NO321466B1 - Fremgangsmate for immunologisk pavisning av antistoffer rettet mot vevstransglutaminase (tTG), oralt farmasoytisk middel inneholdende tTG, samt anvendelse av tTG-inneholdende forbindelser. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for immunologisk påvisning av antistoffer rettet mot vevstransglutaminase (tTG), oralt farmasøytisk middel innholdende tTG, samt anvendelse av tTG-inneholdende forbindelser.

Oppfinnelsen dreier seg om en fremgangsmåte for å påvise antistoff fra kroppsvæsker ved hjelp av en immunreaksjon med vevstransglutaminase (tTG), antigenstrukturene, immunreaktive sekvenser eller analoger av dette, og med tTG-inneholdende forbindelser, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av dette. Fremgangsmåten kan benyttes i diagnose og terapikontroll av sykdommer assosiert med en immunreaksjon mot tTG, tTG-inneholdende forbindelser, og antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av dette. Derfor beskrives også anvendelse av tTG og de ovenfor nevnte substanser i diagnose og terapikontroll, fortrinnsvis i diagnose og terapikontroll av kroniske betennelsessykdommer eller autoimmune sykdommer, og mer fordelaktig i diagnose og behandlingskontroll av sprue eller cøliaki. Oppfinnelsen er også rettet mot et oralt farmasøytisk middel som inkluderer tTG, tTG-inneholdende forbindelser, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av dette som aktive ingredienser og som kan benyttes i behandling av sykdommer som følges av en immunreaksjon mot disse substanser, siden oral tilførsel av de ovenfor nevnte forbindelser resulterer i immuntoleranse.

Den foreliggende oppfinnelse baseres på opptagelsen at vevstransglutaminase (tTG, EC 2.3.2.13) er autoantigene i sprue eller cøliaki.

På basis av den ovenfor nevnte oppdagelse har den immunologiske fremgangsmåte i oppfinnelsen for å påvise antistoff mot tTG og tTg-inneholdende forbindelser blir utviklet.

Cøliaki er en sykdom i tynntarmslimhinnen, der den første manifestasjon for

det meste forekommer i sen spebam- eller småbarnsalder. Dersom det tilsvarende kliniske bilde ikke oppstår før voksen alder blir sykdommen benevnt ikke-tropisk sprue. Således beskriver begge disse ord den samme sykdom. Sprue forekommer sammen med en betennelsesendring i slimhinnen og en generell malabsorpsjon som resultat av dette. I de fleste tilfeller er det morforlogisk og klinisk respons på behandling som består av en glutenfri diett.

Velkjente som patogene faktorer er gluten fra hvete, bygg, rug og delvis havre, mens glutentyper fra planter som har en lavere grad av fylogenetisk relasjon, slik som mais, ris og soya ikke er patogene. Blant de nevnte glutentyper er rollen som patogent middel tilskrevet de alkoholløselige prolaminer, spesielt a-gliadin.

På grunn av dette opptrer sprue fortrinnsvis i land der hvete brukes som en viktig matkilde (Europa, USA, Australia) og har en insidensratio på 0,14/1.000 pr nyfødte i Danmark, 0,7/1.000 i Spania, 1/1.000 i Italia, 0,45/1.000 i Tyskland og 2,42/1.000 i Sverige, som eksempel.

Imidlertid viser ferskere studier at et subklinisk mønster, dvs en morfologisk endring i slimhinnen uten massive symptomer er mer utbredt enn man tidligere har trodd. Sålédes viste en studie utført i Italia i 1994 en insidens på 3,28/1.000 blant skolebarn. Risiko for latent sprue i nære slektninger til spruepasienter går opp til 50%.

Den i hovedsak latente sprue blir ofte fulgt av et polymorft utslett, f.eks dermatitis herpetiformis, der karakteristiske subepidermale små blemmer med granulære utfall av IgA i spissene på de dermale papiller kan observeres. Biopsi fra tynntarmen viser en irregulær og i større eller mindre grad skadet slimhinne.

En annen vel etablert kopling kan observeres mellom sprue og insulinavhengig diabetes mellitus, skjoldbruskkjertelsykdommer, og en selektiv svikt i IgA.

I tillegg til en rekke ledsagende kliniske symptomer på sprue, slik som anemi som bl.a. har blitt begrunnet med en malabsorpsjon av vitamin Bi2, og en mangel på vitamin K som forårsaker en øket blødningstendens spiller den massivt økede risiko for ondartede tarmsvulster en spesiell rolle. Opp til 15% av spruepasientene, de fleste over 50 års alder, utvikler kreftsykdommer, hvorav ca 50% dreier seg om T-celle lymfomer i tarmen og ytterligere 25% dreier seg om spiserør, svelg og tynn-tarmsvulster.

Terapi av sprue omfatter nøye overholdelse av en glutenfri diett resten av livet, der ikke bare produkter som inneholder gluten og som er laget av hvete, men også de som er laget av rug, bygg og havre må bli fjernet. For pasientene representerer dette en alvorlig hindring både i deres spisevaner og i deres sosiale liv.

Dersom sprue blir diagnostisert og behandlet tidsnok er det god prognose. Imidlertid er komplikasjon når de først har opptrådt ofte ikke mulig å reversere totalt. På den annen side kan dersom sykdommen forblir ubehandlet og udiagnostisert alvorlige symptomer oppstås som forårsakes av malabsorpsjon. I sitt ytterste gir sykdommen en øket risiko for å utvikle tarmlymfomer og andre tarmtraktus kreftsykdommer.

For øyeblikket representerer biopsi av tynntarmen toppnivå standard i diagnostiseringen av sprue og oppfølgelsen med glutenfri diett, men ikke invaderende diagnostiske metoder basert på immunologiske markører blir også mer og mer viktige. Siden IgA og IgG klasse antistoff er tilstede i serum hos sprue-pasienter som på den ene side er rettet mot gliadin og på den andre side rettet mot et autoantigen i endomysiet, som er et spesielt bindevev som bl.a inneholder kollagenene I, III og V, elastiske fibre, ikke-kollagene proteiner slik som fibronektin og proteoglykaner, kan serum bli testet med henblikk på IgG og IgA antistoff rettet mot gliadin ved å bruke ELISA, og med henblikk på IgG og IgA antistoff rettet mot endomysiet ved å bruke indirekte immunfluorescens. Mens antistoff rettet mot gliadin ikke er tilstrekkelige spesifikke for å stille diagnosen sprue blir det rapportert høy sensitivitet og spesifisitet (97-100%) for IgA antistoffet mot endomysiet. Imidlertid er det behov for snitt fra spiserøret hos primater for påvisning med immunfluorescens. For øyeblikket gjøres det forsøk på å påvise endomysium antistoff på navlesnormaterialet i tillegg.

