CN1649899A - 结缔组织刺激肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一些新型肽，其包括选自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元，并最多具有氨基酸基元上游或下游的10个氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羟脯氨酸，以及肽刺激骨、软骨和相连结缔组织的发育、维持和修复。本发明进一步涉及这些肽的药物组合物，以及肽的治疗和预防用途。
Description
发明领域
本发明涉及结缔组织的发育、维持和修复。更具体而言，本发明涉及鉴定能够影响骨骼组织的形成和修复的新型肽，所述骨骼组织包括骨、软骨及相关结缔组织。本发明进一步涉及这些肽的药物组合物，以及肽的治疗和预防用途。
发明背景
贯穿本申请，括号中引用的多种参考文献是为了更充分地描述本发明所属领域的现状。这些参考文献在此引作本发明内容的参考。
已经鉴定和表征了多种因子用于刺激骨/或软骨形成和组织修复。这类因子的例子可包括，例如，钙制剂(如碳酸钙)，降血钙素制剂，性激素(如雌激素，雌二醇)，前列腺素A1，双膦酸，伊普黄酮(ipriflavones)，氟化合物(如氟化钠)，维生素K，骨形态发生蛋白(BMPs)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，转化生长因子(TGF-P)，胰岛素样生长因子1和2(IGF-1，IGF-2)，甲状旁腺激素(PTH)，表皮生长因子(EGF)，白介素抑制因子(LIF)，成骨素(osteogenin)，和骨重吸收阻遏物，诸如雌激素，降血钙素和二膦酸盐(酯)。
U.S.5,169,837和5,403,825公开了抽提自哺乳动物骨的粗提取物的成骨因子和方法。成骨因子能够诱导骨生长，如利用大鼠骨生长分析所确定。U.S.5,599,792公开了显示骨刺激活性和降低的血管活性的甲状旁腺激素(PTH)变体。
各种专利公开了骨形态发生蛋白(BMPs)和分离这些蛋白的方法。BMPs用于处理骨和软骨缺陷。U.S.4,761,471公开了从去矿化的骨组织中纯化混合的BMP组合物的方法；U.S.5,013,649公开了骨形态发生蛋白-3(BMP-3)；U.S.5,106,748公开了骨形态发生蛋白-5(BMP-5)；U.S.6,187,076公开了骨形态发生蛋白-6(BMP-6)；U.S.5,141,905公开了骨形态发生蛋白-7(BMP-7)；PCT公布No.WO91/18098公开了骨形态发生蛋白-8(BMP-8)；U.S.6,287,816公开了骨形态发生蛋白-9(BMP-9)；以及PCT公布No.WO94/26893公开了骨形态发生蛋白-10(BMP-10)。
U.S.6,352,973公开了用于治疗骨病的骨刺激因子多肽。U.S.6,344,439公开了用于促进骨形成的因子，所述因子包括RGD结合序列。U.S.5,958,428公开了促进细胞与胶原蛋白结合的合成化合物。
虽然上述因子在骨修复方面的确具有通用性，但也存在多种缺点。例如，一些因子是相对非特异性的，因此在促进骨组织修复时不很有效。某些因子，诸如抽提的因子，还与免疫原性，感染性和/或疾病传播的风险相关。从组织的粗提取物中抽提或经重组方法制备也是昂贵的，因此抵消了其市场生命力。此外，一些因子具有继发性不期望的全身性或局部效应。最著名的事实是若干已知因子可导致异位骨形成。这种异常骨形成是高度不期望的，并且可能导致严重的药并发症。
因此，有需要提供新型肽，其对于有效影响结缔组织的发育，维持和修复具有特异的体外、体内或离体用途。
发明概述
本发明提供众多新型肽及其类似物，它们在骨骼生物学中的影响力在于肽用来刺激骨、软骨和相连结缔组织在体外、体内、离体正常形成，以及用于组织工程应用。这些新型肽的功能性类似物对公开的肽序列含有一个或多个氨基酸添加、替换或缺失。
本发明所述的新型肽统称为BCSP(“骨和软骨刺激肽”)。
本发明还涉及编码分离的结缔组织促进肽及其类似物的核酸，含有所述核酸分子的表达载体，含有所述核酸分子的宿主细胞，这些肽的组合物以及编码这种肽的核酸和针对这些肽的抗体。
新型肽及其编码核酸可用于利用各种载体和方法所施用的组合物以促进诸如骨和软骨的各种结缔组织的形成和作用。照此，肽及其类似物可用于治疗各种骨骼异常，所述异常包括但不限于由于创伤和/或疾病造成的骨和软骨缺陷。
肽及其功能性类似物可用于各种体外、体内或离体应用和方法中。此外，肽及其功能性类似物在各种组织工程应用中也具有效用。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗组合物和方法，用于治疗包括异常骨和/或软骨形成的紊乱和由疾病造成的有关异常骨骼发育，关节炎和包括软骨退化的关节变性病。治疗组合物和方法也可用于治疗创伤诱导的骨骼或软骨损伤。
本发明一方面是一种肽，包括选自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有所述氨基酸基元上游和/或下游的10个氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羟脯氨酸，以及肽刺激骨，软骨和相连结缔组织的发育，维持和修复。
本发明的另一方面是一种肽，包含一个或多个“GP”和/或“PG”基元并包含多达共约20个氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羟脯氨酸以及肽诱导骨和软骨细胞的活性，以致骨和软骨组织得以发育，维持和/或修复。
本发明的肽刺激骨细胞、骨细胞前体和与其共有谱系的细胞的活性。同样，本发明的肽刺激软骨细胞、软骨细胞前体和与其共有谱系的细胞的活性。照此，这些肽在刺激骨和软骨形成中具有效用，如在体外、离体和/或体内中使用的一样。
本发明的肽在长度上可少至3个氨基酸，并且更优选地，长度为至少4个氨基酸。肽可进一步包括一个或多个接头，钙结合基元和因子，并用于局部或全身性施用。
根据本发明的另一方面，提供了具有选自下列通式的肽：
(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；
-其中P1和P2选自脯氨酸和羟脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n独立地选择；
-其中X选自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-异亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；以及
-其中Z选自异亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-羟脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸。
因此，在本发明的一方面中，提供了具有下列氨基酸序列和命名的肽：BCSP1，其具有氨基酸序列NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；BCSP2，其具有氨基酸序列NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；BCSP3，其具有氨基酸序列NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；BCSP4，其具有氨基酸序列NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；BCSP5，其具有氨基酸序列NGLPGP(SEQ ID.NO.5)；BCSP6，其具有氨基酸序列LPGP(SEQ.ID.NO.6)；BCSP7，其具有氨基酸序列PGPIG(SEQ ID.NO.7)；BCSP8，其具有氨基酸序列NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；BCSP9，其具有氨基酸序列PGPIGP(SEQ ID.NO.9)；BCSP10，其具有氨基酸序列PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；BCSP11，其具有氨基酸序列GPIG(SEQ.ID.NO.11)；BCSP12，其具有氨基酸序列PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；BCSP13，其具有氨基酸序列GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；BCSP14，其具有氨基酸序列PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；BCSP15，其具有氨基酸序列PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；BCSP16，其具有氨基酸序列PGPI(SEQ.ID.NO.16)；BCSP17，其具有氨基酸序列GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；BCSP18，其具有氨基酸序列GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；BCSP19，其具有氨基酸序列GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；以及BCSP20，其具有氨基酸序列PIGP(SEQ.ID.NO.20)。如本发明所用，P*用于表示羟脯氨酸。这些肽分别用于体外、体内和离体引发结缔组织促进反应。
