WO2014092150A1 - 筋芽細胞分化促進剤 - Google Patents

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聖子 小泉
富人 杉原
井上　直樹
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新田ゼラチン株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a myoblast differentiation promoter containing a peptide molecule or the like.
  • Patent Document 1 describes that dipeptides such as Hyp-Gly have an osteoclast differentiation inhibitory action, an alkaline phosphatase inhibitory action, and the like.
  • Non-Patent Document 2 describes that peptides such as Hyp-Gly-Pro have an antioxidant action.
  • Patent Document 2 a peptide having up to 10 amino acids in the upstream region and / or the downstream region such as Pro-Gly and Hyp-Gly has an action of stimulating the growth, maintenance and repair of bone and the like.
  • Patent Document 3 describes that prickly pear, soybean peptide, C12 peptide and the like have a myoblast activation action.
  • Non-Patent Document 3 describes the rate of change in muscle weight when an American football player ingests an equal mixture of collagen peptide and whey protein for 3 months under exercise combined use. Ingestion of this equimolar mixture increases muscle weight (Fig. 2), but body weight also increases (Fig. 1), and when converted to the ratio of muscle weight per body weight, it decreases from the start. is doing. In contrast, in the present invention, as described in Test Example 2 described later, the muscle weight ratio per body weight is greatly increased.
  • the present inventors have found that peptide molecules such as Ala-Hyp-Gly, Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp, Glu-Hyp, Gly-Pro-Hyp, Pro-Ala, Hyp-Gly and Pro. It was found that -Hyp has an excellent myoblast differentiation promoting action, and the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • a peptide selected from the group consisting of Ala-Hyp-Gly, Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp, Glu-Hyp, Gly-Pro-Hyp, Pro-Ala, Hyp-Gly and Pro-Hyp A myoblast differentiation promoter containing a pharmaceutically acceptable salt.
  • the preparation is a preparation for oral administration, an injection for direct administration to muscle, a transdermal agent, a suppository, a nasal drop or an inhalant Or a myoblast differentiation promoter.
  • a peptide selected from the group consisting of Ala-Hyp-Gly, Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp, Glu-Hyp, Gly-Pro-Hyp, Pro-Ala, Hyp-Gly and Pro-Hyp A food or drink or feed containing a pharmaceutically acceptable salt.
  • Peptides used in the present invention are Ala-Hyp-Gly, Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp, Glu-Hyp, Gly-Pro-Hyp, Pro-Ala, Hyp-Gly and Pro-Hyp.
  • the peptide can be a pharmaceutically acceptable salt.
  • Preferred peptides include Hyp-Gly and Pro-Hyp.
  • the “pharmaceutically acceptable salt” include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, and phosphate, and organic acid salts such as methanesulfonate, benzenesulfonate, succinate, and oxalate.
  • Inorganic base salts such as sodium salt, potassium salt and calcium salt, and organic base salts such as triethylammonium salt.
  • This peptide can be synthesized by, for example, “solid phase synthesis method” and “liquid phase synthesis method” (for example, JP-A No. 2003-183298).
  • solid phase synthesis method methods of the Fmoc method and the Boc method are further known, and this peptide may be synthesized by any method.
  • An example of the solid phase synthesis method will be specifically described below.
  • a polystyrene polymer gel bead having a diameter of about 0.1 mm whose surface is modified with an amino group is used as a solid phase, and diisopropylcarbodiimide is used as a condensing agent.
  • the amino group of the C-terminal amino acid is protected with an Fmoc group or a Boc group to form a peptide bond with the amino group of the polystyrene polymer gel.
  • the solid phase is thoroughly washed with a solvent, and the remaining reagent and amino acid are washed and removed, and then the amino group protecting group of the amino acid bonded to the solid phase is removed.
  • a peptide is synthesized on a solid phase by sequentially repeating the same reaction using an amino acid with an amino group protected.
  • the peptide can be separated from the solid phase and the peptide can be synthesized.
  • This peptide can also be produced by hydrolyzing gelatin with a combination of two or more of endo-type protease and exo-type protease.