11984 beskrev Maury og Teppo (Lancet, 1984; 20.892-894) et 90 kDa mannoserikt glykoprotein (20% av sukkerinnhold) som en bestanddel av den normale hud og slimhinnen fra tynntarm. De kunne identifisere sirkulerende IgG immunkomplekser som kunne gjenkjenne dette nevnte protein, i 10 pasienter med cøliaki fra totalt 20 undersøkte, og i 7 tilfeller fra 12 pasienter som hadde herpes dermatitt (en sykdom som vurderes å være hudevidens for cøliaki). Det beskrevne glykoprotein på 90 kDa blirkarakterisert vedå ha 20% mannoseinnhold, mens flg synes å være ikke-glykosylert, til tross for nærvær av 6 glykosyleringsseter (Ichinose et al., J. Biol. Chem., 1990, 265:13411-13414).

11986 undersøkte Maury et al. (se Gut, 1986, 27:147-152) de nevnte antistoff ved hjelp av en ELISA-test med sera fra pasienter som hadde cøliaki og kontrollsera. Pasienter med cøliaki viste antistoffnivåer som var signifikant høyere (p < 0,001) enn de som man fant i kontrollsera. De nevnte nivåer falt til normale verdier etter en

behandling med glutenfri diett. Ingen korrelasjon kunne påvises med anti-retikulin antistoff.

Med en tidlig diagnose og en nøye oppfølging av en glutenfri diett kan sykdommen holdes i remisjon og risikoen for utvikling av ondartet tumorer kan således hos pasientene bli senket til en normal verdi. Det er derfor av stor interesse å utvikle et passende påvisnings-testsystem for sprue. Siden gruppen med individer som har laten sprue også hører til høyrisikogruppen bør alle de affiserte individer (spesielt den nærmeste familie), og eventuelt til slutt alle skolebarn, som det nå vurderes i Italia, bli undersøkt ved hjelp av et sensitivt, spesifikt, lett gjennomførbart og lavkost analysesystem.

Pr i dag har imidlertid screeningprogrammer i stor målestokk sviktet pga de følgende problemer: Invasiv tolvfingertarmsbiopsier hos symptomfrie personer kan ikke forsvares

og er prohibitivt dyrt.

Påvisning ved hjelp av ELISA basert på antistoff mot gliadin er ikke hensikts-messig pga antistoffenes svake spesifisitet.

Immunfluorescens deteksjon av IgA klasse antistoff mot endomysium, som baseres på primat spiserør, er for dyrt som en generell screeningsmetode. Videre er vurderingen subjektiv og tillater ikke identifikasjon av sprue-pasienter som har en IgA svikt (2% av pasientene).

Pr i dag er det derfor klart at en tkke-invasiv, spesifikk, kvantitativ, rask, enkel og billig og gjennomførbar påvisningsanalyse ikke eksisterer for sprue/cøliaki og for kontroll av terapi.

Dette problem blir løst av den foreliggende oppfinnelse. Basert på det over-raskende funn at vevstransglutaminase (tTG, EC 2.3.2.13) er autoantigenet i sprue, ble en immunologisk fremgangsmåte ifølge kravene 1 til og med 6 for å påvise antistoff mot tTG og tTG-inneholdende forbindelse fra kroppsvæske, spesielt fra serum, utviklet, der denne fremgangsmåte ikke bare tillater diagnose av sprue eller cøliaki, men også alle sykdommer som er koplet med en immunreaksjon mot flg, tTg-inneholdende forbindelse, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av disse.

Vevstransglutaminase hører til klassen transglutaminaser. Disse TG (EC 2.3.2.13) er enzymer som katalyserer en acyloverføring som avhenger av Ca<2*>, der Y-karboksamidgruppene til peptidbundet glutaminrester fungerer som acyldonorer. Proteinbundede lysinrester fungerer fortrinnsvis som acylakseptorer, slik at over-føringen resulterer i et e-(Y-glutamyl) lysinbinding. Substratspesifisiteten til TG med henblikk på acyldonorene er meget høy (avhengig av aminosyresekvensen), mens en usedvanlig bred gruppe med aksepterer er tilgjengelige (Folk J.E. Annu. Rev. Biochem., 1980; 49:517-531). De kovalente peptidbindinger som dannes er meget stabile og proteaseresistente, noe som fører til en øket motstandskraft hos de kryss-koplede proteiner overfor kjemiske, enzymatiske eller fysikalske effekter. ;I tillegg korrelerer den utstrakte forekomst av ulike TG i ulike organer, vev, i plasma og i interstitielle kroppsvæsker med forekomst av transglutaminase-modifiserte proteiner i blodkoagler, på cellemembraner, i homlaget i overhuden, i hår, negler og i den ekstracellulære matriks (Greenberg C.S. et al FASEB J., 1991; 5:3071-3077). ;De beskrevne transglutaminaser kan holdes fra hverandre basert på deres fysikalske egenskaper, deres lokalisasjon i kroppen og deres primærstruktur. ;Vevs TG (tTg) blir også beskrevet som cellulær, erytrocytt, endoteliell, cyto-plasmatisk, lever eller type II TG, og er en monomer med en molekylvekt på 75-85 kDa. ;Den komplette aminosyresekvens som omfatter 687 rester ble avledet fra cDNA. På proteinnivå er det 84% homologi mellom det humane enzym og enzymet fra musemakrofager, og 81% homologi mellom det humane og marsvinenzym. Nukleotidutbytter mellom disse arter har ofte ingen effekt på aminosyresekvensen. Det aktive senter er høygradig konservert, med en markert proteinhomologi mellom de tre arter (49 av 51 rester er identiske), og med en høy grad av proteinhomologi (75%) sammenlignet med a-subenheten til faktor XIII (se Gentile V. et al. J. Biol. Chem., 1991; 266:478-483; Greenber C.S. et al. FASEB J., 1991; 5:3071-3077). ;Det er heller intet signalpeptid eller glykosylering, og tilsynelatende, til tross for flere cysteinrester er det ingen disulfidbroer. Ved å bruke fluorescens hybridisering ble genet for humant vevstransglutaminase lokalisert på kromosom 20q12 (Gentile V. et al., Genomics, 1994; 20:295-297). Selv om mekanismen for frigjøring av enzymet fremdeles er uklar er det helt klar kunnskap om at tTG, med den omfattende cellulære lokalisasjon, er ansvarlig for viktig funksjoner i den ekstracellulære matriks (ECM). Videre er den intracellulære konsentrasjon av Ca<2+>som kreves for tTG aktivitet ikke mulig å oppnå under fysiologiske forhold, mens derimot tilstrekkelige høye Ca<2*>konsentrasjoner er tilstede i det ekstracellulære miljø (Gentile V. et al., J. Cell Biol., 1992; 119:463-474).