在另一方面，本发明提供了下列肽的功能性类似物用于体外、体内和离体引发结缔组织促进反应：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20。
在另一方面，本发明提供了下列肽的模拟类似物用于体外、体内和离体引发结缔组织促进反应：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20。
在本发明的进一步方面，提供了在哺乳动物，例如，人中用于刺激结缔组织反应的组合物，所述组合物包括有效量的一种或多种选自下列的肽：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性类似物和/或功能性模拟物，还包括可药用稀释剂或载体。这些组合物可配制成制剂含有其他佐剂，共刺激分子和/或稳定剂。
本发明的另一实施方案是用于刺激骨、软骨和相连结缔组织的发育、维持和修复的组合物，所述组合物包括具有选自下列通式的肽：
(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；
-其中P1和P2选自脯氨酸和羟脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n独立地选择；
-其中X选自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-异亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；
-其中Z选自异亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-羟脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸；以及
可药用载体。
本发明的另一方面是在哺乳动物中用于刺激骨、软骨和相连结缔组织的发育、维持和修复的方法，所述方法包括施用有效量的肽，所述肽含有选自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有所述氨基酸基元上游和/或下游的10个氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羟脯氨酸。
本发明的进一步实施方案是用于在哺乳动物中促进结缔组织形成的治疗方法，所述方法包括给哺乳动物施用具有选自下列通式的肽：
(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；
-其中P1和P2选自脯氨酸和羟脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n独立地选择；
-其中X选自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-异亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；
-其中Z选自异亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-羟脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸；
-或者(I)、(II)和/或(III)的功能性类似物或变体。
本发明的进一步实施方案是用于在个体中促进结缔组织形成的治疗方法，所述方法包括给所述个体施用一种或多种选自下列的肽：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性类似物。
根据进一步实施方案，本发明提供了用于在个体中治疗受损的骨、软骨和相关组织的方法，包括给个体施用有效量的一种或多种选自下列的肽：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性类似物和/或模拟类似物，其中肽刺激结缔组织修复和形成。
根据进一步实施方案，本发明提供了用于在个体中增强整形外科或牙科植入物的骨整合的方法，包括给个体施用有效量的一种或多种选自下列的肽：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性类似物。
根据本发明的进一步实施方案，提供了在软骨缺陷部位处体内生产软骨的方法，所述方法包括：
-将一群软骨形成细胞植入缺陷部位，所述细胞在一种或多种选自下列的肽存在下已经体外培养：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性类似物。
本发明包括在软骨缺陷部位处体内促进软骨修复的方法，其中在一种或多种选自下列肽的存在下通过组织工程技术制备的新软骨已经被植入缺陷部位：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性类似物。
根据本发明的另一实施方案，提供了用于治疗特征为软骨退化的关节变性病的方法，所述方法包括：
-将治疗有效量的一种或多种选自下列的肽传递到疾病部位：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性类似物。
根据进一步实施方案，本发明提供了用于在哺乳动物中治疗骨相关紊乱的方法，包括给药于哺乳动物细胞，所述细胞选自衍生自骨，骨髓或血液的成骨细胞(osteoblastic cell)，前成骨细胞，软骨细胞，前软骨细胞，骨骼祖细胞及其混合物，并用有效量的一种或多种选自下列的肽处理：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性类似物。
本发明的方法包括提供全身性和/或局部施用本发明选定的肽或功能性类似物。
根据本发明的另一方面，提供了在脊椎动物的骨部位种植用的形态发生装置，所述装置包括：
-可植入的生物相容性载体；以及
-在所述载体之内或之上提供或分散的一种或多种选自下列的肽：BCSP1，BCSP2，BCSP3，BCSP4，BCSP5，BCSP6，BCSP7，BCSP8，BCSP9，BCSP10，BCSP11，BCSP12，BCSP13，BCSP14，BCSP15，BCSP16，BCSP17，BCSP18，BCSP19和BCSP20及其功能性类似物。
本发明的另一方面是在哺乳动物中用于刺激骨发育的方法，所述方法包括施用有效量的一种或多种选自下列的肽：SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.15和SEQ.ID.NO.18及其功能性类似物和模拟类似物。
本发明的另一方面是在哺乳动物中用于刺激软骨发育的方法，所述方法包括施用有效量的一种或多种选自下列的肽：SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11及其功能性类似物和模拟类似物。
本发明的另一方面是刺激骨和/或软骨形成和相连结缔组织的肽的筛选方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将能够接受骨和/或软骨形成的第一生物样品与测试肽接触；
(b)单独将能够接受骨和/或软骨形成的第二生物样品与生物有效量的选自下列的肽接触从而提供对照：NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；
(c)评价由步骤(a)和步骤(b)产生的骨和/或软骨形成的水平；以及
(d)比较步骤(c)中评价的骨和/或软骨形成的水平，由此能够刺激骨和/或软骨形成的肽由其改变骨和/或软骨形成的水平的能力与步骤(b)的对照比较后所鉴定。
本发明的另一方面是刺激骨和/或软骨形成和相连结缔组织的调节剂的筛选方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将能够接受骨和/或软骨形成的第一生物样品与测试化合物和生物有效量的选自下列的肽接触：NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；
(b)单独将第二生物样品与生物有效量的选自下列的肽接触从而提供对照：NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；
(c)评价由步骤(a)和步骤(b)产生的骨和/或软骨形成的水平；以及
(d)比较步骤(c)中评价的骨和/或软骨形成的水平，由此骨和/或软骨形成的调节剂由其改变骨和/或软骨形成的水平的能力与步骤(b)的对照比较后所鉴定。
本发明的另一方面是刺激骨、软骨和相连结缔组织的发育、维持和修复的肽的鉴定方法，所述方法包括：
-确定所述肽是否与一种或多种选自下列的肽具有可比较的活性：NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；
其中活性的评价方法是分析一种或多种选自下列的标准：骨矿物质密度，骨矿物质含量，碱性磷酸酶活性，成骨细胞增殖，骨结形成，骨结矿化，软骨细胞增殖，胶原蛋白分析和蛋白聚糖分析。
本发明的其他特征和优点将从下列详细描述中变得清晰。然而，应该理解，说明本发明实施方案的详细描述和具体实施例仅以示例性方式给出，这是因为，对本领域技术人员来说，从所述的详细描述中在本发明的实质和范围内进行各种改变和修饰是显而易见的。
附图说明
参照附图，本发明将从下列说明中进一步加以理解，其中：
图1示出了用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的骨缺陷的组织学切片；
图2示出的X光照片表明手术后9周SkeliteTM/BCSP1移植物与自体移植物的性能比较；
