CN102702374A - 制备多糖衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

制备多糖衍生物，其在含水溶剂中具有高溶解度。本发明的制备方法使用了通式(1)所表明的化合物作为缩合剂，并且使具有羧基的多糖与有机化合物进行反应，从而制备多糖衍生物，该有机化合物具有能够与羧基缩合的官能团：R1和R2独立地表示选自1至4个碳原子的烷基和6至8个碳原子的芳基的取代基；Z-代表反阴离子；E+代表如下表示的有机基团：R3、R4和R5独立地表示具有至少一个直接与季氮原子键合的碳原子的有机基团，并且R3、R4和R5中的任何两个或其全部，可以彼此连接，形成环状结构。

Description

制备多糖衍生物的方法
本申请是中国专利申请200780015807.0的分案申请。
技术领域
本发明涉及制备多糖衍生物的方法。
背景技术
按照多糖的构成单糖的类型，存在各种不同的多糖。多糖具有不同的分子量、特性和生理功能，并且是深入研究的时兴目标。
正如本领域已知的那样，具有能够与羧基缩合的官能团的化合物与透明质酸的羧基，(认为透明质酸是高分子量多糖)的偶合，可以降低所得到透明质酸衍生物的亲水性，并且引起溶解度小或甚至不溶解的问题。
使羧基-可连接的亲核官能团与透明质酸的羧基偶合的一个传统已知技术是使用水溶性的碳二亚胺(WSC)，以使透明质酸与氨基在含水溶剂中反应(JP 2004-018750和WO2005/085294)。下文将该技术称为WSC方法。通过WSC方法获得的透明质酸衍生物具有溶解度小或不溶解的问题。按照JP 2004-018750中的说明，当透明质酸的每个双糖单位引进化合物比率(取代度)不小于0.05％时，分离的透明质酸衍生物不溶于中性含水溶剂。当取代度不小于5％时，分离的透明质酸衍生物不溶于含水溶剂。
对于这种不溶解的问题，JP 2004-018750中推荐的制备方法是，透明质酸的缩合反应之后，向反应溶液中添加碱。这种碱处理使WSC方法制备的化合物能够溶于中性含水溶剂。WO2005/085294也采取了JP 2004-018750的这种碱处理步骤，从而制备所得到透明质酸衍生物的中性水溶液。换句话说，JP 2004-018750和WO2005/085294采取了两步制备方法：包括WSC方法的缩合反应步骤，和碱处理步骤，从而制备可溶于含水溶剂的透明质酸衍生物。
如JP 2004-018750所述，预期通过常规WSC方法制备的透明质酸衍生物在其高级结构方面具有变化，这可以以在中性含水溶剂中不溶解现象的形式观察到。WSC方法的缩合条件导致透明质酸衍生物不溶于中性含水溶剂。WSC方法之后进行碱处理，如JP 2004-018750所述，可以恢复透明质酸衍生物的溶解性。水溶性的恢复是由于通过WSC方法改变的高级结构的进一步改变或恢复。
JP 2004-018750所描述的碱加入步骤(碱处理)，可以使缩合反应期间已经改变的高级结构得到进一步改变或恢复，从而恢复曾经失去的、对含水溶剂的高亲合性。
可商业购买的缩合剂4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉
Figure BSA00000709355700021
氯化物(DMT-MM)可以使羧基和羧基-可连接的亲核官能团缩合，并且通过低分子物质的缩合而主要用于合成酰胺化合物。按照Tetrahedron 55(1999)13159，DMT-MM在含水溶剂中活化羧基，并且帮助与氨基高速形成酰胺键。JP 2005-281372描述了DMT-MM在羧基引进的环糊精衍生物的羧基和壳聚糖的氨基之间形成酰胺键的应用。然而，JP 2005-281372的这种制备方法的目的在于得到不能溶解的衍生物。为了制备水溶性的衍生物，DMT-MM应用于高分子量多糖(例如透明质酸)的羧基与有机化合物羧基-可连接的官能团的缩合反应一直没有报道。对于描述所得到衍生物水溶液的特性或所得到衍生物的高级结构的变化，也没有报道。
本发明公开内容
用于缩合反应的传统水溶性缩合剂(水溶性的碳二亚胺)，已经用于在多糖的羧基和有机化合物的可以与羧基缩合的官能团之间形成化学键。然而，所制备的多糖衍生物不能均匀地溶于中性含水溶剂中。为了提高产物的溶解性，缩合反应之后，需要向反应溶液中加入碱的额外步骤。
还有很高的开发简单方法的需求，要求这种方法通过具有羧基的多糖与具有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物进行偶合反应，能够制备高度可溶性产物。
如上所述，通过透明质酸或具有羧基的其它多糖，和具有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物进行反应所制备的现有技术的多糖衍生物，在它们的高级结构方面具有显著的变化，并且在中性含水溶剂中不容易溶解。
为了解决现有技术的这种问题，并且为了设计制备多糖衍生物的简单和有效的方法，本发明人进行了深入的研究。深入研究的结果是，本发明人发现，使用特定缩合剂来代替传统上使用的缩合剂WSC，可以容易且有效地获得有用的多糖衍生物，其在含水溶剂中具有良好的溶解性，由此完成了本发明。
因此，本发明涉及制备高分子量多糖衍生物的简单和有效的方法。