En rekke studier har etablert en kopling av tTG med fibronektin ECM-proteinet; I tillegg til fibronektin kunne også ECM-molekylene nidogen, det N-terminale prokollagen III peptid, kollagenene V og XI, osteonektin, som er et mikrofibrilkoplet glykoprotein, høymolekylvekts dermatansulfatproteoglykan, og galektin 3 lektinet bli identifisert som spesifikke substrater for tTG.

Antydninger om en viktig rolle for tTG i sårtilheling blir også fremskaffet fra immunfluorescensstudier på dyrkede WI38-celler (lunge embryonale fibroblaster) som ikke fremviser ekstracellulær tTG-aktivitet under normale forhold, men som ved kunstig sårdannelse produserer ekstracellulær avleiring av enzymet. Den mulig passive frisetting av enzymet fra skadede celler blir fulgt av en i begynnelsen ikke-kovalent binding til ECM, spesielt til fibronektin og fribrillære kollagener, der enzymet blir katalytisk aktivt i noen timer (Upchurch, H.F. et al.; J. Cell. Physiol., 1991; 149:375-382). Ved bruk av en rottemodell, også etter kunstig dannelse av ét sår, ble en 5 dagers økning av tTG-aktivitet påvist (Bowness, J.M. et al. Biochem. Biophys. Acta; 1988; 967:234-240). Når humane erytrocyttlysater ble inkubert med plasma ble også en sterk affinitet mellom det frigjorte tTG og fibronektin bli demonstrert (Loraud, L. et al. Proe. Nati. Accad. Sei USA 1998; 85:1057-1059). Alle disse funn indikerer at tTG bundet til ECM spiller en sentral rolle i den tidlige fase av sårtilheling, og spesielt bidrar til fibrinstabilisering sammen med faktor XIII, som danner et beskyttende lag og et stabilt adhesivt substrat rundt de skadede celler ved å krysskople ekstracellulære proteiner. Pr i dag har intet enzym som har evne til å kløve de tTG-katalyserte og enormt stabile krysskoplingene mellom proteinene blitt påvist i virveldyr.

Basert på funnet at tTG er autoantigenet i sprue beskrives bruk av tTG, tTG-inneholdende forbindelser, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av disse i diagnose og terapikontroll av sykdommer som er koplet til en immunreaksjon mot de nevnte forbindelser. Spesielt kan akutte betennelsessykdommer slik som lungebetennelse, glomerulonefritt, virus hepatitt eller kroniske betennelsessykdommer, slik som Crohns sykdom, uleerøs kolitt eller autoimmune sykdommer, slik som autoimmun hepatitt, Sjøgrens syndrom, Wegeners granulomatose, kronisk leddgikt, idiopatisk organfibrose, slik som lunge-fibrose bli diagnostisert på denne måte. Spesielt passende er påvisningsanalysen for diagnose og terapikontroll av sprue. Siden denne analyse kan utføres raskt og med lav kostnad tillater den effektiv screening av populasjonen med henblikk på tTG-antistoff.

Ett aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for immunologisk identifikasjon av cøliakisykdom, kjennetegnet ved påvisning av anti- tTG-antistoff i kroppsvæsker ved en immunreaksjon med en vevstransglutaminase (tTG), med tTG-inneholdende forbindelse, med antigene strukturer fra disse, med immunreaktive sekvenser eller analoger av disse.

I et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et oralt farmasøytisk middel som inkluderer tTG, tTG-inneholdende forbindelser, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av disse og eventuelt farmasøytisk tolerable adjuvanser, for behandling av cøliakisykdom.

I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse omhandles en anvendelse av tTG-inneholdende forbindelser, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av disse i produksjon av orale farmasøytiske midler for behandling av cøliakisykdom.

tTg benyttet ifølge oppfinnelsen kan være av dyreopprinnelse inklusive human, syntetiske eller av rekombinant opprinnelse, og det samme dreier seg om de tTG-inneholdende forbindelser som i tillegg også kan ha en kombinert opprinnelse (f.eks dyre tTG koplet med et syntetisk peptid). I oppfinnelsens mening blir tTG-inneholdende forbindelser forstått å være kjemiske forbindelser av tTG med proteiner, eller analoger av dette. I oppfinnelsens mening blir tTG analoger eller analoger av disse tTG-inneholdende forbindelser forstått å være alle de antigene strukturer som gjennomgår en immunreaksjon med antistoff rettet mot tTG eller tTG-inneholdende forbindelser, f.eks syntetiske peptider. Immunreaktive sekvenser blir forstått å være fragmenter av tTG eller tTG-inneholdende forbindelser som er produsert ved proteolyse, syntese eller genetisk manipulasjon, samt også varianter fremskaffet ved aminosyreutbytte.

Den immunologiske påvisning ifølge oppfinnelsen blir utført ved å bruke velkjente fremgangsmåter. Således kan enhver direkte (f.eks ved å bruke en sensor-chip) eller indirekte prosedyre bli benyttet i påvisning av pasientantistoff.