图3示出了BCSP1处理对移植物去脂体(lean mass)(愈伤组织形成)与自体移植物的影响比较；
图4示出了用BCSP1肽注射的胫骨的DEXA分析区。全骨分析包括所有3个胫骨区。BCSP1肽注射施用在区2；
图5示出了BCSP1对全胫骨的骨矿物质密度(BMD)的影响与BSCP1对胫骨内区2的局部影响的比较；
图6示出了BCSP1对全胫骨的骨矿物质含量(BMC)的影响与BCSP1对胫骨内区2的局部影响的比较；
图7A示出了BCSP1，BCSP7，BCSP9，BSCP10和对照对全胫骨的骨矿物质密度的平均增加值；
图7B示出了BCSP1，BCSP7，BCSP9，BSCP10和对照对胫骨区2的骨矿物质密度的平均增加值(参见图4)；
图8A示出了BCSP1，BCSP7，BCSP9，BSCP10和对照对全胫骨的骨矿物质含量的平均增加值；
图8B示出了BCSP1，BCSP7，BCSP9，BSCP10和对照对胫骨区2的骨矿物质含量的平均增加值(参见图4)；
图9示出了BCSP1对牛软骨细胞生长的影响；
图10示出了BSCP1对人软骨细胞生长的影响；
图11示出了BCSP1对大鼠骨髓衍生的成骨细胞培养物中DNA合成的影响；
图12示出了BSCP1对头顶衍生的成骨细胞培养物增殖的影响；
图13示出了BCSP1对骨髓衍生的成骨细胞中碱性磷酸酶活性的影响；
图14示出了BCSP1对头顶衍生的成骨细胞中碱性磷酸酶活性的影响；
图15示出了BCSP1对头顶培养物中骨结形成的影响；以及
图16示出了BCSP1对头顶培养物中骨结矿化的影响。
优选实施方案的详细说明
本发明提供了新型肽及其功能性类似物，其在哺乳动物体外和体内以及离体组织工程中均影响结缔组织的发育，维持和修复。这些肽在结缔组织修复和再生中具有多种用途。
如本发明所用的术语“结缔组织”包括骨，软骨和由共有谱系的细胞形成的相关结缔组织。这种细胞可包括例如，衍生自骨，骨髓或血液的成骨细胞，前成骨细胞，软骨细胞，前软骨细胞和骨骼祖细胞。照此，肽可用于骨，软骨和相连结缔组织的正常结构的发育，维持和修复。
如本发明所用的术语“骨”是本领域技术人员公知的，定义为形成大多数脊椎动物骨骼的主要部分的致密，半刚性，多孔，钙化的结缔组织。其由致密的有机基质和无机矿物质组分以及其中所含的细胞所组成。
如本发明所用的术语“软骨”是本领域技术人员公知的，为诸如关节，外耳和喉的多种身体部分发现的坚韧、弹性、纤维状结缔组织。软骨不是钙化样骨，但由与骨-形成的成骨细胞共有谱系的软骨细胞产生。
如本发明所用的术语“相关结缔组织”定义为与骨和软骨相关的组织，诸如骨髓和其中所含的细胞，腱和韧带。
在一个实施方案中，本发明的肽提供了“骨刺激反应”，其导致软骨内骨形成，骨矿化，骨矿物质密度，骨矿物质含量以及骨修复的增加。一般而言，这涉及对骨-形成细胞(包括但不限于成骨细胞，前成骨细胞，软骨细胞以及前软骨细胞)的有益效果导致产生和分泌增量的矿化基质，所述矿化基质是新骨组织形成的基础。反应是特异的，以致肽的局部传递不会导致异位骨形成。
如本发明所用的缩写“BCSP”表示新型“骨和软骨刺激肽”。本领域普通技术人员将会理解，本发明的BCSP肽长度是变化的，可以少至3个连续氨基酸，更优选至少4个连续氨基酸。在本发明的某些实施方案中，本发明的BCSP肽包括少至3个氨基酸到多至10或20个氨基酸或更多。如本发明所述的肽序列采用正如本领域技术人员所理解的氨基酸的标准单字代码来表示(Short Protocols In MolecularBiology，Second Edition，John WILEY & Sons，1992)。
本发明的BCSP肽是一种包括选自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有氨基酸基元上游和/或下游的10个氨基酸的肽。所述肽刺激骨，软骨和相连结缔组织的发育，维持和修复。基元中的“P”可选自脯氨酸和羟脯氨酸。
在另一实施方案中，本发明的BCSP肽含有一个或多个“GP”和/或“PG”基元，并且包含多达共约20个氨基酸，其中肽诱导骨和软骨细胞的活性，以致骨和软骨组织得以发育，维持和/或修复。基元中的“P”可选自脯氨酸和羟脯氨酸。
本发明的肽一般在所选定的基元上游和/或下游可以连接下列氨基酸的组合：亮氨酸，甘氨酸，天冬酰胺，异亮氨酸，脯氨酸，羟脯氨酸，精氨酸，苏氨酸，天冬氨酸和腺嘌呤。照此，与选定的基元一起使用的适合的氨基酸序列包括但不限于：脯氨酸，精氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，亮氨酸-脯氨酸，脯氨酸-异亮氨酸，甘氨酸-脯氨酸，脯氨酸-精氨酸，甘氨酸-亮氨酸，甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸，甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸，脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸，脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸，脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸，脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸，天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸，脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸，脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸，脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸及其组合。
本发明的肽可由选自下列的通式来表示：
(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；
-其中P1和P2选自脯氨酸和羟脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n独立地选择；
-其中X选自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-异亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；以及
-其中Z选自异亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-羟脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸。在本发明的特定实施方案中，肽选自NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)以及PIGP(SEQ.ID.NO.20)。
本发明还涉及如上和在此所述的肽的功能性等同变体。“功能性等同变体”或“功能性类似物”包括具有部分序列同源性的肽，具有一个或多个特异性保守和/或非保守氨基酸替换的肽，肽共轭物，嵌合蛋白，融合蛋白以及肽编码核酸。功能性等同变体保持天然肽的生物活性。生物活性(即，刺激骨或软骨细胞)可通过分析一种或多种选自下列标准进行评价：骨矿物质密度，骨矿物质含量，碱性磷酸酶活性，成骨细胞的增殖，骨结形成，骨结矿化，软骨细胞增殖，胞内钙通道分析，胶原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。这些方法是众所周知的，并且完全在本领域范围内(参见，例如U.S.专利6,333,312，5,972,623，5,965,136，6,030,792和6,060,255)。
根据“功能性类似物”，为本领域技术人员充分理解，生物功能性肽类似物定义中固有的概念是对变化数目存在限制，所述变化可以在分子的限定部分内进行，并且还导致具有可接受水平的等同生物活性的分子，在这种情况下，所述活性包括在结缔组织形成中诱导变化的能力。根据本发明，可容易制得和使用多个具有不同替换的独特的肽/蛋白。也可以理解的是，某些残基对于蛋白或肽的生物或结构特性尤其重要，诸如受体识别区中的残基，这类残基通常不可以替换。
通过保守或非保守性氨基酸替换可生成功能性类似物。氨基酸替换一般是基于氨基酸侧链取代基之间的相似性，例如，它们的疏水性，亲水性，电荷，大小等。因此，在本发明范围内，保守性氨基酸替换表示在特定位置处的氨基酸变化，其与原始存在的氨基酸属于同一类型，即，疏水性氨基酸替换疏水性氨基酸，碱性氨基酸替换碱性氨基酸等。保守性替换的例子包括一种极性(疏水性)氨基酸诸如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸替换另一种疏水性氨基酸，一种极性(亲水性)氨基酸替换另一种亲水性氨基酸，诸如在精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酰胺和天冬酰胺之间，甘氨酸和丝氨酸之间的替换，一种碱性氨基酸诸如赖氨酸，精氨酸或组氨酸替换另一种碱性氨基酸，或者一种酸性氨基酸，诸如天冬氨酸或谷氨酸替换另一种酸性氨基酸，一种支链氨基酸，诸如异亮氨酸，亮氨酸或缬氨酸替换另一种支链氨基酸，一种芳香族氨基酸，诸如苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸替换另一种芳香族氨基酸。这种氨基酸变化所导致的功能性类似物并未显著改变肽的整个电荷和/或构型。这种保守性替换的例子对本领域专业技术人员是众所周知的，并且落入本发明的范围内。保守性替换还包括使用化学衍生化的残基取代非衍生化的残基，条件是所得的肽在生物功能上等同于如本发明所述的肽以及SEQ ID NOS.1-20中的任一种肽。