本发明的目的是提供制备多糖衍生物的方法，该衍生物中具有羧基的多糖与具有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物进行键合。
其包括：通过利用通式(1)所表示的缩合剂，使多糖与有机化合物进行反应：
Figure BSA00000709355700031
R1和R2独立地表示选自具有1至4个碳原子的烷基和具有6至8个碳原子的芳基的取代基；Z-代表反阴离子；E+表示下列基团：
Figure BSA00000709355700032
R3、R4和R5独立地表示具有至少一个直接与季氮原子键合的碳原子的有机基团，并且R3、R4和R5中的任何两个或其全部，可以彼此连接，形成环状结构。
本发明的进一步目的是提供如上所述方法，其中带有羧基的多糖具有不小于10,000的分子量。
本发明的进一步目的是提供如上所述方法，其中带有羧基的多糖是葡胺聚糖(又称粘多糖)。
本发明的进一步目的是提供如上所述方法，其中带有羧基的多糖是透明质酸。
本发明的进一步目的是提供如上所述方法，其中透明质酸具有不小于100,000的重均分子量。
本发明的进一步目的是提供如上所述的方法，其中带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物，是具有羟基或氨基的有机化合物，且其中多糖和有机化合物通过酯键或酰胺键进行键合。
本发明的进一步目的是提供如上所述的方法，其中带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物，是具有至少一个氨基的有机化合物，其中多糖和有机化合物通过酰胺键进行键合。
本发明的进一步目的是提供如上所述的方法，其中带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物，是通过将带有至少两个官能团的间隔物质与带有官能团的生理活性物质或与带有官能团的药用物质进行共价键合来制备的，间隔物质的至少两个官能团包括能够与羧基缩合的官能团、和能够与生理活性物质或药用物质的官能团形成共价键的官能团。
本发明的进一步目的是提供如上所述方法，其中药用物质是非甾族抗炎症药物或改善疾病的抗风湿药物。
本发明的进一步目的是提供如上所述方法，其中共价键是酯键或酰胺键。
本发明的进一步目的是提供如上所述方法，其中带有至少两个官能团的间隔物质选自氨基醇、亚烷基二胺和氨基酸。
本发明的进一步目的是提供如上所述的方法，其中在通式(1)中，R1和R2独立地选自甲基、乙基和苯基，E+是N-甲基吗啉
Figure BSA00000709355700041
基团，Z-是氯阴离子、高氯酸根阴离子或四氟硼酸根阴离子。
本发明的进一步目的是提供如上所述的方法，其中通式(1)表示的化合物是4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉
Figure BSA00000709355700051
氯化物。
本发明的进一步目的是提供制备多糖衍生物的方法，包括：
(A)利用如上所述方法制备多糖衍生物；和
(B)使碱与步骤(A)中制备的多糖衍生物进行反应。
本发明的进一步目的是提供如上所述的方法，其中多糖衍生物的1％(w/v)水溶液不浑浊，而是清澈的，并且在如下条件下，不包含可见的固态物质：在室温下，通过在220rpm下进行摇动过夜，多糖衍生物溶于水中。
本发明的进一步目的是提供如上所述方法，其中通过孔径0.22μm多孔过滤器过滤后，1％(w/v)水溶液的浓度没有显著的降低。
本发明的进一步目的是提供制备透明质酸衍生物的方法，该衍生物中透明质酸与非甾族抗炎症药物结合，其羧基被氨基醇的羟基酯化，包括使酯化非甾族抗炎症药物的氨基醇的氨基与透明质酸的羧基进行缩合，
其中缩合反应是利用通式(1)所表示的缩合剂进行的，和
其中非甾族抗炎症药物具有通式(3)所示结构：
Figure BSA00000709355700052
R6表示氢原子或选自低级烷基和低级烷氧基的取代基；R7、R8和R9独立地表示卤素原子、氢原子或选自低级烷基、低级烷氧基和羟基的取代基；和X独立地表示卤素原子或选自低级烷基和三氟甲基的取代基，并且至少一个X是卤素原子。
本发明的进一步目的是提供如上所述的方法，其中示于通式(1)的化合物是4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物。
本发明的进一步目的是提供如上所述方法，其中氨基醇由下式表示：
H2N-(CH2)n-OH
n表示2至12的整数。
优选实施方案说明
下面详细参考一些实施方案来描述本发明。
除非另作说明，在本发明中使用的含水溶剂可以是水、含有水的缓冲溶液、水溶液和含有药用金属盐和pH值调节剂的缓冲溶液中的任一项。含水溶剂的典型实例包括注射用蒸馏水、磷酸盐缓冲盐水和生理盐溶液。除非另作说明，在本发明中，多糖的分子量由重均分子量表示。
本发明提供了制备多糖衍生物的新方法。
用作本发明方法的起始原料的多糖是具有羧基的多糖，并且优选具有羧基和不小于10,000分子量的多糖。多糖可以是从例如动物中提取和分离的天然多糖、由基因修饰微生物制备的人造多糖、和由化学合成制备的合成多糖以及可商业购买的多糖。多糖可以是由具有羧基的单糖组成的葡胺聚糖。多糖还可以是中性碳水化合物聚合物的化学上羧甲基化的衍生物例如羧甲纤维素。具有羧基的葡胺聚糖的具体例子包括透明质酸钠、软骨素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素和N-乙酰基肝素(acetylheparosan)。