I de direkte prosedyrer blir binding av antistoffene som skal påvises til antigenet ble bestemt ved endring av kjemiske eller fysikalske egenskaper, slik at etter-følgende påvisningstrinn ved bruk av merkede bindingsmolekyler ikke blir nødvendig. Ifølge oppfinnelsen blir det foretrukket at tTG-antistoffene blir påvist ved hjelp av en immuntest, fortrinnsvis en fastfaseimmuntest, med direkte eller indirekte kopling av en reaktant til en lett påvisbar merkingssubstans. Mer fordelaktig kan påvisning utføres ved hjelp av ELISA, et RIA eller et immunfluorescens analysesystem. Prosedyrene som benyttes i slike deteksjonsfremgangsmåter er velkjente for en person som har øvelse i faget.

I f.eks et ELISA blir antigenet, i dette tilfellet f.eks tTG, direkte bundet eller indirekte bundet til en bærersubstans slik som polystyren. Etter inkubasjon med antistoffene som skal påvises, f.eks fra serum til pasienter, blir antistoffene bundet til antigen påvist direkte eller indirekte ved å bruke enzymkoplede substanser. Disse substanser kan være antistoff, antistoff-fragmenter, eller høyaffinititets ligander, slik som avidin som binder til et biotinmerke. For eksempel kan peroksydase, alkalisk fosfatase, p-glaktosidase, urease eller glukoseoksydase benyttes som mulige enzymer. De bundne enzymer og således f.eks de bundne tTG-antistoff kan kvantifiseres ved å tilsette et kromogent substrat.

I et radioimmunoassay blir antigenet, f.eks tTG, på samme måte bundet direkte eller indirekte til en bærersubstans slik som polystyren. Etter inkubasjon med antistoffene som skal påvises, f.eks fra pasientserum, blir de antigenbundne antistoff påvist ved å bruke substanser som har et radioaktivt merke, f.eks<125>l. Disse substanser kan være antistoff, fragmenter av antistoff eller høyaffinitetsligander slik som avidin som binder til et biotinmerke. Den bundne radioaktivitet kan kvantifiseres ved å bruke et passénde måleinstrument.

I en immunfluorescensanalyse blir de antigenbundne antistoff påvist ifølge det samme prinsipp, der man bruker substanser som har et fluorescerende merke koplet, f.eks fluoresceinisotiocyanat (FITC). Disse substanser kan være antistoff, fragmenter av antistoff eller høyaffinitetsligander, slik som avidin som binder til et biotinmerke. Den bundne mengde av fluorescerende farvestoff blir deretter kvantifisert ved hjelp av et passende måleinstrument.

Ifølge oppfinnelsen er det også mulig å påvise pasientantistoffene i et agglutinasjonstestsystem eller ved en geldiffusjonsmetode. Disse påvisnings-metoder er også velkjente for en person som er øvet i faget. I et geldiffusjonstest-system blir f.eks antigenet eller antistoffløsningene plassert oppe i brønner ved siden av hverandre i agar eller agaroseplater. I det foreliggende tilfellet kan f.eks antigenløsningen være løsning med tTG og antistoffløsningen kan være f.eks blod-serum. Mens substansene diffunderer ut av deres brønner blir det skapt konsentra-sjonsgradienter som går ut fra disse brønnene. Dersom de overlappende antigen og antistoffkonsentrasjonene i gelen faller innenfor spesifikke ratioer og antistoff- løsningen inneholder antistoff rettet mot antigenet blir det dannet synlige persipitater i gelen.

I agglutlnasjonstesten blir partikler som bærer antigen (f.eks tTG), f.eks fra lateks eller polystyren, krysskoplet med antistoff, f.eks fra serum. Aggregatene som blir produsert kan påvises ved å bruke f.eks turbidimetri.

Ifølge oppfinnelsen er det spesielt foretrukket at deteksjonen utføres i serum fra spruepasienter ved å bruke et ELISA spesifikt for IgA eller IgG. På grunn av høy sensitivitet og spesifisitet ble det observert at tTG-basert, og nylig utviklet ELISA-påvisning av IgA-antistoff i serum til spruepasienter var meget effektivt for å stille diagnose og kontrollere terapi av sprue. Dette er også klart i oppfølgingen av de behandlede pasienter (nedgang i antistofftiter under terapi). En sammenligning av ELISA-data ifølge oppfinnelsen med immunfluorescensevalueringen utført av tredje personer (påvisning av IgA-antiendomysium) viser en god overensstemmelse. Diskrepanser oppstår spesielt med lave antistofftitre som imidlertid er et resultat av at den indirekte immunfluorescensteknikk blir vurdert som toppnivåstandard opp til nå. Dette er bl.a forårsaket av den subjektive evaluering og de ikke-spesifikke samtidige reaksjonene i denne tidligere fremgangsmåte.

Den tilsvarende påvisning basert på antistoff fra andre klasser, som eksempel IgG-antistoff, er passende for å påvise spruepasienter med IgA-svikt, og for å studere andre sykdommer som er sammenkoplet med en immunreaksjon mot tTG.

En annen forbedring av denne deteksjonsmetode oppstår når man benytter renset tTG fra marsvin, humant tTG, sekvenser eller analoger fremskaffet ved proteolyse eller genetisk manipulasjon, samt syntetiske immunogene tTG-peptider i analysesystemet. Et ELISA for diagnose og oppfølging av andre sykdommer som følges av en immunreaksjon mot tTG vil bli beskrevet i eksempel 3.3.

Oppfinnelsen blir også rettet mot et oralt farmasøytisk middel ifølge krav 7 for behandling av sykdommer som er koplet med en immunreaksjon mot tTG, tTG-inneholdende forbindelse, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av disse. Fortrinnsvis er den orale tilførselsform en tablett eller en kapsel der oral toleranse blir oppnådd ved å tilføre tTG, tTG-inneholdende forbindelser, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av disse. På den ene side blir den nevnte orale toleranse oppnådd ved oral tilførsel av autoantigenet, og på den annen side er det en såkalt "tilskuereffekf: dersom autoantigenet som induserer sykdommen ikke er kjent kan et annet antigen som kontakter immun- systemet i målorganet bli benyttet i oral terapi i noen tilfeller. Dette antigen har deretter evnen til lokalt å stimulere antigenspesifikk suppressor T-celler, noe som fører til undertrykking av en systemisk immunrespons. Bare ved høyere antigen-doser blir en anergi av de autoreaktive T-celler inudsert.