  • the hydrolyzed peptide mixture itself or a partially purified mixture thereof can also be used as a myoblast differentiation promoter.
  • Examples of chemical modification of the amino group of the N-terminal amino acid include polypeptidylation, succinylation, maleylation, acetylation, deamination, benzoylation, alkylsulfonylation, allylsulfonylation, dinitrophenylation, trinitrophenylation, Examples thereof include carbamylation, phenylcarbamylation, and thiolation.
  • Examples of the chemical modification of the carboxyl group of the C-terminal amino acid include esterification and amidation.
  • the present peptide is cationized, it can be subjected to ethylenediamine formation, spermination or the like.
  • Myoblast differentiation promoting agent The peptide and the like have a myoblast differentiation promoting action as described in the following test examples. Therefore, this peptide etc. can be used for the treatment or prevention of various diseases which require muscle strengthening.
  • the myoblast differentiation promoter of the present invention is, for example, treatment of locomotive syndrome, treatment of sarcopenia, improvement of training effect of athletes, students, etc., enhancement of physical strength of elderly and long-term hospitalized patients, improvement of meat quality of livestock, etc. Can be used.
  • the myoblast differentiation promoter of the present invention can be administered orally or parenterally in various forms of pharmaceutical preparations.
  • the form includes, for example, tablets, granules, capsules, powders, liquids, suspension preparations, emulsion preparations, etc.
  • the myoblast differentiation promoter of the present invention may contain other active ingredients and ingredients for preparations as appropriate as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • active ingredients include muscle enhancing agents such as male hormones, and muscle enhancing supplements such as amino acid mixtures.
  • muscle enhancing agents such as male hormones
  • muscle enhancing supplements such as amino acid mixtures.
  • the blending amount of other active ingredients can be appropriately changed according to each action.
  • the food and drink or the feed peptide is a peptide derived from gelatin, it is extremely safe even if it is taken or applied on a daily basis. Then, it is useful also as food-drinks or feed containing this peptide etc. which utilized the effect of the outstanding myoblast differentiation promotion effect
  • the present invention can be used to increase the physical strength of elderly people and long-term hospitalized patients, to increase the effect of training of athletes and students, and to improve the quality of livestock.
  • the peptide or the like in the food or drink or feed of the present invention can be used by changing the content as appropriate according to the effect to be used.
  • Examples 1 to 22 and Comparative Examples 1 to 4 The peptides of Examples 1 to 8 and Comparative Example 1 below were synthesized using the peptide solid phase synthesis method described above. Using these peptides, equimolar ratio mixtures of the following two peptides of Examples 9 to 21 were prepared, and equimolar ratio mixtures of the following two amino acids of Comparative Examples 2 and 3 were prepared. In addition, commercially available collagen peptides of Example 22 and Comparative Example 4 below were used.
  • Example 1 Ala-Hyp-Gly (AOG) (Example 2) Hyp-Gly-Pro (OGP) (Example 3) Leu-Hyp (LO) (Example 4) Glu-Hyp (EO)
  • Example 5 Gly-Pro-Hyp (GPO)
  • Example 6 Pro-Ala (PA) (Example 7) Hyp-Gly (OG) (Example 8) Pro-Hyp (PO)
  • Example 9 Mixture of OG and PO (OG + PO) (Example 10) Mixture of OG and AOG (OG + AOG) (Example 11) Mixture of OG and OGP (OG + OGP) (Example 12) Mixture of OG and LO (OG + LO) (Example 13) Mixture of OG and EO (OG + EO) (Example 14) Mixture of OG and GPO (OG + GPO) (Example 15) Mixture of OG and PA (OG + PA) (Example 16) Mixture of PA and AOG (PA + AOG) (Example 17: Mixture of PA and OGP (PA + OGP) Example 18: Mixture of PA and LO (PA + LO) Example 19: Mixture of PA and EO (PA + EO) (Example 20) Mixture of PA and GPO (PA + GPO) (Example 22) Collagen peptide "Type-M (manufact
  • Test example 1 Myoblast differentiation promotion test in myoblast culture
  • Mouse-derived C2C12 myoblasts were cultured in D-MEM medium containing 10% FBS, 100 units / ml penicillin G sodium, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 1.0 g / l NaHCO 3.