本发明制备方法的效果(后面详细地描述)是，所得到多糖衍生物在含水溶剂中具有高溶解度，具有高分子量和相对低的取代基例如硫酸酯基团(其可以提高多糖的水溶性)含量的多糖尤其突出。获得显著效果的多糖的典型实例是透明质酸。
透明质酸是含有D-葡醛酸(glucronic acid)和N-乙酰基-D-氨基葡糖的二糖单元的聚合物。在本说明书中，透明质酸可以是经过修饰的透明质酸，其具有二糖单元的重复结构和至少一个未修饰的羧基。
在本发明制备方法中用作起始原料的修饰的透明质酸是任何修饰的透明质酸，其衍生自透明质酸并且具有至少一个未修饰的羧基。一个典型实例是带有另一个低分子化合物(例如醇、药用物质或肉桂酸酯衍生物)的修饰的透明质酸，另一个低分子化合物被引入透明质酸的羧基部分中。
用作起始原料的透明质酸可以是透明质酸和修饰的透明质酸的任何不同的药用盐。
药用盐包括碱金属盐，例如钠盐和钾盐，碱土金属盐，例如镁盐和钙盐。优选碱金属盐，特别优选钠盐。
对于用作起始原料的透明质酸的重均分子量没有特别限制，但优选在10,000至10,000,000的范围，其表示多糖聚合物的特征。透明质酸的重均分子量更优选在100,000至5,000,000的范围，或进一步更优选在500,000至3,000,000的范围。
带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物可以是给低电子密度原子提供或与其共享电子、并且相应地能够与羧基缩合的化合物。官能团可以是羟基或氨基。优选，带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物是带有至少一个氨基的化合物。优选，带有羧基的多糖和带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物通过酯键或酰胺键相互连接。尤其优选的是酰胺键，其可以确保在含水溶剂中反应所产生的稳定产物的高产率。
按照所得到多糖衍生物的目的和应用，带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物合适地选自各种有机化合物，这种有机化合物带有能够与羧基缩合的官能团。
带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物的典型实例包括：直链烷基胺、氨基酸和氨基醇的低分子量化合物和它们的衍生物。氨基醇可以由下式表示：
H2N-(CH2)n-OH
n表示2至12的整数。
在由药用物质或生理活性物质与带有羧基的多糖进行缩合来制备多糖衍生物的情况下，按照所得到多糖衍生物的所需要的药物效果或所需要的生理活性和应用，适当地选择带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物。用于这种目的的合适例子包括如下所述的各种药用物质以及细胞活素、激素、生长因子、酶及其它各种生理活性物质。
药用物质的典型实例包括化学结构中带有官能团例如羧基、羟基或氨基的非甾族抗炎症药物(NSAIDs)和改善疾病的抗风湿药物(DMARDs)。
有多种NSAIDs，包括水杨酸盐NSAIDs，芬那酸盐NSAIDs，芳基乙酸NSAIDs，丙酸NSAIDs和昔康(Oxicam)NSAIDs，以及噻拉米特，甲苯酰吡酸，二氟尼柳，醋氨酚，夫洛非宁和替诺立啶(tinoridine)。优选，带有式(2)所表示结构的化合物用作药用物质：
尤其优选的是通式(3)表示的化合物：
Figure BSA00000709355700082
在通式(3)中，R6表示氢原子或选自低级烷基和低级烷氧基的取代基。
R7、R8和R9独立地表示卤素原子、氢原子或选自低级烷基、低级烷氧基和羟基的取代基。
X独立地表示卤素原子或选自低级烷基和三氟甲基的取代基，并且至少一个X是卤素原子。
在低级烷基和低级烷氧基之中，优选，直链或支链低级烷基和低级烷氧基，两个都具有1至12个碳原子，特别优选，直链或支链低级烷基和低级烷氧基，两个都具有1至6个碳原子。
优选，R6在苯环的5位键合，苯环在1位具有羧甲基、在2位具有氨基残基。
通式(3)表示的化合物包括例如公开在WO99/11605中的化合物，本文引入其全部公开内容作为参考。
还优选通式(4)表示的化合物：
Figure BSA00000709355700091
在通式(4)中，R10表示氢原子或选自低级烷基和低级烷氧基的取代基。优选，R10是氢原子或选自具有1至12个碳原子的直链或支链低级烷基的取代基，更具体地说，是氢原子或选自具有1至4个碳原子的低级烷基的取代基。
X1和X2独立地表示卤素原子或选自低级烷基和三氟甲基的取代基，并且X1和X2中的至少一个是卤素原子。优选，两个X1和X2都是卤素原子，更优选，氟原子或氯原子。
通式(4)所示化合物的一个典型实例是双氯芬酸(diclofenac)，其中双氯芬酸的R10是氢原子，X1和X2两个都是氯原子。