Oral toleranse er den praktiske fremgangsmåte for å behandle en rekke autoimmune sykdommer.

Oppfinnelsens farmasøytiske middel blir fortrinnsvis benyttet i behandling av sprue, men også ved andre kroniske betennelses tarmsykdommer og autoimmun hepatitt.

Ifølge oppfinnelsen anvendes tTG, tTG-inneholdende forbindelser, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av disse i farmasøytiske midler i en dose på 0,01-100 mg/kg kroppsvekt.

Oppfinnelsens farmasøytiske middel kan eventuelt inneholde farmasøytisk akseptable tilsetninger, slik som fyllere, smørere, disintegrerende midler, bindere eller frisetningsmidler som normalt brukes i galeniske preparater. Ratio av de farmasøytiske tilsetninger kan variere innenfor vide grenser, avhengig av det utvalgte innhold av aktiv ingrediens, og er fra 0,1 til 20% i vektenheter i hvert tilfelle.

Spesielt kan fordelene som oppnås med den foreliggende oppfinnelse bli observert i en påvisningsanalyse for sprue og terapikontroll av dette, der analysen er ikke-invasiv, meget spesifikk og rettet umiddelbart mot middelet som er assosiert med sykdommen. Videre er en betydelig fordel av analysen som har blitt utviklet at den er raskt, lett og har lave omkostninger, samt også tilllater muligheten av standardisering mellom ulike laboratorier. Derved tillater analysen effektiv screening av hele populasjonen med henblikk på antistoff rettet mot tTG.

Som et resultat av analysens objektive karakter er også potensiale for kvantitativ evaluering vesentlig bedre enn immunfluorescens evalueringen som inkluderer subjektive aspekter. I tillegg er immunfluorescens evaluering, spesielt med lave titere, hindret av uspesifikke samtidige reaksjoner. Ved å bruke det spesifikke autoantigen i testsystemet, blir de uspesifikke reaksjoner på materialet fra primaters spiserør eller navlestrenger, analysert med immunfluorescens, bli eliminert som mye som mulig.

Siden analysen kan benyttes på IgA klasse antistoff samt også andre antistoff-klasser kan spruepasienter med IgA-svikt også identifiseres. Deteksjonen basert på antistoff rettet mot tTG er også passende for identifikasjon, undersøkelse og terapikontroll av andre sykdommer som er ledsaget av en immunreaksjon mot tTG.

Det er også, som et resultat av identifikasjon av tTG som autoantigen i sprue, mulig å benytte dette i dets helhet eller de immunreaktive epitopene fra dette enzym (sekvenser, analoger eller syntetiske peptider fremstilt ved proteolyse eller ved genetisk manipulasjoner) i den orale terapi av sprue og andre sykdommer som ledsages av en immunrespons overfor tTG.

Eksempel 1

Isolering og karakterisering av autoantigenet

1.1. Immunfluorescens, APAAP-farving

Farvingene ble utført på ulike cellelinjer fiksert i 100% metanol i 2 min ved - 20°C.

I immunfluorescensdeteksjon ble preparatene inkubert med henholdsvis sprue og kontrollsera, vasket og undersøkt ved hjelp av ét TRITC-merket antihumant IgA fra kanin (Schuppan et al., J. Biol. Chem. 1990; 265,8823-32).

APAAP-merket ble utført etter inkubering av cellene med sprueserum, vasking og etterfølgende deteksjon ved å bruke APAAP-komplekset (Cordell J.L. et al., J. Histochem. Cytochem. 1984; 32, 219-229).

Her viste HT1080 (humant fibrosarkomceller) WI38 (humane lunge embryonale fibroblaster), Hep 1 og HepG2 (hepatokarsinomceller) tydelige positive cytoplasmatiske signaler med pasientsera, mens normale sera eller forbehandling med humant IgA ikke ga noen merking. Humane forhudsfibroblaster, humant rhabdomyosarkom (RGVrotte Ito/rotte Morris hepatom, og hund MDCK-celler viste bare fra meget svake til negative reaksjoner.

1.2. Metabolsk cellemerking og immunpresipitering av autoantigenet

Karakterisering og isolering av autoantigenet ble utført ved å bruke HT1080-celler. Cellene ble dyrket med L-alanyl-L-glutamin, 10% føtalt kalveserum (FCS, Gibco), 100 U/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin (Seromed) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco) ved 37°C og 8% C02. For å merkes metabolsk ble cellene overført til dyrkningsskåler med 5 cm diameter, og når omtrent 90% konfluens ble nådd ble de oppbevart i et medium som ikke hadde metionin eller FCS, hvoretter dette medium ble byttet ut med 3 ml med et FCS-fritt medium som inneholdt<35>S-metionin (0,2 mCi, Expre35SæS, NEN-Dupont). Etter 16-20 timers inkubertng ble supematanten fjernet. Celtene ble vasket med fosfatbuffer (PBS, Seromed), og deretter oppløst i 3 ml oppløsningsbuffer (50 mM Tris-HCI, 150 mM. NaCI, 0,5% Triton X-100,0,5% IGEPAL CA-630 ikke-ionisk detergens [Sigma], Complete<®>proteaseinhibitor [Boehringer], pH 7,5). Deretter ble immunpresipitering utført med CNBr-aktivert Sepharose 46 (Pharmacia), både med mediet og celle-lysatet.

Aktivering og binding til Sepharose ble utført ifølge produsentens instruk-sjoner. Etter oppsvulming og vasking i 1 mM HCI, pH 2,5, ble det CNBr-aktiverte Sepharose inkubert med et antistoff fra kanin rettet mot humant IgA (Dianova, 2,4 mg antistoff/ml Sepharose) i 0,1 M NaHC03, 0,5 M NaCI, pH 8,3, ved 4°C over natten. Ikke-bundne antistoff ble fjernet med vasking med koplingsbuffer, og ledige bindingsseter ble mettet ved tilsetning av 1 M etanolamin, pH 9,0 ved romtemperatur i 2 timer. Deretter ble Sepharosekulene vasket 3 ganger alternativt (10 x vol hver gang) med 0,1 M natriumacetat, 0,5 M NaCI, pH 4,0 og 0,1 m Tris-HCI, 0,5 M NaCI, pH 8,0, fulgt av inkubering av Sepharosekulene med sera fra henholdsvis sprue-pasienter og friske personer (0,5 ml serum/ml Sepharose), i koplingsbuffer (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1 mM CaCI2,1 mM MgCI2, pH 8,0) ved 4°C over natten. Overskudd av serumantistoff ble fjernet ved 3 gangers vasking med koplingsbuffer.

