CN106770597A - 用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的cze检测方法 - Google Patents

用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的cze检测方法 Download PDF

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CN106770597A CN201710119843.7A CN201710119843A CN106770597A CN 106770597 A CN106770597 A CN 106770597A CN 201710119843 A CN201710119843 A CN 201710119843A CN 106770597 A CN106770597 A CN 106770597A
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Abstract

本发明涉及一种用于检测组合物中促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)电荷异质体的CZE检测方法，该方法包括：步骤(1)：取NiCl2、NaH2PO4，配制背景电解质；步骤(2)：按照甲醇、HCl、H2O、NaOH、H2O、Amine Regenerator、背景电解质的顺序上样，对胺基涂层毛细管进行预平衡；步骤(3)：将所述的组合物通过正向气压上样；步骤(4)：加反向电压，分离所述的组合物中的不同电荷异质体；步骤(5)：采用UV检测器记录所述的组合物的不同唾液酸含量的电荷异质体的电泳行为，完成对所述的组合物中促红细胞生成素样品的CZE检测。采用了本发明的方法操作简单，克服了EPO产品中人血清白蛋白(HSA)的干扰，解决了传统CZE方法无法检测EPO上市产品的难题。

Description

用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测 方法
技术领域
本发明涉及一种生物医药技术领域，尤其涉及促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)，具体是指一种用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法。
背景技术
促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)是一种糖蛋白，绝大部分由肾脏产生，主要功能是促进红细胞的生成，提高机体血红蛋白的浓度，临床上主要用于治疗肾性贫血和肿瘤等各种慢性疾病所伴发的贫血。EPO分子骨架为165个氨基酸组成的肽链，具有3个N端连接的糖基化位点和1个O端连接的糖基化位点，糖链占蛋白总分子质量的40％，是一种高度糖基化的蛋白。唾液酸分布于糖链末端，作为EPO的主要活性成分之一，唾液酸含量的多少对EPO体内生物学活性的高低起决定性作用。1985年，通过基因重组技术，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产的重组人促红细胞生成素(rhEPO)获批上市。rhEPO与天然EPO活性几乎相同，能够改善机体携氧能力，明显提高人体的红细胞数量及血红蛋白含量。基于唾液酸化程度决定EPO产品的活性的原理，围绕提高EPO蛋白唾液酸含量的生产技术是各EPO生产厂家的研究和竞争热点，唾液酸含量作为质量表征的关键指标，需要一种快速、准确的检测方法。
EPO蛋白唾液酸化修饰程度的差异会导致所带电荷的差异，EPO蛋白不同唾液酸化修饰组分的分析检测也就是对其不同电荷异质体组分的分析检测。传统电荷异质体的分析手段主要依靠平板等电聚焦电泳(IEF)，通过等电点差异对电荷异质体进行分离，唾液酸化程度较高的组分相对等电点较低。然而这种方法只能对不同组分进行定性分析，难以对各个组分的相对百分含量进行分析，使用范围十分局限。随着蛋白分析手段的不断进步和发展，基于毛细管电泳分析技术的毛细管区带电泳(CZE)以其快速、高效、准确的分析特点逐步被应用于蛋白的电荷异质体分析。CZE的分离原理并不单纯依据蛋白所带电荷，而是依据蛋白的荷质比。考虑到CZE与待分离蛋白的分子量也十分相关，在实验设计及方法开发优化过程中，需要同时考虑蛋白分子量与蛋白所带电荷对分离效果的影响。
