条件。将1μL纤维蛋白原释放混合物(24.12μg蛋白)加入到20μL 0.25M EDC与0.25M HOBt的乙醇溶液中，并在37℃反应1小时。接着，加入20μL ACN并在聚糖富集和MALDI-TOF-MS分析前将混合物在-20℃下储存15分钟。

对于HILIC-UHPLC，如前述将释放的N-聚糖用2-AA标记[33]。简而言之，将20μL的PNGase F-释放的纤维蛋白原与10μL 2-AA(48mg/mL)15％冰醋酸的DMSO溶液和10μL 2-PB(107mg/mL)的DMSO溶液混合。将混合物在65℃孵育2小时，在HILIC-UHPLC分析之前稀释为75％ACN。

重复性测试

所建立的乙酯化条件的重复性通过几天相同样品的多次分析确定，在96孔PCR板(PP，普拉特，Greiner Bio-One)中进行所有步骤，用胶带(Nutacon，Leimuiden，荷兰)密封用于孵育步骤。每天从相同的汇集血浆取24个独立的血浆样品，并且如之前所述用PNGase F去糖基化。通过加入到含有20μL 0.25M HOBt 0.25M EDC的乙醇溶液的新PCR板中，，并在37℃下孵育1小时，将1μL各个释放样品乙酯化。在此之后，将20μL ACN加入并且将该板在-20℃下储存30分钟。样品通过棉花HILIC SPE纯化，并通过MALDI-TOF-MS测量。用新鲜配制的试剂将整个过程在连续多日中重复两次以建立逐日变化性。

HILIC SPE聚糖富集

如前述通过棉花HILIC SPE进行聚糖富集[32]，并有一些改善。从-20℃去除的样品被允许回温到室温，之后处理。将20μL的移液器头(Rainin仪器，奥克兰，美国)用200μg棉花(HEMA，荷兰)填充，然后将其通过吸移20μL MQ三次进行调节，并将其用20μL 85％ACN平衡三次。然后通过吸移20次将样品装载至反应混合物中。吸移样品时，需要小心注意不包括沉淀，因为尖端堵塞会使该过程更加困难。在一定角度下移液被证明是防止沉淀干扰的简单方法，并取得了很好的结果。将尖端用20μg 85％乙腈0.1％TFA清洗三次，并用20μg 85％ACN清洗三次。以10μLMQ进行随后的洗脱。在96孔板型的情况下，将12通道移液器用于所有步骤。

HILIC-UHPLC测量

2-AA标记的N-聚糖的分离和分析是使用具有荧光检测的HILIC-UHPLC进行的。对于这一点，使用Dionex Ultimate 3000(ThermoFisher Scientific，布雷达，荷兰)，其具有1.7μm 2.1x100mm的Acquity UPLCBEH聚糖柱(Waters)。将柱烘箱温度设定为60℃，流速为0.6mL/min。两种溶液被用于梯度产生，ACN作为溶液A，以及100mM甲酸铵(由NH4OH将FA缓冲至pH4.4制备)作为溶液B。将样品用75％溶液A(残留百分比始终是溶液B)转移，并且在分离前将柱用85％A冲洗10分钟。流动梯度以75％A开始并在45分钟内直线下降到57％A。然后将该柱用40％A再冲洗10分钟，随后用85％A冲洗10分钟。荧光检测所记录的色谱图是使用Chromeleon版本7.1.2.1713(Dionex)进行分析的。

MALDI-TOF-MS

对于MALDI-TOF-MS分析，将1μL通过棉花HILIC SPE纯化的聚糖样品点于MTP AnchorChip800/384TF MALDI靶(Bruker Daltonik，不来梅，德国)上，在板上与50％ACN中的1μL 2,5-DHB(5mg/mL)混合，并放置干燥。这样点板，RF MALDI-TOF-MS谱表明[M+Na]+和[M+K]+物质几乎是1:1的比例，由此使分析复杂化。将1mM氢氧化钠加入至基质溶液中以纠正这个问题，示出几乎仅有[M+Na]+物质。

通过加入0.2μL乙醇均匀化基质晶体，造成快速重结晶，并且从而提高点到点的重现性和减少盐加成可变性。因为点结晶最终由重结晶步骤确定，点的样品可以在最初空气干燥或在氮气流下快速干燥而没有可辨别的谱差异。