本发明的肽可以嵌合蛋白形式提供，以致嵌合蛋白含有另一蛋白的序列。在一个方面，理想的是给本发明肽提供另一蛋白的非天然钙结合结构域。本发明的嵌合肽包括选自下列蛋白的钙结合序列：骨调素(osteopontin)，牙基质磷蛋白，卵黄高磷蛋白，phosphohoryn，β-酪蛋白，stratherin，基质gla蛋白，核黄素结合蛋白以及αS1酪蛋白。在一个实施方案中，钙结合序列可选自：S*S*，S*S*GS*EE，S*S*S*EE，S*S*S*S*S*S*，DS*S*DS*S*，S*LS*S*S*S*，DS*S*EE，DS*S*ES*，S*MS*S*S*EE和S*IS*S*S*EE及其组合，其中S*表示磷酸化的丝氨酸氨基酸残基。因此，这种嵌合肽的功能性类似物和模拟物也落入本发明的范围内。
一个或多个接头分子与本发明肽连接也落入本发明的范围内。在这方面，接头分子可以连接在选定肽的任意一侧或两侧(即末端部分)。这些接头分子可选自碳二亚胺，醛，马来酰亚胺，巯基，氨基，羧基，羟基，NHS酯，修饰的半胱氨酸，磷酸化的氨基酸，氨基酸，二醋酸，磺酰氯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，环氧树脂，双膦酸酯，焦磷酸酯，磷酸酯，二硫化物，苯基叠氮化物，烷基卤，以及酰肼酰基氯。
本发明的肽还衍生自下列肽SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5，SEQ.ID.NO.6，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.13，SEQ.ID.NO.14，SEQ.ID.NO.15，SEQ.ID.NO.16，SEQ.ID.NO.17，SEQ.ID.NO.18，SEQ.ID.NO.19和SEQ.ID.NO.20，但在一个或多个位置含有非保守性氨基酸替换，替换程度只是这种肽仍能在体外，体内和/或离体提供反应。
本发明的肽可利用全自动仪器通过化学合成获得，或者通过核酸序列表达获得，采用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术，所述核酸序列能够指导肽的合成。本发明的肽的制备可采用蛋白化学中熟知的技术通过化学合成进行，诸如固相合成(Merrifield，J.Am.Chem.Assoc.85：2149-2154(1964))或均匀溶液中的合成(Houbenweyl，Methods of Organic Chemistry(1987)，(Ed.E.Wansch)Vol.15，pts.I andII，Thieme，Stuttgart)。通过重组表达生产蛋白的技术是本领域技术人员熟知的，并且描述在例如，Sambrook等(1989)或其最新版本。
本发明还涉及本发明肽的非肽类似物，例如，提供了结构稳定或生物降解减少的肽模拟物。肽模拟类似物的制备是基于具有选自下列序列的选定的BCSP肽通过一个或多个残基替换非肽部分进行的：SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5，SEQ.ID.NO.6，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.13，SEQ.ID.NO.14，SEQ.ID.NO.15，SEQ.ID.NO.16，SEQ.ID.NO.17，SEQ.ID.NO.18，SEQ.ID.NO.19或SEQ.ID.NO.20。优选的是，非肽部分允许肽保留其天然构型，或者使优选的例如生物活性构型稳定化。这种肽可在基于分子或细胞结合的分析中进行测试，以评价替换对构型和/或活性的影响。从本发明肽中制备非肽模拟类似物可例如，按下列文献所教导的进行：Nachman等，Regul.Pept.57：359-370(1995)。
本发明还包括含有核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码一种或多种选自SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5，SEQ.ID.NO.6，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9 SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.13，SEQ.ID.NO.14，SEQ.ID.NO.15，SEQ.ID.NO.16，SEQ.ID.NO.17，SEQ.ID.NO.18，SEQ.ID.NO.19或SEQ.ID.NO.20的氨基酸序列及其变体。
本发明还包括核酸序列，其互补及反互补于编码序列及其等同序列变体。本领域技术人员能够容易地确定这种互补或反互补的核酸序列。在严格条件下与前述核酸分子之一杂交的核酸序列也是本发明的一部分。如本发明所用的“严格条件”是指本领域所熟悉的参数，并且这些参数讨论在例如，最新版的分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，J.Sambrook等编，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，或者Current Protocolsin Molecular Biology，F.M.Ausubel等编，John Wiley & Sons Inc.，NewYork。本领域技术人员能够识别编码本发明BCSP肽的核酸类似物。细胞和文库的筛选用于表达这种分子，然后进行常规分离，接着分离相关核酸分子和测序。
值得注意的是，本发明所述的核酸分子还可包括简并核酸。由于遗传密码的简并性，DNA序列的变化导致翻译同样的肽。因此，可以理解的是对核苷酸有众多选择，以导致能够指导生产本发明的肽或其功能性类似物的序列。结果，简并核苷酸替换也包括在本发明的范围内。
正如本领域技术人员所理解，本发明的核酸分子可包括单链和双链形式，质粒，病毒核酸，质粒细菌DNA，裸露/游离DNA和RNA。包括编码本发明至少一种肽的核酸序列的病毒核酸可以称作病毒载体。
本发明也包括表达载体，所述载体含有本发明的核酸序列，其在表达载体内编码一种或多种肽SEQ ID NO.1-20及其功能性类似物。可以采用任何表达载体，只要其在原核生物或真核生物宿主细胞中能够携带和表达编码本发明肽及其功能性类似物的核酸序列，包括重组病毒，诸如痘病毒，腺病毒，α病毒和慢病毒(lentivirus)。
本发明还包括转化，转染或感染有这种载体以表达本发明的肽或功能性类似物的宿主细胞。照此，宿主细胞包括任何潜在的细胞，其中导入和/或转染了本发明的核酸。
组合物
由于证明了本发明的一种或多种肽可在体外，体内或离体直接影响结缔组织形成，尤其是具有影响组织修复和组织工程的骨生成促进活性或软骨生成促进活性，因此为了治疗骨骼创伤，骨骼发育异常(非代谢性骨病和代谢性骨病)，关节炎和关节变性病，现在可以开发和使用药物组合物。
本发明肽针对骨创伤或骨发育异常的代表性用途包括例如，修复骨缺陷和缺乏，诸如那些在闭合，开放和非联合性骨折中发生的骨缺陷和缺乏，骨/脊椎变形，骨肉瘤，骨髓瘤，骨发育异常和脊柱侧凸；预防性用于闭合和开放性骨折减少；在整形手术中促进骨愈合；刺激骨向内生长到非接合的修复术关节和牙科植入物；提升绝经期前妇女的骨峰质量；治疗生长缺陷；治疗牙周疾病和缺陷，以及其他牙修复过程；增加牵张骨生成过程中的骨形成；以及治疗其他骨骼紊乱，诸如年龄有关的骨质疏松症，绝经期后骨质疏松症，糖皮质激素诱导的骨质疏松症或废用性骨质疏松症和关节炎，软骨病(osteomalcia)，纤维性骨炎，肾性骨营养不良以及骨的Paget氏病，或从刺激骨形成中受益的任何状况。
本发明肽也可在刺激软骨形成方面用于治疗性用途中。本发明肽针对软骨创伤或软骨异常的代表性用途包括软骨运动损伤，诸如软骨裂伤；软骨缺陷，诸如软骨损伤和骨软骨缺陷；以及软骨变性病，诸如骨关节炎。
本领域技术人员能够利用本发明所述的肽组合物来治疗和缓解前述创伤和疾病，并且对各种细胞类型的生理有益效果具有成功的合理预期，所述细胞类型包括但不限于衍生自骨，骨髓或血液的骨细胞(即，成骨细胞，前成骨细胞和与其共有谱系的细胞)，软骨细胞(即，软骨细胞，前软骨细胞，以及与其共有谱系的细胞)，以及骨骼祖细胞。此外，众多因子，诸如骨形态发生因子，抗重吸收因子，骨生成因子，软骨形态发生因子，生长激素以及分化因子，可与本发明的肽组合物一起使用，目的是有助于促进结缔组织发育，维持和修复。
本发明的组合物在修复结缔组织的先天性，创伤-诱导的或手术切除术(例如，对癌症治疗而言)以及在美容手术中也是有用的。这种组织缺乏或缺陷通过施用本发明的肽可在脊椎动物个体中得到治疗，所述肽显示了某些结构和功能特征。
对于在脊椎动物中进行移植而言，本发明的肽可用于涉及软骨和/或骨组织的离体组织工程的骨骼重建。在组织工程过程中，细胞和/或发育组织可用选定的肽或其功能性类似物进行体外治疗以促进任何或所有步骤的细胞增殖，细胞分化，和/或组织结构形成。用于组织工程过程的细胞源可以是自体的，同种异体的或异种的。离体过程可在细胞扩增，细胞分化或组织结构形成，以及将如此生成的细胞和/或组织导入病人体内后结束。组织工程技术的应用使得组织能够从头形成，从而减少或消除了获得自体移植物，同种异体移植物或异种移植物组织的需要。这种实践是高度理想的，因为这些组织源分别具有相伴的并发症。自体移植物方法一般导致供体部分发病，而使用同种异体移植物带来感染风险，以及异种移植物具有诱导免疫并发症的可能性。本发明的组合物可以全身性或局部施用。对全身性使用而言，本发明的化合物根据常规方法可配制成制剂用于选自下列施用：静脉内，皮下，肌内，腹膜内，口服，肠内，肠胃外，鼻内，肺部，局部或经皮施用。例如，局部施用的组合物的制备可通过关节内注射或采用移植物进行。