  • D-MEM medium (10% FBS, + P / S)
  • the culture was performed in an incubator at 95% air, 5% CO 2 and 37 ° C.
  • D-MEM medium containing 2% horse serum (HS), 100 units / ml penicillin G sodium, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 1.0 g / l NaHCO 3 with 90% confluent C2C12 myoblasts
  • the medium was changed to medium (2% HS + P / S), and thereafter, D-MEM medium (2% HS + P / S) was changed every two days to differentiate into myotube cells.
  • Examples 1-21 and Comparative Examples 1-3 were added to the medium at every final medium exchange at a final concentration of 100 ⁇ M, and the cells were kept exposed for 8 days.
  • the Western blotting method was performed according to the following procedure.
  • the cells used for protein measurement were washed twice with PBS at the time of recovery, peeled off with a cell scraper, transferred to a tube, centrifuged at 4 ° C., 250 ⁇ g for 3 minutes, and then PBS was completely removed, and a buffer ( 20 mM HEPES-NaOH (pH 7.5), 0.5% NP-40, 1 mM EDTA, 100 ⁇ M AEBSF, 1 ⁇ g / ml aprotinin, 10 ⁇ g / ml leupeptin, 1 mM DTT, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM sodium fluoride, 10 ⁇ M molybdenum
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ l of anthracic acid, 10 mM sodium pyrophosphate), and pulverized 3 times for 5 seconds for each sample using an ultrasonic disperser while cooling with ice, and then the amount of protein was quant
  • Protein quantification was performed using bovine serum albumin as a standard protein according to the method of Bradford. After SDS-PAGE finished, equilibrated with methanol transfer buffer (48 mM Tris, 39 mM glycine) to PVDF membrane was carried out prewetting infiltrated and using blotting apparatus, 1 hour electro at 1.5mA per membrane 1 cm 2 A transfer was performed. After the transfer, the PVDF membrane was blocked with PBS (-) containing 6% skim milk for 1 hour. The primary antibody was diluted as follows, and the antigen-antibody reaction was performed overnight at 4 ° C.
  • Peroxidase-conjugated secondary antibodies for each primary antibody were mouse anti-myosin heavy chain monoclonal antibody (MF20) culture supernatant 1/2000, mouse anti-tropomyosin monoclonal antibody (CH1) culture supernatant 1/2000, rabbit anti-GAPDH polyclonal antibody 1 / 3000, peroxidase-conjugated anti-mouse IgG 1/5000, peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG 1/2000 at a ratio of 6% skim milk diluted with PBS (-), reacted for 30 minutes, PBS (-) for 10 minutes, 3 times Washed.
  • MF20 mouse anti-myosin heavy chain monoclonal antibody
  • CH1 mouse anti-tropomyosin monoclonal antibody
  • rabbit anti-GAPDH polyclonal antibody 1 / 3000 rabbit anti-GAPDH polyclonal antibody 1 / 3000
  • tropomyosin and myosin heavy chain are used as differentiation markers for myoblasts. From the above test results, it was confirmed that each of the peptides of Examples 1 to 8 produced more myoblast differentiation markers, tropomyosin and myosin heavy chain, than the control. Therefore, it is understood that these peptides have a myoblast differentiation promoting action. Synergistic for two peptide mixtures selected from Ala-Hyp-Gly, Hyp-Gly-Pro, Leu-Hyp, Glu-Hyp, Gly-Pro-Hyp, Pro-Ala, Hyp-Gly and Pro-Hyp It was shown to have an effect of promoting myoblast differentiation.
  • Test example 2 Clinical test A clinical test was conducted using Example 22 and Comparative Example 4 as collagen peptides.
  • the subjects were 34 healthy women who were not athletes and were 24 to 61 years old. They were randomly assigned to the collagen peptide intake group of Example 22 (17 persons) and the collagen peptide intake group of Comparative Example 4 (17 persons), and a double-blind test was conducted. 5 g of each collagen peptide was ingested continuously for 10 weeks per day.