通过反射型正(RP)离子模式的UltraFlextremeMALDI-TOF/TOF-MS(Bruker Daltonik，不来梅，德国)，采用Flexcontrol 3.4Build 119进行分析。样本测量之前，将谱用肽校准标准(Bruker Daltonik，不来梅，德国)的已知质量进行校准。所有样品通过smartbeam-II激光电离，并在140ns延迟萃取后用25kV加速。将m/z 100至1500的质量窗口用于α2,3-和α2,6-唾液酸乳糖分析，以及对于纤维蛋白原和血浆N-聚糖样品，m/z 1000至5000的窗口抑制高达m/z 900。对于各个谱，20000激光发射在2000Hz的激光频率处累积，每个栅格点使用200次发生的完全样本无规行走。将高激光强度用于样品分析，以允许离子化更大的聚糖物质，并确保该单同位素物质对所有可检测的质量来说仍是清楚地限定的。

采用激光诱导解离的LIFT阳性模式，对人血浆N-糖组中最丰富谱峰进行串联质谱。

MALDI-TOF-MS数据的分析

使用flexAnalysis V3.3Build 65(Bruker Daltonik)，所获得的MALDI-TOF-MS谱使用不同的校准质量内部重新校准。用于聚糖注解的缩写是：己糖(H)、N-乙酰己糖胺(N)、岩藻糖(F)和具有未指定连接的N-乙酰神经氨酸(S)，所附数字表示残基的数目。对于聚糖组分H3N4F1、H4N4F1、H5N4F1、H5N4S1、H5N4F1S1、H5N4S2、H6N5S3、H6N5F1S3和H7N6S4，根据进行的衍生化使用不同唾液酸计算质量为[M+Na]+。对于纤维蛋白原样品，仅H5N4S1和H5N4S2质量用于校准，并且对于唾液酸乳糖，将对烷基化和内酯化的唾液酸变体计算H2S1值。采用0.5Da的质量窗口使用质心算法在谱中将质量提取出来，随后二次校准。将重新校准的谱导出为文本格式，并使用定制软件进一步分析。简言之，使用确定的聚糖组合物列表进行分析，为目标数据提取。对每种组合物计算同位素分布以及相应的质量。对于累计同位素簇的95％范围内的每个同位素，在1Da的质量窗范围内累加谱值。然后对于1Da区域加和比同位素簇少1Da的噪声，并且从各个同位素中扣除(仅仅获得信号值)。将所观察到的同位素比率与计算出的相比，以防止由于重叠导致的误差，在此之后，将各个同位素值相加，得到一个聚糖组合物值。通过用所有值的总和除以各个值，在各个谱中建立这些聚糖值的相对分布。计算重复实验的均值和标准差。

IgG的分离

通过使用蛋白G琼脂糖珠子(GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典)从健康对照血浆纯化得到IgG。将该珠子用1×PBS清洗三次，并将其与150μL的1×PBS一起加载到低结合350μL的MultiScreen过滤板(Millipore公司，阿姆斯特丹，荷兰)(每孔加15μL的珠子)上。将2μL血浆加入到每孔的珠子中并在摇动平台(600RPM)上孵育1小时使用真空歧管。将具有所吸附IgG的珠子用200μL的1×PBS清洗三次，并用200μL的MQ清洗三次。对于洗脱，将100μLMQ中的100mM的甲酸(Sigma-Aldrich)加入到珠子中并收集洗脱液。随后，将洗脱液干燥并溶解在20μL 50mM碳酸氢铵(ABC)(Sigma-Aldrich)中。将所分离的IgG储存在-20℃下直至使用。

胰蛋白酶消化IgG

将分离的IgG通过TPCK处理的胰蛋白酶(Roche Diagnostics)进行消化。向各个孔(在20μL 50mM的ABC中含有约20μg IgG)中加入2μg胰蛋白酶(1:10，酶：蛋白)，并将该板以600RPM振摇10分钟。在确认pH为6至10后，将消化的混合物在37℃孵育过夜。

牛胎球蛋白

在25mM的ABC中将牛胎球蛋白(Sigma-Aldrich)溶解至10.9mg/mL的浓度，其中10μL进行PNGase F释放。如前述(图10A)进行乙酯化、棉花HILIC-SPE和MALDI-TOF-MS分析。进行MS/MS表明乙酯化和区分连接到N-乙酰葡糖胺残基的唾液酸(图10B)。