对于口服而言，组合物可以液体制剂的形式，或者当其以液体形式获得时，可以填充在软胶囊等中以生成口服制剂。当本发明的组合物为固相分散体时，其可包装在胶囊中或成型为丸剂，细颗粒，颗粒或片剂以生成口服制剂。作为固相分散体，组合物可在其他添加剂存在下成型为固相形式，诸如球形，棒形，针形，丸形和膜形，这根据本领域技术人员所理解的需要进行。
静脉内给药可通过一系列注射或连续灌输一延长的时间进行。以注射或其他分隔给药的途径进行给药的间隔期从每周一次到每天1-3次。或者，本发明所公开的肽可以循环方式给药(施用公开的肽，接着无施用，再施用公开的肽，等等)。治疗持续直至取得理想的结果。
根据本发明，肽组合物以治疗有效量施用。治疗浓度为实现所需水平的组织形成或局部组织修复，或降低特定状况或这种状况扩张速率的浓度。有效治疗或预防浓度将随状况不同而不同，并且在某些情况下，可随着在治疗状况的严重性以及病人对治疗的易感性的不同而不同。因此，没有单一浓度是千篇一律有用的，而是取决于在治疗的慢性或急性状况的特性需要加以修饰。这种浓度可通过常规试验获得，正如本领域技术人员所公知的一样。
一般而言，药物制剂包括本发明的肽与可药用载体的组合，所述载体诸如盐水，缓冲盐水，5％葡萄糖的水，乙醇，含有痕量金属的硼酸缓冲的盐水等及其混合物。制剂可进一步包括一种或多种赋形剂，防腐剂，增溶剂，缓冲剂，防止蛋白在病毒表面上丧失的白蛋白，润滑剂，填料，稳定剂等。制剂方法是本领域众所周知的，并且公开在例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Gennaro编，Mack PublishingCo.，Easton Pa.，1990，在此引作参考。
本发明的组合物可相伴与其他因子一起使用用于治疗骨病。同时使用的药物的例子可包括例如，钙制剂(如磷酸钙，硫酸钙，碳酸钙)，降血钙素制剂，性激素(如雌激素，雌二醇)，前列腺素A1，双膦酸，伊普黄酮，氟化合物(如氟化钠)，维生素K，血纤蛋白，蛋白聚糖，骨形态发生蛋白(BMPs)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，转化生长因子(TGF-β)，胰岛素样生长因子1和2(IGF-1，2)，内皮素，甲状旁腺激素(PTH)，表皮生长因子(EGF)，白介素抑制因子(LIF)，成骨素，和骨重吸收阻遏物，诸如雌激素，降血钙素和二膦酸酯。也可考虑将这些因子的混合物使用和配制在本发明的组合物内或者与本发明的组合物结合使用。
本发明中所用的药物组合物的形式可以为无菌，非热原性液体溶液或悬浮液，包被的胶囊，膏体，洗剂，冻干粉或本领域已知的其他形式。本发明的肽可被配制成水凝胶用于局部给药或施加到所需的载体上。局部给药可以通过在损伤或缺陷的部位处注射或在该部位插入或连上固相载体进行。对于局部给药而言，传递载体可提供骨或软骨向内生长用的基体或支架，并且可以是一种被个体吸收而无副作用的载体。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽可以与合成的生物材料化合物结合使用(SkeliteTM，描述在申请人的U.S.专利No.6,323,146中，在此引作参考)。这种分离的生物可重吸收的生物材料化合物包括钙，氧和磷，其中至少一种所述元素的部分被离子半径约0.1-0.6埃的元素所取代。在该实施方案中，合成的生物材料化合物可被成型为所需的三维移植物，而肽组合物可以其上的包衣或散布其中的基质形式提供。或者，肽组合物可以与SkeliteTM的颗粒或粉末形式密切混合用于局部给药。
多种聚合物可用于形成移植物，以将本发明的肽组合物传递到所需的体内部位。合适的聚合物包括但不限于聚酯，聚乙酸乙烯酯，聚丙烯酸酯，聚原酸酯(polyorthoesters)，聚羟基乙基甲基丙烯酸酯(polyhema)和聚酐。基于生物可降解和生物相容的特性可对某些聚合物加以挑选。衍生自丙交酯，乙交酯和己内酯(caprolactone)单体的脂肪族聚酯尤其是有利的，这是因为它们具有相当广泛的降解谱。本发明的肽组合物可以与胶原蛋白，血纤蛋白，淀粉，藻酸盐和透明质酸结合使用。
除了上述聚合物和载体以外，掺入肽组合物中的生物可降解膜和基质可包括同上讨论的其他活性或惰性组分及其混合物。尤其感兴趣的是那些促进组织生长或浸润的因子，诸如生长因子。为此目的的示例性生长因子包括表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，转化生长因子(TGFs)，甲状旁腺激素(PTH)，白介素抑制因子(LIF)，胰岛素样生长因子(IGFs)等。促进骨生长的因子，诸如骨形态发生蛋白(U.S.专利No.4,761,471)，成骨素(Sampath等，Proc.Natl.Acad Sci USA(1987)84：7109-13)和NaF(Tencer等，J.Biomed.Mat.Res.(1989)23：571-89)也是优选的。生物可降解膜或基质包括硫酸钙，磷酸三钙，羟基磷灰石，聚乳酸，聚酐，骨或皮肤胶原蛋白，纯蛋白，胞外基质组分等及其组合。这些生物可降解材料可与非生物可降解材料(例如，聚合物移植物，钛移植物)组合使用，以提供所需的生物，机械，化妆品，或基质界面特性。
一方面，将本发明所述的钛传递给所需的部位可通过使用控释组合物而得以增强，诸如那些在WIPO公布WO 93/20859(在此以其全文引作参考)中描述的控释组合物。这种类型的膜作为可重吸收和非可重吸收的修复术装置和手术移植物的包衣尤其有用。膜可例如，包在手术螺钉，杆，针，盘等的外表面。按惯例，这种类型的可移植装置用于整形外科手术中。膜也可用于包覆骨填充材料，诸如羟基磷灰石块，去矿物化的骨基质塞，胶原蛋白基质等。一般而言，如本发明所述的膜或装置施用到骨的骨折部位上。通常，所述施用是利用标准手术程序移植至骨或连在表面。
传递本发明化合物的替代法包括采用ALZET渗透微型真空泵(Alza Corp.，Palo Alto，Calif.)，缓释基质材料，诸如那些公开在Wang等(PCT公布WO 90/11366)中的材料，带电葡聚糖珠，如在Bao等(PCT公布WO 92/03125)中所公开；基于胶原蛋白的传递系统，例如，如在Ksander等，Ann.Surg.(1990)211(3)：288-94中所公开；甲基纤维素凝胶系统，如在Beck等，J.Bone Min.Res.(1991)6(11)：1257-65中所公开；基于藻酸盐的系统，如在Edelman等，Biomaterials(1991)12：619-26中所公开，等等。其他本领域熟知的用于在骨中持续局部传递的方法包括多孔包覆的可被浸渍的金属假体以及含有本发明治疗用组合物的固体塑料棒。
在一个实施方案中，肽组合物可包括至少一种选自SEQ ID NO.1-20的肽，提供以称为脂质体的磷脂囊泡中所含的溶液或乳状液。脂质体可以是单层或多层，并且形成自选自磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，胆固醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，去肉豆蔻酰磷脂酰胆碱及其组合的组分。多层脂质体包括与单层囊泡有相似组成的多层囊泡，但其制备是为了导致多个区室，其中俘获选定肽的溶液或乳状液。另外，其他佐剂和改性剂可包括在脂质体制剂中，诸如聚乙烯醇，或其他材料。
本领域技术人员所理解的是，任何数目的脂质体双层组合物可用于本发明的组合物中。脂质体的制备可采用多种公知的方法，诸如那些在U.S.专利No.4,235,871和RRC，Liposomes：A Practical Approach.IRL Press，Oxford，1990，第33-101页中公开的方法。
含有本发明肽的脂质体可具有修饰，诸如具有结合到脂质体外部的非聚合物分子，诸如半抗原，酶，抗体或抗体片段，细胞因子和激素以及其他小蛋白，多肽或非蛋白分子，它们赋予脂质体以所需的酶或表面识别特征。优先将脂质体靶向到特异器官或细胞类型的表面分子包括例如，将脂质体靶向到携带特异抗原的细胞的抗体。偶联这种分子的技术为本领域技术人员所熟知的(参见，例如U.S.专利4,762,915)。此外，或者结合，本领域技术人员会理解，任何数目的携带阳性或阴性净电荷的脂质体可用于改变脂质体膜的表面电荷或表面电荷密度。
脂质体也可掺入热敏感或pH敏感的脂质作为脂质双层的成分从而以受控方式降解脂质体囊泡膜。
对于通过静脉内传递全身给药而言，有益的是将本发明的肽以胶囊形式包装在位阻稳定的脂质体内，所述脂质体显示延长的血液循环时间。生产位阻稳定的脂质体，含有聚乙烯醇作为其表面的必需成分，以及制备这种脂质体的方法是本领域技术人员所公知的。
脂质体大小的选择是基于目的靶和给药途径。约10nm-300nm之间的脂质体可以是合适的。此外，本发明的组合物可包括不同大小的脂质体。
尽管本发明的组合物可以被胶囊包装，用于通过脂质体给药，为本领域技术人员所理解的是，其他类型的胶囊密封材料也可用于密封本发明的BCSPs。微球体包括但不限于那些由离子交换树脂，结晶陶瓷，生物可相容性玻璃，乳胶和散布的颗粒组成的微球体，用于本发明中是合适的。同样，纳米球和其他脂质，聚合物或蛋白材料也可使用。
单独或以组合物方式提供的本发明的肽也可在体外用于刺激骨细胞和/或软骨细胞的活性，然后将这种细胞给药于哺乳动物，以治疗骨或软骨紊乱/缺陷。