  • the evaluation method was as follows. Muscle weight (kg: water content included) in each subject was measured using a TANITA body composition meter inner scan 50V BC-622-BK according to left and right parts.

Abstract

　Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐからなる群から選択されるペプチドまたはその薬学上許容される塩は、従来技術よりも優れた筋芽細胞分化促進作用を有する。

Description

筋芽細胞分化促進剤
　本発明は、ペプチド分子等を含有する筋芽細胞分化促進剤に関する。
　近年、ロコモティブシンドローム（運動器症候群）、サルコペニア（筋肉量・筋力の低下と身体機能低下）の予防等が注目されており、筋肉量および筋力を向上させ、かかる症状を改善することが必要とされている。また、健常人においても筋肉疲労の予防および筋肉の増強が要望されている。
　筋肉細胞分化の初期過程で、未分化な細胞が筋線維由来の細胞である筋芽細胞に分化する。筋芽細胞はさらに分化をして筋肉細胞特異的なタンパク質が発現される。筋肉細胞の分化で特徴的な現象は細胞融合であり、単核細胞の筋芽細胞が融合して、多核細胞である筋管細胞に分化する。さらに成熟した筋管細胞から、収縮能を持つ筋線維を形成する段階を経て、筋肉が完成する。上記の筋芽細胞の分化の際に、トロポミオシン、ミオシン重鎖等の特徴的なタンパク質が生成され、これらは分化マーカーとして用いられる（非特許文献１）。
　ペプチド分子に関しては、様々な薬理作用を有することが知られている。例えば、特許文献１には、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ等のジペプチドが破骨細胞分化抑制作用、アルカリフォスファターゼ抑制作用等を有することが記載されている。また、非特許文献２には、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ等のペプチドが抗酸化作用を有することが記載されている。また、特許文献２には、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ等の上流域および／または下流域に１０個までのアミノ酸を有するペプチドが骨等の成長、維持および修復を刺激する作用を有することが記載されている。
　特許文献３には、刺梨、大豆ペプチド、Ｃ１２ペプチド等が筋芽細胞活性化作用を有することが記載されている。しかし、これらペプチド分子に筋芽細胞の分化促進作用があることは知られていない。
　非特許文献３には、アメリカンフットボール選手がコラーゲンペプチドとホエイプロテインの等量混合物を３ヶ月間、運動併用下で摂取した場合の筋肉重量の変化率が記載されている。この等量混合物の摂取によって筋肉重量が増加（図２）しているが、体重もまた同様に増加（図１）しており、体重当たりの筋肉重量比率に換算すれば開始時よりも却って減少している。これに対して、本願発明では、後述の試験例２に記載の通り、体重当たりの筋肉重量比率が大きく増加している。
ＷＯ２０１０／０３８３２３ 特表２００６－５０２９７１ 特開２００８－１５６２９４
J. Biol. Chem., Vol.286, No.4, 41455 (2011) 日本アミノ酸学会第５回学術大会（JSAAS2011）要旨集，p.74 Food Style 21, Vol.14, No.7, 62-65 (2010)
　本発明が解決しようとする課題は、ペプチド分子を含有する、従来技術よりも優れた筋芽細胞分化促進剤を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、ペプチド分子であるＡｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐに優れた筋芽細胞の分化促進作用があることを見出して、本発明を完成させるに至った。即ち本発明は、以下の通りである。
　［１］　Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐからなる群から選択されるペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、筋芽細胞分化促進剤。
　［２］　Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐからなる群から選択されるペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、［１］記載の筋芽細胞分化促進剤。
　［３］　Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐからなる群から選択される２以上のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、［１］記載の筋芽細胞分化促進剤。