基于毛细管区带电泳(CZE)检测技术，研究人员已经开发出一套比较成熟的用于EPO蛋白不同唾液酸化程度的电荷异质体的检测方法，并且记载于欧洲药典，该方法只是针对EPO原液，即不含其它蛋白干扰情况下的分析测试。然而，目前上市的EPO产品中，为保证EPO蛋白的生物活性及结构稳定，需要加入大量人血清白蛋白(HSA)作为辅料。HSA的加入使得传统欧洲药典记载的用于EPO蛋白电荷异质体检测的CZE方法并不能有效地对EPO蛋白不同唾液酸化的组分进行分离，这是因为HSA与EPO有相似的荷质比，在欧洲药典规定的实验条件下，HSA与EPO蛋白的分离过程会相互混杂，难以区分。在生物制药领域，为了实现对原液及最终产品的质量研究、产品放行、可比性研究、稳定性研究等，研究人员需要开发各类质量分析方法。尽管二者的有效成分是一致的，但各类原辅料的引入使得原液和产品的分析检测手段不能简单混用，EPO产品的电荷异质体的CZE检测就是如此，需要根据蛋白样品的特殊情况结合实验原理重新设计完成方法开发。用于EPO产品电荷异质体检测CZE分析方法的建立是比较复杂的，包括毛细管的选择、CZE方法各个参数的优化等。除此之外，该方法必须满足基本的方法精密度、耐用性等要求，保证EPO产品不同唾液酸含量的电荷异质体的检测结果的可靠，用于指导EPO产品的质量研究、可比性研究及稳定性研究等工作。
EPO产品中含有HSA及EPO蛋白，HSA的等电点较高。传统欧洲药典方法的实验条件是传统常规CZE方法，采用非涂层裸毛细管进行蛋白间分离，在裸管条件下电渗流的方向从正极流向负极，采用正向电压，正极进样，检测窗口在负极，蛋白的分离是在电泳电场和电渗电场的矢量叠加电场条件下进行，依据蛋白荷质比的大小进行分离，EPO蛋白与HSA在电渗流的作用下由正极向负极泳动，尽管EPO蛋白(pI＝3.9～4.4)与HSA蛋白(pI＝4.8)的等电点有差异，在该CZE缓冲液条件(pI＝5.55)下，HSA蛋白带较少的负电荷，因此在电泳电场和电渗流的共同作用下，HSA的理论泳动速度较大，但由于HSA分子量较大，EPO蛋白与HSA蛋白的荷质比并无显著差异，所以传统欧洲药典CZE方法无法实现二者分离。
本发明基于EPO蛋白与HSA等电点的细微差异，设计实验缓冲液条件(pI＝3.8～4.2)使HSA带较多正电荷，EPO蛋白带负电荷或较少正电荷，采用胺基涂层的毛细管进行CZE检测，在胺基涂层毛细管的条件下电渗流的方向从负极流向正极，同时采用反向电压，负极进样，检测窗口在正极，在该条件下蛋白的分离也是在电泳电场和电渗电场的矢量叠加电场条件下进行，EPO蛋白与HSA蛋白均从负极向正极泳动，由于EPO蛋白带负电荷或较少正电荷，且分子量较小，因此EPO蛋白的电泳速度较快，并且根据唾液酸化程度不同而带不等量电荷的EPO分子的泳动速度不同，能实现EPO蛋白电荷异质体的分离。与此同时，HSA蛋白带较多正电荷，且分子量较大，在该反向电泳及电渗电场作用下的电泳速度较慢，能够与EPO蛋白在该CZE实验条件下实现分离。概括叙述如下，在本发明的CZE实验条件下，一方面EPO和HSA蛋白所带电荷不同，HSA的泳动速度较慢；另一方面HSA的分子量也较大，根据CZE基于蛋白荷质比进行蛋白区分的原理能够进一步扩大二者的泳动速度差异，在该条件下，EPO相对HSA的泳动速度较大且之间不会产生交联，二者能够实现最大程度的分离。整个方法开发过程包括背景电解质(BGE)的离子强度，分离电压，毛细管柱温等的优化。在初步建立该CZE分析方法之后，我们还对该检测体系进行了初步方法学验证，发现该方法具有较好的精密度和耐用性等，能够保证检测结果的稳定性与可靠性，用于EPO产品的不同唾液酸化电荷异质体组分的分析。此外，我们利用该法完成了对3种市售EPO产品的电荷异质体的分析，能够满足EPO产品可比性研究的需要。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够克服EPO产品中辅料HSA的干扰达到检测目的、同时满足精密度及耐用性以用于不同EPO产品的质量研究及可比性研究的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法。
为了实现上述目的，本发明的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法如下：