带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物可以是初始具有官能团的生理活性物质或药用物质。有机化合物可以另外具有官能团，该官能团被引进用于和多糖进行缩合反应。在后者情况下，带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物可以如下获得：使生理活性物质或药用物质与带有至少两个官能团的间隔物质进行共价连接，或使光敏化合物例如肉桂酸或肉桂酸酯(盐)衍生物与带有至少两个官能团的间隔物质进行共价连接。
带有至少两个官能团的间隔物质具有至少一个能够与羧基缩合的第一官能团，例如氨基和羟基，和能够与生理活性物质或药用物质的官能团缩合的第二官能团，相应地，间隔物质的第二官能团与生理活性物质或药用物质的官能团通过共价键进行缩合，从而制备带有能够与羧基缩合的官能团(第一官能团)的有机化合物。
例如，带有至少两个官能团的间隔物质与带有官能团的生理活性物质或化学物质通过酯键或酰胺键进行连接。
即使当生理活性物质或药用物质最初没有能够与羧基缩合的官能团时，间隔物质的第二官能团与生理活性物质或药用物质的官能团的共价连接，可以获得带有能够与羧基缩合的官能团(第一官能团)的生理活性物质或药用物质。
可以按照所得到的多糖衍生物(利用本发明制备方法获得)的目的和应用，适当地选择带有至少两个官能团的间隔物质。
可以选择带有至少两个官能团的间隔物质，与如上所述的NSAID的官能团对应，以形成共价化合物。
间隔物质的第一官能团是能够与多糖的羧基缩合的官能团。带有羧基作为第二官能团的间隔物质适合通过酯键与NSAID或DMARD的羟基连接。带有羟基作为第二官能团的间隔物质、或带有氨基作为第二官能团的间隔物质适合分别通过酯键或通过酰胺键与NSAID或DMARD的羧基连接。按照通过本发明制备方法获得的最终产品的目的和应用，适当地选择间隔物质与药用物质的键。为了使得到的化合物在活体内容易分解，优选，选择酯键。
带有至少两个官能团、与上述NSAID或DMARD连接的间隔化合物的合适例子包括式H2N-(CH2)n-OH(n表示2至18的整数，或更优选2至12的整数)表示的氨基醇、亚烷基二胺和氨基羧酸。优选的例子是具有2至18个碳原子的二氨基烷烃、具有2至12个碳原子的取代或非取代的氨基烷基醇、和氨基酸。其具体例子包括甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和具有2至5个碳原子的取代和非取代的直链或支链氨基烷基醇。
氨基醇也可以用作间隔物质，与光敏化合物例如肉桂酸或肉桂酸酯衍生物连接。
在本发明制备方法中使用的缩合剂是通式(1)表示的化合物：
Figure BSA00000709355700111
R1和R2独立地表示选自1至4个碳原子的烷基和6至8个碳原子的芳基的取代基；Z-代表反阴离子；E+代表如下表示的有机基团：
Figure BSA00000709355700112
R3、R4和R5独立地表示具有至少一个直接与季氮原子键合的碳原子的有机基团，并且R3、R4和R5中的任何两个或其全部，可以彼此连接，形成环状结构。
在通式(1)表示的化合物中，优选，每个R1和R2表示甲基、乙基或苯基，E+表示N-甲基吗啉
Figure BSA00000709355700113
基团，Z-表示氯阴离子、高氯酸根阴离子或四氟硼酸根阴离子。
通式(1)表示的化合物是例如公开在WO00/53544中的季铵盐，本文引入其全部公开内容作为参考。
通式(1)所示化合物的具体例子是4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉
Figure BSA00000709355700121
氯化物，其中R1和R2两者都是甲基，E+是N-甲基吗啉
Figure BSA00000709355700122
基团，Z-是氯阴离子。
在本发明的制备方法中，用于缩合反应的缩合剂不一定是分离的物质，而是可以在缩合反应系统中形成。换句话说，用于本发明制备方法中的缩合剂可以是在缩合反应系统中形成通式(1)所示化合物的物质(反应原料)。
本发明制备方法的反应条件描述如下，不过本领域技术人员可以适当地选择反应条件，以获得所需要的多糖衍生物。
相对于一摩尔作为起始原料的多糖的羧基，用于缩合反应的缩合剂的量优选在0.0005至0.4当量的范围，更优选在0.001至0.3当量的范围，或进一步更优选在0.003至0.25当量的范围。当缩合剂的纯度未知时，例如，由于存在水合水的情况，缩合剂的纯度是由低分子量羧酸和低分子量胺的缩合产率、以缩合活性因子的形式计算的，并且计算的纯度用于评定每单位重量缩合剂的摩尔数量。
对于带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物的量没有特别限制，只要该数量不小于所使用的缩合剂的量即可。当有机化合物借助于酰胺键与多糖连接时，有机化合物的摩尔数量优选等于缩合剂的摩尔数量，这是为了达到较好纯化效率。
反应温度在0℃至60℃的范围，优选在4℃至50℃的范围，且更优选在15℃至40℃的范围。
反应时间取决于反应温度和能够与羧基缩合的官能团的反应性。对于反应时间没有特别限制，但可以是例如3至24小时。
反应溶液的溶剂的合适例子包括水、水可互溶的有机溶剂和其溶剂混合物。乙醇用作优选的水可互溶的有机溶剂，这是由于其对于人身体的低毒性和其针对各种规则的实用性。按照带有羧基的多糖例如透明质酸的溶解性、反应效率和纯化效率，适当地确定溶剂和它们的混合比例。在某些情况下，有机溶剂可以不必用于反应溶液。