　［４］　製剤が、経口的に投与するための製剤、筋肉に直接投与するための注射剤、経皮剤、坐剤、点鼻剤または吸入剤である、［１］～［３］のいずれか記載の筋芽細胞分化促進剤。
　［５］　Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐからなる群から選択されるペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、飲食品または飼料。
　本発明によって、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐのペプチド分子を含有する、従来技術よりも優れた筋芽細胞分化促進剤を提供することができる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．ペプチド
　本発明に用いられるペプチドは、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐであり、本ペプチドは薬学上許容される塩とすることができる。好ましいペプチドとして、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐが挙げられる。
　「薬学上許容される塩」としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられる。
　本ペプチドは、例えば「固相合成法」および「液相合成法」（例えば、特開２００３－１８３２９８）等で合成することができる。なお、固相合成法の場合はさらにＦｍｏｃ法とＢｏｃ法の方法が知られており、本ペプチドはいずれの方法で合成してもよい。固相合成法の例を、以下に具体的に説明する。表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミドを用いる。まず、Ｃ末のアミノ酸のアミノ基をＦｍｏｃ基またはＢｏｃ基で保護して、上記ポリスチレン高分子ゲルのアミノ基とペプチド結合を形成させる。固相を溶媒でよく洗い、残存する試薬、アミノ酸を洗浄・除去し、その後、固相に結合しているアミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。続いて、アミノ基を保護したアミノ酸を用いて、順次、同様の反応を繰り返すことで、固相上でペプチドを合成する。最後に、固相をトリフルオロ酢酸で温浸させることで、ペプチドを固相から切り離し、ペプチドを合成することができる。
　本ペプチドは、ゼラチンにエンド型プロテアーゼおよびエキソ型プロテアーゼの２種以上を組み合わせて加水分解することによっても製造することができる。また、上記加水分解をしたペプチド混合物自体またはこれを部分精製した混合物を筋芽細胞分化促進剤として用いることもできる。
　本発明において、本ペプチドは化学修飾されていても良い。化学修飾はアミノ酸単位で行われうるが、例えば、ヒドロキシプロリンの水酸基、Ｎ末アミノ酸のアミノ基およびＣ末アミノ酸のカルボキシル基が挙げられる。このような化学修飾によって、弱酸性から中性で溶解可能にでき、後述する他の有効成分との相溶性向上なども可能となる。
　具体的には、ヒドロキシプロリンの水酸基の化学修飾としては、例えばＯ－アセチル化等が挙げられる。Ｎ末アミノ酸のアミノ基の化学修飾としては、例えばポリペプチジル化、スクシニル化、マレイル化、アセチル化、脱アミノ化、ベンゾイル化、アルキルスルホニル化、アリルスルホニル化、ジニトロフェニル化、トリニトロフェニル化、カルバミル化、フェニルカルバミル化、チオール化等が挙げられる。Ｃ末アミノ酸のカルボキシル基の化学修飾としては、例えばエステル化、アミド化等が挙げられる。さらに、本ペプチドをカチオン化する場合は、エチレンジアミン化、スペルミン化などを行うことができる。
　化学修飾の具体的手段や処理条件は、通常のペプチドの化学修飾技術が適用される。例えば、ヒドロキシプロリンの水酸基のＯ－アセチル化は水溶媒中または非水溶媒中で無水酢酸を作用させることなどによって行うことができる。例えば、Ｃ末アミノ酸のカルボキシル基のエステル化はメタノールへの懸濁後に乾燥塩化水素ガスを通気することなどによって行うことができ、そのアミド化はカルボジイミドなどを作用させることによって行うことができる。さらに、化学修飾のその他の具体例として、特公昭６２－４４５２２号公報や特公平５－７９０４６号公報等に記載の化学修飾技術が適用できる。
２．筋芽細胞分化促進剤
　本ペプチド等は、後述の試験例に記載の通り、筋芽細胞の分化促進作用を有する。従って、本ペプチド等は、筋肉増強が必要な各種疾患の治療または予防に用いることができる。本発明の筋芽細胞分化促進剤は、例えば、ロコモティブシンドロームの治療、サルコペニアの治療、運動選手、学生等のトレーニングの効果の向上、老人および長期入院患者等の体力増強、家畜の肉質の向上等に用いることができる。