小鼠血浆的N-糖组

小鼠品系C57BL6混合性别NaEDTA缓冲的汇集的血浆是从创新研究(Innovative Reasearch)(IMS-C57BL6-N，Novi，MI)获得。将20μL该血浆通过PNGase F释放，将其中1μL乙酯化，由棉花HILIC-SPE富集聚糖，并通过MALDI-TOF-MS(图11)进行分析。进行MS/MS表明α2,3-和α2,6-连接的N-羟乙酰基神经氨酸衍生成内酯和乙酯(图12A)，以及通过乙酯化反应将唾液酸O-乙酰化保留(图12B)。

结果

利用唾液酸残基的连接特异性衍生化开发了分析人血浆N-聚糖的稳健的高通量的MALDI-TOF-MS方法。对反应条件进行了优化，以实现对2,6-连接的唾液酸残基乙基化，而2,3-连接的唾液酸经历内酯形成。从10μL人血浆开始，实现了允许区分114种聚糖物质(图6)的聚糖分布。方法开发和验证在下面描述。

不同活化剂/试剂的比较

对于在不纯的N-聚糖混合物中唾液酸残基的连接特异性甲酯化，比较了许多偶联剂及其组合。将市售的汇集血浆(10μL)进行PNGase F处理以获得具有游离N-聚糖的复杂样品。血浆N-糖组包含一大组N-聚糖组合物，包括中性以及具有不同连接的高度唾液酸化的物质[34，35]，并且因此是研究唾液酸修饰方法总体效果的信息量大的样品。所有反应均使用甲醇作为甲基供体和溶剂，直接对未纯化的PNGase F释放混合物进行。将样品在60℃在含有偶联/活化试剂DMT-MM、DCC、EDC、HOBT或Oxyma Pure的甲醇(每个使用和不使用0.2％TFA)中反应1小时。此外，尝试试剂组合DCC+HOBt，DCC+Oxyma Pure，EDC+HOBt和EDC+Oxyma Pure(每个使用和不使用0.2％TFA)。在1小时的孵育步骤中，白色沉淀在样品底部形成，导致混合物(包括聚糖和偶联试剂)中甲醇可溶成分和含蛋白质的甲醇不溶级分的分离。

样品清理被认为是从反应混合物富集和纯化聚糖所必需的，并且我们选择了使用棉花作为固定相的HILIC SPE，如前所述[32]。25至75％浓度的ACN导致优良的保留而对于低或高质量聚糖没有明显偏差，并且选择50％ACN间断值。来自反应的醇溶液和乙腈的1:1混合物示出额外沉淀物的形成，因此将样品在-20℃下孵育15分钟，以加速该过程。为了实施HILIC SPE，将200μg棉花填充至枪头(tips)，用3×20μL MQ和3×20μL85％ACN清洗，通过吸移20次将样品装载至反应混合物中，用3×20μL85％ACN 1％TFA3×20μL85％ACN清洗，并用10μL的MQ洗脱。小心移液是必要的，以防止枪头阻塞。

然后将1μL纯化的样品点在AnchorChip MALDI板上并用1μL2,5-DHB(5mg/mL)作为基质共结晶。为了防止钾加合物的形成，将1mMNaOH加入到基质溶液中，几乎仅得到[M+Na]+物质。用0.2μL乙醇进行重结晶以减少点对点的变化，并进一步降低盐加成的多样化。

各种反应条件的有效性通过考虑到唾液酸化N-聚糖的质量(最显着的是H5N4S2，在血浆N-糖组中最突出的聚糖组合物)来决定(图1)。由所希望的甲酯化引起的质量漂移是每唾液酸+14.016Da，导致对于完全酯化的主要血浆N-聚糖H5N4S质量为22273.804Da[M+Na]+。当与额外的钠(每唾液酸21.982Da)相关时，未修饰的唾液酸仅见于RP模式下，使得在2281.770和2289.736的信号指示不完全反应。此外，该唾液酸中的一种的内酯化是可以观察到的，得到18.011Da的质量损失，导致在m/z 2241.777[M+Na]+的信号。