所述的CZE检测方法包括：
步骤(1)：取NiCl2、NaH2PO4，配制背景电解质；
步骤(2)：按照甲醇、HCl、H2O、NaOH、H2O、Amine Regenerator、背景电解质的顺序上样，对胺基涂层毛细管进行预平衡；
步骤(3)：将所述的组合物通过正向气压上样；
步骤(4)：加反向电压，分离所述的组合物中的不同电荷异质体；
步骤(5)：采用UV检测器记录所述的组合物的不同唾液酸含量的电荷异质体的电泳行为，完成对所述的组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测。
较佳地，所述的组合物中还包括人血白蛋白(HSA)。
较佳地，所述的步骤(1)具体为：
取1mM NiCl2、100～300mM NaH2PO4，配制pH值为3.8～4.2的背景电解质。
较佳地，所述的步骤(2)中HCl为0.1M的HCl，NaOH为1.0M的NaOH。
较佳地，所述的步骤(2)中预平衡的冲洗气压为20psi，冲洗时间为5～10min。
较佳地，所述的步骤(3)中的上样气压为正向0.5～1.0psi，上样时间为8～20s。
较佳地，所述的步骤(4)中分离时的电压为反向8～15kv的电压。
较佳地，所述的步骤(5)中UV检测器的检测波长为200nm～214nm。
较佳地，所述的胺基涂层毛细管内径为50μm，有效长度为50cm，毛细管温度为25℃。
采用本发明的针对EPO产品中含有不同唾液酸含量的电荷异质体的CZE检测方法，其作用机理为通过胺基涂层毛细管使电渗流反向，由负极到正极流动，调整电泳缓冲液pH使EPO蛋白带负电荷或少量正电荷，而HSA蛋白带较多正电荷。同时改变电场方向，样品从负极进样，正极为检测窗口。在反向电场、电渗流叠加作用下，EPO蛋白泳动速度快且分子量小，而与此同时HSA蛋白泳动速度慢且分子量大，二者在本发明的CZE实验条件下，能够实现有效分离。此外，NiCl2的加入可以减缓HSA的迁移速度，更加利于EPO蛋白与HSA的分离。该方法操作简单，不需要花费太多的人力、物力，自动化程度高，完成方法验证，完全满足精密度及耐用性等方面的要求，不同电荷异质体的迁移时间的RSD均小于5％，不同电荷异质体的Area％的RSD均小于20％。该方法能够快速、准确、高效的对上市EPO产品中不同唾液酸含量的电荷异质体进行检测。
附图说明
图1为本发明的实施例1中上市EPO产品A、HSA制剂缓冲液、原液R的毛细管区带电泳检测图。
图2为图1的局部放大图。
图3为本发明的实施例2中不同时间检测的上市EPO产品A的毛细管区带电泳图。
图4为本发明的实施例2中不同时间检测的上市EPO产品B的毛细管区带电泳图。
图5为本发明的实施例2中不同时间检测的上市EPO产品C的毛细管区带电泳图。
图6为本发明的实施例3中不同毛细管柱温的原液R的毛细管区带电泳图。
图7为本发明的实施例4中不同离子强度的BGE条件下原液R的毛细管区带电泳检测图。
图8为本发明的实施例6中不同分离电压下原液R的毛细管区带电泳检测图。
图9为本发明的对比实施例中的方法检测原液R的毛细管区带电泳检测图。
图10为本发明的对比实施例中的方法和本发明的方法分别检测上市EPO产品A的毛细管区带电泳检测图。
图11为图10的局部放大图。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
本发明公开的EPO不同唾液酸含量的电荷异质体检测方法，包括下列实验步骤：
步骤(1)：取NiCl2、NaH2PO4，配制背景电解质；
步骤(2)：按照甲醇、HCl、H2O、NaOH、H2O、Amine Regenerator、背景电解质的顺序上样，对胺基涂层毛细管进行预平衡；
步骤(3)：将所述的组合物通过正向气压上样；
步骤(4)：加反向电压，分离所述的组合物中的不同电荷异质体；
步骤(5)：采用UV检测器记录所述的组合物的不同唾液酸含量的电荷异质体的电泳行为，完成对所述的组合物中促红细胞生成素活性的CZE检测。