　本発明の筋芽細胞分化促進剤は、経口的にまたは非経口的に種々の形態の医薬製剤で投与することができる。その形態としては、経口的に投与する場合は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁製剤、乳化製剤等が挙げられ、非経口的に投与する場合は、例えば、注射剤、経皮剤、坐剤、点鼻剤および吸入剤等が挙げられる。好ましくは、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、筋肉等の患部に直接投与する液剤等が挙げられる。なお、本ペプチドは、消化管でアミノ酸への分解もほとんど起こらず、腸管で迅速に吸収されるため、経口投与による摂取が好適である。また、本ペプチドは食事または飲料に混ぜて摂取させても良い。
　本ペプチドの投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なるが、成人１日当たり、経口投与の場合は、例えば、約０．１～１０００ｍｇ、好ましくは約１～５００ｍｇ、より好ましくは約３０～２００ｍｇが挙げられ、筋肉等の患部に直接投与する場合は、例えば、約０．０１～２００ｍｇ、好ましくは約０．１～１００ｍｇ、より好ましくは約１～５０ｍｇが挙げられる。その他の形態の製剤は、これらの投与量を参考にして適宜決めることができる。これら製剤は、１日１～数回に分けて投与するか、または１～数日に１回投与することができる。
　本発明の筋芽細胞分化促進剤は、本発明の効果を害しない範囲で、適宜他の有効成分や製剤用の成分を含有させても良い。他の有効成分として、例えば男性ホルモン等の筋肉増強剤、アミノ酸混合物等の筋肉増強サプリメント等が挙げられる。他の有効成分の配合量としては、各々の作用に応じて適宜、変更することができる。
　医薬製剤に製剤化する際に用いる薬学上許容される担体としては、希釈剤、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン）、賦形剤（乳糖、ショ糖、コーンスターチ、リン酸カリウム、ソルビット、グリシン）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ）、崩壊剤（バレイショデンプン）および湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。本医薬製剤は、従来公知の方法に従って、本ペプチド、他の有効成分、薬学上許容される担体等を混合して製造することができる。
３．飲食品または飼料
　本ペプチド等は、ゼラチンに由来するペプチドであるため、日常的に摂取または塗布しても極めて安全である。そこで、本ペプチド等の優れた筋芽細胞分化促進作用の効果を利用した、本ペプチド等を含有する飲食品または飼料としても有用である。例えば、老人および長期入院患者等の体力増強のために、運動選手、学生等のトレーニングの効果を高めるために、また家畜の肉質の向上のためなどに、本発明を用いることができる。本発明の飲食品または飼料における本ペプチド等は、利用する効果に応じて適宜、含有量を変更して用いることができる。
　以下、本発明を実施例、比較例および試験例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
　実施例１～２２および比較例１～４
　前記のペプチド固相合成法を用いて、以下の実施例１～８および比較例１のペプチドを合成した。これらペプチドを用いて、以下の実施例９～２１の２種のペプチドの等モル比混合物を調製し、また以下の比較例２および３の２種のアミノ酸の等モル比混合物を調製した。また、以下の実施例２２および比較例４の市販のコラーゲンペプチドを用いた。
（実施例１）Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＡＯＧ）
（実施例２）Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＯＧＰ）
（実施例３）Ｌｅｕ－Ｈｙｐ（ＬＯ）
（実施例４）Ｇｌｕ－Ｈｙｐ（ＥＯ）
（実施例５）Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ（ＧＰＯ）
（実施例６）Ｐｒｏ－Ａｌａ（ＰＡ）
（実施例７）Ｈｙｐ－Ｇｌｙ（ＯＧ）
（実施例８）Ｐｒｏ－Ｈｙｐ（ＰＯ）
（実施例９）ＯＧとＰＯの混合物（ＯＧ＋ＰＯ）
（実施例１０）ＯＧとＡＯＧの混合物（ＯＧ＋ＡＯＧ）
（実施例１１）ＯＧとＯＧＰの混合物（ＯＧ＋ＯＧＰ）
（実施例１２）ＯＧとＬＯの混合物（ＯＧ＋ＬＯ）
（実施例１３）ＯＧとＥＯの混合物（ＯＧ＋ＥＯ）
（実施例１４）ＯＧとＧＰＯの混合物（ＯＧ＋ＧＰＯ）
（実施例１５）ＯＧとＰＡの混合物（ＯＧ＋ＰＡ）
（実施例１６）ＰＡとＡＯＧの混合物（ＰＡ＋ＡＯＧ）
（実施例１７）ＰＡとＯＧＰの混合物（ＰＡ＋ＯＧＰ）
（実施例１８）ＰＡとＬＯの混合物（ＰＡ＋ＬＯ）
（実施例１９）ＰＡとＥＯの混合物（ＰＡ＋ＥＯ）