单一试剂DCC、EDC、HOBT和Oxyma Pure被证明无法修饰唾液酸，不管在反应过程中是否使用酸。DMT-MM的确示出唾液酸残基的甲酯化，但在m/z 2240.792(与预期修饰的质量差-33.012Da，与内酯化产物有重叠)也产生了一个突出的峰，以及羰基基团的酰胺化(-0.984Da)。这些副产物在很大程度上通过将0.2％TFA加入至反应中来防止，但强酸性条件可以导致部分去唾液酸化和其它不稳定取代基的损失。试剂组合DCC+HOBt、DCC+Oxyma Pure和EDC+Oxyma Pure各自都示出了可观的唾液酸残基甲酯化，但钠加成物的存在还指示了转换是不完全的。这很大程度上但不完全由酸性条件校正。EDC+HOBt似乎是最有希望的试剂组合，其示出无论是否使用酸都完全转化，并因此被选择用于进一步的实验。

不同醇的测试

EDC+HOBt被选择为唾液酸酯化最有希望的试剂混合物，并在下面对各种醇进行了测试以作为组合的沉淀剂和烷基供体。使用20μL的甲醇、乙醇、2-丙醇和1-丁醇，1μL的血浆N-糖组溶液在60℃反应1小时。2-丙醇和1-丁醇表现为在室温下仅部分地溶解EDC和HOBt，因此，使用充分匀化的悬浮液。如上所述进行纯化，点样和RP MALDI-TOF-MS测定。

唾液酸化聚糖组合物的分析表明，所有的醇是唾液酸酯化的烷基供体(图2)。以三唾液酸化的聚糖组合物H6N5S3和H6N5F1S3为例进行了研究。用甲醇、乙醇、2-丙醇和1-丁醇衍生化后预的期质量分别为，对于组合物H6N5S3为2944.047、2986.094、3028.141和3070.188Da，并且对于H6N5F1S3为3090.105、3132.152、3174.199和3216.246Da，在所记录的谱中都可以观察到。此外，内酯化产物存在于所有谱中，质量差异为32.026、46.042、60.058和74.073Da，但内酯化和烷基酯化的信号的相对比率对于每种醇不同。除了预期物质，异丙醇显示了多种反应产物，并且异丙醇和1-丁醇对于唾液酸化聚糖都得到了相对低的信号。甲醇和乙醇被选定为最有希望的用于连接特异性唾液酸修饰的溶剂和醇供体，并用于进一步的方法开发。

获得连接特异性

对与甲醇和乙醇的组合的EDC+HOBt的连接特异性，使用具有已知的唾液酸连接类型的寡糖标准进行了研究，所述具有已知的唾液酸连接类型的寡糖标准即3'-唾液酸乳糖(Neu5Ac(α2,3)Gal(β1,4)Glc)和6'-唾液酸乳糖(Neu5Ac(α2,6)Gal(β1,4)Glc)，两者都具有高于98％的纯度。为了进一步研究对连接特异性的温度效应，将样品不仅在60℃下进行反应1小时，而且在50℃、37℃、21℃、4℃进行反应。如上所述进行纯化、点样和RPMALDI-TOF-MS测定。

在内酯化反应产物(在各种条件下638.190Da)以及甲酯化和乙酯化产物(分别为670.217和684.232Da)之间进行相对定量(图3)。没有发现未修饰的反应产物(678.183Da)，表明所有的唾液酸被酯化或被内酯化。显示α2,6连接的唾液酸对烷基化高度敏感，因为无论甲醇还是乙醇都能产生近乎完全酯化(图4)。但是，α2,3连接的唾液酸在甲醇中的内酯化显示温度依赖性的转变，在较低温度形成较低量的副反应(甲醇酯化)。使用甲醇，校正内酯化从在60℃下只有53.9％(SD±1.5％)至在4℃下93.6％(SD±0.6％)。然而，乙醇环境对于2,3连接的唾液酸内酯化表现出高得多的偏好，在所有的温度下平均表现为仅2.3％(SD±0.9％)的副反应(乙醇酯化)。由于3'和6'-唾液酸乳糖反应产物之间的几乎完全不同，选择乙醇作为较好的溶剂和供体，用于通过EDC+HOBt的连接特异性唾液酸修饰。对于进一步的实验，反应条件设定为在37℃1小时，以允许在大多数实验室容易获得的受控的温度条件。