Hver gang ble 1 ml av HT1080 medium eller cellelysat (omtrent 5 x 10<4>celler) av de metabolske merkede celler preinkubert med 50 jxl av C14B Sepharose (Pharmacia) i 30 minutter ved romtemperatur for å fjerne ikke-spesifikt bindende proteiner. Etter sentrifugering (10.000 x g, 5 min, 4°C), ble hver av supematantene inkubert med omrysting ved 4°C over natten med 50 yd av Sepharosen som tidligere hadde fått bundet IgA fra henholdsvis pasientene og kontrollpersoner. Sepharose-kulene ble deretter vasket hver gang med 3 x 1 ml vaskebuffer (10 mM Tris-HCI, 1% IGEPAL CA-630 [Sigma], 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% natriumlaurylsulfat, Complete<9>[Boehringer], pH 8,0), etterfulgt av 1 ml 10 mM Tris-HCI, pH 8,0. Kulene ble deretter tatt opp i SDS analysebuffer, inkubert i 5 minutter ved 95°C under reduserende eller ikke-reduserende betingelser, separert på 10-12,5% SDS polyakrylamidgel (Låmmli, U.K., Nature 1970; 227,680-685), dg analysert ved hjelp av autoradiografi (fig. 1).

I videre analyser ble det bundne høymolekyl vektsproteinet fra mediet funnet å være fibronektin, som bl.a ikke-spesifikt bindes til Sepharose.

Imidlertid kunne et celle-assosiert protein på molekylvekt 85 kDa bli presipitert med alle de 30 spruesera som hittil har blitt benyttet på denne måte, mens det samme ikke var mulig å oppnå med 15 kontrollsera, deriblant normalsera, serum fra pasienter med ulcerøs kolitt og med Sjøgrens syndrom. Det ble konkludert fra dette at proteiner representerer det essensielle autoantigen fra sprue.

Ved hjelp av proteinfarving av gelene med sølvnitrat (Henkeshoven, J. et al., Electrophoresis 1985; 6,103-112) ble et skarpt proteinbånd funnet å representere det autoradiografisk synbare 85 kDa bånd.

1.3. Isolering og rensning av 85 kDa autoantigenet

For å isolere større mengder av autoantigenet ble totalt 60 dyrkningsskåler (hver 175 cm<2>) med HT1080 celler (omtrent 10<9>celler) dyrket. Kort før de nådde konfluens ble mediet byttet ut med et FCS-fritt medium, etterfulgt av inkubering i ytterligere 16-20 timer i en C02inkubator. Lysis og immunpresipitering ble henholdsvis utført som beskrevet over. Sepharose-kulene ble inkubert i et totalt 4,5 ml SDS analysebuffer med 2% DL-ditiotreitol (Sigma) i 5 minutter ved 95°C for å løse vekk bundne proteiner, og deretter analysert i den analytiske SDS polyakrylamidgel.

For videre rensning av autoantigenet ble immunpresipitatet separert via eluerings elektroforese som følger, der en Prep Cell (modell 491 BIO-RAD) ble benyttet: 4,5 ml av proteinblandingen ble plassert på toppen av en rund gel (ytre diameter: 3 cm) som bestod av 6,5 cm separerende gel (8% polyakrylamid, pH 8,8) og 1,5 cm oppsamlingsgel (4% polyakrylamid, pH 6,8) og separert ved elektroforese. De individuelle proteiner ble samlet i elueringsbuffer (25 mM Tris-HCI, 0,1 M glysin, 0,01% SDS, pH 8,3) som 1,2 ml fraksjoner (0,8 ml/min). De eluerte fraksjoner ble analysert i SDS-PAQE, og fraksjonene som inneholdt det ønskede protein (omtrent 15 ml) ble slått sammen og konsentrert til omtrent 1 ml total volum ved bruk av ultra-filtrering (Amicon Centriprep-50, ved 1.000 x g).

1.4. Proteasefordøyelse av autoantigenet

Blant en rekke proteaser som ble forsøkt ble det funnet at endoproteinase Asp-N (sekvenseringsgrad, Boehringer Mannheim) var passende for fragmentering, siden den tillot en stort sett reproduserbar kløving med relativt velseparerte framenter. Enzym/substratkonsentrasjonen ble justert til 1:100, og fordøyelsen ble utført i 30 minutter ved 37°C.

1.5. Overføring til PDVF-membran

Etter fordøyelse av det rensede autoantigenet ble peptidf ragmentene separert på en preparativ 10% Tricine-gel (Schågger, H. et al., Anal Biochem. 1987; 166, 368-379) (fig. 2) og overført ved 4°C til en PVDF-membran (polyvinylidendifluorid, Immobilon™, Millipore) i en semitørr raskblottingsprosedyre med bruk av grafitt-inneholdende elektrodeplater (Fastblot B32/33, Biometra). For dette formål ble de følgende lag plassert på anodeplaten: 1.) et filterpapir dyppet i anodebuffer 1 (300 mM Tris-HCI, 20% metanol, pH 10,4), 2.) et filterpapir dyppet i anodebuffer 2 (30 mM Tris-HCI, 20% metanol, pH 10,4), 3.) PVDF-membranen aktivert i metanol og pre-ekvilibrert i anodebuffer 2, 4.) Tricine-gelen, 5.) to filterpapir dyppet i katodebuffer (25 mM Tris-HCI, 40 mM e-amino-n-kapronsyre, 20% metanol, pH 9,4), 6.) katodeplaten. Overføringen ble utført i løpet av 35 minutter ved 180 mA.