（実施例２０）ＰＡとＧＰＯの混合物（ＰＡ＋ＧＰＯ）
（実施例２１）ＰＡとＰＯの混合物（ＰＡ＋ＰＯ）
（実施例２２）コラーゲンペプチド「Ｔｙｐｅ－Ｍ（新田ゼラチン製）」
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析したところ、本コラーゲンペプチドには以下のペプチドがそれぞれ含まれていた。
Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：７５７３ｐｐｍ，Ｐｒｏ－Ａｌａ：２５４１ｐｐｍ，Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：３３１ｐｐｍ，Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：１８４ｐｐｍ，Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：８５ｐｐｍ，Ｇｌｕ－Ｈｙｐ：７２ｐｐｍ，Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ：７ｐｐｍ
（比較例１）Ａｌａ－Ｈｙｐ（ＡＯ）
（比較例２）ＨｙｐとＧｌｙの混合物（Ｏ＋Ｇ）
（比較例３）ＰｒｏとＨｙｐの混合物（Ｐ＋Ｏ）
（比較例４）コラーゲンペプチド「ＨＤＬ－５０ＳＰ（新田ゼラチン製）」
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析したところ、本コラーゲンペプチドには以下のペプチドがそれぞれ含まれていた。
Ｈｙｐ－Ｇｌｙ：１１ｐｐｍ，Ｐｒｏ－Ｈｙｐ：８ｐｐｍ
　試験例１
筋芽細胞培養における筋芽細胞分化促進試験
　マウス由来Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の培養は、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１．０ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３を含むＤ－ＭＥＭ培地（Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，＋Ｐ／Ｓ））を用いた。培養は９５％空気、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター内で行った。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞が９０％コンフルエントになった状態で２％ウマ血清（ＨＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１．０ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３を含むＤ－ＭＥＭ培地（Ｄ－ＭＥＭ培地（２％ＨＳ＋Ｐ／Ｓ））に交換し、以降２日ごとにＤ－ＭＥＭ培地（２％ＨＳ＋Ｐ／Ｓ）交換をつづけ、筋管細胞へ分化させた。実施例１～２１および比較例１～３を終濃度１００μＭで培地交換毎に培地に添加し、細胞に８日間暴露し続けた。
　ウェスタンブロッティング法に関しては、次の手順で行った。タンパク測定に用いた細胞は回収時にＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレーパーで細胞をはがしチューブに移した後、４℃、２５０×ｇ、３分間遠心後ＰＢＳを完全に取り除いて各チューブにつきバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、０．５％ＮＰ－４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μＭ ＡＥＢＳＦ、１μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭ フッ化ナトリウム、１０μＭ モリブデン酸アントリウム、１０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム）を１００μｌで懸濁後に氷冷しながら超音波分散機を用いて各サンプルにつき５秒間の粉砕を３回行ったあと、タンパク量の定量を行った。タンパク質の定量は、Bradfordの方法に従い、牛血清アルブミンを標準タンパク質として行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ終了後、メタノールで平衡化し、トランスファーバッファー（４８ｍＭ Ｔｒｉｓ，３９ｍＭ グリシン）を浸潤してプレウェッティングを行ったＰＶＤＦメンブレンに、ブロッティング装置を用い、メンブレン１ｃｍ２あたり１．５ｍＡで１時間エレクトロトランスファーを行った。トランスファー終了後、ＰＶＤＦメンブレンを６％スキムミルクを含むＰＢＳ（-）で1時間ブロッキングを行った。一次抗体を次のように希釈し、抗原抗体反応を４℃で一晩行った。