常规WSC方法通常使用1，4-二
Figure BSA00000709355700123
烷(dixoane)和四氢呋喃作为反应溶液的有机溶剂。本发明制备方法不使用这种毒性有机溶剂，并因此降低了反应溶液溶剂毒性。
通过本发明制备方法制备的多糖衍生物，可以利用纯化多糖的任何传统已知的技术进行纯化。优选，将使用乙醇的有机溶剂沉淀法和凝胶过滤柱色谱法用于纯化。
通过本发明制备方法获得的多糖衍生物在中性含水溶剂中具有高溶解度。
通过本发明制备方法制备的透明质酸衍生物可与通过常规WSC方法制备的透明质酸衍生物相比。通过带有羧基的透明质酸与带有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物进行缩合，这些透明质酸衍生物具有类似的化学结构，但在水中具有显著不同的溶解性。这个事实表明了这些透明质酸衍生物在高级结构方面的显著差异。在有机化合物的相同取代度的条件下，通过本发明制备方法制备的透明质酸衍生物可高度溶于含水溶剂中，并产生清澈和粘稠溶液，没有任何可见固态物质，而通过常规WSC方法制备的透明质酸衍生物不溶于蒸馏水，并且产生不溶物质的悬浮液。至少在具有5％至20％范围的有机化合物取代度的透明质酸衍生物中，发现了利用本发明制备方法的透明质酸衍生物和利用WSC方法的透明质酸衍生物之间的这种差异，虽然这种差异可以受所引进有机化合物的疏水性的影响。
除了利用常规WSC方法的透明质酸衍生物的生产工艺之外，JP2004-18750公开了向反应溶液中加入碱的额外步骤。按照该文献，得到的透明质酸衍生物在水中具有高的分子分散。然而，这种透明质酸衍生物在水中的分子分散，曾经在WSC方法的缩合反应期间或之后得到降低。降低的分子分散表示所得到的透明质酸衍生物的高级结构方面发生了变化。加入碱可以恢复曾经降低的分子分散。但这不意味着所得到的透明质酸衍生物恢复其透明质酸的初始高级结构。
另一方面，本发明的制备方法可以获得透明质酸衍生物，没有损坏透明质酸的初始高级结构。
公开在JP2004-18750中的现有技术基本上需要加入碱的额外步骤，以改变或恢复透明质酸的高级结构，和恢复曾经降低的透明质酸衍生物在含水溶剂中的溶解性。因此，为了防止透明质酸衍生物在碱性条件下的改变，需要仔细选择合适的碱处理条件。在JP2004-18750的方法中，建议使用合适数量的弱无机碱。另一方面，为了防止改变透明质酸衍生物的目的，本发明制备方法不需要这种仔细选择反应条件，只要以上所述的反应条件即可。
在本发明的制备方法中，在缩合反应之后，也可以进行向反应溶液中加入碱的额外步骤(公开在JP2004-18750中)，以便使所得到的多糖衍生物具有更高的水溶性。在加入碱的额外步骤中，可以将碳酸氢钠水溶液加入到多糖衍生物的反应溶液中。也可以使用公开在JP2004-18750中的任何其它合适碱来代替碳酸氢钠。例如，无机碱碳酸钠可以用于使反应溶液产生微碱性。
通过本发明方法制备的透明质酸衍生物和其它多糖衍生物优选地具有如下所述的特征。
通过多孔过滤器的渗透性是多糖衍生物在水中的分子分散或溶解性的典型指标。例如，制备所得到的透明质酸衍生物的1.0％(w/v)中性水溶液，并使其通过多孔过滤器。在过滤前和后，测定透明质酸衍生物水溶液的浓度。透明质酸衍生物的浓度降低不多或没有降低，表明了透明质酸衍生物的高水溶性。利用本发明制备方法获得的多糖衍生物，不会因通过多孔过滤器(具有5μm或0.45μm的孔径)过滤其1.0％(w/v)水溶液而被吸附或除去，并且在过滤前后，浓度没有显著的变化。正如在随后的实施例中所描述的那样，当有机化合物的取代度不高于大约14％时，所得到的透明质酸衍生物通过0.22μm孔径的滤过器(其通常用于过滤灭菌)，具有非常高的渗透性。
溶质足够分散且溶于溶剂中的溶液，通常通过过滤器时，浓度不会显著降低。除了多糖衍生物的分子分散和溶解性之外，还有影响过滤渗透性的其它因素。例如，当与多糖结合的有机化合物具有高疏水性时，疏水性部分非特异性地吸附到过滤材料上，可以降低过滤渗透性，同时提高了有机化合物的取代度。
本发明的制备方法可以制备多糖衍生物，同时在整个生产工艺中保持高亲水性。换句话说，通过本发明制备方法制备的透明质酸衍生物保持了透明质酸的初始高级结构和高级结构衍生的特征。本发明的制备方法获得了透明质酸衍生物或另一种多糖衍生物，另一种多糖衍生物不仅具有带有羧基的多糖的初始特征，但还具有与羧基连接的有机化合物的特征。当生理活性物质、药用物质或者以在生理条件下可分解的方式与间隔化合物例如低级醇或氨基酸连接的生理活性物质或药用物质用作合成多糖衍生物的具有官能团的有机化合物时，所得到的多糖衍生物可以用作出色的持续释放药物，并且不会失去多糖的特征。
例如，为了制备适用于治疗炎症和伴有关节病的疼痛的多糖衍生物，NSAID(作为抗炎症药物)和氨基烷基醇(间隔化合物)例如氨基乙醇或氨丙醇通过NSAID的羧基与氨基烷基醇的羟基的酯键所共价连接的物质，被选为具有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物。另一方面，通常用于治疗关节病的透明质酸，被选择作为具有羧基的多糖。然后，用本发明的制备方法，氨基烷基醇的氨基与透明质酸的羧基进行缩合。所获得的透明质酸衍生物保持了高水溶性，并且是容易适用于注射或其它局部应用的有效药物。透明质酸衍生物具有可在活体中裂解的酯键，并且相应实现NSAID的持续释放特性。