也可以衍生化和分析含N-羟乙酰基神经氨酸物质。

唾液酸稳定性

从纤维蛋白原释放的H5N4S1和H5N4S2聚糖的比率在乙酯化之后通过MALDI-TOF-MS测定，并与2-AA标记后的HILIC-UHPLC比较。单唾液酸化聚糖和二唾液酸化聚糖的重复三次分析和相对定量示出了高度可比的信号，对于MALDI-TOF-MS平均为65.3％和34.7％(SD±1.5％)并且对于UHPLC测量则为66.4％和33.6％(SD±0.2％)(图5)。MALDI方法的标准偏差明显比UHPLC方法高，但对于较小的峰仍具有4.3％的变异系数(CV)，而对于较大的峰为2.3％。观察到的比率是主要单唾液酸化聚糖与二唾液酸化双天线聚糖的比率，其是通过质谱法和UHPLC确定的，与文献非常相似一致(来自纤维蛋白原的唾液酸化N-聚糖分布分别为61.94％和38.06％)[36]。

重现性

使用1小时37℃EDC+HOBt乙酯化的人血浆N-糖组分布的可重复性在三个不同日子通过多次重复分析证明。将收集的血浆分为24个独立样品，将聚糖用PNGase F释放，乙酯化，通过棉花HILIC SPE纯化，并通过RP MALDI-TOF-MS进行分析。对聚糖信号进行整合，标准化为强度之和，并且计算相对信号和标准偏差。将该方案额外进行两天来说明每天的变化。

使用乙酯化方案的血浆分布表明聚糖[M+Na]+质量范围为1257.423Da(H5N2)至为4727.640Da(H10N9F1，仅有四个内酯化的唾液酸(简称L)，表明α2,3连接)(图6)。谱图中可以测到总共217个不同同位素簇(平均质量偏差0.012Da)，其中114个可以归属于质量偏差低于0.05Da内的聚糖组合物且，占总谱的约90％。不能被分属于天然聚糖质量的最常见信号显示101.051Da的质量，其比相关的主要聚糖峰更低，表示可能的在N-乙酰氨基葡糖的还原端的0,2A跨环片段化。

源自同一血浆汇集物的24个独立样品中，对20个最高丰度的聚糖(占谱图的累积聚糖分布的94％)的重复性分析，显示一批内的高再现性，以及在不同天制备和测定的三批之间的高再现性。对于最高峰(具有两个酯化唾液酸的H5N4(简称E)，表示α2,6连接)的平均相对强度值对所有测量结果为约54.7％(SD±2.3％)，其中CV平均约为3.8％(图7A)。所有归属的聚糖质量分析显示合理的重现性，即使对于低于累积分布0.1％的值(图7B)。

还原端标记的N-聚糖的衍生化

为了测试还原端标记的聚糖衍生化的乙酯化条件，2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记的A2F和A3聚糖标准获自Ludger有限公司(阿宾登，英国，产品编号CAB-A2F-01和CAB-A3-01)，并将其溶解于MQ浓度至5μM。将1μL这些溶解的标准样品加入到20μL乙基化试剂中，并在37℃下进行1小时的孵育。在加入20μL乙腈之后，将聚糖通过棉花HILIC-SPE回收，通过MALDI-TOF-MS研究(图8)。

聚糖组合物和唾液酸连接的质谱归属是在与由供应商(HILIC HPLC分布，糖苷外切酶消化)进行的归属是一致的。没有观察到可以表示由于在聚糖还原末端2-AB标记导致的副反应或不完全反应的产物的信号。

Ig消化和用于糖肽衍生的醇比较

根据该释放聚糖的方法，0.25M EDC和0.25M HOBt一起被选为最有希望的羧酸活化剂。甲醇和乙醇都用作用于酯化反应的烷基供体和溶剂。对于这两种情况下，将1μL粗制IgG消化物与20μL试剂孵育，在37℃下进行孵育1小时(乙酯化)，或在4℃下进行孵育1小时(甲酯化)，先前观察的条件得到反应产物有最高的连接特异性。此后，将20μLACN(50％，v/v)加入，通过棉花HILIC将修饰的糖肽从反应混合物中富集，并且通过MALDI-TOF-MS进行分析(图9)。

本发明提供了优于用于唾液酸化聚糖衍生化及分析的其他现有技术的许多明显优势。例如，已经开发的试剂显示样品杂质的高耐受性，允许未富集样品的唾液酸衍生化。还具有对于唾液酸酯化反应的高特异性，对酰胺化、烷基化不足和过度烷基化以及其它副反应具有显著的抗性。所使用的温和反应条件防止了唾液酸和其他不稳定基团的损失。例如，唾液酸的乙酰化可以在衍生后保留。因此，本发明可以在测量糖蛋白的乙酰化状态方面应用。这可以应用于分析销售的和/或由受试者采集的激素，并且可以应用于例如，在药物表征和/或兴奋剂检查-，例如分析红细胞生成素。