それぞれの一次抗体に対するペルオキシダーゼ結合二次抗体はマウス抗ミオシン重鎖モノクローナル抗体（ＭＦ２０）培養上清 1/2000、マウス抗トロポミオシンモノクローナル抗体（ＣＨ１）培養上清 1/2000、ウサギ抗ＧＡＰＤＨポリクローナル抗体 1/3000、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ 1/5000、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ 1/2000の割合で６％スキムミルクを含むＰＢＳ（－）で希釈し、３０分間反応させ、ＰＢＳ（－）で１０分間、３回洗浄した。その後、メンブレンをImmobilon TM Western Chemiluminescent HRP Substrateに３分間浸し、LAS-4000（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK）より検出を行った。バンドはimageJにて数値化し、コントロールを１００として数値を表わす。その筋芽細胞分化促進試験の結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　非特許文献１に記載の通り、トロポミオシンおよびミオシン重鎖は筋芽細胞の分化マーカーとして用いられている。上記の試験結果から、実施例１～８の各々のペプチドには、その筋芽細胞の分化マーカーであるトロポミオシンおよびミオシン重鎖がコントロールよりも多く生成していることが確認された。従って、これらペプチドには筋芽細胞分化促進作用があることが理解される。
　Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐから選択される２種のペプチド混合物には相乗的な筋芽細胞分化促進作用があることが示された。特に、実施例９のＨｙｐ－ＧｌｙとＰｒｏ－Ｈｙｐの混合物は筋芽細胞分化促進作用が顕著であった。比較例２および３のアミノ酸のみの混合物では同様の作用はなく、ペプチド分子としてのＰｒｏ－ＨｙｐとＨｙｐ－Ｇｌｙの混合物で初めて、筋芽細胞分化促進作用が生じることが示された。
試験例２
臨床試験
　試験コラーゲンペプチドとして実施例２２と比較例４を用いて、臨床試験を行った。被験者は、運動選手ではない健康な女性３４人であり、２４歳～６１歳であった。実施例２２のコラーゲンペプチド摂取群（１７人）と比較例４のコラーゲンペプチド摂取群（１７人）に無作為に割付し、二重盲検試験を行った。１日当たり５ｇの各コラーゲンペプチドを１０週間連続摂取した。評価方法は、TANITA体組成計左右部位別インナースキャン５０Ｖ　ＢＣ－６２２－ＢＫを用いて各被験者での筋肉重量(ｋｇ：水分量含有)を測定した。また同時に測定した水分量(ｋｇ)を差し引き、体重当たりの筋肉重量比率（％）を計算し、評価した。結果は平均値±標準偏差で表２に示す。表中の＊＊はTwo-way-ANOVAにおいて、比較例４に対してP<0.001で有意であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表２の通り、特殊な酵素で加水分解させたＨｙｐ-Ｇｌｙ、Ｐｒｏ-Ａｌａ、Ｐｒｏ-Ｈｙｐ等が多いペプチド混合物（実施例２２）は、従来から知られている通常の酵素で加水分解させたペプチド混合物（比較例４）と比べて、筋肉重量比率において、有意な有効性を示した。
　本発明によって、天然コラーゲン由来のペプチドを含有する、従来技術よりも優れた筋芽細胞分化促進剤を提供することができる。

Claims (5)

  1. 　Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐからなる群から選択されるペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、筋芽細胞分化促進剤。
  2. 　Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐからなる群から選択されるペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、請求項１記載の筋芽細胞分化促進剤。
  3. 　Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐからなる群から選択される２以上のペプチドまたはそれらの薬学上許容される塩を含有する、請求項１記載の筋芽細胞分化促進剤。
  4. 　製剤が、経口的に投与するための製剤、筋肉に直接投与するための注射剤、経皮剤、坐剤、点鼻剤または吸入剤である、請求項１～３のいずれか記載の筋芽細胞分化促進剤。
  5. 　Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｈｙｐ－ＧｌｙおよびＰｒｏ－Ｈｙｐからなる群から選択されるペプチドまたはその薬学上許容される塩を含有する、飲食品または飼料。
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