实施例
下面基于实施例详细地描述本发明。然而，本发明的范围不局限于这些实施例。
在所有的实施例中，透明质酸钠盐是从Seikagaku Corporation购买的，4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMT-MM)是从Wako Pure Chemical Industries，Ltd.(Lot.EWRO0514)购买的。氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐是利用WO2005/066214的参比实施例5和实施例38所描述的方法制备的。氨丙醇-肉桂酸酯盐酸盐(3-氨基丙基肉桂酸酯盐酸盐)是利用日本专利3343181的实施例1和美国专利US6,025,444的实施例1所描述的方法制备的。
<测定>
取代度的测定
在下面的实验中，用分光光度测定法测定取代度，除非另作说明。具体地说，用咔唑-硫酸反应来测定每个样品溶液中的透明质酸的数量，用分光光度测定法测定每个所引进化合物的数量，而后由两个数值计算取代度。
对于氨基乙醇-双氯芬酸基团的测定，将每个样品溶液溶于蒸馏水中，利用分光光度法，基于双氯芬酸吸光度，在大约280nm处测定双氯芬酸的数量。
对于氨丙醇-肉桂酸酯基团的测定，将每个样品溶液溶于0.1mol/L氢氧化钠水溶液中，利用分光光度法，在大约269nm处，基于肉桂酸酯基团的吸光度，测定肉桂酸酯基团的数量。
<参比实施例1>
氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐的合成在22.5mL水/22.5mL二
Figure BSA00000709355700161
烷中，将200mg具有800,000重均分子量的透明质酸钠盐溶解，而后顺序地加入0.450mL的1mol/L N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)水溶液、0.450mL的0.5mol/L水溶性的碳二亚胺盐酸盐(WSCI.HCl)水溶液、和2.25mL的0.1mol/L氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐溶液
Figure BSA00000709355700162
搅拌过夜。将反应溶液分成两个相等部分，两个部分之一用于参比实施例1，另一个部分用于参比实施例2。将0.5g氯化钠加入并溶解于反应溶液的一个部分中之后，通过加入100mL乙醇来使混合物沉淀。将沉淀顺序地用85％乙醇(两次)、乙醇(两次)和乙醚(一次)洗涤，并在室温下减压干燥过夜，得到113.3mg白色固体部分。
<参比实施例2>
氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐的合成
向在参比实施例1中制备的反应溶液的另一个部分中加入1.5mL的5％碳酸氢钠水溶液，而后搅拌3.5小时。通过加入50％乙酸中和反应溶液之后，加入0.5g氯化钠。通过加入100mL乙醇使混合物沉淀。将沉淀顺序地用85％乙醇(两次)、乙醇(两次)和乙醚(一次)洗涤，并在室温下减压干燥过夜，得到111.5mg白色固体部分。取代度是20.6％。
<参比实施例3>
氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐的合成在15.7mL水/15.7mL二
Figure BSA00000709355700171
烷中，将133mg具有800,000重均分子量的透明质酸钠盐溶解，而后顺序地加入0.267mL的1mol/L HOSu水溶液、0.267mL的0.5mol/L WSCI·HCl水溶液、和0.933mL的0.143mol/L氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐溶液
Figure BSA00000709355700172
搅拌过夜。向该反应溶液中加入4mL 5％碳酸氢钠水溶液，搅拌3小时。通过加入50％乙酸中和反应溶液之后，加入0.67g氯化钠。通过加入133mL乙醇使混合物沉淀。将沉淀顺序地用85％乙醇(两次)、乙醇(两次)和乙醚(一次)洗涤，并在室温下减压干燥过夜，得到124.0mg白色固体部分。取代度是14.3％。
<参比实施例4>
氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐的合成
在参比实施例4中，利用与参比实施例3相同的方法，只不过在向反应溶液中加入5％碳酸氢钠水溶液之后，搅拌时间从3小时变为1小时，获得124.0mg白色固态物质作为得到的产物。
<实施例1>
氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐的合成