本发明还提供了筛选和鉴定肽的其他功能性类似物的方法，其中这种鉴定的肽基本上具有如本发明所述的肽的活性。所述筛选包括将能够接受骨和/或软骨形成的生物样品与测试肽或化合物接触，然后单独将也能够接受骨和/或软骨形成的第二生物样品与一定量的一种或多种肽SEQ ID.NO.1-SEQ.ID.NO.20接触。接着，骨和/或软骨形成的水平通过分析一种或多种选自下列的标准加以评价：骨矿物质密度，骨矿物质含量，碱性磷酸酶活性，成骨细胞的增殖，骨结形成，骨结矿化，软骨细胞增殖，胞内钙通道分析，胶原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。然后，在各个生物样品中比较骨和/或软骨形成的水平以鉴定测试肽或化合物是否基本上具有本发明肽的活性。利用相似方法，也可对骨和/或软骨形成的调节剂进行评价。
总而言之，本发明的肽在结缔组织的发育，维持和修复方面是具影响力的，所述结缔组织不仅包括骨，而且包括软骨和相关结缔组织。
上述公开一般性地描述了本发明。通过参照下列具体实施例可对本发明有更全面的了解。这些实施例的描述仅仅为说明目的，并不旨在限制本发明的范围。由于环境暗示或给予了便利，形式的变化和等同物的替换是可以预期的。虽然具体术语已经在本发明中采用，但是这些术语意在描述性意义而非为了限制目的。
实施例
实施例的描述为了说明目的，并非旨在限制本发明的范围。
本发明公开和实施例中提到但未明确描述的合成化学，蛋白和肽生物化学，分子生物学，组织学和免疫学的方法报道在科技文献中，并且为本领域技术人员所熟知。
实施例1-移植物应用的BCSP1和SkeliteTM载体
BCSP1在骨修复应用中的表现采用临界大小缺陷在体内进行评价，所述缺陷创建在骨骼成熟的新西兰白(NZW)兔的尺骨中，如Bolander等(J.Bone和Joint Surg.，68-A(8)，Oct.1986)所述。收集自髂骨骨突的自体移植物用作对侧对照。研究组和对照组的兔子在12周被终止。
先把9.0mg的肽溶解在0.15ml的水中，并将其冻干在移植物的表面上，从而使得BCSP1结合到SkeliteTM移植物，以创建SkeliteTM/BCSP1移植物。肌内注射芬太奴(Fentanyl)(0.3mg/kg)和咪达唑仑(Midazolam)(2.0mg/kg)使动物麻醉。测量长度2cm，全段尺骨临界大小缺陷的创建采用hall微指令矢状锯(micros saggitalsaw)(型号100，刀片号5023-160)进行。小心确保相邻挠骨的“刻划”或切割不会出现，因为这种损伤会充当应力冒口(riser)，并可能导致挠骨骨折。
骨髓采用18号针经皮收集自股骨的较大转子，将其施用至各个多孔SkeliteTM/BCSP1移植物(6×4×20mm)的表面。将SkeliteTM/BCSP1移植物放置在含有骨髓抽吸液(aspirate)池的无菌培养皿中，并且每分钟旋转移植物共4分钟，同时创建尺骨缺陷，从而完成了上述施用步骤。在SkeliteTM/BCSP1移植物已经移植到右前肢的接受架上后，并且在伤口愈合之前，采用注射器另将0.5ml的骨髓抽吸液施用到SkeliteTM/BCSP1移植物的表面。采用标准整形外科技术，自体骨收集自髂骨骨突，将其修整至合适的尺寸，并且移植到左前肢缺陷。按照标准临床实践，自体移植物未补充有骨髓抽吸液。
采用2ml的戊巴比妥钠(Euthanyl)，通过静脉内过剂量注射在12周时将动物无痛处死。切除前肢，并去除周围的肌肉组织。肉眼检查后，将切除的骨(挠骨和尺骨)固定在70％乙醇或100％福尔马林中，并利用组织学和骨密度计量学技术进行分析。
在所有动物中，在邻近SkeliteTM/BCSP1移植物处注意到皮层样结构或愈伤组织。皮层壳桥接位于移植物周围尺骨的两端。这种新皮层结构在偏振光下具有薄层模式。在新皮质和SkeliteTM/BCSP1移植物之间注意到脂肪髓样组织。同样，在SkeliteTM/BCSP1移植物和挠骨之间注意到髓样组织。
所有SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷都显示出优异的骨整合和大量的骨形成，贯穿全部SkeliteTM/BCSP1移植物的多孔结构，在缺陷两端处在宿主骨和移植物之间整合。与对侧对照不同，所有用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷至手术后9周实现联合(图1)。此外，显微镜下组织学观察鉴定到广泛的破骨细胞重吸收SkeliteTM材料，以及组织在SkeliteTM‘支柱’的三角形空隙内形成。
对于用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷而言，12周时的组织病理学观察始终如一地表明了显著到大量的骨整合，轻微形成编织骨(woven bone)，中度形成薄层骨，髓质样腔，假皮层，以及联合(图2)。相比之下，用自体移植物处理的缺陷通过显微镜发现了假关节病，骨腐骨片，髓坏死/纤维症，以及骨间联合的证据。
当与用自体骨处理的缺陷相比时，用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的临界大小缺陷显示了愈合的加速速率。这种愈合的加速速率在早至手术后3周的X光照片中是显而易见的，并且在所有用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷中观察到大量愈伤组织形成。用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷通常在手术后6周由X光线照片显示出联合证据。SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷的正在进行的愈合包括持续愈伤组织形成，愈伤组织改建，以及包括整个移植物的皮层壳的发育。至9周，所有用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷具有结构联合，并且主要是愈伤组织重建。SkeliteTM/BCSP1移植物和宿主骨之间优异的整合和强大的联合在终止时是显然的。这些X光照片结果得到了切除骨的骨矿物质密度扫描的确证。
对所有用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷而言，组织学评价显示骨整合。与自体骨仅导致部分愈合带有假关节病，骨腐骨片，髓坏死/纤维症的缺陷不同，用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷显示出实体骨联合，高水平的骨整合，以及形成皮层壳和髓样腔。在与SkeliteTM/BCSP1材料直接接触中观察到成熟的薄层骨(在缺乏纤维性组织膜界面的情况下)以及注意到高水平的破骨细胞活性。在所有SkeliteTM/BCSP1移植物的内外表面上经常观察到圆齿状重吸收腔隙和‘切割圆锥物’。
对于用SkeliteTM/BCSP1移植物处理的缺陷而言，愈伤组织形成也加以分析，以在移植物部位为增加的组织形成提供进一步的可计量参数。愈伤组织形成在部分缺陷兔模型上的增加利用DEXA分析去脂体(lean mass)(这排除了矿物质量)得以测量。去脂体的量变显示愈伤组织或软组织形成在SkeliteTM/BCSP1移植物扫描区中的变化(图3)。
这些结果提示，用SkeliteTM/BCSP1移植物处理兔中的临界骨缺陷与自体移植物对照比较导致显著的骨修复。
实施例2-BCSP1，BSCP7，BSCP9和BSCP10对BMC和BMD的影响
在下列4个剂量水平：0.05，0.5，1.0和5.0mg/大鼠或介质，以每个剂量n＝6，对BCSP1肽和BCSP4肽进行测试。60只雄性Wistar大鼠，体重90-110g，随机分成两组，每只大鼠耳朵上附有标签，在试验前安静放置1周。食物和水随意施用。动物注射时体重150-190g。第1组大鼠在水土适应第8天接受BCSP4肽的注射，而第2组大鼠在水土适应第9天接受BCSP1肽的注射。注射后7天，在各自的天数进行解剖。
以0.05-5mg/100μl将肽溶解于无菌水，加入到0.5mg的SkeliteTM干粉中，并且冻干至载体上。样品重悬浮在100μl的无菌注射用盐水。在异氟烷(isofluorane)和氧气的通用麻醉剂下，传递测试化合物。利用0.5cc装有28G1/2″针的胰岛素注射器，将肽沉积到位于胫侧颅侧(Tibialis Cranialis)肌组下邻近膝盖的右中胫骨表面的骨膜面上。对照动物注射有盐水介质和SkeliteTM载体。
注射后7天，用二氧化碳麻醉动物，解剖去除处理后的右胫骨和对侧对照肢。肌肉和软结缔组织在固定在70％乙醇之前切去。
在Norland Eclipse DEXA扫描仪上以小对象方式，成对扫描各个胫骨组的骨矿物质密度(BMD)和骨矿物质含量(BMC)。DEXA分析区示于图4中。对照未处理的对侧肢，计算局部BMD的百分比增加(图5)。由于用BCSP1可见的骨大小增加，作为独立于BMD的骨形成活性的测量，也确定了BMC的增加(图6)。这种在物理大小上的增加降低了BMD的总百分比增加(BMD＝BMC/cm2)。各个胫骨分析在3个相邻区，即近端，中端和远端以及整个尺骨测量。利用标准斯氏t-检验，对各个肽的骨形成活性进行剂量与介质的比较和统计学评价。
在所有区的处理后的整个胫骨中，对BCSP7，BCSP9和BCSP10也表明BMD和BMC的显著变化(图7A，7B，8A和8B)。
实施例3-BCSP1对软骨细胞的影响
采用[3H]胸苷掺入试验，对BCSP1进行体外测试以确定对牛和人初级软骨细胞培养物的影响。对牛软骨细胞，细胞以250,000/孔接种，而对人软骨细胞，以500,000/孔接种(96孔板)，并且附着48小时(含有10％胎牛血清(FBS)的培养基)。然后，汇合前细胞以一式四份用BCSP1进行处理(0，10，20和40ng/ml)48小时，并且用[3H]胸苷(1Ci/ml)处理最后24小时(含有2％FBS的培养基)。所用的培养基为Dulbecco′sModified Eagle Medium(DMEM)(Gibco，目录号#23800)，其含有200个单位/ml青霉素，200ug/ml链霉素和10％FBS用于生长，而2％FBS用于服药。