其中，所述的组合物中还包括人血白蛋白；步骤(1)具体为：取1mM NiCl2、100～300mM NaH2PO4，配制pH值为3.8～4.2的背景电解质，优选地，所述BGE离子强度为200mMNaH2PO4，BGE的pH值为4.0；步骤(2)中HCl为0.1M的HCl，NaOH为1.0M的NaOH，预平衡的冲洗气压为20psi，冲洗时间为5～10min，其中Amine Regenerator和BGE的冲洗时间为10min；步骤(3)中的上样气压为正向0.5～1.0psi，上样时间为8～20s；步骤(4)中分离时的电压为反向8～15kv的电压，优选地，所述的分离电压为反向8kv；步骤(5)中UV检测器的检测波长为200nm～214nm，优选地，UV检测器的检测波长选择200nm；所述的胺基涂层毛细管内径为50μm，有效长度为50cm，毛细管温度为25℃。
本发明提供的一种EPO不同唾液酸含量的电荷异质体检测方法的实施方式为：
一、材料和试剂
材料：上市EPO产品A、B、C，EPO产品A的原液R，HSA制剂缓冲液(不含EPO)。
仪器：毛细管电泳仪PA 800(AB SCIEX)
试剂：二水合磷酸二氢钠(国药，Cat.No.20010718)，六水合氯化镍(Aldrich，Cat.No.654507)，甲醇(国药，Cat.No.10014108)，盐酸(国药，Cat.No.10011008)，乙酸(国药，Cat.No.10000208)，氢氧化钠(国药，Cat.No.10019718)，Amine Regenerator(ABSciex，Cat.No.477433)。
溶液配制：
BGE：取6.24g NaH2PO4·2H2O，0.04754g NiCl2·6H2O，加入200mLH2O，乙酸调节pH＝4.0，2～8℃保存。
0.1M HCl：取9mL HCl加入1000mL H2O。
0.1M NaOH：取0.4g NaOH加入10mL H2O。
二、检测方法步骤
1)预平衡：依次在20psi气压下用甲醇，0.1M HCl，H2O，1.0M NaOH，H2O冲洗胺基涂层毛细管5min，Amine Regenerator，BGE冲洗10min。
2)加样：正向气压0.5psi下，上样5～10sec。
3)分离：反向电压8kv下对样品进行分离。
4)结果分析：在32Karat软件上进行谱图的校正峰面积百分比分析。
下面各个实施例均采用上述实验方法进行，对比实施例除外。
实施例1
利用本发明方法对上市EPO产品A及对应的原液R和HSA制剂缓冲液进行毛细管区带电泳分析，检测EPO蛋白电荷异质体。
以上市EPO产品A及对应原液R、HSA制剂缓冲液为材料，采用上述检测方法，分析样品中不同唾液酸含量的电荷异质体的分布情况。
结果如图1～2所示，EPO产品A的EPO蛋白成分能够与HSA蛋白成分完全分离，并且EPO蛋白和HSA蛋白的出峰位置与单独进样EPO蛋白(EPO原液R)和HSA蛋白(HSA制剂缓冲液)的CZE检测的出峰位置基本一致。说明利用本发明方法能够实现EPO产品中的EPO蛋白成分的电荷异质体检测而不受EPO产品中大量存在的HSA蛋白的干扰。
实施例2
利用本发明方法对上市3个EPO产品A、B、C的EPO蛋白的电荷异质体进行检测和比较，同时考察方法的精密度。
以EPO产品A，B，C为材料，利用本发明方法对3个EPO产品的EPO蛋白电荷异质体进行检测和比较，在不同的3天内对3个样品进行独立检测，考察各个电荷异质体分离峰的迁移时间和峰面积百分比，对本发明方法的精密度进行评价。
结果如图3～图5、表1～表2，利用本发明检测方法，上市EPO产品A，B，C，在不同时间独立检测得到的不同唾液酸含量的电荷异质体检测结果说明，各个分离峰迁移时间的RSD满足＜5％，各峰校正面积百分比的RSD满足＜20％。检测结果表明本发明方法满足方法精密度要求，能够对不同厂家EPO产品的EPO蛋白的不同唾液酸含量的电荷异质体进行准确的比较和分析。
表1.针对3个上市EPO产品的CZE分析方法精密度评价结果汇总表(迁移时间)
表2.针对3个上市EPO产品的CZE分析方法精密度评价结果汇总表(峰面积百分比)
实施例3
本发明方法的毛细管柱温的开发优化
本发明CZE分析方法开发过程中，以EPO产品A对应的原液R为材料，分别选择不同的毛细管柱温(20℃、25℃)，采用上述检测方法对原液R的不同唾液酸含量的电荷异质体进行检测，考察毛细管柱温变化对各个峰的迁移时间及峰面积百分比的影响，选择本发明方法的合适柱温(结果如图6所示)。
表3.针对原液R不同唾液酸含量检测方法柱温考察结果汇总表(峰面积百分比)