Deretter ble PVDF-membranen farvet i 0,1% Coomassie blå serva R-250, 50% metanol i 5 minutter, avbleket med 50% metanol, 10% eddiksyre, grundig vasket med destillert vann og lufttørket. De karakteristiske båndene med det fordøyde autoantigen på 10 kDa, 14 kDa, 16 kDa og 25 kDa ble forsiktig kuttet ut av membranen og utsatt for en første sekvensering fra N-terminalen

1.6 Edman degradering

(Ifølge Edman and Henschen i: Needleman, S.B.: Protein Sequence Determination, Springer Verlag, Berlin. 1975; 232-279).

Sekvensering ved bruk av en Applied Biosystems 4778-Sequenator ga tre aminosyresekvenser som ble sammenlignet med Swiss Prot 31 databasen (ved PC/GENES, IntelliGenetics). På disse kunne en klar henvisning av de tre fragmenter gjøres til humant vevs transglutaminase (tTG, EC 2.3.2.13, protein glutamin y-glutamyltransferase) gjøres med minimal uenighet. Indikasjonene blir gitt under med "en-bokstavskoden"; X representerer ingen identifikasjon:

t-Transglutaminase: 28'REKLVVRRGQPFW

10 kDa fragment: REKLVVRRGQPF (S)

t-Transglutaminase: 581 'DLYLENPEIKIRILG

14 kDa fragment: DLYLENPEIXIXILG

t-Transglutaminase: 438'DITHTYKYPE

16 kDa fragment: DITLTYQYP (V)

Ingen .klar sekvens kunne gis til 25 kDa-fragmentet siden dette var en blanding av flere peptider.

Eksempel 2

Bekreftelse av vevstransglutaminase (tTG) som autoantigen i sprue

2.1. Immunpresipitering av marsvin tTG

Siden tTG fra marsvinlever er kommersielt tilgjengelig og har sekvens homologi (>80%) med humant tTG ble dette preparat (Sigma) først separert ved hjelp av gelelektroforese for å vurdere renheten av preparatet. I tillegg til en rekke andre proteiner ble det funnet at tTG, som var omtrent 50%, representerte ett av de tydeligste båndene.

Selv om humant tTG med 687 aminosyrer adskiller seg bare svakt fra marsvin-proteinet som har 690 aminosyrer viser disse to proteinene meget ulike elektroforetisk bevegelighet i SDS polyakrylamidgelen. Mens proteinet fra marsvin fremstår som et bånd med 75-80 kDa molekylvekt, som forventet, viste det humane protein en klart langsommere bevegelighet, og antyder en tilsynelatende molekylvekt på 85 kDa som beskrevet i litteraturen (Gentile, V., et al., J. Biol. Chem. 1991; 266, 478-483), til tross for at proteinet tilsynelatende mangler N-glykosylering.

Reaktiviteten til det humane autoantistoff fra spruesera med marsvins tTG ble analysert i et immunpresipiteringssystem. For dette formål ble 4 ug tTG (Sigma) i 500 uJ oppløsningsbuffer og 0,5% bovint serumalbumin omrystet ved 4°C over natten med sprue IgA koplet til 4B Sepharose, vasket, kokt i SDS analysebuffer under reduserende betingelser og separert på en 10% polyakrylamidgel (cf., 4.1.2.). Her ble spesifikk presipitering av det forventede bånd (m.w. 80 kDa) observert, uten noen forurensninger.

2.2. Bekreftelse av tTG som autoantigen i et Western blott

Etter separering av 2 jag marsvin tTG på en SDS-gel og overføring til nitro-cellulose ble blottet blokkert i PBS, 2% fettfri skummet melkepulver, 0,3% Tween 20, pH 7,3 ved 4°C over natten. Dette ble etterfulgt av en 1 times inkubering med sprueserum (1/200) i den samme buffer, tre vasketrinn og en 1 times inkubering med alkalisk fosfatasekoplet kaninantistoff rettet mot humant IgA (1/500). Blottene bte vasket i PBS og utviklet med Nitroblå tetrazolium og 5-brom-4-klor-3-indo!ylfosfat som substrat (Blake, M.S., et al., Anal. Biochem. 1984; 136,175-179).

75-80 kDa båndet ga en klar positiv reaksjon med sprueserumet, som er et annet bevis på at spruepasienters sera inneholder IgA klasse antistoff mot tTG,

mens kontrollsera ikke ga noe signal.

2.3. Bekreftelse av tTG som en endomysium autoantigen ved å bruke indirekte immunfluorescens

Spiserørs-vevssnitt fra primater (Euroimmun, Tyskland) ble benyttet i den indirekte påvisning av IgA antistoff rettet mot endomysium i spruesera og deres inhibisjon av tTG. Etter pre-inkubering av 10 ul pasientsera fortynnet 1/320 i PBS med 0,5 eller 10 ug tTG fra marsvin (Sigma) og 10 ug BSA (Sigma) i 1 time ved romtemperatur ble nevnte spiserørssnitt inkubert med dette i 1 time ved romtemperatur i en fuktig atmosfære. Spruesera (1/320) og serum fra friske individer (1/50) ble benyttet som henholdsvis positive og negative kontroller. Etter at snittene hadde blitt vasket 3 ganger i PBS/0,2% BSA og lufttørket ble autoantigen påvist med et TRITC-merket kanin antistoff rettet mot humant IgA (Dianova), fortynnet 1/50 i PBS, i 1 time ved romtemperatur. Overskudd av antistoff ble fjernet med etterfølgende vasker med PBS/0,2% BSA, PBS og tilslutt destillert vann.

Pasientserum viste klar farving av ECM fremkalt av IgA klasse antistoff som

ble hemmet ved å tilsette økende mengder av tTG, men ikke av pre-inkubering med BSA. Kontrollen som benyttet serum fra friske individer viste ingen farving av spise-rs rssn itlene.