结果表明当用BCSP1体外处理时，人或牛软骨细胞增殖是剂量依赖性增加的。以ng级剂量处理，影响高达3倍(图9和10)。
实施例4-利用BCSP1肽的体外分析
在3个试验中对BCSP1进行测试，以理解肽对骨刺激的机制。mg级的剂量范围用于生成剂量反应曲线。所有试验采用来自骨髓或头顶的初级大鼠成骨细胞培养物。
成骨细胞增殖的评价采用基于DNA的分析，所述分析测量了溴脱氧尿苷(BrdU)掺入。成骨细胞分化的确定方法利用中到晚期骨标记碱性磷酸酶。晚期分化和矿化的确定方法利用了骨结形成分析(只是头顶)。
衍生自大鼠骨髓的成骨细胞培养物在对BCSP1存在的反应中显示出增殖增加。在与肽接触24小时之前，将细胞培养4天(图11)。观察到成骨细胞增殖中剂量反应增加至100μg/ml。这表明加入BCSP1导致DNA合成增加高达75％。
衍生自大鼠头顶的成骨细胞培养物也显示出对BCSP1存在反应的增殖增加。以100μg/ml到1.3ng/ml的肽的剂量范围与肽接触24小时之前，将细胞培养4天(图12)。在较高剂量时观察到剂量反应反转。在肽的剂量范围为1.3-6.4ng/ml时观察到统计学上显著性增加。
细胞结合碱性磷酸酶，其来自大鼠骨髓衍生的成骨细胞和大鼠头顶衍生的成骨细胞的细胞裂解物。BCSP1以100μg/ml到1μg/ml的剂量范围提供。在与肽接触48小时之前，将细胞培养3天。对大鼠骨髓培养物(RBM)而言，与对照(介质)相比，可见剂量依赖性反应为1μg/ml到100μg/ml(图13)，而对大鼠头顶培养物(RC)而言，为10μg/ml到100μg/ml(图14)。
将大鼠头顶培养物在BCSP1存在下以1ng/ml到100μg/ml的剂量范围维持10天，服药提供以各个流体变化。矿化的骨结的检测是用茜素红染色。用α图像仪2000TM进行图像分析，以计算和定量节结面积。结果表明了以1ng/ml到10ng/ml范围的缓慢增加形成的骨结数的最小变化(图15)。在BCSP1存在下，总的矿化骨结面积(节结大小)以剂量依赖方式显著增加(图16)，这与碱性磷酸酶数据一致。碱性磷酸酶增加会导致总矿化面积增加。
全部体外结果显示，BCSP1肽增加了细胞增殖，导致碱性磷酸酶水平的增加。其他试验已表明碱性磷酸酶的特异活性增加(未示出)，暗示了由肽带来的进一步分化效果。这也从形成的骨结数和矿化面积的总量中见到的骨形成细胞增加，从而得以证实(图16)。
尽管本发明优选的实施方案已在此详细描述，但是本领域技术人员会理解，在不偏离本发明实质的情况下可对其作出改变。
序列表
<110>米列姆·贝尔罗吉克公司(MILLENIUM BIOLOGIX INC.)
SINDREY，Dennis，R.
PUGH，Sydney，M.
SMITH，Timothy，J.N.
<120>结缔组织促进肽(CONNECTIVE TISSUE STIMULATING PEPTIDES)
<130>SCT044300-47
<150>U.S.60/377,271
<151>03/05/2002
<160>20
<170>PatentIn Ver.2.0
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<400>20
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1
Claims (66)
1.一种肽，包括选自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有所述氨基酸基元上游和/或下游的10个氨基酸，其中所述基元中的“P”表示脯氨酸或羟脯氨酸，以及所述肽刺激骨，软骨和相连结缔组织的发育，维持和修复。
2.权利要求1的肽，其中所述肽刺激骨细胞、骨细胞前体和与其共有谱系的细胞的活性。
3.权利要求1的肽，其中所述肽刺激软骨细胞、软骨细胞前体和与其共有谱系的细胞的活性。
4.权利要求1的肽，其中所述肽刺激骨形成。
5.权利要求1的肽，其中所述肽刺激软骨形成。
6.权利要求1-5任一项的肽，其中所述肽在体外，离体和/或体内刺激反应。
7.权利要求6的肽，其中所述肽长度为至少3个氨基酸。
8.权利要求6的肽，其中所述肽长度为至少4个氨基酸。
9.权利要求6，7或8的肽，其中所述肽进一步包括一个或多个接头基。
10.权利要求9的肽，其中所述接头基选自碳二亚胺，醛，马来酰亚胺，巯基，氨基，羧基，羟基和NHS酯，修饰的半胱氨酸，磷酸化的氨基酸，氨基酸，二醋酸，磺酰氯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，环氧树脂，双膦酸酯，焦磷酸酯，磷酸酯，二硫化物，苯基叠氮化物，烷基卤以及酰肼酰基氯。
11.权利要求1-10任一项所述的肽，其中所述肽提供以嵌合肽。
12.权利要求11的肽，其中所述嵌合肽包括选自下列蛋白的钙结合序列：骨调素，牙基质磷蛋白，卵黄高磷蛋白，phosphohoryn，β-酪蛋白，stratherin，基质gla蛋白，核黄素结合蛋白以及αS1酪蛋白。
13.权利要求12的肽，其中所述结合序列选自S*S*，S*S*GS*EE，S*S*S*EE，S*S*S*S*S*S*，DS*S*DS*S*，S*LS*S*S*S*，DS*S*EE，DS*S*ES*，S*MS*S*S*EE和S*IS*S*S*EE及其组合。
14.权利要求1-5任一项的肽，其中所述刺激的评价是分析一种或多种选自下列的标准：骨矿物质密度，骨矿物质含量，碱性磷酸酶活性，成骨细胞的增殖，骨结形成，骨结矿化，软骨细胞增殖，胞内钙通道分析，胶原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。
15.权利要求1-13任一项的肽，其中所述肽以组合物与可药用载体一起提供。
16.权利要求15的肽，其中所述组合物进一步包括选自下列的因子：磷酸钙，硫酸钙，碳酸钙，血纤蛋白，透明质酸，蛋白聚糖，降血钙素，雌激素，雌二醇，前列腺素A1，双膦酸，伊普黄酮，氟化钠，维生素K，骨形态发生蛋白，成纤维细胞生长因子，血小板衍生的生长因子，转化生长因子，胰岛素样生长因子1和2，内皮素，甲状旁腺激素，表皮生长因子，白介素抑制因子，成骨素及其混合物。
17.权利要求15或16的肽，其中所述组合物可局部和/或全身性施用。
18.权利要求17的肽，其中全身性施用选自静脉内，肌内，腹膜内注射，口服，肠内，肠胃外，鼻内，肺部，局部或经皮施用及其组合。
19.权利要求17的肽，其中局部施用通过注射或采用移植物提供。
20.权利要求19的肽，其中所述肽提供以包衣，填料或散布在所述移植物的基质内。
21.权利要求20的肽，其中所述肽与颗粒或粉末状生物材料化合物一起提供。
22.权利要求1，15或21的肽，其中所述肽与生物相容的和/或生物可降解的聚合物一起提供。
23.权利要求1-5任一项的肽，其中所述肽选自NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；PIGP(SEQ.ID.NO.20)及其混合物。
24.权利要求23的肽的功能性类似物。
25.权利要求23的肽的模拟类似物。
26.一种具有选自下列通式的肽：
(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；
-其中P1和P2选自脯氨酸和羟脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n独立地选择；
-其中X选自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-异亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；以及
-其中Z选自异亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-羟脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸。
27.权利要求26的肽，其中所述肽刺激骨细胞、骨细胞前体和与其共有谱系的细胞的活性。
28.权利要求26的肽，其中所述肽刺激软骨细胞、软骨细胞前体和与其共有谱系的细胞的活性。
29.权利要求26的肽，其中所述肽刺激骨，软骨和相连结缔组织的发育，维持和修复。
30.权利要求26-29的肽，其中所述肽在体外，离体和/或体内刺激反应。
31.权利要求30的肽，其中所述肽长度为至少3个氨基酸。
32.权利要求30的肽，其中所述肽长度为至少4个氨基酸。
33.权利要求30的肽，其中所述肽进一步包括一个或多个接头基。
34.权利要求33的肽，其中所述接头基选自碳二亚胺，醛，马来酰亚胺，巯基，氨基，羧基，羟基和NHS酯，修饰的半胱氨酸，磷酸化的氨基酸，氨基酸，二醋酸，磺酰氯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，环氧树脂，双膦酸酯，焦磷酸酯，磷酸酯，二硫化物，苯基叠氮化物，烷基卤以及酰肼酰基氯。
35.权利要求26的肽，其中所述肽提供以嵌合肽。
36.权利要求35的肽，其中所述嵌合肽包括选自下列蛋白的钙结合序列：骨调素，牙基质磷蛋白，卵黄高磷蛋白，phosphohoryn，β-酪蛋白，stratherin，基质gla蛋白，核黄素结合蛋白以及αS1酪蛋白。
37.权利要求36的肽，其中所述结合序列选自S*S*，S*S*GS*EE，S*S*S*EE，S*S*S*S*S*S*，DS*S*DS*S*，S*LS*S*S*S*，DS*S*EE，DS*S*ES*，S*MS*S*S*EE和S*IS*S*S*EE及其组合。