在10mL水/10mL乙醇中，将100mg具有800,000重均分子量的透明质酸钠盐溶解，而后顺序地加入0.556mL的0.0676mol/L氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐溶液(水∶乙醇＝1∶1)和0.800mL的16.8mg/mLDMT-MM溶液(水∶乙醇＝1∶1)，搅拌过夜。加入0.5g氯化钠于反应溶液中之后，通过加入100mL乙醇来沉淀混合物。将沉淀顺序地用85％乙醇(两次)、乙醇(两次)和乙醚(一次)洗涤，并在室温下减压干燥过夜，得到87.6mg白色固体部分。取代度是13.8％。
<实施例2>
氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐的合成
在实施例2中，利用与工作实施例1相同的方法，只不过将0.800mL的0.05mol/L氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐溶液(水∶乙醇＝1∶1)和0.800mL的22.4mg/mL DMT-MM溶液(水∶乙醇＝1∶1)加入到透明质酸盐溶液中，获得103.5mg白色固态物质作为得到的产物。取代度是19.7％。
<实施例3>
氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐的合成
在30mL水/30mL乙醇中，将300mg具有80,000重均分子量的透明质酸钠盐溶解，而后顺序地加入1.50mL的0.0805mol/L氨基乙醇-双氯芬酸盐酸盐溶液(水∶乙醇＝1∶1)和1.50mL的35.9mg/mLDMT-MM溶液(水∶乙醇＝1∶1)，搅拌过夜。向该反应溶液中加入4.5mL 5％碳酸氢钠水溶液，搅拌3.5小时。通过加入50％乙酸中和反应溶液之后，加入300mL乙醇，使混合物沉淀。将沉淀顺序地用85％乙醇(两次)、乙醇(两次)和乙醚(一次)洗涤，并在室温下减压干燥过夜，得到294.8mg白色固体部分。取代度是18.7％。
<实施例4>
氨基丙醇-肉桂酸酯-引入的透明质酸钠盐的合成
在20mL水/20mL乙醇中，将200mg具有80,000重均分子量的透明质酸钠盐溶解，而后顺序地加入1.0mL的0.101mol/L氨基丙醇-肉桂酸酯盐酸盐溶液(水∶乙醇＝1∶1)和1.0mL的45.0mg/mL DMT-MM溶液(水∶乙醇＝1∶1)，搅拌过夜。通过加入200mL乙醇使混合物沉淀。将沉淀顺序地用85％乙醇(两次)、乙醇(两次)和乙醚(一次)洗涤，并在室温下减压干燥过夜，得到197.7mg白色固体部分。取代度是16.3％。
<实施例5>
氨基丙醇-肉桂酸酯-引入的透明质酸钠盐的合成
在10mL水/10mL乙醇中，将100mg具有800,000重均分子量的透明质酸钠盐溶解，而后顺序地加入0.286mL的0.132mol/L氨基丙醇-肉桂酸酯盐酸盐溶液(水∶乙醇＝1∶1)和0.286mL的59.0mg/mLDMT-MM溶液(水∶乙醇＝1∶1)，搅拌过夜。向该反应溶液中加入1.5mL 5％碳酸氢钠水溶液，搅拌2小时。通过加入50％乙酸中和反应溶液之后，加入100mL乙醇，使混合物沉淀。将沉淀顺序地用85％乙醇(两次)、乙醇(两次)和乙醚(一次)洗涤，并在室温下减压干燥过夜，得到90.4mg白色固体部分。取代度是12.3％。
<实施例6>
正戊胺-引入的透明质酸钠盐的合成
在40mL水/40mL乙醇中，将400mg具有80,000重均分子量的透明质酸钠盐溶解，而后顺序地加入1.8g的0.167mmol/g正戊胺盐酸盐(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd生产)溶液(水∶乙醇＝1∶1)和3.0mL的45.0mg/mL DMT-MM溶液(水∶乙醇＝1∶1)，搅拌过夜。将反应溶液分成两个相等部分，两个部分之一用于实施例6，另一个部分用于实施例7。将1g氯化钠加入并溶解于反应溶液的一个部分中之后，通过加入200mL乙醇来使混合物沉淀。将沉淀顺序地用85％乙醇(十次)、乙醇(两次)和乙醚(一次)洗涤，并在室温下减压干燥过夜，得到188.7mg白色固体部分。
<实施例7>
正戊胺-引入的透明质酸钠盐的合成
向在实施例6中制备的反应溶液的另一个部分中加入3.0mL的5％碳酸氢钠水溶液，搅拌3小时。加入50％乙酸来中和反应溶液、和将1g氯化钠加入并将其溶解到反应溶液中之后，通过加入200mL乙醇来使混合物沉淀。将沉淀顺序地用85％乙醇(十次)、乙醇(两次)和乙醚(一次)洗涤，并在室温下减压干燥过夜，得到185.5mg白色固体部分。利用1H-NMR(D2O)测定的取代度是22％。
<试验实施例1>
在密封瓶中，分别加入实施例2和3制备的氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐、实施例4和5制备的氨基丙醇-肉桂酸酯引入的透明质酸钠盐和实施例6和7制备的正戊胺-引入的透明质酸钠盐与蒸馏水，使得每个透明质酸衍生物的浓度是1.0％，而后在室温下、在220rpm下摇动过夜。用相同方法，试验参比实施例1和2中制备的氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐。将实施例2、3、4、5、6和7的衍生物与参比实施例2的衍生物全部均匀地溶于蒸馏水中，获得清澈和粘稠的水溶液。参比实施例1的氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐不溶于蒸馏水，而获得白色悬浮液。