结果如表3及图6，在不同的毛细管柱温条件下，各电荷异质体组分的迁移时间发生改变，毛细管温度较高的条件下，各个电荷异质体组分的迁移时间有所提前，可能的原因是毛细管内温度升高，溶液的黏度下降，电渗流增加。各电荷异质体组分的校正峰面积的百分比的RSD＜20％，说明在毛细管柱温20℃-25℃范围内对本发明CZE检测的电荷异质体结果并无显著影响。
实施例4
本发明方法的BGE的离子强度的开发优化
以EPO产品A对应的原液R为实验材料，分别用不同离子强度(含100mM，200mM，300mM NaH2PO4)的BGE，采用本发明检测方法对EPO原液R不同唾液酸含量的电荷异质体进行分析，确定合适的BGE的离子强度(如图7所示)。
如图7可以发现，不同离子强度条件下(含100mM，200mM，300mM NaH2PO4的BGE)，EPO的各个电荷异质体的分离峰型并无显著差异，各个电荷异质体分离峰的峰面积百分比的RSD满足<20％(表4)，说明不同离子强度的BGE(含100mM～300mM NaH2PO4)范围内对本发明CZE检测结果并无显著影响。
表4.针对原液RCZE检测方法不同BGE离子强度考察结果汇总表(峰面积百分比)
各峰校正峰面积百分比/％ 100mM 200mM 300mM RSD
Peak1/％ 4.7 4.4 5.0 6.4％
Peak2/％ 10.0 9.7 11.2 7.7％
Peak3/％ 20.6 21.8 21.1 2.8％
Peak4/％ 31.9 31.4 31.5 0.8％
Peak5/％ 23.8 22.8 23.1 2.2％
Peak6/％ 8.0 8.7 6.6 12.3％
Peak7/％ 1.0 1.2 1.5 13.1％
实施例5
分离电压的优化
以EPO产品A对应的原液R为材料，分别对EPO原液R使用反向6kv，8kv，10kv，12kv，15kv的电压进行分离，采用上述检测方法对EPO原液R中不同唾液酸含量的电荷异质体进行检测，确定合适的分离电压。
结果如图8，随着分离电压增加，EPO的不同电荷异质体的迁移时间缩短，原因在于分离电压增加，电渗流增强，分离度提高，同时焦耳热也随之增加，过高的焦耳热导致毛细管内形成温度梯度(中心温度高)，破坏塞流，色谱峰图展宽。从分离峰的分离效果看来，EPO蛋白的不同电荷异质体各个组分在反向8kv电压条件下，具有较好的分离度，确定方法使用的电压为反向8kv进行分离。
对比实施例
与传统欧洲药典方法的比较
一、材料和试剂
材料：上市EPO产品A，
仪器：毛细管电泳仪PA 800(AB SCIEX)
试剂：氯化钠(国药，Cat.No.10019318)，Tricine(Sigma，Cat.No.1001717411)，三水合乙酸钠(国药，Cat.No.10018718)，盐酸(国药，Cat.No.10011008)，Urea(Sigma，Cat.No.U4884)，氢氧化钠(国药，Cat.No.10019718)，putrescine(Aldrich，Cat.No.D13208)，乙酸(国药，Cat.No.1000208)。
溶液配制：
BGE concentrate：取0.584g NaCl，1.792g tricine，0.820g CH3COONa 3H2O加入100mL ddH2O，2-8℃保存。
1M putrescine：取0.882g putrescine加入10mL ddH2O。
BGE：取21g Urea，加入25mL ddH2O，30℃水浴溶解，加入5mL BGE concentrate，加入125μL 1M putrescine，最后以ddH2O定容至50mL，pH 5.55。
三、检测方法步骤
1)预平衡：在20psi气压下，依次用0.1M NaOH，0.1M BGE冲洗毛细管60min，正向电压20kv分离12h。
2)上样前处理：在20psi气压下，用ddH2O冲洗10min，0.1M NaOH冲洗5min，BGE冲洗毛细管10min。
3)加样：气压0.5psi下，上样5～10sec。
4)分离：正向电压15kv对样品进行分离。
5)结果分析：在32Karat软件上进行谱图的校正峰面积百分比分析。
利用该对比实施例的方法(药典记载)检测EPO产品A对应的原液R的CZE检测图谱见图9，可以发现该方法能够实现对EPO原液的各个电荷异质体成分的有效分离分析。利用该对比实施例方法和本发明方法对EPO产品A的CZE检测图谱见图10～11，可以发现对比实施例方法无法去除EPO产品中HSA组分的干扰，无法对EPO产品中的EPO蛋白的各个电荷异质体成分进行有效分离分析，而利用本发明CZE方法则能够将EPO产品中的EPO蛋白和HSA蛋白实现分离，对EPO产品中的EPO蛋白进行电荷异质体分析。