38.权利要求30的肽，其中所述刺激的评价是分析一种或多种选自下列的标准：骨矿物质密度，骨矿物质含量，碱性磷酸酶活性，成骨细胞的增殖，骨结形成，骨结矿化，软骨细胞增殖，胞内钙通道分析，胶原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。
39.权利要求26的肽，其中所述肽选自NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)。
40.权利要求39的肽，其中所述肽具有序列NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)。
41.权利要求39的肽，其中所述肽具有序列PGPIG(SEQ ID.NO.7)。
42.权利要求39的肽，其中所述肽具有序列GPIG(SEQ.ID.NO.11)。
43.权利要求39的肽，其中所述肽具有序列PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)。
44.权利要求30的肽的功能性类似物。
45.权利要求30的肽的模拟类似物。
46.一种用于刺激骨、软骨和相关结缔组织的发育、维持和修复的组合物，所述组合物包括具有选自下列通式的肽：
(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；
-其中P1和P2选自脯氨酸和羟脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n独立地选择；
-其中X选自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-异亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；
-其中Z选自异亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-羟脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸；以及
可药用载体。
47.权利要求46的组合物，其中所述组合物进一步包括选自下列的因子：磷酸钙，硫酸钙，碳酸钙，血纤蛋白，透明质酸，蛋白聚糖，降血钙素，雌激素，雌二醇，前列腺素A1，双膦酸，伊普黄酮，氟化钠，维生素K，骨形态发生蛋白，成纤维细胞生长因子，血小板衍生的生长因子，转化生长因子，胰岛素样生长因子1和2，内皮素，甲状旁腺激素，表皮生长因子，白介素抑制因子，成骨素及其混合物。
48.权利要求45或46的肽，其中所述肽选自NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；PIGP(SEQ.ID.NO.20)及其混合物。
49.权利要求48的组合物，其中所述组合物可局部和/或全身性施用。
50.权利要求49的组合物，其中全身性施用选自静脉内，肌内，腹膜内注射，口服，肠内，肠胃外，鼻内，肺部，局部或经皮施用及其组合。
51.权利要求49的组合物，其中局部施用通过注射或采用移植物提供。
52.权利要求51的组合物，其中所述组合物提供以包衣，填料或散布在所述移植物的基质内。
53.权利要求52的组合物，其中所述组合物与颗粒或粉末状生物材料化合物一起提供。
54.权利要求48，52或53的组合物，其中所述组合物与生物相容的和/或生物可降解的聚合物一起提供。
55.一种在哺乳动物中刺激骨、软骨和相连结缔组织发育、维持和修复的方法，所述方法包括施用有效量的肽，所述肽含有选自“PG”、“GP”、“PI”和“IG”的氨基酸基元并最多具有所述氨基酸基元上游和/或下游的10个氨基酸，其中基元中的“P”表示脯氨酸或羟脯氨酸。
56.权利要求55的肽，其中所述肽长度为至少3个氨基酸。
57.权利要求56的肽，其中所述肽长度为至少4个氨基酸。
58.权利要求55，56或57的方法，其中所述肽由选自下列的通式代表：
(I)X-(P1)mGly(P2)n，(II)(P1)mGly(P2)n-Z，和(III)X-(P1)mGly(P2)n-Z；
-其中P1和P2选自脯氨酸和羟脯氨酸，m＝0或1，n＝0或1，其中m和n独立地选择；
-其中X选自亮氨酸、甘氨酸-亮氨酸、脯氨酸-异亮氨酸、甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸；
-其中Z选自异亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-羟脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸、异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸和精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸。
59.权利要求58的方法，其中所述肽选自：NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；PIGP(SEQ.ID.NO.20)及其混合物。
60.一种在哺乳动物中刺激骨发育的方法，所述方法包括施用有效量的一种或多种选自下列的肽：SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.15和SEQ.ID.NO.18及其功能性类似物和模拟类似物。
61.一种在哺乳动物中刺激软骨发育的方法，所述方法包括施用有效量的一种或多种选自下列的肽：SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.7，SEQ.ID.NO.8，SEQ.ID.NO.9，SEQ.ID.NO.10，SEQ.ID.NO.11及其功能性类似物和模拟类似物。
62.一种刺激骨和/或软骨形成和相连结缔组织的肽的筛选方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将能够接受骨和/或软骨形成的第一生物样品与测试肽接触；
(b)单独将能够接受骨和/或软骨形成的第二生物样品与生物有效量的选自下列的肽接触从而提供对照：NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID，NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；
(c)评价由步骤(a)和步骤(b)产生的骨和/或软骨形成的水平；以及
(d)比较步骤(c)中评价的骨和/或软骨形成的水平，由此能够刺激骨和/或软骨形成的肽由其改变骨和/或软骨形成的水平的能力与步骤(b)的对照比较后所鉴定。
63.一种刺激骨和/或软骨形成和相连结缔组织的调节剂的筛选方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将能够接受骨和/或软骨形成的第一生物样品与测试化合物和生物有效量的选自下列的肽接触：NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；
(b)单独将第二生物样品与生物有效量的选自下列的肽接触从而提供对照：NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；
(c)评价由步骤(a)和步骤(b)产生的骨和/或软骨形成的水平；以及
(d)比较步骤(c)中评价的骨和/或软骨形成的水平，由此骨和/或软骨形成和相连结缔组织的调节剂由其改变骨和/或软骨形成的水平的能力与步骤(b)的对照比较后所鉴定。
64.权利要求62或63的方法，其中步骤(c)的评价是分析一种或多种选自下列的标准：骨矿物质密度，骨矿物质含量，碱性磷酸酶活性，成骨细胞的增殖，骨结形成，骨结矿化，软骨细胞增殖，胞内钙通道分析，胶原蛋白分析，以及蛋白聚糖分析。
65.一种刺激骨、软骨和相连结缔组织的发育、维持和修复的肽的鉴定方法，所述方法包括：
-确定所述肽是否与一种或多种选自下列的肽具有可比较的活性：NGLPGPIGP*(SEQ.ID.NO.1)；NGLPGPIG(SEQ.ID.NO.2)；NGLP*GPIG(SEQ.ID.NO.3)；NGLP*GPIGP*(SEQ.ID.NO.4)；NGLPGP(SEQ.ID.NO.5)；LPGP(SEQ.ID.NO.6)；PGPIG(SEQ.ID.NO.7)；NGLPGPIGP(SEQ.ID.NO.8)；PGPIGP(SEQ.ID.NO.9)；PGPIGPPGPR(SEQ.ID.NO.10)；GPIG(SEQ.ID.NO.11)；PGPIGPPGPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.12)；GPRGRTGDA(SEQ.ID.NO.13)；PGPIGPP(SEQ.ID.NO.14)；PGPIGP*(SEQ.ID.NO.15)；PGPI(SEQ.ID.NO.16)；GLPGPIG(SEQ.ID.NO.17)；GPIGP*(SEQ.ID.NO.18)；GPIGP(SEQ.ID.NO.19)；和PIGP(SEQ.ID.NO.20)；
其中所述活性的评价是分析一种或多种选自下列的标准：骨矿物质密度，骨矿物质含量，碱性磷酸酶活性，成骨细胞增殖，骨结形成，骨结矿物化，软骨细胞增殖，胶原蛋白分析和蛋白聚糖分析。
66.一种肽，其包含一个或多个“GP”和/或“PG”基元，并且包含多达共计约20个氨基酸，其中基元中的“P”为脯氨酸或羟脯氨酸，以及所述肽诱导骨和软骨细胞的活性，以致骨和软骨组织得以发育，维持和/或修复。
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