此外，试剂的速度和易于使用(仅加入试剂以及等待15-60分钟)，其稳定性(在-20℃12周)，低毒性，在α2,3-和α2,6-连接的唾液酸之间非常高的连接特异性以及与HILIC样品净化的兼容性是进一步的优点。

最后，发明人已经能够观察到在PNGaseF释放血浆N-糖组(最高达4800Da)的MALDI-TOF-MS分析中非常高的质量，并在分析模式下的良好的重现性。

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Claims (26)

1.一种用于衍生化聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，所述方法包括：

将生物样品或聚糖制剂与包含至少一种碳二亚胺以及至少一种三唑或2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma pure)的试剂反应，以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在衍生化之后，观察到少于1％的酰胺化。

3.根据权利要求1所述的方法，其中唾液酸的乙酰化随衍生化被保留。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述至少的碳二亚胺是例如以其盐酸盐的形式的N,N′-二环己基碳二亚胺(DDC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。

5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述三唑是羟基苯并三唑(HOBt)，通常以水合的形式，诸如一水合物。

6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述试剂是混合物，诸如DCC与HOBt，DCC与oxyma pure，EDC与HOBt以及EDC与oxymapure。

7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述试剂在醇溶液，如甲醇、乙醇、(异)丙醇或丁醇中提供。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述醇是乙醇。

9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法在酸性或中性条件下进行。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法是在酸性条件下进行的，诸如通过加入三氟乙酸(TFA)，诸如0.1％至0.4％的TFA进行。

11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法是对纯的或不纯的样品进行的。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述不纯的样品是生物样品，诸如已经经过酶消化的血浆、免疫球蛋白或纤维蛋白原样品。

13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述聚糖部分在衍生化之前或之后被标记，诸如用放射性或非放射性标记同位素、或者荧光或发光标签标记。

14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述衍生化的和任选地标记的唾液酸化聚糖在衍生化和/或标记之后被纯化，诸如通过亲水性相互作用色谱(HILIC)，例如棉绒，多孔石墨化碳固相萃取(PGC-SPE)，阳离子交换树脂，液-液萃取或前述方法的混合纯化。

15.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述方法还包括将存在于所述聚糖部分上的所述衍生化的唾液酸残基进行分析，诸如通过对不同连接的唾液酸的合适的分离和检测方式，诸如通过质谱技术分析。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述质谱技术为MALDI-TOF分析，并且任选地将Na⁺，诸如以NaOH的形式，加入到衍生化的样品中，之后使所述衍生化的样品经过MALDI-TOF分析。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在通过MALDI-TOF分析所述样品之前，使所述衍生化的样品经过重结晶步骤。

18.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述方法用于检测和/或确定唾液酸乙酰化和/或唾液酸化。

19.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述方法用于衍生化连接至任意单糖的唾液酸。

20.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述方法用于衍生化与另一个含有唾液酸的部分(诸如通过α2,8连接于N-乙酰神经氨酸或N-羟乙酰神经氨酸)、己糖(诸如通过α2,3连接或α2,6连接于半乳糖)或N-乙酰己糖胺(诸如通过α2,6连接于N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之一连接的唾液酸。

21.一种醇溶液，其包含至少一种碳二亚胺以及至少一种三唑或2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma pure)，用于将存在于聚糖部分上的唾液酸残基衍生化。

22.一种用于衍生化聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，所述方法包括：

处理生物样品或聚糖制剂，通常为酶处理，以释放所述样品内存在的聚糖部分；并将处理过的生物样品与包含含有至少一种碳二亚胺和至少一种三唑或2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma pure)的试剂或DMT-MM的醇溶液直接反应，以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。

23.根据权利要求22所述的方法，其用于还原端标记的聚糖的乙酯化。

24.根据权利要求22所述的方法，其用于糖肽的甲酯化/乙酯化。

25.根据权利要求1至20或22中的任一项所述的方法，其中唾液酸的乙酰化随衍生化被保留。

26.一种用于衍生化在聚糖部分上存在的唾液酸残基的方法，所述方法包括：

将生物样品或聚糖制剂与DMT-MM在酸性条件下反应；以将在生物样品中存在的聚糖部分上可存在的任何唾液酸残基衍生化。