综上所述，本发明公开了一种检测上市EPO产品不同唾液酸含量的电荷异质体的检测方法，该方法操作简单，不需要花费太多的人力、物力，自动化程度高，完成方法验证，满足准确度、精密度及耐用性等方面的要求，完全能够满足推广以及高通量操作，满足对上市EPO产品的不同唾液酸含量的电荷异质体检测研究的需要。
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种利用毛细管区带电泳(CZE)评价上市EPO产品的电荷异质体的检测方法。本发明公开了一种检测上市EPO产品不同唾液酸含量的电荷异质体的检测方法，克服了EPO产品中人血清白蛋白(HSA)的干扰，解决了传统CZE方法无法检测EPO上市产品的电荷异质体的难题。该方法操作简单，不需要花费太多的人力、物力，自动化程度高，完成初步的方法验证，满足精密度及耐用性等方面的要求，同一样品多次分析得到的不同电荷异质体组分的迁移时间的RSD在5％以内，各个组分校正峰面积百分比的RSD在20％以内。该方法能够快速、准确、高效的对上市EPO产品不同唾液酸含量的电荷异质体进行检测。此外，本发明实验方法稳定且易于操作，完全能够满足推广以及高通量操作，满足对上市EPO产品的电荷异质体检测和比较的需要。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (9)

1.一种用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法，其特征在于，
所述的CZE检测方法包括：
步骤(1)：取NiCl2、NaH2PO4，配制背景电解质；
步骤(2)：按照甲醇、HCl、H2O、NaOH、H2O、Amine Regenerator、背景电解质的顺序上样，对胺基涂层毛细管进行预平衡；
步骤(3)：将所述的组合物通过正向气压上样；
步骤(4)：加反向电压，分离所述的组合物中的不同电荷异质体；
步骤(5)：采用UV检测器记录所述的组合物的不同唾液酸含量的电荷异质体的电泳行为，完成对所述的组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测。
2.根据权利要求1所述的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法，其特征在于，所述的组合物中还包括人血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法，其特征在于，所述的步骤(1)具体为：
取1mM NiCl2、100～300mM NaH2PO4，配制pH值为3.8～4.2的背景电解质。
4.根据权利要求1所述的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中HCl为0.1M的HCl，NaOH为1.0M的NaOH。
5.根据权利要求1所述的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中预平衡的冲洗气压为20psi，冲洗时间为5～10min。
6.根据权利要求1所述的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的上样气压为正向0.5～1.0psi，上样时间为8～20s。
7.根据权利要求1所述的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法，其特征在于，所述的步骤(4)中分离时的电压为反向8～15kv的电压。
8.根据权利要求1所述的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法，其特征在于，所述的步骤(5)中UV检测器的检测波长为200nm～214nm。
9.根据权利要求1所述的用于检测组合物中促红细胞生成素电荷异质体的CZE检测方法，其特征在于，所述的胺基涂层毛细管内径为50μm，有效长度为50cm，毛细管温度为25℃。
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