<试验实施例2>
在密封瓶中，将实施例1和参比实施例3和4制备的氨基乙醇-双氯芬酸-引入的透明质酸钠盐分别与蒸馏水混合，使得每个衍生物的浓度是1.0％(w/v)，而后在室温下、在220rpm下摇动过夜。将每个水溶液(试液)注入到针筒(1mL体积：由TERUMO Corporation生产)的后部，针筒配备有多孔过滤器(Millex-GV，0.22μm孔径：由Millipore Corporation生产)，在室温下，用活塞压缩，使水溶液通过多孔过滤器。
在大约280nm处，在过滤通过至少0.5mL之前和之后，对于每个试液，测定基于双氯芬酸的吸光度(峰顶)。利用在过滤通过前后双氯芬酸在试液中的浓度(由所测定吸光度的变化来计算)，表示每个试液的过滤通过系数。
实施例1的水溶液和参比实施例3的水溶液的过滤通过系数各自是95.3％和96.9％。换句话说，实施例1和参比实施例3的水溶液都几乎完全通过了多孔过滤器。参比实施例4的水溶液的过滤通过系数只有11.0％。与参比实施例3相比较，在参比实施例4中，这种低过滤通过系数是由于加入5％碳酸氢钠水溶液之后的搅拌时间较短、得到的处理不充分造成的。
用相同方法，试验实施例5中制备的氨基丙醇-肉桂酸酯-引入的透明质酸钠盐。该水溶液的过滤通过系数是81.6％。
工业实用性
本发明制备方法能够有效和容易地制备具有羧基的多糖的衍生物，例如透明质酸钠盐，并且有效地用于这种多糖衍生物的工业制备规模。通过本发明制备方法获得的多糖衍生物，与通过现有生产方式获得的多糖衍生物相比较，在含水溶剂中具有显著高的溶解性。

Claims (12)

1.制备多糖衍生物的方法，该多糖衍生物包含具有羧基的多糖，且该羧基与具有能够与羧基缩合的官能团的有机化合物进行键合，
其包括：通过利用通式(1)所表示的缩合剂，使多糖与有机化合物进行反应：
Figure FSA00000709355600011
R1和R2独立地表示选自1至4个碳原子的烷基和6至8个碳原子的芳基的取代基；Z-代表反阴离子；E+表示下列基团：
Figure FSA00000709355600012
R3、R4和R5独立地表示具有至少一个直接与季氮原子键合的碳原子的有机基团，并且R3、R4和R5中的任何两个或其全部，可以彼此连接，形成环状结构，其中多糖是透明质酸，该透明质酸具有100,000至5,000,000的重均分子量，
其中有机化合物是具有至少一个氨基的化合物，和
其中有机化合物选自具有选自羧基，羟基和氨基的官能团的非甾族抗炎症药物(NSAID)，改善疾病的抗风湿药物(DMARD)，线性烷基胺、氨基酸、氨基醇和它们的衍生物，所述氨基醇由式H2N-(CH2)n-OH所示，其中n表示2至12的整数。
2.按照权利要求1的方法，其中在通式(1)中，R1和R2独立地选自甲基、乙基和苯基，E+是N-甲基吗啉
Figure FSA00000709355600013
基团，Z-是氯阴离子、高氯酸根阴离子或四氟硼酸根阴离子。
3.按照权利要求2的方法，其中通式(1)表示的化合物是4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉
Figure FSA00000709355600021
氯化物。
4.权利要求2或3所述的方法，其中有机化合物选自式H2N-(CH2)n-OH所示的氨基醇，其中n表示2至12的整数，线性烷基胺，和它们的衍生物。
5.按照权利要求4的方法，其中多糖和有机化合物通过酰胺键进行键合。
6.按照权利要求5的方法，其中线性烷基胺是正戊胺。
7.按照权利要求1的方法，其中有机化合物是通过共价连接光活性化合物或具有选自羧基，羟基和氨基的官能团的NSAID和具有至少两个官能团的间隔物质所得到的化合物。
8.按照权利要求7的方法，其中通式(1)表示的化合物是4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉
Figure FSA00000709355600022
氯化物。
9.按照权利要求7或8的方法，其中的间隔物质选自具有2-12个碳原子的氨基烷基醇、具有2-18个碳原子的二氨基烷烃，和氨基酸。
10.按照权利要求9的方法，其中所述有机化合物是将肉桂酸、肉桂酸酯衍生物或具有通式(3)所示结构的NSAID通过肉桂酸、肉桂酸酯衍生物或NSAID的羧基与氨基烷基醇的羟基形成的酯键与具有2-12个碳原子的氨基烷基醇共价连接所得到的化合物，并且
其中所述有机化合物通过酰胺键键合多糖的羧基
Figure FSA00000709355600023
R6表示低级烷基、低级烷氧基或氢原子，R7、R8和R9独立地表示低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤素原子或氢原子，X独立地表示低级烷基、三氟甲基或卤素原子，并且至少一个X是卤素原子。
11.按照权利要求10的方法，其中有机化合物是通过共价连接NSAID和氨基乙醇所得到的化合物，所述共价连接是由NSAID的羧基与氨基乙醇的羟基形成的酯键进行的，并且其中所述NSAID是双氯芬酸。
12.按照权利要求10的方法，其中有机化合物是3-氨基丙基肉桂酸酯。
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