Eksempel 3

3.1. Utvikling av et sprue-spesifikt ELISA med IgA antistoff for diagnose og oppfølging av sprue 1 u,g marsvin transglutaminase (Sigma T-5398) i 100 jul PBS ble pipettert i hver brønn i polystyrene mikroplater (Greiner Labortechnik, 96-brønner) og inkubert i 2 timer ved 37°C ved en lett roterende bevegelse. Fritt tTG ble fjernet med vasking med PBS (3 x 200 ul), de frie bindingsseter i brønnene ble blokkert med 1% bovint serumalbumin (Sigma) i 250 ul PBS ved 4°C over natten. Etter vasking med PBS/0,1% Tween 20 (3 x 200 ul) ble brønnene inkubert med sekvensielle serum-fortynninger i PBS/0,1% Tween 20 (100 ul) i 1 time ved romtemperatur under lette roterende bevegelser, vasket med PBS/0,1% Tween 20 (3 x 200 ul), og deretter inkubert med et peroksydasekonjugert kanin-antistoff rettet mot humant IgA (Dianova) (1/400 i 100 ul PBS/0,1% Tween 20) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking med PBS (3 ganger) ble en 30 minutters inkubering ved romtemperatur i mørket der det ble benyttet 200 ul 0,1 M citratbuffer, 17,6 mM H202, 5,5 mM o-fenylendiaminhydroklorid (Sigma), pH 4,2, og etterfølgende påvisning av den dannede farve i en ELISA-avleser (MRX, Dynatech Laboratories) ved 450 nm utført. 20 sera av spruepasienter ble testet før og etter terapi med en glutenfri diett, dvs i de aktive og mindre aktive faser av sykdommen. Testsystemet ble funnet å være meget sensitivt, med god korrelasjon mellom verdiene og den aktive spruefase. Den terapeutiske effekt som resultat av å følge en diett ble også gjenspeilet i nedgang av IgA antistoff rettet mot tTG. Den høye spesifisitet ble tydelig når man kunne observere den lave ekstinsjon (bakgrunnsnivå) i kontrollsera fra friske individer, pasienter med ulcerøs kolitt, leverchirrose, ulike svulster, Sjøgrens syndrom etc (fig. 3).

3.2. Utvikling av et ELISA ved å bruke antistoff fra andre klasser for diagnose og oppfølging av sprue, med IgG antistoff som eksempel.

Siden omtrent 2% av spruepasientene har IgA-svikt ble sera testet med henblikk på deres sensitivitet og spesifisitet av IgA antistoff mot tTG. ELISA ble utført som i 3.1., der bare det peroksydasekoplede antihumane IgA antistoff (Dianova) ble byttet ut med et antihumant IgG antistoff (Dianova). Vurdert med henblikk på deres sensitivitet var verdiene hos spruepasientene både før og etter glutenfri diett tilsvarende de resultater som ble oppnådd med IgA antistoff.

Noen av kontrollseraene viste lett økede verdier, i overensstemmelse med tidligere funn av redusert spesifisitet av endomysiumantistoff i den indirekte immunfluorescensanalyse av IgG-klassen (fig. 4).

3.3. Utvikling av et ELISA for diagnose og oppfølging av andre sykdommer som er assosiert med en immunreaksjon mot tTG, med IgG antistoff som eksempel. ELISA ble utført som beskrevet i 3.2.

Sera fra pasienter med kroniske betennelses eller autoimmune sykdommer (ulcerøs kolitt (C.U.), Crohns sykdom, akutt autoimmun hepatitt) viste fra lette til moderat økede verdier.

Ved å bruke den IgG-spesifikke ELISA-analyse av autoantistoff rettet mot tTG er det således mulig å stille diagnose og kontrollere terapi hos pasienter som lider av sykdommer som er assosiert med en immunreaksjon mot tTG.

Eksempel 4

En ny funksjon av vevstransglutaminase (tTG) i krysskopling av gliadin

Selv om et bredt spektrum av acylakseptorer er tilgjengelig for reaksjonen katalysert av tTG kan bare noen få molekyler fungere som acyldonorer. I et in vitro eksperiment kunne tTG-mediert inkorporering av radioaktivt merket putrescin inn i gliadin, og således gliadins funksjon som donorsubstrat for tTG bli etablert. 1160 ul buffer (0,1 M Tris-HCI, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI2, pH 7,5), ble 1 ug substrat (gliadin eller kontrollproteiner slik som albumin), 2 uCi [<3>H]-putrescin og 1 ug tTG (fra marsvin, Sigma) inkubert i 2 timer ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 100 ul 50% trikloreddiksyre (TCA), og proteinene ble presipitert ved 4°C over natten. Etter sentrifugering ble bunnfallene vasket med 10% TCA oppløst i SDS analysebuffer og på den ene side separert ved hjelp av SDS-PAGE, og på den annen side benyttet i en scintillasjonstelling. Mens inkorporering av putrescin ikke påvises med kontrollene viste gliadin klar inkorporering av ^Hj-putrescin både i scintillasjons-tellingen og i SDS-PAGE, noe som viser at gliadin er et utmerket substrat for tTG.

Forkortelser

Claims (8)

1.. Fremgangsmåte for immunologisk identifikasjon av cøliakisykdom,karakterisert vedpåvisning av anti-tTG-antistoff i kroppsvæsker ved en immunreaksjon med en vevstransglutaminase (tTG), med tTG-inneholdende forbindelse, med antigene strukturer fra disse, med immunreaktive sekvenser eller analoger av disse.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertvedat humane IgA og/eller IgG antistoff blir påvist.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat tTG eller de tTG-inneholdende forbindelser er av human, animalsk, syntetisk eller rekombinant opprinnelse.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til og med 3,karakterisertv e d at påvisningen blir utført ved å bruke et i og for seg kjent immunanalytisk system, fortrinnsvis med direkte eller indirekte kopling av en reaktant til en lett påvisbar merkings-substans.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat deteksjonen blir utført på en fast fase.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat deteksjonen blir utført ved å bruke et ELISA, RIA eller et immunfluorescens testsystem.

7. Oralt farmasøytisk middel,karakterisert vedat det inkluderer tTG, tTG-inneholdende forbindelser, de antigene strukturer, immunreaktive sekvenser eller analoger av disse og eventuelt farmasøytisk tolerable adjuvanser, for behandling av cøliakisykdom.

8. Anvendelse av tTG-inneholdende forbindelser, de antigene strukturer,. immunreaktive sekvenser eller analoger av disse i produksjon av orale farmasøytiske midler for behandling av cøliakisykdom.